KR20190001742A - Target nucleic acids detection method using quantum dot for dispersed light - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 검출 프로브(detecting probe)가 표적 핵산에 혼성화될 시에 상태 변화하는 형광염료의 형광 특성을 기반으로 표적 핵산을 검출함에 있어, 양자점(QD : quantum dot)을 분산광원으로 하여 형광염료를 여기시킴으로써, 양자점을 생접합(bioconjugation)하지 아니하여도 되어 표적 핵산의 검출을 위한 시약을 쉽게 제조 사용할 수 있고, 양자점을 여기시킬 빛과 형광염료의 형광 빛을 상호 간섭되지 아니하게 하며 형광 빛을 분석하여 표적 핵산을 정확하게 검출할 수 있는 표적 핵산 검출 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid based on the fluorescence characteristic of a fluorescent dye that changes state when a detecting probe is hybridized to a target nucleic acid, By excitation, the reagent for detecting the target nucleic acid can be easily prepared and used without bioconjugation of the quantum dots, and the fluorescent light of the fluorescent dye to be excited by the quantum dots can be prevented from interfering with each other, To a target nucleic acid detection method capable of accurately detecting a target nucleic acid.
본 발명과 관련된 연구는 산업통상자원부 핵심소재원천기술개발사업(펨토몰 수준의 암유전자 진단을 위한 PNA-나노하이브리드 융합소재 및 분자진단시스템 개발, 과제번호:10047831)의 지원을 받아 수행하였다. 또한, 본 발명에 따른 표적 핵산 검출 방법을 실제 임상샘플에 적용한 검증 실험은 인천성모병원 인체유래물질 자원은행에서 임상 검체를 제공받아 수행하였다.The research related to the present invention was carried out with the support of the core material technology development business of the Ministry of Industry and Commerce (development of PNA-nanohybrid fusion material and molecular diagnostic system for cancer gene diagnosis at the level of femtomole, Project No. 10047831). In addition, a verification test applying the target nucleic acid detection method according to the present invention to actual clinical samples was carried out by receiving a clinical sample from the material-resource bank of Incheon St. Mary's Hospital.
특정 유전자의 존재 또는 돌연변이 발생 여부와 질병 사이의 관계가 지속적으로 밝혀짐에 따라 전통적으로 질병의 증상이 있는 환자에 대해서 유전 질환을 확진하거나 감별하기 위해서 수행하던 유전자 검사가 질병의 예방, 조기 진단, 치료 및 관리를 통해 질환의 이환율과 사망률을 감소시키기 위한 목적으로 확장되고 있다. As the relationship between the presence of a specific gene or the occurrence of a mutation and the disease continues to be known, genetic testing performed to confirm or differentiate a genetic disease in a patient with a symptom of a disease, Treatment and management to reduce the morbidity and mortality of the disease.
특히, 종양 유전자(Oncogenes) 변이(mutations), 종양 억제 유전자(tumorsuppressor genes) 변이, 탈조절(deregulations)과 염색체 이상(chromosomal abnormalities) 등의 유전자 이상이 암의 발병과 약물의 예후 판단에 관여한다는 사실이 밝혀지면서 다양한 연구가 보고되고 있다(Fearson ER et al., Cell., 1990; K.W Kinzler et al., Cell., 1996; Manuel Serrano et al., Cell., 1997; Amado RG et al., J. Clin. Oncol., 2008, Raponi M et al., Curr. Opin. Pharmacol., 2008; Siena S et al., J. Natl. Cancer Inst., 2009). 이에 따르면, 암에 특이적인 유전자를 분석함으로써, 암의 발병 여부를 간접적으로 확인할 수도 있다.In particular, it has been shown that gene abnormalities such as oncogenes mutations, tumorsuppressor genes mutations, deregulations and chromosomal abnormalities are involved in the pathogenesis of cancer and the prognosis of drugs 1997), Amado RG et al., J (1996), Jawan et al., Cell, 1996, 2008, Raponi et al., Curr. Opin. Pharmacol., 2008; Siena S et al., J. Natl. Cancer Inst., 2009). According to this, by analyzing a gene specific to cancer, it is possible to indirectly confirm whether the cancer has occurred or not.
이와 같이 질환 관련 유전자, 특히 암 관련 유전자의 돌연변이 발생 여부가 암의 조기진단, 발병 여부 판단, 예후 판단은 물론 치료제의 선택 및 변경에까지 영향을 미치기 때문에 이를 정확히 검출하는 것은 임상적으로 매우 중요하다. 따라서 분석하고자 하는 목적 또는 유전자의 종류에 따른 다양한 돌연변이 검출 방법들이 개발되고 있다(Taylor CF, Taylor GR. Methods Mol. Med., 92:9, 2004). 하지만, 많은 경우에 분석 샘플에 존재하는 특정 돌연변이가 발생한 암세포의 수는 정상세포 및/또는 해당 돌연변이가 발생하지 않은 암세포와 대비하여 현저히 적기 때문에 검출하기 매우 어려우며 고도의 검출 기술을 필요로 한다(Chung et al, Clin Endocrinol, 2006/ Trovisco et al, J Pathol.,2004).Thus, it is very important clinically to detect the mutation of the disease-related gene, especially the cancer-related gene, because it affects the early diagnosis of cancer, determination of the onset of cancer, determination of prognosis as well as selection and change of therapeutic agent. Therefore, a variety of mutation detection methods have been developed depending on the purpose or type of gene to be analyzed (Taylor CF, Taylor GR. Methods Mol. Med., 92: 9, 2004). However, in many cases, the number of cancer cells in which specific mutations are present in the assay sample is very difficult to detect due to the small number of cancer cells compared with normal cells and / or cancer cells from which the mutation did not occur, and requires a high detection technique et al, Clin Endocrinol, 2006 / Trovisco et al, J Pathol., 2004).
통상적으로 암 관련 유전자 돌연변이 검사는 침습적인 조직 생검(Tissue Biopsy) 검체로 수행해 왔는데, 이는 환자의 고통을 야기할 뿐만 아니라 아예 조직 생검이 불가능한 환자도 다수 존재하며, 이에 더하여 암 조직 세포의 불균질성(Heterogeneity)으로 인한 편향(bias) 위험성 등의 문제점이 존재하기 때문에 비침습적이면서도 균질성을 제공하는 액체 생검(Liquid Biopsy) 검체인 혈액 등으로부터 검사를 수행해야 할 필요성이 제기되었고, 이로 인해 더 적은 양의 유전자로부터 돌연변이를 정확히 검출할 필요성이 대두되고 있다.In general, cancer-related gene mutation testing has been performed with invasive Tissue Biopsy specimens, which not only cause patient pain but also can not be biopsied at all. In addition, heterogeneity of cancer tissue cells ), There is a need to perform a test from a blood sample, which is a non-invasive but homogeneous liquid biopsy specimen. As a result, a smaller amount of genes The need for accurate detection of mutations is emerging.
유전자 변이 검사 방법으로는 전통적인 방법인 생어 시퀀싱(sanger sequencing), 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 최근 개발된 리얼-타임 PCR(real-time PCR), 디지털 PCR(digital PCR) 등이 있다.Methods for genetic mutation testing include traditional methods such as sanger sequencing, pyrosequencing, recently developed real-time PCR, and digital PCR.
또한, 소량 함유된 돌연변이 유전자를 선택적으로 증가시키기 위해 돌연변이에 특이적인 프라이머(primer)를 이용하는 대립형질 특이적(allele specific) PCR 방법(Rhodes et al., Diagnmol pathol., 6:49, 1997), 스콜피언 실시간 대립형질 특이적 PCR(scorpion Real-time allele specific PCR, DxS' scorpions and ARMS) 방법 (Mark et al., Journal of Thoracic Oncology, 4:1466, 2009), 대립형질 특이적(allele specific) 프라이머 기술과 MGB(minor groove binder)-프로브를 이용하여 야생형 유전자의 증폭을 억제하고 돌연변이 유전자만을 선택적으로 증폭 후 택만(Taqman) 프로브를 이용하여 돌연변이가 일어난 위치를 포함하지 않고 증폭 산물을 검출하는 CAST PCR 방법 (Didelot A et al., Exp Mol Pathol., 92:275, 2012), 임계적 변성온도(critical denaturation temperature, Tc)를 이용하여 돌연변이의 민감도를 증가시킬 수 있는 콜드PCR(Cold-PCR) 방법(Zuo et al., Modern Pathol., 22:1023, 2009) 등의 실시간 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응) 기술에 기반을 둔 다양한 선택적인 증폭 방법이 소개되고 있다. 이러한 방법들을 통해 다양한 암 관련 유전자의 변이 진단 및 분석 결과를 비교적 쉽고 빠르게 제공할 수 있게 되었다(Bernard et al., Clinical Chemistry, 48:1178, 2002). In addition, an allele specific PCR method (Rhodes et al., Diagnmol pathol., 6:49, 1997) using a mutation-specific primer to selectively increase a small amount of a mutant gene, Alleles specific primers (Marker et al., Journal of Thoracic Oncology, 4: 1466, 2009), scorpion real-time allele specific PCR (DxS scorpions and ARMS) CAST PCR, which detects amplification products without mutagenesis using a Taqman probe and amplifies only the mutant gene by suppressing the amplification of the wild type gene using the technology and the MGB (minor groove binder) probe (Cold-PCR) method, which can increase the sensitivity of mutations using a method (Didelot A et al., Exp Mol Pathol., 92: 275, 2012) and critical denaturation temperature (Zuo et al, Modern Pathol, 22:.. 1023, 2009) There are a variety of selective amplification method based on the real-time PCR (polymerase chain reaction, polymerase chain reaction) technology has been introduced and the like. These methods provide a relatively easy and quick way to diagnose and analyze mutations of various cancer-related genes (Bernard et al., Clinical Chemistry, 48: 1178, 2002).
이러한 실시간 PCR 기술에 기반을 둔 선택적인 증폭 방법에서는 표적 유전자 돌연변이를 검출하기 위한 방법으로 프로브에 표지한 형광 물질의 형광 빛을 사용하는 경우가 일반적이다. In a selective amplification method based on this real-time PCR technique, fluorescent light of a fluorescent substance labeled on a probe is generally used as a method for detecting a target gene mutation.
특히 형광 물질과 근접할 시에 형광 빛을 흡수하여 형광 빛의 세기를 감소시키는 소광자(quencher)를 이용한 기술들이 종종 사용되는데, 등록특허 제10-1496671호에 따르면, 프로브가 단일 가닥으로 있을 시에 산화그래핀에 흡착되어 프로브의 형광 물질을 소광시키고, 프로브와 표적 핵산이 결합하여 이중 가닥으로 있을 시에 산화그래핀에 흡착되지 아니하여 프로브의 형광 물질을 형광 회복시키는 특성을 이용한다.In particular, techniques using a quencher that absorbs fluorescence light and reduces the intensity of fluorescent light when it is in close proximity to the fluorescent material is often used. According to Patent No. 10-1496671, when the probe is in a single strand The probe is adsorbed on the graphene oxide to extinguish the fluorescent material of the probe, and when the probe and the target nucleic acid bind to each other, they are not adsorbed to the oxidized graphene when they are double-stranded, so that the fluorescence of the probe is recovered by fluorescence.
또한, 공개특허 제10-2015-0139096호에 따르면, 관심 질병으로 의심되는 세포로부터 나온 엑소좀에 관심 질병과 연관된 특이적인 유전자를 상보적으로 결합할 수 있는 분자 비컨을 사용하되, 분자 비컨의 일측 단부에는 검출라벨(형광 물질)을 결합시키고, 분자 비컨의 타측 단부에는 검출라벨과 대응하는 소광자를 결합시켰다. 이에, 분자 비컨이 특이 유전자와 결합되지 아니할 시에는 검출라벨과 소광자의 결합에 의해 검출라벨을 소광시키고, 특이 유전자와 결합할 시에는 검출라벨이 소광자와 이격되어 형광을 회복하므로, 형광의 회복 여부로 유전자를 검출할 수 있다.In addition, according to Published Patent No. 10-2015-0139096, a molecular beacon capable of complementarily binding a specific gene associated with a disease of interest to an exosome derived from a cell suspected of a disease of interest is used, A detection label (fluorescent substance) was bonded to the end portion, and the detection label and the corresponding quencher were bonded to the other end portion of the molecular beacon. Therefore, when the molecular beacon is not bound to the specific gene, the detection label is extinguished by the combination of the detection label and the quencher. When the specific label is bound to the specific label, the detection label is separated from the small photon, Whether or not the gene can be detected.
