KR20190001349A - Preparation method of Carbon Quantum-dot - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 새로운 탄소 양자점의 제조방법 및 이로부터 제조된 탄소 양자점에 대한 것이다.The present invention relates to a method for producing a new carbon quantum dot and a carbon quantum dot prepared therefrom.
과거 양자점(quantum-dot)은 반도체 디스플레이 분야에서 널리 사용되었으며, 주로 중금속을 기반으로 하였다. 그러나 양자점의 생물 및 의약 분야로의 이용가능성이 대두되면서, 인체에 투여될 수 있는 생체 적합성 양자점에 대한 연구가 활성화되고 있다. 특히, 탄소 양자점(carbon quantum-dot)은 중금속 기반의 양자점에 비해 낮은 세포독성, 높은 생체 친화성, 화학적 안정성의 특성을 나타낼 것으로 예상된다.In the past, quantum-dots were widely used in the field of semiconductor displays, mainly based on heavy metals. However, with the emergence of quantum dots in the biological and medical fields, studies on biocompatible quantum dots that can be administered to the human body are being actively promoted. In particular, the carbon quantum-dot is expected to exhibit lower cytotoxicity, higher biocompatibility, and chemical stability characteristics than heavy metal-based quantum dots.
일반적으로 탄소 양자점은 탑-다운(top-down, TD) 방식 또는 바텀-업(bottom-up, BU) 방식 두 가지 중 하나의 방식으로 합성된다. TD 방식은 반응 조건이 까다로우며, 형태의 조절이 어렵고 합성 단계가 복잡하다는 단점이 있다. 반면, BT 방식은 전구체의 종류와 탄화작용의 조건에 따라 비교적 쉽고 정교하게 양자점의 형태와 크기를 조절할 수 있다. 수열처리방식(hydrothermal treatment, HTT)은 양자점을 합성하는 주요 방식 중 하나이다. 그러나 HTT 방식을 사용하기 위해서는 높은 반응 온도와 압력을 견디면서 완벽한 밀봉을 유지할 수 있는 특수한 수열반응기가 필요하다. 또한 HTT 방식을 사용하여 탄소 양자점을 생성하기 위해서는 유기용매 또는 강염기가 필요한 경우가 많으며, 반응시간도 대체로 매우 길다.In general, carbon quantum dots are synthesized in one of two ways: top-down (TD) or bottom-up (BU). The TD method is disadvantageous in that the reaction conditions are difficult, the shape is difficult to control, and the synthesis step is complicated. On the other hand, the BT method can relatively easily and precisely control the shape and size of the quantum dots according to the kind of the precursor and the conditions of the carbonization. Hydrothermal treatment (HTT) is one of the main methods of synthesizing the quantum dots. However, in order to use the HTT method, a special hydrothermal reactor capable of withstanding a high reaction temperature and pressure and maintaining a perfect seal is needed. In addition, organic solvents or strong bases are often required to generate carbon quantum dots using the HTT method, and reaction times are generally very long.
효과적으로 탄소 양자점을 합성하기 위한 방법에 대한 연구가 이루어지고 있으나, 제조조건의 경제성, 수득되는 양자점의 수율 및 균일성, 환경 친화성, 생체 적합성 등을 만족하는 탄소 양자점의 제조방법에 보고는 많지 않다.Although studies have been made on methods for effectively synthesizing carbon quantum dots, there have been few reports on methods for producing carbon quantum dots satisfying economical conditions of production, yield and uniformity of quantum dots obtained, environmental compatibility, and biocompatibility .
한편, 피브로인(fibroin)은 누에고치에서 얻은 실크 섬유에서 세리신(sericin)을 제거한 섬유성 단백질이다. 실크 섬유는 피브로인과 세리신을 모두 함유할 경우, 알레르기 반응을 보이지만 피브로인 단일 단백질은 알레르기 반응을 일으키지 않는다. 피브로인은 수용성이고, 생체 적합성이 우수하여 필름, 하이드로 겔 등을 제작하는데 널리 사용되고 있다. On the other hand, fibroin is a fibrous protein from which sericin is removed from silk fibers obtained from cocoon. Silk fibers contain both fibroin and sericin, but they allergic, but fibroin monoclonal protein does not cause an allergic reaction. Fibroin is water-soluble and has excellent biocompatibility and is widely used for producing films, hydrogels and the like.
탄소 양자점을 산업적으로 이용하기 위해서는 제조과정이 경제적이어야 한다. 따라서 본 발명의 목적은 경제적으로 생체 적합성 탄소 양자점을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.In order to use carbon quantum dots industrially, the manufacturing process must be economical. It is therefore an object of the present invention to provide a method for economically producing biocompatible carbon quantum dots.
또한, 약물 전달 및 진단을 포함한 바이오 의약 분야에서 탄소 양자점을 활용하기 위해서는 세포 내로 잘 흡수되고, 이후 체외로 배출이 잘 이루어져야 하며, 세포 독성이 없어야 한다. 따라서 본 발명의 다른 목적은 생체 적합성이 우수한 탄소 양자점을 제공하는 것이다.In addition, in order to utilize carbon QDs in biopharmaceutical fields including drug delivery and diagnosis, they must be well absorbed into the cells, then discharged to the outside of the body, and not cytotoxic. Therefore, another object of the present invention is to provide a carbon quantum dot having excellent biocompatibility.
상기 목적을 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은In one aspect of the present invention,
a) 피브로인(fibroin)을 용매에 용해시켜 전구체 용액을 제조하는 단계; 및a) dissolving fibroin in a solvent to prepare a precursor solution; And
b) 전구체 용액에 마이크로파를 조사하는 단계b) irradiating the precursor solution with microwaves
를 포함하는 탄소 양자점의 제조방법을 제공한다.The method comprising the steps of:
본 발명의 제조방법에서, 용매는 구체적으로, 물, 탄소수 1-4의 저가 알코올, 수크로오스, 염수, 포름산, 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoroisopropanol, HFIP) 또는 이의 혼합물일 수 있다.In the production process of the present invention, the solvent may specifically be water, lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms, sucrose, brine, formic acid, hexafluoroisopropanol (HFIP) or a mixture thereof.
본 발명의 제조방법에서, 피브로인은 구체적으로 전구체 용액 전체 양에 대하여 1 내지 300 mg/mL의 농도로 용해될 수 있다.In the production process of the present invention, fibroin can be specifically dissolved at a concentration of 1 to 300 mg / mL based on the total amount of the precursor solution.
본 발명의 제조방법에서, 단계 a)는 구체적으로 10 내지 40 ℃의 온도에서 수행되는 탄소 양자점의 제조방법.In the production process of the present invention, step a) is carried out specifically at a temperature of from 10 to 40 占 폚.
본 발명의 제조방법에서, 단계 b)는 구체적으로 0 내지 350 ℃에서 수행될 수 있다.In the production process of the present invention, step b) can be carried out specifically at 0 to 350 ° C.
본 발명의 제조방법에서, 단계 b)는 구체적으로 1 내지 60분 동안 진행될 수 있다.In the production process of the present invention, step b) may be carried out specifically for 1 to 60 minutes.
본 발명의 제조방법은 바람직하게는 c) 마이크로파가 조사된 용액을 원심분리하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 더 바람직하게는 추가로 d) 원심분리된 용액의 상층액을 취해 여과하는 단계를 더 포함할 수 있다.The production method of the present invention may preferably further comprise the step of c) centrifuging the solution irradiated with microwaves, more preferably further d) taking the supernatant of the centrifuged solution and filtering .
