KR20190004677A

KR20190004677A - 항균 화장용 퍼프의 신속한 합성을 위한 생체적합성 조성물 및 그의 제조 방법

Info

Publication number: KR20190004677A
Application number: KR1020180077762A
Authority: KR
Inventors: 김용태; 이상재; 조세희
Original assignee: 주식회사 바이오빛
Priority date: 2017-07-04
Filing date: 2018-07-04
Publication date: 2019-01-14
Also published as: KR101950009B1; WO2019009626A1; CN110868886A

Abstract

본 발명은 화장용 퍼프를 항균 접착 단백질로 신속하게 코팅할 수 있는 생체적합성 코팅 조성물 및 이를 포함하는 화장용 퍼프를 제공한다. 강하게 부착된 항균 단백질은 화장용 퍼프에 항균 기능을 부여하며, 그 항균 활성은 6개월에 걸쳐 지속된다. 본 발명은 또한 생체적합성 조성물 내의 항균 접착 단백질로 화장용 퍼프를 신속하게 코팅하는 방법을 개시한다.

Description

항균 화장용 퍼프의 신속한 합성을 위한 생체적합성 조성물 및 그의 제조 방법{Biocompatible Composition for Rapid Synthesis of Antimicrobial Cosmetic Puff and Method for Preparation thereof}

본 발명은 습한 환경에서 사용된 후 사용 및 보관하는 동안에 퍼프에서의 미생물의 성장을 방지하는 항균 특성을 갖는 화장용 퍼프에 관한 것이다.

다양한 물질로 제조된 화장용 퍼프가 알려져 있으며, 이들 중에서 피부에 부드럽고 편안한 화장용 퍼프가 선호된다. 이러한 화장용 퍼프의 예로는 폴리에스테르 벨벳이나 폴리에스테르 트리코 파일 및 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트로 제조된 것들을 포함한다(특허문헌 1 내지 특허문헌 3). 퍼프는 일반적으로 벨루어, 스폰지 등으로 제조되며, 특히 어플리케이터, 화장용 콤팩트, 파우더 및 파운데이션에 사용하기 위해 제조된다.

화장용 퍼프는 화장품 용기로부터 화장품, 주로 파우더 화장품을 긁어내고, 긁어낸 화장품을 퍼프가 적용되는 피부 표면으로 전달하기 위해 사용된다. 이 경우, 긁어내어 퍼프 표면에 부착된 화장품을 피부 표면에 가능한 많이 전달하는 것이 필요하다.

화장용 파우더는 때때로 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 애루지노사(Psuedomonas aeruginosa), 클로스트리디움 테타나이(Clostridium tetani), 효모 및 곰팡이와 같은 미생물에 오염되며, 상기 미생물들은 원료 물질이나 화장품의 제조, 가공, 화장품 용기의 깨어짐 또는 손상으로부터, 또는 먼지로 인해 소매 시장에서, 및 제품의 사용 중에 유래된다(비특허문헌 1).

사실, 사람들은 매 순간 화장을 손질하고, 이로 인해 피부 상의 모든 더럽고 작은 미생물들이 제품 내로 전달된다. 이는 브러시나 스폰지 어플리케이터의 경우에도 마찬가지이며, 이들 미생물들은 모두 필연적으로 화장품 내로 들어갈 것이다. 또한, 상기와 같이 세균에 오염된 화장품은 입, 눈, 또는 임의의 손상된 피부 내로 침투될 수 있다.

상기 미생물 오염으로부터 제품과 신체를 보호하기 위하여, 은의 항균 특성을 이용해 은 나노입자를 포함하는 은 기반의 항균제가 화장품 제품에 가장 널리 사용되고 있다. 예를 들면, 은 나노입자는 붕대나 직물, 그리고 가정용 물품과 같은 의료용 제품 내에 포함된다. 화장용 어플리케이터의 경우, 일부 대한민국 특허 문헌에서 은 기반의 화장용 퍼프를 개시하고 있다(특허문헌 4 및 특허문헌 5).

그러나, 은 나노입자와 같은 은 화합물은 많은 상이한 종에서 독성을 유도하는 것으로 알려져 있고, 은에 만성적으로 노출되면 사람에게 은중독 및/또는 은중독증을 일으키는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 2).

또한, 항균 접착 단백질 기반의 코팅 조성물이 특허 문헌에 개시되어 있다(특허문헌 6). 그러나, DOPA(3,4-dihydroxyphenylalanine)-매개성 부착은 신체 조직에 독성이 있는 산화제를 사용하지 않을 경우에는 일반적으로 적어도 6시간의 오랜 접촉 시간을 필요로 한다. DOPA-함유 화합물의 빠른 경화를 위해서는 버퍼 또는 용매의 pH가 강염기가 되어야만 하는데, 이 또한 신체 조직을 위해서는 바람직하지 않다.

이러한 이유로, 화장용 퍼프에 사용하기 위한 신규하고 독성이 거의 없거나 덜한 경화성의 항균제에 대한 필요성이 있다. 본 발명자들은 천연 항균 펩티드를 천연 접착 단백질 내로 재조합적으로 포함시킴으로써 독성 문제를 해결할 수 있음을 발견하였다. 상기 항균 접착 단백질의 자가-부착성은 빠른 코팅이나 부착을 위하여 가교제와 같은 임의의 화학물질이 필요하지 않을 수 있다.

일본 공개특허공보 특개11-000224호 일본 공개특허공보 제2004-033432호 미국 공개특허공보 제2015/0173485호 대한민국 등록특허공보 제10-1750832호 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0137442호 대한민국 등록특허공보 제10-1652263호

Michael Macvren Dashen, et al., Microbiological quality assessment of some brands of cosmetics powders sold within Jos Metropolis, Plateau State. J. Microbiol. Biotech. Res., 2011, 1 (2): 101-106 ChristianeBeer, et al., Toxicity of silver nanoparticles - Nanoparticle or silver ion? Toxicology Letters Volume 208, Issue 3 (5) 2012, 86-292

본 발명의 과제는 인체에 무해하고, 피부 독성 및 트러블을 원천차단하며, 세균 및 곰팡이의 성장을 억제하는 천연 항균 펩티드가 포함된 접착 단백질을 포함하는 코팅 조성물 및 상기 코팅 조성물로 코팅된 화장용 퍼프를 제공하는 것이다.

본 발명의 한 측면에서, 본 발명은 버퍼 용액 및 항균 펩티드로 재조합적으로 기능화된 천연 접착 단백질을 포함하는 코팅 조성물을 제공한다.

