KR20180131269A - A method and kit for assessing risk of hepatocellular carcinoma using metabolite profiling - Google Patents

A method and kit for assessing risk of hepatocellular carcinoma using metabolite profiling Download PDF

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Abstract

The present invention relates to a diagnosis method for evaluating the risk level associated with liver cancer based in a specific biomarker. Provided is a method for evaluating the prognosis or risk level of liver cancer comprises the steps of: collecting a biological sample from a subject; (b) measuring the concentration of at least one metabolite selected from the group consisting of tyrosine, aspartate aminotransferase (AST), 5-hydroxyhexanoic acid, tauroursodeoxycholic acid, lysophosphatidylcholines 16 : 1, lysophosphatidylcholine 20 : 3, oleamide, and androsterone sulfate; and (c) comparing the measured level of the metabolite to a measured value of a normal control sample.

Description

대사체 프로파일링을 이용한 간암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트{A METHOD AND KIT FOR ASSESSING RISK OF HEPATOCELLULAR CARCINOMA USING METABOLITE PROFILING}METHOD AND KIT FOR ASSESSING RISK OF HEPATOCELLULAR CARCINOMA USING METABOLITE BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method and kit for evaluating the prognosis or risk of liver cancer using metabolic profiling,

본 발명은 특정 바이오마커의 농도를 측정하여 간암 관련 위험도를 평가하는 진단 방법 및 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a diagnostic method and a kit for evaluating the risk of liver cancer by measuring the concentration of a specific biomarker.

암은 세포주기가 조절되지 않아 세포분열을 계속 하는 질병으로, 주위 조직에 침윤하면서 빠르게 성장하고 신체 각 부위에 확산되거나 전이되어 생명을 위협한다. 간에 생긴 암을 간암이라고 하며, 간암은 세계적으로 발병률이 높은 암 가운데 하나이다. 한국에서 간암 사망률은 인구 10만 명당 23명으로 매우 높은 편이며, 한국인의 총 사망률의 약 10%는 간염, 간경화 및 간암과 관계되어 있다.Cancer is a disease in which the cell cycle is not regulated and continues cell division. It grows rapidly as it infiltrates the surrounding tissues and spreads or transits to each part of the body, threatening life. Cancer of the liver is called liver cancer, and liver cancer is one of the highest incidence cancer in the world. In Korea, liver cancer mortality rate is very high at 23 per 100,000 population, and about 10% of the total mortality rate of Koreans is related to hepatitis, liver cirrhosis and liver cancer.

간암은 다른 조직의 암이 간으로 전이되는 전이성 간암과 간세포 자체에서 암이 발생하는 원발성 간암(HCC; hepatocellular carcinoma)으로 분류할 수 있으나, 원발성 간암이 간암의 90%를 차지하기 때문에 대부분의 간암은 원발성 간암(HCC)을 의미한다.Hepatocellular carcinomas can be classified as hepatocellular carcinoma (HCC) in which metastatic hepatocellular carcinoma originating from hepatocellular carcinoma and metastatic hepatocellular carcinoma in which other cancers are transferred to the liver. However, since primary hepatocellular carcinoma accounts for 90% Means primary liver cancer (HCC).

간암의 원인은 B형간염 및 C형간염 바이러스, 알코올성 간질병, 대사성 만성 간질병, 독성물질 등이 있다. B 형간염 및 C 형간염 바이러스는 만성 간염이나 간경화증과 같은 만성 간질환이나 간암을 일으킬 수 있는 바이러스로, 주로 아시아 지역과 아프리카 지역에 감염자가 많다. 한국의 간암 환자의 65~80%는 B 형간염 항원 보균자로 알려져 있다.Causes of liver cancer include hepatitis B and hepatitis C virus, alcoholic epilepsy, metabolic chronic epilepsy, and toxic substances. Hepatitis B and C viruses can cause chronic liver disease or liver cancer such as chronic hepatitis or cirrhosis, and many people are infected mainly in Asia and Africa. Of the hepatocellular carcinoma patients in Korea, 65-80% are known to be carriers of hepatitis B antigens.

그러나 최근에는 비만, 당뇨병 등이 증가하면서 대사성 만성 간질병으로 인한 간암환자가 증가하고 있다. 대사증후군이 점진적으로 진행되어 대사성 만성 간질병을 일으키고, 장기적으로 간암이 발생할 수 있다. 대사증후군은 여러 가지 신진대사와 관련된 질환이 함께 동반되는 것으로 고혈압 및 당뇨병을 비롯한 당대사 이상 등 각종 성인병이 복부비만과 함께 동시 다발적으로 나타난 상태를 말한다.However, in recent years, obesity, diabetes mellitus, etc. have increased, and liver cancer patients due to metabolic chronic epilepsy are increasing. The metabolic syndrome progresses progressively, causing metabolic chronic epilepsy, and liver cancer may develop in the long term. Metabolic syndrome is associated with various metabolic diseases, such as hypertension, diabetes and other metabolic disorders such as diabetes mellitus with abdominal obesity and concurrently refers to the state of simultaneous occurrence.

간암은 생존율이 낮고, 예후가 나쁜 질병이기 때문에 예방과 조기발견이 중요하다.Because liver cancer has a low survival rate and poor prognosis, prevention and early detection are important.

간암을 조기에 진단하는 방법으로서 신규 바이오마커에 대한 연구가 진행되고 있다. 바이오마커는 일반적으로 단백질이나 DNA, RNA, 대사물질 등을 이용해 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표를 의미하며, 바이오마커를 활용하면 대상체의 정상 또는 병리적인 상태, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정할 수 있다. 바이오마커는 특정 질병의 내적 표현형이라고 불리며, 특정 질병의 원인을 찾거나 발병 위험도를 측정하는데 이용될 수 있다.Research on new biomarkers as a method for early diagnosis of liver cancer is underway. Biomarkers are generally indicators of changes in the body through the use of proteins, DNA, RNA, and metabolites. By using biomarkers, we can objectively determine the normal or pathological state of a subject, Can be measured. Biomarkers are called internal phenotypes of certain diseases and can be used to find the cause of a specific disease or to measure the risk of an onset.

세포 내의 대사물질과 대사회로를 총체적으로 분석하는 대사체학(metabolomics)은 질병의 바이오마커를 검출하는데 널리 사용되고 있다. 암 발병 시기에 특이적으로 다량 또는 소량으로 존재하는 대사체를 암 특이적 마커로 사용할 수 있으며, 암이 발병되었는지 의심되는 환자로부터 생물학적 시료를 채취하여 암 특이적 마커의 변화 양상을 관찰함으로써 암의 유무를 예측할 수 있다. 간암을 진단하는 특이적 마커로 DNA, mRNA, 및 단백질이 연구되어 왔으나, 간암 환자 및 건강한 사람 간의 대사체 변화에 대한 포괄적인 이해는 아직 미흡한 상태이다.Metabolomics, which collectively analyze metabolites and metabolic circuits in cells, are widely used to detect biomarkers of disease. A specific amount of a metabolite present in a large amount or a small amount at the onset of cancer can be used as a cancer specific marker and a biological specimen can be taken from a patient suspected of having developed cancer to observe the change pattern of a cancer- . DNA, mRNA, and proteins have been studied as specific markers for the diagnosis of liver cancer. However, comprehensive understanding of metabolic changes among liver cancer patients and healthy persons is still insufficient.

본 발명자들은 간암과 관련된 대사체를 동정하고 간암 발병과의 상관 관계를 규명하여 간암의 위험성 또는 예후를 진단하는 방법을 제공하고자 하였다.The present inventors have identified metabolites associated with hepatocellular carcinoma and identified a correlation with hepatocellular carcinoma, thereby providing a method of diagnosing the risk or prognosis of hepatocellular carcinoma.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 특정 대사체의 수준을 측정하여 간암의 위험성 또는 예후를 진단하는 방법을 제공한다.Disclosure of Invention Technical Problem [8] Accordingly, the present invention has been made in view of the above problems, and it is an object of the present invention to provide a method for diagnosing the risk or prognosis of liver cancer by measuring the level of a specific metabolite.

본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료에서 타이로신(tyrosine), AST(aspartate aminotransferase), lysoPC(16:1), lysoPC(20:3), 올레아미드(oleamide), 5-하이드록시헥산(5-hydroxyhexanoic acid), 안드로스테론 황산염(androsterone sulfate), 및 TUDCA(tauroursodeoxycholic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체 농도를 측정하는 단계; 및 (c) 상기 측정된 대사체의 수준을 정상 대조군 시료에서의 측정값과 비교하는 단계;를 포함하는 간암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법이 제공된다.According to an aspect of the present invention, there is provided a method of detecting a biological sample, comprising: (a) obtaining a biological sample from a subject; (b), wherein the biological sample contains tyrosine, aspartate aminotransferase (AST), lysoPC (16: 1), lysoPC (20: 3), oleamide, 5-hydroxyhexanoic acid, Measuring at least one metabolite concentration selected from the group consisting of androsterone sulfate, and tauroursodeoxycholic acid (TUDCA); And (c) comparing the level of the measured metabolite to the measured value in a normal control sample. A method for assessing the prognosis or risk of a liver cancer is provided.

일 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 ALT(alanine aminotransferase), γ-GTP(γ-glutamyl transpeptidase), 류신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 및 아라키돈산(arachidonic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체 농도를 더 측정할 수 있다.In one embodiment, in step (b), the compound selected from the group consisting of alanine aminotransferase (ALT), gamma-glutamyl transpeptidase (γ-GTP), leucine, phenylalanine and arachidonic acid Lt; RTI ID = 0.0 > metabolite < / RTI >

일 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 L-팔미토일카르니틴(L-palmitoylcarnitine), LPA(16:0) 및 LPA(18:1)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체 농도를 더 측정할 수 있다.In one embodiment, the concentration of one or more metabolites selected from the group consisting of L-palmitoylcarnitine, LPA (16: 0) and LPA (18: 1) can do.

일 실시예에 있어서, 기준시점으로부터 7년 이후 간암의 발병 가능성을 판단할 수 있다.In one embodiment, the likelihood of developing liver cancer can be determined after 7 years from the reference time point.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 타이로신(tyrosine), AST(aspartate aminotransferase), lysoPC(16:1), lysoPC(20:3), 올레아미드(oleamide), 5-하이드록시헥산(5-hydroxyhexanoic acid), 안드로스테론 황산염(androsterone sulfate), 및 TUDCA(tauroursodeoxycholic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 간암 발병 위험도 진단용 키트가 제공된다.According to another aspect of the present invention there is provided a method for the production of a pharmaceutical composition comprising tyrosine, aspartate aminotransferase, lysoPC (16: 1), lysoPC (20: 3), oleamide, 5-hydroxyhexanoic acid, , Androsterone sulfate, and TUDCA (tauroursodeoxycholic acid). The kit for diagnosing the risk of liver cancer is provided.

일 실시예에 있어서, ALT(alanine aminotransferase), γ-GTP(γ-glutamyl transpeptidase), 류신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 및 아라키돈산(arachidonic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체에 대한 정량장치를 더 포함할 수 있다.In one embodiment, at least one metabolite selected from the group consisting of alanine aminotransferase (ALT), gamma-glutamyl transpeptidase (γ-GTP), leucine, phenylalanine, and arachidonic acid And may further include a metering device for the metering device.

일 실시예에 있어서, L-팔미토일카르니틴(L-palmitoylcarnitine), LPA(16:0) 및 LPA(18:1)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체에 대한 정량장치를 더 포함할 수 있다.In one embodiment, it may further comprise a quantitative device for one or more metabolites selected from the group consisting of L-palmitoylcarnitine, LPA (16: 0) and LPA (18: 1) .