본 발명은 또한, 상기 제조방법으로 제조된 탄소 양자점을 제공한다.The present invention also provides a carbon quantum dot produced by the above production method.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 피브로인을 포함하는 탄소 양자점 제조용 조성물을 제공한다. As another aspect for achieving the object of the present invention, the present invention provides a composition for composing a carbon quantum dot comprising fibroin.
본 발명은 또한, 상기 탄소 양자점 제조용 조성물로부터 수득된 탄소 양자점을 제공한다.The present invention also provides a carbon quantum dot obtained from the composition for preparing a carbon quantum dot.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 탄소 양자점 전구체로써의 피브로인의 용도를 제공한다. In another aspect to accomplish the objects of the present invention, the present invention provides the use of fibroin as a carbon quantum dot precursor.
본 발명의 제조방법은, 과도한 장치 없이도 짧은 시간 안에, 높은 수율로 균일한 탄소 양자점을 제조할 수 있어 경제적이다. 또한, 본 발명의 제조방법은 온도 및 압력 등의 반응 조건의 조절이 용이하며, 정제가 편리하다. 또한, 본 발명의 제조방법은 천연 원료를 이용할 수 있으므로 환경 친화적이다. The manufacturing method of the present invention is economical because uniform carbon quantum dots can be produced at a high yield in a short time without an excessive apparatus. In addition, the production method of the present invention is easy to control reaction conditions such as temperature and pressure, and is convenient for purification. Further, the production method of the present invention is environmentally friendly since natural raw materials can be used.
본 발명의 탄소 양자점은 친수성을 가지며, 체내에서 쉽게 흡수, 확산 및 배출되고, 세포 독성도 매우 낮아 생체 적합성이 우수하다. 또한, 본 발명의 탄소 양자점은 인식되기 충분한 형광 신호를 방출한다. 따라서 본 발명의 탄소 양자점은 약물 전달 및 진단을 포함한 바이오 의약 분야, 구체적으로 바이오 이미징 및 약물 전달 캐리어로써 유용하게 사용될 가능성이 있다.The carbon quantum dots of the present invention are hydrophilic and easily absorbed, diffused and discharged in the body, and cytotoxicity is very low, so that the biocompatibility is excellent. In addition, the carbon quantum dots of the present invention emit fluorescence signals that are sufficient to be recognized. Accordingly, the carbon quantum dots of the present invention are likely to be useful as biomedical fields including drug delivery and diagnosis, specifically bioimaging and drug delivery carriers.
도 1은 본 발명의 제조방법의 순서도 및 개념도이다.
도 2는 자외-가시광선 흡광도 및 풋-램버트 방출 패턴을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명 탄소 양자점의 수용액을 가시광선에 노출시킨 것(왼쪽)과 자외선에 노출시킨 것(오른쪽)의 디지털 사진이다.
도 4는 피브로인 및 본 발명의 탄소 양자점을 퓨리에 변환 적외선 분광 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 피브로인 및 본 발명의 탄소 양자점을 X-선 광전자 분광분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
또 6은 피브로인 및 본 발명의 탄소 양자점을 X-선 광전자 분광분석한 결과를 디콘볼루션하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 탄소 양자점을 X-선 회절분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 탄소 양자점을 동적 광산란 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 탄소 양자점을 전계 방출형 주사 전자현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 10은 KB 세포에 본 발명의 탄소 양자점을 처리하고, MTT 분석 키트를 사용하여 세포 생존율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 KB 세포에 본 발명의 탄소 양자점을 처리하고 세포 섭취를 공초점 레이져 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 12는 본 발명의 탄소 양자점을 마우스에 주입하기 전 및 주입한 후의 형광 신호를 시간에 따라 관찰한 이미지이다.
도 13은 본 발명의 탄소 양자점이 주입된 마우스에서 적출된 장기로부터 형광 신호를 관찰한 이미지이다.
도 14는 본 발명의 탄소 양자점이 주입된 마우스로부터 적출된 장기를 헤마토실린&에오신 염색 처리하여 조직학적 병리 검사를 수행한 결과를 나타낸 이미지이다.1 is a flowchart and a conceptual diagram of a manufacturing method of the present invention.
2 is a graph showing the ultraviolet-visible light absorbance and the foot-lambert emission pattern.
Fig. 3 is a digital photograph of an aqueous solution of the inventive carbon quantum dots exposed to visible light (left) and exposed to ultraviolet light (right).
4 is a graph showing a result of Fourier transform infrared spectroscopic analysis of fibroin and the carbon quantum dots of the present invention.
5 is a graph showing the results of X-ray photoelectron spectroscopic analysis of fibroin and the carbon quantum dots of the present invention.
6 is a graph showing X-ray photoelectron spectroscopic analysis of fibroin and the carbon quantum dots of the present invention by deconvolution.
7 is a graph showing the results of X-ray diffraction analysis of the carbon quantum dots of the present invention.
8 is a graph showing the results of dynamic light scattering analysis of the carbon quantum dots of the present invention.
9 is an image of the carbon quantum dots of the present invention observed by a field emission scanning electron microscope.
FIG. 10 is a graph showing the results of measuring the cell viability by treating the KB quantum dots of the present invention with the carbon quantum dots and using an MTT assay kit.
11 is an image obtained by treating the KB cell with the carbon quantum dots of the present invention and observing the cell uptake by a confocal laser microscope.
FIG. 12 is an image obtained by observing the fluorescence signal before and after injecting the carbon quantum dots of the present invention into the mouse over time. FIG.
13 is an image showing fluorescence signals observed from organs extracted from a mouse injected with a carbon quantum dot of the present invention.
FIG. 14 is an image showing the results of histological pathology examination of hematocylline and eosin-stained organs extracted from a mouse injected with a carbon quantum dot of the present invention.
본 발명은,According to the present invention,
a) 피브로인(fibroin)을 용매에 용해시켜 전구체 용액을 제조하는 단계; 및a) dissolving fibroin in a solvent to prepare a precursor solution; And
b) 전구체 용액에 마이크로파를 조사하는 단계b) irradiating the precursor solution with microwaves
를 포함하는 탄소 양자점의 제조방법을 제공한다.The method comprising the steps of:
본 발명의 제조방법을 도 1에 순서에 따라 나타내었다.The manufacturing method of the present invention is shown in Fig. 1 in order.
본 발명의 제조방법에서, 단계 a)는 피브로인을 용액 상태로 만드는 단계이다. In the production process of the present invention, step a) is a step of bringing the fibroin into a solution state.
상기 피브로인은, 일반적으로 누에나방(bombyx mori)의 고치(cocoon)로부터 수득되며, 구체적으로 고치에서 뽑아낸 그대로의 생사(生絲)에서 세리신(sericin)을 제거하여 수득된다. The fibroin is generally obtained from a cocoon of bombyx mori and is obtained by removing sericin from raw silk as extracted from a cocoon.
본 발명의 제조방법에서, 피브로인을 용해시키는 용매는 구체적으로, 물, 탄소수 1-4의 저가 알코올, 수크로오스, 염수, 포름산, 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoroisopropanol, HFIP) 또는 이의 혼합물일 수 있으며, 바람직하게는 물이다. 상기 물은 예를 들어, 증류수, 정제수, 멸균정제수 또는 주사용수일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 탄소수 1-4의 저가 알코올은 예를 들어, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소-프로판올, n-부탄올, 이소-부탄올일 수 있다.In the production method of the present invention, the solvent for dissolving fibroin may specifically be water, lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms, sucrose, brine, formic acid, hexafluoroisopropanol (HFIP) Is water. The water may be, for example, but not limited to, distilled water, purified water, sterile purified water or injectable water. The lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms may be, for example, methanol, ethanol, n-propanol, iso-propanol, n-butanol or iso-butanol.