통상적으로 사용되는 형광 물질들은 여기시키기 위한 광 흡수 스펙트럼이 좁아서 형광물질에 따라 서로 다른 광원을 사용하거나 해당 파장의 빛만 투과 또는 반사시키는 광학 편광 필터를 사용해야만 하고 이로 인해 적용할 수 있는 형광물질의 종류나 개수가 제한되거나 검출 장치가 복잡해지는 문제점을 가진다.Normally used fluorescent materials have a narrow light absorption spectrum to excite them, so that it is necessary to use different light sources depending on the fluorescent materials or optical polarizing filters which transmit or reflect only light of the corresponding wavelengths. Therefore, There is a problem in that the number of sensors is limited or the detection device becomes complicated.
이에 더하여 형광물질이 표지된 프로브는 실시간 PCR 기술 기반의 선택적 증폭방법과 결합하여 사용되곤 하는데 프로브가 PCR 증폭을 저해하여 민감도를 저하시킬 가능성이 상존하는 문제점도 존재한다.In addition, the probe labeled with a fluorescent substance is used in combination with a selective amplification method based on real-time PCR technology. However, there is a possibility that the probe may inhibit the PCR amplification, thereby lowering the sensitivity.
이에 따라 좀 더 정확하고 민감한 검출 방법에 대한 임상 현장에서의 요구를 충족하기 위한 노력이 지속되고 있다.As a result, efforts are being made to meet the needs of more accurate and sensitive detection methods in the clinical field.
최근에는 다형(polymorphism)의 검출 방법으로서 융해점(융해온도, Tm : melting temperature) 해석 방법이 제시되고 있다. 융해점 해석을 통한 다형의 검출 방법은 검출하려는 다형을 포함하는 영역에 상보적인 프로브를 사용하여, 핵산과 프로브의 상보적 결합에 의한 하이브리드(이중 가닥 핵산)을 형성시킨 다음 하이브리드를 가열 처리하여, 온도 상승에 따라 하이브리드가 단일 가닥 핵산으로 분리되는 융해점을 흡광도 등의 시그널을 측정하여 얻고, 이로부터 다형을 판단한다. 일반적으로 측정된 융해곡선으로부터 융해곡선 분석(Melting Curve Analysis)에 의해 융해점을 도출한 다음 이로부터 다형을 판단한다.Recently, a method of analyzing a melting point (melting temperature) as a polymorphism detection method has been proposed. A method of detecting a polymorphism through melting point analysis is a method of detecting a polymorphism by forming a hybrid (double stranded nucleic acid) by complementary binding of a nucleic acid and a probe using a complementary probe to a region containing a polymorphism to be detected, The melting point at which the hybrid is separated into a single-stranded nucleic acid is obtained by measuring a signal such as absorbance and ascertaining the polymorphism therefrom. Generally, the melting point is derived from the measured melting curve by Melting Curve Analysis, and then the polymorphism is judged from the melting point.
융해점은 하이브리드화한 양 단일 가닥 핵산의 상보성이 높을수록 높고, 상보성이 낮을수록 낮아지므로 유전자와 프로브의 상보적 결합에 의해 생성된 하이브리드에 대해서 융해점을 검출하여 평가 기준치로 선정하고, 검사 대상의 핵산과 프로브에 의한 하이브리드의 융해점을 평가 기준치와 비교하여서, 핵산의 검출 대상 부위가 목적의 유전자와 동일한 것인지를 판별할 수 있다. 또한, 측정치가 검사 평가 기준치보다도 낮을 경우, 피검 핵산의 검출 대상 부위가 다른 형인 것으로 판별할 수 있다. 이에 따라, 검출 프로브를 첨가하여 PCR 반응시킨 이후 시그널 측정을 수행하는 것만으로, 다형을 검출할 수 있다.Since the melting point is higher as the complementarity of both hybridized single strand nucleic acids is higher and lower as the complementarity is lower, the melting point is detected with respect to the hybrid produced by the complementary binding of the gene and the probe, And the melting point of the hybrid by the probe can be compared with the evaluation reference value to determine whether the detection target site of the nucleic acid is the same as the target gene. Further, when the measured value is lower than the inspection evaluation reference value, it can be determined that the detection target site of the nucleic acid to be tested is of a different type. Accordingly, polymorphism can be detected only by performing signal measurement after adding a detection probe to perform PCR reaction.
융해점 측정을 위한 측정 시그널로는 프로브에 표지한 형광 물질의 형광 빛을 사용하는 경우가 일반적인데, 통상적으로 사용되는 형광 물질들은 여기시키기 위한 광 흡수 스펙트럼이 좁아 형광물질에 따라 서로 다른 광원을 사용하거나 해당 파장의 빛만 투과 또는 반사시키는 광학 편광 필터를 사용해야만 하고 이로 인해 적용할 수 있는 형광물질의 종류나 개수가 제한되거나 장치가 복잡해지는 문제점을 가지게 된다.As a measurement signal for measuring the melting point, it is common to use a fluorescent light of a fluorescent substance labeled on a probe. Usually, fluorescent substances to be used generally have a narrow light absorption spectrum for excitation, It is necessary to use an optical polarizing filter which transmits or reflects light of a corresponding wavelength only, which limits the kinds and number of applicable fluorescent materials or complicates the apparatus.
아울러 통상 검체 내 표적 핵산의 농도가 매우 낮아서 PCR 또는 실시간 PCR 등으로 표적 핵산을 증폭 또는 돌연변이 선택적으로 증폭한 다음 융해점 측정을 수행하게 되므로, 융해점 측정을 위한 프로브가 증폭을 저해하여 민감도를 저하시킬 위험성은 여전히 존재하고 있다.In addition, since the concentration of the target nucleic acid in the specimen is usually very low, the target nucleic acid is amplified or mutatively selectively amplified by PCR or real-time PCR and then the fusion point is measured. Therefore, the probe for measuring the melting point may inhibit the amplification, Is still present.
양자점(QD : quantum dot)은 사이즈에 따른 스펙트럼 변화(즉, 사이즈 변화에 따라 다른 파장의 빛을 방출하는 특성), 개선된 휘도, 광 표백(photo bleaching)에 대한 우수한 안정성, 동시 다중 형광 여기 등과 같은 특유의 유용한 광학 특성을 가지고 있어 최근 바이오 분야에서 많은 주목을 받아온 나노 소재이다. Quantum dots (QDs) are used to detect changes in spectral size (ie, the ability to emit light of different wavelengths depending on size change), improved brightness, excellent stability against photo bleaching, simultaneous multi- It is a nano material that has attracted much attention in the bio field in recent years due to its unique useful optical properties.
특히 넓은 흡수 스펙트럼 및 좁은 방출 스펙트럼을 갖고 있어서, 기존 형광물질의 대체뿐만 아니라 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 현상을 기반으로 하는 바이오센서 또는 진단 시스템 내에서 도너(donor) 또는 어셉터 (acceptor)로 활용하려는 시도도 많이 진행되었다.In particular, it has wide absorption spectrum and narrow emission spectrum, so it can be used as a donor or acceptor in biosensor or diagnostic system based on FRET (fluorescence resonance energy transfer) phenomenon as well as replacement of existing fluorescent substance. Many attempts have been made.
FRET 현상은 두개의 서로 다른 파장 영역의 형광 물질이 인접했을 경우에 여기된 어느 하나의 형광 물질에서 다른 하나의 형광 물질로 비복사 과정을 통해 에너지가 전이되어 다른 하나의 형광 물질의 고유 형광을 나타내는 물리적인 현상이다. 이때, 에너지를 주는 물질을 도너(donor, 공여체)라 하고, 에너지를 받는 물질을 어셉터(acceptor, 수용체)라 한다. The FRET phenomenon is a phenomenon in which, when two fluorescent materials in different wavelength regions are adjacent to each other, energy is transferred from one excited fluorescent material to another fluorescent material through a non-radiation process, It is a physical phenomenon. At this time, the substance that gives energy is called a donor, and the substance that receives energy is called an acceptor.
이와 같은 FRET 현상은 통상적으로 대부분의 생물 내 매크로 분자의 치수(dimension)에 상당하는 대략 10Å 내지 100Å 범위 내로 도너와 어셉터가 근접하였을 시에 일어나기 때문에, 생접합 기술 등을 적용하여 도너와 어셉터 간의 국지적 거리를 보장해야 한다.Since such a FRET phenomenon usually occurs when the donor and the acceptor are close to each other within a range of about 10 A to 100 A corresponding to the dimension of macro-molecules in most living organisms, The local distance between them must be guaranteed.
양자점을 이용한 FRET 기반 센서의 다수는 단백질-양자점 접합체(conjugates) 또는 스트렙타비딘(Streptavidin)-양자점 시스템을 사용하고 있으며, 비특이적 흡착, 정전기적 상호작용 및 공유 결합 등을 통해 생분자를 양자점에 접합시킨 경우도 보고되었다. 양자점을 이용한 FRET 기반 센서 관련 기술로서, siRNA 서열을 스크리닝하기 위한 양자점-접합된(conjugated) 혼성화 프로브, 고감도 DNA 나노센서, DNA-양자점 접합에 기반하는 뉴클레아제 내성(nuclease tolerant) FRET 프로브 등이 보고되었다. Many of the FRET-based sensors using quantum dots use protein-QD conjugates or Streptavidin-QD systems to conjugate biomolecules to quantum dots through nonspecific adsorption, electrostatic interactions, and covalent bonds. Were also reported. As a FRET-based sensor technology using quantum dots, a quantum dot-conjugated hybridization probe for screening siRNA sequences, a highly sensitive DNA nanosensor, a nuclease tolerant FRET probe based on DNA-QD junction, etc. .
양자점을 이용한 종래기술의 구체적인 예로서, 등록특허 제10-0704011호 및 등록특허 제10-1510513호가 있다.As a specific example of the prior art using quantum dots, there are the registered patent 10-0704011 and the registered patent 10-1510513.
상기 종래기술을 비롯한 대부분의 양자점을 이용한 FRET 기반 기술은, 도너인 양자점에 접합시키기에 앞서 대부분 표적 물질(핵산, 유전물질, 예를 들면 DNA)을 먼저 염료(dye)로 라벨링할 것을 요구할 뿐만 아니라, 경우에 따라서는 복수의 프로브를 사전에 제조하거나 접합에 앞서 표적 물질 및 양자점에 각각 바이오틴 처리 및 스트렙타비딘 처리를 수반하기 때문에 절차가 상대적으로 매우 복잡하다. 또한, 프로브를 양자점에 생접합하는 경우, 프로브와 표적 물질 간의 혼성화를 방해하기도 한다.Most of the FRET-based technologies using the quantum dots, including the above-mentioned prior art, not only require labeling of a target material (nucleic acid, genetic material, for example DNA) with a dye before bonding to a donor quantum dot , And the procedure is relatively complicated because the target material and the quantum dot are subjected to biotin treatment and streptavidin treatment, respectively, in advance, when a plurality of probes are prepared in advance or before bonding. Further, when the probes are biojointed to the quantum dots, hybridization between the probes and the target material may be hindered.
본 발명은 상기한 바와 같이 종래 생접합의 어려움, 형광 물질의 검출 시 부정확성, 광학계의 복잡도 및 형광 물질의 제한적 문제점을 해소하여, 보다 간편하면서도 신속 정확하게 표적 물질을 검출할 수 있는 표적 핵산 검출 방법을 제공하는 데 목적을 둔다.As described above, the present invention solves the problems of conventional bio-bonding, inaccuracies in detection of fluorescent materials, complexity of an optical system, and limited limitation of fluorescent materials, thereby enabling a target nucleic acid detection method capable of detecting a target substance more easily and quickly and accurately The purpose is to provide.