본 발명의 한 구현예에서, 상기 버퍼 용액은 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올과 같은 저급 알코올일 수 있다. 이들 중, 에탄올이 보다 바람직하다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 상기 버퍼 용액 내에서 알코올 대 물의 중량 비는 1:9 내지 9:1의 범위일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 코팅 조성물 내의 버퍼 용액은 10 내지 100 mM 농도의 염을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 염은 무기염 또는 유기염일 수 있다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 무기염은 나트륨 아세테이트, 나트륨 카보네이트, 나트륨 바이카보네이트, 나트륨 포스페이트, 나트륨 히드록사이드, 칼륨 아세테이트, 칼륨 카보네이트, 칼륨 바이카보네이트, 칼륨 포스페이트 또는 칼륨 히드록사이드일 수 있고, 상기 유기염은 Tris, Bis-Tris, MES, PIPES, MOPS 또는 HEPES일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 코팅 조성물 내의 천연 접착 단백질은 따개비 유래 접착 단백질, 콜라겐, 피브린 또는 홍합 유래 접착 단백질일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 홍합 유래 접착 단백질은 서열번호 13 또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 홍합 유래 접착 단백질은 티로시나아제로 전처리되어 티로신 잔기가 DOPA 잔기로 전환될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 코팅 조성물 내의 항균 펩티드는 KLWKKWAKKWLKLWKA(서열번호 16), FALALKALKKL(서열번호 17), ILRWPWWPWRRK(서열번호 18), AKRHHGYKRKFH(서열번호 19), KWKLFKKIGAVLKVL(서열번호 20), LVKLVAGIKKFLKWK(서열번호 21), IWSILAPLGTTLVKLVAGIGQQKRK(서열번호 22), GIGAVLKVLTTGLPALISWI(서열번호 23), SWLSKTAKKGAVLKVL(서열번호 24), KKLFKKILKYL(서열번호 25), GLKKLISWIKRAAQQG(서열번호 26) 또는 GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR(서열번호 27)일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 코팅 조성물을 포함하는 화장용 퍼프를 제공한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 화장용 퍼프는 폴리우레탄(PUR), 아크릴로니트릴 부타디엔 고무(NBR), 스티렌-부타디엔 고무(SBR), 천연 고무(NR), 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 에틸렌-비닐 아세테이트 부틸 고무(EVA), 라텍스, 실리콘, 스티렌-이소프렌-스티렌(SIS), 스티렌-에틸렌-부틸렌-스티렌(SEBS), 폴리비닐 알코올(PVA), 니트릴 고무, 부틸 고무, 클로로프렌 고무 또는 이들의 조합으로부터 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 코팅 조성물로 코팅된 화장용 퍼프의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 a) 항균 펩티드를 포함하는 본 발명의 코팅 조성물을 제공하는 단계; b) 상기 코팅 조성물을 화장용 퍼프의 표면에 적용하는 단계; 및 c) 상기 항균 펩티드가 코팅된 화장용 퍼프를 건조하는 단계를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 상기 코팅 조성물 내의 항균 펩티드의 농도는 0.01 내지 0.2 ㎎/㎖의 범위가 바람직하고, 0.02 내지 0.1 ㎎/㎖의 범위가 보다 바람직하다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 건조는 60℃에서 수행될 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, 화장용 퍼프를 위한 신규한 항균 코팅제 및 상기 항균 코팅제로 코팅된 화장용 퍼프의 제조 방법이 제공되며, 상기 항균 펩티드는 사람의 혈액 또는 개구리의 피부로부터 유래될 수 있다.

DOPA를 함유하는 접착제, 예컨대 홍합 접착 단백질 또는 폴리도파민에 대한 종래 기술은 경화를 촉진하기 위하여 적어도 8 이상의 높은 pH 및 과산화제와 같은 경화제의 첨가를 필요로 하며, 그렇지 않을 경우 코팅 또는 부착을 위해 적어도 10시간 이상이 필요하다. 본 발명은 pH를 조정하거나 경화를 촉진하기 위한 어떠한 제제의 사용없이 화장용 퍼프를 코팅하기 위한 접착 조성물 및 방법을 제공한다.

제1 측면에서, 본 발명은 항균 접착 단백질을 포함하는 항균 코팅 조성물을 제공하며, 상기 항균 접착 단백질은 상기 접착 단백질 백본(backbone) 내에 적어도 1 몰%의 카테콜기를 함유할 수 있다.

제2 측면에서, 본 발명은 화장용 퍼프의 표면에 항균 접착 코팅을 적용하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 항균 접착 단백질의 용액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계; b) 상기 조성물을 코팅되는 표면에 적용하여 상기 표면에 항균 접착제 코팅을 얻는 단계; 및 c) 상기 접착 코팅을 건조하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 상기 조성물 내의 항균 펩티드의 농도는 0.01 내지 0.2 ㎎/㎖의 범위가 바람직하고, 0.02 내지 0.1 ㎎/㎖의 범위가 보다 바람직하다.

본 발명의 항균 기능성 펩티드가 부가된 접착 단백질을 포함하는 코팅 조성물은 화장용 퍼프의 표면에 안정적으로 코팅되어 항균, 항바이러스, 항마찰대전성 등 다양한 기능성을 확보할 수 있는 효과가 있다. 특히, 본 발명의 코팅 조성물 및 상기 코팅 조성물을 포함하는 화장용 퍼프는 홍합이나 따개비 등으로부터 유래되는 접착 단백질의 강력한 접착력을 바탕으로 항균성, 항마찰대전성 등 일상생활에 필수적인 기능성이 지속적으로 유지됨으로써, 종래에 사용되는 유무기 항균제에서 발생할 수 있는 첨가제의 용출에 의한 항균력 감소 등의 현상을 방지할 수 있다.

도 1은 항균 접착 단백질과 L-도파민의 신속한 항균 코팅을 보여주는 개략도이다.
도 2a 및 도 2b는 항균 접착 단백질이 다양한 농도로 용해되어 있는 알코올 함유 버퍼 용액으로부터 항균 코팅된 표면의 항균 활성을 나타낸다. 상기 항균 코팅된 표면에서의 대장균(도 2a) 및 스타필로코커스 아우레우스(도 2b)의 성장이 완벽하게 억제되었다.
도 3은 항균 코팅된 화장용 퍼프를 나타낸다. 항균 코팅된 표면과 대조군 샘플의 외형상의 변화는 관찰되지 않았다.
도 4는 항균 접착 단백질 코팅된 표면의 항균 효능을 나타낸다. 상기 코팅은 도파민의 첨가에 의해 촉진되었으며, 항균 효과는 L-DOPA에 의해 영향을 받지 않았다.
도 5는 지속성 테스트 결과를 나타낸다. 본 발명의 항균 접착 단백질 코팅된 퍼프(B)는 시판되는 항균 화장용 퍼프(C)와 비교할 때 3 내지 10회의 물세탁 하에서 뛰어난 장기 항균 활성을 보여주었다.