본 발명의 일 측면에 따르면, 혈청 내 특정 대사체의 농도를 측정함으로써, 간암의 발병 가능성을 효과적으로 예측할 수 있다.According to one aspect of the present invention, by measuring the concentration of a specific metabolite in serum, the possibility of developing liver cancer can be effectively predicted.

특히, 상기 방법은 기준시점으로부터 평균 7년 이후의 간암 발병가능성에 관한 정보와 함께 선제적인 대응 가능성을 제공한다.In particular, the method provides preemptive countermeasures with information on the likelihood of developing liver cancer at an average of 7 years from baseline.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정한 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.It should be understood that the effects of the present invention are not limited to the effects described above, but include all effects that can be deduced from the details of the present invention or the composition of the invention described in the claims.

도 1은 대조군(Control group, n=134)과 HCC 군(Hepatocellular cancer group, n=75) 사이 혈장 대사체를 비교한 것이다. OPLS-DA 모델로부터 얻은 양이온 모드(a)와 음이온 모드(b)의 스코어 플롯과, OPLS-DA 모델로부터 얻은 양이온 모드(c)와 음이온 모드(d)의 공변인 [p] 및 신뢰도 관계(reliability correlation) [p(corr)]에 대한 S-플롯을 나타낸다.
도 2는 인리치먼트(enrichment) 분석(y축) 및 토폴로지(topology) 분석(x축)에 기반한 스코어에 따라 배열된 경로를 나타내는 대사 경로 분석 결과이다. 각 원의 색상과 크기는 각각 P-값 및 경로 영향력 값(pathway impact value)을 나타낸다.
도 3은 대조군(control group)과 HCC 군(hepatocellular cancer group)에서의 AST(aspartate aminotransferase)와 7가지 주요 대사체들 간의 상관관계를 나타낸 매트릭스다. 피어슨 상관 계수(Pearson's correlation coefficient)를 사용하여 상관관계를 도출하였으며, 빨강색은 양의 상관관계를, 파란색은 음의 상관관계를 나타낸다.
도 4는 대조군(Control group)과 HCC 군(Hepatocellular cancer group)에서의 주요 대사체와 생화학적 특징 간의 상관관계를 나타낸 매트릭스다. 피어슨 상관 계수(Pearson's correlation coefficient)를 사용하여 상관관계를 도출하였으며, 빨강색은 양의 상관관계를, 파란색은 음의 상관관계를 나타낸다.
도 5는 간암 발병에 대한 타이로신(tyrosine), AST(aspartate aminotransferase), 5-하이드록시헥산(5-hydroxyhexanoic acid) 및 TUDCA(tauroursodeoxycholic acid)에 대한 ROC 곡선을 도식화한 것이다.Figure 1 compares plasma metabolites between the control group (n = 134) and the HCC group (hepatocellular cancer group, n = 75). The score plot of the positive ion mode (a) and negative ion mode (b) obtained from the OPLS-DA model and the covariance [p] of the positive ion mode (c) and the negative ion mode (d) obtained from the OPLS- correlation [p (corr)].
Figure 2 is a metabolic path analysis result indicating a path arranged according to a score based on enrichment analysis (y axis) and topology analysis (x axis). The color and size of each circle represent the P - value and the pathway impact value, respectively.
Figure 3 is a matrix showing the correlation between aspartate aminotransferase (AST) and the seven major metabolites in the control and hepatocellular cancer groups. Correlations were derived using Pearson's correlation coefficient. The red color indicates a positive correlation, while the blue color indicates a negative correlation.
Figure 4 is a matrix showing the correlation between major metabolites and biochemical characteristics in the control group and the HCC group (Hepatocellular cancer group). Correlations were derived using Pearson's correlation coefficient. The red color indicates a positive correlation, while the blue color indicates a negative correlation.
Figure 5 depicts the ROC curve for tyrosine, aspartate aminotransferase, 5-hydroxyhexanoic acid and TUDCA (tauroursodeoxycholic acid) on liver cancer incidence.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, the present invention will be described with reference to the accompanying drawings. The present invention may, however, be embodied in many different forms and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein. In order to clearly illustrate the present invention, parts not related to the description are omitted, and similar parts are denoted by like reference characters throughout the specification.

어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.When an element is referred to as " comprising ", it means that it can include other elements, not excluding other elements unless specifically stated otherwise.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고서에 기술되어 있다.Unless otherwise defined, can be performed by molecular biology, microbiology, protein purification, protein engineering, and DNA sequencing and routine techniques commonly used in the art of recombinant DNA within the skill of those skilled in the art. These techniques are known to those skilled in the art and are described in many standardized textbooks and references.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.Unless otherwise defined herein, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art.

본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.Various scientific dictionaries, including the terms contained herein, are well known and available in the art. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein are found to be used in the practice or testing of the present application, some methods and materials have been described. It is not intended that the invention be limited to the particular methodology, protocols, and reagents, as they may be used in various ways in accordance with the context in which those skilled in the art use them.

이하, 첨부된 도면을 참고하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the accompanying drawings.

본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료에서 타이로신(tyrosine), AST(aspartate aminotransferase), lysoPC(16:1), lysoPC(20:3), 올레아미드(oleamide), 5-하이드록시헥산(5-hydroxyhexanoic acid), 안드로스테론 황산염(androsterone sulfate), 및 TUDCA(tauroursodeoxycholic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체 농도를 측정하는 단계; 및 (c) 상기 측정된 대사체의 수준을 정상 대조군 시료에서의 측정값과 비교하는 단계;를 포함하는 간암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법이 제공된다.According to an aspect of the present invention, there is provided a method of detecting a biological sample, comprising: (a) obtaining a biological sample from a subject; (b), wherein the biological sample contains tyrosine, aspartate aminotransferase (AST), lysoPC (16: 1), lysoPC (20: 3), oleamide, 5-hydroxyhexanoic acid, Measuring at least one metabolite concentration selected from the group consisting of androsterone sulfate, and tauroursodeoxycholic acid (TUDCA); And (c) comparing the level of the measured metabolite to the measured value in a normal control sample. A method for assessing the prognosis or risk of a liver cancer is provided.

상기 대상체(subject)는 진단 대상으로서 인간일 수 있고, 상기 생물학적 시료는 간암 관련 질환의 위험성을 평가하고자 하는 상기 대상체에서 분리된 시료로써, 조직, 세포, 혈액, 혈장, 복막액, 활막액, 타액, 소변, 대변 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게 상기 생물학적 시료는 혈액일 수 있으며, 구체적으로 혈액에서 분리된 혈장일 수 있다.The subject may be a human subject to be diagnosed, and the biological sample is a sample separated from the subject to be evaluated for the risk of a liver cancer-related disease. The biological sample may be a tissue, a cell, a blood, a plasma, a peritoneal fluid, , Urine, feces, and the like. Preferably, the biological sample may be blood, and specifically may be plasma separated from blood.

상기 정상 대조군은 평균 7년 동안 암에 걸리지 않거나 암에 걸린 기록이 없는 대상으로 인간일 수 있다.The normal control group may be a human being who does not develop cancer or has no cancer-stained record for an average of 7 years.

또한, 상기 대사체 각각을 개별적으로 분석하여 간암의 예후 또는 위험성 여부를 진단할 수 있으나, 상기 관련 대사체의 수준을 전체적으로 분석함으로써 진단의 정확성을 향상시킬 수 있다.In addition, each of the metabolites can be individually analyzed to diagnose the prognosis or risk of liver cancer, but the accuracy of the diagnosis can be improved by analyzing the level of the relevant metabolites as a whole.

상기 대사체는 대사체학을 통하여 간암의 병리학적 경로를 연구함으로써 결정할 수 있다. 상기 “대사체학”이란 세포내의 대사물질과 대사회로를 총체적으로 분석 및 연구하는 생물학 분야 중 하나이다. 상기 “대사체”는 주로 혈액 등에서 분류가 가능한 세포 과정(cellular process) 중 발생하는 소분자의 대사산물 전체(metabolome)를 말하며, 상기 대사체학은 혈액에서 추출된 상기 대사체를 분석하는 것이 기본이며, 그 응용은 주로 대사관련 질병을 연구하는 것이다.The metabolites can be determined by studying the pathological pathways of liver cancer through metabolomics. The term " metabolomics " is one of the fields of biology that collectively analyzes and studies metabolites and metabolic circuits in cells. The term " metabolite " refers to the metabolome of a small molecule occurring in a cellular process, which can be classified mainly in blood, and the metabolism is based on analyzing the metabolite extracted from blood, The application is mainly to study metabolic diseases.

상기 대사체는 간에서 만들어지는 효소, 분지형 아미노산, 방향족 아미노산, 글리세롤 인지질, 지방산의 대사산물, 및 담즙산일 수 있다.The metabolites may be enzymes produced in the liver, branched amino acids, aromatic amino acids, glycerol phospholipids, metabolites of fatty acids, and bile acids.

상기 “타이로신(tyrosine)”은 방향족 아미노산의 일종으로 아드레날린(부신피질 호르몬), 티록신(갑상선 호르몬) 등 호르몬 생합성에 중요한 역할을 한다. 상기 타이로신은 생체 내 간에서 페닐알라닌으로부터 생합성된다. 간암과 간경화증 환자에서 아미노산 불균형이 확인되며, 특히 방향족 아미노산인 타이로신이 증가하였다. 따라서 타이로신의 증가는 간암의 발병 위험을 나타내는 지표가 될 수 있다.The term "tyrosine" is a kind of aromatic amino acid and plays an important role in hormone biosynthesis such as adrenaline (adrenocortical hormone) and thyroxine (thyroid hormone). The tyrosine is biosynthesized from phenylalanine in the liver in vivo. Amino acid imbalance was observed in patients with liver cancer and liver cirrhosis, especially tyrosine, an aromatic amino acid. Therefore, an increase in tyrosine can be an indicator of the risk of developing liver cancer.

상기 “AST(aspartate aminotransferase)”는 아스파르트산 아미노기전달효소로 간에서 요소 회로를 진행하기 위해 간에서 생성되는 간 효소이다. 간 질환 환자의 간에서 간 효소가 증가한다고 보고된 바 있으며, 이러한 간 효소는 AST뿐 아니라 ALT(alanine aminotransferase) 및 γ-GTP(γ-glutamyl transpeptidase)가 있다. 특히 단계별 회귀분석에 따르면, AST는 간암 발생에 영향을 미치는 독립 변수 중 하나이기 때문에 AST의 증가는 간암의 발병 위험을 예측하는 중요한 지표가 될 수 있다.The "AST (aspartate aminotransferase)" is an aspartic acid amino acid transporter enzyme, which is a hepatic enzyme produced in the liver in order to conduct the urea cycle in the liver. It has been reported that hepatic enzymes increase in the liver of patients with liver disease. These liver enzymes include ALT (alanine aminotransferase) and γ-GTP (γ-glutamyl transpeptidase) as well as AST. In particular, according to the stepwise regression analysis, since AST is one of the independent variables affecting the development of liver cancer, the increase of AST can be an important index to predict the risk of liver cancer.

상기 “lysoPC(16:1) 및 lysoPC(20:3)”는 라이소포스파티딜콜린(lysoPC)의 한 종류이다. 최근 연구에 의하면, 간암 환자에서 lysoPC가 감소되었고, 종양 진단을 받은 환자에서 포스파티딜콜린(PC)의 전환이 급속히 증가하므로 lysoPC의 하향 조절이 발생된다고 보고된 바 있다. 따라서 lysoPC(16:1) 및 lysoPC(20:3)의 감소는 간암의 발병 위험을 나타내는 지표가 될 수 있다.The above "lysoPC (16: 1) and lysoPC (20: 3)" are a kind of lysophosphatidylcholine (lysoPC). Recent studies have reported that lysoPC is reduced in patients with liver cancer and that the conversion of phosphatidylcholine (PC) rapidly increases in patients with a diagnosis of tumors, resulting in down regulation of lysoPC. Thus, a decrease in lysoPC (16: 1) and lysoPC (20: 3) may be an indicator of the risk of developing liver cancer.