본 발명은 표적 핵산에 대해 상보적 염기서열을 갖는 검출 프로브를 표전 핵산과 혼성화시켜 혼성화 여부에 따라 형광 특성이 달라지는 형광염료의 상태 변화를 유도하는 혼성화 단계; 및 형광염료의 형광 빛을 측정하여 표적 핵산을 검출하는 검출 단계;를 포함하는 표적 핵산 검출 방법에 있어서, 상기한 목적을 달성하기 위한 표적 핵산 검출 방법을 제공하는 발명으로서, 양자점을 검출 프로브와 함께 산재되도록 혼합하여, 양자점이 산재되어 있는 환경 하에 검출 프로브가 표적 핵산과 혼성화되게 하고, 검출 프로브와 표적 핵산의 혼성화에 따라 생성된 하이브리드의 주변에 산재되어 있는 양자점을 여기시켜 분산광원의 역할을 하게 하며, 양자점의 여기에 의해 방출된 빛이 형광염료에 흡광되어 방출되는 형광염료 고유의 형광 빛을 측정함으로써, 표적 핵산을 검출한다. The present invention relates to a hybridization step of hybridizing a detection probe having a complementary base sequence to a target nucleic acid with a target nucleic acid to induce a change in the state of a fluorescent dye whose fluorescence characteristics vary depending on hybridization; And a detection step of detecting a target nucleic acid by measuring fluorescence light of the fluorescent dye. In the target nucleic acid detection method, there is provided a method for detecting a target nucleic acid, The detection probes are hybridized with the target nucleic acid under the environment where the quantum dots are scattered and the quantum dots scattered around the hybrids generated by the hybridization of the detection probe and the target nucleic acid are excited to serve as a dispersive light source And the target nucleic acid is detected by measuring the fluorescent light inherent in the fluorescent dye in which the light emitted by the excitation of the quantum dots is absorbed and emitted by the fluorescent dye.
이에 따라, 양자점을 검출 프로브에 생접합하지 아니하여도 되고, 검출 프로브와 표적 핵산의 혼성화를 방해하지도 아니하며, 외부에서 여기시킬 대상과 검출할 대상이 분리되어 있으므로, 여기시킬 대상인 양자점을 자외선 또는 레이저로 여기시켜 간섭 없이 형광 빛을 검출할 수 있다. Accordingly, since the object to be excited and the object to be excited are separated from each other, the quantum dots to be excited can be excited by ultraviolet rays or a laser It is possible to detect fluorescent light without interference.
이에, 광학계를 간소화할 수 있고, 협대역의 방출 스펙트럼을 갖는 양자점의 특성에 따라 특정 형광염료를 타겟으로 한 양자점을 사용함으로써, 형광염료가 갖는 고유 형광 파장의 빛을 측정하며 정확하게 표적 핵산을 검출할 수 있는 표적 핵산 검출 방법을 제공한다.By using quantum dots targeting specific fluorescent dyes in accordance with the characteristics of quantum dots having a narrow emission spectrum, it is possible to measure the light of the intrinsic fluorescent wavelength possessed by the fluorescent dyes and accurately detect the target nucleic acid A method for detecting a target nucleic acid is provided.
또한, 흡광 및 방출 형광 빛의 파장대가 상이한 형광염료를 표지한 서로 다른 프로브와 각 형광염료의 흡광 파장대에 맞는 서로 다른 크기의 양자점을 투입하여서, 다중 검출(multiplex detection)이 가능한 표적 핵산 검출 방법을 제공할 수 있다.In addition, a target nucleic acid detection method capable of multiplex detection by introducing different probes labeled with fluorescent dyes having different wavelength ranges of the light-absorbing and emitting fluorescent light and quantum dots of different sizes suitable for the absorption wavelength band of each fluorescent dye .
또한, 일측 단부에 형광염료를 결합하고 타측 단부에 소광자를 결합한 검출 프로브를 사용하여서, 검출 프로브가 표적 핵산에 혼성화되지 아니할 시에 형광 빛을 소광하고 표적 핵산에 혼성화될 시에 형광 빛을 방출하게 되는 특성을 활용하는 검출 방식, 일측 단부에 형광염료를 결합한 검출 프로브와 함께 검출 프로브를 흡착하는 소광자를 사용하여 검출 프로브가 표적 핵산에 혼성화될 시에 소광자와 분리되어 형광 빛을 방출하게 되는 특성을 활용하는 검출 방식, 등의 다양한 검출 방식에 적용할 수 있는 표적 핵산 검출 방법을 제공한다.In addition, using a detection probe having a fluorescence dye bonded to one end and a quencher attached to the other end, fluorescence light is extinguished when the detection probe is not hybridized to the target nucleic acid, and fluorescent light is emitted when hybridizing to the target nucleic acid A detection method utilizing a characteristic of a detection probe combined with a fluorescent dye at one end thereof and a quencher that adsorbs a detection probe together with the detection probe to emit fluorescent light separately from the small photon when the detection probe is hybridized to a target nucleic acid And a detection method utilizing the detection method using the target nucleic acid.
또한, 검출 단계에서 융해곡선(melting curve) 분석을 함에 있어, 형광염료를 안정적으로 여기시키는 분산광원을 이용하는 표적 핵산 검출 방법을 제공한다.Further, in the melting curve analysis in the detection step, a method of detecting a target nucleic acid using a dispersed light source that stably excites a fluorescent dye is provided.
본 발명의 일 실시 예에 따르면, 양자점을 히드록시기(-OH), 카르복실기(-COOH), 아민기(-NH2), 또는 티올기(-SH)로 표면 개질하여, 수용성을 나타내도록 함으로써, 시약에 고르게 산재되어 있도록 한다. 이를 통해, 형광염료를 고르게 형광시킬 수 있는 분산광원을 갖는 표적 핵산 검출 방법을 제공한다.According to one embodiment of the present invention, the quantum dot is surface-modified with a hydroxyl group (-OH), a carboxyl group (-COOH), an amine group (-NH2), or a thiol group (-SH) Ensure that they are scattered evenly. Thereby, a method for detecting a target nucleic acid having a dispersed light source capable of evenly fluorescing a fluorescent dye is provided.
본 발명의 일 실시 예에 따르면, 표적 핵산이 함유된 시료를 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응) 증폭하는 증폭 단계를 포함하며, 상기 혼성화 단계에서는 검출 프로브와 양자점이 각자 고르게 산재되어 있는 시약을 준비한 후, 증폭 단계에 의해 PCR 증폭된 시료에 검출용 시약을 투입한다. 이를 통해, PCR 증폭과정에의 양자점 열화 문제가 발생하지 아니하므로, 검출 정확성을 보장하는 표적 핵산 검출 방법을 제공할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, there is provided an amplification step of amplifying a sample containing a target nucleic acid by PCR (polymerase chain reaction, polymerase chain reaction). In the hybridization step, a detection probe and a reagent And the detection reagent is added to the PCR amplified sample by the amplification step. As a result, there is no problem of deterioration of the quantum dots in the PCR amplification process, so that a target nucleic acid detection method that ensures detection accuracy can be provided.
본 발명의 일 실시 예에 따르면, 상기 검출 단계는 상기 양자점을 여기시키기 위한 여기 광을 자외선 또는 레이저로 하되, 여기 광을 반사시키고 형광염료의 형광 빛을 투과시키는 다이크로익 미리(dichroic mirror)의 도움을 받아 여기 광의 광축 및 형광 빛을 광축을 일치시킨다. 이를 통해, 단순한 광학계에 의해서도 표적 핵산을 정확하게 검출하는 표적 핵산 검출 방법을 제공한다.According to an embodiment of the present invention, the detecting step may be performed by using a dichroic mirror which excites the excitation light to excite the quantum dots by ultraviolet rays or a laser, reflects the excitation light, and transmits the fluorescent light of the fluorescent dye. The optical axis of the excitation light and the fluorescent light are aligned with the optical axis. This provides a target nucleic acid detection method that accurately detects a target nucleic acid even by a simple optical system.
상기한 바와 같이 이루어지는 본 발명은 혼성화가 이루어지는 시료 시약 반응액 내에 고르게 분포시킨 양자점을 새로운 개념의 분산광원으로 하여 형광염료를 고르게 여기시킬 수 있고, 넓은 입사 스펙트럼 및 협대역 방출 스펙트럼을 갖는 양자점의 특성에 의해서 양자점을 여기시키기 위한 광원의 제약을 덜 받으며, 특정 형광염료를 타겟으로 하여 형광 빛을 방출시킴으로써, 검출하려는 표적 핵산을 정확하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라 정확한 다중 검출도 가능하고, 생접합 기술이 필요치 아니하여 간편하다.As described above, according to the present invention, a quantum dot uniformly distributed in a sample reagent reaction solution in which hybridization is performed can be used as a dispersion light source of a new concept to uniformly excite a fluorescent dye, and a quantum dot characteristic having a broad incident spectrum and a narrowband emission spectrum It is possible to detect the target nucleic acid to be detected accurately as well as to detect multiple targets accurately by emitting fluorescence light with a specific fluorescent dye as a target, It is not necessary and easy.
또한, 본 발명은 여기시키기 위해 조사하는 빛과 검출되는 형광 빛 사이의 간섭을 일으키지 아니하게 할 수 있어, 검출 정확성을 높일 수 있고, 광학계를 간소화할 수 있으며, 형광물질의 선택폭도 넓고, 다양한 형광물질을 동시 사용하여 한 번에 여러 표적 핵산을 동시 검출하는 다중 검출을 용이하게 수행할 수 있고, 검출 프로브를 사용한 다양한 표적 핵산 검출 방법에도 쉽게 적용할 수 있다.Further, the present invention can prevent the interference between the light irradiated for excitation and the fluorescent light to be detected, thereby increasing the detection accuracy, simplifying the optical system, broadening the selection range of the fluorescent material, The simultaneous detection of multiple target nucleic acids at the same time can be easily performed, and the method can be easily applied to various target nucleic acid detection methods using detection probes.
도 1은 형광염료 및 소광자를 결합한 프로브를 이용하는 표적 핵산 검출 방법에 본 발명을 적용한 실시 예를 보여주는 모식도이다.
도 2는 형광염료를 결합한 프로브를 소광자 기능의 물질에 흡착되게 한 표적 핵산 검출 방법에 본 발명을 적용한 실시 예를 보여주는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 실시를 위한 키트(100)이다. 키트(100)는 유동 칩(110) 및 커버(120)를 기구적 구성요소로 하며, 유동 칩(110) 및 커버(120)의 사시도, 상면도 및 단면도를 도시하되, 유동 칩(110)은 상면 사시도(a) 및 상면도(b)를 도시하고, 커버(120)는 저면 사시도(d) 및 저면도(e)로 도시하여, 유동 칩(110)의 상면측과 접하는 커버(120)의 저면측을 자세히 보여준다.
도 4는 도 3의 키트(100)에 광학계(200) 및 히터(300)를 더하여 구성한 표적 핵산 검출 장치의 구성도이다.
도 5 및 도 6은 키트(100)를 포함한 핵산 검출 장치에 의해 이루어지는 표적 핵산 검출 방법의 순서도이다.
도 7은 Cell line으로부터 추출된 KRAS G12D 돌연변이(Mutant) DNA와 야생형(wild) DNA를 이용하여, 돌연변이 비율에 따라 얻은 융해곡선 그래프이다.
도 8은 실제 임상샘플에 적용한 실험 결과를 얻기 위해서, 인천성모병원 인체유래물질 자원은행에서 제공받은 임상검체를 진단한 결과로 얻은 융해곡선 그래프이다.1 is a schematic diagram showing an embodiment in which the present invention is applied to a method for detecting a target nucleic acid using a probe having a fluorescent dye and a quencher attached thereto.
FIG. 2 is a schematic diagram showing an embodiment in which the present invention is applied to a target nucleic acid detection method in which a probe having a fluorescent dye is adsorbed on a material having a small photon function.
3 is a
4 is a configuration diagram of a target nucleic acid detecting device constructed by adding an
5 and 6 are flow charts of a target nucleic acid detection method performed by the nucleic acid detection device including the
FIG. 7 is a graph of the melting curve obtained according to the mutation ratio using KRAS G12D mutant DNA and wild DNA extracted from the cell line.
FIG. 8 is a graph of the melting curve obtained as a result of diagnosing a clinical sample provided by the material-resource bank of the Incheon St. Mary's Hospital, in order to obtain an experimental result applied to an actual clinical sample.
