KR20190012243A - Strain of microbacterium genus and method for producing psicose using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 신규하게 분리된 마이크로박테리움 속 균주, 상기 균주를 포함하는 사이코스 생산용 조성물 및 이를 이용한 사이코스 생산방법에 관한 것이다.The present invention relates to a newly isolated strain of the genus Microbacterium, a composition for producing psicose comprising the strain, and a method for producing psicose using the same.
일반적으로 사이코스(psicose)는 과당(D-fructose)의 3번 탄소의 에피머(epimer)이다. 과당과 비교할 때 과당의 70%에 해당하는 감미도를 가지고 있으나, 과당과 달리 체내 흡수 시 거의 대사되지 않으며, 포도당의 흡수를 억제하여 혈당 억제 작용을 하는 기능이 있다. 따라서, 당뇨병 환자용 음식품 또는 수신용 음식품 등에 사용할 수 있으며, 간에서의 지질합성에 관여하는 효소 활성을 억제는 기능이 있어 복부 지방 축적 억제를 할 수 있는 등 혈당 조절, 충치예방 및 간에서 지방합성을 저해하는 기능을 가지고 있으므로, 건강식품 등 여러 기능성 식품 등에 사용할 수 있다.In general, psicose is the epimer of carbon 3 of fructose (D-fructose). Compared to fructose, it has a sweetness of 70% of fructose, but unlike fructose, it is hardly metabolized when absorbed in the body, and has a function of inhibiting blood sugar by inhibiting the absorption of glucose. Therefore, it can be used for food products for diabetics or food for reception, and it has the function of inhibiting the activity of enzymes involved in lipid synthesis in the liver, so it can control the accumulation of abdominal fat, etc., to control blood sugar, prevent caries, and prevent fat in the liver. Since it has a function of inhibiting synthesis, it can be used in various functional foods such as health foods.
설탕 대체 감미료로 많이 사용되고 있는 당 알코올류는 일정량 이상 섭취 시 설사를 유발하는 등의 부작용이 있으나 사이코스는 알려진 부작용이 없다. 이에 사이코스는 다이어트 감미료로서 관심이 높아지고 있지만, 자연계에 극히 드물게 존재하는 단당류인 희소당에 속하기 때문에, 식품 산업에 적용하기 위해서는 사이코스를 효율적으로 제조하는 기술의 개발이 필요하다. Sugar alcohols, which are widely used as sugar substitute sweeteners, have side effects such as causing diarrhea when consumed over a certain amount, but Psychos has no known side effects. Accordingly, Psychos is gaining interest as a diet sweetener, but since it belongs to rare saccharides, which are monosaccharides that are extremely rare in nature, it is necessary to develop a technology for efficiently manufacturing Psicose in order to be applied to the food industry.
종래의 사이코스 제조 방법은 몰리브덴산 이온의 촉매작용을 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 화학적 방법과 같은 주로 화학적 합성 과정을 거쳐 제조하는 것이었다. 그러나 화학적 합성에 의할 경우, 당밀 처리과정 또는 포도당 이성화 반응 과정 중에 사이코스가 매우 소량 존재하고, 비용이 많이 소모되며, 부산물이 발생하는 단점이 있다. The conventional method for preparing psicose was mainly prepared through a chemical synthesis process, such as a chemical method for producing psicose from fructose using the catalytic action of molybdate ions. However, in the case of chemical synthesis, there is a disadvantage in that a very small amount of psicose exists, a high cost is consumed, and a by-product is generated during the molasses treatment process or the glucose isomerization process.
이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 아그로박테리움 투메패시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 사이코스 에피머화 효소에 의하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 것과 같은, 과당을 기질로 하여 효소 반응에 의하여 사이코스를 제조하는 생물학적 방법이 연구되고 있다. In order to solve such a problem, Psycose is produced by an enzymatic reaction using fructose as a substrate, such as the production of psicose from fructose by a psicose epimerase derived from Agrobacterium tumefaciens. Biological methods of making are being studied.
그러나 기존의 기능이 밝혀진 효소적 방법에 의하면 사이코스를 생산하는 효소들이 알칼리 조건의 pH 하에서 최적을 나타내는 경우가 많은데, 알칼리 조건 하에서의 반응은 비특이적 반응과 당의 갈변화를 유도하기 때문에 산업화에 적당하지 않다. 또한, 기존의 효소들은 높은 온도에서 안정성이 떨어지거나 느린 반응 속도로 인해 산업화에 적용되는 사이코스 생산의 수율이 낮고 제조원가가 상승하는 문제가 있었다. 따라서 부산물을 생성하지 않으면서, 산업화에 적합한 온도 및 pH 조건 하에서 높은 수율로 사이코스를 생산할 수 있는 방법이 요구되고 있다.However, according to the existing enzymatic methods, the enzymes that produce psicose are often optimal under alkaline pH conditions, and the reaction under alkaline conditions is not suitable for industrialization because it induces nonspecific reactions and browning of sugars. . In addition, conventional enzymes have low stability at high temperatures or have a problem in that the yield of Psychos production applied to industrialization is low and the manufacturing cost increases due to a slow reaction rate. Therefore, there is a need for a method capable of producing psicose in high yield under temperature and pH conditions suitable for industrialization without generating by-products.
본 발명의 일 예는 과당으로부터 사이코스를 생산하는 사이코스 전환활성을 갖는 신규한 마이크로박테리움 (Microbacterium) 속 균주를 제공한다. An example of the present invention provides a novel strain of the genus Microbacterium , which has an activity to convert between fructose and to produce a psicose from fructose.
본 발명의 또 다른 예는 상기 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 균주, 상기 균주의 배양물, 및/또는 상기 균주의 파쇄물을 포함하는 사이코스 생산용 조성물을 제공한다. Another example of the present invention provides a composition for producing a psicose comprising a strain of the genus Microbacterium , a culture of the strain, and/or a lysate of the strain.
본 발명의 또 다른 예는 상기 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 균주를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 방법을 제공한다.Another example of the present invention provides a method for producing psicose from fructose using the microbacterium spp.