본 발명은 항균 화장용 퍼프를 위한 항균 접착 단백질 코팅 조성물과 직접적으로 연관되며, 상기 항균 접착 단백질은 천연 또는 합성 항균 펩티드로 재조합적으로 기능화된 천연 접착 단백질을 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 천연 접착 단백질은 홍합 접착 단백질, 따개비 접착 단백질, 피브린 또는 콜라겐으로부터 유래될 수 있다. 종래 기술과는 다른 자기-접착성으로 인하여, 본 발명은 화장용 퍼프의 코팅을 위하여 임의의 화학물질을 필요로 하지 않을 수 있다.

본 발명에 있어서, 추출된 또는 재조합 따개비 접착 단백질, 콜라겐, 피브린 또는 홍합 접착 단백질을 비제한적으로 포함하는 임의의 적합한 접착 단백질이 상기 접착 단백질로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 단백질은 재조합 홍합 접착 단백질이다.

임의의 적합한 재조합 홍합 접착 단백질이 본 발명에 사용될 수 있다. 시판되는 기질 단백질의 예는 콜로디스 바이오사이언스, 인코포레이티드(North Augusta, SC, USA)에 의해 판매되는 MAPTrix™ 또는 주식회사 바이오빛에 의해 판매되는 BV AMP를 포함한다. 선택적인 제3 성분은 생체적합성 폴리머(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리비닐알코올)이며, 코팅 공정을 향상시키기 위해 상기 조성물에 첨가되어 물리적 또는 기계적 특성, 예를 들면, 점도와 같은 물리기계적 특징을 향상시킬 수 있다.

콜로디스 바이오사이언스, 인코포레이티드(North Augusta, SC, USA)에 의해 개발된 사전 디자인된 홍합 접착 단백질인 MAPTrix™ 또는 따개비 기반의 접착 단백질은 소수성 또는 친수성 표면 코팅용으로 적합하다. 상기 사전-디자인된 MAPTrix™은 표면 코팅용으로 매우 유리한데, 그 이유는 그 분자 백본에 소수성 및 친수성 도메인이 교대로 존재하기 때문이다. 본 출원인의 BV AMP는 항균 펩티드로 재조합적으로 기능화된 양친매성 접착 단백질에 기반한다.

최근, 본 발명자들은 항균 접착 단백질이 코팅된 직물 및 화장용 퍼프를 개발하고 상기 직물 및 화장용 퍼프 표면의 미생물의 성장을 억제하는 능력을 테스트하였다(그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 대한민국 특허 출원 제2017-0084822 및 미국 특허 출원 제15/953,055호 참조).

상기 MAPTrix™은 서열번호 8 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 홍합 족사 단백질(foot protein) FP-5 또는 서열번호 15의 따개비 유래의 접착 단백질의 제1 펩티드 및 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 홍합 FP-1, 서열번호 4의 홍합 FP-2, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 홍합 FP-3, 서열번호 7의 홍합 FP-4, 서열번호 12의 홍합 FP-6 및 그의 절편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제2 펩티드를 포함하는 융합 단백질이며, 상기 제2 펩티드는 상기 FP-5의 C-말단, N-말단 또는 C- 및 N-말단 모두에 결합된다. 바람직하게는, 상기 제2 펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 FP-1이다. 보다 바람직하게는, 상기 융합된 홍합 접착 단백질은 서열번호 13 또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다. 강한 접착을 위하여 상기 재조합 홍합 접착 단백질은 티로시나아제로 처리되어 티로신 잔기를 DOPA 잔기로 전환시킬 수 있다. 티로신 잔기를 DOPA로 전환시키기 위하여, 상기 재조합 홍합 접착 단백질은 0.1 M 아스코르브산을 함유하는 0.1 M 나트륨 아세테이트 버퍼, pH 5.5 내에 0.1 ㎎/㎖으로 용해될 수 있다. 버섯 티로시나아제가 150 U/㎖의 최종 농도로 첨가되고, 상기 혼합물은 산소 조건 하에 300 rpm으로 1시간 동안 인큐베이션된다. 효소 활성은 전술한 것과 같이 반응액의 밀리리터 당 0.2 ㎖의 6 N HCl을 첨가함으로써 중단된다(DS Hwang, et al, Appl Environ Microbiol. 2004; 70(6): 3352-3359).

살아있는 유기체로부터 유래되거나 합성 디자인된 임의의 적합한 항균 펩티드가 본 발명에서 사용될 수 있다. 대부분의 합성 또는 자연형 항균 펩티드는 전체적으로 양이온성으로서, 일부 예의 경우에는 순전하(net charge)가 +9만큼 높다. 항균 펩티드의 혼합된 양이온성 및 소수성 조성물은 전형적으로 포스파티딜글리세롤 또는 카디올리핀과 같은 지질이 풍부하여 음이온성 표면이 제공되는 미생물의 세포막과 상호작용하여 이들을 교란시키기에 매우 적합하다(William C. Wimley, Describing the Mechanism of Antimicrobial Peptide Action with the Interfacial Activity Model, ACS Chem Biol. 2010; 5(10): 905-917).

정전기적 상호작용의 기여로 인하여, 미생물 막에 대한 항균 펩티드의 결합은 현저하지만, 동물의 세포질의 중성 포스파티딜콜린/콜레스테롤/스핑고마이엘린-풍부 표면에 대한 항균 펩티드의 결합은 약하다. AMP와 1시간 이상 접촉한 후, 미생물의 세포질막 구조가 전체적으로 파괴된다.