본 발명의 제조방법에서, 피브로인은 전구체 용액 전체 양에 대하여 1 내지 300 mg/mL, 바람직하게는 10 내지 100 mg/mL의 농도로 용해될 수 있다.In the production process of the present invention, fibroin may be dissolved at a concentration of 1 to 300 mg / mL, preferably 10 to 100 mg / mL, based on the total amount of the precursor solution.
본 발명의 제조방법에서, 단계 a)는 10 내지 40 ℃의 온도에서 수행될 수 있으며, 구체적으로 실온에서 수행될 수 있다.In the production process of the present invention, step a) can be carried out at a temperature of from 10 to 40 캜, specifically at room temperature.
본 발명의 제조방법의 구체적인 실시양태에 따르면, 단계 a)에서 피브로인은 물에 20 mg/mL의 농도로 용해될 수 있다.According to a specific embodiment of the preparation process of the present invention, the fibroin in step a) can be dissolved in water at a concentration of 20 mg / mL.
본 발명의 제조방법의 구체적인 실시양태에 따르면, 고치를 탄산나트륨 수용액에 넣고 80 내지 120 ℃에서, 20 내지 90분 동안 가열하여 세리신을 제거함으로써 피브로인을 수득할 수 있다.According to a specific embodiment of the production method of the present invention, fibroin can be obtained by putting the cocoa in an aqueous solution of sodium carbonate and heating at 80 to 120 DEG C for 20 to 90 minutes to remove sericin.
또한, 본 발명의 제조방법의 구체적인 실시양태에 따르면, 세리신을 제거함으로써 수득된 피브로인을 투석 등을 통해 정제하여 순도가 높은 피브로인을 수득할 수 있다. 상기 투석은 예를 들어, 피브로인을 브롬화 리튬 용액, 염화칼슘 용액에 첨가하여 수행될 수 있다.Further, according to a specific embodiment of the production method of the present invention, fibroin obtained by removing sericin can be purified through dialysis or the like to obtain fibroin having high purity. The dialysis can be performed, for example, by adding fibroin to a lithium bromide solution, a calcium chloride solution.
본 발명의 제조방법에서, 전구체 용액은 탄소 양자점의 제조 시의 반응시간 단축, 수율 개선, 안정성 확보 및/또는 균일성의 향상을 위해 첨가물을 더 포함할 수 있으며, 예를 들어, 수산화나트륨 또는 과산화수소 등을 더 함유할 수 있다.In the production method of the present invention, the precursor solution may further contain an additive for shortening the reaction time in the production of the carbon quantum dots, improving the yield, securing the stability, and / or improving the uniformity. Examples thereof include sodium hydroxide, hydrogen peroxide May be further contained.
본 발명의 제조방법에서, 단계 b)는 마이크로파의 조사로 피브로인을 탄화(carbonization)하여 탄소 양자점을 생성시키는 단계이다.In the production method of the present invention, step b) is carbonization of fibroin by microwave irradiation to generate carbon quantum dots.
본 발명의 제조방법에서, 조사되는 마이크로파의 파장은 일반적인 마이크로파의 파장 범위에 해당하며, 구체적으로 1 ㎜ 내지 1 m일 수 있다.In the manufacturing method of the present invention, the wavelength of the irradiated microwave corresponds to the wavelength range of general microwave, and may be specifically 1 mm to 1 m.
본 발명의 제조방법에서, 마이크로파의 조사에는 통상적으로 마이크로파 조사에 사용될 수 있는 장치를 사용할 수 있으며, 예를 들어, 디스커버 시스템(Discover System, CEM, 미국)을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In the manufacturing method of the present invention, an apparatus that can be used for microwave irradiation is typically used for irradiation of microwaves. For example, a Discover System (CEM, USA) can be used, but the present invention is not limited thereto.
본 발명의 제조방법에서, 단계 b)는 0 내지 350 ℃, 바람직하게는 100 내지 300 ℃의 온도에서 수행될 수 있다.In the production process of the present invention, step b) can be carried out at a temperature of from 0 to 350 캜, preferably from 100 to 300 캜.
본 발명의 제조방법에서, 단계 b)는 1 내지 60분, 바람직하게는 5 내지 30분 동안 진행될 수 있다.In the production process of the present invention, step b) may be carried out for 1 to 60 minutes, preferably 5 to 30 minutes.
본 발명의 제조방법은, c) 마이크로파가 조사된 용액을 원심분리하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 단계 c)는 단계 b) 이후에 수행된다. The production method of the present invention may further include the step of c) centrifuging the solution irradiated with microwaves, and step c) is performed after step b).
본 발명의 제조방법의 구체적인 실시양태에 따르면, 단계 c)의 원심분리는 3000 내지 16000 rpm의 속도로, 5 내지 30분 동안 수행될 수 있다.According to a specific embodiment of the preparation process of the present invention, the centrifugation of step c) can be carried out at a rate of 3000 to 16000 rpm for 5 to 30 minutes.
본 발명의 제조방법은, 추가적으로 d) 원심분리된 용액의 상층액을 취해 여과하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 단계 d)는 단계 c) 이후에 수행된다. 상기 상층액의 여과는, 통상적으로 사용되는 필터를 사용하여 수행될 수 있다.The manufacturing method of the present invention may further comprise the step of d) filtering the supernatant of the centrifuged solution and performing step d) after step c). The filtration of the supernatant may be carried out using a commonly used filter.
본 발명의 제조방법의 구체적인 실시양태에 따르면, 상층액의 여과에는 폴리에틸설폰(PES) 주사기 필터를 사용할 수 있다.According to a specific embodiment of the production process of the present invention, a polyethylsulfone (PES) syringe filter can be used for filtration of the supernatant.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명의 제조방법으로 수득된 탄소 양자점의 수율은 70 % 이상이었다. 따라서 본 발명의 제조방법에 의하면 높은 수율로 탄소 양자점을 제조할 수 있다.According to a specific embodiment of the present invention, the yield of carbon quantum dots obtained by the production method of the present invention was 70% or more. Therefore, according to the production method of the present invention, carbon quantum dots can be produced with high yield.
본 발명의 구체적인 일 실험예에 따르면, 본 발명의 제조방법으로 수득된 탄소 양자점의 직경은 5.4 ± 0.9 ㎚였다. 또한 본 발명의 구체적인 다른 실험예에 따르면, 본 발명의 제조방법으로 수득된 탄소 양자점의 직경은 6.1 ± 0.7 ㎚ 였다. 따라서 본 발명의 제조방법은 우수한 균일성을 갖도록 탄소 양자점을 제조할 수 있다. According to one specific experimental example of the present invention, the diameter of the carbon quantum dots obtained by the production method of the present invention was 5.4 ± 0.9 nm. According to another experimental example of the present invention, the diameter of the carbon quantum dots obtained by the production method of the present invention was 6.1 ± 0.7 nm. Therefore, the manufacturing method of the present invention can produce carbon quantum dots so as to have excellent uniformity.