상기 “올레아미드(oleamide)”는 불포화 지방산 아미드 중 하나이며, 뇌에서 수면 유도를 돕고 중추신경계에서 중요한 역할을 한다. 간암이 발병하면 아미노산 대사뿐 아니라 지질 대사에도 영향을 주기 때문에, 불포화 지방산인 상기 올레아미드의 수치가 변할 수 있다. 또한, 올레아미드는 간경화증과 관련이 없기 때문에 간암의 특이적인 표지자가 될 수 있다.The term " oleamide " is one of the unsaturated fatty acid amides, which helps induce sleep in the brain and plays an important role in the central nervous system. Since the onset of liver cancer affects not only amino acid metabolism but also lipid metabolism, the value of the oleamide, which is an unsaturated fatty acid, may change. In addition, oleamide can be a specific marker of liver cancer because it is not associated with cirrhosis.

상기 “5-하이드록시헥산(5-hydroxyhexanoic acid)”은 지방산 대사산물이고, 상기 “안드로스테론 황산염”은 안드로겐 대사산물이다. 상기 5-하이드록시헥산과 안드로스테론 황산염의 간암 발병률에 관한 연구는 종래에 없었으나, 간암이 발병하면 각종 대사에 영향을 받기 때문에 5-하이드록시헥산과 안드로스테론 황산염의 수치가 변할 수 있다.The term " 5-hydroxyhexanoic acid " is a fatty acid metabolite, and " androseron sulfate " is an androgen metabolite. Although there has been no study on the incidence of hepatocellular carcinoma of 5-hydroxyhexane and androsterone sulfate, the values of 5-hydroxyhexane and androsterone sulfate may be changed because of the influence of various metabolism upon the development of liver cancer.

상기 “TUDCA(tauroursodeoxycholic acid)”는 생체 내에서 매우 낮은 수준으로 생성되는 친수성 담즙산이다. 상기 TUDCA는 소포체(endoplasmic reticulum) 스트레스뿐만 아니라 지방간 질환, 알코올성 간 질환, 바이러스성 간염 및 간암과 같은 간 질환을 유발하는 UPR(unfolded protein response) 신호 전달로 인한 세포 사멸을 감소시킨다. 생체 내의 간암이 발생하면 보호 작용으로 생체 내의 TUDCA의 수준이 증가할 수 있으며, TUDCA의 증가는 간암의 특이적인 표지자가 될 수 있다.The above-mentioned " TUDCA (tauroursodeoxycholic acid) " is a hydrophilic bile acid which is produced at a very low level in vivo. The TUDCA reduces cell death due to unfolded protein response (UPR) signaling leading to endoplasmic reticulum stress as well as liver disease such as fatty liver disease, alcoholic liver disease, viral hepatitis and liver cancer. When in vivo hepatocarcinogenesis occurs, protective action may increase the level of TUDCA in vivo, and an increase in TUDCA may be a specific marker of liver cancer.

따라서, 상기 (c) 단계에서 타이로신, AST, 5-하이드록시헥산, 및 TUDCA로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 대사체의 농도가 상기 정상 대조군 시료에서의 측정값보다 높은 경우에 상기 대상체는 간암의 발병 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있고, lysoPC(16:1), lysoPC(20:3), 올레아미드, 및 안드로스테론 황산염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 대사체의 농도가 낮은 경우에 상기 대상체는 간암의 발병 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.Therefore, when the concentration of any one or more metabolites selected from the group consisting of tyrosine, AST, 5-hydroxyhexane, and TUDCA is higher than the value measured in the normal control sample in the step (c) And when the concentration of any one or more metabolites selected from the group consisting of lysoPC (16: 1), lysoPC (20: 3), oleamide, and androsterone sulfate is low, It can be concluded that subjects are at high risk of developing liver cancer.

한편, 상기 (b) 단계에서 ALT(alanine aminotransferase), γ-GTP(γ-glutamyl transpeptidase), 류신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 및 아라키돈산(arachidonic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체 농도를 더 측정할 수 있고, 상기 (b) 단계에서 L-팔미토일카르니틴(L-palmitoylcarnitine), LPA(16:0) 및 LPA(18:1)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체 농도를 더 측정할 수 있다. Meanwhile, in step (b), one or more metabolites selected from the group consisting of alanine aminotransferase (ALT), γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTP), leucine, phenylalanine and arachidonic acid The concentration of at least one metabolite selected from the group consisting of L-palmitoylcarnitine, LPA (16: 0) and LPA (18: 1) can be measured in step (b) Can be further measured.

상기 대사체들의 수준을 추가적으로 분석하고 상기 정상 대조군과 비교함으로써 진단의 신뢰도를 더욱 개선할 수 있다.The level of the metabolites can be further analyzed and compared with the normal control group to further improve the reliability of the diagnosis.

상기 ALT(alanine aminotransferase) 및 γ-GTP(γ-glutamyl transpeptidase)는 AST와 같이 간에서 생성되는 효소이다. 전술한 바와 같이, 간 질환 환자에서 간에서 생성되는 효소가 증가한다고 보고된 바 있고, ALT 및 γ-GTP의 증가는 간암의 특이적인 표지자가 될 수 있다.The ALT (alanine aminotransferase) and γ-GTP (γ-glutamyl transpeptidase) are enzymes produced in the liver, such as AST. As described above, liver-produced enzymes have been reported to increase in patients with liver disease, and the increase in ALT and γ-GTP may be a specific marker of liver cancer.

또한, 20년의 추적 연구를 통해 AST 및 γ-GTP가 증가한 사람들의 간암 발생율은 정상 수치의 사람들보다 높다고 보고된 바 있다. 따라서 간암이 발병하기 전에 AST, ALT 및 γ-GTP와 같은 간 효소의 수치가 상승할 수 있다.In addition, 20-year follow-up studies have reported that the incidence of hepatocarcinoma among people with elevated AST and γ-GTP is higher than those with normal levels. Thus, levels of liver enzymes such as AST, ALT, and γ-GTP may be elevated before liver cancer develops.

상기 류신(leucine)은 분지형 아미노산 중 하나이고, 상기 페닐알라닌(phenylalanine)은 방향족 아미노산으로 생체 내의 필수 아미노산이다. 간암과 간경화증 환자에서 아미노산 불균형이 확인되며, 상기 류신과 상기 페닐알라닌의 수준은 간암의 특이적인 표지자가 될 수 있다.The leucine is one of the branched amino acids, and the phenylalanine is an aromatic amino acid and is an essential amino acid in vivo. Amino acid imbalance is observed in patients with liver cancer and liver cirrhosis, and the levels of leucine and phenylalanine can be specific markers of liver cancer.

상기 아라키돈산(arachidonic acid)은 불포화 지방산 중 하나이며, 리놀레산 및 레놀렌산 과 같은 필수 지방산이다. 간암 환자와 정상인 간에 여러 유리 지방산의 수치가 상이한 것으로 보고된 바 있다. 특히 상기 아라키돈산은 혈관 신생 과정에 중요한 역할을 하며, 상기 혈관 신생 과정은 간암 환자에게 빈번하게 관찰되는 특징이기 때문에 아라키돈산의 증가는 간암의 특이적인 표지자가 될 수 있다.The arachidonic acid is one of the unsaturated fatty acids and is an essential fatty acid such as linoleic acid and linolenic acid. It has been reported that the levels of various free fatty acids in liver cancer patients and normal people are different. Especially, the arachidonic acid plays an important role in the angiogenesis process, and since the angiogenesis process is a feature frequently observed in patients with liver cancer, the increase of arachidonic acid may be a specific marker of liver cancer.

상기 L-팔미토일카르니틴(L-palmitoylcarnitine)은 지방산 대사에 관여하는 카르니틴의 에스테르 유도체이다. 간암 환자와 정상인 사이의 카르니틴 수준 차가 보고된 바 있으며, L-팔미토일카르니틴 수준은 간암의 특이적인 표지자가 될 수 있다.The L-palmitoylcarnitine is an ester derivative of carnitine which is involved in fatty acid metabolism. Differences in carnitine levels between liver cancer patients and normal individuals have been reported, and L-palmitoyl carnitine levels may be a specific marker of liver cancer.

상기 LPA(16:0) 및 상기 LPA(18:1)은 포스파티드산의 아실기가 유리하여 하이드록실기가 된 형태의 리소체 인지질이다. 간암이 발병하면 인지질 대사에 영향을 주기 때문에 LPA들의 수치가 변할 수 있다. 따라서 상기 LPA(16:0) 및 상기 LPA(18:1)의 수치는 간암의 특이적인 표지자가 될 수 있다.The LPA (16: 0) and the LPA (18: 1) are lysophospholipids in the form of a hydroxyl group in which the acyl group of the phosphatidic acid is advantageous. The incidence of liver cancer affects the phospholipid metabolism, so the levels of LPAs may change. Thus, the values of LPA (16: 0) and LPA (18: 1) may be specific markers of liver cancer.

따라서, 상기 (c) 단계에서 ALT(alanine aminotransferase), γ-GTP(γ-glutamyl transpeptidase), 류신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 및 아라키돈산(arachidonic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 대사체의 농도가 상기 정상 대조군 시료에서의 측정값보다 높은 경우에 상기 대상체는 간암의 발병 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있고, L-팔미토일카르니틴(L-palmitoylcarnitine), LPA(16:0) 및 LPA(18:1)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 대사체의 농도가 상기 정상 대조군 시료에서의 측정값보다 낮은 경우에 상기 대상체는 간암의 발병 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.Therefore, in step (c), it is preferable that at least one selected from the group consisting of alanine aminotransferase (ALT), γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTP), leucine, phenylalanine and arachidonic acid L-palmitoylcarnitine, LPA (16: 0), and L-carnitine carnitine were used as the control, and when the concentration of the metabolite was higher than that of the normal control sample, LPA (18: 1) is lower than the value measured in the normal control sample, it can be judged that the subject has a high risk of developing liver cancer.

한편, 상기 방법은 기준시점으로부터 7년 이후 간암의 발병 가능성을 판단할 수 있다. 상기 “기준시점”은, 대사체 프로파일링, 즉 상기 대사체의 농도 측정을 수행한 특정 시점을 의미한다.On the other hand, the above method can determine the possibility of developing liver cancer after 7 years from the reference time point. The " reference time point " means metabolomic profiling, that is, a specific time point at which the concentration measurement of the metabolite is performed.

한편, 본 발명의 다른 측면은 타이로신(tyrosine), AST(aspartate aminotransferase), lysoPC(16:1), lysoPC(20:3), 올레아미드(oleamide), 5-하이드록시헥산(5-hydroxyhexanoic acid), 안드로스테론 황산염(androsterone sulfate), 및 TUDCA(tauroursodeoxycholic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 간암 발병 위험도 진단용 키트를 제공한다.Another aspect of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising tyrosine, aspartate aminotransferase (AST), lysoPC (16: 1), lysoPC (20: 3), oleamide, 5-hydroxyhexanoic acid, , Androsterone sulfate, and TUDCA (tauroursodeoxycholic acid). The present invention also provides a kit for diagnosing the risk of liver cancer.

상기 정량장치는 상기 각 대사체의 농도를 측정하기 위한 것으로, 크로마토그래피, 질량분석기 등을 예시할 수 있다.The quantification device is for measuring the concentration of each metabolite, and may be exemplified by chromatography, mass spectrometry, and the like.