본 발명은 화장용 퍼프를 위한 항균 접착 단백질 코팅 조성물을 제공하며, 이로 인해 은 나노입자 또는 항생제와 같은 임의의 추가적인 항균제를 사용하지 않고도 미생물 오염이 충분히 저해된다. 미생물 오염은 화장용 퍼프와 같은 화장용 어댑터(adaptor)에서 주요한 문제이다. 오염은 사용자나 그 주변 환경으로부터 기인될 수 있다. 항균 접착 단백질이 코팅된 표면은 사람의 세포막에는 작용하지 않고 미생물의 막 표면에만 작용하는 항균 펩티드를 제공함으로써 이러한 종류의 미생물 오염을 방지할 수 있다. 상기 항균 코팅 조성물은 접착 단백질로서 상기 접착 단백질의 C-말단, N-말단, 또는 C- 및 N-말단 모두에 재조합적으로 포함될 수 있는 하나 또는 2개의 항균 펩티드로 기능화된 홍합 접착 단백질을 포함한다. 상기 항균 펩티드는 KLWKKWAKKWLKLWKA(서열번호 16), FALALKALKKL(서열번호 17), ILRWPWWPWRRK(서열번호 18), AKRHHGYKRKFH(서열번호 19), KWKLFKKIGAVLKVL(서열번호 20), LVKLVAGIKKFLKWK(서열번호 21), IWSILAPLGTTLVKLVAGIGQQKRK(서열번호 22), GIGAVLKVLTTGLPALISWI(서열번호 23), SWLSKTAKKGAVLKVL(서열번호 24), KKLFKKILKYL(서열번호 25), GLKKLISWIKRAAQQG(서열번호 26), 또는 GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR(서열번호 27)로부터 선택될 수 있다.

한 구현예에서, 화장용 퍼프 표면의 세균의 성장을 억제하기 위하여 항균 화장용 퍼프를 위한 항균 펩티드 KLWKKWAKKWLKLWKA(서열번호 16)로 기능화된 홍합 접착 단백질을 포함하는 코팅 조성물이 제공된다. 다른 구현예에서, 화장용 퍼프 표면의 넓은 범위의 세균의 성장을 억제하기 위하여 항균 화장용 퍼프를 위한 항균 펩티드 KLWKKWAKKWLKLWKA(서열번호 16) 및 AKRHHGYKRKFH(서열번호 19)로 각각 기능화된 홍합 접착 단백질을 포함하는 코팅 조성물이 제공된다.

상기 항균 접착 단백질의 제조 방법은 PCT/KR2016/008677, KR 10-2015-0179898 및 PCT/KR2017/002980 특허 출원에 개시되어 있으며, 그 전체 내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명은 추가로 화장용 퍼프를 위한 항균 코팅 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 항균 접착 단백질로 코팅된 항균 화장용 퍼프가 제공된다. 상기 항균 코팅 조성물은 폴리우레탄(PUR), 아크릴로니트릴 부타디엔 고무(NBR), 스티렌-부타디엔 고무(SBR), 천연 고무(NR), 스티렌-이소프렌-스티렌(SIS), 스티렌-에틸렌-부틸렌-스티렌(SEBS), 폴리비닐 알코올, 니트릴 고무, 부틸 고무, 클로로프렌 고무 또는 이들의 조합으로부터 제조되는 임의의 화장용 퍼프에 적용될 수 있다.

본 발명의 한 구현예에서, 항균 접착 단백질을 포함하는 조성물의 자가-경화를 위한 방법이 제공된다. 항균 홍합 접착 단백질은 효소적으로 처리되어 티로신 잔기를 DOPA 잔기로 전환시킬 수 있고, 이를 동결건조한 후, DOPA를 함유하는 항균접착 단백질을 0.1 내지 3 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 0.3 중량%의 농도로 증류수에 용해시킬 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, pH와 무관하게 항균 접착 단백질을 포함하는 조성물의 빠른 경화를 위한 방법이 제공된다.

종래 기술에서, DOPA를 함유하는 폴리머 또는 단백질의 pH가 약 5 이상으로 상승할 때, 도파퀴논으로의 DOPA의 자가-산화(auto-oxidation)가 달성되고, 상기 자가-산화는 pH가 높아질수록 더 빨라짐이 잘 알려져 있다. DOPA를 함유하는 접착 단백질 기반의 조성물에서, 낮은 pH는 접착제의 경화를 너무 느리게 한다. 상기 접착제의 경화 속도를 증가시키기 위한 종래의 전략은 pH를 올리거나(WO 2003/051418), pH를 낮추고 농축된 용액을 사용하거나(WO 2004/005421), 퍼아이오데이트(periodate) 이온을 첨가하는 것이다(WO 2003/080137).

종래의 기술에 있어서 홍합 접착 단백질에 기반한 폴리도파민 코팅은 pH 8.5의 버퍼화된 폴리도파민 용액에서 제조되었다. 폴리도파민에서 다양한 기질을 코팅하는 인큐베이션 시간은 약 18시간으로서 매우 비효율적이었다(Sileika et al, Antibacterial performance of polydopamine-modified polymer surfaces coating passive and active component, ACS Appl. Mater. Interfaces, 2011, 3(12), 4602-4610). 빠른 경화를 위하여, 온도가 20℃에서 60℃로 증가할 때 도파민의 자가-중합 속도가 증가하였다(Zhou P, et al, (2014) Rapidly-deposited polydopamine coating via high temperature and vigorous stirring: formation, characterization and biofunctional evaluation. PLoS ONE 9(11):e113087).

빠른 경화를 위하여, 상기 버퍼는 가교결합 반응을 위해 DOPA가 도파퀴논으로의 자가-산화를 촉진하기 위하여 신속하게 증발될 필요가 있다. 버퍼 용액이 증발하면, 농축된 DOPA 함유 용액이 얻어진다. 또한, 농축된 DOPA 함유 용액을 가열하면 신속하게 경화될 수 있다.

임의의 알코올 함유 버퍼가 빠른 증발을 위한 항균 접착 단백질 코팅 조성물의 제조를 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 저급 알코올, 예컨대 에탄올, 프로판올, 이소프로필 알코올 등이 본 발명에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 화장용 퍼프를 신속하게 코팅하기 위하여 항균 접착 단백질 코팅 조성물의 제조에 에탄올을 함유하는 버퍼가 사용된다. 상기 알코올의 백분율은 10% 내지 90%의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 상기 에탄올 함량은 상기 버퍼 내에서 50% 내지 70% 범위이다. 한 구현예에서, 30분 내에 코팅되는 화장용 퍼프를 제조하기 위하여 70% 에탄올 버퍼에 용해된 0.05 ㎎의 항균 접착 단백질을 포함하는 항균 조성물이 제공된다. 60℃까지 가열될 때, 상기 화장용 퍼프를 코팅하기 위한 인큐베이션 시간은 항균 활성의 손실없이 5분으로 감소된다.

본 발명은 코팅 조성물로서 나트륨 아세테이트 또는 나트륨 바이카보네이트 기반의 버퍼와 같은 나트륨 염을 포함하는 버퍼화된 항균 접착 단백질을 제공하며, 상기 항균 접착 단백질은 0.02 내지 0.1 ㎎/㎖의 농도로 용해된다.

