KR20180131577A - 신규의 최소 utr 서열 - Google Patents

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KR20180131577A
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Abstract

극도로 짧은 동시에 그들을 함유하는 RNA 분자의 높은 번역 효율을 가능하게 하는 이점을 조합하는 신규의 UTR 서열을 보유하는 mRNA로 전사될 수 있는 DNA 분자가 기재된다. 추가로, 이러한 DNA 분자를 포함하는 벡터 및 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포가 기재된다. 또한, 이러한 UTR을 함유하는 상응하는 RNA 분자가 기재된다. 추가로, 기재된 RNA 분자 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물과 더불어 RNA 분자의 코딩 영역을 상기 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질로 번역하기 위한 기재된 UTR의 용도가 기재된다.

Description

신규의 최소 UTR 서열
본 발명은, 극도로 짧은 동시에 그들을 함유하는 RNA 분자의 높은 번역 효율을 가능하게 하는 이점을 조합하는 신규의 UTR 서열을 보유하는 mRNA로 전사될 수 있는 DNA 분자에 관한 것이다. 추가로 본 발명은, 이러한 DNA 분자를 포함하는 벡터 및 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 이러한 UTR을 함유하는 상응하는 RNA 분자에 관한 것이다. 추가로 본 발명은, 기재된 RNA 분자 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물과 더불어 RNA 분자의 코딩 영역을 상기 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질로 번역하기 위한 기재된 UTR의 용도에 관한 것이다.
최근에, 전령 RNA(mRNA)는 새로운 약물체(new drug entity)로서 점점 더 유의미해져 왔다. DNA-기반 유전자 치료제와는 대조적으로, mRNA는 핵 내로 수송될 필요가 없고 세포질에서 단백질로 직접 번역된다(문헌[J Control Release, 2011, 150:238-247], 및 문헌[Eur J Pharm Biopharm, 2009, 71:484-489]). 이는 DNA 유전자 의약품의 예상 밖이지만 실존하는 위험인 잠재적 삽입 돌연변이유발을 방지함에 있어서 mRNA를 더 안전하게 만든다. 결과로서, mRNA 치료제는 매우 다양한 의학적 적응증에서 유전자 및 단백질 대체 요법에 대한 유망한 대안으로서 부상하고 있다(문헌[J Control Release, 2011, 150:238-247]; 문헌[Eur J Pharm Biopharm, 2009, 71:484-489]; 문헌[Nat Biotech, 2011, 29:154-157], 및 문헌[Nat Rev Genet, 2011, 12:861-874]). 그러나, 관용적인 mRNA의 강력한 면역원성과 더불어 제한된 안정성은, 그의 임상적 응용가능성을 추가로 확립하기 위해 극복되어야 한다. 이와 관련하여, mRNA 안정성 및 특히 mRNA의 번역 속도는 예상되는 의학적 응용을 위한 필수 파라미터인데, 이는 그것이, 예를 들어, mRNA 약물의 투여 및 투여 간격을 결정하기 때문이다.
안정성을 증가시키는 것 및 세포 또는 유기체에 투여된 mRNA에 의해 촉발된 면역원성 반응을 감소시키는 것 양자 모두에 있어서 몇몇 전략이 성공적인 것으로 판명되었다. 이들 중에는 화학적으로 개질된 뉴클레오티드의 포함이 있다(문헌[Current Opinion in Drug Discovery and Development, 2007, 10:523]). 코르만(Kormann) 등은, 단지 25%의 우리딘 및 시티딘 잔기를 2-티오우리딘 및 5-메틸-시티딘으로 대체하는 것이 mRNA 안정성을 증가시킴과 더불어 시험관내에서 외부적으로 투여된 mRNA에 의해 촉발된 선천 면역의 활성화를 감소시키기에 충분하다는 것을 입증했다(제WO2012/0195936 A1호; 제WO2007024708 A2호).
또한, mRNA 내의 비번역 영역(UTR)은 mRNA 안정성 및 mRNA 번역 양자 모두의 조절에 있어서 중추적 역할을 담당하는 것으로 보고된 바 있다. UTR은 번역 개시, 신장, 및 종결과 더불어, RNA 결합 단백질과 그들의 상호작용을 통한 mRNA 안정화 및 세포내 분포에 영향을 주는 것으로 나타난다(문헌[Briefings in Bioinformatics, 2000, 1:236-249] 및 문헌[Cold Spring Harbor Monograph Archive, 2007, 48:87-128]). UTR 내의 특이적 모티브에 따라, 그것은 mRNA 턴오버(mRNA turnover)를 향상시키거나 감소시킬 수 있다(문헌[Cell. Mol. Life Sci., 2012, 69:3613-3634]; 문헌[Nucleic Acids Research, 2005, 33:D141-D146]; 문헌[Science, 2005, 309:1514-1518], 및 문헌[Current Protein & Peptide Science, 2012, 13:294-304]). 최근에는, mRNA 반감기 및 상응하는 UTR 서열에 대한 데이터가 공개된 바 있다(문헌[Nucleic Acids Research, 2011, 39:556-566] 및 문헌[Nucleic Acids research, 37, e115]).
UTR은 mRNA의 시작 코돈의 업스트림 및 종결 코돈의 다운스트림에 있는 mRNA 분자의 섹션, 즉, 번역되지 않는 서열이다. 이들 영역은 코딩 영역과 함께 전사되며, 따라서 그들은 성숙한 mRNA에 존재하므로 엑손이다. mRNA의 시작 코돈의 업스트림에 있는 UTR은 5' UTR이라고 불리며, 일단 전사되면, 특히 프로모터의 (잔여 3') 일부에 상응하는 서열과 더불어 소위 코작(Kozak) 서열 보유한다.
코작 공통 서열, 코작 공통, 또는 코작 서열은 진핵생물 mRNA에서 나타나는 것으로 알려져 있고 공통(gcc)gccRccAUGG를 가진 서열이다. 코작 공통 서열은 번역 과정의 개시에서 주요 역할을 담당한다. 그 서열은 그것의 중요성을 이끌어낸 사람인 마릴린 코작의 이름을 따서 명명되었다. mRNA 분자 내의 이 서열은 번역 시작 부위에서 리보솜에 의해 인식되며, 이로부터 그 mRNA 분자에 의해 단백질이 코딩된다. 리보솜은 번역을 개시하기 위해 이 서열 또는 그의 가능한 변이체를 필요로 한다. 그 서열은 표기 (gcc)gccRccAUGG에 의해 식별되며, 이는 하기와 같이 매우 다양한 공급원(총 약 699개)으로부터의 코작에 의해 분석된 데이터를 요약한다: 소문자는 염기가 그럼에도 변동될 수 있는 위치의 가장 통상적인 염기를 표기하고; 대문자는 고도로 보존된 염기를 표시하며, 즉, "AUGG" 서열은 불변하거나, 변화한다고 해도 드물게 변화하며, "R"은 퓨린(아데닌 또는 구아닌)이 항상 이 위치에서 관찰됨을 표시하고(코작은 아데닌이 더 빈번한 것으로 주장함); 괄호 안의 서열((gcc))은 유의성이 불명확한 것이다.
코작 공통 서열은 프리프로인슐린 유전자의 번역시에 개시 코돈(AUG, 이와 관련하여 A는 위치 +1을 정의함) 주위의 점 돌연변이의 분석으로 인해 원래 ACCAUGG로서 정의되었다. 699개 척추동물 mRNA의 더 상세한 돌연변이유발은 공통 서열 GCCGCCACCAUGG를 유발했으며, 여기에서 AUG 시작 코돈의 업스트림에 있는 위치 -3의 A는 또한 G일 수 있었다(문헌[Nucleic Acids Res., 1987, 15(20):8125-8148]). 진핵 세포에서 프리프로인슐린 및 알파-글로빈 번역에 대한 연구는 위치 -3의 퓨린(통상적으로 A)이 효율적인 번역 개시에 필수적이며 이 퓨린이 누락될 경우에는 위치 + 4의 G가 필수적임을 규명했다(문헌[J. Cell Biol., 1989, 108:229-41]). mRNA 분자로부터 합성되는 단백질의 양은 코작 요소의 서열에 강력하게 의존하며: 단백질의 N-말단 메티오닌을 암호화하는 AUG 시작 코돈이 가장 중요하다. 강력한 공통성을 위해, 위치 +4(G) 및 -3(A 또는 G)의 뉴클레오티드는 양자 모두 공통성에 부합해야 한다. 적절한 공통 서열은 이들 2개의 부위 중 하나만을 가지는 반면에, 약한 공통 서열은 위치 +4 또는 -3에서의 요건 중 어느 것도 충족하지 않는다. -1 및 -2의 2개의 시티딘 잔기는 그다지 많이 보존되지 않는 반면에(문헌[Cell, 1986, 44(2):283-92]), 위치 -6의 G는 번역의 개시에 있어서 중요하다(문헌[Br. J. Haematol., 2004, 124(2):224-31]).
mRNA의 안정성을 증가시키고, 세포 또는 유기체에 투여된 mRNA에 의해 촉발된 면역원성 반응을 감소시키며, 발현 효율(즉, 전사 및/또는 번역 효율)을 증가시키는 수단 및 방법이 선행 기술에 이미 기재되어 있지만, 특히 발현 효율(즉, 전사 및/또는 번역 효율)을 증가시키는 추가의 수단 또는 대안적 수단에 관해 개선의 필요성이 여전히 존재하며, 이는 발현 효율이, 예를 들어 mRNA 약물의 투여 및 투여 간격을 결정하고, 궁극적으로 최종 산물, 즉, 암호화되는 펩티드 또는 단백질의 생체이용율을 결정하므로 발현 효율은 예상되는 의학적 응용을 위한 필수 파라미터이기 때문이다. 동시에, mRNA 약물의 제조 비용을 추가로 감소시키고, 생성되는 mRNA 분자의 수율을 증가시키며, 실제 이식유전자를 위한, 즉, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역을 위한, 생성되는 mRNA 분자 내의 이용가능한 공간을 증가시킬 필요성이 계속 존재한다.
본 출원은 청구범위에 정의된 바와 같은 실시 형태를 제공함으로써 이 필요성을 다룬다.
특히 본 출원은, UTR 서열의 크기를 "최소 UTR" 서열로 감소시킴으로써, mRNA 약물의 제조 비용을 감소시키고, 생성되는 mRNA 분자의 수율을 증가시키며, 실제 이식유전자를 위한, 즉, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역을 위한, 생성되는 mRNA 분자 내의 이용가능한 공간을 증가시킬 수 있음을 의외로 발견하였다. 또한, 동시에, 이 최소 UTR 서열은 의외로 관용적인 UTR 서열에 비해 발현율을 유지하거나 심지어 개선하는 한편, 이 최소 UTR 서열 내의 개질은 심지어 mRNA 분자의 발현율을 증가시킴이 발견되었다.
이 발견은 청구범위에 특성화된 바와 같은 실시 형태의 제공, 특히 이러한 "최소 UTR" 서열을 보유하는 RNA 분자의 생성과 더불어 상응하는 RNA 분자의 제공을 가능하게 하는 DNA 분자의 제공을 유발한다.
제1 태양에는 상응하는 분자가 DNA-수준에서 기재되는 반면에, 추가로 하기 제2 태양에는 상응하는 분자가 RNA-수준에서 기재된다.
따라서 제1 태양에서 본 발명은, mRNA로 전사될 수 있는 DNA 분자에 관한 것이며, 여기에서 상기 DNA 분자는 하기 요소를 가진 하나의 가닥을 포함하거나 상보적인 가닥을 포함한다:
(a) 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는, 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역; 및
(b) 상기 코딩 서열의 바로 업스트림에 있는,
(b1) R1-CGCCACC(서열 번호 1);
또는 상기 서열에서 서열 번호 1의 위치 6에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 1의 위치 7에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 1의 위치 5에서 A가 G에 의해 치환된 서열; 및
(b2) 서열 번호 2의 위치 2에서 뉴클레오티드 N이 T, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 R1-CNGCCACC(서열 번호 2);
또는 상기 서열에서 서열 번호 2의 위치 7에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 2의 위치 8에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 2의 위치 6에서 A가 G에 의해 치환된 서열로 구성된 그룹 중에서 선택되며,
여기에서 R1은 DNA-의존성 RNA-폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터인 서열.
DNA 서열은 그의 서열이 단백질로 변역되는 전령 RNA 사본의 것과 동일한 경우에 "센스"라고 불린다. 대향하는 상보적인 가닥 상의 서열은 "안티센스" 서열이라고 불린다. 본 발명의 DNA 분자는 센스 가닥에 관하여 상기 (a) 및 (b)에 정의되는 반면에, 상응하는 상보적인 안티센스-가닥은 염기 대합 규칙을 고려하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 DNA 분자는 mRNA 분자로 전사될 수 있는 DNA 분자이다. 전사는 유전자 발현의 제1 단계이며, 여기에서는 DNA 분자의 특정 세그먼트가 효소 RNA 폴리머라제에 의해 mRNA 분자로 복사된다. 전사 중에, DNA 서열은 RNA 폴리머라제에 의해 판독되며, 이는 1차 전사체라고 불리는 상보적인 역평형 RNA 가닥을 생성한다.
2개의 DNA 가닥 중 하나만 전사를 위한 주형으로서의 작용한다. 전사 중에 DNA의 안티센스 가닥은 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 3' 단부로부터 5' 단부로 판독된다(3' → 5'). 상보적인 RNA는 반대 방향으로 5' → 3'으로 생성되어, 티민을 우라실로 전환하는 점을 제외하고는 센스 가닥의 서열에 부합한다. 이 방향성은 RNA 폴리머라제가 성장하는 mRNA 사슬의 3' 단부에만 뉴클레오티드를 부가할 수 있기 때문이다. DNA의 비-주형 센스 가닥은 코딩 가닥이라고 불리는데, 이는 그의 서열이 새로 생성되는 RNA 전사체와 동일하기 때문이다(티민을 우라실로 치환한 점을 제외함). 이는 DNA 서열을 나타낼 경우에 관례에 의해, 그리고 본 발명에 관련하여 사용되는 가닥이다.
본 발명의 DNA 분자는 이중-가닥 또는 단일-가닥 또는 부분적으로 이중-가닥 및 부분적으로 단일-가닥일 수 있다.
본 발명의 DNA 분자는 2개의 주모듈("항목"이라고도 지칭됨), 즉, (a) 폴리펩티드를 코딩하며 그의 5'-단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역, 및 (b) 상기 코딩 영역의 바로 업스트림에 있는, 본 명세서에 상기 (b1) 또는 (b2)에 정의된 바와 같은 서열을 포함한다. 이러한 DNA 분자는, 전사될 경우에, 상기 기재된 이점을 부여하는 극도로 짧은 UTR 서열을 가진 mRNA를 유발한다.
부가적으로, 본 발명의 DNA 분자는 mRNA로 전사될 경우에 코딩 영역의 다운스트림에 있는 UTR을 생성하는 서열을 바람직하게 포함한다. 따라서, 본 발명의 DNA 분자는 생성되는 mRNA 분자 내에 코딩 영역과 더불어 전사시에 (5' 및 3') 비번역 영역(UTR)을 생성하는 서열을 바람직하게 보유한다.
본 발명에 따라 사용되는 바와 같이, 용어 "그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은 코돈으로 이루어진 DNA 서열에 관련되며, 이는 DNA-의존성 RNA-폴리머라제에 의해 mRNA 분자로 전사되고, 여기에서 상응하는 mRNA 분자는 "유전 암호"에 의해 제공되는 정보에 따라 리보솜에 의해 해독되고 단백질로 번역될 수 있다. 코딩 영역은 통상적으로 그들의 5' 단부에서 시작 코돈으로 시작되고 종결 코돈으로 종료된다. 일반적으로, 시작 코돈은 ATG 삼중항(RNA 수준 상의 AUG 삼중항에 상응함)이고 종결 코돈은 TAA, TAG, 또는 TGA(RNA 수준 상의 UAA, UAG, 또는 UGA에 상응함)이다. 단백질-코딩임에 부가하여, 코딩 영역의 일부가 엑손 스플라이싱 인핸서(exoninc splicing enhancer) 또는 엑손 스플라이싱 사일런서(exoninc splicing silencer)로서 프리-mRNA에서 조절 서열로서 작용할 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자의 코딩 영역은 또한 코딩 서열 또는 (코딩 DNA 서열로부터의) CDS로서 알려져 있으며, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 엑손으로 이루어진 유전자의 DNA 또는 RNA의 부분이다. mRNA 내의 코딩 영역에는 5'-비번역 영역(5' UTR) 및 3'-비번역 영역(3' UTR)이 인접하며, 이 또한 엑손의 부분이다. 또한, mRNA 분자는 소위 5' 캡 및 폴리-A 테일(poly-A-tail)을 추가로 포함할 수 있다. 5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 및 폴리-A 테일은 단백질로 번역되지 않는 mRNA 분자의 영역이다.
본 발명에 따라 사용되는 바와 같이, 용어 "비번역 영역" 또는 "UTR"은 시작 코돈의 업스트림 및 종결 코돈의 다운스트림에 있는 mRNA의 번역되지 않는 섹션에 관한 것이므로, 각각 5 프라임 비번역 영역(5' UTR) 및 3 프라임 비번역 영역(3' UTR)이라고 명명된다. 이들 영역은 코딩 영역과 함께 전사되며, 따라서 그들은 성숙한 mRNA에 존재하므로 엑손이다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, 3' 비번역 영역(3'-UTR)은 번역 종결 코돈 직후의 전령 RNA(mRNA)의 섹션에 관한 것이다. 3' UTR은 3'-비번역 영역 내에 조절 영역을 포함할 수 있으며, 이는 mRNA의 폴리아데닐화 및 안정성에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 다수의 3'-UTR이 또한 AU-풍부 요소(ARE)를 함유한다. 추가로, 3'-UTR은 mRNA 전사체의 단부에 폴리(A) 테일이라고 불리는 수백개의 아데닌 잔기를 부가하는 것을 지시하는 서열 AAUAAA를 바람직하게 함유할 수 있다.
5' 비번역 영역(5' UTR)(리더 서열 또는 리더 RNA라고도 알려짐)은 시작 코돈의 바로 업스트림에 있는 mRNA의 영역이다. 5′ UTR은 전사 시작 부위에서 시작되고 코딩 영역의 시작 코돈(mRNA에서 통상적으로 AUG)으로부터 1개 뉴클레오티드(nt) 전에 종료된다. 진핵생물에서 5' UTR의 길이는 일반적으로 100 내지 수천개 뉴클레오티드의 길이이지만 간혹 더 짧은 UTR도 진핵생물에 발생한다.
본 발명에서, 프로모터와 코딩 영역(상기 (b1) 또는 (b2)에 정의된 바와 같음) 사이의 서열은 극도로 짧으며, 전사시에 매우 짧은 "최소" UTR 서열을 가진 mRNA 분자를 유발한다.
DNA 분자의 하나의 모듈, 즉, "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"(모듈 (a))은 특별히 제한되지 않으며 제공된 세포에서 발현될 임의의 목적하는 코딩 영역일 수 있다. 따라서, 이 모듈은 목적하는 폴리펩티드, 즉, 목적하는 최종 산물을 코딩하는 코딩 영역일 수 있다. 코딩 영역의 성질은 세포 내에서 생성될 목적 산물에 의존하므로, 본 발명은 "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"에 관련하여 제한되지 않는다. 이러한 코딩 영역은 또한 알려진 천연 서열과 상이하고 돌연변이(즉, 점 돌연변이, 삽입 돌연변이, 결실, 및 그의 조합)를 함유하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 또한, 이러한 코딩 영역은 부분적으로 또는 전적으로 모듈 (a)로 사용될 천연 서열로부터 유래된 코돈 최적화 서열일 수 있다. 코돈 최적화는 관심 유전자로부터 유래된 mRNA의 번역 효율을 증가시킴으로써 단백질 발현을 최대화하는 기술이다. 천연 유전자는 이용가능한 코돈을 무작위로 사용하는 것이 아니라 동일한 아미노산을 위한 특정 코돈에 대한 소정의 선호도를 나타낸다는 것이 알려져 있다. 따라서, 유전 암호의 축중성으로 인해 - 하나의 아미노산이 몇몇 코돈에 의해 암호화될 수 있음 - 관심 유전자의 뉴클레오티드 서열이 동일하거나 다른 종의 선호되는 코돈의 세트로 변환된다.
언급된 바와 같이, 모듈 (a)는 특별히 제한되지 않으며 제공되는 세포에서 발현될 임의의 목적하는 코딩 영역일 수 있다. 따라서, 본 발명에 관하여 "코딩 영역"은, 세포 내로 도입될 경우에 폴리펩티드/단백질 또는 그의 단편으로 번역가능한 mRNA 분자로 전사될 수 있는 임의의 폴리-데스옥시리보뉴클레오티드 분자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 임의의 종류의 아미노산 서열, 즉, 펩티드 결합을 통해 각각 연결되는 2개 이상의 아미노산의 사슬을 포함하며, 펩티드 및 융합 단백질 또한 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은, 세포내 또는 세포 부근에서의 그의 작용이 필요하거나 유익한 폴리펩티드/단백질 또는 그의 단편, 예를 들어, 세포 또는 그의 부근에서 그의 결여 또는 결손형이 질환 또는 질병을 촉발하는 단백질, 그의 제공이 질환 또는 질병을 완화하거나 예방할 수 있는 단백질, 또는 신체에 유익한 과정을 촉진할 수 있는 단백질을 암호화하는 데스옥시리보뉴클레오티드 서열을 함유한다. 코딩 영역은 완전한 단백질 또는 그의 기능성 변이체를 위한 서열을 함유할 수 있다. 추가로, 코딩 영역의 데스옥시리보뉴클레오티드 서열은 인자, 유도제, 조절제, 자극제 또는 효소, 또는 그의 기능성 단편으로서 작용하는 단백질을 암호화할 수 있으며, 여기에서 이 단백질은 장애, 특히 대사정 장애를 치료하기 위해, 또는 새로운 혈관, 조직 등의 형성과 같은 생체내 과정을 개시하기 위해 그의 기능이 필요한 것이다. 본 명세서에서 기능성 변이체는, 그의 작용이 세포 내에서 필요하거나 그의 결여 또는 결손형이 병원성인 단백질의 기능을 세포 내에서 수행할 수 있는 단편을 의미하는 것으로 이해된다.
바람직한 실시 형태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은 치료 효과 또는 예방 효과를 나타내는 치료적으로 또는 약제학적으로 활성인 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화한다. 그러므로, 상기 "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"을 포함하는 mRNA로 전사될 수 있는 본 발명의 DNA 분자는 핵산 요법 및 관련 응용에 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에 따라, 몇가지 예를 들면 낭포성 섬유증, 혈우병, 또는 근이영양증과 같은 다수의 대사성 질환 및 유전성 질환의 경우와 같이, 특히 내인성 유전자가 결손되거나 침묵하거나, 불충분하거나 결손되거나 기능장애인 유전자 발현 산물을 유발하거나 유전자 발현 산물을 유발하지 않는 경우에, mRNA 및 추가로 폴리펩티드 또는 단백질로의 본 발명의 DNA 분자의 전사 및 번역은 내인성 유전자 발현을 보상하거나 보충하도록 의도될 수 있다. mRNA 및 추가로 폴리펩티드 또는 단백질로의 본 발명의 DNA 분자의 전사 및 번역은 또한, 발현 산물이 유전자 발현, 신호 전달, 및 다른 세포 과정의 조절과 같은 임의의 내인성 세포 과정과 상호작용하거나 이를 방해하도록 하는 것을 의도할 수 있다. mRNA 및 추가로 폴리펩티드 또는 단백질로의 본 발명의 DNA 분자의 전사 및 번역은 또한, 형질감염되거나 형질도입된 세포가 체류하거나 체류하도록 만들어진 유기체에 관하여 면역 반응을 일으키도록 의도될 수 있다. 예는 수지상 세포와 같은 항원-제시 세포의, 백신 접종 목적으로 그들이 항원을 제시하도록 하기 위한 유전적 개질이다. 다른 예는, 상기 코딩 영역이 사이토카인을 암호화하는, mRNA 및 추가로 폴리펩티드 또는 단백질로의 본 발명의 DNA 분자의 전사 및 번역이다. 예를 들어, 이는 종양-특이적 면역 반응을 유발하기 위해 종양에서 바람직할 수 있다. 추가로, mRNA 및 추가로 폴리펩티드 또는 단백질로의 본 발명의 DNA 분자의 전사 및 번역은 또한, 재생 의약품을 위한 개질된 T-세포 또는 전구체 또는 줄기 세포 또는 다른 세포와 같은, 세포 요법을 위해 생체내 또는 생체외에서 일시적으로 유전적으로 개질된 세포를 생성하도록 의도될 수 있다.
다른 바람직한 실시 형태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은 성장 과정 및 혈관신생에 일조하는 단백질을 암호화할 수 있으며, 예를 들어, 이는 제어된 재생에 필요하고, 이어서 본 발명에 따른 RNA 분자의 도입에 의해 특이적으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 이는 성장 과정에, 또는 골 결함, 조직 결함의 치료를 위해, 그리고 매식(implantation) 및 이식(transplantation)에 관련하여 유용할 수 있다.
언급된 바와 같이, "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"을 포함하는 본 발명의 DNA 분자 및, 특히 상응하여 전사된 RNA 분자는, 천연적으로 체내에 존재할 것이나 유전자 결함 또는 질환으로 인해 존재하지 않거나 결핍된 형태 또는 너무 적은 양으로 존재하는 폴리펩티드 또는 단백질을 체내에 제공하고자 하는 임의의 경우에 적당하게 사용될 수 있다. 그의 결핍 또는 결함이 질환과 연결된 단백질 및 그들을 암호화하는 유전자가 알려져 있다. 온전한 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 코딩 영역의 각각의 온전한 버전을 본 발명에 따라 사용할 수 있다.