본 발명의 또 다른 예는 과당을 사이코스로 전환하는 효소를 생산하는 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 균주를 식품으로부터 분리하는 방법을 제공한다.Another example of the present invention provides a method of separating a strain of the genus Microbacterium , which produces an enzyme that converts fructose into psicose, from food.
과당을 사이코스로 전환하는 활성이 우수한 신규 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 균주 (예컨대, Microbacterium foliorum)를 식품으로부터 분리 및 동정하였으며, 상기 균주의 균체를 사용하여 과당에서 사이코스로의 전환능을 확인하고, 높은 사이코스 전환능을 얻기 위한 균체 반응의 최적 온도, 최적 pH 및 금속이온 요구성 여부를 확인하여 사이코스를 효율적으로 대량 생산하기 위한 조건을 확립하여 본 발명을 완성하였다. A novel Microbacterium genus strain (e.g., Microbacterium foliorum ) having excellent activity in converting fructose to psicose was isolated and identified from food, and the ability to convert from fructose to psicose was confirmed using the cells of the strain. The present invention was completed by establishing conditions for efficiently mass-producing psicose by confirming the optimum temperature, optimum pH and metal ion requirement of the cell reaction for obtaining high psicose conversion ability.
본 발명의 일 예는 과당을 사이코스로 전환하는 신규 마이크로박테리움 (Microbacterium) 속 균주를 제공한다. Still another aspect of the invention is to convert fructose into new micro-psicose tumefaciens (Microbacterium) Provides strains of the genus.
다른 예는 상기 마이크로박테리움 속 균주를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 제조 방법에 있어서, 높은 사이코스 전환능을 얻기 위한 균체의 최적 반응 조건 및 사이코스의 대량 생산을 위한 조건을 제안한다.Another example provides a method of producing psicose from fructose using the microbacterium spp. In the above production method, the optimal reaction conditions of the cells for obtaining high psicose conversion ability and conditions for mass production of psicose are proposed.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
우선, 신규한 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 균주가 제공된다. 상기 마이크로박테리움 속 균주는 과당을 사이코스로 전환하는 활성이 우수한 균주로, Microbacterium foliorum, Microbacterium oxydans, Microbacterium maritypicum, Microbacterium liquefaciens, Microbacterium luteolum, Microbacterium ginsengiterrae, Microbacterium keratanolyticum, Microbacterium natoriense, Microbacterium lacticum, Microbacterium xylanilyticum, Microbacterium koreense, Microbacterium imperial 또는 Microbacterium phyllosphaerae일 수 있으며, 바람직하게는 Microbacterium foliorum, Microbacterium oxydans, 및 Microbacterium phyllosphaerae로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 예를 들어, Microbacterium foliorum 균주일 수 있다.First, a novel strain of the genus Microbacterium is provided. The strains of the genus Microbacterium are strains having excellent activity to convert fructose into psychoses, Microbacterium foliorum, Microbacterium oxydans, Microbacterium maritypicum, Microbacterium liquefaciens, Microbacterium luteolum, Microbacterium ginsengiterrae, Microbacterium keratanolyticum, Microbacterium natoriense, Microbacterium xlacticum, Microbacterium lacticum, It may be Microbacterium koreense, Microbacterium imperial or Microbacterium phyllosphaerae , preferably It may be one or more selected from the group consisting of Microbacterium foliorum , Microbacterium oxydans, and Microbacterium phyllosphaerae , and may be, for example, a Microbacterium foliorum strain.
일 구체예에서, 상기 마이크로박테리움 속 균주는 기탁번호 KCCM11774P인 Microbacterium foliorum SYG27B 균주일 수 있다. In one embodiment, the microbacterium The genus strain may be a Microbacterium foliorum SYG27B strain with accession number KCCM11774P.
상기 마이크로박테리움 속 균주는 과당을 사이코스로 전환시키는 사이코스 전환능이 우수한 것을 특징으로 한다. The microbacterium The genus strain is characterized by an excellent ability to convert fructose to psicose.
상기 사이코스 전환능은 상기 마이크로박테리움 속 균주가 과당을 사이코스로 전환시키는 효소를 생산함으로써 얻어지는 것으로, 상기 마이크로박테리움 속 균주는 사이코스 전환능이 높은 효소를 생산하거나, 사이코스 전환 효소를 대량으로 생산하여 우수한 사이코스 전환능을 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 마이크로박테리움 속 균주는 사이코스 제조에 유용하게 적용될 수 있으며, 사이코스 생산 수율을 보다 증진시킬 수 있다. The psicose conversion ability is the microbacterium A strain of the genus is obtained by producing an enzyme that converts fructose into psicose, the microbacterium The genus strain can produce an enzyme having a high psicose conversion ability, or produce an enzyme with a large amount of psicose conversion enzymes to exhibit excellent psicose conversion ability. Therefore, the microbacterium The genus strain can be usefully applied to the production of psicose, and can further enhance the yield of psicose production.
상기 사이코스 전환능은 40℃ 이상의 온도 조건하에서 활성을 갖는 것일 수 있으며, 40 내지 80℃, 예컨대, 50 내지 80℃, 60 내지 80℃, 또는 70 내지 80℃, 예를 들어, 75℃의 온도 조건에서 최대 활성을 나타내는 것일 수 있다.The psicose conversion ability may be one having activity under a temperature condition of 40° C. or higher, and a temperature of 40 to 80° C., for example, 50 to 80° C., 60 to 80° C., or 70 to 80° C., for example, 75° C. It may be one that exhibits maximum activity under conditions.
또한, 상기 사이코스 전환능은 pH 6.5 내지 9.0, 예컨대, pH 7.0 내지 9.0, pH 7.5 내지 9.0, pH 8.0 내지 9.0 또는 8.5 내지 9.0의 조건하에서 높은 활성을 가질 수 있다. 특히, pH 7.0 내지 8.0의 중성 pH 범위에서도 사이코스의 효율적인 생산이 가능하다.In addition, the psicose conversion ability may have high activity under conditions of pH 6.5 to 9.0, for example, pH 7.0 to 9.0, pH 7.5 to 9.0, pH 8.0 to 9.0, or 8.5 to 9.0. In particular, efficient production of psicose is possible even in the neutral pH range of pH 7.0 to 8.0.