본 발명은 또한 항균 코팅을 촉진할 수 있는 적어도 하나의 염을 포함하는 알코올-함유 버퍼 용액을 제공한다. 나트륨 아세테이트와 같은 일부 염은 홍합 접착 단백질의 응집을 초래하여 화장용 퍼프의 표면에 코팅되는 나노규모 내지 마이크로규모의 입자를 형성한다. 코팅 용액의 빠른 증발은 상기 항균 접착 단백질 입자가 상기 화장용 퍼프의 표면에 신속하게 코팅되도록 한다. 상기 염은 나트륨 아세테이트(CH₃COONa), 나트륨 바이카보네이트(NaHCO₃), 나트륨 카보네이트(Na₂CO₃), 나트륨 포스페이트(Na₃PO₄), 나트륨 히드록사이드(NaOH), 칼륨 아세테이트, 칼륨 카보네이트, 칼륨 바이카보네이트, 칼륨 포스페이트 및 칼륨 히드록사이드로부터 선택될 수 있다. 한 구현예에서, 상기 항균 접착 단백질의 농도는 상기 코팅 조성물에서 0.02 내지 0.1 ㎎/㎖ 사이이고, 상기 항균 접착 단백질은 10 mM 나트륨 아세테이트 버퍼에서 50 중량% 에탄올 내에 용해된다.

본 발명은 염 기반의 버퍼 또는 알코올 함유 버퍼 내에 용해되는 항균 접착 단백질 및 L-도파민을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 한 구현예에서, L-도파민은 항균 접착 단백질 용액에 용해되며, 상기 L-도파민의 농도는 0.0001 내지 0.2 ㎎/㎖의 범위, 바람직하게는 0.001 내지 0.1 ㎎/㎖의 범위이다.

본 발명은 화장용 퍼프의 표면에 항균 접착 단백질 코팅을 적용하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:

a) 알코올 버퍼에 용해된 항균 접착 단백질을 포함하는 항균 코팅 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 조성물 내의 항균 접착 단백질의 농도는 바람직하게는 0.01 내지 0.2 ㎎/㎖, 보다 바람직하게는 0.02 내지 0.1 ㎎/㎖의 범위이고;

b) 상기 코팅 조성물을 화장용 퍼프의 코팅되는 표면에 적용하여 화장용 퍼프 표면의 적어도 일부에 항균 코팅을 얻는 단계; 및

c) 상기 항균 접착 단백질이 코팅된 화장용 퍼프를 건조하는 단계.

또한, 본 발명은 화장용 퍼프 표면에 10분 내에 빨리 경화되는 고속 항균 접착 코팅을 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 항균 접착 단백질 코팅을 화장용 퍼프의 표면에 적용하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:

a) 항균 접착 단백질의 알코올 함유 용액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 조성물 내의 항균 접착 단백질의 농도는 바람직하게는 0.01 내지 0.2 ㎎/㎖의 범위, 보다 바람직하게는 0.02 내지 0.1 ㎎/㎖의 범위이고;

b) 상기 조성물을 화장용 퍼프의 코팅되는 표면에 적용하는 단계; 및

c) 상기 접착제가 코팅된 화장용 퍼프를 60℃에서 건조하는 단계.

하기 실시예들은 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하기 위해 제공되며, 본 발명은 예시의 목적으로만 제공되는 하기 특정 구현예에 의해 그 범위가 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 기능적으로 동일한 제품, 조성물 및 방법은 본 발명의 범위에 포함되는 것이 자명하다.

실시예 1. 항균 펩티드가 융합된 홍합 접착 단백질을 암호화하는 발현 벡터 제조

항균 홍합 접착 단백질의 제조를 위해, 재조합 홍합 접착 단백질의 C-말단 부위에 항균 펩티드 서열이 부가된 발현 벡터를 디자인하였다. 상기 항균 펩티드를 암호화하는 핵산의 합성을 ㈜코즈모진텍에 의뢰하였다. 제작 완료된 발현 벡터는 E. coli BL21(DE3)로 형질전환되었으며, 홍합 접착 단백질의 C-말단에 부가된 항균 펩티드 서열은 표 1과 같다.

홍합 접착 단백질에 부가된 항균 펩티드 서열

융합 항균 펩티드	서열	융합 부위	서열번호
AMP1	KLWKKWAKKWLKLWKA	탄소 말단	16
AMP2	ILRWPWWPWRRK	탄소 말단	17
AMP3	AKRHHGYKRKFH	탄소 말단	19

실시예 2. 항균 펩티드가 융합된 홍합 접착 단백질의 제조2 .1. 단백질 발현

E. coli BL21(DE3)는 LB 배지(5 g/liter yeast extract, 10 g/liter Tryptone 및 10 g/liter NaCl)에 배양하고, 배양액의 흡광도가 600 nm에서 0.6 정도가 되었을 때 IPTG를 최종 농도 1 mM로 첨가하여 재조합 항균 펩티드가 융합된 홍합 접착 단백질의 발현을 유도하였다. E. coli BL21(DE3) 배양액은 13,000 rpm으로 4 내지 10분간 원심분리하여 세포 펠렛을 수득하고, 이를 -80℃에 보관하였다.

상기 세포 펠렛을 SDS-PAGE용 버퍼(0.5 M Tris-HCl, pH 6.8, 10% glycerol, 5% SDS, 5% β-mercaptoethanol, 0.25% bromophenol blue) 100 ㎍에 재부유시켰고, 100℃에서 5분간 끓여 변성시켰다. SDS-PAGE 분석의 경우 샘플을 15% SDS-폴리아크릴아마이드 젤에 전기영동한 후 쿠마시블루(Coomasie blue) 염색을 이용하여 단백질 밴드를 검출, 확인하였다.

2.2. 항균 펩티드가 융합된 홍합 접착 단백질의 정제

상기 실시예 <2.1>에서 수득된 세포 펠렛을 용해 버퍼(2.4 g/L Sodium phosphate monobasic, 5.6 g/L Sodium phosphate dibasic, 10 mM EDTA 및 1% Triton X-100)를 사용하여 교반한 후, 고압 파쇄기를 사용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄물은 9,000rpm으로 20분간 원심분리하여 홍합 접착 단백질을 함유하는 불용성 단백질 응집체를 수득하였다. 상기 불용성 단백질 응집체로부터 25%(v/v) 아세트산을 사용하여 항균 펩티드가 융합된 홍합 접착 단백질을 추출하고, 9,000rpm으로 20분간 원심분리하여 홍합 단백질을 포함하는 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액은 10 N NaOH를 첨가하여 pH 12.8까지 상승시켰고, 동일한 조건으로 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 상기 상층액을 아세트산을 사용하여 pH 6∼7까지 중화적정한 후, 동일한 조건으로 원심분리하여 항균 펩티드가 융합된 홍합 접착 단백질의 침전물을 수득하였다. 수득된 침전물을 적정량의 정제수로 용해한 후, 동결건조하여, 순도 90% 이상의 항균 펩티드가 융합된 홍합 접착 단백질 동결건조물을 수득하였다.