본 발명의 제조방법은, 짧은 시간 안에, 높은 수율로 탄소 양자점을 제조할 수 있어 경제적이다. 또한, 본 발명의 제조방법은 온도 및 압력 등의 반응 조건의 조절이 용이하며, 정제가 편리하다. 또한, 본 발명의 제조방법은 천연 원료를 이용할 수 있으므로 환경 친화적이다. The manufacturing method of the present invention is economical because it can manufacture carbon quantum dots at a high yield in a short time. In addition, the production method of the present invention is easy to control reaction conditions such as temperature and pressure, and is convenient for purification. Further, the production method of the present invention is environmentally friendly since natural raw materials can be used.
본 발명은 또한, 상기 기술된 본 발명의 제조방법으로 제조된 탄소 양자점을 제공한다.The present invention also provides a carbon quantum dot produced by the above-described production method of the present invention.
본 발명의 탄소 양자점은 바람직하게는 직경이 1 내지 10 nm일 수 있으며, 더 바람직하게는 3 내지 6 nm일 수 있다. The carbon quantum dots of the present invention may preferably have a diameter of 1 to 10 nm, more preferably 3 to 6 nm.
탄소 양자점의 크기는 체내 주입시 얼마나 효율적으로 전달이 되느냐 뿐만 아니라, 전달 후에 신장을 통해 얼마나 빨리 빠져나오느냐 에도 영향을 미친다. 또한, 불필요한 체내 축적을 피한다면, 체내 독성에도 영향을 줄 수 있다. 본 발명의 탄소 양자점의 크기는 신장에서 쉽게 배출되기에 적합하다. The size of the carbon quantum dot affects not only how efficiently it is delivered when injected into the body but also how quickly it exits through the kidney after delivery. In addition, avoiding unnecessary accumulation in the body may also affect the toxicity of the body. The size of the carbon quantum dots of the present invention is suitable for easy ejection in the kidney.
본 발명의 구체적인 일 실험예에 따르면, 본 발명의 탄소 양자점은 카르복실기와 히드록실기의 비율이 전구체인 피브로인보다 크게 증가되었다. 따라서 본 발명의 탄소 양자점은 물에서 양호한 콜로이드 안정성을 나타내어, 우수한 친수성을 가지며, 약물 전달 및 진단을 포함한 바이오 의약 분야로의 적용에 유리하다.According to one specific experimental example of the present invention, the carbon quantum dots of the present invention were significantly increased in the ratio of the carboxyl group and the hydroxyl group to that of fibroin, which is a precursor. Therefore, the carbon quantum dots of the present invention exhibit good colloidal stability in water, have excellent hydrophilicity, and are advantageous for application to the biomedical field including drug delivery and diagnosis.
본 발명의 구체적인 일 실험예에 따르면, 본 발명의 탄소 양자점은 KB 세포에 성공적으로 흡수되었다. 따라서 본 발명의 탄소 양자점은 약물 전달 및 진단을 포함한 바이오 의약 분야에서 효과적으로 활용될 수 있다.According to one specific experimental example of the present invention, the carbon quantum dots of the present invention were successfully absorbed into KB cells. Therefore, the carbon quantum dots of the present invention can be effectively utilized in the field of biopharmaceuticals including drug delivery and diagnosis.
본 발명의 구체적인 일 실험예에 따르면, 본 발명의 탄소 양자점을 1 ㎎/mL의 농도까지 처리하여도 KB 세포의 생존율이 평균 95 % 이상으로, 세포 독성이 매우 낮았다. 또한, 본 발명의 구체적인 다른 실험예에 따르면, 본 발명의 탄소 양자점을 마우스에 투여하여도 조직에서 손상이나 염증이 발견되지 않았다. 따라서 본 발명의 탄소 양자점은 독성이 매우 낮다.According to a specific example of the present invention, even when the carbon quantum dots of the present invention were treated to a concentration of 1 mg / mL, the survival rate of KB cells was more than 95% on average and the cytotoxicity was very low. In addition, according to another experimental example of the present invention, when the carbon quantum dots of the present invention were administered to mice, no damage or inflammation was found in the tissues. Therefore, the carbon quantum dots of the present invention are extremely low in toxicity.
본 발명의 구체적인 일 실험예에 따르면, 본 발명의 탄소 양자점을 마우스에 투여하였을 때, 체내에서 강한 형광을 관찰할 수 있었다. 따라서 본 발명의 탄소 양자점은 바이오 이미징에 효과적으로 활용될 수 있다.According to one specific experimental example of the present invention, when the carbon quantum dots of the present invention were administered to mice, strong fluorescence could be observed in the body. Therefore, the carbon quantum dots of the present invention can be effectively utilized for bioimaging.
본 발명의 구체적인 일 실험예에 따르면, 본 발명의 탄소 양자점은 마우스에 주입 직후 체내에 고루 확산되었으며, 주입 후 18시간이 경과하면 체내에 거의 남아 있지 않았다. 따라서, 본 발명의 탄소 양자점이 단시간에 체내에 고루 확산될 수 있을뿐만 아니라, 불필요한 체내 축적도 발생하지 않음을 알 수 있다.According to one experimental example of the present invention, the carbon quantum dots of the present invention spread evenly in the body immediately after injection into the mouse, and almost no remained in the body after 18 hours from the injection. Therefore, it can be seen that not only the carbon quantum dots of the present invention can be uniformly diffused in the body in a short time, but also unnecessary accumulation in the body does not occur.
이와 같이, 본 발명의 제조방법으로 제조한 탄소 양자점은 친수성이고, 체내 확산 및 배출이 용이하며, 독성이 매우 낮은 생체 적합성이 우수한 양자점이다. 또한, 본 발명의 탄소 양자점은 체내에서 강한 형광으로 관찰될 수 있어, 효과적으로 바이오 의약 분야에 활용될 수 있다.As described above, the carbon quantum dots prepared by the production method of the present invention are hydrophilic, easy to diffuse and emit in the body, and have excellent toxicity and excellent biocompatibility. Further, the carbon quantum dots of the present invention can be observed as strong fluorescence in the body, and can be effectively utilized in the biomedical field.
본 발명은 피브로인을 포함하는 탄소 양자점 제조용 조성물을 제공한다. The present invention provides a composition for producing carbon quantum dot comprising fibroin.
또한, 본 발명은 상기 탄소 양자점 제조용 조성물로부터 수득된 탄소 양자점을 제공한다. Further, the present invention provides a carbon quantum dot obtained from the composition for preparing a carbon quantum dot.
본 발명은 탄소 양자점의 전구체로써의 피브로인의 용도를 제공한다. The present invention provides the use of fibroin as a precursor of carbon quantum dots.
이하에서, 본 발명을 구체적인 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 및 실험예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to specific examples and experimental examples. However, the following examples and experimental examples are provided only to aid understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited by the examples and the experimental examples.
실시예 1: 피브로인을 전구체로 사용한 탄소 양자점의 제조Example 1: Preparation of carbon quantum dots using fibroin as a precursor
한림대학교 의료원으로부터 입수한 피브로인을 20 mg/mL의 농도로 증류수에 용해시켰다. 4 mL의 피브로인 용액을 전구체로 사용하여, 200 ℃ 에서 20 분 동안 마이크로파에 노출시켰다(디스커버 시스템, CEM, 미국). 흰색의 수용액이 옅은 황색으로 변하는 것으로 탄소 양자점의 생성을 확인하였다.Fibroin obtained from Hallym University Medical Center was dissolved in distilled water at a concentration of 20 mg / mL. 4 mL of fibroin solution was used as a precursor and exposed to microwave for 20 minutes at 200 < 0 > C (Discover System, CEM, USA). The white aqueous solution turned into a pale yellow color, confirming the formation of carbon quantum dots.