따라서, 상기 마이크로박테리움 속 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 사이코스 생산용 조성물이 제공된다. Therefore, the microbacterium There is provided a composition for producing psicose comprising at least one selected from the group consisting of the cells of the genus strain, the culture of the strain, and the lysate of the strain.
상기 배양물은 상기 마이크로박테리움 속 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 균주의 상기 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. The culture is the microbacterium It includes an enzyme produced from the genus strain, and may be in a cell-free form that includes the strain of the strain or does not include the strain.
상기 파쇄물은 상기 마이크로박테리움 속 균주를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 마이크로박테리움 속 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것이다. The lysate is the microbacterium It refers to the lysate obtained by crushing the genus strain or the supernatant obtained by centrifuging the lysate, the microbacterium It includes enzymes produced from strains of the genus.
본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 사이코스의 제조에 사용되는 마이크로박테리움 속 균주는 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 사용된다.In the present specification, unless otherwise noted, microbacterium used in the production of Psychos The genus strain is used to mean at least one selected from the group consisting of the bacterial body of the strain, the culture of the strain, and the lysate of the strain.
또한, 상기 마이크로박테리움 속 균주를 사용하는 사이코스 생산 방법이 제공된다. 상기 사이코스 생산 방법은 상기 마이크로박테리움 속 균주를 과당과 반응시키는 단계를 포함한다. In addition, the microbacterium There is provided a method for producing Psychos using the genus strain. The method for producing Psicose is the microbacterium And reacting the genus strain with fructose.
일 구체예에서, 상기 마이크로박테리움 속 균주를 과당과 반응시키는 단계는 상기 마이크로박테리움 속 균주의 균체를 과당이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. In one embodiment, the microbacterium The step of reacting the genus strain with fructose is the microbacterium It can be carried out by culturing the cells of the genus strain in a culture medium containing fructose.
다른 구체예에서, 상기 마이크로박테리움 속 균주를 과당과 반응시키는 단계는 상기 균주(균체, 균주의 배양물, 및/또는 균주의 파쇄물)를 과당과 접촉시키는 단계, 예컨대, 상기 균주를 과당과 혼합하는 단계 또는 상기 균주가 고정화된 담체에 과당을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이와 같이 마이크로박테리움 속 균주를 과당과 반응시킴으로써 과당을 사이코스로 전환하여 과당으로부터 사이코스를 생산할 수 있다.In another embodiment, the microbacterium The step of reacting the genus strain with fructose is a step of contacting the strain (cell, a culture of the strain, and/or a lysate of the strain) with fructose, for example, mixing the strain with fructose or a carrier on which the strain is immobilized. It can be carried out by the step of contacting the fructose. Microbacterium like this By reacting a strain of the genus with fructose, it is possible to convert fructose into psicose to produce psicose from fructose.
상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하여, 기질로서 사용되는 과당의 농도는 전체 반응물 기준으로 40 내지 75%(w/v), 45 내지 75%(w/v), 예컨대, 50 내지 75%(w/v)일 수 있다. 과당의 농도가 상기 범위보다 낮으면 경제성이 낮아지고, 상기 범위보다 높으면 과당이 잘 용해되지 않으므로, 과당의 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 상기 과당은 완충 용액 또는 물(예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다. In the method for producing psicose, for efficient psicose production, the concentration of fructose used as a substrate is 40 to 75% (w/v), 45 to 75% (w/v), for example, 50 To 75% (w/v). When the concentration of fructose is lower than the above range, economic efficiency is lowered, and when the concentration of fructose is higher than the above range, fructose is not easily dissolved. Therefore, the concentration of fructose is preferably within the above range. The fructose may be used as a buffer solution or a solution dissolved in water (eg, distilled water).
상기 사이코스 생산방법에 있어서, 상기 반응은 30℃ 이상, 예컨대 40℃ 이상의 온도 조건하에서 수행될 수 있다. 온도가 80℃ 이상이 되면 기질인 과당의 갈변 현상이 일어날 수 있으므로, 상기 반응은 40 내지 80℃, 예컨대, 50 내지 80℃, 60 내지 80℃, 또는 70 내지 80℃, 예를 들어, 75℃의 조건하에서 수행될 수 있다.In the method for producing Psychos, the reaction may be carried out under a temperature condition of 30° C. or higher, for example, 40° C. or higher. When the temperature is 80° C. or higher, browning of fructose as a substrate may occur, so the reaction is 40 to 80° C., for example, 50 to 80° C., 60 to 80° C., or 70 to 80° C., for example, 75° C. It can be carried out under the conditions of.
또한, 상기 반응은 pH 6.5 내지 9.0, 예컨대, pH 7.0 내지 9.0, pH 7.5 내지 9.0, pH 8.0 내지 9.0 또는 8.5 내지 9.0의 조건하에서 수행될 수 있다. 특히, pH 7.0 내지 8.0의 중성 pH 범위에서도 사이코스의 효율적인 생산이 가능하다. In addition, the reaction may be carried out under conditions of pH 6.5 to 9.0, for example, pH 7.0 to 9.0, pH 7.5 to 9.0, pH 8.0 to 9.0, or 8.5 to 9.0. In particular, efficient production of psicose is possible even in the neutral pH range of pH 7.0 to 8.0.
또한, 상기 사이코스 생산방법에 있어서, 상기 반응 시간은 길수록 사이코스 전환률이 높아진다. 예컨대, 상기 반응 시간은 1시간 이상, 예컨대 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상 또는 6시간 이상으로 하는 것이 좋다. 또한, 반응 시간이 48시간을 넘어가면 사이코스 전환률의 증가율이 미미하거나 오히려 감소하므로, 반응시간은 48시간을 넘기지 않는 것이 좋다. 따라서 상기 반응 시간은 1 내지 48시간, 2 내지 48시간, 3 내지 48시간, 4 내지 48시간, 5 내지 48시간, 또는 6 내지 48시간으로 할 수 있으며, 산업적 및 경제적 측면을 고려하여, 1 내지 48시간, 2 내지 36시간, 3 내지 24시간, 3 내지 12시간, 또는 3 내지 6시간 정도로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In addition, in the above method for producing psicose, the longer the reaction time, the higher the rate of psicose conversion. For example, the reaction time is preferably 1 hour or more, such as 2 hours or more, 3 hours or more, 4 hours or more, 5 hours or more, or 6 hours or more. In addition, if the reaction time exceeds 48 hours, the increase rate of the psychotic conversion rate is insignificant or rather decreases, so the reaction time should not exceed 48 hours. Therefore, the reaction time may be 1 to 48 hours, 2 to 48 hours, 3 to 48 hours, 4 to 48 hours, 5 to 48 hours, or 6 to 48 hours, considering industrial and economic aspects, 1 to It may be 48 hours, 2 to 36 hours, 3 to 24 hours, 3 to 12 hours, or 3 to 6 hours, but is not limited thereto.