도 1 및 도 2의 모식도로 보여준 실시 예를 참조하면, 본 발명에 따른 표적 핵산 검출 방법은 검출 프로브(detecting probe)와 표적 핵산 사이의 혼성화 여부에 따라 형광 특성이 달라지는 형광염료(fluorescent dye)의 상태 변화를 검출하여 표적 핵산을 검출함에 있어서, 형광염료의 흡광 파장대의 빛을 사방으로 방출하는 양자점(QD : quantum dot)을 분산광원으로 사용한다. 1 and 2, the method for detecting a target nucleic acid according to the present invention is a method for detecting a target nucleic acid using fluorescent dyes having different fluorescence characteristics depending on hybridization between a detecting probe and a target nucleic acid In detection of the target nucleic acid by detecting the change in the state, a quantum dot (QD) that emits light in the wavelength range of the fluorescent dye in all directions is used as a dispersion light source.
구체적으로, 본 발명은 표적 핵산에 대해 상보적 염기서열을 갖고 있는 검출 프로브를 양자점이 산재되어 있는 환경 하에 표적 핵산과 혼성화시켜 혼성화 여부에 따라 형광 특성이 달라지는 형광염료의 상태 변화를 유도하는 혼성화 단계; 및 산재되어 있는 양자점을 여기시킴에 따라 분산광원 역할을 하는 양자점의 방출 빛을 받는 형광염료의 형광 빛을 검출함으로써 표적 핵산을 검출하는 검출 단계; 를 포함한다.Specifically, the present invention relates to a hybridization step of hybridizing a detection probe having a complementary base sequence to a target nucleic acid with a target nucleic acid in an environment in which quantum dots are scattered, thereby inducing a change in the state of the fluorescent dye, ; Detecting a target nucleic acid by detecting fluorescence light of a fluorescent dye that receives emission light of a quantum dot serving as a dispersion light source by exciting scattered quantum dots; .
표적 핵산은 검출하고자 하는 모든 종류의 핵산을 의미하며, 다양한 DNA, RNA, 염색체, 대사물질 등이 있다. 표적 핵산은 예를 들어 질병 발생 가능성 및 발병 위험도와 관련된 돌연변이 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 표적 핵산을 함유하는 시료를 채취하여 표적 핵산을 검출한다.The target nucleic acid refers to all kinds of nucleic acids to be detected, and various DNA, RNA, chromosomes, and metabolites. The target nucleic acid may comprise, for example, a mutation gene related to the likelihood of disease development and the risk of onset. A sample containing such a target nucleic acid is collected to detect a target nucleic acid.
채취한 시료에는 표적 핵산이 소량 함유되어 있는 것이 일반적이며, 본 발명의 실시 예에서는 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응) 증폭을 선행하여 시료 내의 표적 핵산을 증폭하는 증폭 단계를 상기 혼성화 단계 이전에 수행한 이후, 검출 프로브 및 양자점이 각자 고르게 산재되어 있게 함유된 혼합액을 검출을 위한 시약으로서 증폭 결과물 함유 시료에 투입하여 혼성화 단계를 수행한다. In the present invention, the amplification step of amplifying the target nucleic acid in the sample is performed prior to the hybridization step (PCR) (polymerase chain reaction, polymerase chain reaction) , The hybridization step is carried out by injecting a mixed solution containing detection probes and quantum dots dispersed evenly therein into a sample containing the amplification product as a reagent for detection.
이를 통해, PCR 증폭 과정에서의 열적 영향이 양자점 및 검출 프로브에 미치지 아니하므로, 양자점의 열화 문제 또는 PCR 시약과 검출 프로브 사이의 열적 특성 차이에 따른 문제가 생기지 아니한다.As a result, since the thermal influence in the PCR amplification process does not reach the quantum dots and the detection probes, there is no problem due to deterioration of the quantum dots or a difference in thermal characteristics between the PCR reagent and the detection probes.
한편, PCR 증폭은 PCR 증폭 시약을 투입한 상태에서 변성(Denaturation), 결합(Annealing) 및 신장(Elongation)으로 이루어지는 일련의 과정을 반복하여, 표적 핵산을 증폭하는 공지의 기술인 바, 상세한 설명을 생략한다.On the other hand, the PCR amplification is a known technique for amplifying a target nucleic acid by repeating a series of processes consisting of denaturation, annealing, and elongation in a state where a PCR amplification reagent is added, and a detailed description thereof is omitted do.
< 검출 프로브(detecting probe) >≪ detecting probe >
검출 프로브(detecting probe)는 표적 핵산에 상보적으로 결합하여 혼성화하는 모든 핵산 또는 핵산 유사체로서, 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide), PNA(peptide nucleic acids) 및 LNA (Locked nucleic acid)로 이루어진 군에서 각각 선택될 수 있다. PCR 증폭을 위한 중합효소에 일반적으로 뉴클레아제(nuclease) 활성이 있어서, 검출 프로브의 손상이 생길 가능성도 있으므로, 뉴클레아제에 대해 안정한 PNA와 같은 합성 핵산을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 검출 프로브는 표적 핵산의 유전자를 선택적으로 검출시키는 역할을 하므로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려진 핵산 검출을 위한 검출 프로브를 사용할 수 있다.A detecting probe is any nucleic acid or nucleic acid analogue that is complementarily bound to hybridize to a target nucleic acid and is selected from the group consisting of oligonucleotides, peptide nucleic acids (PNA), and LNA (locked nucleic acid) . It is preferable to use a synthetic nucleic acid such as PNA which is stable against nuclease, since the polymerase for PCR amplification generally has nuclease activity and may cause damage to the detection probe. In addition, since the detection probe serves to selectively detect the gene of the target nucleic acid, a detection probe for nucleic acid detection well known in the art can be used.
본 발명의 일 실시예에서는 바람직하게 PNA 프로브를 사용하였으며, PNA 프로브는 인공합성 DNA로서 타겟 DNA 또는 타겟 RNA와의 특이적 결합이 가능하고, 뉴클레아제에 대해 안정하기 때문에 프로브를 기반으로 한 융해곡선(melting curve) 분석이 가능하다. In one embodiment of the present invention, a PNA probe is preferably used. Since the PNA probe is an artificial synthetic DNA and can be specifically bound to a target DNA or a target RNA and is stable to nuclease, a probe-based fusion curve (melting curve) analysis is possible.
이때의 검출 프로브는 표적 핵산의 특정 위치 유전자에만 혼성화하는 것일 수도 있다. 예를 들어 야생형(wild) 유전자는 제외하고 돌연변이(mutant) 유전자와 혼성화하는 검출 프로브일 수도 있다.The detection probe at this time may hybridize only to a specific position gene of the target nucleic acid. For example, it may be a detection probe that hybridizes with a mutant gene except for a wild gene.
혼성화는 잘 알려진 바와 같이 상보적인 단일 가닥 핵산들이 상보적 결합하여 이중 가닥 핵산, 즉, 하이브리드(hybrid)를 형성하는 것을 의미한다. 표적 핵산이 이중 가닥인 경우, 검출 프로브와의 혼성화 반응을 일으키기 위해서 표적 핵산을 단일 가닥으로 분리하여야 하는 데, 이러한 방법으로서, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 또는 글리콕살 처리, 효소적 방법, 결합 단백질 등이 알려져 있으나, 본 발명의 실시 예 설명에서는 히터(300)에 의한 열처리에 의해서 달성하는 것으로 이해해도 좋다.Hybridization, as is well known, means that complementary single-stranded nucleic acids are complementarily combined to form a double-stranded nucleic acid, i.e., a hybrid. When the target nucleic acid is double-stranded, the target nucleic acid must be separated into single strands in order to cause a hybridization reaction with the detection probe. Such methods include heat, alkali, formamide, urea or glycoconjal treatment, enzymatic method, Protein and the like are known. However, in the description of the embodiment of the present invention, it can be understood that heat treatment by the
형광염료(fluorescent dye)는 특정 파장의 빛을 흡수 및 방출하여 형광을 발하는 물질로서, 표적 핵산 검출 기술분야에 있어서, 표적 핵산과 검출 프로브 사이의 혼성화가 이루어졌는지 확인하는 데 사용된다. BACKGROUND OF THE INVENTION Fluorescent dyes absorb and emit light of a specific wavelength and emit fluorescence. In the field of target nucleic acid detection technology, a fluorescent dye is used to confirm hybridization between a target nucleic acid and a detection probe.
이러한 형광 염료는 플루오레신 (fluorescein), 플루오레신 클로로 트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 형광 물질을 사용할 수 있다.Such fluorescent dyes include, but are not limited to, fluorescein, fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, tetramethylrhodamine, FITC, Oregon green, Alexa Fluor, FAM, JOE, ROX, HEX, Texas Red, TET, TRITC, TAMRA, Cyanine dyes and thiadicarbocyanine dyes , But the present invention is not limited thereto, and fluorescent materials known in the art may be used.
여기서 사용하는 형광염료는 특정 파장의 빛을 흡수 및 방출하는 특성이 있으므로, 적절한 파장의 빛을 흡수하여 형광 빛을 방출되게 하여야 하며, 본 발명에 따르면, 양자점(QD : quantum dot)이 형광염료의 형광 빛을 방출시키기 위한 적절한 파장의 광을 제공한다.Since the fluorescent dye used here has a characteristic of absorbing and emitting light of a specific wavelength, it is required to emit fluorescence light by absorbing light of an appropriate wavelength. According to the present invention, a quantum dot (QD) And provides light of an appropriate wavelength for emitting fluorescence light.
한편, 검출 프로브와 표적 핵산 사이 혼성화 여부에 따라 형광 특성, 즉, 형광 빛을 방출하거나 형광 빛을 소광하는 특성이 달라지도록, 혼성화 여부에 따라 형광염료의 상태 변화(예를 들면 도 1,2에 예시한 혼성화 전후의 상태 변화)를 유도하여 하며, 이를 위해 본 발명의 실시 예에서는 소광자(quencher)를 사용한다.On the other hand, in order to change the fluorescence characteristics depending on hybridization between the detection probe and the target nucleic acid, that is, to change the characteristics of emitting fluorescence light or extinguishing fluorescence light, The change in state before and after hybridization is exemplified. For this, a quencher is used in the embodiment of the present invention.
소광자(quencher)는 형광염료에서 방출하는 형광 빛을 흡수하여 형광 세기를 감소시키는 물질을 의미하며, 형광염료와의 거리에 따라 소광(quenching) 량이 달라지며, 그 종류에 따라 상이하지만 소정 거리 이내로 형광염료와 근접할 시에 광학계로 식별 가능한 소광 특성을 발휘한다.A quencher refers to a material that absorbs fluorescence light emitted from a fluorescent dye and thereby reduces the fluorescence intensity. The quenching amount varies depending on the distance from the fluorescent dye, and the quencher is different within a predetermined distance Exhibits a quenching characteristic that can be discerned by the optical system when it is close to the fluorescent dye.
이러한 소광자는 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, IRDye QC-1 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 그 종류에 따라 형광세기를 감소시키는 범위가 다르므로 이를 고려하여 선택 사용할 수 있다.These quenchers include Dabcyl, TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, Blackberry Quencher, Black Hole Quencher, Qxl, Iowa black FQ, Iowa Black RQ, IRDye QC- But the present invention is not limited thereto, and the range of decreasing the intensity of fluorescence differs depending on the type thereof.
도 1에 예시한 본 발명의 실시 예에 따르면, 일측 단부에 형광염료를 표지하고 타측 단부에 소광자를 결합한 검출 프로브를 사용하여, 검출 프로브가 표적 핵산에 혼성화되기 이전에는 검출 프로브의 특성에 따라 형광염료와 소광자 사이의 거리가 근접하므로, 외부 광(본 발명에서는 양자점의 방출 빛)을 흡광하더라도 형광염료의 형광 빛이 소광자에 의해 소광된다. 그렇지만, 검출 프로브가 표적 핵산에 혼성화될 시에 펴져 표적 핵산과 결합하게 되므로 형광염료와 소광자 사이의 간격이 멀어지고, 이에, 소광자에 의한 소광 특성을 발휘할 수 없게 되고, 외부 광에 의한 형광염료의 형광 빛이 방출된다. 이러한 검출 프로브는 예를 들어 선행기술문헌 공개특허 제10-2015-0139096호에 개시된 것을 사용하여도 좋으나, 이에 한정되는 것은 아니다.According to the embodiment of the present invention illustrated in FIG. 1, a detection probe having a fluorescence dye at one end and a quencher at the other end is used. Before the detection probe is hybridized to the target nucleic acid, Since the distance between the dye and the small photon is close to each other, the fluorescent light of the fluorescent dye is quenched by the small photon even though it absorbs external light (the emission light of the quantum dots in the present invention). However, when the detection probe is hybridized to the target nucleic acid, it spreads and binds with the target nucleic acid, so that the distance between the fluorescent dye and the small photon is distant, and the quenching property by the small photon can not be exhibited. Fluorescent light of the dye is emitted. For example, the detection probe described in the prior art document 10-2015-0139096 may be used, but is not limited thereto.