상기 크로마토그래피는 액체 크로마토그래피(LC), 액체-고체 크로마토그래피(LSC), 종이 크로마토그래피(PC), 박층 크로마토그래피(TLC), 기체-고체 크로마토그래피(GSC), 액체-액체 크로마토그래피(LLC), 포말 크로마토그래피(FC), 유화 크로마토그래피(EC), 기체-액체 크로마토그래피(GLC), 이온 크로마토그래피(IC), 겔 여과 크로마토그래피(GFC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(GPC)일 수 있고, 바람직하게는 액체 크로마토그래피, 더 바람직하게는 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC, ultra-performance liquid chromatography)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The chromatography can be carried out in a liquid chromatography (LC), a liquid-solid chromatography (LSC), a paper chromatography (PC), a thin layer chromatography (TLC), a gas-solid chromatography (GSC) ), Foam chromatography (FC), emulsion chromatography (EC), gas-liquid chromatography (GLC), ion chromatography (IC), gel filtration chromatography (GFC) or gel permeation chromatography , Preferably liquid chromatography, more preferably ultra-performance liquid chromatography (UPLC).

또한, 상기 질량분석기는 푸리에 변환 질량분석기(FTMS, Fourier transform mass spectrometer)를 사용할 수 있고, 구체적으로 LTQ-Orbitrap-XL 질량분석기를 사용할 수 있다.The mass spectrometer may be a Fourier transform mass spectrometer (FTMS). Specifically, an LTQ-Orbitrap-XL mass spectrometer may be used.

상기 크로마토그래피는 분자마다 상이한 이동성을 이용하여 각 대사체를 분리할 수 있고, 상기 질량분석기는 상기 분석 대상의 분자량 정보뿐만 아니라 구조 정보를 통해 대사체를 식별할 수 있다.The above-mentioned chromatography can separate each metabolite using different mobility for each molecule, and the mass spectrometer can identify the metabolite through structure information as well as molecular weight information of the object to be analyzed.

상기 진단 키트는 ALT(alanine aminotransferase), γ-GTP(γ-glutamyl transpeptidase), 류신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 및 아라키돈산(arachidonic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체에 대한 정량장치를 더 포함할 수 있다.The diagnostic kit can be used for quantitative determination of one or more metabolites selected from the group consisting of alanine aminotransferase (ALT), gamma-glutamyl transpeptidase (γ-GTP), leucine, phenylalanine, and arachidonic acid Device. ≪ / RTI >

상기 진단 키트는 L-팔미토일카르니틴(L-palmitoylcarnitine), LPA(16:0) 및 LPA(18:1)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체에 대한 정량장치를 더 포함할 수 있다.The diagnostic kit may further comprise a quantification device for one or more metabolites selected from the group consisting of L-palmitoylcarnitine, LPA (16: 0) and LPA (18: 1).

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 기술한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples.

실험방법Experimental Method

실험대상Subject

한국 대사 증후군 연구 사업(Korean Metabolic Syndrome Research Initiative)에서 2005년부터 수집된 자료를 참고하여, 본 발명과 관련된 연구를 “Korean Cancer Prevention Study-II (KCPS-II)”로 명명하였다.The research related to the present invention was named "Korean Cancer Prevention Study-II (KCPS-II)" by referring to data collected from the Korean Metabolic Syndrome Research Initiative since 2005.

연구 대상자로 서울과 경기도의 건강증진센터(health promotion center in Seoul and Gyeonggi Province, South Korea)에서 2004년 내지 2013년의 정기 건강 검진자들을 모집하였다. 혈액 샘플의 제공을 동의한 156,701명의 지원자들 중 연령과 성별이 매치되는 75명의 간암 환자(HCC 군)와 134명의 건강한 지원자(정상 대조군)를 1:2 비율로 선발하였다.The subjects of this study were regular health checkers from 2004 to 2013 at the health promotion center in Seoul and Gyeonggi Province, South Korea. Of the 156,701 volunteers who agreed to provide blood samples, 75 liver cancer patients (HCC group) and 134 healthy volunteers (normal control group) were selected at a 1: 2 ratio.

설문 및 인체측정Survey and Human Measurement

모든 참가자는 구조적 설문지(structured questionnaire)에 따라 하기 사항에 대한 인터뷰를 수행하였다:All participants were interviewed according to the structured questionnaire:

흡연(흡연 미경험자, 흡연 유경험자, 현재 흡연자) 및 음주 이력, 가벼운 복장에 따른 키 및 몸무게, BMI, 최소 15분 동안의 휴식 후 수축기 및 이완기 혈압, 늑골 하단 및 장골능 사이의 허리 둘레.BMI, systolic and diastolic blood pressure after resting for at least 15 minutes, waist circumference between lower ribs and iliac crest, and smoking history (smoking inexperienced, smokers, current smoker) and drinking history, weight and weight according to light attire.

혈액 수집 및 생화학적 분석Blood collection and biochemical analysis

임상 화학적 분석을 위해, 12시간 이상의 공복 후 각 참가자로부터 말초 정맥 혈액에서 분리된 혈청을 수득하고, 분석 때까지 -70℃에서 보관하였다.For clinical chemistry analysis, serum separated from peripheral venous blood was obtained from each participant after 12 hours of fasting and stored at -70 ° C until analysis.

공복 혈당, 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 저밀도 지질단백질-콜레스테롤(LDL-cholesterol), 고밀도 지질단백질-콜레스테롤(HDL-cholesterol), AST(aspartate aminotransferase), ALT(alanine aminotransaminase) 및 hs-CRP(Serum high-sensitivity C-reactive protein)는 자동 분석 장치를 이용하여 측정하였다.(LDL-cholesterol), HDL-cholesterol, aspartate aminotransferase (ALT), alanine aminotransaminase (ALT) and hs-CRP (serum high-density lipoprotein cholesterol) sensitivity C-reactive protein) was measured using an automatic analyzer.

각각의 측정은 Korean Association of Laboratory Quality Control이 요구하는 내부 및 외부적 품질 관리 절차에 따라 수행되었다.Each measurement was performed according to the internal and external quality control procedures required by the Korean Association of Laboratory Quality Control.

개별 병원 사이 각각의 바이오 마커에 대한 일치도는 높았다(상관 계수는 0.96 ~ 0.99 범위).The agreement of each biomarker among individual hospitals was high (correlation coefficient ranged from 0.96 to 0.99).

간암(Liver cancer HCCHCC ) 진단) Diagnosis

간암 발병률에 대한 데이터는 National Cancer Registry의 기록과 대상자가 치료를 받은 병원으로부터 얻어졌다. National Cancer Registry에 보고되지 않은 자료는 대상자의 병원 입원 기록을 참고하였다.Data on the incidence of hepatocellular carcinoma were obtained from National Cancer Registry records and hospitals where patients were treated. Data not reported in the National Cancer Registry refer to hospital hospital records.

전반적(Overall 비표적화Non-targeting ) 혈청 ) Serum 대사체Metabolism 프로파일링 Profiling

UPLCUPLC -- LTQLTQ -- OrbitrapOrbitrap XLXL MS 분석 MS analysis

샘플 준비 절차는 종래 문헌에 따라 수행하였다(Nutr Metab 2016; 13:3). The sample preparation procedure was performed according to the conventional literature (Nutr Metab 2016; 13: 3).

크로마토그래피를 이용한 분리 절차는 Thermo UPLC 시스템(Ultimate 3000 BioRS, Dionex-Thermo Fischer Scienrific, Bremen, Germany)에 설치된 Acquity UPLC-BEH-C18 컬럼(2.1 x 50 ㎜, 1.7 ㎛; Waters Milford, MA, USA)을 이용하여, ESI 양이온 모드와 ESI 음이온 모드로 실시하였다.The chromatographic separation procedure was carried out on an Acquity UPLC-BEH-C18 column (2.1 x 50 mm, 1.7 [mu] m; Waters Milford, MA, USA) equipped with a Thermo UPLC system (Ultimate 3000 BioRS, Dionex-Thermo Fischer Scienific, Bremen, Germany) , ESI cation mode and ESI anion mode.

각 샘플(5 μL)을 컬럼에 주입하고, 50℃로 유지하였다.Each sample (5 [mu] L) was injected into the column and maintained at 50 [deg.] C.

양이온 모드는 0.1%의 포름산을 포함하는 LC-MS grade water(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA)인 용액 A와 0.1%의 포름산을 포함하는 LC-MS grade methanol(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA)인 용액 B를 이용하였다. The cation mode was carried out using Solution A, a solution of LC-MS grade water (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA) containing 0.1% formic acid and LC-MS grade methanol (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ , USA) was used.

메탄올의 비율은 15분간 0%에서 100%까지 증가시키고, 4분간 100%로 유지시켰으며, 2분간 100%에서 0%로 감소시켰다.The ratio of methanol was increased from 0% to 100% for 15 minutes, maintained at 100% for 4 minutes, and decreased from 100% to 0% for 2 minutes.

음이온 모드는 6.5 mM 탄화수소 암모늄(ammonium bicarbonate)을 포함하는 LC-MS grade water(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA)로 주입된 샘플을 평균화 하였고, 6.5 mM 탄화수소 암모늄(ammonium bicarbonate)을 포함하는 5% water (Fisher Scientific)로 용출하였다. 용출 용액의 비율은 15분간 0%에서 100%까지 증가시키고, 5분간 100%로 유지시켰으며, 2분간 100%에서 0%로 감소시켰다.The anion mode was averaged over a sample injected with LC-MS grade water (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA) containing 6.5 mM ammonium bicarbonate and was diluted to 5 with 5 mM ammonium bicarbonate % water (Fisher Scientific). The ratio of the elution solution was increased from 0% to 100% for 15 minutes, maintained at 100% for 5 minutes, and decreased from 100% to 0% for 2 minutes.

상기 양이온 모드 및 음이온 모드의 총 유속은 각각 0.4 mL/min 및 0.35 mL/min으로 고정하였다.The total flow rates of the cation and anion modes were fixed at 0.4 mL / min and 0.35 mL / min, respectively.

MS는 푸리에 변환 MS에 대해 풀 스캔 모드로 작동되는 LTQ-Orbitrap-XL 질량 분석계(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 수행하였다. 질량 분해능은 60,000이고, 스프레이 전압은 5 kV이다. 질소(nitrogen sheath) 가스 및 보조 가스의 유속은 각각 50 및 5(arbitrary units)이다. 모세관 전압, 튜브-렌즈 전압, 및 모세관 온도는 각각 35 V, 120 V, 및 360℃로 일정하게 유지하였다. MS was performed with a LTQ-Orbitrap-XL mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass., USA) operating in full scan mode for Fourier transformed MS. The mass resolution is 60,000 and the spray voltage is 5 kV. The flow rates of the nitrogen sheath gas and the auxiliary gas are 50 and 5 (arbitrary units), respectively. The capillary voltage, tube-lens voltage, and capillary temperature were kept constant at 35 V, 120 V, and 360 ° C, respectively.

MS 데이터는 m/z 50 내지 1,000 범위에서 수집하였다. 품질 관리를 위해, 통합 제어 샘플은 각 샘플과 혼합하여 준비하였으며, 5번째마다 샘플을 주입하였다. 대사체의 MS/MS 스펙트럼은 20 내지 55%에서의 충돌 에너지 램프를 통해 획득하였다.MS data were collected in the m / z 50-1,000 range. For quality control, an integrated control sample was prepared by mixing with each sample, and a sample was injected every fifth time. The MS / MS spectra of the metabolites were obtained via a collision energy ramp at 20-55%.

데이터 처리 및 Data processing and 대사체Metabolism 동정 Sympathy

유지시간, m/z비, 및 이온 강도를 포함하는 모든 관련 데이터는 SIEVE 2.2 데이터 분석 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 수집하였다. 분석 파라미터는 하기와 같다: m/z 범위 50-1,000 m/z; 폭 5 ppm; 및 유지시간 폭 2.5분.All relevant data including retention time, m / z ratio, and ionic strength were collected using SIEVE 2.2 data analysis software (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass., USA). The analytical parameters are as follows: m / z range 50-1,000 m / z; 5 ppm in width; And a retention time width of 2.5 minutes.