상기 조건은 과당에서 사이코스로의 전환 효율이 최대화되는 조건으로서 선정된 것이다. The above conditions were selected as conditions in which the conversion efficiency of fructose to psicose is maximized.
또한, 상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 사용되는 마이크로박테리움 속 균주의 균체 농도는 전체 반응물 기준으로 5mg(dcw: 건조세포중량)/ml 이상, 예컨대, 5 내지 100mg(dcw)/ml, 10 내지 90mg(dcw)/ml, 20 내지 80mg(dcw)/ml, 30 내지 70mg(dcw)/ml, 40 내지 60mg(dcw)/ml, 또는 45 내지 55mg(dcw)/ml일 수 있다. 균체 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 사이코스 전환 활성이 낮거나 거의 없고, 상기 범위를 초과하면 균체가 너무 많아져서 사이코스 전환 반응의 전체적인 효율이 낮아지므로, 균체 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. In addition, in the method for producing psicose, the concentration of cells in the microbacterium genus strain used is 5 mg (dcw: dry cell weight)/ml or more, for example, 5 to 100 mg (dcw)/ml, 10 to It may be 90 mg (dcw) / ml, 20 to 80 mg (dcw) / ml, 30 to 70 mg (dcw) / ml, 40 to 60 mg (dcw) / ml, or 45 to 55 mg (dcw) / ml. When the cell concentration is less than the above range, there is little or no psicose conversion activity, and if it exceeds the above range, the number of cells becomes too large and the overall efficiency of the psicose conversion reaction is lowered. Therefore, the cell concentration is preferably in the above range.
상기 마이크로박테리움 속 균주가 생산하는 과당을 사이코스로 전환시키는 효소(예컨대, 에피머레이즈)는 금속 이온에 의하여 활성화가 조절될 수 있으므로, 상기 마이크로박테리움 속 균주를 이용한 사이코스 생산에 있어서, 금속 이온을 첨가하면 과당에서 사이코스로의 전환 효율, 즉 사이코스 생산율이 증가될 수 있다.remind Microbacterium Since the enzyme (e.g., epimerase) that converts fructose produced by the genus strain to psicose can be regulated by metal ions, the microbacterium In the production of psicose using the genus strain, the addition of metal ions can increase the conversion efficiency of fructose to psicose, that is, the rate of psicose production.
따라서, 상기 마이크로박테리움 속 균주를 포함하는 사이코스 생산용 조성물은 금속 이온을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 마이크로박테리움 속 균주를 이용한 사이코스 생산 방법은 금속 이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. Therefore, the microbacterium The composition for producing psicose containing the genus strain may be one further comprising a metal ion. In addition, the microbacterium The method for producing psicose using the genus strain may further include the step of adding a metal ion.
일 구현예에서, 상기 금속 이온은 상기 배양 단계의 배양 배지에 첨가되거나, 상기 배양 단계가 상기 금속 이온이 첨가된 배양 배지에서 수행되는 것일 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 금속 이온은 과당에 첨가되거나, 상기 마이크로박테리움 속 균주와 과당과의 혼합물에 첨가될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 마이크로박테리움 속 균주가 고정화된 담체에 첨가되거나(과당 첨가 전), 상기 마이크로박테리움 속 균주가 고정화된 담체와 과당과의 혼합물에 첨가되거나(과당 첨가 후), 또는 과당 첨가 시에 과당과 혼합물의 형태로 또는 각각 첨가될 수 있다.In one embodiment, the metal ions may be added to the culture medium of the culturing step, or the culturing step may be performed in a culture medium to which the metal ions are added. In another embodiment, the metal ion is added to fructose, or the microbacterium It can be added to a mixture of the genus strain and fructose. In another embodiment, the microbacterium The strain of the genus is added to the immobilized carrier (before the addition of fructose), or the microbacterium The genus strain may be added to a mixture of the immobilized carrier and fructose (after the addition of fructose), or may be added in the form of a mixture with fructose at the time of addition of fructose or, respectively.
상기 금속 이온은 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 니켈 이온, 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 금속 이온은 망간 이온, 마그네슘 이온, 니켈 이온, 코발트 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 일 예에서 상기 금속 이온은 망간 이온, 코발트 이온, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.The metal ions may be at least one selected from the group consisting of copper ions, manganese ions, calcium ions, magnesium ions, zinc ions, nickel ions, cobalt ions, iron ions, and aluminum ions. For example, the metal ions may be one or more selected from the group consisting of manganese ions, magnesium ions, nickel ions, cobalt ions, and the like, and in one example, the metal ions may be manganese ions, cobalt ions, or a mixture thereof.
금속 이온으로 망간 이온, 코발트 이온, 또는 이들의 혼합물이 존재하는 경우에는 사이코스 전환 활성이 금속 이온이 없는 경우에 비해 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 또는 2.3배 이상 증가하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 1.2 내지 2.3배 증가하는 것일 수 있다.When manganese ions, cobalt ions, or mixtures thereof are present as metal ions, the psicose conversion activity is 1.2 times, 1.3 times, 1.4 times, 1.5 times, 1.6 times, 1.7 times, 1.8 times compared to the case without metal ions. , It may increase 1.9 times, 2.0 times, 2.1 times, 2.2 times, or 2.3 times or more, for example, it may increase 1.2 to 2.3 times.