큰 불순물 응집체를 제거하기 위해, 생성된 황색 용액을 3500 rpm 에서 30 분 동안 두 번 원심분리하였다. 상층액을 모아 0.22 ㎛ 폴리에틸설폰(polyethylsulfone, PES) 주사기 필터로 여과하고, 동결건조시켜 황색의 고체 68 ㎎을 수득하였으며, 수율{(반응에 넣은 피브로인 질량/총 수득한 탄소 양자점 질량)x100}은 85 %였다. To remove large impurity aggregates, the resulting yellow solution was centrifuged twice at 3500 rpm for 30 minutes. The supernatant was collected and filtered through a 0.22 탆 polyethylsulfone (PES) syringe filter and lyophilized to give 68 mg of a yellow solid. Yield {(mass of fibroin put into the reaction / total mass of carbon quantum dots obtained) x 100} Was 85%.
또한, 실험의 재현성을 확인하기 위해 동일 조건에서 반복 실험한 결과, 적어도 70 % 이상의 수율로 탄소 양자점을 수득할 수 있었다.Further, in order to confirm the reproducibility of the experiment, repeated experiments were carried out under the same conditions, and as a result, the carbon quantum dots could be obtained at a yield of at least 70% or more.
실시예 2: 피브로인을 전구체로 사용한 탄소 양자점의 제조Example 2: Fabrication of carbon quantum dots using fibroin as a precursor
상기 실시예 1과 동일한 조건을 적용하되, 피브로인 용액의 양을 2 mL로 하여 탄소 양자점을 제조하였다.Carbon quantum dots were prepared using the same conditions as in Example 1 except that the amount of fibroin solution was 2 mL.
그 결과, 실시예 1과 유사한 수준의 수율로 탄소 양자점이 수득되었다. 또한 수득된 탄소 양자점의 크기도 실시예 1과 유사하였다.As a result, carbon quantum dots were obtained in a yield similar to that of Example 1. [ The size of the obtained carbon quantum dots was also similar to that of Example 1.
실험예 1: 탄소 양자점의 광학적 특성 확인Experimental Example 1: Determination of optical properties of carbon quantum dots
실시예 1에서 제조된 탄소 양자점을 1.0 ㎎/mL 농도로 물에 용해시킨 후 이하의 광학적 특성 확인 실험에 사용하였다.The carbon quantum dots prepared in Example 1 were dissolved in water at a concentration of 1.0 mg / mL and used in the following optical property confirmation experiments.
1-1. 자외선-가시광선 흡광도 분석1-1. Ultraviolet-visible light absorbance analysis
자외선-가시광선(UV-Vis) 분광스펙트럼을 1 cm 폭의 석영 큐벳을 사용하여 시마즈 UV 1650-PC (Shimadzu UV 1650-PC)에 기록하였다. 형광 스펙트럼은 시마즈 RF-5301 (Shimadzu RF-5301)에 수집되었으며, 여기와 방출을 위해 3 nm 의 슬릿폭을 갖는 1 cm 폭의 석영 큐벳을 사용하였다. The ultraviolet-visible (UV-Vis) spectral spectrum was recorded on a Shimadzu UV 1650-PC using a 1 cm wide quartz cuvette. Fluorescence spectra were collected on a Shimadzu RF-5301 (Shimadzu RF-5301) and a 1 cm wide quartz cuvette with a slit width of 3 nm was used for excitation and emission.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 방향족 π-π* 전이에 기인한 272 nm 부분의 전형적인 강한 흡수 피크를 확인할 수 있었고, 카보닐기의 n-π* 전이에 기인한 약 320 nm의 영역에서의 넓은 피크를 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Fig. 2, a typical strong absorption peak at 272 nm due to aromatic π-π * transition was confirmed, and a strong absorption peak at about 320 nm due to the n-π * transition of the carbonyl group Wide peak.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 풋-램버트(Foot-Lambert, FL) 방출 강도 흡수파장이 300 nm 에서 500 nm 까지 20 nm 씩 증가하였고, 강도가 낮아짐에 따라 파장이 긴쪽 범위로 이동하였다. 이러한 흡수파장에 따른 가변적인 방출은 탄소 양자점의 고유한 특성 중 하나이다. 따라서 탄소 양자점이 성공적으로 합성되었음을 알 수 있다.In addition, as shown in FIG. 2, the absorption intensity of the foot-lambert (FL) emission intensity was increased from 300 nm to 500 nm by 20 nm, and the wavelength shifted to a longer range as the intensity was lowered. Variable emission along these absorption wavelengths is one of the inherent characteristics of carbon QDs. Thus, it can be seen that the carbon quantum dots were successfully synthesized.
1-2. 자외선 조사1-2. UV irradiation
도 3에 나타낸 바와 같이, 탄소 양자점 수용액이 가시광선 하에서는 투명한 황색을 띄지만, 365 nm의 자외선 하에서는 강한 청색 발광을 나타내는 것이 확인되었다.As shown in Fig. 3, it was confirmed that the aqueous solution of carbon quantum dots exhibited a transparent yellow color under visible light, but a strong blue light emission under ultraviolet light of 365 nm.
실험예 2: 탄소 양자점의 화학적 구성 확인Experimental Example 2: Confirmation of chemical composition of carbon quantum dots
2-1. 퓨리에 변환 적외선 분광분석2-1. Fourier transform infrared spectroscopy
써모 사이언티픽 니콜렛 380 분광분석기(Thermo Scientific Nicolet 380 spectrometer, high tech Thermo Scientific, 미국)를 사용하여 실시예 1에서 제조한 탄소 양자점과 전구체인 피브로인의 퓨리에 변환 적외선 분광 분석(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)을 수행하였다. KBr 펠렛 기술을 이용하여 400 내지 4000 ㎝-1 파장에서 스펙트럼을 측정하였다.Fourier transform infrared spectroscopy (FT) of the carbon quantum dots prepared in Example 1 and the precursor fibroin (
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같은 스펙트럼을 얻었다. 도 4에서 ν(O-H), ν(C-O-C), ν(C-O), δ(C-O)에 대응하는 3425, 1238, 1165, 1084 ㎝-1의 피크는 탄소 양자점에서 카복실기 및 히드록실기의 존재를 나타낸다. 또한, ν(N-H)와 ν(C-N) 에 대응하는 1539, 1456-1404 ㎝-1의 피크를 통해 탄소 양자점이 N-함유기를 가지고 있음을 알 수 있다. 또한, 1653 ㎝-1의 날카로운 피크는 불포화 C=C의 형성을 나타내며, 272 nm 에서 방향족 π-π* 전이의 강한 자외선의 흡수와 일치한다. 이러한 결과는 전구체인 피브로인과 비교했을 때, 카복실기와 히드록실기의 비율이 크게 증가되어 물에서 본 발명의 탄소 양자점의 우수한 콜로이드 안정성을 나타낸다.As a result, a spectrum as shown in Fig. 4 was obtained. Peaks at 3425, 1238, 1165 and 1084 cm -1 corresponding to ν (OH), ν (COC), ν (CO) and δ (CO) in FIG. 4 indicate the presence of carboxyl and hydroxyl groups in the carbon quantum dots . It can also be seen that the carbon quantum dots have N-containing groups through peaks at 1539, 1456-1404 cm -1 corresponding to v (NH) and v (CN). In addition, the sharp peak at 1653 cm -1 indicates the formation of unsaturated C = C, consistent with the strong ultraviolet absorption of aromatic π-π * transitions at 272 nm. These results show that the ratio of carboxyl group to hydroxyl group is greatly increased as compared with fibroin, which is a precursor, and shows excellent colloidal stability of the carbon quantum dots of the present invention in water.