단일 유전자의 돌연변이에 의해 야기되는 다수의 유전적 장애가 알려져 있으며, mRNA 치료 접근법을 위한 후보가 된다. 낭포성 섬유증, 혈우병, 및 기타 다수와 같이 단일-유전자 돌연변이에 의해 야기되는 장애는 소정의 특성이 후손에서 나타날 가능성에 관련하여 우성 또는 열성일 수 있다. 우성 대립유전자는 대립유전자의 사본을 하나만 가진 개체에서 표현형을 나타내는 반면에, 열성 대립유전자의 경우에는 표현형이 되기 위해 개체가 각각의 부모로부터 하나씩 2개의 사본을 가져야 한다. 반면에, 복합유전자 장애는 2개 이상의 유전자에 의해 야기되며 각각의 질환의 표현은 종종 유동적이고 환경 요인에 연계된다. 복합유전자 장애에 대한 예는 고혈압, 상승된 콜레스테롤 수준, 암, 신경변성 장애, 정신병 등이다. 이들 경우에도 이들 유전자 중 하나 이상을 나타내는 치료 mRNA가 그들 환자에게 유익할 수 있다. 추가로, 유전적 장애는 반드시 부모의 유전자로부터 물려받은 것은 아니고, 새로운 돌연변이에 의해서도 야기될 수 있다. 이들 경우에도 정확한 유전자 서열을 나타내는 치료 mRNA가 환자에게 유익할 수 있다.
현재 22,993개 항목의 인간 유전자 및 유전적 장애를 그들 각각의 유전자 및 그들의 표현형의 설명과 함께 가진 온라인 카탈로그가 ONIM(Online Mendelian Inheritance in Man) 웹페이지(http://onim.org)에서 이용가능하며; 각각의 서열은 Uniprot 데이터베이스(http://www.uniprot.org)로부터 이용가능하다. 비제한적 예로서, 하기 표 1은 일부 선천성 질환 및 상응하는 유전자(들)를 열거한다. 세포 신호전달 경로의 고도의 상호작용으로 인해, 소정의 유전자의 돌연변이는 다중의 병원성 증상을 야기하며, 그 중에서 특징적인 것만 표 1에 열거되어 있다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 치료 단백질은 표 1에 열거된 세포 단백질로부터 선택된다. 따라서, 본 발명의 DNA 분자는 치료 세포 단백질을 암호화할 수 있으며, 여기에서 암호화되는 치료 단백질은 표 1에 열거된 것 또는 그의 상동체이다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 치료 단백질은 표 1에 열거된 분비 단백질로부터 선택된다. 따라서, 본 발명의 DNA 분자는 치료 융합 단백질을 암호화할 수 있으며, 여기에서 암호화되는 치료 단백질 또는 그의 상동체는 표 1에 열거된 것이고 제2 단백질은 치료 단백질의 분비를 가능하게 하는 신호 펩티드이다. 신호 펩티드는 짧고 길이가 전형적으로 5-30개 아미노산인, 상기 치료 단백질의 N-말단에 존재하는 아미노산 서열이며, 이는 소정의 소기관(즉, 소포체, 골지체, 또는 엔도솜)을 통해 융합 단백질을 세포의 분비 경로를 향해 인도한다. 따라서, 이러한 융합 단백질은 세포 또는 세포 소기관으로부터 분비되거나 세포 구획 또는 세포 표면에서 세포막 내로 삽입된다(예를 들어, 다중-스패닝 막관통 단백질).
따라서, 본 발명의 바람직한 실시 형태에서 "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"(모듈 (a))은 질환으로부터의 보호 또는 성향을 야기하는 하기 유전자를 암호화할 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 치료(또는 예방)할 수 있는 이러한 장애의 비제한적 예는 상기 폴리펩티드, 단백질, 또는 펩티드가 하기 표 1에 개관된 바와 같은 것들로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것들을 포함한다.
일부 실시 형태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은 자연적인 단백질의 수준 이상의 수준으로 세포 활성을 포함하는 부분 또는 전장 단백질로 전사 및 번역될 수 있다. 일부 실시 형태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은 치료 효과 또는 예방 효과를 나타내는 치료적으로 또는 약제학적으로 활성인 폴리펩티드, 단백질, 또는 펩티드를 암호화하며, 여기에서 상기 폴리펩티드, 단백질, 또는 펩티드는 하기 표 1에 개관된 바와 같은 것들로 구성된 그룹 중에서 선택된다. "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"을 사용하여 자연적인 단백질의 수준 이하의 수준으로 세포 활성을 나타내는 부분 또는 전장 단백질을 발현시킬 수 있다. 이는 RNA 분자의 투여가 권고될 수 있는 질환의 치료를 가능하게 할 수 있다.
[표 1]
인간 유전자 및 유전적 장애의 비제한적 예
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
상기 표 1은 그 안의 결함이 본 발명의 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자로 치료할 수 있는 질환을 유발하는 유전자의 예를 나타내며, 여기에서 DNA 분자(및 상응하여 전사된 RNA 분자)는 상기 개시된 결손 유전자의 단백질의 온전한 버전 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"을 포함한다. 특히 바람직한 실시 형태에서는, 예를 들어 폐를 손상시키는 유전성 질환, 예컨대 SPB(계면활성제 단백질 B) 결핍증, ABCA3 결핍증, 낭포성 섬유증, 및 α1-항트립신 결핍증, 또는 혈장 단백질을 손상시키고(예를 들어 선천성 혈색소침착증(헵시딘 결핍증), 혈전성 혈소판 감소성 자반증(TPP, ADAMTS 13 결핍증) 및 응고 결함(예를 들어 혈우병 a 및 b) 및 보체 결함(예를 들어 단백질 C 결핍증), 면역 결함, 예컨대 SCID(RAG1, RAG2, JAK3, IL7R, CD45, CD3δ, CD3ε과 같은 상이한 유전자 내의 돌연변이에 의해 야기됨) 또는 예를 들어 아데노신 데스아미나제의 결여로 인한 결핍에 의한 면역 결함(ADA-SCID), 패혈성 육아종증(예를 들어, gp-91-phox 유전자, p47-phox 유전자, p67-phox 유전자, 또는 p33-phox 유전자의 돌연변이에 의해 야기됨) 및 저장 질환, 예컨대 고셔병, 파브리병, 크라베병, MPS I, MPS II(헌터 증후군), MPS VI, 글리코겐 저장 질환 유형 II, 또는 뮤코폴리사카라이드증을 야기하는 유전성 질환을 언급할 수 있다.
"펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"을 포함하는 본 발명이 유용할 수 있는 다른 장애는, SMN1-관련 척수성 근육 위축증(SMA); 근위축성 측삭 경화증(ALS); GALT-관련 갈락토스혈증; 낭포성 섬유증(CF); 시스틴뇨증을 포함하는 SLC3A1-관련 장애; 알포트 증후군을 포함하는 COL4A5-관련 장애; 갈락토세레브로시다제 결핍증; X-연관 부신백질이영양증 및 부신척수신경병증; 프리드리히 운동실조; 펠리제우스-메르츠바하병; TSC1 및 TSC2-관련 결절성 경화증; 산필리포 B 증후군(MPS IIIB); CTNS-관련 시스틴증; 취약 X 증후군, 취약 X-연관 진전/운동실조 증후군, 및 취약 X 조기 난소 부전 증후군을 포함하는 FMR1-관련 장애; 프라더-윌리 증후군; 유전성 출혈성 모세혈관확장증(AT); 니만-피크병 유형 C1; 청소년기 뉴런 세로이드 리포푸스신증(JNCL), 청소년기 바텐병, 산타부오리-할티아병, 얀스키-빌쇼스키병, 및 PTT-1 및 TPP1 결핍증을 포함하는 뉴런 세로이드 리포푸신증-관련 질환; 중추 신경계 저수초형성/백색질 소멸을 동반하는 EIF2B1, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4, 및 EIF2B5-관련 유년기 운동실조; CACNA1A 및 CACNB4-관련 간헐성 운동실조 유형 2; 전형적 레트 증후군, MECP2-관련 중증 신생아 뇌병증, 및 PPM-X 증후군을 포함하는 MECP2-관련 장애; CDKL5-관련 비전형 레트 증후군; 케네디병(SBMA); 피질하 경색 및 백질뇌병증을 동반하는 Notch-3 관련 대뇌 상염색체 우성 동맥병증(CADASIL); SCN1A 및 SCN1B-관련 발작 장애; 알퍼스-후텐로처 증후군, POLG-관련 감각 실조 신경병증, 구음장애, 및 안근마비를 포함하는 폴리머라제 G-관련 장애, 및 미토콘드리아 DNA 결실을 동반하는 상염색체 우성 및 열성 진행성 외안근마비; X-연관 부신 저형성증; X-연관 무감마글로불린혈증; 파브리병; 및 윌슨병과 같은 장애를 포함한다.
이들 질환 모두에서, 단백질, 예를 들어 효소가 결손되며, 이는 결손 유전자에 의해 암호화되는 단백질 또는 그의 기능성 단편을 이용가능하게 만드는 본 발명의 DNA 분자로부터 전사된 RNA로 치료함으로써 치료할 수 있다. 전사체 대체 요법/효소 대체 요법은 기저의 유전적 결함에 영향을 주지 않지만, 환자에게 결핍된 효소의 농도를 증가시킨다. 예로서, 폼페병에서, 전사체 대체 요법/효소 대체 요법은 결핍된 리소좀 효소 산 알파-글루코시다제(GAA)를 대체한다.
따라서, 본 발명에 따른 모듈 (a)의 "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"에 의해 암호화될 수 있는 단백질의 비제한적 예는 에리트로포이에틴(EPO), 성장 호르몬(소마토트로핀, hGH), 낭포성 섬유증 막관통 전도도 조절제(CFTR), 성장 인자, 예컨대 GM-SCF, G-CSF, MPS, 단백질 C, 헵시딘, ABCA3, 및 계면활성제 단백질 B이다. 본 발명에 따른 RNA로 치료할 수 있는 질환의 추가의 예는 혈우병 A/B, 파브리병, CGD, ADAMTS13, 헐러병, X 염색체-매개 A-γ-글로불린혈증, 아데노신 데아미나제-관련 면역결핍증, 및 SP-B와 연관되는 신생아에서의 호흡곤란 증후군이다. 특히 바람직하게, 본 발명에 따른 DNA 분자의 "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은 계면활성제 단백질 B(SP-B) 또는 에리트로포이에틴에 대한 서열을 함유한다. 본 발명에 따른 DNA 분자의 "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"에 의해 암호화될 수 있는 단백질의 추가의 예는 성장 인자, 예컨대 인간 성장 호르몬 hGH, BMP-2, 또는 혈관신생 인자이다.
대안적으로 대상에게 면역을 부여하기 위해 핵산은 전장 항체 또는 더 작은 항체(예를 들어, 중쇄 및 경쇄 양자 모두)를 암호화할 수 있다. 다른 실시 형태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은 기능성 단클론 또는 다클론 항체를 암호화할 수 있으며, 이는 생물학적 표적(예를 들어, 종양 괴사 인자와 같은 자극성 사이토카인)의 표적화 및/또는 비활성화에 유용할 수 있다. 마찬가지로, "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은, 예를 들어, 막증식성 사구체신염 유형 II 또는 급성 용혈성 요독 증후군의 치료에 유용한 기능성 항-신장 인자(anti-nephrotic factor) 항체를 암호화할 수 있거나, 대안적으로 암과 같은 VEGF-매개 질환의 치료에 유용한 항-혈관 내피 성장 인자(VEGF) 항체를 암호화할 수 있다.
모듈 (a), 즉, "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은 유전체 편집 기술에 사용할 수 있는 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 코딩 영역일 수 있다. 유전체 편집은 뉴클레아제를 사용하여 유기체의 유전체 내에서 DNA를 삽입하거나 결실시키거나 대체하는 유전 공학의 유형이다. 이들 뉴클레아제는 유전체 내의 목적하는 위치에 부위-특이적 이중-가닥 절단(DSB)을 생성한다. 유도된 이중-가닥 절단은 비-상동성 단부-연결 또는 상동성 재조합에 의해 복구되어, 유전체 내에 표적화 돌연변이를 유발함으로써 유전체를 "편집"한다. 상이한 폴리펩티드 또는 단백질을 이용하는 다수의 유전체 편집 시스템, 즉, 예를 들어, CRISPR-Cas 시스템, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 및 전사 활성화인자-유사 효과인자-기반 뉴클레아제(TALEN)가 당업계에 알려져 있다. 유전체 조작 방법은 문헌[Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405]에 검토되어 있다.
따라서, 바람직한 실시 형태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은 Cas(CRISPR 연관 단백질) 단백질 패밀리의 폴리펩티드 또는 단백질, 바람직하게 Cas9(CRISPR 연관 단백질 9)를 암호화하는 데스옥시리보뉴클레오티드 서열을 함유한다. Cas 단백질 패밀리의 단백질, 바람직하게 Cas9는 CRISPR/Cas9 기반 방법 및/또는 CRISPR/Cas9 유전체 편집 기술에 사용될 수 있다. 유전체 편집, 조절, 및 표적화를 위한 CRISPR-Cas 시스템은 문헌 [Nat. Biotechnol., 2014, 32(4):347-355]에 검토되어 있다.
다른 바람직한 실시 형태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은 메가뉴클레아제를 암호화하는 데스옥시리보뉴클레오티드 서열을 함유한다. 메가뉴클레아제는 "관용적인" 엔도데옥시리보뉴클레아제와는 대조적으로 큰 인식 부위(예를 들어, 12 내지 40개 염기쌍의 이중-가닥 DNA 서열)를 인식하는 엔도데옥시리보뉴클레아제이다. 결과로서, 각각의 부위는 임의의 제공된 유전체에서 단지 수회, 바람직하게 단지 1회 발생한다. 그러므로 메가뉴클레아제는 가장 특이적인 천연 발생 제한 효소인 것으로 간주되며, 따라서, 유전체 편집 기술에 적합한 도구이다.
다른 바람직한 실시 형태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 암호화하는 데스옥시리보뉴클레오티드 서열을 함유한다. ZFN은 징크 핑거 DNA-결합 도메인을 DNA-절단 도메인에 융합시킴으로써 생성되는 인공 제한 효소이다. 징크 핑거 도메인을 조작하여 목적하는 특이적 DNA 서열을 표적화할 수 있으며, 이는 징크-핑거 뉴클레아제가 복잡한 유전체 내의 고유한 서열을 표적화할 수 있게 한다. 내인성 DNA 복구 기전을 이용함으로써, ZFN은 고등 생물의 유전체를 정밀하게 변경하기 위해 사용될 수 있으며, 그러므로 유전체 편집 기술에 적합한 도구이다.
다른 바람직한 실시 형태에서, "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은 전사 활성화인자-유사 효과인자 뉴클레아제(TALEN)를 암호화하는 데스옥시리보뉴클레오티드 서열을 함유한다. TALEN은 DNA의 특이적 서열을 절단하도록 조작될 수 있는 제한 효소이다. TALEN은 TAL 효과인자 DNA-결합 도메인이 뉴클레아제의 DNA 절단 도메인에 융합된 융합 단백질이다. 전사 활성화인자-유사 효과인자(TALE)는 사실상 임의의 목적하는 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 따라서, 뉴클레아제와 조합될 경우, DNA는 목적하는 특이적 위치에서 절단될 수 있다.
본 발명의 DNA 분자는 제2 모듈 (b)로서 코딩 서열의 바로 업스트림에 위치하는 서열을 포함한다.
더욱 특이적으로, 본 발명의 DNA 분자는 상기 코딩 서열의 바로 업스트림에 있는 모듈 (b)를 포함하고, 여기에서 상기 모듈 (b)는
(b1) R1-CGCCACC(서열 번호 1);
또는 상기 서열에서 서열 번호 1의 위치 6에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 1의 위치 7에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 1의 위치 5에서 A가 G에 의해 치환된 서열; 및
(b2) 서열 번호 2의 위치 2에서 뉴클레오티드 N이 T, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 R1-CNGCCACC(서열 번호 2);
또는 상기 서열에서 서열 번호 2의 위치 7에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 2의 위치 8에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 2의 위치 6에서 A가 G에 의해 치환된 서열로 구성된 그룹 중에서 선택된 서열이며, 여기에서 R1은 DNA-의존성 RNA-폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터이다.
본 명세서에서 상기 항목 (b)에 정의된 바와 같은 서열은 상기 특이적 서열로 특별히 제한되지 않지만, 이러한 서열에 비교하여 (a) 뉴클레오티드(들) 부가(들)를 나타내는 (a) 서열(들)에 또한 관련될 수 있으며, 여기에서 부가적인 뉴클레오티드(들)는 상기 기재된 서열(들) 내의 R1의 5'-단부에 부가될 수 있다. 부가적인 뉴클레오티드(들)는 최대 0(변화 없음), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 뉴클레오티드, 바람직하게 최대 20개 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함한다. 더욱 바람직하게, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 또는 19개의 뉴클레오티드가 5'-단부에 부가된다. 더욱 더 바람직하게, 최대 30개의 뉴클레오티드가 5'-단부에 부가된다.
프로모터 R1의 업스트림의 뉴클레오티드의 부가는 본 발명의 UTR(들)의 상기 기능성 특성을 변화시키지 않을 것이므로 뉴클레오티드의 부가는 또한 최대 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 심지어 100개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최대 200, 300, 400, 또는 500개 뉴클레오티드의 길이를 나타낼 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 이중-가닥 DNA 분자는 2개의 역평형 가닥을 포함하며, 여기에서 하나의 가닥은 그의 서열이 단밸질로 번역되는 전령 RNA 사본의 것과 동일한 경우에 "센스" 가닥이라고 불린다. 대향하는 상보적인 가닥 상의 서열은 "안티센스" 서열이라고 불린다. 따라서, 본 발명의 DNA 분자는 상기 요소 (a) 및 (b)를 가진 하나의 가닥을 포함하는 mRNA에 상응하는 상기 DNA 분자 뿐 아니라, 상보적인 가닥, 즉, mRNA로 전사될 수 있는 안티센스 가닥을 포함하는 DNA 분자에도 관련된다. 본 발명의 DNA 분자의 이러한 상보적인 가닥은 염기 대합 규칙을 고려하여 용이하게 결정할 수 있는 안티센스 가닥을 참조하여 정의한다.
본 발명의 DNA 분자는 또한 모듈 (b) 내에 DNA-의존성 RNA-폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터 R1을 포함한다. 바람직하게, 상기 프로모터 R1은 항목 (b1) 또는 (b2)에 정의된 나머지 서열에 직접, 즉, 임의의 개재되는 뉴클레오티드의 발생 없이 연결된다.
DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터 R1의 성질은 특별히 제한되지 않는다. 상응하는 DNA-의존성 RNA-폴리머라제가 각각의 서열을 인식할 수 있는 한, 임의의 프로모터(및 그의 변이체)를 사용할 수 있다. 다수의 RNA 폴리머라제(DNA-의존성 RNA-폴리머라제라고도 알려져 있으며 종종 RNAP 또는 RNApol이라고 약칭됨)가 당업계에 알려져 있다. 이들 효소는 1차 전사체 RNA를 생성할 수 있다. 상기 개관된 바와 같이, DNA-의존성 RNA-폴리머라제는 전사라고 불리는 과정에서 DNA를 주형으로 사용하여 RNA 사슬을 합성할 수 있다. DNA-의존성 RNA-폴리머라제는 프로모터라고 알려진 특이적 DNA 서열에서 전사를 개시한다. 이어서, 그것은 주형 DNA 가닥에 상보적인 RNA 사슬을 생성한다. RNA 가닥에 뉴클레오티드를 부가하는 과정은 신장이라고 알려져 있다. 그러므로, 본 발명에 관하여, 용어 "인식하는"은 바람직하게 DNA-의존성 RNA-폴리머라제가 그의 상응하는 프로모터 서열 R1을 특이적으로 검출/결합할 수 있음을 의미할 뿐이 아니다. 이 용어는 또한 DNA-의존성 RNA-폴리머라제가 전사를 개시하는 능력, 및 이어서 신장 중에 RNA 분자를 생성하는 능력을 지칭한다.
당업자는 제공된 DNA-의존성 RNA-폴리머라제가 각각의 프로모터를 인식할 수 있는지 여부를 당업계에 알려진 방법에 의해 결정할 수 있다. 또한, 단백질/DNA-상호작용의 평가를 위해 잘 알려진 방법을 사용함으로써, 주어진 DNA-의존성 RNA-폴리머라제의 상응하는 (미지) 프로모터 서열 R1을 식별할 수 있으며, 그 역 또한 성립한다.
따라서, 예를 들어, 문헌[Journal of Biological Chemistry, 1993, 268(26):19299-19304]에 기재된 것과 같이 당업계에 알려진 방법에 의해, DNA-의존성 RNA-폴리머라제가 그의 프로모터 R1을 인식/결합하는 능력 및, 바람직하게, 전사를 개시하는 능력을 결정할 수 있는 한편, 다수의 DNA-의존성 RNA-폴리머라제의 발견이 문헌[Journal of Biological Chemistry, 2005, 280(52):42477-42485]에 검토되어 있다.
바람직한 실시 형태에서, DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터 R1은 박테리오파지 프로모터이다.
단지 예로서, T7 DNA-의존성 RNA 폴리머라제는 서열 TAATACGACTCACTATAGGGAGA(서열 번호 3)를 인식하고, T3 DNA-의존성 RNA 폴리머라제는 서열 AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA(서열 번호 4)를 인식하며, SP6 DNA-의존성 RNA 폴리머라제는 서열 ATTTAGGTGACACTATAGAAG(서열 번호 5)를 인식하고, K11 DNA-의존성 RNA 폴리머라제는 서열 AATTAGGGCACACTATAGGGA(서열 번호 6)를 인식한다는 것이 당업계에 알려져 있다. 그러나, 본 발명은 이들 프로모터 및 상응하는 DNA-의존성 RNA 폴리머라제로 제한되지 않으므로, 이들 예는 단지 예시 목적으로 제공된다. 사실상, 상응하는 DNA-의존성 RNA-폴리머라제, 바람직하게 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제가 각각의 서열을 인식할 수 있는 한, 임의의 프로모터(및 그의 변이체)를 사용할 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, R1은
(i) TAATACGACTCACTATAGGGAGA(서열 번호 3) 또는 서열 번호 3에 비교하여 1 내지 6개의 치환을 나타내고 T7 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 서열;
(ii) AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA(서열 번호 4) 또는 서열 번호 4에 비교하여 1 내지 6개의 치환을 나타내고 T3 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 서열;
(iii) ATTTAGGTGACACTATAGAAG(서열 번호 5) 또는 서열 번호 5에 비교하여 1 내지 6개의 치환을 나타내고 SP6 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 서열; 및
(iv) AATTAGGGCACACTATAGGGA(서열 번호 6) 또는 서열 번호 6에 비교하여 1 내지 6개의 치환을 나타내고 K11 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 서열로 구성된 그룹 중에서 선택된다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 상응하는 서열이 각각 T7, T3, SP6, 및 K11 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 여전히 인식될 수 있는 한, 서열은 1 내지 3, 4, 또는 5개의 치환을 나타내는 서열일 수 있다. 더욱 바람직한 실시 형태에서, 상응하는 서열이 각각 T7, T3, SP6, 및 K11 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 여전히 인식될 수 있는 한, 서열은 1 내지 2개의 치환을 나타내는 서열일 수 있다. 가장 바람직하게, 상응하는 서열이 각각 T7, T3, SP6, 및 K11 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 여전히 인식될 수 있는 한, 서열은 1개의 치환을 나타내는 서열일 수 있다.
다른 실시 형태에서, DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터 서열 R1은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 또는 서열 번호 6의 서열, 또는 이에 비교하여 1 내지 6개의 치환을 나타내는 서열 중 임의의 것으로 특별히 제한되는 것이 아니라, 상응하는 서열이 각각 T7, T3, SP6, 및 K11 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 여전히 인식될 수 있는 한, 1 내지 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 치환을 나타내는 서열일 수도 있다.
바람직한 실시 형태에서, TAATACGACTCACTATAGGGAGA(서열 번호 3), AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA(서열 번호 4), ATTTAGGTGACACTATAGAAG(서열 번호 5), 또는 AATTAGGGCACACTATAGGGA(서열 번호 6)의 서열 내의 상기 치환(들)으로부터, 서열 번호 3 내지 6의 상기 서열 내의 위치 11 내지 12에서 5개 뉴클레오티드 "CACTA"에서의 치환은 배제되는데, 이는 이들 5 뉴클레오티드가 4개 서열 사이에서 보존되기 때문이다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 서열 번호 3 내지 6의 서열 내의 상기 치환(들)으로부터, 서열 번호 3 내지 6의 상기 서열 내의 위치 4에서 뉴클레오티드 "T"에서의 치환은 배제되는데, 이는 이 뉴클레오티드가 4개 서열 사이에서 보존되기 때문이다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 서열 번호 3 내지 6의 서열 내의 상기 치환(들)으로부터, 서열 번호 3 내지 6의 상기 서열 내의 위치 5에서 뉴클레오티드 "A"에서의 치환은 배제되는데, 이는 이 뉴클레오티드가 4개 서열 사이에서 보존되기 때문이다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 서열 번호 3 내지 6의 서열 내의 상기 치환(들)으로부터, 서열 번호 3 내지 6의 상기 서열 내의 위치 18에서 뉴클레오티드 "G"에서의 치환은 배제되는데, 이는 이 뉴클레오티드가 4개 서열 사이에서 보존되기 때문이다.
T7, T3, SP6, 및 K11 DNA-의존성 RNA-폴리머라제가 그의 프로모터 R1을 인식/결합하는 능력은 상기 개관된 바와 같이 당업계에 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다.
더욱 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 DNA 분자는 상기 코딩 서열의 바로 업스트림에 모듈 (b1)을 포함하는 DNA 분자이며, 여기에서 상기 모듈 (b1)에서 서열 번호 2의 위치 2에서 뉴클레오티드 N은 T, G, 또는 C로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드이고, 여기에서 뉴클레오티드 N은 A가 아니다.
더욱 더 바람직한 실시 형태에서, 서열 번호 2의 위치 2에서 상기 뉴클레오티드 N은 T이다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 DNA 분자는 시작 코돈의 바로 다운스트림에 이어지는 뉴클레오티드가 뉴클레오티드 G가 아닌 DNA 분자이다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 DNA 분자는 시작 코돈의 바로 다운스트림에 이어지는 뉴클레오티드가 A, T, 및 C로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 DNA 분자이다.