또한, 상기 금속 이온의 첨가량이 0.5mM 미만인 경우에는 사이코스 생산 수율 증진 효과가 미미하므로, 상기 금속 이온의 첨가량은 0.5mM 이상으로 할 수 있다. 한편, 상기 금속 이온의 첨가량이 5mM을 초과하면 그 초과량에 비하여 효과가 미미하기 때문에, 상기 금속 이온의 첨가량은 5mM 이하로 할 수 있다. 예컨대, 상기 금속 이온의 첨가량은 0.5mM 내지 5mM, 0.5mM 내지 4mM, 0.5mM 내지 3mM, 예컨대, 0.5 mM 내지 2mM 범위로 할 수 있다.In addition, when the amount of the metal ions added is less than 0.5 mM, the effect of improving the yield of psicose production is insignificant, and thus the amount of the metal ions added may be 0.5 mM or more. On the other hand, when the amount of the metal ions added exceeds 5 mM, the effect is insignificant compared to the excess amount, so the amount of the metal ions added may be 5 mM or less. For example, the amount of the metal ion added may be in the range of 0.5mM to 5mM, 0.5mM to 4mM, 0.5mM to 3mM, for example, 0.5mM to 2mM.
상기 담체는 고정된 균주, 또는 상기 균주로부터 생산되는 효소의 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성할 수 있는 것으로, 효소 고정화 용도로 사용할 수 있는 공지된 모든 담체일 수 있다. The carrier may be a fixed strain, or an environment in which the activity of an enzyme produced from the strain can be maintained for a long period of time, and may be any known carrier that can be used for enzyme immobilization.
예컨대, 상기 담체로서 알긴산나트륨(soduim alginate)을 사용할 수 있다. 알긴산나트륨은 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 천연 콜로이드성 다당류로, 만누로닉산(β-D-mannuronic acid)과 글루로닉산(α-L-gluronic acid)이 조성되어 있고, 함량 면에서는 무작위로 베타-1,4 결합을 이루어 형성되어, 균주 또는 효소가 안정적으로 고정되어 우수한 사이코스 수율을 나타내는 데 유리할 수 있다. For example, sodium alginate may be used as the carrier. Sodium alginate is a natural colloidal polysaccharide that is abundantly present in the cell wall of algae, and contains mannuronic acid (β-D-mannuronic acid) and gluronic acid (α-L-gluronic acid). It is formed by forming a beta-1,4 bond, so that a strain or an enzyme is stably immobilized, and it may be advantageous in showing an excellent psicose yield.
일 구체예에서, 사이코스의 수율을 보다 증진시키기 위하여 1.5 내지 4.0%(w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액(예컨대, 알긴산나트륨 수용액), 예컨대, 약 2.5%의 (w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액을 균주의 고정화에 사용할 수 있다. 예컨대, 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양액, 또는 상기 균주의 파쇄물의 1 내지 2 부피 배의 알긴산나트륨 수용액에 상기 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양물, 또는 상기 균주의 파쇄물을 첨가하여 혼합한 후, 상기 얻어진 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 약 0.2M 칼슘 이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 함으로써, 알긴산나트륨 담체에 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양물, 또는 상기 균주의 파쇄물이 고정화시킬 수 있다. 상기 효소는 상기 균주, 균주 배양물 또는 상기 균주의 파쇄물로부터 통상의 방법, 예컨대 투석, 침전, 흡착, 전기영동, 친화 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 등의 방법에 의하여 정제된 것일 수 있다.In one embodiment, in order to further improve the yield of psicose, a sodium alginate solution at a concentration of 1.5 to 4.0% (w/v) (e.g., an aqueous sodium alginate solution), for example, an alginic acid at a concentration of about 2.5% (w/v) Sodium solution can be used for immobilization of strains. For example, the cells of the strain, the culture medium containing the enzyme produced by the strain, or the cell of the strain in an aqueous solution of sodium alginate 1 to 2 times the volume of the lysate of the strain, a culture containing the enzyme produced by the strain, Alternatively, after the lysate of the strain is added and mixed, the obtained mixture is dropped into about 0.2M calcium ion solution using a syringe pump and a vacuum pump to generate beads, so that the bacterial cells of the strain and the strain are in the sodium alginate carrier. A culture containing the produced enzyme, or a lysate of the strain may be immobilized. The enzyme may be purified from the strain, strain culture, or lysate of the strain by conventional methods, such as dialysis, precipitation, adsorption, electrophoresis, affinity chromatography, ion exchange chromatography, and the like.
본 발명에서 제안되는 사이코스를 생산하는 방법은 완충 용액을 사용하지 않고 균체를 이용하여 과당을 사이코스로 전환하는 것이 가능하므로, 보다 간편한 방법으로 사이코스를 높은 수율로 생산할 수 있다는 장점이 있다. The method for producing psicose proposed in the present invention has the advantage that it is possible to convert fructose into psicose using cells without using a buffer solution, and thus, it is possible to produce psicose in a high yield by a simpler method.
본 발명은 신규 하게 분리된 마이크로박테리움 속 균주, 상기 균주를 포함하는 사이코스 생산용 조성물 및 이를 이용한 사이코스 생산방법에 관한 것으로, 본 발명의 마이크로박테리움 속 균주는 산업적으로 유용한 범위의 pH, 온도에서 안정성을 가지며, 과당으로부터 높은 수율로 사이코스를 생산하는 활성을 가지므로, 기능성 당 관련 건강식품 및 의약 산업에서 폭넓게 사용될 것으로 기대된다.The present invention relates to a newly isolated strain of the genus Microbacterium, a composition for producing psicose comprising the strain, and a method for producing psicose using the same, wherein the strain of the genus Microbacterium of the present invention has a pH in an industrially useful range, Since it has stability at temperature and has the activity of producing psicose in high yield from fructose, it is expected to be widely used in functional sugar-related health food and pharmaceutical industries.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 고농도 과당으로부터 사이코스가 생산된 것을 고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)으로 확인한 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 분리된 Microbacterium foliorum 균주의 온도에 따른 사이코스 생산 상대활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 분리된 Microbacterium foliorum 균주의 pH에 따른 사이코스 생산 상대활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 분리된 Microbacterium foliorum 균주의 금속 이온 종류에 따른 사이코스 생산 상대활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 분리된 Microbacterium foliorum 균주의 50 에서의 온도 안정성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 분리된 Microbacterium foliorum 균주의 고농도 기질반응 시 사이코스 생산성을 나타낸 그래프이다.1 is a graph showing a chromatogram confirmed by high-performance liquid chromatography (HPLC) that psicose was produced from high-concentration fructose in an embodiment of the present invention.