대사체는 하기 데이터베이스를 이용하여 검색하였다: Human Metabolome(www.hmdb.ca); Lipid MAPS(www.lipidmaps.org); KEGG(www.genome.jp/kegg); MassBank(www.massbank.jp); 및 ChemSpider(www.chemspider.com).Metabolites were searched using the following databases: Human Metabolome (www.hmdb.ca); Lipid MAPS (www.lipidmaps.org); KEGG (www.genome.jp/kegg); MassBank (www.massbank.jp); And ChemSpider (www.chemspider.com).

MS/MS를 통해 잠재적 대사체를 확인하였다. MS/MS를 수행하여 얻은 스펙트라를 상기 데이터베이스의 참고 수치들과 비교하여 잠재적 대사체를 동정하였다.Potential metabolites were identified via MS / MS. The potential metabolites were identified by comparing the spectra obtained from MS / MS with reference values in the above database.

통계적 분석Statistical analysis

통계적 분석은 SPSS v. 23.0(IBM, Chicago, IL, USA)을 이용하였다. 왜곡된 변수들은 대수적으로(logarithmically) 변환하였다. 기술적(descriptive) 목적을 위해, 평균값은 변환되지 않은 값으로 표시하였다. 결과는 평균±표준오차(SE)로 표현하였다. 양측 P-검정값(two-tailed P-value)<0.05를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. 두 그룹 간의 파라미터들을 비교하기 위해 독립 t-검정을 사용하였다.Statistical analysis was performed using SPSS v. 23.0 (IBM, Chicago, IL, USA) was used. Distorted variables are logarithmically transformed. For descriptive purposes, the mean value is expressed as an untransformed value. Results are expressed as mean ± standard error (SE). Both sides P - the test-values (two-tailed P -value) < 0.05 was considered statistically significant. Independent t-tests were used to compare the parameters between the two groups.

변수들 간의 관계를 평가하기 위해 피어슨 상관 계수(Pearson's correlation coefficient)를 사용하였다. R 패키지 'fdrtool'을 이용하여 오류 발견률(FDR, False discovery rate-corrected)을 보정한 q-값을 산출하였고, 0.05 미만의 q-값이 유의성을 가지는 것으로 간주하였다.Pearson's correlation coefficient was used to evaluate the relationship between the variables. Was calculated values, q is less than 0.05 - - R q package used in the calibration the error detection rate (FDR, False discovery rate-corrected ) the 'fdrtool' was considered to be a value having a significance.

간암 발병의 주요 독립 예측 인자를 동정하기 위하여 단계적 회귀분석(stepwise regression analysis)을 수행하였다.Stepwise regression analysis was performed to identify the major independent predictors of liver cancer incidence.

단계적 회귀분석 결과를 기반으로, 수신자 조작 특성 곡선 분석(receiver-operating characteristic curve analysis)을 이용하여 각각의 생화학적 특징에 대한 최적의 컷오프(cut-off) 값을 결정하였다.On the basis of the stepwise regression analysis, an optimal cut-off value for each biochemical characteristic was determined using receiver-operating characteristic curve analysis.

또한, 대사체와 생화학적 특징 중에서의 상관관계를 시각화하여 평가하기 위하여 히트 맵을 생성하였다.In addition, a heat map was generated to visualize and evaluate the correlation between metabolites and biochemical characteristics.

모든 스펙트라 데이터는 다변수 통계 분석(multivariate analysis)을 위해 SIMCA-P+ 14.0(Umetrics, Umea, Sweden)으로 이출되었다. 다변수 통계 분석에 앞서, 파레토 스케일링(Pareto scaling)을 모든 데이터에 적용하였다.All spectra data were exported to SIMCA-P + 14.0 (Umetrics, Umea, Sweden) for multivariate analysis. Prior to multivariate statistical analysis, Pareto scaling was applied to all data.

직교 부분 최소 자승 판별 분석(Orthogonal partial least squares discriminant analysis; OPLS-DA)을 이용하여 모델들을 비교하였다. 모델의 유효성은 R2Y 및 Q2Y의 파라미터와, 교차검증 분산분석(cross-validation analysis of variance; CV-ANOVA)을 통해 평가하였다.The models were compared using orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA). The validity of the model was evaluated using the parameters of R 2 Y and Q 2 Y and the cross-validation analysis of variance (CV-ANOVA).

대사 경로 분석Metabolic pathway analysis

대사 경로 분석은 MetaboAnalyst 3.0(http://metaboanalyst.ca)을 이용하였다. 본 프로그램은 몇몇의 데이터베이스(KEGG(http://www.genome.jp/kegg/), Human Metabolome Database(http://www.hmdb.ca) 등)의 정보를 기반으로 현저히 변경된 경로에 대한 정보를 제공한다. 상기 MetaboAnalyst는 경로-인리치먼트 분석(pathway enrichment analysis) 및 경로-위상 분석(pathway topology analysis)을 통합하여 대사 경로를 분석하였다.Metaboanalyst 3.0 (http://metaboanalyst.ca) was used for metabolic pathway analysis. This program is based on the information of several databases (KEGG (http://www.genome.jp/kegg/), Human Metabolome Database (http://www.hmdb.ca), etc.) Lt; / RTI &gt; The MetaboAnalyst analyzed metabolic pathways by integrating pathway enrichment analysis and pathway topology analysis.

실험결과Experiment result

실험예Experimental Example 1 : 기준시점의 임상적 특징 1: Clinical features at baseline

평균 7년 동안, 20 내지 84세의 156,701명의 지원자 중 75명의 대상자에서 간암이 발병하였다. 간암으로 입원한 75명의 환자와 암에 걸리지 않고 연령 및 성별이 매칭되는 134명의 지원자를 HCC 군과 정상 대조군으로 분류하였다.Over an average of 7 years, 75 of the 156,701 volunteers aged 20 to 84 years developed liver cancer. HCC group and normal control group were divided into 75 patients who were hospitalized with liver cancer and 134 patients whose age and sex matched without cancer.

흡연과 음주 상태를 보정한 후, 정상 대조군(n=134)과 HCC 군(n=75)의 BMI, 수축기 및 이완기 혈압뿐 아니라 포도당, 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 및 hs-CRP의 혈중 농도를 표 1에 나타냈다.Triglyceride, total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, and hs (p <0.05), as well as the BMI, systolic and diastolic blood pressures of the normal control (n = 134) and HCC The blood concentrations of -CRP are shown in Table 1.

HCC 군에서 백혈구 수치가 낮았고, AST(P<0.001), ALT(P<0.001) 및 γ-GTP(P<0.001)의 수준은 높았다.The levels of AST ( P <0.001), ALT ( P <0.001) and γ-GTP ( P <0.001) were higher in the HCC group.

구분division 대조군(n=134)Control group (n = 134) HCCHCC 군(n=75) Group (n = 75) PP aa PP bb 연령(년)Age (years) 52.7±0.8152.7 ± 0.81 52.8±1.1852.8 ± 1.18 0.9680.968 0.9830.983 남/여 n, (%)Male / Female n, (%) 121(90.3)/13(9.7)121 (90.3) / 13 (9.7) 67(89.3)/8(10.7)67 (89.3) / 8 (10.7) 0.8240.824 0.7930.793 현 흡연자 n, (%)Current smoker n, (%) 42(33.3)42 (33.3) 31(45.6)31 (45.6) 0.0930.093 -- 음주자 n, (%)Drinker n, (%) 103(82.4)103 (82.4) 48(71.6)48 (71.6) 0.0830.083 -- 음주 주기(g/day)∮ Drinking frequency (g / day) ∮ 18.2±3.2418.2 ± 3.24 22.3±7.2422.3 ± 7.24 0.2350.235 0.3590.359 체중(kg)Weight (kg) 69.2±0.8969.2 ± 0.89 69.7±1.1769.7 ± 1.17 0.7440.744 0.8920.892 신장(cm)Height (cm) 168.0±0.61168.0 + - 0.61 168.5±0.88168.5 ± 0.88 0.6040.604 0.6010.601 허리 둘레(cm)Waist circumference (cm) 84.9±0.8884.9 ± 0.88 86.8±1.0786.8 ± 1.07 0.1540.154 0.3050.305 BMI(kg/m2)BMI (kg / m 2 ) 24.5±0.2524.5 ± 0.25 24.6±0.3824.6 ± 0.38 0.8680.868 0.9660.966 수축기혈압(mmHg)Systolic blood pressure (mmHg) 122.8±1.3122.8 ± 1.3 121.5±1.59121.5 ± 1.59 0.5520.552 0.7300.730 이완기혈압(mmHg)Diastolic blood pressure (mmHg) 77.4±1.0077.4 ± 1.00 76.5±1.1876.5 ± 1.18 0.5900.590 0.8030.803 포도당(mg/dL)∮ Glucose (mg / dL) ∮ 96.8±1.7896.8 ± 1.78 98.7±2.7098.7 ± 2.70 0.5460.546 0.6230.623 트리글리세라이드(mg/dL)∮ Triglyceride (mg / dL) ∮ 135.1±7.20135.1 ± 7.20 120.4±9.24120.4 + 9.24 0.1330.133 0.0640.064 총 콜레스테롤(mg/dL)∮ Total cholesterol (mg / dL) ∮ 188.6±2.76188.6 ± 2.76 179.6±3.41179.6 ± 3.41 0.0490.049 0.0680.068 HDL-콜레스테롤(mg/dL)∮ HDL-cholesterol (mg / dL) ∮ 50.6±0.9350.6 ± 0.93 51.0±1.3651.0 + - 1.36 0.8710.871 0.8030.803 LDL-콜레스테롤(mg/dL)∮ LDL-cholesterol (mg / dL) ∮ 114.2±2.44114.2 + - 2.44 106.8±3.52106.8 ± 3.52 0.0630.063 0.1010.101 AST(IU/L)∮ AST (IU / L) ∮ 24.1±0.6324.1 ± 0.63 42.9±4.0842.9 ± 4.08 <0.001<0.001 <0.001<0.001 ALT(IU/L)∮ ALT (IU / L) ∮ 27.5±1.5627.5 ± 1.56 49.7±8.9549.7 ± 8.95 <0.001<0.001 <0.001<0.001 γ-GTP(U/L)∮ γ-GTP (U / L) ∮ 42.9±4.9842.9 ± 4.98 90.7±15.490.7 ± 15.4 <0.001<0.001 <0.001<0.001 백혈구 수(x103/μL)∮ White blood cell count (x10 3 / μL) ∮ 6.08±0.156.08 ± 0.15 5.66±0.175.66 ± 0.17 0.0930.093 0.0310.031 hs-CRP(mg/L)∮ hs-CRP (mg / L) ∮ 0.21±0.030.21 + 0.03 0.22±0.060.22 ± 0.06 0.5090.509 0.3250.325

각 값들은 평균±표준오차로 나타내었다; ∮은 로그 변환으로 검사한 값이다. 독립적인 t-test로 파생된 P a -값. 음주 및 흡연에 대한 보정 후 독립적인 t-test로 파생된 P b -값.Each value is expressed as mean ± standard error; ∮ is the value checked by log conversion. P a - value derived from independent t-test. P b -values derived from independent t-tests after correction for drinking and smoking.