도 2에 예시한 본 발명의 실시 예에 따르면, 일측 단부에 형광염료가 표지되어 있되, 소광자에 흡착되는 검출 프로브를 사용한다. 이에 따르면, 외부 광에 의한 형광염료의 형광 빛을 소광하고, 검출 프로브가 표적 핵산에 혼성화될 시에 소광자로부터 분리되며 혼성화되므로, 소광 특성이 발휘되지 아니하고, 외부 광에 의한 형광염료의 형광 빛이 소광되지 아니함에 따라 방출된다. 이러한 검출 프로브 및 소광자는 예를 들어 선행기술문헌 등록특허 제10-1496671호에 개시된 것을 사용하여도 좋으나, 이에 한정되는 것은 아니다.According to the embodiment of the present invention illustrated in FIG. 2, a fluorescent dye is labeled at one end, and a detection probe adsorbed to a small photon is used. According to this, fluorescent light of the fluorescent dye by external light is quenched, and when the detection probe is hybridized to the target nucleic acid, it is separated and hybridized from the small photon, so that the extinction characteristic is not exerted and the fluorescence light of the fluorescent dye Is emitted as it is not extinguished. Such a detection probe and a quencher may be, for example, those disclosed in the prior art document No. 10-1496671, but are not limited thereto.
한편, 도면으로 도시하지 아니하였고 선행기술문헌으로 언급하지는 아니하였지만, 혼성화 여부에 따라 형광 특성이 달라지는 형광염료의 상태 변화를 유도하는 방법으로서, 공개특허 제10-2017-0058780호의 도 3에 예시한 바와 같이 형광염료 및 소광자가 결합된 검출 프로브가 표적 핵산과 혼성화할 시에 형광염료가 결합된 부위가 분리되게 하는 방법, 또는 검출 프로브와 표적 핵산의 혼성화에 따라 형성된 이중 가닥의 하이브리드에 흡착하여 소광하는 형광물질을 사용하는 방법 등에서도 양자점을 분산광원으로 하는 본 발명을 적용할 수 있을 것이다.Although not shown in the drawings and not referred to as prior art documents, a method for inducing a change in the state of a fluorescent dye whose fluorescence characteristics vary depending on hybridization is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-2017-0058780, As described above, when a detection probe having a fluorescent dye and a quencher is hybridized with a target nucleic acid, a site where the fluorescent dye is bound is separated, or a method of adsorbing to a double-stranded hybrid formed by hybridization of a detection probe and a target nucleic acid, The present invention can also be applied to a method of using a quantum dot as a dispersed light source.
바람직하게는 검출 프로브의 변형은 없으면서 상태 변화에 따라 형광 빛의 발광 및 소광이 결정되게 하는 도 1 또는 도 2의 검출 프로브를 사용하는 것이고, 더욱 바람직하게는 양자점을 분산광원으로 한다는 점을 고려하여 검출 프로브와 양자점을 함유한 혼합액을 사용하는 도 1의 검출 프로브를 사용하는 것이라 하겠다.Preferably, the detection probe of FIG. 1 or 2 is used to determine the emission and extinction of fluorescence light in accordance with the change of state without deformation of the detection probe, more preferably considering the point of quantum dots as a dispersion light source The detection probe of FIG. 1 using a mixed solution containing a detection probe and a quantum dot is used.
이하, 설명의 편의를 위해서 도 1에 예시한 바와 같이 말단에 형광염료 및 소광자를 구비한 검출 프로브를 사용하는 것으로 설명하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 형광염료의 상태 변화를 유도하는 여타 다른 방법에도 적용될 수 있음은 자명하다.For convenience of explanation, the detection probe having a fluorescent dye and a quencher is used at the end as illustrated in FIG. 1, but the present invention is not limited to this, and other methods for inducing a state change of the fluorescent dye It is obvious that it can be applied.
< 양자점(QD : quantum dot) >≪ Quantum dot (QD) >
양자점(QD : quantum dot)은 나노 사이즈의 입자로서, 입자 크기별로 빛 파장이 다르게 나타난다. Quantum dots (QDs) are nano-sized particles with different light wavelengths by particle size.
종래 핵산 검출 기술분야에 있어서, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 기반으로 양자점을 활용하기 위해 양자점을 프로브에 접합 또는 링크시켜야 하였으나, 본 발명에 있어서는 FRET 기반으로 하지 아니하므로, 프로브와의 접합 또는 링크가 필요치 아니한다.In the conventional nucleic acid detection technology field, the quantum dots have to be bonded or linked to the probes in order to utilize the quantum dots based on the fluorescence resonance energy transfer (FRET). However, since the present invention is not based on FRET, It is not necessary.
즉, 본 발명에 따르면, 양자점은 검출 프로브 혼합액 내에 독립적으로 고르게 산재되어 있어 검출 프로브와 결합되지 아니하게 하고, 검출 프로브와 표적 핵산이 혼성화할 시에도 혼성화에 따라 발생한 하이브리드와 함께 각자 고르게 산재되어 있게 한다.That is, according to the present invention, the quantum dots are dispersed evenly and independently in the detection probe mixture solution so as not to be combined with the detection probe, and even when the detection probe and the target nucleic acid are hybridized, do.
이에, 혼성화 이전 검출 프로브가 함유된 수용액 내에서 뿐만 아니라 혼성화가 이루어지는 수용액 내에서도 양자점이 독립적으로 고르게 산재되어 있도록 하기 위해서, 본 발명의 실시 예에서는 수용성(water-soluble)을 나타내도록 양자점을 표면 처리한다. 이때의 양자점 표면 처리는 히드록시기(-OH), 카르복실기(-COOH), 아민기(-NH2), 티올기(-SH) 등의 친수성 작용기로 표면 개질(modification)하는 것일 수 있다.In order to uniformly disperse quantum dots independently and not only in the aqueous solution containing the pre-hybridization detection probe but also in the aqueous solution containing the hybridization, the quantum dots are surface-treated so as to exhibit water-soluble property in the embodiment of the present invention . At this time, the surface treatment of the quantum dots may be a modification of the surface with a hydrophilic functional group such as a hydroxyl group (-OH), a carboxyl group (-COOH), an amine group (-NH2), or a thiol group (-SH).
그리고, 양자점을 여기시켜 양자점을 발광시킴으로써 분산광원 역할을 하게 하고, 양자점에서 방출되는 빛이 사방으로 조사됨에 따라 주변 형광염료에 흡광되어 형광염료 고유의 형광 빛을 발하게 한다.Then, the quantum dots are excited to emit quantum dots to serve as a dispersed light source, and as the light emitted from the quantum dots is radiated in all directions, the fluorescent dyes are absorbed by the surrounding fluorescent dyes and emit fluorescent light inherent in the fluorescent dyes.
양자점의 입자 크기는 여기될 시에 형광염료의 특정 입사 파장대의 빛을 방출하도록 형광염료의 입사 파장대에 맞게 선정한다. 이와 같이 양자점을 형광염료에 매칭시킴으로써, 양자점은 특정 파장대의 빛을 흡광하여 고유의 형광 빛을 방출하는 형광염료를 타겟으로 하여 빛을 방출함으로써 타겟이 되는 형광염료의 형광 빛을 방출되게 할 수 있다.The particle size of the quantum dot is selected to match the incident wavelength of the fluorescent dye so as to emit light at a specific incident wavelength band of the fluorescent dye when excited. By matching the quantum dots with the fluorescent dyes as described above, the quantum dots can emit fluorescent light of the target fluorescent dyes by emitting light by targeting fluorescent dyes that absorb light of a specific wavelength band and emit intrinsic fluorescent light .
본 발명의 실시 예에 따르면, 시료 내에 2 종류 이상의 표적 핵산이 존재하여 각 종류의 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 2 종류 이상의 검출 프로브를 사용하는 다형의 표적 핵산 검출 방법에 적용할 수 있으며, 이를 위해서, 검출 프로브의 종류별로 흡광(흡수 또는 수광) 빛의 파장대는 물론이고 방출 형광 빛의 파장대도 상이한 형광염료를 표지하며, 검출 프로브의 종류별로 표지한 서로 다른 형광염료와 일대일 매칭되는 상호 다른 크기의 양자점을 투입 사용한다. 이에, 2 종류 이상의 검출 프로브는 각각 자신과 상보적인 표적 핵산과 혼성활할 시에 표지된 형광염료의 흡광 파장대의 빛을 발산하는 양자점의 빛을 받아 형광 빛을 방출하게 되어서, 다중 검출(multiplex detection)이 가능하다.According to the embodiments of the present invention, the present invention can be applied to a polymorphic target nucleic acid detection method using two or more types of detection probes capable of hybridizing to each kind of target nucleic acid by presence of two or more kinds of target nucleic acids in the sample. , Fluorescent dyes having different wavelength ranges of the emitted fluorescence light as well as the wavelength band of the light absorbing (absorbing or receiving) light are labeled according to the types of the detection probes. The fluorescence dyes having different sizes, which are one to one matched with the fluorescent dyes, Quantum dots are inserted and used. Accordingly, when two or more kinds of detection probes are hybridized with a target nucleic acid complementary to itself, they emit fluorescent light by receiving light of a quantum dot emitting light of a wavelength range of a fluorescent dye labeled with a fluorescent dye, ) Is possible.
물론, 서로 다른 크기의 양자점을 투입 사용하더라도 넓은 흡수 스펙트럼을 갖는 양자점의 특성에 의해서, 서로 다른 크기의 양자점을 단일 여기 광으로 동시 여기시킬 수 있다.Of course, even when quantum dots of different sizes are used, quantum dots of different sizes can be excited simultaneously with single excitation light by the characteristics of the quantum dots having a wide absorption spectrum.
< 검출 ><Detection>
이와 같이 양자점이 주변에 산재되어 있는 상황에서, 검출 프로브와 표적 핵산이 혼성화되면, 형광염료가 소광자로부터 이격되어 형광 빛을 방출할 수 있는 상태로 되므로, 혼성화 여부를 형광 빛으로 검출할 수 있고, 결국, 표적 핵산을 검출할 수 있게 된다.When the detection probe and the target nucleic acid are hybridized in the situation where the quantum dots are scattered around, the fluorescent dye is separated from the small photon and is capable of emitting fluorescence light. Therefore, hybridization can be detected by fluorescent light , So that it becomes possible to detect the target nucleic acid.
본 발명의 실시 예에 따르면, 양자점을 여기시키기 위한 여기 광은 형광 빛과 간섭을 일으키지 아니하는 자외선 또는 레이저로 한다. 이에, 광학계는 하나의 대물렌즈를 통해 여기 광의 광축과 검출을 위한 형광 빛의 광축을 일치시키더라도 형광 빛을 정확하게 검출할 수 있다.According to the embodiment of the present invention, the excitation light for exciting the quantum dots is ultraviolet rays or a laser which does not interfere with fluorescent light. Therefore, even if the optical axis of the excitation light and the optical axis of the fluorescent light for detection coincide with each other through the single objective lens, the optical system can accurately detect the fluorescent light.
도 1 및 도 2에 예시한 실시 예의 광학계(또는 광학 시스템)에 따르면, 양자점이 산재되어 있는 상황에서 검출 프로브와 표적 핵산이 혼성화되는 수용액에 조사되는 여기 광의 광축과 수용액 내에서 방출되는 형광 빛의 광축을 일치시키되, 이때의 일치된 광축 선상에 다이크로익 미러(dichroic mirror)를 설치하여 여기 광 조사를 돕는다. According to the optical system (or optical system) of the embodiment shown in Figs. 1 and 2, in the situation where the quantum dots are scattered, the optical axis of the excitation light irradiated to the aqueous solution in which the detection probe and the target nucleic acid are hybridized and the fluorescence light And a dichroic mirror is provided on the coincident optical axis line at this time to assist excitation light irradiation.