Figure 2 is a graph showing the relative activity of the production of psicose according to the temperature of the Microbacterium foliorum strain isolated in an embodiment of the present invention.
Figure 3 is a graph showing the relative activity of the production of psicose according to the pH of the Microbacterium foliorum strain isolated in an embodiment of the present invention.
Figure 4 is a graph showing the relative activity of the production of psicose according to the metal ion type of the Microbacterium foliorum strain isolated in an embodiment of the present invention.
5 is a graph showing the results of temperature stability analysis at 50 of the Microbacterium foliorum strain isolated in an embodiment of the present invention.
6 is a graph showing the productivity of the microbacterium foliorum isolated in an embodiment of the present invention during a high-concentration substrate reaction.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by the following examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예 1. 과당을 사이코스로 전환하는 식품 유래 미생물의 분리Example 1. Isolation of food-derived microorganisms that convert fructose to psicose
과당을 사이코스로 전환하는 균주를 분리하기 위해 1% (w/v) 사이코스가 첨가된 Mineral salt broth (KH2PO4 2.4 g/L, K2HPO4 5.6 g/L, (NH4)2SO4 2.6 g/L, MgSO47H2O 0.1 g/L, yeast extract 1 g/L)를 사용하였다. Mineral salt broth (KH 2 PO 4 2.4 g/L, K 2 HPO 4 5.6 g/L, (NH 4 ) added with 1% (w/v) psicose to isolate the strain that converts fructose into psicose, (NH 4) 2 SO 4 2.6 g/L, MgSO 4 7H 2 O 0.1 g/L, yeast extract 1 g/L) was used.
식품 (예를 들어, 브로콜리, 인삼, 식용꽃 등)을 선정하여, 각각의 식품을 1g을 채취하고 MSP broth에 첨가 후 30℃에서 24시간 배양하여 증균을 실시하였다. 그 다음, 배양액 100 μL(microliter)를 취해 한천 배지에 도말한 후 30℃에서 콜로니가 확인될 때까지 배양하였다. 상기 한천 배지에서 형성된 콜로니 중 모양과 크기가 다른 콜로니를 선별하여 MSP broth에 접종 후, 30℃에서 24시간 진탕배양하고 원심분리하여 균체만 회수하였다. 회수한 균체는 50 mM PIPES(piperazine-N, N'-bis(2-ethanesulfonic acid)) 완충용액(pH 7.0) 100 μL에 넣어 부유시키고, 음파진동기(Ultrasonic processor. ColepParmer)를 사용하여 파쇄하여 파쇄액을 수득하였다. 상기 파쇄액을 12,000rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리 후, 상등액을 회수하여 효소액(crude enzyme)으로 사용하였으며, 상기 효소액을 10 mM 과당 및 사이코스를 기질로 하여 30℃에서 12시간 동안 반응시켰다. Foods (eg, broccoli, ginseng, edible flowers, etc.) were selected, and 1 g of each food was collected, added to MSP broth, and cultured at 30° C. for 24 hours to perform enrichment. Then, 100 μL (microliter) of the culture solution was taken, spread on agar medium, and cultured at 30° C. until colonies were identified. Among the colonies formed in the agar medium, colonies of different shapes and sizes were selected, inoculated into MSP broth, cultured with shaking at 30° C. for 24 hours, and centrifuged to recover only the cells. The recovered cells are suspended by placing them in 100 μL of 50 mM PIPES (piperazine-N, N'-bis (2-ethanesulfonic acid)) buffer solution (pH 7.0), and crushed by crushing using an ultrasonic processor (ColepParmer). A liquid was obtained. The lysate was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes at 4° C., and the supernatant was recovered and used as a crude enzyme, and the enzyme solution was reacted at 30° C. for 12 hours using 10 mM fructose and psicose as substrates. Made it.
박층 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC) 분석을 통해 상기 반응액에서 사이코스가 과당으로 전환되었는지 확인하였다. 상기 박층 크로마토그래피 분석은 가로 20cm, 세로 10cm의 실리카겔(Silica gel 60F254(Merck, Germany)) 고정상과 아세토나이트릴(acetonitrile)과 물을 85:15 부비피로 혼합한 이동상 전개용매를 사용하여 10분간 3번씩 전개하여 수행하였다.Through thin layer chromatography (TLC) analysis, it was confirmed whether the picose was converted to fructose in the reaction solution. The thin-layer chromatography analysis was performed for 10 minutes using a mobile phase developing solvent in which a silica gel (Silica gel 60F254 (Merck, Germany)) of 20 cm in width and 10 cm in length was mixed with acetonitrile and water at 85:15. It was performed by deploying each time.
상기 TLC 분석을 통해 사이코스에서 과당으로 전환이 확인된 균주를 선별하여 0.1%(w/v) 사이코스가 첨가된 MS broth에 접종하여 30℃에서 24시간 진탕배양 하였으며, 원심분리 후 균체만 회수하였다. 회수한 균체는 0.85%(w/v) NaCl로 세척한 후, 400g/L 과당과 1mM 망간 이온을 첨가한 50mM PIPES 완충용액(pH 7.0)을 넣어 부유시키고, 70℃에서 1시간 동안 반응하였다. Through the TLC analysis, strains confirmed to be converted from psicose to fructose were selected, inoculated into MS broth to which 0.1% (w/v) psicose was added, and cultured with shaking at 30° C. for 24 hours, and only the cells were recovered after centrifugation. I did. The recovered cells were washed with 0.85% (w/v) NaCl, and then a 50mM PIPES buffer solution (pH 7.0) to which 400g/L fructose and 1mM manganese ions were added was added and suspended, and reacted at 70° C. for 1 hour.