실험예Experimental Example 2 :  2 : UPLCUPLC -- LTQLTQ -- orbitraporbitrap MS를 이용한 혈청  Serum using MS 대사체Metabolism 프로파일링 Profiling

기준시점에서 얻은 혈청 대사체에 대한 총 이온 크로마토그래피 데이터(양이온 및 음이온 모드)를 OPLS-DA 스코어 플롯을 사용하여 분석하였다. 특히, OPLS-DA는 양이온 모드에서 대조군(기준시점 및 7년간 간암에 걸리지 않음; n=134) 및 HCC 군(기준시점 암에 걸리지 않았으나 7년간 간암이 발병함; n=75) 간 기준시점의 대사체를 비교하였다(도 1a).Total ion chromatographic data (cation and anion modes) for the serum metabolites obtained at baseline were analyzed using an OPLS-DA score plot. In particular, the OPLS-DA was significantly lower than that of the control group (n = 134) and the HCC group (baseline and 7-year hepatocellular carcinoma, n = 75) Metabolites were compared (Fig. 1A).

OPLS-DA의 품질은 모델의 적합성 및 각 모델의 예측력을 평가하는 R2 및 Q2 값을 사용하여 시험하였다.The quality of the OPLS-DA was tested using the R 2 and Q 2 values to assess the suitability of the model and the predictive power of each model.

도 1을 참조하면, 상기 모델은 적합도(goodness of fit)가 88.2%(R2Y=0.882), 예측력이 65.8%(Q2Y=0.658)로 나타났다. 상기 결과는 OPLS-DA 모델의 접합도가 높고 수용 가능한 예측력을 가지고 있음을 시사한다.Referring to FIG. 1, the model shows goodness of fit of 88.2% (R 2 Y = 0.882) and predictive power of 65.8% (Q 2 Y = 0.658). These results suggest that the degree of connectivity of the OPLS-DA model is high and that it has acceptable predictive power.

또한, OPLS-DA는 음이온 모드에서 적합도R2Y=0.798 및 예측력 Q2Y=0.604의 통계적 파라미터로 대조군 및 HCC 군 간 기준시점의 대사체를 비교하였다(도 1b).Also, OPLS-DA was statistically analyzed in the negative ion mode with the fitness R 2 Y = 0.798 and the predictive power Q 2 Y = 0.604 (Fig. 1b).

상기 결과는 대사체의 존재도의 차이를 기반으로 두 그룹을 구별 할 수 있음을 시사한다.These results suggest that the two groups can be distinguished based on the difference in the presence of metabolites.

확인된 차이에 기여하는 잠재적 변수를 추출하기 위해, 양이온 모드(도 1c)와 음이온 모드(도 1d)에서 파레토 스케일링(Pareto scaling)을 이용하여 OPLS-DA 모델로부터 공변인 p(1) 및 신뢰도 관계 p(corr) (1)의 S-플롯을 생성하였다. 상기 대사체가 높거나 낮은 p(corr) 값을 가질 때, 두 그룹을 구별함에 있어 더 높은 관련성을 가진다.In order to extract the potential variables contributing to the identified differences, p (1) covariance from the OPLS-DA model using the Pareto scaling in the cation mode (Fig. 1c) and the negative ion mode An S-plot of p (corr) (1) was generated. When the metabolite has a high or low p (corr) value, it has a higher relevance in distinguishing the two groups.

실험예Experimental Example 3 : 혈청  3: Serum 대사체의Metabolite 동정 Sympathy

각 군의 구분에 중요한 역할을 하는 변수(대사체)를 변수중요도척도(Variable Important in the Projection; VIP) 파라미터에 따라 선별하였다. VIP 값이 1.5를 초과할 때 샘플 군들 간의 차이에 높은 관련성이 있음을 의미한다.Variables (metabolites), which play an important role in the classification of each group, were selected according to the Variable Important in the Projection (VIP) parameter. This means that when the VIP value exceeds 1.5, the difference between the sample groups is highly related.

대조군(기준시점 및 7년간 암에 걸리지 않음; n=134) 및 HCC 군(기준시점 암에 걸리지 않았으나 7년간 간암이 발병함; n=75) 간의 기준시점 대사체 수준의 비교에서, 180개의 대사체가 VIP 값이 1.5를 초과하였다. 이 중 55개의 대사체가 종래에 확인된 바 있으며, 나머지는 신규였다.In a comparison of baseline metabolic levels between control (baseline and 7 years without cancer, n = 134) and HCC group (baseline, no liver cancer, but 7 years with liver cancer; n = 75) The VIP value of the body exceeded 1.5. Of these, 55 metabolites have been identified in the past and the rest are new.

표 2와 3은 대조군과 HCC 군에서 혈청 대사체를 나타낸다.Tables 2 and 3 show serum metabolites in the control and HCC groups.

대조군과 비교하여, HCC 군에서 이소발레르알데히드(isovaleraldehyde), 4-하이드록시노네날(4-hydroxynonenal), 아젤라익산(azelaic acid), 3-하이드록시세바식산(3-hydroxysebacic acid), 트라마트산(traumatic acid), 3-하이드록시도데카네디오익산(3-hydroxydodecanedioic acid), 3-하이드록시테트라데카네디오익산(3-hydroxytetradecanedioic acid), 올레아미드(oleamide, q=2.17x10-5), 페닐알라닐페닐알라닌(phenylalanylphenylalanine), 디하이드로에피안드로스테론 황산염(dehydroepiandrosterone sulfate), 안드로스테론 황산염(androsterone sulfate), L-팔미토일카르니틴(L-palmitoylcarnitine, q=1.26x10-5), 2종의 LPA (16:0, 18:1) 및 14종의 lysoPC(14:0, 15:0, 16:1(q=1.81x10-10), 16:0, 17:0, 18:4, 18:3, 18:2, 18:1(q=2.09x10-5), 20:5, 20:4, 20:3(q=1.97x10-8), 22:6, 22:5)을 포함하는 28개의 대사체의 수준은 현저히 낮았다.Compared with the control group, in the HCC group, isovaleraldehyde, 4-hydroxynonenal, azelaic acid, 3-hydroxysebacic acid, 3-hydroxydodecanedioic acid, 3-hydroxytetradecanedioic acid, oleamide (q = 2.17x10 -5 ), phenyl (3-hydroxydodecanedioic acid) alanyl-phenylalanine (phenylalanylphenylalanine), dihydro-epi Andros Theron sulfate (dehydroepiandrosterone sulfate), Andros Theron sulfate (androsterone sulfate), L- palmitoyl carnitine (L-palmitoylcarnitine, q = 1.26x10 -5), LPA (16 two kinds of (14: 0, 15: 0, 16: 1 ( q = 1.81x10 -10 ), 16: 0, 17: 0, 18: 4, 18: 3, 18 : 28 metabolites, including 5): 2, 18: 1 (q = 2.09x10 -5), 20: 5, 20: 4, 20: 3 (q = 1.97x10 -8), 22: 6, 22 Was significantly lower.

대조군과 비교하여, HCC 군에서 류신(leucine, q=1.84x10-4), 5-하이드록시헥산(5-hydroxyhexanoic acid, q=7.47x10-3), 페닐알라닌(phenylalanine, q=9.22x10-5), 타이로신(tyrosine, q=3.24x10-9), 아라키돈산(arachidonic acid, q=2.51x10-2), 8, 11, 14-에이코사트리엔산(8, 11, 14-eicosatrienoic acid), 글리코우르소데옥시콜릭산(glycoursodeoxycholic acid), 글리콜산(glycolic acid, q=1.18x10-2), 및 타우로우르소데옥시콜릭산(tauroursodeoxycholic acid; TUDCA, q=3.35x10- 4)을 포함하는 9개의 대사체의 수준은 현저히 높았다.Compared to the control, the HCC group leucine (leucine, q = 1.84x10 -4) , 5- hydroxy-hexanes (5-hydroxyhexanoic acid, q = 7.47x10 -3), phenylalanine (phenylalanine, q = 9.22x10 -5) , tyrosine (tyrosine, q = 3.24x10 -9) , arachidonic acid (arachidonic acid, q = 2.51x10 -2 ), 8, 11, 14- trien-eicosyl four acid (8, 11, 14-eicosatrienoic acid), glycoside 9, including -; (4 TUDCA, q = 3.35x10 tauroursodeoxycholic acid) Ur sode DCA acid (glycoursodeoxycholic acid), glycolic acid (glycolic acid, q = 1.18x10 -2 ), and tau by Ur sode DCA acid The levels of metabolites were significantly higher.

또한, 대조군과 비교하여 HCC 군에서 리놀레산의 수준은 현저히 높았다.In addition, the level of linoleic acid was significantly higher in the HCC group than in the control group.

대조군과 HCC 군에서 상향 조절된 혈청 대사체의 동정Identification of upregulated serum metabolites in the control and HCC groups m/zm / z
[M+H]†[M + H] †
[M-H] ‡[M-H] ‡ 화학식The 대사체Metabolism VIPVIP tt -Test-Test Cohen'sCohen's dd PP qq 132.102132.102 C6H13NO2 C 6 H 13 NO 2 L-Leucine†L-Leucine † 3.6823.682 <0.001<0.001 1.84E-041.84E-04 0.5910.591 133.086133.086 C6H12O3 C 6 H 12 O 3 5-Hydroxyhexanoic acid†5-Hydroxyhexanoic acid † 1.6311.631 0.0080.008 7.47E-037.47E-03 0.4610.461 166.086166.086 C9H11NO2 C 9 H 11 NO 2 L-Phenylalanine†L-Phenylalanine † 3.3533.353 <0.001<0.001 9.22E-059.22E-05 0.6150.615 182.081182.081 C9H11NO3 C 9 H 11 NO 3 L-Tyrosine†L-Tyrosine † 3.8443.844 <0.001<0.001 3.24E-093.24E-09 1.1921.192 205.097205.097 C11H12N2O2 C 11 H 12 N 2 O 2 L-Tryptophan†L-Tryptophan † 2.6082.608 0.7760.776 0.2870.287 0.0410.041 253.217253.217 C16H30O2 C 16 H 30 O 2 Palmitoleic acid‡Palmitoleic acid ‡ 2.8712.871 0.1800.180 0.0980.098 0.2200.220 279.232279.232 C18H32O2 C 18 H 32 O 2 Linoleic acid‡Linoleic acid ‡ 4.4664.466 0.0980.098 0.0620.062 0.2670.267 295.226295.226 C18H30O3 C 18 H 30 O 3 9-HOTE†9-HOTE † 1.9611.961 0.1450.145 0.0840.084 0.2550.255 295.227295.227 C18H32O3 C 18 H 32 O 3 Alpha-dimorphecolic acid‡Alpha-dimerphecolic acid ‡ 2.1162.116 0.1160.116 0.0710.071 0.3020.302 301.216301.216 C20H30O2 C 20 H 30 O 2 Eicosapentaenoic acid‡Eicosapentaenoic acid ‡ 1.9681.968 0.3020.302 0.1420.142 0.1570.157 303.232303.232 C20H32O2 C 20 H 32 O 2 Arachidonic acid‡Arachidonic acid ‡ 4.2434.243 0.0320.032 2.51E-022.51E-02 0.3730.373 305.248305.248 C20H34O2 C 20 H 34 O 2 8,11,14-Eicosatrienoic acid‡8,11,14-Eicosatrienoic acid ‡ 2.4012.401 0.0050.005 5.23E-035.23E-03 0.5020.502 319.227319.227 C20H32O3 C 20 H 32 O 3 15(S)-HETE‡15 (S) -HETE ‡ 2.3212.321 0.2350.235 0.1190.119 0.2270.227 325.216325.216 C22H28O2 C 22 H 28 O 2 Etonogestrel†Etonogestrel † 1.7131.713 0.8500.850 0.3060.306 0.0270.027 327.232327.232 C22H32O2 C 22 H 32 O 2 Docosahexaenoic acid‡Docosahexaenoic acid ‡ 4.1274.127 0.1170.117 0.0710.071 0.2600.260 329.247329.247 C22H34O2 C 22 H 34 O 2 Docosapentaenoic acid‡Docosapentaenoic acid ‡ 1.5371.537 0.1890.189 0.1010.101 0.2110.211 343.227343.227 C22H32O3 C 22 H 32 O 3 8-HDoHE‡8-HDoHE ‡ 2.5572.557 0.2710.271 0.1320.132 0.2090.209 448.306448.306 C26H43NO5 C 26 H 43 NO 5 Glycoursodeoxycholic acid‡Glycoursodeoxycholic acid ‡ 4.3414.341 0.0010.001 1.24E-031.24E-03 0.9410.941 464.300464.300 C26H43NO6 C 26 H 43 NO 6 Glycocholic acid‡Glycocholic acid ‡ 2.1712.171 0.0130.013 1.18E-021.18E-02 0.7590.759 498.288498.288 C26H45NO6SC 26 H 45 NO 6 S Tauroursodeoxycholic acid‡Tauroursodeoxycholic acid ‡ 2.3202.320 <0.001<0.001 3.55E-043.55E-04 1.1261.126