2-2. X-선 광전자 분광분석2-2. X-ray photoelectron spectroscopy
K-알파 1063(K-Alpha 1063) X-선 광전자 분석기(Thermo Fisher Scientific, 영국)를 사용하여 실시예 1에서 제조한 탄소 양자점과 전구체인 피브로인의 X-선 광전자 분광분석(X-ray Photoelectron Spectroscopy, XPS)을 수행하였다.X-ray photoelectron spectroscopy (X-ray photoelectron spectroscopy) of the carbon quantum dots prepared in Example 1 and the precursor fibroin using a K-Alpha 1063 X-ray photoelectron analyzer (Thermo Fisher Scientific, UK) , XPS) was performed.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 탄소 양자점이 전구체인 피브로인에서 파생된 탄소(C), 질소(N) 및 산소(O) 의 전형적인 피크를 가지고 있음이 확인되었다. 탄소 양자점의 탄소 함량은 60.58 wt%로, 탄소 함량이 58.60 wt%인 피브로인보다 증가하였으나, 탄소 양자점의 질소와 산소의 함량은 모두 피브로인보다 감소하여, 본 발명의 제조방법을 통해 수득된 탄소 양자점의 성공적인 탄화를 확인할 수 있다.As a result, it was confirmed that the carbon quantum dots had typical peaks of carbon (C), nitrogen (N) and oxygen (O) derived from fibroin, which is a precursor, as shown in FIG. The carbon content of the carbon quantum dots was 60.58 wt%, which was higher than that of fibroin having a carbon content of 58.60 wt%. However, the contents of nitrogen and oxygen in the carbon quantum dots were both lower than those of fibroin, Successful carbonization can be confirmed.
2-3. XPS 피크의 디콘볼루션2-3. Deconvolution of XPS peak
추가로, 실험예 2-2에서 확인된 XPS 피크의 C1s, N1s, O1s 스펙트럼을 디콘볼루션(deconvolution) 하였다. In addition, the C 1s , N 1s , and O 1s spectra of the XPS peak identified in Experimental Example 2-2 were deconvoluted.
탄소 양자점의 C1s스펙트럼은 284 eV (C-C), 286 eV (C-N), 287 eV (C-O) 및 289 eV (C=N, C=O) 를 중심으로 4 개의 피크로 디콘볼루션 될 수 있다. N1s스펙트럼은 399.5 eV (C-N-C), 399.9 eV (O=C-N) 및 401 eV (N-H) 를 중심으로 3 개의 피크로 디콘볼루션 될 수 있다. O1s의 스펙트럼은 531 eV (C=O) 및 532 eV (O-H) 를 중심으로 2 개의 피크로 디콘볼루션 될 수 있다.The C 1s spectrum of the carbon quantum dots can be deconvoluted at four peaks around 284 eV (CC), 286 eV (CN), 287 eV (CO) and 289 eV (C═N, C═O). The N 1s spectrum can be deconvoluted to three peaks centered at 399.5 eV (CNC), 399.9 eV (O = CN) and 401 eV (NH). The spectrum of O 1s can be deconvoluted into two peaks centered at 531 eV (C = O) and 532 eV (OH).
그 결과는 도 6에 나타낸 바와 같이, 실험예 2-1의 FT-IR 결과와 일치하였다. The results are consistent with the FT-IR results of Experimental Example 2-1 as shown in Fig.
XPS 피크의 디콘볼루션에 의한 원소 분석의 구체적인 결과는 하기 표 1에 나타내었다.Specific results of elemental analysis by deconvolution of the XPS peak are shown in Table 1 below.
[표 1][Table 1]
표 1에 표시된 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 의하여 수득된 탄소 양자점은 전구체인 피브로인과 비교하여 C-N, N-H 및 O-H 의 비율이 감소된 것을 알 수 있으며, 따라서 제조과정에서 마이크로파에 의한 탄화로 피브로인의 사슬 간의 탈수 및 중합 과정이 일어나 수소와 산소의 손실이 발생했음을 알 수 있다.As shown in Table 1, the carbon quantum dots obtained by the production method of the present invention show a decrease in the ratio of CN, NH and OH as compared to fibroin, which is a precursor, The dehydration and polymerization processes between the chains of hydrogen and oxygen occurred.
실험예 3: 탄소 양자점의 형태 및 구조 확인Experimental Example 3: Confirmation of the shape and structure of carbon quantum dots
3-1. X-선 회절 분석을 통한 탄소 양자점의 결정성 확인3-1. Determination of the crystallinity of carbon QDs by X-ray diffraction analysis
DMAX-2500(Rigaku, 일본)을 사용하여 실시예 1에서 제조한 탄소 양자점의 X-선 회절(X-ray Diffraction, XRD) 패턴을 확인하였다. 층간 저면간격(d-spacing)은 브랙의 법칙(Bragg's law)에 1.5406 Å 의 파장을 적용하여 결정되었다.An X-ray diffraction (XRD) pattern of the carbon quantum dots prepared in Example 1 was confirmed using DMAX-2500 (Rigaku, Japan). The d-spacing was determined by applying a wavelength of 1.5406 A to Bragg's law.
그 결과, 도 7과 같은 XRD 패턴이 얻어졌다. 도 7에서 보이는 것과 같이 21 °에서 넓은 피크가 관찰되었고, 이를 통해 계산된 층간 저면간격(d-spacing)은 약 0.215 nm이며, 본 발명의 탄소 양자점이 결정성을 가지는 것을 알 수 있다. As a result, an XRD pattern as shown in Fig. 7 was obtained. As shown in FIG. 7, a broad peak at 21 ° was observed, and the calculated inter-layer spacing (d-spacing) was about 0.215 nm, indicating that the carbon quantum dots of the present invention have crystallinity.
3-2. 동적 광 산란 분석을 통한 탄소 양자점 크기 확인3-2. Determination of Carbon Quantum Dot Size by Dynamic Light Scattering Analysis
633 nm He-Ne 가스 레이저가 장착된 제타사이저 나노 에스 90(Zetasizer Nano S 90) (ZEN1690, Malvern Instruments, 영국)으로 동적 광산란 분석(Dynamic light scattering, DLS)을 수행하였다.Dynamic light scattering (DLS) was performed on a Zetasizer Nano S 90 (ZEN 1690, Malvern Instruments, UK) equipped with a 633 nm He-Ne gas laser.
구체적으로, 실시예 1에서 제조한 탄소 양자점을 증류수에 분산시켜 각각 0.5 mg/mL의 농도의 샘플을 제작하였다. 25 ℃에서 고정 산란각 90°로 고정하여 직경을 측정하였다.Specifically, the carbon quantum dots prepared in Example 1 were dispersed in distilled water to prepare samples each having a concentration of 0.5 mg / mL. The diameter was fixed by fixing the scattering angle at 90 ° at 25 ° C.