즉, 여기 광이 다이크로익 미러에 반사되어 수용액에 조사되고, 수용액 내에서 발생하는 형광염료의 형광 빛은 다이크로익 미러를 투과하여 형광 빛 검출부(예를 들어 CCD 센서 또는 PMT)에 의해 검출된다.That is, the excitation light is reflected by the dichroic mirror and is irradiated to the aqueous solution, and the fluorescent light of the fluorescent dye generated in the aqueous solution is transmitted through the dichroic mirror and detected by the fluorescence light detecting part (for example, CCD sensor or PMT) do.
여기서, 다이크로익 미러는 특정 파장을 초과하는 빛을 모두 통과시키고, 그 이하의 파장을 갖는 빛은 반사시키는 특성이 있으며, 여기 광 파장대 이하의 파장대를 갖는 빛은 반사시키고, 여기 광 파장대을 초과하는 파장대의 빛은 모두 통과시키는 것으로 선택 적용한다.Here, the dichroic mirror has a property of passing light exceeding a specific wavelength and reflecting light having a wavelength lower than that, and reflects light having a wavelength band below the excitation light wavelength band, The light of the wavelength band is selectively applied by passing it all.
한편, 본 발명에 따르면, 여기 광으로 여기시켜 분산광원으로 사용하는 양자점의 방출 빛도 다이크로익 미러를 투과하여 검출될 수 있으므로, 검출부와 다이크로익 미러의 사이에 추가로 다이크로익 미러를 설치하여 양자점의 방출 빛을 반사시키고, 형광 빛을 투과되게 한다.According to the present invention, since the emission light of the quantum dots excited by the excitation light and used as the dispersion light source can also be detected through the dichroic mirror, a dichroic mirror is additionally provided between the detection unit and the dichroic mirror To reflect the emitted light of the quantum dots and to transmit the fluorescent light.
이를 통해, 양자점의 방출 빛을 검출함으로써, 양자점이 분산광원으로서의 역할을 제대로 하는지 검증할 수 있고, 또는, 혼성화 이전과 혼성화 이후의 빛을 비교하여 혼성화 전후의 상황 변화를 비교 분석할 수도 있다.By detecting the emitted light of the quantum dots, it is possible to verify whether the quantum dots properly function as a dispersed light source or to compare the state before and after hybridization by comparing light before and after hybridization.
본 발명의 실시 예에 따르면, 형광염료의 형광 빛을 검출하여 표적 핵산을 검출하는 방법은 융해곡선 분석(Melting Curve Analysis)에 의해 이루어진다.According to an embodiment of the present invention, a method of detecting fluorescent light of a fluorescent dye and detecting a target nucleic acid is performed by Melting Curve Analysis.
융해곡선 분석(Melting Curve Analysis)은 온도를 높일수록 검출 프로브와 표적 핵산 간의 혼성화 강도가 약해지고, 소정 온도 이상으로 높이면 분리되는 특성을 이용하는 분석 방법으로서, 온도를 점차 높여가며 형광 빛 세기의 변동율을 산정하여 얻는 융해곡선을 패턴 분석(실제로는 융해 피크 분석)하여 표적 핵산의 유무, 또는 표적 핵산 중의 변이 유무 등을 판정할 수 있다. 일반적으로 융해곡선의 융해 피크(melting peak)가 형성되는 부분의 온도를 융해점 또는 Tm(Melting Temperature) 값으로 하여 판정한다.Melting Curve Analysis is an analytical method that uses the property of weakening the hybridization strength between the detection probe and the target nucleic acid as the temperature is raised and separating when the temperature is raised above a predetermined temperature. The Melting Curve Analysis is a method of calculating the rate of change of the fluorescent light intensity (Actually, melting peak analysis) can be used to determine the presence or absence of a target nucleic acid or the presence or absence of a mutation in the target nucleic acid. Generally, the temperature at the portion where the melting peak of the melting curve is formed is determined as the melting point or Tm (Melting Temperature) value.
물론, 형광염료의 형광 빛 및 양자점의 발광 빛을 검출할 시에는 각각 해당 빛의 파장대를 선별적으로 투과하는 필터로 필터링한 후 해당 빛을 측정하는 것이 바람직하다.Of course, when fluorescent light of the fluorescent dye and light emitted from the quantum dots are detected, it is preferable to filter the light by selectively filtering the wavelength band of the corresponding light and then measure the corresponding light.
이하, 본 발명에 따른 표적 핵산 검출 방법의 구체적인 실시 예를 위해서 창안한 시약 시료 반응 분석용 키트 및 이를 이용한 표적 핵산 검출 장치와, 표적 핵산 검출 방법의 구체적인 실시 예를 설명한다.Hereinafter, specific embodiments of a reagent sample reaction analyzing kit, a target nucleic acid detecting device and a target nucleic acid detecting method, which are invented for a specific embodiment of the target nucleic acid detecting method according to the present invention, will be described.
< 시약 시료 반응 분석용 키트 ><Kit for analyzing reagent sample reaction>
도 3을 참조하면, 키트(100)는 유동 칩(110) 및 커버(120)를 기구적 구성요소로 포함하여 구성된다. 키트(100)를 설명함에 있어, 예시적으로 시료는 표적 핵산을 함유한 시료이고, 시약은 표적 핵산을 검출하기 위한 시료로 하여, 상기한 표적 핵산 검출 방법에 이용할 수 있음을 보여준다.Referring to FIG. 3, the
상기 유동 칩(110)은 표적 핵산을 함유한 시료를 담아둘 제1 웰(111), 시약을 담아둘 제2 웰(112), 및 제2 웰(112)의 시약이 넘칠 시에 제1 웰(111)로 투입되게 할 유로(113)를 조성한 구성요소이다.The
실시 예를 구체적으로 살펴보면, 상호 이격된 위치에 조성하는 제1 웰(111) 및 제2 웰(112)은 각각 상부가 열려 있고 하부로 갈수록 점차 줄어드는 우물 형태로 아래로 돌출되어 있고, 상부 열려 있는 개구 중에 상호 마주하는 방향에 노치(notch)를 조성한 후 노치 사이를 이어지게 한 장요홈 형태의 유로(113)를 조성하였다.In detail, the first and
여기서, 유로(113)는 제1 웰(111)과 연결되는 부위와 제2 웰(112)에 연결되는 부위의 내부 바닥면을 각각 하향 경사지게 조성한 경사면(113a)으로 조성하여, 제2 웰(112)의 시약이 제1 웰(111)로 원활하게 유입되게 한다.Here, the
한편, 유동 칩(110)의 상면 중에 제1,2 웰(111, 112)의 둘레, 유로(113)의 둘레, 및 테두리를 제외한 면을 하방으로 함몰시킨 함몰부(114)를 조성하여서, 후술하는 커버(120)의 끼움부(124)가 끼워지게 한다.A
상기 커버(120)는 시약 시료가 새지 아니하도록 유동 칩(110)의 상부를 덮어 실링하는 구성요소로서, 함몰부(114)의 조성에 따라 함몰부(114)의 바닥면으로 돌출되게 된 제1,2 웰(111, 112)의 상부 개구 둘레 및 유로(113)의 상부 개구 둘레에 밀착되며, 함몰부(114)의 형상에 맞게 하부로 돌출된 끼움부(124)를 저면에 구비하여, 끼움부(124)를 함몰부(114)에 끼우는 방식으로 유동 칩(110)의 상면에 겹쳐 고정시킬 수 있고, 이에, 제2 웰(112)에서 넘치는 시약이 다른 데로는 새지 아니하고 유로(113)를 통해서만 제1 웰(111)로 흐르게 한다. The
아울러, 상기 커버(120)는 제1 웰(111)의 상부 개구를 덮는 부위를 절개 제거하여 조성한 투광창(121), 및 하부 방향으로의 눌림에 의해 제2 웰(112)에 담겨지도록 제2 웰(112)의 상부 개구를 덮는 부위에 조성한 담금 부재(122)를 구비한다.The
상기 투광창(121)을 페구하기 위한 수단을 구비하며, 구체적인 실시 예에 따르면, 투명한 실링 테이프(125)로 투광창(121)을 덮게 하며, 점착성 또는 접착성을 갖게 하여 이탈하지 않게 한다.According to a specific embodiment of the present invention, the
본 발명의 실시 예에 따르면, 상기 커버(120)는 탄성적으로 수축 가능한 재질로서 예를 들어 실리콘 재질처럼 고무탄성 특성을 갖는 재질로 구성되어, 끼움부(124)를 함몰부(114)에 억지끼움 방식으로 유동 칩(110)의 상면을 덮으면, 제1 웰(111), 제2 웰(112) 및 유로(113)의 상부 열린 부위를 덮어 실링할 수 있다.According to the embodiment of the present invention, the
담금 부재(122)는 커버(120) 중에 제2 웰(112)의 상부 개구를 덮는 부위로 구성되되, 하부로 돌출되어 있어 제2 웰(112)에 담길 수 있고, 하부로 돌출된 하부 구조를 제2 웰(112)의 하부측 내부의 형상으로 형태 유지할 수 있는 형상 유지부(122a)로 구성하고, 상부측 구조에 대해서는 형상 유지부(122a)의 눌림에 의해 하부로 늘어나거나 형상 유지부(122a)를 하부로 이동시키는 데 필요한 길이만큼 주름져 있어서, 형상 유지부(122a)를 상부측 노출된 부위를 하방으로 눌러 제2 웰(112)의 내부 바닥에 밀착시킬 수 있다. 이에, 제2 웰(112)의 시약을 최대한 많이 제1 웰(111)로 투입할 수 있다. The
본 발명의 실시 예에서는 고무탄성 재질로 되어 있다고 하였고, 담금 부재(122)의 상부측 구조는 하부측 형상 유지부(122a)에서 연장되어 커버(120) 위로 돌출된 후 커버(120)의 평평한 면에 이어지도록 1회 굽어진 형태를 갖추므로, 담금 부재(122)는 하방으로 눌렀을 시에 눌어남과 동시에 굽어진 상부측 구조를 펴지게 하면서 제2 웰(112)의 내부 바닥까지 담겨진다.The upper side structure of the
실시 예에 따르면, 담금 부재(122)의 형상 유지부(122a)는 제2 웰(112) 하부 측 내부면에 밀착할 수 있으면서 속이 채워진 형태를 이루어, 눌림에 의한 형태 변화는 적게 나타나게 하였다.According to the embodiment, the
상기 커버(120)는 제1 웰(111)에서 제2 웰(112)로 역류하는 것을 방지하는 역류 방지 수단을 구비하며, 구체적인 실시 예에 따르면, 역류 방지 수단은 상기 유로(113)를 막은 상태에서 담금 부재(122)의 눌림으로 투입되는 시약의 유압에 의해 제1 웰(111) 방향으로 탄성 변형되며 유로(113)를 개방하는 역류방지 돌기(123)로 구성된다. The
이때의 역류방지 돌기(123)는 유로(113) 내에 조성한 경사면(113a) 중에 제1 웰(111) 측의 경사면(113a)이 조성된 부위의 유로(113)를 막도록 저면에 돌출되어 있고, 제1 웰(111)에서 멀어질수록 하부로의 돌출 높이를 작게 하여서, 시약에 의한 유압이 가해질 시에 제1 웰(111) 방향으로 탄성 변형되며 유로(113)를 개방한다. 물론, 유압이 가해지지 아니하면 탄성 복원하여 유로(113)를 막게 되고, 제1 웰(111)에서의 역방향 압력이 가해져도 개방하지 아니하고 유로(113)를 막은 상태로 유지되게 한다.The
한편, 커버(120)의 재질적 특성에 의해 담금 부재(122)를 눌렀을 시에 유로(113)를 덮는 부위가 담금 부재(122) 쪽으로 당겨지게 되고, 이에 따라, 역류방지 돌기(123)를 개방 동작시키는 힘이 가해지게 하므로, 개방 동작을 원활하게 한다.On the other hand, due to the material characteristics of the
이와 같이 구성되는 키트(100)는 시료 및 시약을 독립적으로 상호 분리되어 있도록 제1,2 웰(111, 112)에 담아 두어 시료와 시약 간의 반응을 위한 세팅이 완료되므로, 다루기 쉽고, 시료 또는 시약에 대한 전처리 과정이 필요한 경우 해당되는 것만 독립적으로 전처리 과정을 수행할 수 있으며, 전처리 과정 이후 시료와 시약 간의 반응을 위한 혼합과정이 용이함은 물론이고, 반응으로 나타나는 결과도 관찰할 수 있게 되어 있어, 전반적으로 시약 시료 반응 분석용 키트에 유용하다.In the
한편, 다중 검출(multiplex detection)을 위해 서로 다른 크기의 양자점을 키트의 구성품으로 하는 것이 좋다.On the other hand, it is preferable to use quantum dots of different sizes as components of the kit for multiplex detection.