더욱 더 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 DNA 분자는 상기 정의된 바와 같은 모듈 (b1)을 포함하는 DNA 분자이며, 여기에서 상기 모듈 (b1)은 서열 번호 1의 위치 6에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 1의 위치 7에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 1의 위치 5에서 A가 G에 의해 치환되며, 여기에서 시작 코돈의 바로 다운스트림에 이어지는 뉴클레오티드가 A, T, 및 C로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 서열이다.
더욱 더 바람직한 다른 실시 형태에서, 본 발명의 DNA 분자는 상기 정의된 바와 같은 모듈 (b2)를 포함하는 DNA 분자이며, 여기에서 상기 모듈 (b2)는 서열 번호 2의 위치 7에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 2의 위치 8에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 2의 위치 6에서 A가 G에 의해 치환되며, 여기에서 시작 코돈의 바로 다운스트림에 이어지는 뉴클레오티드가 A, T, 및 C로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 서열이다.
분자 생물학 및 유전학에서, 업스트림 및 다운스트림은 양자 모두 DNA 분자에서의 상대적인 위치를 지칭한다. 본 발명에 관하여, 업스트림은 DNA 분자의 센스 가닥의 5' 단부를 향하고 다운스트림은 분자의 3' 단부를 향한다.
따라서, 본 발명에서 상기 항목 (b)에 정의된 서열은 항목 (a)의 코딩 영역의 바로 업스트림에, 더욱 특이적으로, 코딩 영역의 시작 코돈의 바로 업스트림에 위치한다. 따라서, 이에 관하여 "바로 업스트림"은 항목 (b)에 정의된 바와 같은 서열과 시작 코돈으로 개시되는 코딩 서열 사이에 추가의 뉴클레오티드가 없음을 의미한다. 따라서, 시작 코돈으로 개시되는 코딩 영역은 본 명세서에 상기 항목 (b)에 정의된 바와 같은 서열에 바로 인접한다.
본 발명의 DNA 분자는 당업자에게 알려진 방법에 의해 재조합적으로(예를 들어, 생체내 또는 시험관내 시스템에서) 또는 합성적으로(예를 들어, PCR 반응에 의해, 또는 화학 반응에서) 생성/합성될 수 있다.
본 발명의 DNA 분자는 바람직하게 재조합 핵산 분자이며, 즉, 그것은 이 조합으로 천연적으로 발생하지 않는 요소로 이루어진다. 본 발명의 핵산 분자는 합성 또는 반-합성일 수 있다.
DNA 분자는 모듈 (a) 및 (b)(상기 항목 (a) 및 (b)에 각각 정의됨)의 융합된 DNA 서열, 즉, 상기 모듈을 함유하는 적어도 2개의 뉴클레오티드 서열을 조합함으로써 형성되는 (융합) DNA 분자의 형태로 존재할 수 있다. 전형적으로, 하기 추가로 더 상세히 설명될 바와 같이, RNA 분자로의 전사를 가능하게 하는 발현 벡터 내로 cDNA를 클로닝함으로써 이를 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명의 DNA 분자는 융합된 DNA 서열, 즉, 다른 뉴클레오티드 상의 3' 탄소에 결합된 하나의 뉴클레오티드로부터의 포스페이트 기를 통해 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 연결하여 하나의 모듈의 각각의 단부와 다른 분자의 단부 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성함으로써 형성되는 키메라 분자일 수 있다. 이 방식으로, 상기 적어도 2개의 모듈을 함유하는 DNA 분자가 DNA 분자의 형태로 함께 연결된다. 일단 프레임 내에 클로닝되면, 이러한 재조합 DNA 분자는 이어서 상기 단백질, 폴리펩티드, 또는 효소 분자를 암호화하는 그의 상응하는 RNA 핵산 서열로 전사될 수 있다.
본 발명에 따른 DNA 분자는 표준 분자 생물학 기술에 의해 벡터, 바람직하게 발현 벡터 내에 도입될 수 있다(예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd Ed, 1989] 참조). 본 발명에 관련하여 용어 "벡터", 예컨대 "발현 벡터" 또는 "클로닝 벡터"는, 염색체 DNA에 독립적으로 세포 내에서 복제되며 그것이 복제 및/또는 발현될 수 있는(즉, RNA로 전사되고 아미노산 서열로 번역됨) 세포 내로 유전 재료를 운반하기 위한 비히클로 사용되는 DNA의 환형 이중-가닥 단위로서 이해된다. 외래 DNA를 함유하는 벡터는 재조합 DNA라고 명명된다. 벡터 자체는 일반적으로 인서트(예를 들어, 핵산 분자/본 발명의 DNA 분자) 및 벡터의 "골격"으로서 작용하는 더 큰 서열로 전형적으로 구성된 DNA 서열이다. 본 발명에 관련하여 플라스미드는 박테리아에서 가장 자주 발견되며 재조합 DNA 연구에서 세포들 사이에 유전자를 전달하기 위해 사용되고, 그러므로 본 발명에 관련하여 사용되는 바와 같은 "벡터"의 하위집단이다.
추가의 조절 서열이 본 발명의 DNA 분자에 부가될 수 있음은 당업자에게 자명하다. 예를 들어, 전사 인핸서 및/또는 유도 발현을 가능하게 하는 서열이 채용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 유도성 시스템은, 예를 들어 문헌[Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992), 5547-5551] 및 문헌[Gossen, Trends Biotech. 12(1994), 58-62]에 기재된 바와 같은 테트라사이클린-조절 유전자 발현, 또는 예를 들어 문헌[Crook, EMBO J. 8(1989), 513-519]에 기재된 바와 같은 덱사메타손-유도성 유전자 발현 시스템이다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 벡터, 바람직하게 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지, 또는 예를 들어 유전 공학에 관용적으로 사용되는 다른 벡터일 수 있으며, 적합한 숙주 세포 내에서 적합한 조건 하에 상기 벡터의 선택을 가능하게 하는 마커 유전자와 같은 추가의 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 DNA 분자는 또한 폴리-A 테일의 부가에 의해 전사의 종결 및 전사체의 안정화를 보장하는 폴리-A 신호를 바람직하게 함유한다.
본 발명의 DNA 분자 및 벡터는 세포 내로의 직접 도입을 위해, 또는 리포솜, 바이러스 벡터(예를 들어 아데노바이러스, 레트로바이러스), 전기천공, 고속탄도침투법(ballistic)(예를 들어 유전자 총), 또는 다른 전달 시스템을 통한 도입을 위해 설계될 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 핵산 분자를 위한 진핵생물 발현 시스템으로서 배큘로바이러스 시스템을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 벡터로 형질감염되거나 형질전환된 숙주 또는 본 발명의 벡터를 보유하는 비-인간 숙주, 즉, 본 발명에 따른 DNA 분자 또는 이러한 DNA 분자를 포함하는 벡터로 유전적으로 개질된 숙주 세포 또는 숙주에 관한 것이다. 용어 "유전적으로 개질된"은 숙주 세포 또는 숙주가 그의 천연 유전체에 부가하여 세포 또는 숙주 또는 그의 선조/부모 중 하나 내로 도입된 본 발명에 따른 DNA 분자 또는 벡터를 포함함을 의미한다. DNA 분자 또는 벡터는 유전체 외부의 독립적인 분자로서, 바람직하게 복제가 가능한 분자로서 유전적으로 개질된 숙주 세포 또는 숙주 내에 존재할 수 있거나, 그것이 숙주 세포 또는 숙주의 유전체 내로 안정적으로 통합될 수 있다. 본 발명에 따른 벡터에 의한 숙주 세포의 형질전환은, 예를 들어 문헌[Sambrook and Russell(2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA]; 문헌[Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990]에 기재된 바와 같이 표준 방법에 의해 실행될 수 있다. 숙주 세포는, 특히 pH 값, 온도, 염 농도, 통기, 항생제, 비타민, 미량 원소 등에 관하여, 사용되는 특정 숙주 세포의 요건을 충족하는 영양 배지 중에 배양된다.
본 발명의 숙주 세포는 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 적합한 원핵 세포는 E. 콜라이(E. coli) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같이 클로닝에 일반적으로 사용되는 것들이다. 추가로 진핵 세포는, 예를 들어 진균 세포 또는 동물 세포를 포함한다. 적합한 진균 세포에 대한 예는 효모 세포, 바람직하게 사카로마이세스(Saccharomyces) 속의 것들, 가장 바람직하게 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 종의 것들이다. 적합한 동물 세포는, 예를 들어 곤충 세포, 척추동물 세포, 바람직하게 포유동물 세포, 예를 들어 HEK293, NSO, CHO, COS-7, MDCK, U2-OSHela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, PC-12, PC-3, IMR, NT2N, Sk-n-sh, CaSki, C33A이다. 당업계에 알려진 추가의 적합한 세포주는, 예를 들어 독일 생물자원센터(DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) 또는 미국 세포주은행(ATCC: American Type Culture Collection)과 같은 세포주 보관소로부터 이용가능하다. 본 발명에 따라, 1차 세포/세포 배양물이 숙주 세포로서 기능할 수 있을 것으로 추가로 예상된다. 상기 세포는 특히 곤충(예컨대 드로소필라(Drosophila) 또는 블라타(Blatta) 종의 곤충) 또는 포유동물(예컨대 인간, 돼지, 마우스, 또는 랫트)로부터 유래된다. 상기 숙주 세포는 또한, 신경모세포종 세포주와 같은 세포주로부터의 세포 및/또는 그로부터 유래된 세포를 포함할 수 있다. 상기 언급된 1차 세포는 당업계에 잘 알려져 있으며, 특히 1차 성상세포, (혼합) 척수 배양물(spinal culture), 또는 해마 배양물을 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 DNA 분자, 본 발명의 벡터, 또는 본 발명의 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
제2 태양에서 본 발명은,
(a) 폴리펩티드를 코딩하는, 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역; 및
(b) 상기 코딩 서열의 바로 업스트림에 있는,
(b1) 서열 R2-CGCCACC(서열 번호 1)의 UTR,
또는 상기 UTR 서열에서 서열 번호 1의 위치 6에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 1의 위치 7에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 1의 위치 5에서 A가 G에 의해 치환된 서열; 및
(b2) 서열 번호 2의 위치 2에서 뉴클레오티드 N이 U, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 서열 R2-CNGCCACC(서열 번호 2)의 UTR, 또는 상기 UTR 서열에서 서열 번호 2의 위치 7에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 2의 위치 8에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 2의 위치 6에서 A가 G에 의해 치환된 서열로 구성된 그룹 중에서 선택되며,
여기에서 R2는 DNA-의존성 RNA-폴리머라제가 RNA 합성을 개시하는 뉴클레오티드로 시작되는 프로모터 영역의 부분에 상응하는 RNA 서열인 UTR을 포함하는 RNA 분자에 관한 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 바와 같이, 리보핵산(RNA) 분자는 G, A, U, 및 C로 명명된 뉴클레오티드의 사슬로서 조립되는 중합체성 분자에 관련된다. RNA 내의 각각의 뉴클레오티드는 1' 내지 5'으로 번호화된 탄소를 가진 리보오스 당을 함유한다. 질소성 염기, 일반적으로 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 또는 우라실(U)이 1' 위치에 부착된다. 중합체성 RNA 분자에서 포스페이트 기는 하나의 리보오스의 3' 위치 및 그 다음 것의 5' 위치에 부착된다. 따라서, 중합체성 RNA 분자 내의 뉴클레오티드는 서로에게 공유적으로 연결되며, 여기에서 하나의 뉴클레오티드로부터의 포스페이트 기가 후속하는 뉴클레오티드 상의 3' 탄소에 결합됨으로써 포스포디에스테르 결합을 형성한다. 따라서, RNA 가닥은 5' 단부 및 3' 단부를 가지며, 리보오스 환 상의 탄소에 대해 그렇게 명명된다. 관례에 의해, 업스트림 및 다운스트림은 RNA 전사가 일어나는 5'으로부터 3'으로의 방향에 관련된다. 바람직하게, RNA 분자는 전령 RNA(mRNA) 분자이다. mRNA는 DNA로부터 리보솜으로 유전 정보를 운반하는 큰 패밀리의 RNA 분자이며, 여기에서 그들은 유전자 발현의 단백질 산물의 아미노산 서열을 명시한다. 분자 생물학의 중심 원리에 요약된 바와 같이, RNA 폴리머라제에 의한 1차 전사체 mRNA(프리-mRNA라고 알려짐)의 전사 후에, 가공되고 성숙한 mRNA가 아미노산의 중합체인 단백질로 번역된다. DNA에서와 같이, mRNA 유전 정보는 뉴클레오티드의 서열 내에 있으며, 이는 각각 3개의 염기로 구성된 코돈으로 배열된다. 단백질 합성을 종결하는 종결 코돈을 제외하고, 각각의 코돈은 특이적 아미노산을 암호화한다.
본 발명의 RNA 분자는 상기 항목 (a) 및 (b)에 정의된 바와 같이 2개의 주모듈을 포함한다. 부가적으로, 본 발명의 RNA 분자는 그의 3' 단부에 UTR을 바람직하게 포함한다. 따라서, 본 발명의 RNA 분자는, 그의 구조에 관하여, 코딩 영역과 더불어 (5' 및 3') 비번역 영역(UTR) 및 임의로 폴리-A 테일을 보유하는 천연적으로 나타나는 "정상적" mRNA 분자와 유사하다.
본 발명에 따라 사용되는 바와 같이, 용어 "그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"은, 유전 암호에 의해 제공되는 정보에 따라 리보솜에 의해 해독되고 단백질로 번역되는 코돈으로 이루어진 서열에 관련된다. 코딩 영역은 통상적으로 그들의 5' 단부에서 시작 코돈으로 시작되고 종결 코돈으로 종료된다. 일반적으로, 시작 코돈은 AUG 삼중항이고 종결 코돈은 UAA, UAG, 또는 UGA이다. 단백질-코딩임에 부가하여, 코딩 영역의 일부가 엑손 스플라이싱 인핸서 또는 엑손 스플라이싱 사일런서로서 프리-mRNA 내의 조절 서열로서 작용할 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자의 코딩 영역은 또한 코딩 서열 또는 CDS(코딩 DNA 서열로부터의)라고 알려져 있으며, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 엑손으로 이루어진 유전자의 DNA 또는 RNA의 부분이다. mRNA 내의 코딩 영역에는 5'-비번역 영역(5' UTR) 및 3'-비번역 영역(3' UTR)이 인접하며, 이 또한 엑손의 부분이다. 또한, mRNA 분자는 소위 5' 캡 및 폴리-A 테일을 추가로 포함할 수 있다. 5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 및 폴리-A 테일은 단백질로 번역되지 않는 mRNA 분자의 영역이다.
본 발명에 따라 사용되는 바와 같이, 용어 "비번역 영역" 또는 "UTR"은 시작 코돈의 업스트림 및 종결 코돈의 다운스트림에 있는 mRNA의 번역되지 않는 섹션에 관한 것이므로, 각각 5 프라임 비번역 영역(5' UTR) 및 3 프라임 비번역 영역(3' UTR)이라고 명명된다. 이들 영역은 코딩 영역과 함께 전사되며, 따라서 그들은 성숙한 mRNA에 존재하므로 엑손이다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, 3' 비번역 영역(3'-UTR)은 번역 종결 코돈 직후의 전령 RNA(mRNA)의 섹션에 관한 것이다. 3' UTR은 3'-비번역 영역 내에 조절 영역을 포함할 수 있으며, 이는 mRNA의 폴리아데닐화 및 안정성에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 다수의 3'-UTR이 또한 AU-풍부 요소(ARE)를 함유한다. 추가로, 3'-UTR은mRNA 전사체의 단부에 폴리(A) 테일이라고 불리는 수백개의 아데닌 잔기를 부가하는 것을 지시하는 서열 AAUAAA를 바람직하게 함유할 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, 5' 비번역 영역(5' UTR)(리더 서열 또는 리더 RNA라고도 알려짐)은 시작 코돈의 바로 업스트림에 있는 mRNA의 영역이다. 5′ UTR은 전사 시작 부위에서 시작되고 코딩 영역의 시작 코돈(통상적으로 AUG)으로부터 1개 뉴클레오티드(nt) 전에 종료된다. 진핵생물에서 5' UTR의 길이는 일반적으로 100 내지 수천개 뉴클레오티드의 길이이지만 간혹 더 짧은 UTR도 진핵생물에 발생한다.
최소 UTR 서열을 제공하는 것이 본 발명의 목적이므로, 본 발명에서 5' UTR은 극도로 짧다.
본 발명의 RNA 분자는 또한 폴리-A 테일을 함유할 수 있다. 폴리-A 테일은 폴리아데닐화라고 불리는 과정에 의해 프리-mRNA의 3' 단부에 부가되는 아데닌 뉴클레오티드의 긴 서열(종종 수백개)이다. 이 테일은 핵으로부터의 반출 및 번역을 촉진하며, mRNA를 분해로부터 보호한다. 폴리아데닐화는 전령 RNA에 폴리(A) 테일을 부가하는 것이다. 폴리(A) 테일은 다중의 아데노신 모노포스페이트로 구성되며; 다시 말해서, 그것은 아데닌 염기만 가진 RNA의 연장부이다. 진핵생물에서, 폴리아데닐화는 번역을 위해 성숙한 전령 RNA(mRNA)를 생성하는 과정의 일부이다.
RNA 분자의 하나의 모듈, 즉, "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"(모듈 (a))은 특별히 제한되지 않으며 제공된 세포에서 발현될 임의의 목적하는 코딩 영역일 수 있다. 용어 "폴리펩티드를 코딩하는 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"(모듈 (a))의 바람직한 실시 형태에 관하여, 본 발명의 DNA 분자에 관련하여 상기 기술된 바와 동일한 것이 필요한 부분만 약간 수정하여 본 발명의 RNA 분자에 적용된다.
본 발명의 RNA 분자는 상기 코딩 서열의 바로 업스트림에 있는 모듈 (b)를 포함하며, 여기에서 상기 모듈 (b)는
(b1) 서열 R2-CGCCACC(서열 번호 1)의 UTR,
또는 상기 UTR 서열에서 서열 번호 1의 위치 6에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 1의 위치 7에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 1의 위치 5에서 A가 G에 의해 치환된 서열; 및
(b2) 서열 번호 2의 위치 2에서 뉴클레오티드 N이 U, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 서열 R2-CNGCCACC(서열 번호 2)의 UTR, 또는 상기 UTR 서열에서 서열 번호 2의 위치 7에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 2의 위치 8에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 2의 위치 6에서 A가 G에 의해 치환된 서열로 구성된 그룹 중에서 선택되며,
여기에서 R2는 DNA-의존성 RNA-폴리머라제가 RNA 합성을 개시하는 뉴클레오티드로 시작되는 프로모터 영역의 부분에 상응하는 RNA 서열인 UTR이다.
R2의 성질은 특별히 제한되지 않는다. DNA-의존성 RNA-폴리머라제가 RNA 합성을 개시하는 뉴클레오티드로 시작되는 프로모터 영역의 부분에 상응하는 임의의 RNA 서열을 사용할 수 있다. 당업자는 DNA-의존성 RNA-폴리머라제가 RNA 합성을 개시하는 뉴클레오티드로 시작되는 프로모터 영역의 부분을 용이하게 결정할 수 있다. 이 RNA 서열 R2는 전사되는 프로모터의 부분에 상응하는, 즉, 일단 전사되면 전사체 내에 실제로 존재하는 프로모터의 서열이다.
바람직한 실시 형태에서, 프로모터 R2는 박테리오파지 유래의 DNA-의존성 RNA-폴리머라제가 RNA 합성을 개시하는 뉴클레오티드로 시작되는 프로모터 영역의 부분에 상응하는 RNA 서열이다.
바람직한 실시 형태에서, 프로모터 R2는 T7 DNA-의존성 RNA 폴리머라제, T3 DNA-의존성 RNA 폴리머라제, SP6 DNA-의존성 RNA 폴리머라제, 또는 K11 DNA-의존성 RNA 폴리머라제가 RNA 합성을 개시하는 뉴클레오티드로 시작되는 프로모터 영역의 부분에 상응하는 RNA 서열이다.
이를 예시하기 위해, 비제한적 예로서, R2는 TAATACGACTCACTATAGGGAGA (서열 번호 3; 즉, T7 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터), AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA(서열 번호 4; 즉, T3 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터), ATTTAGGTGACACTATAGAAG (서열 번호 5; 즉, SP6 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터), 및 AATTAGGGCACACTATAGGGA(서열 번호 6; 즉, K11 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터)의 프로모터 서열 내의 밑줄 친 서열이다. 밑줄 친 서열은, DNA-의존성 RNA-폴리머라제가 RNA 합성을 개시하며, 따라서, 일단 전사되면 RNA 분자 내에(즉, 전사체 내에) 실제로 존재하는 각각의 프로모터의 부분에 상응한다.
서열 R2-CGCCACC(서열 번호 1)의 UTR에 비교하여, 또는 서열 R2-CNGCCACC(서열 번호 2)의 UTR에 비교하여 상기 치환 중 임의의 것을 갖는 UTR 서열(들)은 각각 서열 R2-CGCCACC(서열 번호 1)의 UTR을 포함하는 RNA 분자 및 서열 R2-CNGCCACC(서열 번호 2)의 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 유사한, 바람직하게 더 높은 번역 효율을 나타내는 RNA 분자를 유발할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 UTR을 포함하는 제공된 RNA 분자의 번역 효율은 하기에 기재된 바와 같고 당업계에 알려진 방법에 의해 당업자가 결정할 수 있다.
번역 효율은 세포 내에서 폴리펩티드 또는 단백질로의 mRNA 번역의 속도이다. 제공된 mRNA의 번역 효율은 시간 단위당 mRNA당 번역되는 단백질 또는 폴리펩티드의 수로서 측정된다. 번역은 세포 리보솜이 단백질을 생성하는 과정이며 당업자에게 잘 알려져 있다. 약술하면, 번역에서는, DNA로부터의 전사에 의해 생성된 전령 RNA(mRNA)가 리보솜에 의해 해독되어 특이적 아미노산 사슬 또는 폴리펩티드 또는 단백질을 생성한다.
따라서, 상기 치환 중 임의의 것을 가진 개질된 UTR 서열을 보유하는 제공된 RNA 분자의 번역 효율은, 동일하지만 각각 본 명세서에 상기 정의된 바와 같은 R2-CGCCACC(서열 번호 1) 또는 R2-CNGCCACC(서열 번호 2)의 UTR을 보유하는 제공된 RNA의 번역 효율에 비교하여, 바람직하게 동일하거나 더 높다. 따라서, 시간 단위당 RNA당 번역되는, 상기 치환 중 임의의 것을 가진 개질된 UTR 서열을 보유하는 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 암호화되는 단백질 또는 폴리펩티드의 수는, 시간 단위당 RNA당 번역되는, 각각 본 명세서에 상기 정의된 바와 같은 R2-CGCCACC(서열 번호 1) 또는 R2-CNGCCACC(서열 번호 2)의 UTR을 보유하는 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 암호화되는 단백질 또는 폴리펩티드의 수와 적어도 동일하거나, 바람직하게 그보다 더 높다.
본 발명에 관하여 번역 효율은, 바람직하게 소정의 시점에 세포 내의 각각의 단백질을 암호화하는 mRNA의 양에 관련하여, 동일한 시점에 상기 세포 내에서 mRNA가 단백질로 번역되는 속도이다. 따라서, 번역 효율은 소정의 시점에 세포 내에서 단백질로 번역된 mRNA와 각각의 단백질을 암호화하는 mRNA의 양의 몫이다. 양자 모두의 파라미터, 즉, 단백질로 번역된 mRNA와 더불어 각각의 단백질을 암호화하는 mRNA의 양은 당업계에 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 세포 내에서 단백질로 번역된 mRNA의 양은, 예를 들어, 유세포 분석법(FC: flow cytometry)에 의해 결정되는 바에 의해 결정될 수 있는 반면에, 각각의 단백질을 암호화하는 mRNA의 양은, 예를 들어, qPCR에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에서 상기 항목 (b)에 정의된 바와 같은 UTR(들)은 상기 특이적 서열로 특별히 제한되지 않으나, 또한 이러한 서열에 비교하여 (a) 뉴클레오티드(들) 부가(들)를 나타내는 서열을 포함하는 (a) UTR 서열(들)에 관련될 수 있으며, 여기에서 부가적인 뉴클레오티드(들)는 상기 기재된 UTR(들)의 5'-단부에 부가될 수 있다. 부가적인 뉴클레오티드(들)는 최대 0(변화 없음), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 뉴클레오티드, 바람직하게 최대 20개 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함한다. 더욱 바람직하게, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 또는 19개의 뉴클레오티드가 5'-단부에 부가된다. 더욱 더 바람직하게, 최대 30개의 뉴클레오티드가 5'-단부에 부가된다.
뉴클레오티드의 부가는 아마도 각각의 UTR(들)의 상기 기능성 특성을 변화시키지 않을 것이라는 근거에 비추어, 이들 서열이 본 명세서에서 상기 항목 (b)에 정의된 UTR과 유사한 능력(상기-기재된 번역 효율의 관점에서)을 나타내는 한, 뉴클레오티드의 부가는 또한 최대 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 심지어 100개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최대 200, 300, 400, 또는 500개 뉴클레오티드의 길이를 나타낼 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 본 명세서에서 상기 항목 (b1)에 정의된 바와 같은 UTR은 11, 12, 또는 13개 뉴클레오티드의 최대 길이를 나타낸다. 바람직하게, R2가 GGGAGA(서열 번호 7) 또는 GGGAGA(서열 번호 8)인 경우에 본 명세서에서 상기 항목 (b1)에 정의된 바와 같은 UTR은 13개 뉴클레오티드의 최대 길이를 나타낸다.
바람직하게, R2가 GAAG(서열 번호 9) 또는 GGGA(서열 번호 10)인 경우에 본 명세서에서 상기 항목 (b1)에 정의된 바와 같은 UTR은 11개 뉴클레오티드의 최대 길이를 나타낸다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 본 명세서에서 상기 항목 (b2)에 정의된 바와 같은 UTR은 12, 13, 또는 14개 뉴클레오티드의 최대 길이를 나타낸다. 바람직하게, R2가 GGGAGA(서열 번호 7) 또는 GGGAGA(서열 번호 8)인 경우에 본 명세서에서 상기 항목 (b2)에 정의된 바와 같은 UTR은 14개 뉴클레오티드의 최대 길이를 나타낸다.