그 결과는 도 8에 나타낸 바와 같으며, 탄소 양자점의 평균 입자 크기는 5.4 ± 0.9 nm 로 측정되었다. 따라서 본 발명의 탄소 양자점이 생체에 적용하기 적합한 크기를 가지고 있음을 알 수 있다.The results are shown in Fig. 8, and the average particle size of the carbon quantum dots was measured to be 5.4 0.9 nm. Therefore, it can be seen that the carbon quantum dots of the present invention have a size suitable for living bodies.
3-3. 방출형 주사 전자현미경 관찰을 통한 탄소 양자점 크기 확인3-3. Determination of Carbon Quantum Dot Size by Emission Scanning Electron Microscopy Observation
200 kV 에서 작동하는 전계 방출형 주사 전자현미경(Field-Emission Scanning Electron Microscopy, FE-TEM)인 JEM-2100F (JEOL, 일본)을 이용하였다. JEM-2100F (JEOL, Japan), which is a Field-Emission Scanning Electron Microscopy (FE-TEM) operated at 200 kV, was used.
구체적으로, 실시예 1에서 제조한 탄소 양자점을 1.0 mg/mL의 농도로 증류수에 분산시켜 샘플 용액을 제조한 후, 400 메쉬의 탄소가 코팅된 구리 격자 상에 놓고 블롯팅 한 후 상온에서 건조시켰다. 그 후 실시예 1에서 제조한 탄소 양자점을 촬영하였다.Specifically, the carbon quantum dots prepared in Example 1 were dispersed in distilled water at a concentration of 1.0 mg / mL to prepare a sample solution. The sample solution was placed on a 400 mesh carbon-coated copper lattice, blotted, and dried at room temperature . Then, the carbon quantum dots prepared in Example 1 were photographed.
그 결과는 도 9에 나타낸 바와 같다. 도 9a로부터 탄소 양자점의 평균 직경이 6.1 ± 0.7 nm임을 확인할 수 있으며, 실험예 3-2에서 DLS를 통해 확인한 것과 유사한 결과를 보여준다. 또한 도 9b으로부터 탄소 양자점의 격자 간격이 2.2 Å임을 확인할 수 있으며, 높은 결정성을 가지고, 6각 상을 나타냄을 알 수 있다. The results are shown in Fig. From FIG. 9A, it can be confirmed that the average diameter of the carbon quantum dots is 6.1. + -. 0.7 nm, which is similar to that observed in DLS in Experimental Example 3-2. 9B, it can be seen that the lattice spacing of the carbon quantum dots is 2.2 ANGSTROM, which shows high crystallinity and hexagonal phase.
또한, 실험예 3-1에서 XRD를 통해 확인한 것과 간격이 일치하는 것으로 보아 본 발명의 제조방법으로 수득한 탄소 양자점이 안정된 결정성을 가지는 것이 증명된다. In addition, since the intervals correspond to those observed through XRD in Experimental Example 3-1, it is proved that the carbon quantum dots obtained by the production method of the present invention have stable crystallinity.
실험예 4: 탄소 양자점의 Experimental Example 4: Preparation of carbon quantum dots in vitroin vitro 세포독성 및 세포내 흡수 검사 Cytotoxicity and intracellular absorption test
4-1. 세포독성 검사4-1. Cytotoxicity test
KB 세포를 5 % CO2를 함유하며, 가습한 37 ℃ 에서 10 % 소태아혈청과 1 % 항생제(50 units/mL 페니실린 및 50 units/mL 스트렙토마이신)를 함유하는 L-글루타민(300 mg/L)과 함께 RPMI 1640에서 배양하였다. KB 세포를 96-웰 플레이트(well plate)에 웰 당 5 x 105세포로 도말하고, 10 % 소태아혈청 및 1 % 항생제를 함유하는 L-글루타민 300 mg/L를 포함한 100 μL RPMI 1640에서 24 시간 동안 배양 하였다. KB cells were incubated with L-glutamine (300 mg / L) containing 5% CO 2 and containing 10% fetal bovine serum and 1% antibiotics (50 units / mL penicillin and 50 units / mL streptomycin) ). ≪ / RTI > KB cells, a 96-well plate (well plate) on a per well 5 x 10 5 in the smear, and 10% fetal bovine serum and 1
실시예 1에서 제조한 탄소 양자점을 각각 다른 농도(0, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0 mg/mL)로 인산완충식염수(PBS)에 용해시키고 KB 세포와 함께 24 시간 동안 배양하였다. 탄소 양자점 없이 세포만 배양한 군이 대조군으로 동시에 시행되었다. The carbon quantum dots prepared in Example 1 were dissolved in phosphate buffered saline (PBS) at different concentrations (0, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0 mg / mL) and incubated with KB cells for 24 hours. The cells cultured without carbon quantum dots were used as controls.
세포 생존율은 제조사의 지시에 따라 셀 타이터 96 (CellTiter 96) 비 방사성 세포증식 분석키트(MTT, Promega)를 사용하여 측정하였다. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액 15 μL 을 각 웰에 첨가하였다. 4 시간 배양 후, 반응하지 않은 MTT를 함유하는 배지를 조심스럽게 제거하였다. 생성된 프로마잔 블루(formazan blue) 결정을 녹이기 위해 디메틸 설폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO) 100 μL를 각 웰에 첨가 한 후, 파워웨이브 HT 마이크로플레이트 리더(Powerwave HT Microplate Reader, Bio-Tek)를 사용하여 570 nm 파장에서의 흡광도를 기록하였다. 각각의 농도를 4 번 반복하였다. 세포 생존율은 탄소 양자점 처리군의 흡광도 대 대조군의 흡광도의 비율로 계산하였다. Cell viability was measured using a CellTiter 96 non-radioactive cell proliferation assay kit (MTT, Promega) according to the manufacturer's instructions. 15 μL of a solution of MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) was added to each well. After incubation for 4 hours, the medium containing unreacted MTT was carefully removed. 100 μL of dimethyl sulfoxide (DMSO) was added to each well to dissolve the generated formazan blue crystals, followed by the use of a Powerwave HT Microplate Reader (Bio-Tek) And the absorbance at a wavelength of 570 nm was recorded. Each concentration was repeated four times. Cell viability was calculated as the ratio of the absorbance of the carbon QT group to that of the control group.
그 결과는 도 10 및 표 2와 같다. 본 발명의 제조방법으로 수득한 탄소 양자점은 1 ㎎/mL 까지의 KB 세포의 생존율이 평균 95 % 이상으로, 세포 독성이 매우 낮음을 확인할 수 있다. The results are shown in FIG. 10 and Table 2. The carbon quantum dots obtained by the production method of the present invention have an average survival rate of KB cells of up to 1 mg / mL of 95% or more, indicating that cytotoxicity is very low.
[표 2][Table 2]
4-2. 세포내 흡수 검사4-2. Intracellular absorption test
KB 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 2x105세포로 도말하고, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM) 2 mL에서 24 시간 배양하고 37 ℃ 에서 4 시간 동안 실시예 1에서 제조한 탄소 양자점을 함유하는 용액(0.1 mg/mL)을 적용하였다. 또한 탄소 양자점 용액과 동일한 양의 PBS를 KB 세포에 적용하여 대조군으로 하였다. KB cells were plated on a 6-well plate at 2 × 10 5 cells per well and cultured in 2 mL of Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) for 24 hours and incubated at 37 ° C. for 4 hours with carbon A solution containing a quantum dot (0.1 mg / mL) was applied. The same amount of PBS as the carbon quantum dot solution was applied to the KB cells as a control.