이상에서 설명한 키트(100)는 표적 핵산을 함유한 시료를 제1 웰(111)에 넣고, 표적 핵산의 검출을 위한 시약을 제2 웰(112)에 넣으며, 시약을 시료에 투입한 후 투광창(121)을 통해 표적 핵산을 검출하는 키트로 사용할 수 있다. 여기서, 시약은 상기한 바와 같이 표적 핵산에 대해 상보적 염기서열을 갖는 검출 프로브가 양자점과 함께 산재되어 있는 시약으로 하여서, 시약을 시료에 투입함에 따라 양자점이 산재되어 있는 환경 하에서 검출 프로브와 표적 핵산을 혼성화시켜 혼성화 여부에 따라 형광 특성이 달라지는 형광염료의 상태 변화를 유도하게 할 수 있다.In the
이에 대해서는 하기의 표적 핵산 검출 장치에 대한 설명에서 상세하게 설명한다.This will be described in detail in the following description of the target nucleic acid detecting apparatus.
< 표적 핵산 검출 장치 ><Target nucleic acid detection device>
도 4를 참조하면, 상기 키트(100)에 광학계(또는 광학시스템, 200) 및 히터(300)를 더하여 표적 핵산 검출 장치를 구성한다.Referring to FIG. 4, an optical system (or optical system 200) and a
히터(300)는 컨트롤러(미도시)에 의해 온도를 제어할 수 있는 구성요소로서, 상기 키트(100)를 올려놓는 안착대(301) 중에 제1 웰(111)이 끼워져 안착되는 부위에 장착된다. The
이때, 안착대(301)에 올려놓는 키트(100)는 표적 핵산을 함유한 시료 및 PCR 증폭 시약을 상기 제1 웰(111)에 넣고, 표적 핵산의 검출을 위한 시약을 제2 웰(112)에 넣은 후 커버(120)로 실링한 상태이다. 실시 예에 따르면, 시약은 표적 핵산에 대해 상보적 염기서열을 갖는 검출 프로브와, 분산광원으로 사용할 양자점이 고르게 산재되어 있되, 혼성화 여부에 따라 형광 특성이 달라지는 형광염료가 검출 프로브에 표지되어 있다. The reagent for detecting the target nucleic acid is immobilized on the
한편, 컨트롤러(미도시)에 의한 온도 제어는 시약을 투입하기 이전 제1 웰(111)의 시료에 대해 온도 변화를 주어 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응) 증폭하기 위한 온도 제어와, 제2 웰(112)의 시약을 제1 웰(111)에 투입한 상태에서 제1 웰(111)에 온도 변화를 주어 융해곡선 분석(Melting Curve Analysis) 하기 위한 온도 제어이며, 이와 같은 온도 제어 방식은 본 발명이 속한 기술분야에서 공지된 기술인 바, 상세 설명을 생략한다.On the other hand, the temperature control by the controller (not shown) includes temperature control for amplifying PCR (polymerase chain reaction, polymerase chain reaction) by applying a temperature change to the sample of the first well 111 before introducing the reagent, The temperature control for performing a melting curve analysis by applying a temperature change to the first well 111 in a state where the reagent of the two
여기서, 커버(120)의 담금 부재(122)를 누를 수 있는 누름 수단을 유압 실린더 등으로 구성하여, 시약의 투입을 컨트롤러에 의해 이루어지게 하여도 좋다.Here, the pressing means for pressing the
상기 광학계(200)는 히터(300)에 안착된 키트(100)의 투광창(121) 위에 배치된다. 구체적으로, 투광창(121) 위에는 대물렌즈부(210), 제1 다이크로익 미러(220), 제2 다이크로익 미러(230), 형광 빛 검출용 필터(241) 및 형광 빛 검출부(240)의 순서로 연직방향으로 배치되어, 형광 빛을 검출할 수 있고, 양자점을 여기시키는 여기 광원(221)이 제1 다이크로익 미러(220)의 반사에 의한 도움을 받아 형광 빛의 광축과 일치되어 대물레즈부(210)를 통해 제1 웰(111)에 조사되게 한다. The
양자점에서 방출되는 빛이 형광염료의 형광 빛과 함께 제1 웰(111)로부터 방출되므로, 제2 다이크로익 미러(230)로 양자점의 방출 빛을 반사시킨 후 필터(232)로 필티링하여 양자점 빛 검출부(231)로 검출되게 한다.Since the light emitted from the quantum dots is emitted from the first well 111 together with the fluorescent light of the fluorescent dye, the emitted light of the quantum dots is reflected by the second
여기서, 제1,2 다이크로익 미러(220)는 특정 파장을 초과하는 빛을 모두 통과시키고, 그 이하의 파장을 갖는 빛은 반사시키는 특성이 있는 다이크로익 미러(dichroic mirror)로서, 제1 다이크로익 미러(220)는 형광 빛과 양자점 방출 빛을 포함하는 파장대는 통과시키지만 여기 광의 파장대 빛은 반사시키고, 제2 다이크로익 미러(230)는 형광 빛의 파장대 빛은 통과시키지만 양자점 방출 빛의 파장대 빛은 반사시키도록 적절하게 선택 사용한다. 또한 다중 검출에서와 같이 검출하고자 하는 파장대의 검출부를 추가하려는 경우 다이크로익 미러를 추가 설치할 수도 있고 방향을 달리하여 설치할 수도 있음을 밝혀 둔다.Here, the first and second
그리고, 필터(232, 241)는 각각 검출하려는 빛의 파장대만 선별적으로 통과시키는 필터로 구성하면 된다. 또한, 경우에 따라 회전판상에 서로 다른 파장대역을 갖는 필터를 배치하여 선별적으로 회전시켜 다양한 파장대의 빛을 검출하도록 할 수도 있다.Each of the
형광 빛 검출부(240) 및 양자점 빛 검출부(232)는 예를 들어 CCD 센서 또는 PMT(photo multiplier tube)로 구성할 수 있다.The fluorescent
이와 같이 구성되는 표적 핵산 검출 장치를 이용한 표적 핵산 검출 방법의 구체적인 실시 예를 설명한다.A specific example of the method for detecting a target nucleic acid using the target nucleic acid detecting apparatus constructed as above will be described.
<구체적인 실시 예><Specific Example>
본 발명을 적용하여 KRAS G12D 돌연변이를 검출한 실시 예를 도 5 내지 도 8을 참조하며 설명한다.An embodiment in which the KRAS G12D mutation is detected by applying the present invention will be described with reference to FIGS. 5 to 8. FIG.
먼저, 준비단계(S10)를 수행하였다.First, preparation step S10 was performed.
이 단계에서는, KRAS G12D 돌연변이의 증폭을 위한 PCR 증폭 시약 20㎕과 KRAS G12D 돌연변이를 함유한 시료 5㎕를 순차적으로 제1 웰(111)에 넣고(S11, S12), 검출 프로브를 함유한 시약 36.8㎕와 키트의 구성품인 양자점의 희석액을 순차적으로 제2 웰(112)에 넣었다(S13, S14).In this step, 20 μl of a PCR amplification reagent for amplification of KRAS G12D mutation and 5 μl of a sample containing a KRAS G12D mutation were sequentially introduced into the first well 111 (S11, S12), and the reagent 36.8 And the dilution liquid of the quantum dots as the components of the kit were sequentially introduced into the second well 112 (S13, S14).
구체적인 실시 예에서는, KRAS 돌연변이 종류 중에 G12D 및 G12V를 동시 검출하기 위해 각각 타겟으로 하는 돌연변이와 혼성활할 수 있도록 염기서열이 상이한 2종의 PNA 검출 프로브를 사용하였다. In a specific example, two types of PNA detection probes with different base sequences were used to simultaneously detect G12D and G12V in KRAS mutant species, respectively, so as to hybridize with target mutations.
검출 프로브 중에, G12D의 검출을 위한 검출 프로브에는 HEX 형광염료를 표지되어 있고, G12V의 검출을 위한 검출 프로브에는 텍사스 레드 형광염료가 표지되어 있으며, 소광자는 답실(Dabcyl)을 사용한 것으로 하였다. 이러한 검출 프로브는 본 발명의 출원인이 특허출원한 공개특허 제10-2015-0054633호에서 보여준 PNA 프로브을 활용하여 본 발명에 적합하게 한 것으로 하였다.Among the detection probes, HEX fluorescent dye was labeled for the detection probe for detecting G12D, Texas red fluorescent dye was labeled for the detection probe for detecting G12V, and Dabcyl was used for the quencher. Such a detection probe is adapted to the present invention utilizing the PNA probe shown in the patent application No. 10-2015-0054633 filed by the applicant of the present invention.
그리고, HEX 형광염료를 여기시키기 위한 530 QD와, 텍사스 레드 형광염료를 여기시키기 위한 590 QD로 이루어지는 2종의 양자점을 사용한다. 각각의 양자점은 증류수로 1/100로 희석한 후 6.6㎕씩 제2 웰(112)에 넣었다.Two types of quantum dots are used, which are 530 QD for exciting the HEX fluorescent dye and 590 QD for exciting the Texas red fluorescent dye. Each of the quantum dots was diluted 1/100 with distilled water, and 6.6 占 퐇 was added to the
다음으로, 조립 단계(S20)를 수행하였다.Next, the assembling step S20 was performed.
이 단계에서는, 커버(120)로 유동 칩(110)을 덮고(S21), 실링 테이프(125)로 투광창(121)을 막아(S22), 유동 칩(110)을 실링하였다. 즉, 끼움부(124)를 함몰부(114)에 억지 끼워넣는 방식으로 커버(120)를 유동 칩(111)에 고정하여 제1,2 웰(111, 112) 및 유로(113)의 상부 열린 개구를 커버(120)로 덮어 실링한다. 이때, 역류방지 돌기(123)에 의해 유로(113)가 막혀 있게 되며, 담금 부재(112)는 일부 제2 웰(112)에 담겨 있게 된다. 한편, 투광창(121)을 실링 테이브(125)로 미리 막아둔 커버(120)를 유동 칩(110)에 고정하여도 좋다.In this step, the floating
다음으로, PCR 단계(S30)를 수행하였다.Next, the PCR step (S30) was performed.
이 단계에서는 키트(100)를 안착대(301)에 안착한 후, 제1 웰(111)을 히터(300)로 가열 및 냉각하는 사이클을 반복하여 표적 핵산(여기서는 G12D)을 증폭하였다. 구체적인 PCR 증폭 사이클은 예를 들어 본 발명의 출원인이 특허 출원한 공개특허 제10-2015-0054633호에서 KRAS 돌연변이 유전자 검출에 적용한 실시 예를 응용하였다.In this step, the
이와 같이 양자점이 함유된 제2 웰(112)의 검출 시약을 제1 웰(111)에 투입하기 이전, PCR 증폭하므로 PCR 증폭에 따른 양자점의 열화 문제는 발생하기 아니한다.Since the detection reagent of the second well 112 containing the quantum dots is PCR amplified before the first reagent is introduced into the
또한, 제1 웰(111)은 실링 테이프(125)를 포함한 커버(120)에 의해 밀폐되고, 역류방지 돌기(123)에 의해서도 제2 웰(112)과의 통로인 유로(113)가 막혀 있으므로, PCR 증폭과정에서 증발에 의한 시료의 유실도 방지한다.The
다음으로, 혼성화 단계(S40)를 수행하였다.Next, a hybridization step (S40) was performed.