2.3. 티로신 잔기를 DOPA 잔기로 효소적으로 전환

상기 동결건조된 홍합 접착 단백질을 20 mM 아스코르브산 및 20 mM 나트륨 보레이트를 함유하는 0.1 M의 아세테이트 버퍼 내에 1 ㎎/㎖의 농도로 용해시킨 후, 상기 홍합 접착 단백질 용액에 산소 가스를 30분 동안 가하여 산소로 포화시켰다. 항균 접착 단백질 당 40∼1 ㎍의 티로시나아제를 첨가한 후, 산소 분위기 하에서 1시간 동안 교반하였다. 이후, 상기 용액에 5% 아세트산을 첨가함으로써 화학적 변형 반응을 중단시켰다. 상기 중단된 접착 단백질 용액을 동결건조하여 동결건조된 분말을 수득하였다. 상기 공정을 통해 홍합 접착 단백질의 티로신 잔기는 DOPA로 변형되었다.

실시예 3. 항균 홍합 접착 단백질로 코팅된 화장용 퍼프의 제조

<실시예 2.3>에서 제조된 항균 접착 단백질을 증류수에 각각 1 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖의 농도로 녹여 항균 코팅 용액을 준비하였다. 폴리우레탄으로 구성된 화장용 퍼프의 항균 코팅은 두 가지 방법으로 진행하였다. 첫째는 화장용 퍼프에 항균 코팅액을 분사하여 코팅한 후, 클린 벤치에서 실온에서 자연 건조하였다. 두 번째 방법으로 항균 코팅 용액에 화장용 퍼프 샘플을 완전히 침지시켜 각각 30분, 6시간 및 12시간 코팅이 되도록 한 후, 화장용 퍼프를 꺼내 클린 벤치에서 실온에서 자연 건조하였다.

실시예 4. 항균 단백질 코팅 화장용 퍼프의 항균 활성 측정

실시예 3에서 제조된 항균 단백질 코팅 화장용 퍼프의 스타필로코커스 아우레우스에 대한 항균 효과를 평가하기 위하여, 스타필로코커스 아우레우스를 1×10⁴ CFU/㎖로 함유하는 PBS를 준비하였고, 상기 미생물을 각각의 샘플 내로 접종하여 18시간 배양한 후 항균력을 측정하였다. 항균력 측정은 표준 규격인 KS K 0693 규격에 맞춰 정량적 표준 테스트를 통해 항균 효과를 측정하였다. 대조군 샘플로서, 시판되는 퍼프(주식회사 이니스프리)를 비교를 위해 사용하였다.

그 결과, 표 2에 나타낸 것과 같이, 종래 상용 화장용 퍼프 및 본 발명의 항균 단백질 코팅 화장용 퍼프 모두 세탁전 항균력 결과는 스타필로코커스 아우레우스 세균이 99.9% 정도 감소하였으나, 종래 유무기 항균제의 특성상 종래 상용 화장용 퍼프의 경우에는 물세탁 3회(10회 주무름/1회)에서 항균력이 약간 감소하였고, 세제세탁 3회(10회 주무름/1회)에서는 78.9%로 항균력이 21% 감소하였다. 이와 대조적으로, 본 발명의 항균 단백질 코팅 화장용 퍼프는 물세탁 3회(10회 주무름/1회)에서는 항균력을 유지하였고, 세제세탁 3회(10회 주무름/1회)에서는 93.9%로 항균력이 단지 6%만이 감소함을 확인하였다.

상용 퍼프와 항균 단백질 코팅 퍼프의 항균력 비교

조건	항균 단백질 코팅 퍼프	상용 퍼프(이니스프리)
세탁 전	99.9%	99.9%
물세탁 3회	99.9%	99.9%
세제 세탁 3회	93.9%	78.9%

상기 결과로부터, 본 발명의 항균 단백질 코팅 화장용 퍼프는 시판되는 화장용 퍼프와 비교하여 항균력이 뛰어나면서도 종래 화장용 퍼프가 갖고 있는 항균제가 용출되어 장기간 사용시 항균력이 감소되는 문제를 해결할 수 있는 기술임을 확인하였다. 종래의 항균 화장용 퍼프는 일반적으로 은 나노입자에 기반한 것으로서, 화장용 퍼프로부터 은 나노입자가 지속적으로 방출되어 내구성 문제를 초래하였다.실시예 5. 고속 코팅 항균 조성물의 제조

항균 접착 단백질에 대한 다양한 코팅 조건을 2가지 상이한 농도로 준비하였고, 이를 표 3에 요약하였다.

AMP MAP	도파민 농도(㎎/㎖)
0.025 ㎎/㎖	0	0.01	0.1	1
0.05 ㎎/㎖	0	0.01	0.1	1

70 ㎖의 정제된 에탄올(SigmaAldrich, St. Louis, USA)을 30 ㎖의 증류수와 혼합하여 70 부피%의 에탄올 용액을 제조하였다. C-말단에 KLWKKWAKKWLKLWKA(서열번호 16)의 서열을 갖는 항균 접착 단백질 5 ㎎을 50 ㎖의 70 부피% 에탄올 버퍼에 용해시켜 0.1 ㎎/㎖의 항균 접착 단백질 코팅 용액을 제조하였고, 이후 70 부피%의 에탄올 버퍼 용액을 추가로 첨가하여 각각 0.05 ㎎/㎖ 및 0.025 ㎎/㎖로 희석하였다. 98%의 도파민 염산(SigmaAldrich, St. Louis, USA)을 그대로 사용하였고, L-도파민을 상기 70% 에탄올 버퍼 용액에 용해시켜 각각 0.01 ㎎/㎖, 0.1 ㎎/㎖ 및 1 ㎎/㎖의 도파민 용액으로 제조하였다. 먼저, 상기 도파민 용액(1 ㎖)을 폴리스티렌 페트리 디쉬의 소수성 표면에 적용하여 습윤성을 증가시킨 후, 상기 항균 홍합 접착 단백질을 상기 소수성 폴리스티렌 페트리 디쉬의 도파민 코팅된 표면에 신속하게 도입하였다. 항균 접착 단백질 코팅 용액(2 ㎖)을 각각의 페트리 디쉬를 코팅하기 위해 첨가하였다. 10분의 인큐베이션 후, 상기 코팅 용액을 페트리 디쉬로부터 제거하였고, 코팅된 페트리 디쉬를 실온에서 30분 동안 건조시켰다. 결과물인 건조된 페트리 디쉬를 사용하여 항균 활성을 추가로 분석하였다.실시예 6. 코팅된 표면의 항균 활성 측정

그람 음성 박테리아(대장균) 및 그람 양성 박테리아(스타필로코커스 아우레우스)를 사용하여 실시예 5에서 제조된 코팅된 표면의 항균 활성을 평가하였다. 상기 코팅된 표면의 항균 활성은 JIS Z 2801:2000에 의해 결정하였다(Haldar et al Nature Protocols 2007, 2(19), 2412). 기본적으로, 상기 JIS Z 2801:2000은 대개 처리된 표면과 비처리된 표면에서 측정된 콜로니 형성 단위(CFU)의 Log10 수 사이의 차로부터 계산되는 항균 값으로 표현된다.