그 다음, 상기 반응 결과물을 원심분리하여 상등액을 회수한 후 고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) 분석을 실시하였다. 상기 액체 크로마토그래피 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된 HPLC(Agilent, USA)의 RID(Refractive Index Detector, Agilent 1260 RID)를 이용하여 수행하였다. 이동상 용매는 물을 사용하였고 온도는 80℃, 유속은 0.6 mL/min로 하였다. 상기 얻어진 결과를 도 1에 나타내었고, 1500종의 균주 중에서 사이코스를 가장 많이 생산한 균주 1종을 최종 선정하였다.Then, the reaction product was centrifuged to recover the supernatant, and then high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis was performed. The liquid chromatography analysis was performed using a RID (Refractive Index Detector, Agilent 1260 RID) of HPLC (Agilent, USA) equipped with an Aminex HPX-87C column (BIO-RAD). Water was used as the mobile phase solvent, the temperature was 80°C, and the flow rate was 0.6 mL/min. The obtained results are shown in Fig. 1, and one strain that produced the most Psychos among the 1500 strains was finally selected.
실시예 2. 사이코스 전환균주의 동정Example 2. Identification of Psicos transforming strains
2-1. 균주 동정2-1. Strain identification
실시예 1에서 분리된 균주를 동정하기 위하여 16S 리보좀 RNA의 염기서열을 확인하였다. 분리 균주의 16S 리보좀 RNA의 염기서열(5'→3')은 서열번호 1과 같으며 Microbacterium foliorum DSM12966과 99.5% 동일함을 확인하였고, Microbacterium foliorum SYG27B로 명명하였다. 상기 균주는 2015년 9월 24일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM11774P를 부여받았다. In order to identify the strain isolated in Example 1, the nucleotide sequence of 16S ribosomal RNA was confirmed. 16S ribosomal DNA sequence of the RNA (5 '→ 3') of strain is the same as SEQ ID NO: 1 was confirmed that the same Microbacterium foliorum DSM12966 and 99.5%, was named Microbacterium foliorum SYG27B. The strain was deposited with the Korea Microbial Conservation Center on September 24, 2015, and was given the accession number KCCM11774P.
2-2. 동일 속 균주의 사이코스 전환 활성 2-2. Psychoswitching activity of strains of the same genus
실시예 1에서 사이코스 전환 활성을 나타내는 분리 균주 중, 16S 리보좀 RNA의 염기서열을 통해 Microbacterium 속으로 동정된 균주는 3종(M. foliorum, M. oxydans, M. phyllosphaerae)으로 나타났다. 이 중에서 브로콜리와 인삼에서 분리되는 것으로 알려져있어 안정성 면에서 우수할 것으로 생각되는 M. foliorum을 선정하여 이하의 실험을 실시하였다.Among the isolated strains exhibiting psicose conversion activity in Example 1, three strains were identified as Microbacterium genus through the base sequence of 16S ribosomal RNA (M. foliorum , M. oxydans , M. phyllosphaerae ). Among them, it is known to be separated from broccoli and ginseng, so M. The following experiment was performed by selecting foliorum.
실시예 3. 상기 균주의 균체반응을 이용한 최적조건 확립Example 3. Establishment of optimal conditions using the microbial reaction of the strain
상기에서 분리된 균주를 다양한 pH, 온도 및 금속이온 조건하에서 균체와 기질을 반응시키고 그에 따른 사이코스 전환 활성을 비교하였다. The strains isolated above were reacted with cells and substrates under various pH, temperature, and metal ion conditions, and the resulting psicosic conversion activity was compared.
3-1. 온도에 따른 활성 분석3-1. Activity analysis according to temperature
사이코스 생산 최적 온도를 확인하기 위하여, 400g/L 과당과 1mM 망간 금속이온을 첨가한 50 mM PIPES 완충용액(pH7.0)에 상기 실시예 1에서 분리된 균주의 균체 농도를 5mg(dcw)/mL로 하여, 55 내지 80℃ 범위에서 온도를 변화시키면서 1시간 동안 반응시키고, 반응 종료 후 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 HPLC 분석을 통하여 사이코스 생산량을 측정하였으며, 얻어진 결과를 도 2 및 표 1에 나타내었다. In order to confirm the optimum temperature for the production of psicose, the cell concentration of the strain isolated in Example 1 was 5 mg (dcw)/ As mL, the reaction was carried out for 1 hour while changing the temperature in the range of 55 to 80°C, and after completion of the reaction, the amount of psicose production was measured through HPLC analysis in the same manner as in Example 1, and the obtained results are shown in FIGS. 2 and 1 Shown in.
도 2 및 표 1에 나타난 바와 같이, Microbacterium foliorum SYG27B는, 75℃까지 반응 온도가 높아질수록 상대적 활성이 증가하였고, 80℃에서 감소함을 확인하였다. 또한, 상기 분리균주는 75 온도에서 최대 활성을 나타내는 것으로 나타났다. As shown in Figure 2 and Table 1, Microbacterium foliorum SYG27B, it was confirmed that the relative activity increased as the reaction temperature increased to 75°C, and decreased at 80°C. In addition, the isolates were found to exhibit maximum activity at 75 temperature.
3-2. pH에 따른 활성 분석3-2. Activity analysis according to pH
전환반응에서 pH 효과를 조사하기 위하여, 상기 실시예 1에서 분리된 균주의 균체 농도 5 mg/mL 및 과당 농도 400 g/L의 1mM 망간 이온을 첨가한 완충용액 McIlvaine(0.1 M citric acid와 0.2 M disodium hydrogen phosphate 용액을 pH별로 양을 다르게 첨가하여 제조하는 완충용액) pH 5.0 내지 9.0 범위를 각각 사용하여, 각 pH 조건에서 70℃에서 1시간 반응시키고, 반응 종료 후 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 HPLC 분석을 통하여 사이코스 생산량을 측정하고, 얻어진 결과를 도 3 및 표 2에 나타내었다. In order to investigate the pH effect in the conversion reaction, the buffer solution McIlvaine (0.1 M citric acid and 0.2 M A buffer solution prepared by adding different amounts of disodium hydrogen phosphate solution for each pH) Using a pH range of 5.0 to 9.0, reacting at 70° C. for 1 hour at each pH condition, and after completion of the reaction, in the same manner as in Example 1 Psychos production was measured through HPLC analysis, and the obtained results are shown in FIG. 3 and Table 2.