†는 ESI-양이온 모드(M/Z [M+H])에서 얻은 대사체, ‡는 ESI-음이온 모드(M/Z [M-H])에서 얻은 대사체이다. VIP는 변수중요도척도이다. P-값은 대조군(n=134) 및 HCC 군(n=75) 간의 독립 t-검정으로부터 도출되었다. q-값은 오류 발견률(FDR)을 보정한 P-값이다. Cohen's d는 합동표준편차(pooled standard deviation)에 의해 분할된 양 평균 간 차이 비교에 대한 영향력 크기이다. d=0.20이면 “작은”, d=0.50이면 “중간의”, d=0.80이면 “큰”으로 영향력의 크기를 정의한다. 변화 경향은 대조군과 비교하여 HCC 군에서 대사체의 상대적 피크 강도를 비교함으로써 결정하였다.† is the metabolite obtained in the ESI-cation mode ( M / Z [M + H]) and ‡ is the metabolite obtained in the ESI-anion mode ( M / Z [MH]). VIP is a variable importance measure. P -values were derived from independent t-tests between the control group (n = 134) and the HCC group (n = 75). The q - value is the P - value that corrects the error detection rate (FDR). Cohen's d is the magnitude of the impact on the comparison of the differences between the two means divided by the pooled standard deviation. Define the magnitude of the influence as "small" if d = 0.20, "medium" if d = 0.50, and "large" if d = 0.80. The trend of change was determined by comparing the relative peak intensities of the metabolites in the HCC group compared to the control group.

대조군과 HCC 군에서 하향 조절된 혈청 대사체의 동정Identification of down-regulated serum metabolites in the control and HCC groups m/zm / z
[M+H]†[M + H] †
[M-H] ‡[M-H] ‡ 화학식The 대사체Metabolism VIPVIP tt -Test-Test Cohen'sCohen's dd PP qq 87.08087.080 C5H10OC 5 H 10 O Isovaleraldehyde†Isovaleraldehyde † 1.5471.547 <0.001<0.001 1.22E-041.22E-04 -0.540-0.540 157.122157.122 C9H16O2 C 9 H 16 O 2 4-Hydroxynonenal†4-Hydroxynonenal † 1.5851.585 <0.001<0.001 1.32E-041.32E-04 -0.536-0.536 189.112189.112 C9H16O4 C 9 H 16 O 4 Azelaic acid†Azelaic acid † 1.5901.590 <0.001<0.001 7.39E-057.39E-05 -0.554-0.554 219.122219.122 C10H18O5 C 10 H 18 O 5 3-Hydroxysebacic acid†3-Hydroxysebacic acid † 2.1182.118 <0.001<0.001 6.91E-056.91E-05 -0.551-0.551 227.201227.201 C14H28O2 C 14 H 28 O 2 Myristic acid‡Myristic acid ‡ 1.5711.571 0.0930.093 0.0600.060 -0.244-0.244 229.143229.143 C12H20O4 C 12 H 20 O 4 Traumatic acid†Traumatic acid † 3.2563.256 <0.001<0.001 6.85E-056.85E-05 -0.544-0.544 247.154247.154 C12H22O5 C 12 H 22 O 5 3-Hydroxydodecanedioic acid†3-Hydroxydodecanedioic acid † 3.5153.515 <0.001<0.001 6.94E-056.94E-05 -0.546-0.546 255.232255.232 C16H32O2 C 16 H 32 O 2 Palmitic acid‡Palmitic acid ‡ 5.1465.146 0.7350.735 0.2760.276 -0.049-0.049 275.185275.185 C14H26O5 C 14 H 26 O 5 3-Hydroxytetradecanedioic acid†3-Hydroxytetradecanedioic acid † 3.7903.790 <0.001<0.001 1.12E-041.12E-04 -0.525-0.525 277.216277.216 C18H30O2 C 18 H 30 O 2 Gamma-linolenic acid‡Gamma-linolenic acid ‡ 1.7251.725 0.2700.270 0.1310.131 -0.160-0.160 281.248281.248 C18H34O2 C 18 H 34 O 2 Oleic acid‡Oleic acid ‡ 5.8675.867 0.9380.938 0.3270.327 -0.011-0.011 282.279282.279 C18H35NOC 18 H 35 NO Oleamide†Oleamide † 2.8172.817 <0.001<0.001 2.17E-052.17E-05 -0.580-0.580 283.263283.263 C18H36O2 C 18 H 36 O 2 Stearic acid‡Stearic acid ‡ 3.1443.144 0.3560.356 0.1610.161 -0.133-0.133 301.216301.216 C20H28O2 C 20 H 28 O 2 All-trans-retinoic acid†All-trans-retinoic acid † 2.2112.211 0.9040.904 0.3190.319 -0.017-0.017 313.154313.154 C18H20N2O3 C 18 H 20 N 2 O 3 Phenylalanylphenylalanine†Phenylalanylphenylalanine † 3.4723.472 <0.001<0.001 5.30E-105.30E-10 -0.893-0.893 367.157367.157 C19H28O5SC 19 H 28 O 5 S Dehydroepiandrosterone sulfate‡Dehydroepiandrosterone sulfate ‡ 2.3822.382 <0.001<0.001 4.26E-044.26E-04 -0.548-0.548 369.173369.173 C19H30O5SC 19 H 30 O 5 S Androsterone sulfate‡Androsterone sulfate ‡ 2.7842.784 <0.001<0.001 1.08E-061.08E-06 -0.780-0.780 400.342400.342 C23H45NO4 C 23 H 45 NO 4 L-Palmitoylcarnitine†L-Palmitoylcarnitine † 1.5181.518 <0.001<0.001 1.26E-051.26E-05 -0.624-0.624 409.235409.235 C19H39O7PC 19 H 39 O 7 P LPA(16:0)‡LPA (16: 0) ‡ 4.0894.089 <0.001<0.001 4.64E-074.64E-07 -0.810-0.810 435.250435.250 C21H41O7PC 21 H 41 O 7 P LPA(18:1)‡LPA (18: 1) ‡ 2.3382.338 <0.001<0.001 4.18E-064.18E-06 -0.731-0.731 468.307468.307 C22H46NO7PC 22 H 46 NO 7 P LysoPC (14:0)†LysoPC (14: 0) † 4.5604.560 <0.001<0.001 3.22E-103.22E-10 -1.051-1.051 480.344480.344 C24H50NO6PC 24 H 50 NO 6 P LysoPC (P-16:0)†LysoPC (P-16: 0) † 2.1512.151 0.8200.820 0.2990.299 -0.033-0.033 482.323482.323 C23H48NO7PC 23 H 48 NO 7 P ysoPC (15:0)†ysoPC (15: 0) † 2.8602.860 <0.001<0.001 3.77E-083.77E-08 -0.865-0.865 494.323494.323 C24H48NO7PC 24 H 48 NO 7 P LysoPC(16:1)LysoPC (16: 1) 5.7005.700 <0.001<0.001 1.81E-101.81E-10 -1.066-1.066 496.339496.339 C24H50NO7PC 24 H 50 NO 7 P LysoPC (16:0)LysoPC (16: 0) 9.9929.992 <0.001<0.001 4.62E-064.62E-06 -0.728-0.728 510.355510.355 C25H52NO7PC 25 H 52 NO 7 P LysoPC (17:0)†LysoPC (17: 0) † 3.7213.721 <0.001<0.001 2.26E-062.26E-06 -0.760-0.760 516.308516.308 C26H46NO7PC 26 H 46 NO 7 P LysoPC (18:4)†LysoPC (18: 4) † 2.0672.067 <0.001<0.001 3.88E-083.88E-08 -0.821-0.821 518.323518.323 C26H48NO7PC 26 H 48 NO 7 P LysoPC (18:3)†LysoPC (18: 3) † 4.0684.068 <0.001<0.001 8.63E-098.63E-09 -0.942-0.942 520.338520.338 C26H50NO7PC 26 H 50 NO 7 P LysoPC (18:2)†LysoPC (18: 2) † 7.4837.483 <0.001<0.001 1.41E-081.41E-08 -1.070-1.070 522.354522.354 C26H52NO7PC 26 H 52 NO 7 P LysoPC (18:1)†LysoPC (18: 1) † 6.0906.090 <0.001<0.001 2.09E-052.09E-05 -0.766-0.766 542.323542.323 C28H48NO7PC 28 H 48 NO 7 P LysoPC (20:5)†LysoPC (20: 5) † 5.9085.908 <0.001<0.001 3.32E-113.32E-11 -1.117-1.117 544.338544.338 C28H50NO7PC 28 H 50 NO 7 P LysoPC (20:4)†LysoPC (20: 4) † 5.1825.182 <0.001<0.001 5.67E-095.67E-09 -0.958-0.958 546.354546.354 C28H52NO7PC 28 H 52 NO 7 P LysoPC(20:3)†LysoPC (20: 3) † 4.8784.878 <0.001<0.001 1.97E-081.97E-08 -0.812-0.812 568.338568.338 C30H50NO7PC 30 H 50 NO 7 P LysoPC (22:6)†LysoPC (22: 6) † 4.1584.158 <0.001<0.001 6.43E-086.43E-08 -0.875-0.875 570.354570.354 C30H52NO7PC 30 H 52 NO 7 P LysoPC (22:5)†LysoPC (22: 5) † 1.9311.931 0.0010.001 1.11E-031.11E-03 -0.494-0.494

†는 ESI-양이온 모드(M/Z [M+H])에서 얻은 대사체, ‡는 ESI-음이온 모드(M/Z [M-H])에서 얻은 대사체이다. VIP는 변수중요도척도이다. P-값은 대조군(n=134) 및 HCC 군(n=75) 간의 독립 t-검정으로부터 도출되었다. q-값은 오류 발견률(FDR)을 보정한 P-값이다. Cohen's d는 합동표준편차(pooled standard deviation)에 의해 분할된 양 평균 간 차이 비교에 대한 영향력 크기이다. d=0.20이면 “작은”, d=0.50이면 “중간의”, d=0.80이면 “큰”으로 영향력의 크기를 정의한다. 변화 경향은 대조군과 비교하여 HCC 군에서 대사체의 상대적 피크 강도를 비교함으로써 결정하였다.† is the metabolite obtained in the ESI-cation mode ( M / Z [M + H]) and ‡ is the metabolite obtained in the ESI-anion mode ( M / Z [MH]). VIP is a variable importance measure. P -values were derived from independent t-tests between the control group (n = 134) and the HCC group (n = 75). The q - value is the P - value that corrects the error detection rate (FDR). Cohen's d is the magnitude of the impact on the comparison of the differences between the two means divided by the pooled standard deviation. Define the magnitude of the influence as "small" if d = 0.20, "medium" if d = 0.50, and "large" if d = 0.80. The trend of change was determined by comparing the relative peak intensities of the metabolites in the HCC group compared to the control group.