배양 배지를 제거한 후, 세포를 PBS로 3 회 세척하였다. 상층액을 제거한 후, 4 ℃ 에서 20 분 동안 차가운 메탄올(-20 ℃)로 세포를 고정시켰다. 슬라이드를 PBS로 5 회, 트윈 20을 함유한 트리스 완충 식염수(tris-buffered saline Tween 20, TBST)로 3 회 세척하였다. After removing the culture medium, the cells were washed three times with PBS. After removing the supernatant, the cells were fixed with cold methanol (-20 ° C) for 20 minutes at 4 ° C. The slides were washed 5 times with PBS and three times with tris-buffered saline Tween 20 (TBST) containing
탄소 양자점의 세포 섭취(cellular uptake) 및 세포 내 형광 이미지를 LSM 510 Meta/Axiovert 200 (Carl Zeiss, Jena, Germany) 공초점 레이져 현미경(confocal laser scanning microscopy, CLSM)으로 관찰하였다.The cellular uptake and intracellular fluorescence images of the carbon QDs were observed by confocal laser scanning microscopy (CLSM) on a LSM 510 Meta / Axiovert 200 (Carl Zeiss, Jena, Germany).
관찰된 현미경 이미지는 도 11과 같다. 본 발명의 탄소 양자점이 처리된 KB 세포에서는 핵에서 명확한 형광이 확인되었으나, PBS가 처리된 KB 세포에서는 형광이 나타나지 않았다. 즉, 탄소 양자점이 성공적으로 세포내로 흡수된 것을 알 수 있으며, 탄소 양자점이 효과적인 바이오 이미징 프로브로 사용될 가능성이 있음을 알 수 있다.The observed microscope image is shown in Fig. In the KB cells treated with the carbon quantum dots of the present invention, clear fluorescence was observed in the nucleus, but fluorescence was not observed in the PBS-treated KB cells. That is, it can be seen that the carbon quantum dots are successfully absorbed into the cells, and the carbon quantum dots are likely to be used as effective bioimaging probes.
실험예Experimental Example 5: 탄소 5: Carbon 양자점의Quantum dot inin vivovivo 확산·배출 검사 및 조직학적 검사 Diffusion / Emission Examination and Histological Examination
5-1. 확산 및 배출 검사5-1. Diffusion and Discharge Inspection
6-7 주령 암컷 nude Balb/c 마우스의 꼬리 정맥에 체중(kg)당 50 mg의 양으로 실시예 1에서 제조한 탄소 양자점을 주입하였다. 탄소 양자점의 형광 신호는 녹색 필터를 사용하여 18 시간 동안 기록되었으며, 이를 도 12에 나타내었다. 또한, 18시간 후 마우스를 희생시키고, 체내 주요 장기(간, 폐, 신장, 비장 및 심장)를 적출하여 장기별 축적 정도를 ex-vivo 이미징을 통해 관찰하였으며, 이를 도 13에 나타내었다. The carbon quantum dots prepared in Example 1 were injected into the tail vein of 6-7 week old female nude Balb / c mice in an amount of 50 mg per kg of body weight (kg). The fluorescent signal of the carbon quantum dots was recorded for 18 hours using a green filter, which is shown in FIG. After 18 hours, mice were sacrificed and major organs (liver, lung, kidney, spleen and heart) were extracted from the body, and the degree of accumulation of organs was observed through ex-vivo imaging, as shown in FIG.
도 12에 표시된 바와 같이, 주입 직후 마우스 체내 전체에서 강한 형광이 관찰되었다. 즉, 나노사이즈의 탄소 양자점이 체내에 고루 확산되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 주입 후 3시간 까지 유지되었으며, 그 이후로는 급격히 배출되어 약 18시간 후에는 거의 체내에 남아있지 않았다.As shown in Fig. 12, strong fluorescence was observed throughout the mouse body immediately after injection. In other words, it was confirmed that the nano-sized carbon quantum dots spread uniformly in the body. It was maintained for up to 3 hours after the injection, and thereafter was abruptly released and remained almost in the body after about 18 hours.
도 13에 표시된 바와 같이, 18시간 이후에는 폐에만 미량의 탄소 양자점이 남아 있었으며, 그 외 주요 장기에는 탄소 양자점이 거의 존재하지 않는 것이 확인되었다.As shown in Fig. 13, after 18 hours, only a small amount of carbon quantum dots remained in the lung, and other major organs were found to have almost no carbon quantum dots.
이러한 결과로부터, 본 발명의 탄소 양자점이 단시간에 체내에 고루 확산될 뿐만 아니라 불필요한 체내 축적도 발생하지 않음을 알 수 있다.From these results, it can be seen that the carbon quantum dots of the present invention not only diffuse uniformly in the body in a short time, but also do not cause unnecessary accumulation in the body.
5-2. 조직학적 검사5-2. Histological examination
체내 주요 장기 내 탄소 양자점의 축적 정도를 자세히 관찰하고, in vivo 세포독성을 확인하기 위해, 실험예 5-1에서 적출한 5개 장기를 헤마토실린&에오신(Hematoxylin&Eosin, H&E) 염색 처리하여 조직학적 병리(Histopathology) 검사를 수행하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.To observe the degree of accumulation of carbon QDs in major organs in the body and to confirm cytotoxicity in vivo , the five organs extracted from Experimental Example 5-1 were stained with hematoxylin & eosin (H & E) Histopathology tests were performed. The results are shown in Fig.
도 14에 표시된 바와 같이, 조직에서 유의한 손상 또는 염증은 발견되지 않았다. 이는 실험예 4-1의 in vitro 세포독성 검사 결과 및 실험예 5-1의 in vio 이미징 결과와도 일치하는 결과이다. 따라서 본 발명에 의하면, 탄소 양자점에 의한 장시간의 독성에 대한 위험부담이 줄어들 수 있다.As shown in Fig. 14, no significant damage or inflammation in the tissues was found. This is consistent with the in vitro cytotoxicity test results of Experimental Example 4-1 and the in vio imaging results of Experimental Example 5-1. Thus, according to the present invention, the risk of long term toxicity due to carbon quantum dots can be reduced.
이와 같은 결과를 종합해보면 본 발명의 제조방법으로부터 수득된 탄소 양자점이 우수한 생체 적합성을 나타내며, 향후 다른 바이오의약 분야에 적용될 때 큰 이점을 가질 수 있음을 알 수 있다.These results indicate that the carbon quantum dots obtained from the production method of the present invention exhibit excellent biocompatibility and can have a great advantage when applied to other biopharmaceutical fields in the future.
Claims (10)
b) 피브로인이 용해된 용액에 마이크로파를 조사하는 단계
를 포함하는 탄소 양자점의 제조방법.a) dissolving fibroin in a solvent to prepare a precursor solution; And
b) irradiating microwaves to the solution in which the fibroin is dissolved
Lt; RTI ID = 0.0 > 1, < / RTI >
c) 마이크로파가 조사된 용액을 원심분리하는 단계
를 더 포함하는 탄소 양자점의 제조방법.The method according to claim 1,
c) centrifuging the microwave irradiated solution
Further comprising the steps of:
d) 원심분리된 용액의 상층액을 취해 여과하는 단계
를 더 포함하는 탄소 양자점의 제조방법.8. The method of claim 7,
d) taking the supernatant of the centrifuged solution and filtering
Further comprising the steps of:
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