도 2a(대장균) 및 도 2b(스타필로코커스 아우레우스)에 나타낸 것과 같이, 상기 세균들의 성장은 완벽하게 억제되었는데, 이는 도파민을 첨가하더라도 항균 효능에는 영향을 미치지 않고, 또한 물체의 표면이 도파민으로 코팅되면 항균 접착 단백질이 상기 물체의 표면에 코팅되는 것을 촉진 또는 가속화시킬 수 있음을 나타낸다.

실시예 7. 실온에서 화장용 퍼프 표면에 대한 항균 코팅

항균 코팅 용액 및 도파민 용액을 실시예 5에 따라 제조하였다. 5 ㎖의 코팅 용액을 각각 60 ㎜×15 ㎜ 폴리스티렌 페트리 디쉬에 개별적으로 분배하였다. 발포 폴리우레탄 기반의 화장용 퍼프(Dessin)를 각각 상기 도파민 용액 내에 침지시킨 후, 즉시 상기 항균 코팅 용액 내로 각각 10초, 30초, 60초 및 180초 동안 침지시켰다. 코팅 후, 모든 퍼프를 60℃에서 10분 동안 건조시켰다.

도 3에 나타낸 것과 같이, 코팅된 화장용 퍼프에 어떠한 색 변화도 관찰되지 않았다.

실시예 8. 고속 코팅된 항균 화장용 퍼프의 항균 활성 측정

실시예 7에 따라 제조된 일련의 항균 접착 단백질이 코팅된 화장용 퍼프에 대해 JIS Z 2801에 따라 항균 활성을 테스트하였다. 상기 화장용 퍼프에 대장균을 접종한 후, 대장균의 콜로니 형성 단위(CFU)를 계수하였다. 도 4에 나타낸 것과 같이, 코팅하지 않은 화장용 퍼프(대조군)는 대장균의 성장을 억제하지 못했지만, 본 발명의 항균 화장용 퍼프는 짧은 코팅 시간으로도 대장균의 성장을 현저하게 억제함을 보여주었다. 본 테스트에서는 대장균의 성장을 완벽하게 억제하지는 않았지만, 상기 항균 효능은 코팅 시간이나 항균 접착 단백질의 농도를 증가시킴으로써 향상될 것이다.

실시예 9. 내구성 테스트

실시예 7에 따라 제조된 항균 코팅된 화장용 퍼프를 4 ㎝×4 ㎝의 크기로 자르고, 상이한 회수(3회 및 10회)로 세재의 존재 또는 부재 하에 물세탁하였다. 시판되는 항균 화장용 퍼프를 대조군으로 사용하였다. 1회의 물세탁은 가정에서 세탁기로 1회 세탁하는 것과 동등하다.

실시예 8에 개시된 절차에 따라 항균 활성을 측정하였고, 항균 코팅이 없는 퍼프(A), 항균 접착 단백질로 코팅된 퍼프(B) 및 시판되는 퍼프(C)를 도 5에 나타내었다. 그 결과, 항균 코팅되지 않은 화장용 퍼프는 세균이 성장하였으나, 2종의 항균 화장용 퍼프는 세균의 성장을 억제하였다. 물세탁 후, 본 발명의 항균 접착 단백질이 코팅된 퍼프는 10회의 물세탁 후에도 현저한 항균 활성을 보였지만, 시판되는 항균 퍼프는 낮은 항균 활성을 나타내었다.