바람직하게, R2가 GAAG(서열 번호 9) 또는 GGGA(서열 번호 10)인 경우에 본 명세서에서 상기 항목 (b2)에 정의된 바와 같은 UTR은 12개 뉴클레오티드의 최대 길이를 나타낸다.
상기-기재된 UTR(들)을 함유하는 본 발명의 RNA 분자는 당업자에게 알려진 방법에 의해 재조합적으로(예를 들어, 생체내 또는 시험관내 시스템에서) 또는 합성적으로 생성/합성될 수 있다.
RNA의 시험관내 전사는 통상적으로 DNA-의존성 RNA-폴리머라제가 결합하고 RNA 합성을 개시하는 이중-가닥 프로모터 영역을 함유하는 선형 DNA 주형을 필요로 하는 한편, 코딩 영역은 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 선형 DNA 주형이 단일-가닥 코딩 영역을 함유하는 경우, 코딩 영역의 안티센스 가닥(즉, DNA-의존성 폴리머라제에 의해 판독되는 가닥)은 주형의 일부이다. 통상의 DNA-의존성 RNA-폴리머라제는 T7 폴리머라제, T3 폴리머라제, SP6 폴리머라제, 및 K11 폴리머라제이다. 그들의 각각의 프로모터의 전체 서열을 서열 번호 3 내지 6에 나타낸다.
시험관내 전사를 위한 전사 주형은, 예를 들어, RNA 전구체로부터 합성된 cDNA 주형, PCR에 의해 생성된 주형, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 및 플라스미드 작제물을 포함한다. 다중 클로닝 부위 내로 삽입된 뉴클레오티드 서열의 각각의 가닥의 전사를 가능하게 하기 위해, 널리 사용되는 다수의 플라스미드 클로닝 벡터가 다중 클로닝 부위의 양쪽에 위치한 파지 폴리머라제 프로모터를 보유한다. 통상적으로 사용되는 클로닝 벡터는, 예를 들어 Invitrogen의 pCRII, Promega의 pGEM, 및 Stratagene의 pBluescript 벡터를 포함한다. Ambion의 pTRIPLEscript 패밀리의 벡터는 3개의 파지 폴리머라제 프로모터 모두를 직렬로(다중 클로닝 부위의 동일한 측면 상에) 함유하여, 3개의 폴리머라제, SP6, T7, 또는 T3 중 임의의 것을 사용할 수 있게 한다.
본 발명의 RNA 분자는 당업자에게 알려진 방법에 의해 생체내 시스템에서 재조합적으로 생성될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 RNA 분자는, 예를 들어 시험관내 전사 시스템을 사용하여 시험관내 시스템에서 생성될 수 있다. 시험관내 전사 시스템은 통상적으로 알려져 있으며, 통상적으로 RNA 분자를 "암호화"하는 DNA 서열을 함유하는 정제된 선형 DNA 주형을 필요로 하고, 여기에서 상기 DNA 서열은 적당한 프로모터의 제어 하에 있다. 또한, 시험관내 전사 시스템도 통상적으로 리보뉴클레오시드 트리포스페이트, DTT 및 마그네슘 이온을 포함하는 완충제 시스템, 및 상응하는 본 발명의 RNA 분자로의 DNA 서열의 시험관내 전사를 위한 효소 활성을 제공하는 적당한 RNA 폴리머라제를 필요로 한다.
추가로, 예를 들어, 고체상 지지체 및 표준 기술을 사용하는 자동화 뉴클레오티드 서열 합성기 상의 관용적인 화학적 합성에 의해, 또는 각각의 DNA-서열의 화학적 합성 및 그의 후속의 시험관내 또는 생체내 전사에 의해 RNA 분자를 화학적으로 합성할 수 있다.
상기에 따라, 본 발명은 RNA 분자/폴리리보핵산 분자, 바람직하게 개질된 폴리리보핵산 분자를 제공하며, 여기에서 상기 RNA 분자의 하나의 모듈, 즉, "그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역"(모듈 (a))은 폴리펩티드를 암호화한다. 용어 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 호환적으로 사용되며 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 용어 뉴클레오티드는 데옥시뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 용어 리보핵산 및 폴리리보뉴클레오티드는 호환적으로 사용되며, 소정의 실시 형태에서, 50% 초과의 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드인 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 소정의 실시 형태에서, 폴리리보뉴클레오티드는 60%, 70%, 75%, 80%, 90% 초과, 95% 초과, 99% 초과, 또는 100%의 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드인 뉴클레오티드의 중합체를 포함한다. 하나 이상의 뉴클레오티드가 개질된 뉴클레오티드인 폴리리보뉴클레오티드는 개질된 폴리리보뉴클레오티드라고 지칭할 수 있다. 그러나, 용어 폴리리보뉴클레오티드는 개질된 폴리리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드의 서열은, 예를 들어, 관심 유전자의 유전 정보를 포함하는 임의의 적합한 핵산으로부터 유래될 수 있다. 핵산의 예는 관심 유전자(들)를 포함하는 임의의 박테리아 세포 또는 고세균 세포로부터의 유전체 DNA, RNA, 또는 cDNA를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 돌연변이화된 유전자 및 다형성을 지닌 핵산으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 특별히 제한되지 않는 서열을 포함하며, 제공된 세포에서 발현되는 임의의 목적하는 코딩 영역을 모듈 A로서 포함할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 서열은 상기 개관된 바와 같이 목적하는 폴리펩티드/단백질을 코딩하는 코딩 영역일 수 있다. 바람직하게, 상기에 따라, RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 모듈 A의 시작 코돈의 업스트림(5')에 위치하는 비번역 서열, 모듈 A의 종결 코돈의 다운스트림(3')에 위치하는 비번역 서열, 또는 모듈 A의 시작 코돈의 업스트림(5')에 위치하는 비번역 서열 및 모듈 A의 종결 코돈의 다운스트림(3')에 위치하는 비번역 서열 양자 모두를 추가로 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드일 수 있다.
4개의 전형적인 리보뉴클레오티드, 즉, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 및 우리딘에 부가하여, 이들 핵염기 각각의 다수의 유사체가 존재한다. 간혹 문헌에서 전체적으로, 이들 유사체, 또는 이들 유사체 중 하나 이상을 포함하는 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 개질된 것(예를 들어, 개질된 뉴클레오티드 또는 개질된 리보뉴클레오티드)으로 지칭된다. 일부 유사체는 상기 정준 핵염기와는 상이하지만, 천연적으로 존재할 수 있다. 다른 유사체는 비-천연 발생이다. 각각의 유형의 유사체가 고려된다.
소정의 실시 형태에서, 본 발명의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체를 포함한다(예를 들어, 폴리리보뉴클레오티드는 개질된 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다). 예시적인 뉴클레오티드 유사체가 하기 제공된다(예를 들어, U의 유사체; C의 유사체; A의 유사체; G의 유사체). 부가적으로, 소정의 실시 형태에서, 본 개시의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 또는 다른 핵산은 또한 (부가적으로 또는 대안적으로) 포스포디에스테르 골격 또는 핵염기들 사이의 연결부에 개질을 포함할 수 있다. 본 개시의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드의 일부 또는 전부를 형성할 수 있는 예시적인 핵산은 리보핵산(RNA), 데옥시리보핵산(DNA), 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA, 베타-D-리보 입체배치를 나타내는 LNA, 알파-L-리보 입체배치를 나타내는 알파-LNA(LNA의 부분입체이성체), 2'-아미노 기능기화를 나타내는 2'-아미노-LNA, 및 2'-아미노 기능기화를 나타내는 2'-아미노-알파-LNA를 포함함), 또는 그의 혼성체를 포함하나 이로 제한되지 않는다.
소정의 실시 형태에서, 개질은 하나 이상의 뉴클레오시드(들) 또는 핵산/폴리뉴클레오티드 분자의 골격 상에 있을 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 개질은 뉴클레오시드 및 골격 연결부 양자 모두 상에 있을 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 개질은 시험관내에서 폴리뉴클레오티드 내로 조작될 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 개질된 리보뉴클레오티드/뉴클레오티드는 또한 전사 후에 전형적/천연 리보뉴클레오티드/뉴클레오티드의 공유적 개질에 의해 합성될 수 있다.
본 발명의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드일 수 있으며, 소정의 실시 형태에서는, 퓨린의 유사체 및/또는 피리미딘의 유사체를 포함할 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 피리미딘 유사체, 예컨대 우리딘의 유사체 및/또는 시티딘의 유사체를 포함한다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 우리딘의 유사체 및 시티딘의 유사체를 포함한다. 소정의 실시 형태에서, 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 아데노신의 유사체 및/또는 구아노신의 유사체를 포함하지 않는다. 소정의 실시 형태에서, RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 우리딘의 단일 유형의 유사체 및 시티딘의 단일 유형의 유사체(예를 들어, 하나의 유형의 유사체, 단일 분자의 유사체가 아님 - 단일 유사체는 본 명세서에 기재된 몇몇 백분율 중 임의의 것으로 존재할 수 있음)를 포함한다. 다른 실시 형태에서, RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 우리딘 및/또는 시티딘의 하나 초과의 유형의 유사체 및, 임의로, 그리고 존재하는 경우, 아데노신 및/또는 구아노신의 하나 이상의 유사체(또는 어느 하나도 아니거나 양자 모두)를 포함한다.
일부 경우에 개질된 우리딘(예를 들어, 우리딘의 유사체)은 2-티오우리딘, 5'-메틸우리딘, 슈도우리딘, 5-요오도우리딘(I5U), 4-티오우리딘(S4U), 5-브로모우리딘(Br5U), 2'-메틸-2'-데옥시우리딘(U2'm), 2'-아미노-2'-데옥시우리딘(U2'NH2), 2'-아지도-2'-데옥시우리딘(U2'N3), 및 2'-플루오로-2'-데옥시우리딘(U2'F) 중에서 선택된다. 일부 경우에, 개질된 시티딘(예를 들어, 시티딘의 유사체)은 5-메틸시티딘, 3-메틸시티딘, 2-티오-시티딘, 2'-메틸-2'-데옥시시티딘(C2'm), 2'-아미노-2'-데옥시시티딘(C2'NH2), 2'-플루오로-2'-데옥시시티딘(C2'F), 5-요오도시티딘(I5C), 5-브로모시티딘(Br5C), 및 2'-아지도-2'-데옥시시티딘(C2'N3) 중에서 선택된다. 유사체를 지칭할 경우, 전술한 것은 그들의 5' 트리포스페이트 형태인 유사체 또한 지칭함에 유의한다. 소정의 실시 형태에서, 시티딘 유사체는 5-요오도시티딘이고 우리딘 유사체는 5-요오도우리딘이다.
일부 실시 형태에서, RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 비-개질된(또는 개질되지 않은) RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드에 비교하여 적어도 25% 더 안정하다. 일부 경우에, 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 비-개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드에 비교하여 적어도 30% 더 안정하거나, 적어도 35% 더 안정하거나, 적어도 40% 더 안정하거나, 적어도 45% 더 안정하거나, 적어도 50% 더 안정하거나, 적어도 55% 더 안정하거나, 적어도 60% 더 안정하거나, 적어도 65% 더 안정하거나, 적어도 70% 더 안정하거나, 적어도 75% 더 안정하거나, 적어도 80% 더 안정하거나, 적어도 85% 더 안정하거나, 적어도 90% 더 안정하거나, 적어도 95% 더 안정할 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 안정성은 생체내에서 측정된다. 소정의 실시 형태에서, 안정성은 시험관내에서 측정된다. 소정의 실시 형태에서, 안정성은 폴리리보뉴클레오티드의 반감기를 측정함으로써 정량화된다.
본 발명의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 동일한 형태로 개질된 뉴클레오티드 또는 상이한 개질된 뉴클레오티드의 혼합물을 가질 수 있다. 개질된 뉴클레오티드는 전령 RNA에서 천연 발생하거나 천연 발생하지 않는 개질을 가질 수 있다. 다양한 개질된 뉴클레오티드의 혼합물을 사용할 수 있다. 예를 들어 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 내의 하나 이상의 개질된 뉴클레오티드는 천연 개질을 가질 수 있는 반면에, 다른 부분은 mRNA에서 천연적으로 발견되지 않는 개질을 갖는다. 부가적으로, 일부 개질된 뉴클레오티드는 염기 개질을 가질 수 있는 반면에, 다른 개질된 뉴클레오티드는 당 개질을 갖는다. 동일한 방식으로, 모든 개질이 염기 개질이거나, 모든 개질이 당 개질이거나, 그의 임의의 적합한 혼합인 것이 가능하다. 일부 경우에, 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드의 안정성은 개질된 폴리리보뉴클레오티드 내의 개질된 염기의 성질을 변화시킴으로써 선택적으로 최적화할 수 있다.
U의 유사체의 비제한적 예
명칭 염기 개질(5'-위치) 당 개질(2'-위치) mRNA에서 천연적
5-메틸우리딘(m5U) CH3 - 아니오
5-요오도우리딘(I5U) I - 아니오
5-브로모우리딘(Br5U) Br - 아니오
2-티오우리딘(S2U) S(2 위치에) - 아니오
4-티오우리딘(S4U) S(4 위치에) - 아니오
2'-메틸-2'-데옥시우리딘(U2'm) - CH3 예
2'-아미노-2'-데옥시우리딘(U2'NH2) - NH2 아니오
2'-아지도-2'-데옥시우리딘(U2'N3) - N3 아니오
2'-플루오로-2'-데옥시우리딘(U2'F) - F 아니오
C의 유사체의 비제한적 예
명칭 염기 개질(5'-위치) 당 개질(2'-위치) mRNA에서 천연적
5-메틸시티딘(m5C) CH3 - 예
5-요오도시티딘(I5C) I - 아니오
5-브로모시티딘(Br5C) Br - 아니오
2-티오시티딘(S2C) S(2 위치에서) - 아니오
2'-메틸-2'-데옥시시티딘(C2'm) - CH3 예
2'-아미노-2'-데옥시시티딘(C2'NH2) - NH2 아니오
2'-아지도-2'-데옥시시티딘(C2'N3) - N3 아니오
2'-플루오로-2'-데옥시시티딘(C2'F) - F 아니오
A의 유사체의 비제한적 예
명칭 염기 개질(5'-위치) 당 개질(2'-위치) mRNA에서 천연적
N6-메틸아데노신(m6A) CH3(6 위치에서) - 예
N1-메틸아데노신(m1A) CH3(1 위치에서) - 아니오
2'-0-메틸아데노신(A2'm) - CH3 예
2'-아미노-2'-데옥시아데노신(A2'NH2) - NH2 아니오
2'-아지도-2'-데옥시아데노신(A2'N3) - N3 아니오
2'-플루오로-2'-데옥시아데노신(A2'F) - F 아니오
G의 유사체의 비제한적 예
명칭 염기 개질(5'-위치) 당 개질(2'-위치) mRNA에서 천연적
N1-메틸구아노신(m1G) CH3(위치 1에서) 아니오
2'-0-메틸구아노신(G2'm) - CH3 예
2'-아미노-3'-데옥시구아노신(G2'NH2) - NH2 아니오
2'-아지도-2'-데옥시구아노신(G2'N3) - N3 아니오
2'-플루오로-2'-데옥시구아노신(G2'F) - F 아니오
소정의 실시 형태에서, 유사체(예를 들어, 개질된 뉴클레오티드)는 피리딘-4-온 리보뉴클레오시드, 5-요오도우리딘, 5-요오도시티딘, 5-아자-우리딘, 2'-아미노-2'-데옥시시티딘, 2'-플루오르-2'-데옥시시티딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시우리딘, 3-메틸우리딘, 5-카복시메틸-우리딘, 1-카복시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-l-메틸-슈도우리딘, 2-티오-l-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-l-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-l-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 5-아자-시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포르밀시티딘, 5-메틸시티딘, N4-메틸시티딘, 5-하이드록시메틸시티딘, 1-메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-l-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-l-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 1-메틸-l-데아자-슈도이소시티딘, 제불라린, 5-아자-제불라린, 5-메틸-제불라린, 5-아자-2-티오-제불라린, 2-티오-제불라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘, 4-메톡시-l-메틸-슈도이소시티딘, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린, 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6-(시스-하이드록시이소펜테닐)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시이소펜테닐) 아데노신, N6-글리시닐카바모일아데노신, N6-트레오닐카바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카바모일아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 2-메톡시-아데닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 와이오신, 와이부토신, 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, 및 N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신을 포함하는 그룹 중에서 선택될 수 있다.
소정의 실시 형태에서, 본 발명의 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 슈도우리딘을 포함하지 않는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 5-메틸 시티딘을 포함하지 않는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 5-메틸 우리딘을 포함하지 않는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 U의 유사체 및 C의 유사체를 포함하며, 여기에서 이러한 U의 유사체는 모두 동일한 유사체일 수 있거나 상이한 유사체(예를 들어, 하나 초과의 유형의 유사체)일 수 있고, 여기에서 이러한 C의 유사체는 모두 동일한 유사체일 수 있거나 상이한 유사체(예를 들어, 하나 초과의 유형의 유사체)일 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 아데노신의 유사체 및 구아노신의 유사체를 포함하지 않는다.
본 명세서에 상세히 기재된 바와 같이, RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드가 개질된 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 경우, 유사체는 화합물 내의 뉴클레오티드의 소정의 비율로 존재할 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 제공된 핵염기의 제공된 백분율이 유사체일 수 있음).
적어도 하나의 개질된 뉴클레오티드를 포함하는 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드이다. 소정의 실시 형태에서, 적어도 약 5%의 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 개질되거나 비-천연 발생(예를 들어, 유사체이거나 개질됨) 아데노신, 시티딘, 구아노신, 또는 우리딘, 예컨대 본 명세서에 기재된 유사체 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%의 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 개질되거나 비-천연 발생(예를 들어, 유사체이거나 개질됨) 아데노신, 시티딘, 구아노신, 또는 우리딘을 포함한다. 일부 경우에, 최대 약 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%의 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 개질되거나 비-천연 발생 아데노신, 시티딘, 구아노신, 또는 우리딘을 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 RNA 분자는 개질된 뉴클레오티드와 개질되지 않은 뉴클레오티드의 조합을 함유한다. 바람직하게, 본 발명의 RNA 분자는 제WO　2011/012316호에 기재된 바와 같이 개질된 뉴클레오티드와 개질되지 않은 뉴클레오티드의 조합을 함유한다. 이러한 RNA 분자 또한 알려져 있으며, "SNIM®-RNA"로서 상업화되어 있다. 제WO　2011/012316호에 기재된 RNA 분자는 증가된 안정성 및 경감된 면역원성을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 바람직한 실시 형태에서는, 이러한 개질된 RNA 분자에서 5 내지 50%의 시티딘 뉴클레오티드 및 5 내지 50%의 우리딘 뉴클레오티드가 개질된다. 아데노신- 및 구아노신-함유 뉴클레오티드는 개질되지 않을 수 있다. 아데노신 및 구아노신 뉴클레오티드는 개질되지 않거나 부분적으로 개질될 수 있으며, 그들은 바람직하게 개질되지 않은 형태로 존재한다. 바람직하게 10 내지 35%의 시티딘 및 우리딘 뉴클레오티드가 개질되며, 특히 바람직하게 개질된 시티딘 뉴클레오티드의 함량은 7.5 내지 25%의 범위 내에 있고 개질된 우리딘 뉴클레오티드의 함량은 7.5 내지 25%의 범위 내에 있다. 사실상 상대적으로 낮은 함량, 예를 들어 각각 단지 10%의 개질된 시티딘 및 우리딘 뉴클레오티드가 목적하는 특성을 달성할 수 있다는 것이 발견되었다. 개질된 시티딘 뉴클레오티드는 5-메틸시티딘 잔기이고 개질된 우리딘 뉴클레오티드는 2-티오우리딘 잔기인 것이 특히 바람직하다. 가장 바람직하게, 개질된 시티딘 뉴클레오티드의 함량 및 개질된 우리딘 뉴클레오티드의 함량은 각각 25%이다.
소정의 다른 실시 형태에서는, 이러한 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 분자에서, 5 내지 50%의 시티딘이 C의 유사체이고 5 내지 50%의 우리딘이 U의 유사체이다. 소정의 실시 형태에서는, 이러한 개질된 폴리리보뉴클레오티드 분자에서 5 내지 40%의 시티딘이 C의 유사체이고 5 내지 40%의 우리딘이 U의 유사체이다. 소정의 실시 형태에서는, 이러한 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 분자에서 5 내지 30%의 시티딘이 C의 유사체이고 5 내지 30%의 우리딘이 U의 유사체이다. 소정의 실시 형태에서는, 이러한 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 분자에서 10 내지 30%의 시티딘이 C의 유사체이고 10 내지 30%의 우리딘이 U의 유사체이다. 소정의 실시 형태에서는, 이러한 개질된 폴리리보뉴클레오티드 분자에서 5 내지 20%의 시티딘이 C의 유사체이고 5 내지 20%의 우리딘이 U의 유사체이다. 소정의 실시 형태에서는, 이러한 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 분자에서 5 내지 10%의 시티딘 뉴클레오티드 및 5 내지 10%의 우리딘 뉴클레오티드가 개질된다. 소정의 실시 형태에서는, 이러한 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 분자에서 25%의 시티딘 뉴클레오티드 및 25%의 우리딘 뉴클레오티드가 개질된다. 소정의 실시 형태에서, 아데노신- 및 구아노신-함유 뉴클레오티드는 개질되지 않을 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 아데노신 및 구아노신 뉴클레오티드는 개질되지 않거나 부분적으로 개질될 수 있으며, 그들은 바람직하게 개질되지 않은 형태로 존재한다.
상기 언급된 바와 같이, 소정의 실시 형태에서, U의 유사체는 U의 단일 유형의 유사체를 지칭한다. 소정의 실시 형태에서, U의 유사체는 U의 2개 이상의 유형의 유사체를 지칭한다. 소정의 실시 형태에서, C의 유사체는 C의 단일 유형의 유사체를 지칭한다. 소정의 실시 형태에서, C의 유사체는 C의 2개 이상의 유형의 유사체를 지칭한다.
소정의 실시 형태에서, 시티딘의 유사체인 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 내의 시티딘의 백분율은 우리딘의 유사체인 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 내의 우리딘의 백분율과 동일하지 않다. 소정의 실시 형태에서, 시티딘의 유사체의 백분율은 우리딘의 유사체의 백분율보다 더 낮다. 상기 언급된 바와 같이, 이는 아데노신 및 구아노신의 유사체의 존재 또는 부재 하에서일 수 있으나, 소정의 실시 형태에서는, 아데노신의 유사체 및 구아노신의 유사체의 부재 하에서이다. 소정의 실시 형태에서, 본 개시의 폴리리보뉴클레오티드는 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 2% 미만의 아데노신의 유사체, 구아노신의 유사체, 또는 양자 모두를 포함한다.
소정의 실시 형태에서, 본 발명의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 시티딘의 유사체 및 우리딘의 유사체를 포함하며, 5 내지 20%의 시티딘은 시티딘의 유사체이고 25 내지 45%의 우리딘은 우리딘의 유사체이다. 다시 말해서, RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 개질된 시티딘 및 개질되지 않은 시티딘 및 개질된 우리딘 및 개질되지 않은 우리딘을 포함하며, 5 내지 20%의 시티딘은 시티딘의 유사체를 포함하는 반면에 25 내지 45%의 우리딘은 우리딘의 유사체를 포함한다. 다른 실시 형태에서, RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드는 5 내지 10%의 시티딘의 유사체 및 30 내지 40%의 우리딘의 유사체, 예컨대 7-9%의 시티딘의 유사체, 예컨대 약 7, 7.5 또는 8% 및, 예컨대 32-38%의 우리딘의 유사체, 예컨대 약 33, 34, 35, 36%를 포함한다.
소정의 실시 형태에서는, 임의로 슈도우리딘을 배제하고, 본 명세서에 기재된 우리딘의 유사체 및 시티딘의 유사체 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 시티딘의 유사체는 5-요오도시티딘을 포함하거나 이로 구성되고(예를 들어, 구성되는 경우, 그것은 사용되는 단일 유사체 유형임) 우리딘의 유사체는 5-요오도우리딘을 포함하거나 이로 구성된다(예를 들어, 구성되는 경우, 그것은 사용되는 단일 유사체 유형임).
전술한 것 중 임의의 것의 소정의 실시 형태에서, 제공된 뉴클레오티드의 유사체의 백분율은 투입 백분율(예를 들어, 시험관내 전사 반응의 시작과 같은 반으의 시작에서의 유사체의 백분율)을 지칭한다. 전술한 것 중 임의의 것의 소정의 실시 형태에서, 제공된 뉴클레오티드의 유사체의 백분율은 산출(예를 들어, 합성되거나 전사된 화합물에서의 백분율)을 지칭한다.