도 3 및 표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 얻어진 분리 균주인 Microbacterium foliorum SYG27B는, pH 6.5 내지 9.0 범위에서 높은 활성을 나타내었으며, 특히, pH 7.0 내지 8.0의 중성 pH 범위에서도 사이코스의 효율적인 생산이 가능함을 확인하였다. As shown in Figure 3 and Table 2, Microbacterium foliorum SYG27B, the isolated strain obtained in Example 1, exhibited high activity in the pH range of 6.5 to 9.0. It was confirmed that production is possible.
3-3. 금속이온에 따른 활성 분석3-3. Analysis of activity according to metal ions
금속이온 요구성을 확인하기 위하여, 400g/L 과당을 기질로 사용하고, 상기 실시예 1에서 분리된 균주의 균체 농도 5mg/mL, 70℃, 및 50mM PIPES 완충용액(pH 7.0)에 녹인 1mM 금속이온(CaCl2, CoCl2, CuCl2, FeSO4, MnCl2, NiSO4, ZnSO4) 용액을 각각 사용하여 1시간 동안 반응시키고 반응 종료 후, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 HPLC 분석을 통하여 사이코스 생산량을 측정하고, 얻어진 결과를 도 4 및 표 3에 나타내었다.In order to confirm the metal ion requirement, 400 g/L fructose was used as a substrate, and the cell concentration of the strain isolated in Example 1 was 5 mg/mL, 70° C., and 1 mM metal dissolved in a 50 mM PIPES buffer solution (pH 7.0). After reacting for 1 hour using ions (CaCl 2 , CoCl 2 , CuCl 2 , FeSO 4 , MnCl 2 , NiSO 4 , ZnSO 4 ) solution, respectively, after completion of the reaction, HPLC analysis was performed in the same manner as in Example 1. The production amount of the course was measured, and the obtained results are shown in Fig. 4 and Table 3.
도 4 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 금속이온은 첨가하지 않은 대조군(Non)과 비교하였을 때, 실시예 1에서 얻어진 Microbacterium foliorum SYG27B는, 망간(Mn) 이온과 코발트(Co) 이온을 첨가한 경우에 대조군에 비해서 더 높은 사이코스 전환 활성을 나타내었다.As shown in Figure 4 and Table 3, when compared to the control (Non) to which no metal ions were added, Microbacterium foliorum SYG27B obtained in Example 1 was added with manganese (Mn) ions and cobalt (Co) ions. In comparison to the control group showed a higher psicose conversion activity.
실시예 4. 사이코스 대량생산을 위한 조건Example 4. Conditions for mass production of Psychos
4-1. 균체의 온도 안정성 분석4-1. Temperature stability analysis of cells
상기 분리된 균주의 온도 안정성을 확인하기 위해, 상기 실시예 1에서 분리된 균체를 1 mM 망간 이온을 첨가한 50 mM PIPES 완충용액(pH 7.0)으로 부유시키고, 36시간 동안 50℃의 열충격을 가하였다. 그 다음, 최종 과당 농도 400g/L, 균체 농도 5 mg/mL로 하고, 70℃에서 1시간 반응시킨 후 열충격이 가해진 시간별 사이코스 생산량을 HPLC 분석을 통하여 측정하여 얻어진 결과를 도 5 및 표 4에 나타내었다.In order to check the temperature stability of the isolated strain, the cells isolated in Example 1 were suspended in a 50 mM PIPES buffer solution (pH 7.0) to which 1 mM manganese ion was added, and a thermal shock of 50° C. was applied for 36 hours. I did. Then, the final fructose concentration was 400 g/L and the cell body concentration was 5 mg/mL, and after reacting at 70° C. for 1 hour, the result obtained by measuring the amount of time-wise psicose production to which a thermal shock was applied through HPLC analysis was obtained. Indicated.
도 5 및 표 4에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 얻어진 Microbacterium foliorum SYG27B에 대해 50℃에서 열충격을 가한 경우, 열충격을 가하지 않은 경우의 사이코스 전환 활성을 비교하였을 때, 반감기(half-life)는 약 28시간으로 나타났다.As shown in Fig. 5 and Table 4, when heat shock was applied at 50° C. to Microbacterium foliorum SYG27B obtained in Example 1, when comparing the pyogenic conversion activity when no heat shock was applied, the half-life was It appeared to be about 28 hours.
4-2. 사이코스 생산성4-2. Psychos productivity
상기에서 확립된 사이코스 대량생산 조건하에서, 반응 시간에 따른 최대 생산성을 확인하였다. 상기 실시예 1에서 분리된 균주의 균체 농도 20mg/mL, 과당 농도 400g/L 온도 70℃ 및 pH 7.0 조건하에서 반응 시간별 활성을 확인하였다. 상기 반응은 12시간 동안 진행하였으며, 2시간 간격으로 사이코스 생산성을 HPLC 분석을 통하여 확인하였다. 그 결과를 도 6 및 표 5에 나타내었다.Under the conditions for mass production of psicose established above, the maximum productivity according to the reaction time was confirmed. The activity of the strain isolated in Example 1 was confirmed by reaction time under conditions of a cell concentration of 20 mg/mL, a fructose concentration of 400 g/L, a temperature of 70° C., and a pH of 7.0. The reaction proceeded for 12 hours, and the productivity of the psicose was confirmed through HPLC analysis at intervals of 2 hours. The results are shown in Fig. 6 and Table 5.
도 6 및 표 5에 나타난 바와 같이, Microbacterium foliorum SYG27B는 반응 시간이 지날수록 사이코스 전환율이 증가하였으며, 특히 70℃에서 12시간 반응 후 사이코스 전환율이 약 27%로 최대로 나타내었으며, 이때 사이코스 생산량은 약 75g/L로 확인되었다.As shown in Figure 6 and Table 5, Microbacterium foliorum SYG27B increased the rate of psicose conversion as the reaction time elapsed, and in particular, after 12 hours reaction at 70° C., the rate of psicose conversion was shown at a maximum of about 27%. The production was confirmed to be about 75g/L.
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)Name of deposit institution: Korea Microorganism Conservation Center (overseas)
수탁번호 : KCCM11774PAccession number: KCCM11774P
수탁일자 : 20150924Consignment date: 20150924
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