<110> Biovit Co., Ltd. <120> Biocompatible Composition for Rapid Synthesis of Antimicrobial Cosmetic Puff and Method for Preparation thereof <130> 2018-DPA-2763 <150> KR 10-2017-0084822 <151> 2017-07-04 <160> 27 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> model peptide of the tandem repeat decapeptide derived from foot protein 1 (FP-1, Mytilus edulis) <400> 1 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2 times repeated sequence derived from foot protein 1 (FP-1, Mytilus edulis) <400> 2 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys 20 <210> 3 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6 times repeated sequence derived from foot protein 1 (FP-1, Mytilus edulis) <400> 3 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 50 55 60 <210> 4 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial sequence of foot protein type 2 (FP-2, Mytilus californianus) <400> 4 Glu Val His Ala Cys Lys Pro Asn Pro Cys Lys Asn Asn Gly Arg Cys 1 5 10 15 Tyr Pro Asp Gly Lys Thr Gly Tyr Lys Cys Lys Cys Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Ser Gly Pro Thr Cys Ala Cys 35 <210> 5 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Foot protein type 3 (FP-3, Mytilus edulis) <400> 5 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly 1 5 10 15 Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Gly Ser Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys 20 25 30 Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 Glu Phe Glu Phe 50 <210> 6 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Foot protein type 3 (FP-3, Mytilus galloprovincialis : mgfp-3A) <400> 6 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly 1 5 10 15 Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp 20 25 30 Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 <210> 7 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial sequence from foot protein type 4 (Mytilus californianus) <400> 7 Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Lys His Val His Asn His 1 5 10 15 Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His 20 25 30 Val His Arg His Gln Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val 35 40 45 Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His 50 55 60 <210> 8 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Foot protein type5 (FP-5, Mytilus edulis) <400> 8 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 9 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Foot protein 5 (FP-5, Mytilus edulis) <400> 9 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 10 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Foot protein 5 (FP-5, Mytilus coruscus) <400> 10 Tyr Asp Asp Tyr Ser Asp Gly Tyr Tyr Pro Gly Ser Ala Tyr Asn Tyr 1 5 10 15 Pro Ser Gly Ser His Trp His Gly His Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr 20 25 30 Gly Lys Gly Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Phe Lys Arg Thr Gly Lys Tyr 35 40 45 Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys 50 55 60 His Tyr Gly Gly Ser Ser Ser 65 70 <210> 11 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mussel adhesive protein foot protein type5 from (Mytilus galloprovincialis) <400> 11 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 12 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mussel adhesive protein foot protein type 6 <400> 12 Gly Gly Gly Asn Tyr Arg Gly Tyr Cys Ser Asn Lys Gly Cys Arg Ser 1 5 10 15 Gly Tyr Ile Phe Tyr Asp Asn Arg Gly Phe Cys Lys Tyr Gly Ser Ser 20 25 30 Ser Tyr Lys Tyr Asp Cys Gly Asn Tyr Ala Gly Cys Cys Leu Pro Arg 35 40 45 Asn Pro Tyr Gly Arg Val Lys Tyr Tyr Cys Thr Lys Lys Tyr Ser Cys 50 55 60 Pro Asp Asp Phe Tyr Tyr Tyr Asn Asn Lys Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asn 65 70 75 80 Asp Lys Asp Tyr Phe Asn Cys Gly Ser Tyr Asn Gly Cys Cys Leu Arg 85 90 95 Ser Gly Tyr <210> 13 <211> 194 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hybrid mussel adhesive protein (FP-151, MEFP-5 based: Kollodis) <400> 13 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu 50 55 60 Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His Tyr His Ser Gly 65 70 75 80 Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr 85 90 95 Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys 100 105 110 Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys 115 120 125 Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 130 135 140 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 145 150 155 160 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 165 170 175 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 180 185 190 Tyr Lys <210> 14 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hybrid mussel adhesive protein (FP-151, MGFP-5 based) <400> 14 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu 50 55 60 Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly 65 70 75 80 Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr 85 90 95 Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys 100 105 110 Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys 115 120 125 Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys 195 <210> 15 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> adhesive peptide from Semibalanus balanoides <400> 15 Met Arg Val Ile Leu Phe Ala Met Leu Ile Gly Gly Ser Leu Ala Cys 1 5 10 15 Gln Asn Arg Leu Glu Thr Leu Val Gln Glu Ala Thr Gly Asn Ala Gly 20 25 30 Asp Leu Ser Thr Asn Val His Glu Glu Cys Asn Ser Gln Val Gly Thr 35 40 45 Phe Asn Ala Val His Ala Pro Gln 50 55 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-microbacterial peptide (KLWKKWAKKWLKLWKA) <400> 16 Lys Leu Trp Lys Lys Trp Ala Lys Lys Trp Leu Lys Leu Trp Lys Ala 1 5 10 15 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-microbacterial peptide (FALALKALKKL) <400> 17 Phe Ala Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Lys Leu 1 5 10 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-microbacterial peptide (ILRWPWWPWRRK) <400> 18 Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp 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Claims

버퍼 용액 및 항균 펩티드로 재조합적으로 기능화된 천연 접착 단백질을 포함하는 코팅 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 버퍼 용액은 물을 포함하는 코팅 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 버퍼 용액은 알코올을 포함하는 코팅 조성물.
청구항 3에 있어서,
상기 알코올은 에탄올인 코팅 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 버퍼 용액은 에탄올 및 물을 포함하는 코팅 조성물.
청구항 5에 있어서,
상기 버퍼 용액 내에서 알코올 대 물의 중량 비는 1:9 내지 9:1의 범위인 코팅 조성물.
청구항 2에 있어서,
상기 버퍼 용액은 10 내지 100 mM 농도의 염을 추가로 함유하는 코팅 조성물.
청구항 7에 있어서,
상기 염은 무기염인 코팅 조성물.
청구항 8에 있어서,
상기 무기염은 나트륨 아세테이트, 나트륨 카보네이트, 나트륨 바이카보네이트, 나트륨 포스페이트, 나트륨 히드록사이드, 칼륨 아세테이트, 칼륨 카보네이트, 칼륨 바이카보네이트, 칼륨 포스페이트 및 칼륨 히드록사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 코팅 조성물.
청구항 7에 있어서,
상기 염은 유기염인 코팅 조성물.
청구항 10에 있어서,
상기 유기염은 Tris, Bis-Tris, MES, PIPES, MOPS 및 HEPES로 이루어진 군으로부터 선택되는 코팅 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 천연 접착 단백질은 따개비 유래 접착 단백질, 콜라겐, 피브린 및 홍합 유래 접착 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 코팅 조성물.
청구항 12에 있어서,
상기 홍합 유래 접착 단백질은 서열번호 13 또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지며, 티로시나아제로 전처리되어 티로신 잔기가 DOPA 잔기로 전환된 코팅 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 항균 펩티드는 KLWKKWAKKWLKLWKA(서열번호 16), FALALKALKKL(서열번호 17), ILRWPWWPWRRK(서열번호 18), AKRHHGYKRKFH(서열번호 19), KWKLFKKIGAVLKVL(서열번호 20), LVKLVAGIKKFLKWK(서열번호 21), IWSILAPLGTTLVKLVAGIGQQKRK(서열번호 22), GIGAVLKVLTTGLPALISWI(서열번호 23), SWLSKTAKKGAVLKVL(서열번호 24), KKLFKKILKYL(서열번호 25), GLKKLISWIKRAAQQG(서열번호 26) 및 GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR(서열번호 27)로 이루어진 군으로부터 선택되는 코팅 조성물.
청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항의 코팅 조성물 중 어느 하나를 포함하는 화장용 퍼프.
청구항 15에 있어서,
상기 화장용 퍼프는 폴리우레탄(PUR), 아크릴로니트릴 부타디엔 고무(NBR), 스티렌-부타디엔 고무(SBR), 천연 고무(NR), 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 에틸렌-비닐 아세테이트 부틸 고무(EVA), 라텍스, 실리콘, 스티렌-이소프렌-스티렌(SIS), 스티렌-에틸렌-부틸렌-스티렌(SEBS), 폴리비닐 알코올(PVA), 니트릴 고무, 부틸 고무, 클로로프렌 고무 및 이들의 조합으로부터 제조되는 화장용 퍼프.
a) 항균 펩티드를 포함하는 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항의 코팅 조성물을 제공하는 단계; b) 상기 코팅 조성물을 화장용 퍼프의 표면에 적용하는 단계; 및 c) 상기 항균 펩티드가 코팅된 화장용 퍼프를 건조하는 단계를 포함하는, 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항의 코팅 조성물로 코팅된 화장용 퍼프의 제조 방법.
청구항 17에 있어서,
상기 코팅 조성물 내의 상기 항균 펩티드의 농도는 0.02 내지 0.1 ㎎/㎖의 범위인 방법.
청구항 17에 있어서,
상기 건조는 60℃에서 수행되는 방법.