본 발명의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 분자는 하기에 추가로 더 상세히 기재되는 당업자에게 알려진 방법에 의해 생체내 시스템에서 재조합적으로 생성될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 개질된 폴리리보뉴클레오티드 분자는, 예를 들어 하기에 추가로 더 상세히 기재되는 시험관내 전사 시스템을 사용하는 시험관내 시스템에서 생성될 수 있다. 본 발명의 목적하는 특성을 가진 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드를 생성하기 위해, RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드를 생성할 수 있는 시험관내 전사 시스템은 개질된 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 개질되지 않은 뉴클레오시드 트리포스페이트의 투입 혼합물을 필요로 한다. 소정의 실시 형태에서는, 이러한 투입 혼합물 내에서 5 내지 50%의 시티딘이 시티딘의 유사체이고 이러한 투입 혼합물 내에서 5 내지 50%의 우리딘이 우리딘의 유사체이다. 소정의 실시 형태에서는, 이러한 투입 혼합물 내에서 5 내지 40%의 시티딘이 시티딘의 유사체이고 이러한 투입 혼합물 내에서 5 내지 40%의 우리딘이 우리딘의 유사체이다. 소정의 실시 형태에서는, 이러한 혼합물 내에서 5 내지 30%의 시티딘이 시티딘의 유사체이고 이러한 투입 혼합물 내에서 5 내지 30%의 우리딘이 우리딘의 유사체이다. 소정의 실시 형태에서는, 이러한 혼합물 내에서 5 내지 30%의 시티딘이 시티딘의 유사체이고 이러한 혼합물 내에서 10 내지 30%의 우리딘이 우리딘의 유사체이다. 소정의 실시 형태에서는, 이러한 투입 혼합물 내에서 5 내지 20%의 시티딘이 시티딘의 유사체이고 이러한 투입 혼합물 내에서 5 내지 20%의 우리딘이 우리딘의 유사체이다. 소정의 실시 형태에서는, 이러한 투입 혼합물 내에서 5 내지 10%의 시티딘이 시티딘의 유사체이고 이러한 투입 혼합물 내에서 5 내지 10%의 우리딘이 우리딘의 유사체이다. 소정의 실시 형태에서는, 이러한 투입 혼합물 내에서 25%의 시티딘이 시티딘의 유사체이고 이러한 투입 혼합물 내에서 25%의 우리딘이 우리딘의 유사체이다. 소정의 실시 형태에서, 투입 혼합물은 아데노신 및/또는 구아노신의 유사체를 포함하지 않는다. 다른 실시 형태에서, 임의로, 투입 혼합물은 아데노신 및/또는 구아노신의 하나 이상의 유사체(또는 어느 하나도 아니거나 양자 모두)를 포함한다.
소정의 실시 형태에서, 시티딘의 유사체인 투입 혼합물 내의 시티딘의 백분율은 우리딘의 유사체인 투입 혼합물 내의 우리딘의 백분율과 동일하지 않다. 소정의 실시 형태에서, 투입 혼합물 내의 시티딘의 유사체의 백분율은 투입 혼합물 내의 우리딘의 유사체의 백분율보다 더 낮다. 상기 언급된 바와 같이, 이는 투입 혼합물 내의 아데노신 및 구아노신의 유사체의 존재 또는 부재 하에서일 수 있으나, 소정의 실시 형태에서는, 투입 혼합물 내의 아데노신의 유사체 및 구아노신의 유사체의 부재 하에서이다.
소정의 실시 형태에서, 본 발명의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드를 생성하는 시험관내 전사 시스템을 위한 뉴클레오티드의 투입 혼합물은 시티딘의 유사체 및 우리딘의 유사체를 포함하며, 투입 혼합물의 5 내지 20%의 시티딘은 시티딘의 유사체이고 투입 혼합물의 25 내지 45%의 우리딘은 우리딘의 유사체이다. 다시 말해서, 투입 혼합물은 개질된 시티딘 및 개질되지 않은 시티딘 및 개질된 우리딘 및 개질되지 않은 우리딘을 포함하며, 투입 혼합물의 5 내지 20%의 시티딘은 시티딘의 유사체를 포함하는 반면에 투입 혼합물의 25 내지 45%의 우리딘은 우리딘의 유사체를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 투입 혼합물은 5 내지 10%의 시티딘의 유사체 및 30 내지 40%의 우리딘의 유사체, 예컨대 7-9%의 시티딘의 유사체, 예컨대 7, 7.5, 또는 8% 및, 예컨대 32-38%의 우리딘의 유사체, 예컨대 33, 34, 35, 36%를 포함한다.
소정의 실시 형태에서는, 임의로 슈도우리딘을 배제하고, 본 명세서에 기재된 우리딘의 유사체 및 시티딘의 유사체 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 시티딘의 유사체는 5-요오도시티딘을 포함하거나 이로 구성되고(예를 들어, 그것은 사용되는 단일 C 유사체 유형임) 우리딘의 유사체는 5-요오도우리딘을 포함하거나 이로 구성된다(예를 들어, 그것은 사용되는 단일 U 유사체 유형임).
예시적인 유사체가 상기 표에 기재되어 있다. 목적하는 폴리펩티드를 암호화하는 개질된 폴리리보뉴클레오티드(모듈 (a))에 대해, 달리 지시되지 않는 한, 5' 및 3' 비번역 영역을 포함하는, 목적하는 폴리펩티드를 암호화하는 전체 폴리리보뉴클레오티드(모듈 (a))에 걸쳐 유사체 및 개질의 수준이 고려됨을 이해해야 한다 (예를 들어, 개질의 수준은 전사되는 위치에 유사체가 혼입될 수 있도록 하는 시험관내 전사 반응에서의 유사체의 투입비를 기반으로 함).
추가로, 예를 들어, 고체상 지지체 및 표준 기술을 사용하는 자동화 뉴클레오티드 서열 합성기 상의 관용적인 화학적 합성에 의해, 또는 각각의 DNA 서열의 화학적 합성 및 그의 후속의 시험관내 또는 생체내 전사에 의해 개질된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 분자를 화학적으로 합성할 수 있다.
분자 생물학 및 유전학에서, 업스트림 및 다운스트림은 양자 모두 RNA 분자에서의 상대적인 위치를 지칭한다. 본 발명에 관하여, 업스트림은 RNA 분자의 5' 단부를 향하고 다운스트림은 분자의 3' 단부를 향한다.
따라서, 본 발명에서 상기 항목 (b)에 정의된 UTR은 항목 (a)의 코딩 영역의 바로 업스트림에, 더욱 특이적으로, 코딩 영역의 시작 코돈의 바로 업스트림에 위치한다. 따라서, 이에 관하여 "바로 업스트림"은 항목 (b)에 정의된 UTR과 시작 코돈으로 개시되는 코딩 서열 사이에 추가의 뉴클레오티드가 없음을 의미한다. 따라서, 시작 코돈으로 개시되는 코딩 영역은 상기 UTR 서열에 바로 인접한다.
RNA 분자는 모듈 (a) 및 (b)(각각 상기 항목 (a) 및 (b)에 정의됨)의 융합된 RNA 서열, 즉, 상기 모듈을 암호화하는 적어도 2개의 뉴클레오티드 서열을 조합함으로써 제조되는 혼성체 유전자의 발현에 의해 형성되는 (융합) RNA 분자의 형태로 존재할 수 있다. 전형적으로, 하기에 추가로 더 상세히 설명될 바와 같이, 이는 RNA 분자 내로의 전사를 가능하게 하는 발현 벡터 내로 cDNA를 클로닝함으로써 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명의 RNA 분자를 암호화하는 DNA 분자는 융합된 DNA 서열, 즉, 다른 뉴클레오티드 상의 3' 탄소에 결합된 하나의 뉴클레오티드로부터의 포스페이트 기를 통해 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 연결하여 하나의 모듈의 각각의 단부와 다른 분자의 단부 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성함으로써 형성되는 키메라 분자일 수 있다. 이 방식으로, 상기 적어도 2개의 모듈을 암호화하는 상기 DNA 분자를 DNA 분자의 형태로 함께 연결한다. 이어서, 이러한 재조합 DNA 분자가 그의 상응하는 RNA 핵산 서열로 전사된다.
바람직한 일 실시 형태에서, R2는
(i) GGGAGA(서열 번호 7);
(ii) GGGAGA(서열 번호 8);
(iii) GAAG(서열 번호 9); 및
(iv) GGGA(서열 번호 10)로 구성된 그룹 중에서 선택된다.
바람직한 실시 형태에서, 서열 R2-CNGCCACC(서열 번호 2)를 포함하는 RNA 분자는, 서열 번호 2의 위치 2에서 뉴클레오티드 N이 U, G, 또는 C로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드이고, 여기에서 뉴클레오티드 N은 A가 아닌 RNA 분자이다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 서열 번호 2의 위치 2에서 상기 뉴클레오티드 N은 U이다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 RNA 분자는, 시작 코돈의 바로 다운스트림에 이어지는 뉴클레오티드가 뉴클레오티드 G가 아닌 RNA 분자이다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 RNA 분자는, 시작 코돈의 바로 다운스트림에 이어지는 뉴클레오티드가 A, U, 및 C로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 RNA 분자이다.
더욱 더 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 RNA 분자는 상기 정의된 바와 같은 모듈 (b1)을 포함하는 RNA 분자이며, 여기에서 상기 모듈 (b1)은 서열 번호 1의 위치 6에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 1의 위치 7에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 1의 위치 5에서 A가 G에 의해 치환되고, 여기에서 시작 코돈의 바로 다운스트림에 이어지는 뉴클레오티드는 A, U, 및 C로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 서열이다.
더욱 더 바람직한 다른 실시 형태에서, 본 발명의 RNA 분자는 상기 정의된 바와 같은 모듈 (b2)를 포함하는 RNA 분자이며, 여기에서 상기 모듈 (b2)는 서열 번호 2의 위치 7에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 2의 위치 8에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 2의 위치 6에서 A가 G에 의해 치환되고, 여기에서 시작 코돈의 바로 다운스트림에 이어지는 뉴클레오티드는 A, U, 및 C로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 서열이다.
상기 언급된 바와 같이, 코작 공통 서열 (gcc)gccRccAUGG는, 특히 이 위치가 퓨린(즉, 아데닌 또는 구아닌)인 한 "R"로 나타내는 위치 -3(즉, 시작 코돈 AUG로부터 3개 뉴클레오티드 업스트림)의 뉴클레오티드에 대한 변이체일 수 있다. 상기 기재된 UTR에서, 이 위치에 상응하는 뉴클레오티드는 "A"인 것으로 정의된다. 그러나, 본 발명은 또한, 이 위치에 "G"를 가진 상응하는 UTR을 포함하는 RNA 분자에 관한 것이다.
따라서, 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 RNA 분자는 상기 항목 (b1)에 정의된 바와 같은 UTR을 함유하며, 여기에서 (b1)의 상기 UTR 서열에서, 서열 번호 1의 위치 5에서 A가 G에 의해 치환되거나; 여기에서 (b2)의 상기 UTR 서열에서 서열 번호 2의 위치 6에서 A가 G에 의해 치환된다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 RNA 분자는 또한 폴리-A 테일을 보유할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 폴리-A 테일은 RNA의 3' 단부에 위치하는 아데닌 뉴클레오티드의 서열에 관련된다. 폴리-A 테일은 통상적으로 폴리아데닐화라고 불리는 과정에 의해 RNA의 3' 단부에 부가된다. 따라서, 본 발명은 상기-기재된 RNA 중 임의의 것에 관한 것이며, 여기에서 RNA 분자는 3' 단부에 폴리-A 테일을 포함한다.
폴리-A 테일의 길이는 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 RNA 분자는 3' 단부에 폴리-A 테일을 포함하며, 여기에서 폴리-A 테일의 길이는 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 110개 뉴클레오티드이다. 더욱 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 RNA 분자는 3' 단부에 폴리-A 테일을 포함하며, 여기에서 폴리-A 테일의 길이는 적어도 120개 뉴클레오티드이다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 RNA 분자는 3' 단부에 폴리-A 테일을 포함하며, 여기에서 폴리-A 테일의 길이는 적어도 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개 뉴클레오티드이다.
하기에 추가로 본 명세서에 기재된 바와 같이 시험관내 전사 방법에 의해 본 발명의 RNA 분자가 생성되는 경우, 폴리-A 테일은 RNA 분자의 3' 단부에서 UTR에 인접한 RNA의 3' 단부에 위치하는 반면에, 시험관내 전사된 RNA 분자가 상기 폴리-A 테일을 함유함을 보장하기 위해 본 발명의 RNA 분자를 보유하는 플라스미드는 시험관내 전사 전에 폴리-A 테일의 다운스트림에서 선형화된다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 RNA 분자는 모듈 (a) 및 (b)의 융합된 RNA 서열, 즉, 상기 모듈을 암호화하는 적어도 2개의 뉴클레오티드 서열을 조합함으로써 제조된 혼성체 유전자의 전사에 의해 형성되는 (융합) RNA 분자의 형태로 존재할 수 있다. 전형적으로 이는, 전체 RNA 분자의 전사를 가능하게 하는 발현 벡터 내로 cDNA를 클로닝함으로써 수행된다. 본 발명의 RNA 분자를 "암호화하는" 합성 이중-가닥 핵산 분자를 생성하기 위한 핵산 합성, 혼성화, 및/또는 증폭을 포함하는, 융합 작제물의 제조를 위한 다양한 방법이 알려져 있다. 이러한 이중-가닥 핵산 분자(즉, DNA 분자)는 하나의 가닥 상에(즉, 코딩 또는 센스 가닥 상에) 본 발명의 RNA 분자에 상응하는 DNA 서열을 보유하며, 따라서 본 발명의 RNA 분자를 "암호화"한다. 다시 말해서, 이러한 이중-가닥 핵산/DNA 분자는 본 명세서에 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 전사된 RNA 분자에 상응하는 유전 정보를 가닥 상에 포함한다. 본 발명에 관하여 용어 "코딩하는" 또는 "암호화하는"은 그의 관용적인 의미, 즉, 단백질을 코딩하는 유전자의 DNA(및, 따라서, 폴리펩티드 또는 단백질 아미노산 서열로 번역될 수 있는 유전 정보)에 관련해서만 사용되는 것이 아니다. 그보다는, 본 발명의 관점에서, 모듈 (a) 및 (b)를 암호화하는 개별적인 DNA 서열이 단일(키메라) DNA 분자로 "융합"되거나 연결된 작제물에서, 작제물은 또한 단백질로 번역되지 않는 구성요소(즉, 모듈 (b))를 포함한다. 그렇지만, 모듈 (b)에 상응하는 DNA 서열은 정보, 즉, 5' UTR의 구조에 대한 "코드"를 제공하며, 따라서, 본 발명에서 용어 "암호화하는"은 또한, 예를 들어 이중-가닥 핵산 분자 내에 존재하는 경우에 발현될 수 있는, 즉, 전사될 수 있는 UTR에 대한 유전 정보에 관련된다. 따라서, 본 발명에 관하여 용어 "암호화하는"은, 통상적으로 그것이 단백질의 코딩/발현에 관련해서만 사용되지만, 어떤 의미에서는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 부분(즉, 모듈 (a)) 및 UTR을 암호화하는 부분(즉, 모듈 (b))을 보유하는 상응하는 RNA 분자로 핵산 분자가 전사될 수 있다는 것으로 이해되어야 하며, 여기에서 UTR은 단백질 또는 폴리펩티드로 번역되지 않으므로 후자는 발현될 경우에 최종 산물을 나타낸다. 이러한 이중-가닥 핵산은 표준 분자 생물학 기술(예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd Ed, 1989] 참조)에 의해 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 본 발명에 관련하여 용어 "벡터", 예컨대 "발현 벡터" 또는 "클로닝 벡터"는, 염색체 DNA에 독립적으로 세포 내에서 복제되며 그것이 복제 및/또는 발현될 수 있는(즉, RNA로 전사되고 아미노산 서열로 번역됨) 세포 내로 유전 재료를 운반하기 위한 비히클로 사용되는 DNA의 환형 이중-가닥 단위로서 이해된다. 외래 DNA를 함유하는 벡터는 재조합 DNA라고 명명된다. 벡터 자체는 일반적으로 인서트(즉, 단백질로 번역되지 않는 모듈 (b) 및 코딩 영역 모듈 (a)) 및 벡터의 "골격"으로서 작용하는 더 큰 서열로 전형적으로 구성된 DNA 서열이다. 본 발명에 관련하여 플라스미드는 박테리아에서 가장 자주 발견되며 재조합 DNA 연구에서 세포들 사이에 유전자를 전달하기 위해 사용되고, 그러므로 본 발명에 관련하여 사용되는 바와 같은 "벡터"의 하위집단이다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 RNA 분자를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다.
핵산은, 예를 들어, 본 발명의 RNA 분자의 2개의 주모듈(즉, 모듈 (a) 및 모듈 (b))을 암호화하는 DNA이다. 본 발명의 상기 핵산 분자는 바람직하게 재조합 핵산 분자이다. 본 발명의 핵산 분자는 합성 또는 반-합성일 수 있다.
RNA 분자를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자에 추가의 조절 서열이 부가될 수 있음은 당업자에게 자명하다. 예를 들어, 전사 인핸서 및/또는 유도 발현을 가능하게 하는 서열이 채용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 유도성 시스템은, 예를 들어 문헌[Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992), 5547-5551] 및 문헌[Gossen, Trends Biotech. 12(1994), 58-62]에 기재된 바와 같은 테트라사이클린-조절 유전자 발현, 또는 예를 들어 문헌[Crook, EMBO J. 8(1989), 513-519]에 기재된 바와 같은 덱사메타손-유도성 유전자 발현 시스템이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터, 바람직하게 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 RNA 분자를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관하여, 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 벡터에 관련하여 상기 기술된 바와 동일한 것이 필요한 부분만 약간 수정하여 적용된다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 벡터로 형질감염되거나 형질전환된 숙주 또는 본 발명의 벡터를 보유하는 비-인간 숙주, 즉, 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터로 유전적으로 개질된 숙주 세포 또는 숙주에 관한 것이다.
본 발명의 RNA 분자를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관하여, 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관련하여 상기 기술된 바와 동일한 것이 필요한 부분만 약간 수정하여 적용된다.
본 발명은 또한, 본 발명의 개별적인 모듈 또는 본 발명의 전체 RNA 분자를 암호화하는 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포를 배양 배지 중에 배양하는 단계, 및 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 RNA 분자를 회수하는 단계에 의한, 본 발명의 RNA 분자를 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명의 숙주 세포의 배양 및 임의로 배양물로부터 RNA 분자를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 RNA 분자를 생성하는 방법에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 RNA 분자의 회수 방법 및/또는 후속의 정제 방법은 당업자에게 알려져 있다.
본 발명은 또한, 당업자에게 알려진 방법에 의해 본 발명의 RNA 분자를 시험관내 반응에서 생성하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특이적으로, 본 발명의 RNA 분자는 시험관내 전사 시스템을 사용하여 시험관내에서 생성될 수 있다. 시험관내 전사 시스템은 통상적으로 알려져 있으며, 통상적으로 상기 개관된 바와 같이 모듈 (b) 및 모듈 (a)를 "암호화하는" DNA 서열을 함유하는 정제된 선형 DNA 주형을 필요로 하고, 여기에서 상기 DNA 서열은 적당한 프로모터의 제어 하에 있다. 또한, 시험관내 전사 시스템도 통상적으로 리보뉴클레오티드 트리포스페이트, DTT 및 마그네슘 이온을 포함하는 완충제 시스템, 및 본 발명의 RNA 분자로의 DNA 서열의 시험관내 전사를 위한 효소 활성을 제공하는 적당한 RNA 폴리머라제를 필요로 한다.
시험관내 전사를 사용하여 RNA 분자를 생성하기 위해 통상적으로 사용되는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Methods Mol. Biol. 703(2011):29-41]에 기재되어 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 RNA 분자가 본 명세서에 하기 추가로 기재된 바와 같은 시험관내 전사 방법에 의해 생성되는 경우, 상기 폴리-A 테일은 본 발명의 RNA 분자의 일부일 수 있으며 (반드시 클로닝 벡터 상에 원래 위치하는 것은 아니고) RNA의 3' 단부에, 예를 들어 RNA 분자의 3' 단부에서 UTR에 인접하여 위치한다. 본 발명의 RNA 분자가 시험관내 전사 방법에 의해 생성되는 경우, 시험관내 전사된 RNA 분자가 상기 폴리-A 테일을 함유함을 보장하기 위해 본 발명의 RNA 분자를 보유하는 플라스미드는 시험관내 전사 전에 폴리-A 테일의 다운스트림에서 선형화된다.
대안적으로, 예를 들어 고체상 지지체 및 표준 기술을 사용하는 자동화 뉴클레오티드 서열 합성기 상의 관용적인 화학적 합성에 의해, 본 발명의 RNA 분자는 또한 화학적으로 합성될 수 있다.
본 발명은 또한, 당업자에게 알려지고 상기 개관된 바와 같은 방법에 의해 본 발명의 RNA 분자를 시험관내 반응에서 생성하고 반응 혼합물로부터 RNA 분자를 회수하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 RNA 분자의 회수 방법 및/또는 후속의 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
모듈 (a)의 코딩 영역에 의해 암호화되는 임의의 목적하는 폴리펩티드 또는 단백질의 효율적인 발현을 위해, 당업계에 알려진 시험관내 번역 시스템에서 본 발명의 RNA 분자를 용이하게 사용할 수 있다.
시험관내 번역 시스템은 당업계에 알려져 있으며, 본 발명의 RNA 분자와 함께 직접 사용될 수 있다. 대안적으로, 이들 시험관내 번역 시스템을 상기 시험관내 전사 시스템과 조합할 수 있다. 시험관내 전사 및/또는 시험관내 번역을 위한 상응하는 무세포 시스템은 알려져 있고 이용가능하다. 단백질 합성을 위한 이들 무세포 시스템(또한 시험관내 단백질 합성이라고 불리거나 CFPS라고 약칭됨)은, 살아 있는 세포를 사용하지 않으면서 생물학적 기전을 사용하여 폴리펩티드 또는 단백질의 발현/생성을 가능하게 한다. 이들 시스템에서, 시험관내 단백질 합성 환경은 세포 벽 또는 세포 생존도를 유지하기 위해 필요한 항상성 조건에 의해 제약을 받지 않고 번역 환경의 직접 접근 및 제어를 가능하게 하며, 이는 단백질 생성의 최적화, 단백질 복합체의 최적화, 단백질 합성의 연구, 비-천연 아미노산의 혼입, 고효율 스크린, 및 합성 생물학을 포함하는 다수의 응용을 위한 이점이다. 무세포 반응의 통상적 구성요소는 세포 추출물, 에너지 공급원, 아미노산의 보급, 마그네슘과 같은 보조인자, 및 목적하는 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA를 포함한다. 세포 추출물은 관심 세포를 용해시키고 세포 벽, DNA 유전체, 및 다른 잔해를 원심분리해냄으로써 얻을 수 있다. 나머지는 리보솜, 아미노아실-tRNA 신테타제, 번역 개시 및 신장 인자, 뉴클레아제 등을 포함하는 필요한 세포 기전이다. DNA로부터 시작하는 폴리펩티드 또는 단백질의 합성을 위한 무세포 시스템(즉, 시험관내 전사 및 시험관내 번역의 단계를 포함하는 시스템)에서는, 2개 유형의 DNA, 즉, 플라스미드 또는 선형 발현 주형(LET)이 통상적으로 사용된다. RNA로부터 시작하는 폴리펩티드 또는 단백질의 합성을 위한 무세포 시스템(즉, 시험관내 번역의 단계만 포함하는 시스템)에서는 RNA가 직접 사용될 수 있다. 이들 시험관내 무세포 반응은, 반응을 위해 추출물에 첨가되는 아미노산의 보급과 함께, 필요한 에너지 공급원을 함유하는 별도의 혼합물에 의해 통상적으로 제공되는 에너지 공급원을 필요로 한다. 통상의 에너지 공급원은 포스포에놀 피루베이트, 아세틸 포스페이트, 및 크레아틴 포스페이트이다. 통상적으로 사용되는 통상의 세포 추출물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)(ECE), 토끼 망상적혈구(RRL), 맥아(WGE), 및 곤충 세포(ICE)로부터 제조된다. 이들 추출물 모두는 구매가능하다.
따라서, 본 발명은 또한, 상기 RNA 분자에 함유된 코딩 영역에 의해 암호화되는 목적하는 폴리펩티드 또는 단백질의 시험관내 번역을 위한 본 발명의 RNA 분자의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 RNA 분자의 이러한 용도의 바람직한 실시 형태에 관하여, 상기 정의된 바와 같은 RNA 분자에 관련하여 상기 기술된 바와 동일한 것이 필요한 부분만 약간 수정하여 적용된다.
상기 정의된 바와 같은 RNA 분자는 의료 환경에, 그리고 소정의 질환의 치료에, 그리고 특히 RNA-기반 요법에 특히 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 RNA 분자, 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 벡터, 또는 본 발명의 숙주 세포 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어 "치료" 등은 일반적으로 목적하는 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미하기 위해 사용된다. 따라서, 본 발명의 치료는 소정의 질환의 (급성) 상태의 치료에 관한 것일 수 있으나, 질환 또는 그의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 방제적(prophylactic) 치료에 관한 것일 수도 있다. 바람직하게, 용어 "치료"는 질환 및/또는 질환으로 인한 유해 효과 및/또는 증상을 부분적으로 또는 완전히 치유하는 관점에서 치료적인 것으로 이해되어야 한다. 이와 관련하여 "급성"은 대상이 질환의 증상을 나타냄을 의미한다. 다시 말해서, 치료할 대상은 실제로 치료를 필요로 하며, 본 발명에 관하여 용어 "급성 치료"는 질환의 발병 또는 질환의 발생 후에 실제로 질환을 치료하기 위해 취한 조치에 관한 것이다. 치료는 또한, 예를 들어, 감염 및/또는 질환의 발병을 예방하기 위한 방제적 또는 예방적 치료, 즉, 질환 예방을 위해 취한 조치일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당업자에게 알려진 광범위한 부류의 투여 형태를 통해 투여될 수 있다. 투여는 정제, 바늘 주사, 흡입기의 사용, 크림, 포말, 겔, 로션, 및 연고를 포함하나 이로 제한되지 않는 에어로졸을 통한 전신, 국소, 경구일 수 있다.
언급된 바와 같이, 본 발명은 상기에 따른 본 발명의 RNA 분자(또는 핵산 분자, 벡터, 또는 숙주 세포)의 유효량 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
부형제 또는 담체는, 강력한 활성 성분을 함유하는 제형을 증량하는 목적으로 활성 성분, 즉, 본 발명의 RNA 분자(또는 핵산 분자, 벡터, 또는 숙주 세포)와 함께 제형되는 비활성 물질이다. 부형제는 종종 "증량제", "충전제", 또는 "희석제"라고 지칭된다. 증량은 투여형을 생성할 경우에 약물 물질의 편리하고 정확한 분배를 가능하게 한다. 그들은 또한 다양한 치료-향상 목적, 예컨대 약물 흡수 또는 용해도의 촉진, 또는 다른 약동력학적 고려사항에 도움이 될 수 있다. 부형제는 또한, 산제 유동성 또는 비-점착 특성의 촉진에 의한 것과 같이 관련 활성 물질의 취급을 보조하기 위해, 부가적으로 예상되는 저장 수명에 걸친 변성의 방지와 같이 시험관내 안정성을 보조하기 위해, 제조 공정에 유용할 수 있다. 적당한 부형제의 선택은 또한 투여 경로 및 투여형과 더불어 활성 성분 및 다른 인자에 의존한다.