이 단계에서는 커버(120)에 구비된 담금 부재(122)를 형상 유지부(122a)가 제2 웰(112)의 내부 바닥에 닿을 때까지 눌렀다. 즉, 제2 웰(112)의 검출 시약은 유로(113)를 통해 제1 웰(111)을 향해 흐르려는 압력을 받게 되고, 역류방지 돌기(123)를 탄성 변형 시켜 유로(113)를 개방하며 제1 웰(111)로 투입되었다At this stage, the
이에, 제1 웰(111) 내에서는 양자점이 산재되어 있는 혼합액 내에서 검출 프로브와 표적 핵산(즉, G12D) 간에 혼성화가 진행되었다.Thus, in the
다음으로, 검출 단계(S50)를 수행하였다.Next, the detection step S50 is performed.
이 단계에서는, 히터(300)를 제어하여 제1 웰(111)에 온도 변화를 주며, 광학계(200)로 검출하여 융해곡선 분석(Melting Curve Analysis)하였다. 실링 테이프(125)를 제거하더라도 융해곡선 분석 과정에서 증발 등의 문제가 큰 영향을 주지 아니한다면, 실링 테이프(125)를 제거한 상태에서 검출 단계(S50)를 수행하여도 좋다.In this step, the
이때의 광학계(200)는 자외선 또는 레이저를 제1 웰(111) 내로 조사하면서 검출되는 형광 빛 및 양자점 방출 빛을 검출한다. 또한, 융해곡선을 얻을 시에는 0.5℃ 간격으로 온도를 상승시키며 형광 빛을 측정함으로써, 융해 피크의 정밀도를 높이는 것이 좋다.At this time, the
2종의 양자점을 사용하였지만, 넓은 입사 스펙트럼을 갖는 양자점의 특성에 의해, 모든 양자점을 여기시켜 분산광원 역할을 하게 할 수 있다. 그리고, 2종의 양자점은 각기 그 크기에 대응되는 협대역의 빛을 방출하게 되므로, 각자 타겟으로 하는 형광염료를 방출 빛으로 여기시켜 고유 형광 빛을 방출되게 한다. Although two types of quantum dots are used, all the quantum dots can be excited by the characteristics of the quantum dots having a broad incident spectrum to serve as a dispersion light source. Each of the two types of quantum dots emits light in a narrow band corresponding to the size of the quantum dots, so that the fluorescent dye serving as a target is excited by the emitted light to emit intrinsic fluorescent light.
구체적인 실시 예에서는 405nm 파장대역을 갖는 자외선으로 양자점을 여기시켰다.In a specific embodiment, the quantum dots are excited with ultraviolet light having a wavelength band of 405 nm.
도 7은 KRAS G12D 돌연변이(Mutant) DNA와 야생형(wild) DNA의 비율 변화에 따른 결과 그래프로서, KRAS G12D 돌연변이(Mutant) DNA의 비율이 0%, 0.5%, 1%, 10%, 100%인 경우마다 도 5,6 에 도시한 표적 핵산 검출 방법을 반복 수행하여 얻은 결과를 보여준다. 이에 따르면, 융해 피크(melt peak)의 Tm은 45℃ 내지 52℃ 범위 내로 수렴되므로, 이 온도 범위를 KRAS G12D 돌연변이의 판정기준으로 선정하였다.FIG. 7 is a graph showing the results of KRAS G12D mutant DNA and wild DNA ratio changes. The ratio of KRAS G12D mutant DNA was 0%, 0.5%, 1%, 10%, and 100% The result obtained by repeatedly performing the target nucleic acid detection method shown in Figs. 5 and 6 is shown in each case. According to this, since the Tm of the melt peak converges within the range of 45 to 52 캜, this temperature range is selected as a criterion for KRAS G12D mutation.
한편, KRAS G12V의 검출을 위한 검출 프로브 및 590 QD에 의해 검출되는 형광 빛은 유의미한 크기 이하로 미미하였다.On the other hand, the fluorescence light detected by the detection probe and the 590 QD for detection of KRAS G12V was insignificant or less than a significant size.
실제 임상샘플에 적용하여 본 발명에 따른 표적 핵산 검출 방법을 검증하였다.The target nucleic acid detection method according to the present invention was verified by applying to actual clinical samples.
이를 위해서, 인천성모병원 인체유래물질 자원은행에서 임상 검체를 제공받아 본 발명에 따른 표적 핵산 검출 방법을 적용한 결과, 융해곡선 분석(Melting Curve Analysis)에 따른 도 8의 그래프를 얻었다.In order to achieve this, a clinical sample was received from the human-derived material resource bank of Incheon St. Mary's Hospital, and the target nucleic acid detection method according to the present invention was applied. As a result, the graph of FIG. 8 according to the Melting Curve Analysis was obtained.
도 8의 그래프를 살펴보면, 융해 곡선 중에 융해 피크(melt peak)의 Tm이 48℃인 곡선이 존재하고, 상기한 판정기준 내에 들어가므로, KRAS G12D 돌연변이가 검출되는 것으로 판정 내릴 수 있다. Referring to the graph of FIG. 8, it can be judged that a KRAS G12D mutation is detected because a curve having a melting peak Tm of 48 DEG C exists in the melting curve and falls within the above-mentioned criterion.
한편, KRAS G12V 돌연변이의 검출을 위해 투입한 검출 프로브 및 590 QD에 의해 검출되는 융해 곡선 그래프도 나타나기는 하지만, 융해 피크(melt peak)의 Tm이 G12V의 판정범위에 들지 않기 때문에 KRAS G12V 돌연변이가 존재하지 않는 것으로 판정할 수 있다. 또한 융해 피크(melt peak)의 Tm이 판정범위안에 들 경우에도 융해 피크(melt peak)의 최소높이를 지정하여 KRAS G12V 돌연변이는 존재하지 아니하는 것으로 판정 내릴 수 있다. 예를 들어, noise의 판정 기준은 KRAS G12V 돌연변이가 존재하지 아니하는 시료를 검출할 시에 나타나는 융해 피크를 얻어 돌연변이 존재 여부의 판정기준으로 사용할 융해 피크의 threshold 값을 590 QD의 량에 따라 미리 정하여 사용할 수도 있다.On the other hand, a KRAS G12V mutation is present because the Tm of the melt peak does not fall within the range of G12V, although a detection curve inserted for the detection of KRAS G12V mutation and a melting curve graph detected by 590 QD are also shown It can be determined not to be. Also, even if the Tm of the melt peak falls within the determination range, it can be determined that the KRAS G12V mutation does not exist by designating the minimum height of the melt peak. For example, the noise criterion is the threshold of the melting peak to be used as a criterion for determining the presence of a mutation by preliminarily determining the amount of the 590 QD when a sample having no KRAS G12V mutation is detected, It can also be used.
이상에서 본 발명의 기술적 사상을 예시하기 위해 구체적인 실시 예로 도시하고 설명하였으나, 본 발명은 상기와 같이 구체적인 실시 예와 동일한 구성 및 작용에만 국한되지 않고, 여러가지 변형이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 한도 내에서 실시될 수 있다. 따라서, 그와 같은 변형도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주해야 하며, 본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의해 결정되어야 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments, . ≪ / RTI > Accordingly, such modifications are deemed to be within the scope of the present invention, and the scope of the present invention should be determined by the claims that follow.
100 : 키트
110 : 유동 칩 111 : 제1 웰 112 : 제2 웰
113 : 유로 113a : 경사면 114 : 함몰부
120 : 커버 121 : 투광창 122 : 담금 부재
122a : 형상 유지부 123 : 역류방지 돌기 124 : 끼움부
125 : 실링 테이프
200 : 광학계
210 : 대물렌즈부
220 : 제1 다이크로익 미러 221 : 여기 광원
230 : 제2 다이크로익 미러 231 : 양자점 빛 검출부 232 : 필터
240 : 형광 빛 검출부 241 : 필터
300 : 히터 301 : 안착대100: Kit
110: floating chip 111: first well 112: second well
113:
120: cover 121: light transmitting window 122: immersion member
122a: shape retaining portion 123: backflow preventing projection 124:
125: sealing tape
200: Optical system
210: Objective lens unit
220: first dichroic mirror 221: excitation light source
230: second dichroic mirror 231: quantum dot light detecting unit 232: filter
240: fluorescent light detector 241: filter
300: heater 301: seat
Claims (10)
산재되어 있는 양자점을 여기시킴에 따라 분산광원 역할을 하게 하고, 양자점의 방출 빛을 받는 형광염료의 형광 빛을 검출함으로써 표적 핵산을 검출하는 검출 단계;
를 포함하는 표적 핵산 검출 방법.A hybridization step of hybridizing a detection probe having a complementary base sequence to a target nucleic acid with a target nucleic acid in an environment in which quantum dots are scattered to induce a change in the state of the fluorescent dye whose fluorescence characteristics are different depending on hybridization;
Detecting a target nucleic acid by detecting fluorescence light of a fluorescent dye which emits light emitted from the quantum dots by acting as a dispersed light source by exciting scattered quantum dots;
≪ / RTI >
상기 혼성화 단계 이전에 표적 핵산을 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응) 증폭하는 증폭 단계를 수행하는 표적 핵산 검출 방법.The method according to claim 1,
And performing an amplification step of amplifying the target nucleic acid by PCR (polymerase chain reaction) before the hybridization step.
상기 혼성화 단계는 검출 프로브와 양자점이 각자 고르게 산재되어 있는 혼합액을 준비하여 상기 증폭 단계에 의해 증폭된 표적 핵산이 함유되어 있는 시료에 투입하는 표적 핵산 검출 방법.3. The method of claim 2,
Wherein the hybridization step comprises preparing a mixture solution in which the detection probes and the quantum dots are uniformly dispersed, and introducing the mixed solution into a sample containing the target nucleic acid amplified by the amplification step.
상기 검출 단계는 자외선 또는 레이저로 양자점을 여기시키되, 여기 광을 반사시키고 형광염료의 형광 빛을 투과시키는 다이크로익 미러(dichroic mirror)의 도움을 받아 여기 광의 광축 및 형광 빛의 광축을 일치시키는 표적 핵산 검출 방법.The method according to claim 1,
The detection step may include detecting the excitation of the quantum dots by ultraviolet light or a laser, the excitation of the excitation light, the excitation of the excitation light by a dichroic mirror which reflects the excitation light and transmits the fluorescent light of the fluorescent dye, Nucleic acid detection method.
상기 양자점은 수용성을 나타내도록 표면 처리한 표적 핵산 검출 방법.The method according to claim 1,
Wherein the quantum dot is surface-treated to exhibit water solubility.
상기 검출 프로브는 일측 단부에 상기 형광염료를 표지하고, 타측 단부에 소광자를 결합한 것으로 하는 표적 핵산 검출 방법.The method according to claim 1,
Wherein the detection probe has the fluorescence dye at one end and the quencher at the other end.
상기 검출 프로브는 일측 단부에 상기 형광염료를 표지하고, 소광자에 흡착되어 있다가 표적 핵산과 혼성화될 시에 소광자로부터 분리되는 것으로 하는 표적 핵산 검출 방법.The method according to claim 1,
Wherein the detection probe is labeled at one end with a fluorescent dye and adsorbed to the small photon and then separated from the small photon when hybridized with the target nucleic acid.
상기 형광염료는 특정 파장대의 빛을 흡광하여 고유의 형광 빛을 방출하고,
상기 양자점은 상기 형광염료가 갖고 있는 특정 파장대의 흡광 빛을 방출할 수 있는 크기로 하는 표적 핵산 검출 방법.The method according to claim 1,
The fluorescent dye absorbs light of a specific wavelength band and emits fluorescence of its own,
Wherein the quantum dot has a size capable of emitting an absorbing light of a specific wavelength band possessed by the fluorescent dye.
다형의 표적 핵산 검출을 위해 흡광 및 방출 형광 빛의 파장대가 상이한 형광염료를 표지한 검출 프로브와, 각 형광염료의 흡광 파장대에 맞는 상호 다른 크기의 양자점을 투입하는 표적 핵산 검출 방법.9. The method of claim 8,
A detection probe labeled with a fluorescent dye having a different wavelength band of a light absorbing and emitting fluorescence light for detection of a polymorphism target nucleic acid; and a method for detecting a target nucleic acid by introducing quantum dots of mutually different sizes to match the absorption wavelength band of each fluorescent dye.
상기 검출 단계는 융해곡선 분석(Melting Curve Analysis)으로 이루어지는 표적 핵산 검출 방법.The method according to claim 1,
Wherein the detecting step comprises a Melting Curve Analysis.
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