따라서, 본 발명의 RNA 분자(또는 핵산 분자, 벡터, 또는 숙주 세포)의 유효량을 포함하는 약제학적 조성물은 고체, 액체, 또는 기체 형태일 수 있으며, 특히 산제(들), 정제(들), 액제(들), 또는 에어로졸(들)의 형태일 수 있다. 상기 약제학적 조성물이 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 임의로 포함하는 것이 바람직하다.
적합한 약제학적 담체, 부형제, 및/또는 희석제의 예는 당업계에 잘 알려져 있으며 포스페이트 완충 식염 용액, 물, 유탁액, 예컨대 오일/물 유탁액, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 관용적인 방법에 의해 제형화될 수 있다. 이들 약제학적 조성물은 적합한 용량, 즉, "유효량"으로 대상에게 투여될 수 있으며, 이는 당업계에 알려진 방법에 의해 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 투여 계획은 담당 의사 및 임상 인자에 의해 결정될 것이다. 의료 기술분야에 잘 알려진 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 환자 또는 대상의 크기, 체표면적, 연령, 투여할 특정 화합물, 성별, 투여의 시간 및 경로, 일반적 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함하는 다수의 인자에 의존한다.
따라서, 바람직하게, 본 발명의 RNA 분자(또는 핵산 분자, 벡터, 또는 숙주 세포)는 유효량으로 포함된다. 용어 "유효량"은 약제학적 조성물이 투여될 대상에서 검출가능한 치료 반응을 유도하기에 충분한 양을 지칭한다. 상기에 따라, 약제학적 조성물 내의 본 발명의 RNA 분자(또는 핵산 분자, 벡터, 또는 숙주 세포)의 함량은, 그것이 상기 기재된 바와 같은 치료에 유용한 한 제한되지 않지만, 바람직하게 총 조성물당 0.0000001-10 중량%를 함유한다. 추가로, 본 명세서에 기재된 RNA 분자(또는 핵산 분자, 벡터, 또는 숙주 세포)는 바람직하게 담체 내에 채용된다. 일반적으로, 조성물이 등장성이 되게 하기 위해 적당한 양의 약제학적으로 허용되는 염을 담체 내에 사용한다. 담체의 예는 식염수, 링거 용액, 및 덱스트로스 용액을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 바람직하게, 완충제, 예컨대 시트레이트, 포스페이트, 및 다른 유기산; 염-형성 반대-이온, 예를 들어 소듐 및 포타슘; 저분자량(> 10개 아미노산 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 또는 젤라틴; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 히스티딘, 글루타민, 리신, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 글리신; 글루코스, 만노오스, 또는 덱스트린을 포함하는 탄수화물; 단당류; 이당류; 다른 당, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 또는 소르비톨; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 Tween, Pluronic, 또는 폴리에틸렌 글리콜; 메티오닌, 아스코르브산, 및 토코페롤을 포함하는 산화방지제; 및/또는 방부제, 예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸을 포함하는, 허용되는 부형제, 담체, 또는 안정화제는 채용되는 투여량 및 농도에서 비-독성이다. 적합한 담체 및 그들의 제형은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985, Mack Publishing Co]에 더 상세히 기재되어 있다.
치료 진행은 주기적 평가에 의해 모니터링할 수 있다. 본 발명의 RNA 분자(또는 핵산 분자, 벡터, 또는 숙주 세포) 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 유탁액과 더불어 크림 및 좌제 내에 있을 수 있다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 식염수 및 완충 배지를 포함하는 물, 알코올성/수성 용액, 유탁액, 또는 현탁액을 포함한다. 예를 들어, 항미생물제, 산화방지제, 킬레이트화제, 및 불활성 기체 등과 같은 방부제 및 다른 첨가제 또한 존재할 수 있다. 추가로, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 조성물의 의도되는 용도에 따라 추가의 약제를 포함할 수 있다. 상기 약제는, 예를 들어, 상표명 Tween으로 시중에서 이용가능한 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 프로필렌 글리콜, EDTA, 시트레이트, 수크로스와 더불어 당업자에게 잘 알려진 약제학적 조성물의 의도되는 용도에 적합한 다른 약제일 수 있다.
본 발명에 따라, 용어 "약제학적 조성물"은 환자, 바람직하게 인간 환자에게 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물는 RNA-기반 요법에 사용하기 위한 것일 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"을 포함하는 본 발명의 RNA 분자는 RNA-기반 요법에 사용될 수 있으며, 여기에서 "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"은 치료 효과 또는 예방 효과를 나타내는 치료적으로 또는 약제학적으로 활성인 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화한다. 따라서, 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 표 1에 인용된 바와 같은 질환의 치료 또는 예방에서 RNA-기반 요법에 사용하기 위한 것일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 RNA-기반 요법은 상기 표 1에 인용된 바와 같은 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것일 수 있다.
따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 표 1에 기재된 유전자 결함이 본 발명의 RNA 분자를 이용하는 전사체 대체 요법/효소 대체 요법에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 질환을 유발하는 경우에 RNA-기반 요법에 사용하기 위한 것일 수 있으며, 여기에서 RNA 분자는 개시된 결손 유전자를 보상하는 단백질 또는 그의 기능성 단편의 온전한 버전을 암호화하는 "폴리펩티드를 위한 코딩 영역"을 포함한다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 리소좀 질환, 예컨대 고셔병, 파브리병, MPS I, MPS II(헌터 증후군), MPS VI, 및 글리코겐 저장 질환, 예컨대 글리코겐 저장 질환 유형 I(폰 기에르케병), 유형 II(폼페병), 유형 III(코리병), 유형 IV(앤더슨병), 유형 V(맥아들병), 유형 VI(허스병), 유형 VII(타우리병), 유형 VII, 유형 IX, 유형 X, 유형 XI(판코니-비켈 증후군), 유형 XI, 또는 유형 0의 치료 또는 예방에서 RNA-기반 요법에 사용하기 위한 것일 수 있다. 전사체 대체 요법/효소 대체 요법은 유익하게 기저의 유전적 결함에 영향을 주지 않지만, 환자에게 결핍된 효소의 농도를 증가시킨다. 예로서, 폼페병에서 전사체 대체 요법/효소 대체 요법은 결핍된 리소좀 효소 산 알파-글루코시다제(GAA)를 대체한다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 RNA-기반 요법에 사용하기 위한 것일 수 있으며, 여기에서 "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"은 치료 효과 또는 예방 효과를 나타내는 치료적으로 또는 약제학적으로 활성인 폴리펩티드, 단백질, 또는 펩티드를 암호화하고, 여기에서 상기 폴리펩티드, 단백질, 또는 펩티드는 표 1에 개괸된 바와 같은 유전자에 의해 암호화되는 그룹 중에서 선택된다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 RNA-기반 요법은 암, 심혈관 질환, 바이러스 감염, 면역 기능장애, 자가면역 질환, 신경학적 장애, 선천적 대사성 장애 또는 유전적 장애, 또는 세포 내에 생성된 단백질 또는 단백질 단편이 환자에게 유익한 효과를 나타낼 수 있는 임의의 질환의 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다. 암의 예는 두경부암, 유방암, 신장암, 방광암, 폐암, 전립선암, 골암, 뇌암, 자궁경부암, 항문암, 결장암, 결장직장암, 충수암, 안암, 위암, 백혈병, 림프종, 간암, 피부암, 난소암, 음경암, 췌장암, 고환암, 갑상선암, 질암, 외음부암, 자궁내막암, 심장암, 및 육종을 포함한다.
심혈관 질환의 예는 죽상동맥경화증, 관상동맥 심장 질환, 폐 심장 질환, 및 심근병증을 포함한다.
면역 기능장애 및 자가면역 질환의 예는 류머티스 질환, 다발성 경화증, 및 천식을 포함하나 이로 제한되지 않는다.
바이러스 감염의 예는 인간 면역결핍증 바이러스, 단순 포진 바이러스, 인간 파필로마바이러스와 더불어 간염 B 및 C 바이러스에 의한 감염을 포함하나 이로 제한되지 않는다.
신경학적 장애의 예는 파킨슨병, 다발성 경화증, 및 치매를 포함하나 이로 제한되지 않는다.
선천적 대사성 장애의 예는 고셔병 및 페닐케톤뇨증을 포함하나 이로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 RNA-기반 요법의 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 RNA-기반 요법에 의한 암, 심혈관 질환, 바이러스 감염, 면역 기능장애, 자가면역 질환, 신경학적 장애, 선천적 대사성 장애 또는 유전적 장애와 같은 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 치료 방법의 바람직한 실시 형태에 관하여, 상기 정의된 바와 같은 RNA-기반 요법에 사용하기 위한 RNA 분자 또는 약제학적 조성물에 관련하여 상기 기술된 바와 동일한 것이 필요한 부분만 약간 수정하여 적용된다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명에서 대상은 포유동물, 예컨대 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 말, 설치류, 예를 들어, 랫트, 마우스, 및 기니아 피그, 또는 영장류, 예를 들어, 고릴라, 침팬지, 및 인간이다. 가장 바람직한 실시 형태에서, 대상은 인간이다.
상기 언급된 바와 같이, 상기 정의된 바와 같은 RNA 분자는 의료 환경에, 그리고 소정의 질환의 치료에, 그리고 특히 RNA-기반 요법에 특히 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 RNA 분자, 핵산 분자, 벡터, 또는 숙주 세포, 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
그러나, RNA 요법에서는 일부 단계에서 RNA 분자의 효과를 침묵시키는 것이 종종 바람직하다.
이는, 예를 들어, 본 발명의 UTR 서열에 상보적인 핵산 가닥을 사용함으로써 RNAi(RNA 간섭) 메카니즘을 이용하여 실행할 수 있다. 사실상, 본 발명의 최소 UTR의 작은 크기는 이 접근법을 실현가능하게 만드는데, 이는 이들 UTR이 2차 또는 3차 구조를 형성하지 않으며 정상 세포에는 그들이 존재하지 않기 때문이다. 따라서, 상기 질환의 치료 후 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 사용하는 상기 RNA-기반 요법 후의 의료 환경에 이러한 UTR 서열의 상보적인 가닥을 유익하게 사용함으로써 본 발명의 치료적 RNA 분자를 침묵시킬 수 있다.
따라서, 본 발명에 관련하여 RNAi-접근법은 또한, 본 발명의 치료적 RNA 분자의 효과를 침묵시키기 위한 약제학적 조성물의 제조에서의 용도로 예상된다.
용어 "RNA 간섭" 또는 "저해 RNA"(RNAi/iRNA)는 분해를 위해 특이적 mRNA를 표적화함으로써 그들의 발현을 침묵시키기 위한 이중-가닥 RNA의 사용을 기재한다. 바람직한 저해 RNA 분자는 이중-가닥 RNA(dsRNA), RNAi, siRNA, shRNA, 및 stRNA로 구성된 그룹 중에서 선택될 수 있다. 유전자 서열에 일치하는 dsRNA는 시험관내에서 합성되어 세포 내로 도입된다. dsRNA는 또한, 센스 및 안티센스 배향으로 표적 유전자 서열을 발현시키는 벡터의 형태로, 예를 들어 헤어핀 mRNA의 형태로 세포 내로 도입될 수 있다. 센스 및 안티센스 서열은 또한, 별도의 벡터로부터 발현될 수 있으며, 이에 의해 그들의 발현시에 개별적인 안티센스 및 센스 분자가 이중-가닥 RNA를 형성한다. 일부 경우에는 센스 배향의 서열 또는 심지어 프로모터 서열의 발현이 세포 내에서 내부 증폭 메카니즘으로 인해 dsRNA 및 후속적으로 siRNA가 생기게 하기에 충분하다는 것이 당업계에 알려져 있다. 따라서, 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질의 활성의 감소를 유발하는 모든 수단 및 방법이 본 발명에 따라 사용될 것이다. 예를 들어 센스 작제물, 안티센스 작제물, 헤어핀 작제물, 센스 및 안티센스 분자, 및 그의 조합을 사용하여 이들 siRNA를 생성/도입할 수 있다. dsRNA 전구체 분자를 짧은 간섭 RNA(siRNA)로 절단하는 고도로 보존된 뉴클레아제 다이서(dicer)를 포함하는, 천연의, 그러나 부분적으로만 이해된 과정 내로 dsRNA가 투입된다. siRNA(들)의 생성 및 제조와 더불어 표적 유전자의 발현을 저해하는 방법은, 특히 제WO　02/055693호, 문헌[Wei(2000) Dev. Biol. 15:239-255]; 문헌[La Count(2000) Biochem. Paras. 111:67-76]; 문헌[Baker(2000) Curr. Biol. 10:1071-1074]; 문헌[Svoboda(2000) Development 127:4147-4156], 또는 문헌[Marie(2000) Curr. Biol. 10:289-292]에 기재되어 있다. 이어서, 이들 siRNA는 RNA-유도 침묵화 복합체(RISC: RNA-induced silencing complex), 침묵화 촉발제에 상동적인 전령 RNA를 파괴하는 다중복합체 뉴클레아제의 서열 특이적 부분을 만들었다. 문헌[Elbashir(2001) EMBO J. 20:6877-6888]은 세포 배양에 21 뉴클레오티드 RNA의 이중체를 사용하여 포유동물 세포에서의 유전자 발현을 방해할 수 있음을 입증했다. 포유동물 세포에서 RNAi는 siRNA에 의해 매우 효율적으로 매개되지만 안정한 세포주 또는 비-인간 형질전환 동물의 생성은 제한되었음이 이미 알려져 있다. 그러나, 예를 들어 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 안정적으로 발현시키기 위해 새로운 세대의 벡터를 채용할 수 있다. 포유동물 세포에서의 siRNA의 안정한 발현은 특히 문헌[Brummelkamp(2002) Science 296:550-553]에 입증되어 있다. 또한 문헌[Paul(2002) Nat. Biotechnol. 20:505-508]에는 인간 세포에서의 작은 간섭 RNA의 효과적인 발현이 기록되었다. 포유동물 세포에서의 짧은-간섭 RNA 및 헤어핀 RNA의 발현에 의한 RNA 간섭은 또한 문헌[Yu(2002) PNAS 99:6047-6052]에 의해 입증되었다. 유전자 침묵화를 위한 shRNA 접근법은 당업계에 잘 알려져 있으며 st(작은 일시적) RNA의 사용을 포함할 수 있다(특히, 문헌[Paddison(2002) Genes Dev. 16:948-958] 참조). 이들 접근법은 벡터-기반일 수 있으며, 특히 문헌[Yu(2002), 상기 인용]; 문헌[Miyagishi(2002), 상기 인용], 또는 문헌[Brummelkamp(2002), 상기 인용]에 예시된 바와 같이, 예를 들어 pSUPER 벡터, 또는 RNA polIII 벡터가 채용될 수 있다. pSUPER 또는 RNA polIII 벡터를 기반으로 하는 시스템과 유사한 양식으로 본 발명의 조절 서열을 사용하는 것이 예상된다.
siRNA를 추정하고 작제하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 문헌[Elbashir(2002) Methods 26:199-213]에, siRNA의 판매자의 인터넷 웹 사이트, 예를 들어 Qiagen GmbH(https://www1.qiagen.com/GeneGlobe/Default.aspx); Dharmacon(www.dharmacon.com); Xeragon Inc.(http://www.dharmacon.com/Default.aspx), 및 Ambion(www.ambion.com)에, 또는 톰 투슬(Tom Tuschl)의 연구 그룹의 웹 사이트 (http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html)에 기재되어 있다. 부가적으로, 제공된 mRNA 서열로부터 siRNA를 추정하는 프로그램이 온라인으로 이용가능하다(예를 들어 http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html 또는 http://katahdin.cshl.org:9331/RNAi/html/rnai.html). 활성의 손실 없이 2-nt 3' 돌출부 내의 우리딘 잔기를 2'데옥시티미딘으로 대체할 수 있으며, 이는 RNA 합성의 비용을 유의적으로 감소시키고 포유동물 세포에 적용될 경우에 siRNA 이중체의 저항성 또한 향상시킬 수 있다(문헌[Elbashir(2001) 상기 인용]). siRNA는 또한 T7 또는 다른 RNA 폴리머라제를 사용하여 효소적으로 합성할 수 있다(문헌[Donze(2002) Nucleic Acids Res 30:e46]). 효과적인 RNA 간섭을 매개하는 짧은 RNA 이중체(esiRNA)는 또한 에스케리키아 콜라이 RNase III을 이용한 가수분해에 의해 생성될 수 있다(문헌[Yang(2002) PNAS 99:9942-9947]). 추가로, 진핵 세포에서 작은 헤어핀 RNA 루프에 의해 연결된 이중 가닥 siRNA를 발현시키기 위한 발현 벡터가 개발되었다(예를 들어 문헌[Brummelkamp(2002) Science 296:550-553]). 이들 작제물 모두는 상기 거명된 프로그램의 도움으로 개발될 수 있다. 부가적으로, 서열 분석 프로그램 내에 혼입되거나 별도로 판매되는 구매가능한 서열 예측 도구, 예를 들어 www.oligoEngine.com(워싱턴주 시애틀 소재)에 의해 제공되는 siRNA 설계 도구를 siRNA 서열 예측에 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따라 특이적 간섭 RNA를 본 발명의 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질의 발현 및/또는 기능의 길항제/사일런서로 사용할 수 있다. 이들 siRNA는 상보적/안티센스 및 센스 가닥에 의해 형성되며, 이에 의해 안티센스/센스 가닥은 적어도 10개, 더욱 바람직하게 적어도 12개, 더욱 바람직하게 적어도 14개, 더욱 바람직하게 적어도 16개, 더욱 바람직하게 적어도 18개, 더욱 바람직하게 적어도 19, 20, 21, 또는 22개의 뉴클레오티드를 바람직하게 포함한다. 더욱 더 바람직한 실시 형태에서, 안티센스/센스 가닥은 25개 이상의 뉴클레오티드를 바람직하게 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따라 사용할 siRNA의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 명세서에 제공된 교시를 기반으로, 당업자는 용이하게 이러한 siRNA를 제조할 수 있을 뿐 아니라 siRNA가 본 발명의 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질을 길항/저해/침묵화할 수 있는지 여부를 평가할 수 있다. 상기 기재된 siRNA는 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 코딩 영역 및 UTR 모듈을 보유하는 본 발명의 RNA 분자의 분해를 유발하며, 따라서 본 발명의 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질의 감소된 폴리펩티드/단백질 수준을 유발한다는 것이 본 명세서에서 예상된다.
따라서, 본 발명은 본 명세서에 상기 기재된 바와 같이 본 발명의 UTR에 상보적인 RNA 분자에 관한 것이다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 CAUGGUGGCGUCUCCC(서열 번호 11) 또는 서열 번호 11에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 번호 12의 위치 10에서 뉴클레오티드 N이 U, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 서열 CAUGGUGGCNGUCUCCC(서열 번호 12), 또는 서열 번호 12에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내고 본 발명의 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질을 길항/저해/침묵화할 수 있는 서열을 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 CAUCUUGGCGUCUCCC(서열 번호 13), 또는 서열 번호 13에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 번호 14의 위치 10에서 뉴클레오티드 N이 U, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 한편 A가 더욱 바람직한 서열 CAUCUUGGCNGUCUCCC(서열 번호 14), 또는 서열 번호 14에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내고 본 발명의 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질을 길항/저해/침묵화할 수 있는 서열을 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 CAUGGCGGCGUCUCCC(서열 번호 15), 또는 서열 번호 15에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 번호 16의 위치 10에서 뉴클레오티드 N이 U, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 서열 CAUGGCGGCNGUCUCCC(서열 번호 16), 또는 서열 번호 16에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내고 본 발명의 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질을 길항/저해/침묵화할 수 있는 서열을 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 CAUCUCGGCGUCUCCC(서열 번호 17), 또는 서열 번호 17에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 번호 18의 위치 10에서 뉴클레오티드 N이 U, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 한편 A가 더욱 바람직한 서열 CAUCUCGGCNGUCUCCC(서열 번호 18), 또는 서열 번호 18에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내고 본 발명의 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질을 길항/저해/침묵화할 수 있는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 CAUGGUGGCGUCCC(서열 번호 19), 또는 서열 번호 19에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 번호 20의 위치 10에서 뉴클레오티드 N이 U, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 서열 CAUGGUGGCNGUCCC(서열 번호 20), 또는 서열 번호 20에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내고 본 발명의 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질을 길항/저해/침묵화할 수 있는 서열을 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 CAUCUUGGCGUCCC(서열 번호 21), 또는 서열 번호 21에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 번호 22의 위치 10에서 뉴클레오티드 N이 U, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 한편 A가 더욱 바람직한 서열 CAUCUUGGCNGUCCC(서열 번호 22), 또는 서열 번호 22에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내고 본 발명의 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질을 길항/저해/침묵화할 수 있는 서열을 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 CAUGGCGGCGUCCC(서열 번호 23), 또는 서열 번호 23에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 번호 24의 위치 10에서 뉴클레오티드 N이 U, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 서열 CAUGGCGGCNGUCCC(서열 번호 24), 또는 서열 번호 24에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내고 본 발명의 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질을 길항/저해/침묵화할 수 있는 서열을 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 CAUCUCGGCGUCCC(서열 번호 25), 또는 서열 번호 25에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 번호 26의 위치 10에서 뉴클레오티드 N이 U, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 한편 A가 더욱 바람직한 서열 CAUCUCGGCNGUCCC(서열 번호 26), 또는 서열 번호 26에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내고 본 발명의 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질을 길항/저해/침묵화할 수 있는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 CAUGGUGGCGCUUC(서열 번호 27), 또는 서열 번호 27에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 번호 28의 위치 10에서 뉴클레오티드 N이 U, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 서열 CAUGGUGGCNGCUUC(서열 번호 28), 또는 서열 번호 28에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내고 본 발명의 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질을 길항/저해/침묵화할 수 있는 서열을 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 CAUCUUGGCGCUUC(서열 번호 29), 또는 서열 번호 29에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 번호 30의 위치 10에서 뉴클레오티드 N이 U, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 한편 A가 더욱 바람직한 서열 CAUCUUGGCNGCUUC(서열 번호 30), 또는 서열 번호 30에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내고 본 발명의 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질을 길항/저해/침묵화할 수 있는 서열을 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 CAUGGCGGCGCUUC(서열 번호 31), 또는 서열 번호 31에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 번호 32의 위치 10에서 뉴클레오티드 N이 U, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 서열 CAUGGCGGCNGCUUC(서열 번호 32), 또는 서열 번호 32에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내고 본 발명의 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질을 길항/저해/침묵화할 수 있는 서열을 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 CAUCUCGGCGCUUC(서열 번호 33), 또는 서열 번호 33에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 UTR에 상보적인 상기 RNA 분자는 서열 번호 34의 위치 10에서 뉴클레오티드 N이 U, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 한편 A가 더욱 바람직한 서열 CAUCUCGGCNGCUUC(서열 번호 34), 또는 서열 번호 34에 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내고 본 발명의 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질을 길항/저해/침묵화할 수 있는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시 형태에서 본 발명은, 시작 코돈에 상보적인 삼중항을 넘어 연장되는 부가적인 뉴클레오티드(들)를 5' 단부에 보유하고 본 발명의 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 암호화되는 목적하는 폴리펩티드 또는 단백질의 서열에 상보적인 서열 번호 11 내지 34로 구성된 그룹 중에서 선택된 RNA 분자에 관한 것이다. 바람직하게, 본 발명의 UTR 서열에 상보적인 상기 서열을 포함하는 상보적인 서열(즉, 서열 번호 11 내지 34로 구성된 그룹 중에서 선택된 RNA 분자)은 적어도 15개, 더욱 바람직하게 적어도 16개, 더욱 바람직하게 적어도 17개, 더욱 바람직하게 적어도 18개, 더욱 바람직하게 적어도 19개, 더욱 바람직하게 적어도 20, 21, 22, 23, 또는 24개의 뉴클레오티드를 바람직하게 포함한다. 더욱 더 바람직한 실시 형태에서, 이들 서열은 25, 30, 35, 40개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 상보적인 서열의 특이성을 증가시킴으로써 원하지 않는 부작용을 예방하기 위해, 5' 단부에서 길이를 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.
다른 바람직한 실시 형태에서 본 발명은, 상기 RNA 분자 중 임의의 것 뿐 아니라 또한 상기 기재된 RNA 분자에 대해 최대 5%, 10%, 20%, 또는 30%의 불일치를 포함하는 서열 번호 11 내지 34로 구성된 그룹 중에서 선택된 RNA 분자에 관한 것이다. 추가로, RNA 분자는 본 명세서에 상기 기재된 바와 같이 화학적으로 개질될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 DNA 분자, 본 발명의 RNA 분자, 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 벡터, 또는 본 발명의 숙주 세포를 포함하는 키트에 관한 것이다. 바람직한 실시 형태에 관하여, 본 발명에 따른 DNA 분자, RNA 분자, 핵산 분자, 벡터, 또는 숙주 세포에 관련하여 상기 기술된 바와 동일한 것이 필요한 부분만 약간 수정하여 적용된다. 유리하게, 본 발명의 키트는 임의로 완충제(들), 저장 용액, 및/또는 상기 및 하기 용도 및 방법의 수행에 필요한 나머지 시약 또는 재료를 추가로 포함한다. 추가로, 본 발명의 키트의 부품들을 바이알 또는 병에 개별적으로, 또는 용기 또는 다중용기 단위에 조합하여 포장할 수 있다. 본 발명의 키트는, 특히 본 발명의 방법의 실행 또는 본 발명의 RNA 분자의 제조에 유리하게 사용될 수 있으며, 본 명세서에 언급된 다양한 응용, 예를 들어, 상기 및 하기 개관된 바와 같은 용도에 채용될 수 있을 것이다. 키트에 포함될 수 있는 다른 구성요소는 키트를 그의 용도로 사용하는 사람에 대한 설명서이다. 키트의 제조는 당업자에게 알려진 표준 절차를 바람직하게 따른다.
본 발명은 또한, RNA 분자의 코딩 영역을 상기 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질로 번역하기 위한 본 명세서에 상기 기재된 바와 같은 UTR의 용도에 관한 것이다.
더욱 바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 또한, RNA 분자의 코딩 영역을 상기 코딩에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질로 번역하는 효율을 증가시키기 위한 본 명세서에 상기 기재된 바와 같은 UTR의 용도에 관한 것이다.
용도의 바람직한 실시 형태에 관하여, 본 발명의 RNA 분자에 관련하여 상기 기술된 바와 동일한 것이 필요한 부분만 약간 수정하여 적용된다.
바람직한 실시 형태에서, 하기 항목 1 내지 항목 20에 의해 특성화되는 바와 같이 본 발명은 하기에 관한 것이다:
1. 하기 요소를 가진 하나의 가닥을 포함하거나 상보적인 가닥을 포함하는, mRNA로 전사될 수 있는 DNA 분자:
(a) 폴리펩티드를 코딩하는, 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역; 및
(b) 상기 코딩 서열의 바로 업스트림에 있는,
(b1) R1-CGCCACC(서열 번호 1);
또는 상기 서열에서 서열 번호 1의 위치 6에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 1의 위치 7에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 1의 위치 5에서 A가 G에 의해 치환된 서열; 및
(b2) 서열 번호 2의 위치 2에서 뉴클레오티드 N이 T, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 R1-CNGCCACC(서열 번호 2);
또는 상기 서열에서 서열 번호 2의 위치 7에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 2의 위치 8에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 2의 위치 6에서 A가 G에 의해 치환된 서열로 구성된 그룹 중에서 선택되며,
여기에서 R1은 DNA-의존성 RNA-폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터인 서열.
2. 항목 1에 있어서, DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터가
(i) TAATACGACTCACTATAGGGAGA(서열 번호 3) 또는 서열 번호 3에 비교하여 1 내지 6개의 치환을 나타내고 T7 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 서열;
(ii) AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA(서열 번호 4) 또는 서열 번호 4에 비교하여 1 내지 6개의 치환을 나타내고 T3 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 서열;
(iii) ATTTAGGTGACACTATAGAAG(서열 번호 5) 또는 서열 번호 5에 비교하여 1 내지 6개의 치환을 나타내고 SP6 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 서열; 및
(iv) AATTAGGGCACACTATAGGGA(서열 번호 6) 또는 서열 번호 6에 비교하여 1 내지 6개의 치환을 나타내고 K11 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 서열로 구성된 그룹 중에서 선택되는 DNA 분자.
3. 항목 1 또는 항목 2에 있어서, 서열 번호 2의 위치 2에서 뉴클레오티드 N이 T, G, 또는 C로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드이고, 여기에서 뉴클레오티드 N은 A가 아닌 DNA 분자.
4. 항목 3에 있어서, 서열 번호 2의 위치 2에서 상기 뉴클레오티드 N이 T인 DNA 분자.
5. 항목 4의 DNA 분자를 포함하는 벡터.
6. 항목 5의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
7. 항목 1 내지 항목 4 중 어느 한 항목에 따른 DNA 분자, 항목 5에 따른 벡터, 또는 항목 6에 따른 숙주 세포를 포함하는 조성물.
8. (a) 폴리펩티드를 코딩하는, 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역; 및
(b) 상기 코딩 서열의 바로 업스트림에 있는,
(b1) 서열 R2-CGCCACC(서열 번호 1)의 UTR,
또는 상기 UTR 서열에서 서열 번호 1의 위치 6에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 1의 위치 7에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 1의 위치 5에서 A가 G에 의해 치환된 서열; 및
(b2) 서열 번호 2의 위치 2에서 뉴클레오티드 N이 U, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 서열 R2-CNGCCACC(서열 번호 2)의 UTR, 또는 상기 UTR 서열에서 서열 번호 2의 위치 7에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 2의 위치 8에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 2의 위치 6에서 A가 G에 의해 치환된 서열로 구성된 그룹 중에서 선택되며,
여기에서 R2는 DNA-의존성 RNA-폴리머라제가 RNA 합성을 개시하는 뉴클레오티드로 시작되는 프로모터 영역의 부분에 상응하는 RNA 서열인 UTR을 포함하는 RNA 분자.
9. 항목 8에 있어서, R2가
(i) GGGAGA(서열 번호 7);
(ii) GGGAGA(서열 번호 8);
(iii) GAAG(서열 번호 9); 및
(iv) GGGA(서열 번호 10)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 RNA 분자.
10. 항목 8 또는 항목 9에 있어서, 서열 번호 2의 위치 2에서 뉴클레오티드 N이 U, G, 또는 C로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드이고, 여기에서 뉴클레오티드 N은 A가 아닌 RNA 분자.
11. 항목 10에 있어서, 서열 번호 2의 위치 2에서 상기 뉴클레오티드 N이 U인 RNA 분자.
12. 항목 8 내지 항목 11 중 어느 한 항목에 있어서, 3' 단부에 폴리-A 테일을 포함하는 RNA 분자.
13. 항목 8 내지 항목 12 중 어느 한 항목에 있어서, 폴리-A 테일의 길이가 적어도 120개 뉴클레오티드인 RNA 분자.
14. 항목 8 내지 항목 13 중 어느 한 항목의 RNA 분자를 암호화하는 핵산 분자.
15. 항목 14의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
16. 항목 15의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
17. 항목 8 내지 항목 13 중 어느 한 항목에 따른 RNA 분자, 항목 14에 따른 핵산 분자, 항목 15에 따른 벡터, 또는 항목 16에 따른 숙주 세포, 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
18. 항목 17에 있어서, RNA-기반 요법에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
19. 항목 1 내지 항목 4 중 어느 한 항목에 따른 DNA 분자, 항목 8 내지 항목 13 중 어느 한 항목에 따른 RNA 분자, 항목 14에 따른 핵산 분자, 항목 5 또는 항목 15에 따른 벡터, 또는 항목 6 또는 항목 16에 따른 숙주 세포를 포함하는 키트.
20. RNA 분자의 코딩 영역을 상기 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질로 번역하기 위한, 항목 8(b)에 정의된 바와 같은 UTR의 용도.
도 1: 본 발명에 사용된 각각의 루시페라제 리포터 작제물의 명칭과 함께 "최소 UTR" 서열을 보유하는 서열을 나타낸다. 서열은 T7 프로모터 및 코작 요소의 일부에 이어서 시작 코돈 ATG를 보유한다. TATA 서열을 포함하는 최초 10개 염기 및 후속의 6개 염기(GGGAGA)는 T7 프로모터 유래의 서열인 반면에 시작 코돈 ATG의 업스트림에 있는 나머지 염기는 코작 요소에 속한다(GCCACC). "sp30"은 30개 뉴클레오티드의 무작위 서열이다. 서열 번호 9에서 밑줄 친 서열은 길이가 30개 뉴클레오티드인 인간 알파 글로빈("hAg")으로부터의 5' UTR 서열이다.
도 1에 나타낸 바와 같이 서열 1 내지 9는 각각 서열 번호 37 내지 45에 상응한다.
도 2a 및 도 2b: "최소 UTR" 내의 여분의 "C"가 필수적임을 나타낸다(도 1의 서열 1 및 2). 인간 폐포 상피 세포주(A549) 및 인간 간세포 암종 세포주(HepG2)를 각각 20,000 세포/웰 및 40,000 세포/웰의 밀도로 96 웰 플레이트에 접종하였다. 접종 후 24 시간에, Lipofectamine2000을 사용하여 상이한 루시페라제 코딩 SNIM RNA 작제물(도 1의 서열 1 및 2)로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 24 시간에 루시페라제 발현을 측정하였다. 값은 3회 반복실험의 평균 ± SD를 나타내며, 형질감염 용량에 대해 플로팅하였고, GraphPad Prism을 통해 데이터를 분석하였다. A549 및 HepG2 세포 양자 모두에서, C의 결실은 더 낮은 발현을 유발했다. 그러므로 이 여분의 C는 모든 추가의 작제물의 설계에 포함되었다.
도 3: A549 형질감염된 세포에서 표시된 바와 같은 개별적인 뉴클레오티드의 효과를 나타내며 여분의 "C"와 코작 요소 사이의 거리의 효과를 나타낸다. 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 세포를 형질감염시키고 루시페라제 어세이를 수행하였다. 더 높은 용량은 선형 범위를 벗어났으므로, 최대 62,5 ng/웰의 용량 반응만 여기에 제공된다. 인간 알파 글로빈으로부터의 5'UTR을 양성 대조군으로 사용하였다. 각각 도 1로부터의 서열 3-8을 보유하는 SNIM RNA 분자로 형질감염 실험을 수행하였다. 인간 폐포 상피 세포주(A549)를 20,000 세포/웰의 밀도로 96 웰 플레이트에 접종하였다. 접종 후 24 시간에, Lipofectamine2000을 사용하여 상이한 루시페라제 코딩 SNIM RNA 작제물(도 1로부터의 서열 번호 3-8)로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 24 시간에 루시페라제 발현을 측정하였다. 값은 형질감염 용량에 대해 플로팅하였고, GraphPad Prism을 통해 데이터를 분석하였다. 값은 3회 반복실험의 평균 ± SD를 나타낸다.
폐포 상피 세포주(A549)에서, C와 코작 요소 사이에 여분의 "A"를 삽입하는 것은(도 1에서 서열 번호 3) 유의적으로 더 낮은 발현을 유발했다(도 3). C와 코작 서열 사이에 단일 "T"를 삽입하는 것은(도 1에서 서열 번호 4) 양성 대조군으로 사용된 인간 알파 글로빈 5'UTR로 달성된 것과 유사한 발현 수준을 유발했다.
도 4: HepG2 형질감염된 세포에서 표시된 바와 같은 개별적인 뉴클레오티드의 효과를 나타내며 여분의 "C"와 코작 요소 사이의 거리의 효과를 나타낸다. 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 세포를 형질감염시키고 루시페라제 어세이를 수행하였다. 더 높은 용량은 선형 범위를 벗어났으므로, 최대 62,5 ng/웰의 용량 반응만 여기에 제공된다. 도 1로부터의 서열 번호 3-8로 형질감염 실험을 수행하였다. 간세포 암종 세포주(HepG2)를 40,000 세포/웰의 밀도로 96 웰 플레이트에 접종하였다. 접종 후 24 시간에, Lipofectamine2000을 사용하여 상이한 루시페라제 코딩 SNIM RNA 작제물(도 1로부터의 서열 번호 3-8)로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 24 시간에 루시페라제 발현을 측정하였다. 값은 형질감염 용량에 대해 플로팅하였고, GraphPad Prism을 통해 데이터를 분석하였다. 값은 3회 반복실험의 평균 ± SD를 나타낸다. 양자 모두의 세포주(A549 세포(도 3) 및 HepG2(도 4))에서, C와 코작 요소 사이에 여분의 "A"를 삽입하는 것(도 1로부터의 서열 번호 3)은 유의적으로 더 낮은 발현을 유발했다(도 3 및 도 4). 양자 모두의 세포 유형에서, C와 코작 요소 사이에 단일 "T"를 삽입하는 것은(도 1로부터의 서열 번호 4) 양성 대조군으로 사용된 인간 알파 글로빈 5'UTR로 달성된 것과 유사한 발현 수준을 유발했다. HepG2 세포에서는, 서열 번호 1(도 1) 또한 동일하게 효과적이었다.
도 5: A549 세포에서의 루시페라제의 발현에 대한 TISU 요소의 효과를 나타낸다. 선택된 루시페라제 암호화 작제물에 대해 상세한 용량 반응 및 곡선 적합을 수행하였다. 도 2 내지 도 4로부터의 이전의 데이터를 기반으로, TISU 요소를 서열 4(도 1)의 조합 내로 이전시켰으며, 이는 2개의 바람직한 속성을 함유하였다(도 1로부터의 서열 번호 9를 달성하기 위한 T7 프로모터와 코작 요소 사이의 C 및 C와 코작 요소 사이의 여분의 T).
인간 폐포 상피 세포주(A549)(도 5a 및 도 5b) 및 인간 간세포 암종 세포주(HepG2)(도 5c 및 도 5d)를 각각 20,000 세포/웰 및 40,000 세포/웰의 밀도로 96 웰 플레이트에 접종하였다. 접종 후 24 시간에, Lipofectamine2000을 사용하여 상이한 루시페라제 코딩 SNIM RNA 작제물로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 24 및 48 시간에 루시페라제 발현을 측정하였다(도 5e). 값은 형질감염 용량에 대해 플로팅하였고 GraphPad Prism을 통해 데이터를 분석하였다. 표시된 바와 같이 상이한 루시페라제 코딩 mRNA로 A459(a, b) 및 HepG2(c, d) 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 24(a, c) 및 48(b, d) 시간에 루시페라제 활성을 측정하였다. 값은 3회 반복 실험의 평균 ± SD를 나타낸다.
양자 모두의 세포주에서, 그리고 양자 모두의 측정 시점에, TISU 요소를 함유하는 루시페라제 작제물에 의해 유의적으로 더 높은 발현이 얻어졌다(도 5a-도 5d).
도 6: A549 세포(도 6a) 및 HepG2 세포(도 6b)에서의 루시페라제의 발현에 대한 TISU 요소의 효과를 나타낸다. 인간 폐포 상피 세포주(A549) 및 인간 간세포 암종 세포주(HepG2)를 각각 20,000 세포/웰 및 40,000 세포/웰의 밀도로 96 웰 플레이트에 접종하였다. 접종 후 24 시간에, Lipofectamine2000을 사용하여 상이한 루시페라제 코딩 SNIM RNA 작제물로 세포를 형질감염시켰다(X-축은 96 웰 플레이트의 웰당 SNIM RNA의 ng 양을 나타냄). 형질감염 후 24 시간에 루시페라제 발현을 측정하였다. 값은 형질감염 용량에 대해 플로팅하였고 GraphPad Prism을 통해 데이터를 분석하였다. 표시된 바와 같이 상이한 루시페라제 코딩 mRNA로 A459(a) 및 HepG2(b) 세포를 형질감염시켰다.
도 7: 상이한 루시페라제 코딩 mRNA 작제물을 이용한 마우스에서의 생체내 실험의 결과를 나타낸다. 도 7에 표시된 바와 같은 루시페라제 작제물(각각의 UTR 서열 요소에 대해서는 도 1을 참조함)을 Balb/c 마우스(자성, 6-8 주)에서 생체내 시험하였다. 이 실험의 세트를 위해, 이식유전자 발현을 향상시키는 것으로 입증된 부가적인 UTR 요소(국제 공개 제WO 2012/170930 A1호) 또한 그의 효율에 대해 시험하였다. 이 UTR 요소를 함유하는 루시페라제 작제물을 Luc2-SUSA라고 표기하였다. 20 ㎍의 각각의 SNIM-RNA를 LF-44와 복합체화하고 Balb/c 마우스 내로 정맥내 주사하였다. 주사 후 6 시간에 IVIS 영상화 시스템을 채용하여 생체내 영상화를 수행하고 광자/sec/cm2/sr로서 정량화된 값을 플로팅하였다. 전체 동물 영상화로부터의 결과는 도 7a에 나타내고 전체 기관의 영상화로부터의 결과는 각각 도 7b(간), 도 7c(폐), 도 7d(비장)에 나타낸다.
동물로부터 취한 기관을 액체 질소에 냉동하고 균질화하였다. 트리스-HCl 용해 완충제 중에 세포를 용해시키고 루시페라제 활성을 측정하였다. 결과는 각각 도 7e(간), 도 7f(폐), 도 7g(비장)에 나타낸다.
TISU 요소의 삽입은 이전에 공개된 5' 및 3' UTR(국제 공개 제2012/170930 A1호)에 비교하여 더 높은 발현을 유발했다. C와 코작 사이의 단일 T의 부가(도 1로부터의 서열 번호 4)는 인간 알파 글로빈 UTR(도 1로부터의 서열 번호 8)에 의해 관찰된 것과 유사한 발현 수준을 유발한다. 서열 번호 4 내로의 TISU 요소의 부가(도 1)는 발현을 추가로 증가시켰다(도 1로부터의 서열 번호 9). 인간 알파 글로빈 UTR의 효과는 서열 특이적인 것으로 판명되지 않았다는 것이 의외로 발견되었다. 무작위 30개 뉴클레오티드 서열은 인간 알파 글로빈 5'UTR과 유사한 발현 수준을 지원했다.
세포주에서의 시험관내 결과 및 마우스에서의 생체내 실험을 기반으로, 전사체 요법을 위한 "최소 UTR"을 보유하는 서열에 대한 유망한 후보로서 서열 번호 1, 4, 7, 및 9(도 1)가 제안된다. 이들 최소 UTR 서열은 시험관내 전사 중에 RNA 수율에 대한 부정적 효과가 없으며, 생성되는 mRNA는 선행 기술 UTR을 함유하는 mRNA에 비교하여 훨씬 더 효율적으로 번역된다.
도 8: 상이한 루시페라제 코딩 mRNA 작제물을 이용한 마우스로부터의 백혈구 계수(WBC)(도 8a), 적혈구(RBC)(도 8b), 혈소판(도 8c), 헤모글로빈(도 8d), 및 적혈구용적률(도 8e) 값을 나타낸다. 본질적으로 도 7에 기재된 바와 같이 실험을 수행하였으며, Sysmex KX-21N™ 자동 혈액 분석기(미국 일리노이주 소재)를 채용하여 혈액 파라미터를 분석하였다.
도 9: 매우 높은 EPO 발현을 지원하는 것으로 알려진 (국제 공개 제2012/170930 A1호: 도 1 및 도 2)(SUSA UTR)로부터의 5' 및 3' UTR을 함유하는 인간 EPO 암호화 mRNA로부터의 것에 비교하여 TISU 요소 함유 인간 EPO 암호화 mRNA를 이용한 발현 실험을 나타낸다.
인간 폐포 상피 세포주(A549) 및 인간 간세포 암종 세포주(HepG2)를 각각 20,000 세포/웰 및 40,000 세포/웰의 밀도로 96 웰 플레이트에 접종하였다. 접종 후 24 시간에, Lipofectamine2000을 사용하여 250 ng의 상이한 EPO 코딩 SNIM RNA 작제물로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 24 시간에 ELISA(R&D Systems(미국 미네소타주 소재)로부터의 인간 에리트로포이에틴 Quantikine IVD ELISA 키트)를 통해 EPO 양을 정량화하고 GraphPad Prism을 통해 데이터를 분석하였다. 값은 3회 반복실험의 평균 ± SD를 나타낸다.
도 10: 인간 OTC를 이용한 발현 실험을 나타낸다. 인간 OTC의 경우, TISU 요소 함유 hOTC 암호화 mRNA로부터의 발현을 지금까지 알려진 다른 모든 조합에 비교하여 최고의 발현을 산출하는 것으로 알려진 5' 인간 알파 글로빈 UTR을 함유하는 hOTC 암호화 mRNA로부터의 발현에 비교하였다.
인간 간세포 암종 세포주(HepG2)를 96 웰 플레이트에 접종하고 접종 후 24 시간에 Lipofectamine2000을 사용하여 상이한 hOTC 암호화 SNIM RNA 작제물로 세포를 형질감염시켰다. 형질 감염 후 24 h에 세포를 용해시키고 웨스턴 블롯을 사용하여 OTC 양을 정량화하였다.
hAg 및 TISU 요소 함유 hOTC 암호화 SNIM RNA 양자 모두가 유사한 수준의 hOTC 발현을 유발했다(도 10a). 빈쿨린을 하우스키퍼(housekeeper)로 사용하였고 밴드 강도를 정량화하여 내부 정량화 표준으로 사용하였다(도 10b).
도 11: 서열 7 내에 존재하는 무작위 30개 뉴클레오티드 길이의 스페이서(좌측) 및 서열 8 내에 존재하는 인간 알파 글로빈의 5'UTR(우측)의 예측된 2차 구조.
본 발명의 다른 태양 및 이점을 하기 실시예에서 기재할 것이며, 이는 제한으로서가 아니라 예시의 목적으로 제공된다. 본 출원에 인용된 각각의 간행물, 특허, 특허 출원, 또는 다른 문서는 원용에 의해 전체적으로 본 명세서에 포함된다.
실시예
I. 재료 및 방법
플라스미드 벡터
각각의 5' UTR 서열은 코돈 최적화 루시페라제 서열과 함께 GeneScriptG(미국 뉴저지주 소재)에 의해 합성되었으며 pUC57-Kan(GeneScript)에 클로닝되었다. EPO(코돈 최적화 인간 에리트로포이에틴) 및 OTC(코돈 최적화 인간 오르니틴 트랜스카바밀라제)의 경우에 코딩 서열 루시페라제 유전자는 각각 EPO(서열 번호 35) 및 OTC(서열 번호 36) 유전자의 코딩 서열에 의해 대체되었다. 작제물에 사용된 UTR 서열을 각각의 루시페라제 리포터 작제물의 명칭과 함께 도 1에 나타낸다.
mRNA 제조
시험관내 전사된 mRNA(IVT mRNA)를 생성하기 위해, 플라스미드 BstBI 분해에 의해 플라스미드를 선형화하고 클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 정제하였다. RiboMax 대규모 RNA 제조 시스템-T7(독일 소재의 Promega)을 사용하는 시험관내 전사에 정제된 선형 플라스미드를 주형으로 사용하였다. 항-역전 캡 유사체(ARCA: Anti-Reverse Cap Analog)를 반응 혼합물에 첨가하여 5' 캡핑된 mRNA를 생성하고 mRNA를 폴리아데닐화하여(Thermo Scientific) 3' 폴리-A 테일을 생성하였다.
부가적으로 SNIM mRNA의 생성을 위해, 화학적으로 개질된 뉴클레오티드, 즉, 메틸-CTP 및 티오-UTP(독일 소재의 Jena Bioscience)를 7.57 mM:5.68 mM:5.68 mM:1.89 mM:1.89 mM:1.21 mM의 ATP:CTP:UTP:메틸-CTP:티오-UTP:GTP의 최종 농도로 첨가하였다. 완전한 IVT 혼합물을 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션한 후에 DNaseI로 20 분 동안 37 ℃에서 DNA 분해하였다. 암모늄 아세테이트(최종 농도 2.5 M)로 RNA를 침전시키고 70% EtOH로 세척하였다. 세척 단계는 2회 수행하였다. 최종적으로, RNA 펠렛을 RNAse가 없는 물에 재현탁하였다. 모든 mRNA를 1% 아가로스 겔 상에서 검증하였다. 전사된 RNA는 약 25%의 우리딘 잔기가 2-티오우리딘(s2U)이고 약 25%의 시티딘 잔기가 5-메틸시티딘(m5C)이도록 화학적으로 개질된다. UTR의 서열은 도 1에 제공된다.
시험관내 형질감염
인간 폐포 상피 세포주(A549) 및 인간 간세포 암종 세포주(HepG2)를 각각 20,000 세포/웰 및 40,000 세포/웰의 밀도로 96 웰 플레이트에 접종하였다. 접종 후 24 시간에, 상업적인 형질감염 시약 LipofectamineTM2000을 2.5 ㎕ LipofectamineTM2000/1 ㎍ mRNA의 비로 사용하여 상이한 루시페라제 코딩 SNIM RNA 작제물로 세포를 형질감염시켰다(도 2 내지 도 6에서 X-축은 96 웰 플레이트의 웰당 SNIM RNA의 ng 양을 나타냄). 복합체 형성은 하기와 같이 제조하였다: OptiMEM 형질감염 배지에 LipofectamineTM2000 및 mRNA를 별도로 희석하여 각각 45 ㎕의 총 부피가 되게 하였다. 이들 혼합물을 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, LipofectamineTM2000 용액을 mRNA 용액과 혼합한 후에, 실온에서 추가로 20 분 동안 인큐베이션하였다. 90 ㎕의 총 형질감염 부피로 37 ℃(5% CO2 수준)에서 1 시간 동안 세포를 인큐베이션하였다. 그 후에 형질감염 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척하였다. 후속적으로, 10% FBS를 함유하는 라이보비츠 L-15 배지와 함께 세포를 재-인큐베이션하였다.
세포 배양
인간 폐포 선암종 세포주(A549, ATCC CCL-185)를 10% FBS로 보충된 햄 F12K 배지 중에 성장시켰다. 10% 우태아 혈청으로 보충된 DMEM 배지 중에 인간 간세포 암종 세포주(HepG2, ATCC HB-8065)를 배양하였다. 모든 세포주는 5% CO2 수준에서 가습 대기 중에 성장시켰다.
생물발광 측정
반딧불이 루시페라제(FFL)는 포유동물에 내인성으로 존재하지 않으며 발광 영상화에 의해 용이하게 검출될 수 있는 통상의 리포터 단백질이다. 루시페라제는 생물발광 방출을 유발하는 루시페린과 산소의 반응을 촉매한다.
인간 폐포 상피 세포주(A549) 및 인간 간세포 암종 세포주(HepG2)를 각각 20,000 세포/웰 및 40,000 세포/웰의 밀도로 96 웰 플레이트에 접종하였다. 접종 후 24 시간에, Lipofectamine2000을 사용하여 상이한 루시페라제 코딩 SNIM RNA 작제물로 세포를 형질감염시켰다(X-축은 96 웰 플레이트의 웰당 SNIM RNA의 ng 양을 나타냄). 형질감염 후 24 시간에 생물발광을 측정하였다. 값은 형질감염 용량에 대해 플로팅하였고 GraphPad Prism을 통해 데이터를 분석하였다.
균질화된 조직 용해물에서 루시페라제 발현을 정량화하기 위해, 동물로부터 기관을 취하고, 액체 질소에 냉동하고, 균질화하고 용해 완충제(0,1% Tritron-X100을 가진 25 mM 트리스-HCl pH 7.5) 중에 세포를 용해시켰다.
동물
주령이 6 내지 8 주인 자성 BALB/c 마우스를 Janvier(Route Des Chenes SecsBP5, F-53940 Le Genest St. Isle, France)로부터 입수하고, 특이적 병원체가 없는 조건 하에 유지하였다. 실험 전에 적어도 7 일 동안 마우스를 동물 시설의 환경에 적응시켰다. 모든 동물 절차는 지역 윤리 위원회에 의해 승인되고 제어되었으며 독일 동물 생명 보호법(law of protection of animal life)의 지침에 따라 실행되었다.
리피도이드 ( Lipidoid ) 제형화
하기와 같이 리피도이드를 mRNA와 함께 제형화하였다: C12-(2-3-2), DOPE, Chol, 및 DSPE-PEG2k(3.6:0.18:0.76:1 중량비)를 에탄올에 용해시키고, 20%의 최종 에탄올 농도가 산출되도록 10.5의 지질/mRNA 중량비로 반딧불이 루시페라제를 암호화하는 화학적으로 개질된 mRNA를 포함하는 시트레이트-완충 용액(10 mM 시트르산, 150 mM NaCl, pH=4.5) 내로 신속하게 주사하고, 물에 대해 투석하였다. 생성되는 리피도이드/mRNA 복합체는 양성 하전된 나노입자(92.6 ± 0.7 nm; 21.0 ± 0.2 mV)를 유발하였고, 고정시킨 마우스의 꼬리 정맥 내로 정맥내 주사되었다. 제2 실험에서는, 리피도이드/mRNA 복합체를 정맥내 주사 전에 PBS에 조정하였으며, 이는 거의 하전되지 않은 나노입자(91.5 ± 0.6 nm; -0.7 ± 0.2 mV)를 유발하였다.
생체내 생물발광 영상화를 사용하는 마우스에서의 Luc 활성의 측정
투여 후 24 시간에 메데토미딘(11.5 ㎍/kg BW), 미다졸람(115 ㎍/kg BW), 및 펜타닐(1.15 ㎍/kg BW)의 복강내 주사에 의해 마우스를 마취하였다. D-루시페린 기질(마우스당 3 mg/100 ㎕ PBS)을 정맥내 주사에 의해 적용하였다. 10 분 후에 IVIS 100 영상화 시스템(미국 알라메다 소재의 Xenogen) 및 하기 카메라 설정을 사용하여 생물발광을 측정하였다: Bin(HS), 시야 10, f1 f-스톱, 고해상도 비닝, 및 5 min의 노출-시간. Living Image Software 버전 2.50(미국 알라메다 소재의 Xenogen)을 사용하여 신호를 정량화하고 분석하였다.
OTC 단백질의 웨스턴 블롯 분석
냉동된 플레이트를 해동시키고 플레이트 내에서의 직접 세포 용해를 수행하였다. 프로테아제 저해제(cOmplete, 무-EDTA, 독일 소재의 Roche Diagnostics) 및 DNase(DNase I 용액(2500 U/mL), 미국 소재의 Thermo Fisher)로 보충된 용해 완충제(25 mM 트리스, 0.1% Triton-X 100, 독일 소재의 Sigma-Aldrich)를 사용하여 단백질을 용해시켰다. 용해 후에 샘플을 NuPage® LDS 샘플 완충제 및 샘플 환원제(미국 소재의 Thermo Fisher)와 혼합하고 10 min 동안 70 ℃에서 가열하였다. 15 ㎕의 용해물을 사용하여 XCell4 SureLock™ 미디, Bio-Rad Criterion™ 시스템(미국 소재의 Thermo Fisher)을 이용하는 NuPAGE 10% 비스-트리스 미디 겔 상에서 겔 전기영동을 수행하였다. TransBlot® Turbo™ 전달 시스템(독일 소재의 Biorad)을 사용하여 30 min 동안 단백질을 전달하였다. 전달 후에 NET-젤라틴으로 30 min 동안 막을 블로킹한 후, NET-젤라틴에 1:2000 희석된 1차 항체(OTC 다클론 항체(중앙), AP6928c-AB, 독일 소재의 Biocat)와 함께 막을 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. NET-젤라틴을 이용한 3회의 세척 단계 후에, NET-젤라틴에 1:10,000 희석된 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합 2차 항체(염소 항-토끼 IgG-HRP, sc-2004, 미국 소재의 Santa Cruz Biotechnology)를 RT에서 1 h 동안 첨가하였다. 신호가 화학발광 기질 키트(Luminata Crescendo 웨스턴 HRP 기질, 독일 소재의 Merck Millipore)로 가시화될 때까지 막을 NET-젤라틴으로 다시 3회 세척하고 ChemiDoc™ MP 시스템(독일 소재의 Biorad)을 사용하여 가시화하였다.
재료
FBS, 라이보비츠 L-15 배지(Gibco), LipofectamineTM2000, 및 OptiMEM( Gibco)는 독일 소재의 Invitrogen으로부터 구입하였다. 멸균 PBS는 자체 제조하였다. 햄 F-12K, DMEM, 및 트립신-EDTA는 독일 소재의 c.c.pro GmbH로부터 구입하였다.
II. 결과
II.a 세포 배양 실험
도 2a 및 도 2b는 T7 프로모터와 코작 요소 사이의 여분의 "C"가 필수적임을 나타낸다. 그 염기의 결실은 비교한 세포 유형 양자 모두에서 감소된 발현을 유발한다. 양자 모두의 작제물(도 1로부터의 서열 번호 1 및 2)에 대해, 비교 및 편의를 위해 전체 용량 범위 및 선형 범위(배제된 값: 분석으로부터 배제된 62,5 ng/웰보다 더 높은 적용량)가 별도로 제공된다. A549 및 HepG2 세포 양자 모두에서, C의 결실은 더 낮은 발현을 유발했다. 그러므로 이 여분의 C는 모든 추가의 작제물의 설계에 포함되었다.
A549 및 HepG2 세포에서 얻어진 결과를 기반으로, 여분의 "C"(서열 번호 1: T7Luc2)를 함유하는 작제물로 추가의 실험을 수행하였다.
도 3 및 도 4.
서열 1을 주형으로 사용하였으며, 이 서열에는 단일 뉴클레오티드(A, T, G, 또는 C: 각각 도 1로부터의 서열 번호 3 - 6), 또는 길이가 30개 뉴클레오티드이고 임의의 예측가능한 2차 구조(서열 7) 또는 인간 알파 글로빈으로부터의 5' UTR(서열 8)이 없는 무작위 서열이 조사되는 "C"와 코작 요소 사이에 혼입되었다.
재료 및 방법에 기재된 바와 같이 세포를 형질감염시키고 루시페라제 어세이를 수행하였다. 더 높은 용량은 선형 범위를 벗어났으므로, 최대 62,5 ng/웰의 용량 반응만 여기에 제공된다. 인간 알파 글로빈으로부터의 5'UTR을 양성 대조군으로 사용하였다.
상기 결과를 요약하면, 도 1 내지 도 4는, 최소한의 5'UTR을 채용함으로써 높은 단백질 발현을 달성함에 관련하여 T7 프로모터와 코작 요소 사이의 여분의 "C"가 필수적임을 나타낸다. 그 뉴클레오티드의 결실은 감소된 발현을 유발한다. 여분의 "C"와 코작 요소 사이에 여분의 "A"를 부가하는 것은 발현에 부정적 영향을 준다. 그 위치에 피리미딘 염기, 가장 바람직하게 "T"를 부가할 경우, hAg로부터의 5'UTR에 의해 관찰된 것들과 유사한 수준이 얻어진다.
후속적으로,
- 최상의 작동 서열(서열 9)과 조합될 경우에 TISU 요소의 효과를 규명하고,
- hAg로부터의 5' UTR의 효과가 서열 특이적 효과인지, 또는 5'캡과 시작 코돈 사이의 거리가 중요한지를 결정하기 위해 부가적인 실험을 수행하였다.
도 5는 A549 세포에서 루시페라제의 발현에 대한 TISU 요소의 효과를 나타낸다. "TISU 요소"는 도 1에 나타낸 바와 같은 서열 번호 4에 비교하여 도 1에 나타낸 바와 같은 서열 번호 9에서 "CC" 대신에 "AG"를 혼입시킨다. A549 세포(도 5a 및 도 5b)와 더불어 HepG2 세포(도 5c 및 도 5d)는, 형질감염 후 24(a, c) 및 48(b, d) 시간에 서열 번호 1로부터의 "C" 및 이 "C"와 코작 요소 사이의 부가적인 "T"와 함께 TISU 요소를 함유하는 루시페라제 작제물에 의한 유의적으로 더 높은 루시페라제 발현을 나타냈다.
도 6은, 인간 알파 글로빈 UTR(도 1로부터의 서열 8)과 동일한 길이의 무작위 서열(도 1로부터의 서열 7)의 병렬 비교를 가능하게 하기 위해, 도 5 로부터의 것과 동일하나 30개 뉴클레오티드 무작위 서열을 함유하는 5'UTR을 부가한 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 표시된 바와 같이 형질감염 후 24 시간에 SNIM RNA로 HepG2(도 6a) 및 A549 세포(도 6b)에서 루시페라제 발현을 측정하였다.
도 9는, 각각의 SNIM RNA로 A549 및 HepG2 세포를 형질감염시킨 후에 표준으로 사용된 (국제 공개 제2012/170930 A1호: 도 1 및 도 2)(SUSA UTR)로부터의 5' 및 3' UTR을 함유하는 hEPO 암호화 mRNA의 것에 비교하여 TISU 요소 함유 hEPO 암호화 mRNA를 이용한 발현 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 형질감염 후 24 시간에 ELISA를 통해 EPO 양을 정량화하였다. 값은 3회 반복실험의 평균 ± SD를 나타낸다.
인간 A549 세포에서, TISU 요소의 혼입은 5' 및 3' UTR의 혼입에 의해 달성된 것에 비교하여 더 높은 발현을 유발했다(도 9a). 유사한 수준의 발현이 HepG2 세포에서 관찰되었다(도 9b). SUSA 5' 및 3' UTR의 혼입은 본 발명에 따른 UTR에 비교하여 RNA를 약 200개 뉴클레오티드 더 길게 만드므로, 이는 본질적으로 의외이다.
도 10은 인간 OTC를 이용한 발현 실험을 나타낸다. 비교를 위해 TISU 요소 함유 hOTC 암호화 mRNA를 지금까지 알려진 다른 모든 조합에 비교하여 최고의 발현을 산출하는 것으로 알려진 5' 인간 알파 글로빈 UTR을 함유하는 hOTC 암호화 mRNA로부터의 것에 비교하였다.
HepG2 세포를 상이한 hOTC 암호화 SNIM RNA 작제물로 형질감염시키고, 24 시간 후에 용해시키고, 웨스턴 블로팅에 의해 OTC 양을 정량화하였다.
hAg 및 TISU 요소 함유 hOTC 암호화 SNIM RNA 양자 모두가 유사한 수준의 hOTC 발현을 유발했다(도 10a). 빈쿨린을 하우스키퍼로 사용하였고 밀도측정법(densitometry)을 사용하여 밴드 강도를 비교하였다(도 10b).
II.b 마우스에서 Luc2 작제물의 IV 적용
결과는 도 7 및 도 8에 나타낸다.
하기 작제물이 마우스에서의 IV 적용에 사용되었다:
Luc2(+8+A)
Luc2(+8+T)
Luc2(+8+T) + TISU
Luc2-hAg
Luc2-Sp30
Luc2-SUSA UTR
20 ㎍의 각각의 SNIM-RNA를 LF-44와 복합체화하고 Balb/c 마우스 내로 IV 주사하였다. 부가적인 대조군으로서, 5'단부에서 인간 CMV 인핸서(Luc2-SUSA) 및 3'단부에서 인간 성장 호르몬 3'UTR에 인접한 Luc2 서열 또한 제조하였다. 이 작제물에서 UTR로 사용된 서열은 Shire 특허(제WO 2012/170930 A1호: 서열 번호 1 / 도 1)로부터 취하였다.
주사 후 6 시간에 IVIS 영상화 시스템을 채용하여 생체내 영상화를 수행하고 광자/sec/cm2/sr로서 정량화된 값을 플로팅하였다. 전체 동물 영상화로부터의 결과는 도 7a에 나타내고 전체 기관의 영상화로부터의 결과는 각각 도 7b(간), 도 7c(폐), 도 7d(비장)에 나타낸다.
동물로부터 취한 기관을 액체 질소에 냉동하고, 균질화하고, 용해시키고, 루시페라제 활성을 측정하였다. 결과는 각각 도 7e(간), 도 7f(폐), 도 7g(비장)에 나타낸다.
Sysmex KX-21N™ 자동 혈액 분석기를 채용하여 동물의 혈액 파라미터를 분석하였다: 상이한 루시페라제 코딩 mRNA 작제물에 의한 마우스로부터의 백혈구 계수(WBC)(도 8a), 적혈구(RBC)(도 8b), 혈소판(도 8c), 헤모글로빈(도 8d), 및 적혈구용적률(도 8e) 값은 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
도 11: 서열 7 내에 존재하는 무작위 30개 뉴클레오티드 길이의 스페이서(좌측) 및 서열 8 내에 존재하는 동일한 길이의 인간 알파 글로빈의 5'UTR(우측)의 예측된 2차 구조. 양자 모두의 서열의 2차 구조는 심지어 유사하지도 않지만, 그들은 유사한 발현 수준을 유발했으며(도 6a 및 도 6b), 이는 T7Luc2(+8+T)-TISU에 비교하여 양자 모두 동일하게 낮았다.
SEQUENCE LISTING <110> ETHRIS GMBH <120> NOVEL MINIMAL UTR SEQUENCES <130> IPA181077-DE <150> EP 16163264.1 <151> 2016-03-31 <150> EP 16177094.6 <151> 2016-06-30 <160> 45 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..7 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="Minmal UTR1" /organism="Artificial Sequence" <400> 1 cgccacc 7 <210> 2 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..8 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="Minimal UTR2" /organism="Artificial Sequence" <220> <221> variation <222> 2 <223> /replace="A" /replace="T" /replace="C" /replace="G" <400> 2 cngccacc 8 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..23 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="T7 promoter" /organism="Artificial Sequence" <400> 3 taatacgact cactataggg aga 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..23 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="T3 promoter" 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17 <210> 17 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..16 <223> /mol_type="unassigned RNA" /note="Reverse complementary sequence of the alternative minimal UTR1 including TISU element" /organism="Artificial Sequence" <400> 17 caucucggcg ucuccc 16 <210> 18 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..17 <223> /mol_type="unassigned RNA" /note="Reverse complementary sequence of the alternative minimal UTR2 including TISU element" /organism="Artificial Sequence" <220> <221> variation <222> 10 <223> /replace="U" /replace="G" /replace="C" /replace="A" <400> 18 caucucggcn gucuccc 17 <210> 19 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..14 <223> /mol_type="unassigned RNA" /note="Reverse complementary sequence of minimal UTR1" /organism="Artificial Sequence" <400> 19 caugguggcg uccc 14 <210> 20 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..15 <223> /mol_type="unassigned RNA" /note="Reverse complementary sequence of minimal UTR2" /organism="Artificial Sequence" <220> <221> variation <222> 10 <223> /replace="A" /replace="C" /replace="G" /replace="U" <400> 20 caugguggcn guccc 15 <210> 21 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..14 <223> /mol_type="unassigned RNA" /note="Reverse complementary sequence of minimal UTR1 including TISU element" /organism="Artificial Sequence" <400> 21 caucuuggcg uccc 14 <210> 22 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..15 <223> /mol_type="unassigned RNA" /note="Reverse complementary sequence of minimal UTR2 including TISU element" /organism="Artificial Sequence" <220> <221> variation <222> 10 <223> /replace="A" /replace="C" /replace="G" /replace="U" <400> 22 caucuuggcn guccc 15 <210> 23 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..14 <223> /mol_type="unassigned RNA" /note="Reverse complementary sequence of the alternative minimal UTR1" 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/replace="U" <400> 26 caucucggcn guccc 15 <210> 27 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..14 <223> /mol_type="unassigned RNA" /note="Reverse complementary sequence of minimal UTR1" /organism="Artificial Sequence" <400> 27 caugguggcg cuuc 14 <210> 28 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..15 <223> /mol_type="unassigned RNA" /note="Reverse complementary sequence of minimal UTR2" /organism="Artificial Sequence" <220> <221> variation <222> 10 <223> /replace="A" /replace="C" /replace="G" /replace="U" <400> 28 caugguggcn gcuuc 15 <210> 29 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..14 <223> /mol_type="unassigned RNA" /note="Reverse complementary sequence of minimal UTR1 including TISU element" /organism="Artificial Sequence" <400> 29 caucuuggcg cuuc 14 <210> 30 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..15 <223> /mol_type="unassigned RNA" /note="Reverse complementary sequence of minimal UTR2 including TISU element" /organism="Artificial Sequence" <220> <221> variation <222> 10 <223> /replace="A" /replace="C" /replace="G" /replace="U" <400> 30 caucuuggcn gcuuc 15 <210> 31 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..14 <223> /mol_type="unassigned RNA" /note="Reverse complementary sequence of the alternative minimal UTR1" /organism="Artificial Sequence" <400> 31 cauggcggcg cuuc 14 <210> 32 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..15 <223> /mol_type="unassigned RNA" /note="Reverse complementary sequence of the alternative minimal UTR2" /organism="Artificial Sequence" <220> <221> variation <222> 10 <223> /replace="A" /replace="C" /replace="G" /replace="U" <400> 32 cauggcggcn gcuuc 15 <210> 33 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..14 <223> /mol_type="unassigned RNA" /note="Reverse complementary sequence of the alternative minimal UTR1 including TISU element" /organism="Artificial Sequence" <400> 33 caucucggcg cuuc 14 <210> 34 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..15 <223> /mol_type="unassigned RNA" /note="Reverse complementary sequence of the alternative minimal UTR2 including TISU element" /organism="Artificial Sequence" <220> <221> variation <222> 10 <223> /replace="A" /replace="C" /replace="G" /replace="U" <400> 34 caucucggcn gcuuc 15 <210> 35 <211> 637 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..637 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="T7-TISU-hEPO (codon optimized)" /organism="Artificial Sequence" <400> 35 gtgactagat cttaatacga ctcactatag ggagactgcc aagatgggcg tgcacgaatg 60 tcctgcttgg ctgtggctgc tgctgagcct gctgtctctg cctctgggac tgcctgtgct 120 gggagcccct cctagactga tctgcgacag ccgggtgctg gaaagatacc tgctggaagc 180 caaagaggcc gagaacatca ccaccggctg cgccgagcac tgcagcctga acgagaatat 240 caccgtgccc gacaccaaag tgaacttcta cgcctggaag cggatggaag tgggccagca 300 ggctgtggaa gtgtggcagg gactggccct gctgagcgaa gctgtgctga gaggacaggc 360 tctgctcgtg aacagcagcc agccttggga gcctctgcag ctgcacgtgg acaaggccgt 420 gtctggcctg agaagcctga ccacactgct gagagccctg ggggcccaga aagaggccat 480 ctctccacct gatgccgcct ctgccgcccc tctgagaacc atcaccgccg acaccttcag 540 aaagctgttc cgggtgtaca gcaacttcct gcggggcaag ctgaagctgt acacaggcga 600 ggcctgccgg accggcgata gataattcga agtgact 637 <210> 36 <211> 1120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..1120 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="T7-TISU-hOTC (codon optimized)" /organism="Artificial Sequence" <400> 36 gtgactgcta gctaatacga ctcactatag ggagactgcc aagatgctgt tcaacctgcg 60 gatcctgctg aacaacgccg ccttccggaa cggccacaac ttcatggtgc gcaacttcag 120 atgcggccag cccctgcaga acaaggtgca gctgaagggc agggacctgc tgaccctgaa 180 gaacttcacc ggcgaagaga tcaagtacat gctgtggctg agcgccgacc tgaagttccg 240 gatcaagcag aagggcgagt acctgcccct gctgcagggc aagtctctgg gcatgatctt 300 cgagaagcgg agcacccgga cccggctgtc taccgagaca ggatttgccc tgctgggcgg 360 ccacccttgc tttctgacca cccaggatat ccacctgggc gtgaacgaga gcctgaccga 420 cacagccaga gtgctgagca gcatggccga tgccgtgctg gccagagtgt acaagcagag 480 cgacctggac accctggcca aagaggccag catccccatc atcaacggcc tgtccgacct 540 gtaccacccc atccagatcc tggccgacta cctgaccctg caggaacact acagctccct 600 gaagggcctg acactgagct ggatcggcga cggcaacaac atcctgcact ctatcatgat 660 gagcgccgcc aagttcggca tgcatctgca ggccgccacc cccaagggct atgagcctga 720 tgccagcgtg accaagctgg ccgagcagta cgccaaagag aacggcacca agctgctgct 780 gaccaacgac cctctggaag ccgcccacgg cggcaatgtg ctgatcaccg atacctggat 840 cagcatgggc caggaagagg aaaagaagaa gcggctgcag gccttccagg gctaccaagt 900 gaccatgaag accgccaaag tggccgccag cgactggacc ttcctgcact gcctgcccag 960 aaagcccgaa gaggtggacg acgaggtgtt ctacagcccc cggtccctgg tgtttcccga 1020 ggccgagaac cggaagtgga ccatcatggc tgtgatggtg tctctgctga ccgactactc 1080 cccccagctg cagaagccca agttctgaag cgctgtgact 1120 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..20 <223> 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source <222> 1..21 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="T7Luc2 (+8+C)" /organism="Artificial Sequence" <400> 42 tatagggaga ccgccaccat g 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..21 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="T7Luc2 (+8+Sp30)" /organism="Artificial Sequence" <220> <221> variation <222> 12 <223> /replace="sequence of a random sequence of 30 nucleotides" <400> 43 tatagggaga cngccaccat g 21 <210> 44 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..50 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="T7Luc2 (+8+hAg)" /organism="Artificial Sequence" <400> 44 tatagggaga ctcttctggt ccccacagac tcagagagaa cgccaccatg 50 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..21 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="T7Luc2 (+8+T)+TISU" /organism="Artificial Sequence" <400> 45 tatagggaga ctgccaagat g 21

Claims (17)

  1. (a) 폴리펩티드를 코딩(coding)하는, 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역; 및
    (b) 상기 코딩 서열의 바로 업스트림(upstream)에 있는,
    (b1) R1-CGCCACC(서열 번호 1);
    또는 상기 서열에서 서열 번호 1의 위치 6에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 1의 위치 7에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 1의 위치 5에서 A가 G에 의해 치환된 서열; 및
    (b2) 서열 번호 2의 위치 2에서 뉴클레오티드 N이 T, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 R1-CNGCCACC(서열 번호 2);
    또는 상기 서열에서 서열 번호 2의 위치 7에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 2의 위치 8에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 2의 위치 6에서 A가 G에 의해 치환된 서열로 구성된 그룹 중에서 선택되고,
    여기에서 R1은 DNA-의존성 RNA-폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터인 서열을 가진 하나의 가닥을 포함하거나 상보적인 가닥을 포함하며,
    여기에서 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터는
    (i) T7 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 TAATACGACTCACTATAGGGAGA(서열 번호 3);
    (ii) T3 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA(서열 번호 4);
    (iii) SP6 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 ATTTAGGTGACACTATAGAAG(서열 번호 5); 및
    (iv) K11 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 AATTAGGGCACACTATAGGGA(서열 번호 6)로 구성된 그룹 중에서 선택되는, mRNA로 전사될 수 있는 DNA 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    서열 번호 2의 위치 2에서 뉴클레오티드 N이 T, G, 또는 C로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드이고, 여기에서 뉴클레오티드 N은 A가 아닌 DNA 분자.
  3. 제2항에 있어서,
    서열 번호 2의 위치 2에서 상기 뉴클레오티드 N이 T인 DNA 분자.
  4. 제3항의 DNA 분자를 포함하는 벡터(vector).
  5. 제4항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 DNA 분자, 제4항에 따른 벡터, 또는 제5항에 따른 숙주 세포를 포함하는 조성물.
  7. (a) 폴리펩티드를 코딩하는, 그의 5' 단부에 시작 코돈을 포함하는 코딩 영역; 및
    (b) 상기 코딩 서열의 바로 업스트림에 있는,
    (b1) 서열 R2-CGCCACC(서열 번호 1)의 UTR,
    또는 상기 UTR 서열에서 서열 번호 1의 위치 6에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 1의 위치 7에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 1의 위치 5에서 A가 G에 의해 치환된 서열; 및
    (b2) 서열 번호 2의 위치 2에서 뉴클레오티드 N이 U, G, C, 또는 A로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드인 서열 R2-CNGCCACC(서열 번호 2)의 UTR, 또는 상기 UTR 서열에서 서열 번호 2의 위치 7에서 C가 A에 의해 치환되고 서열 번호 2의 위치 8에서 C가 G에 의해 치환되고/되거나; 서열 번호 2의 위치 6에서 A가 G에 의해 치환된 서열로 구성된 그룹 중에서 선택되며,
    여기에서 R2는 DNA-의존성 RNA-폴리머라제가 RNA 합성을 개시하는 뉴클레오티드로 시작되는 프로모터 영역의 부분에 상응하는 RNA 서열이고,
    여기에서 R2는
    (i) GGGAGA(서열 번호 7);
    (ii) GGGAGA(서열 번호 8);
    (iii) GAAG(서열 번호 9); 및
    (iv) GGGA(서열 번호 10)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 UTR을 포함하며;
    3' 단부에 폴리-A 테일(poly-A-tail)을 포함하는 RNA 분자.
  8. 제7항에 있어서,
    서열 번호 2의 위치 2에서 뉴클레오티드 N이 U, G, 또는 C로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드이고, 여기에서 뉴클레오티드 N은 A가 아닌 RNA 분자.
  9. 제8항에 있어서,
    서열 번호 2의 위치 2에서 상기 뉴클레오티드 N이 U인 RNA 분자.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리-A 테일의 길이가 적어도 120개 뉴클레오티드인 RNA 분자.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항의 RNA 분자를 암호화(encoding)하는 핵산 분자.
  12. 제11항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  13. 제12항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  14. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 RNA 분자, 제11항에 따른 핵산 분자, 제12항에 따른 벡터, 또는 제13항에 따른 숙주 세포, 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    RNA-기반 요법에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 DNA 분자, 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 RNA 분자, 제11항에 따른 핵산 분자, 제4항 또는 제12항에 따른 벡터, 또는 제5항 또는 제13항에 따른 숙주 세포를 포함하는 키트(kit).
  17. RNA 분자의 코딩 영역을 상기 코딩 영역에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 단백질로 번역하기 위한, 제7항 b에 정의된 바와 같은 UTR의 용도.
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