실험예Experimental Example 4 : 대상자에서 간암 발병과 관련된 대사 경로 4: Metabolic pathway associated with the development of liver cancer in the subject

선별된 대사체에서 가장 관련성이 높은 경로를 동정하고자, 웹-기반 분석 모듈인 MetaboAnalyst 3.0을 이용하여 대사 경로 분석(Metabolic pathway analysis)을 수행하였다(도 2).Metabolic pathway analysis was performed using MetaboAnalyst 3.0, a web-based analysis module, to identify the most relevant pathways in the selected metabolites (FIG. 2).

간암이 발생한 또는 발생하지 않은 모든 대상자는 기준시점에서 타이로신 대사; 페닐알라닌 대사; 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판 생합성; 발린, 류신 및 이소류신 분해; 발린, 류신 및 이소류신 생합성; 트립토판 대사; 글리세롤인지질 대사; 리놀레산 대사; 아라키돈산 대사; 초기 담즙산 생합성; 및 지방산 대사가 연관되었다(표 4).All subjects with or without liver cancer metastatic at baseline; Phenylalanine metabolism; Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis; Valine, leucine and isoleucine decomposition; Valine, leucine and isoleucine biosynthesis; Tryptophan metabolism; Glycerol phospholipid metabolism; Linoleic acid metabolism; Arachidonic acid metabolism; Early bile acid biosynthesis; And fatty acid metabolism (Table 4).

대사 경로 분석Metabolic pathway analysis 대사 경로Metabolic pathway HitsHits PP FDRFDR ImpactImpact Tyrosine metabolismTyrosine metabolism L-TyrosineL-Tyrosine 2.64E-192.64E-19 2.64E-192.64E-19 0.047240.04724 Phenylalanine metabolismPhenylalanine metabolism L-TyrosineL-Tyrosine 7.92E-197.92E-19 4.16E-184.16E-18 0.119060.11906 L-PhenylalanineL-Phenylalanine Phenylalanine, tyrosine and
tryptophan biosynthesisPhenylalanine, tyrosine and
tryptophan biosynthesis L-TyrosineL-Tyrosine 1.83E-161.83E-16 6.39E-166.39E-16 0.0080.008 L-PhenylalanineL-Phenylalanine L-TryptophanL-Tryptophan Valine, leucine and isoleucine
degradationValine, leucine and isoleucine
degradation L-LeucineL-Leucine 7.29E-127.29E-12 1.70E-111.70E-11 0.022320.02232 Valine, leucine and isoleucine
biosynthesisValine, leucine and isoleucine
biyosynthesis L-LeucineL-Leucine 7.29E-127.29E-12 1.70E-111.70E-11 0.013250.01325 Tryptophan metabolismTryptophan metabolism L-TryptophanL-Tryptophan 1.44E-081.44E-08 2.76E-082.76E-08 0.108530.10853 Glycerophospholipid metabolismGlycerophospholipid metabolism LysoPC(18:1)LysoPC (18: 1) 3.11E-063.11E-06 5.45E-065.45E-06 0.104290.10429 Linoleic acid metabolismLinoleic acid metabolism Linoleic acidLinoleic acid 2.57E-052.57E-05 4.15E-054.15E-05 0.656250.65625 Gamma-linoleic acidGamma-linoleic acid Arachidonic acid metabolismArachidonic acid metabolism Arachidonic acidArachidonic acid 6.30E-056.30E-05 9.45E-059.45E-05 0.22550.2255 15(S)-HETE15 (S) -HETE Primary bile acid biosynthesisPrimary bile acid biosynthesis Glycocholic acidGlycocholic acid 0.0014030.001403 0.0018410.001841 0.008460.00846 Fatty acid metabolismFatty acid metabolism Palmitic acidPalmitic acid 0.0029020.002902 0.0035850.003585 0.029590.02959 L-PalmitoylcarnitineL-Palmitoylcarnitine

Hits는 MetaboAnalyst에 업로드된 대사체와 실제로 일치하는 것이다. FDR은 오류 발견률(False Discovery Rate)을 보정한 P-값이다. Impact는 경로 토폴로지(topology) 분석으로부터 계산된 경로 영향력 값(pathway impact value)이다. 영향력 값 0은 표시하지 않았다.Hits are actually matched to metabolites uploaded to MetaboAnalyst. The FDR is a P -value that corrects the False Discovery Rate. Impact is the pathway impact value calculated from the path topology analysis. Influence value 0 is not displayed.

대사 경로 분석은 타이로신이 타이로신 대사에 속해 있음을 밝혀냈고, 영향력 계수는 0.047로 나타났다. 페닐알라닌 대사는 타이로신 및 페닐알라닌과 연관되었고, 대사 경로 분석 기반의 영향력 계수는 0.119로 나타났다. 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판 생합성은 타이로신, 페닐알라닌 및 트립토판과 연관되었고, 영향력 계수는 0.008로 나타났다. 발린, 류신 및 이소류신의 분해 및 생합성은 모두 류신과 연관되었고, 대사 경로 분석 기반의 영향력 계수는 각각 0.022 및 0.013으로 나타났다.Metabolic pathway analysis revealed that tyrosine belongs to the metabolism of tyrosine, and the coefficient of influence is 0.047. The phenylalanine metabolism was associated with tyrosine and phenylalanine, and the influence coefficient based on metabolic pathway analysis was 0.119. Phenylalanine, tyrosine, and tryptophan biosynthesis were associated with tyrosine, phenylalanine, and tryptophan, and the influence coefficient was 0.008. The degradation and biosynthesis of valine, leucine and isoleucine were all associated with leucine and the influence coefficients based on metabolic pathway analysis were 0.022 and 0.013, respectively.

트립토판 대사는 트립토판과 연관되었고, 영향력 계수는 0.108로 나타났다. 글리세롤인지질 대사는 lysoPC(18:1)과 연관되었고, 영향력 계수는 0.104로 나타났다. 리놀레산 대사는 리놀레산과 감마 리놀레산과 연관되었고, 영향력 계수는 0.656으로 나타났다. 아라키돈산 및 하이드록시에이소카펜타에노익산은 아라키돈산 대사와 연관되었고, 영향력 계수는 0.226으로 나타났다. 초기 담즙산 생합성은 글리코콜릭산과 연관되었고, 영향력 계수는 0.009로 나타났다. L-팔미토일카르니틴 및 팔미틱산은 지방산 대사와 연관되었고, 영향력 계수는 0.030으로 나타났다.The tryptophan metabolism was associated with tryptophan, and the influence coefficient was 0.108. The glycerol phospholipid metabolism was associated with lysoPC (18: 1) and the influence coefficient was 0.104. Linoleic acid metabolism was associated with linoleic acid and gamma linoleic acid, and the coefficient of influence was 0.656. Arachidonic acid and hydroxyacocapentaenoic acid were associated with arachidonic acid metabolism and the coefficient of effect was 0.226. Early bile acid biosynthesis was associated with glycocholic acid, and the influence coefficient was 0.009. L-Palmitoyl carnitine and palmitic acid were associated with fatty acid metabolism and the coefficient of influence was 0.030.

실험예 5 : 간암 발병 빈도에 따른 양상과 주요 대사체 간의 연관성Experimental Example 5: Relationship between the incidence of hepatocellular carcinoma and major metabolites

7년 동안 간암이 발병한 75명의 환자들과 간암이 발병하지 않은 연령과 성별이 매칭된 134명의 대조군에 대해 간암 발병 빈도에 따른 생화학적 특성과 주요 대사체를 포함하는 상관관계 매트릭스를 도 4에 나타냈다.The correlation matrix including the major metabolites and the biochemical characteristics according to the frequency of liver cancer incidence is shown in FIG. 4 for the control group of 75 patients with hepatocellular carcinoma and the age and sex matched hepatocarcinoma group for 7 years .

간암의 발병에 대해 상이한 변수의 독립적인 영향을 분석하고자, 다음의 변수에 대한 단계적 회귀분석(stepwise regression analysis)을 수행하였다: 백혈구 수, AST 수준, ALT 수준; γ-GTP 수준, 및 37가지 대사체(이소발레르알데히드, 4-하이드록시노네날, 아젤라익산, 3-하이드록시세바식산, 3-하이드록시도데카네디오익산, 3-하이드록시테트라데카네디오익산, 올레아미드, 페닐알라닐페닐알라닌, 디하이드로에피안드로스테론 황산염, 안드로스테론 황산염, L-팔미토일카르니틴, LPA(16:0, 18:1), lysoPC(14:0, 15:0, 16:1, 16:0, 17:0, 18:4, 18:3, 18:2, 18:1, 20:5, 20:4, 20:3, 22:6, 22:5), 류신, 5-하이드록시헥산, 페닐알라닌, 타이로신, 아라키돈산, 8, 11, 14-에이코사트리엔산, 글리코우르소데옥시콜릭산, 글리콜산, TUDCA).To analyze the independent effects of different variables on the incidence of liver cancer, stepwise regression analysis was performed on the following variables: leukocyte count, AST level, ALT level; gamma] -GTP levels, and 37 metabolites (including isovaleraldehyde, 4-hydroxy nonenal, azelaic acid, 3-hydroxycabic acid, 3-hydroxydodecanediiodic acid, 3-hydroxytetradecanedioic acid L-palmitoylcarnitine, LPA (16: 0, 18: 1), lysoPC (14: 0, 15: 0, 16: 1), oleamide, phenylalanyl phenylalanine, dihydroepiandrosterone sulfate, androsterone sulfate, 20: 5, 20: 4, 20: 3, 22: 6, 22: 5), leucine, 5- Hydroxyhexane, phenylalanine, tyrosine, arachidonic acid, 8,11,14-eicosatrienoic acid, glycoordoxyocholic acid, glycolic acid, TUDCA).

모든 환자의 간암 발병률은 AST, 타이로신, 올레아미드, lysoPC(16:1), lysoPC(20:3), 5-하이드록시헥산, 안드로스테론 황산염 및 TUDCA에 영향을 받았다. 상기 결과를 바탕으로 AST와 7가지 대사체를 포함하는 상관관계 매트릭스를 작성하였다(도 3).The incidence of liver cancer in all patients was affected by AST, tyrosine, oleamide, lysoPC (16: 1), lysoPC (20: 3), 5-hydroxyhexane, androsterone sulfate and TUDCA. Based on the above results, a correlation matrix containing AST and 7 metabolites was prepared (FIG. 3).

단계적 회귀분석의 결과를 기반으로, ROC 곡선 분석(ROC curve analysis)을 통해 각각의 변수의 최적의 컷오프(cut-off) 값을 결정하였다.Based on the results of the stepwise regression analysis, the optimal cut-off value of each variable was determined by ROC curve analysis.

ROC 곡선의 하단의 영역(AUROC)은 L-타이로신의 경우 0.79±0.03(P<0.001), AST 수준의 경우 0.78±0.04(P<0.001), 5-하이드록시헥산 수준의 경우 0.61±0.04(P=0.010), TUDCA의 경우 0.77±0.04(P<0.001) 였다. 나머지 변수의 경우 AUROC는 0.5 이하였다. 상기 4가지 변수의 예측 확률(88%, P<0.001)의 합은 변수를 독립적으로 고려했을 때 보다 컸다(도 5).Region (AUROC) of the lower end of the ROC curves for L- tyrosine 0.79 ± 0.03 (P <0.001) , when the AST level of 0.78 ± 0.04 (P <0.001) , the case of 5-hydroxy-hexane-level 0.61 ± 0.04 (P = 0.010) and 0.77 ± 0.04 ( P <0.001) for TUDCA, respectively. For the remaining variables, AUROC was less than 0.5. The sum of the predicted probabilities of the four variables (88%, P <0.001) was greater than when the variables were considered independently (FIG. 5).

상기 결과는 타이로신 대사; 페닐알라닌 대사; 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판 생합성; 발린, 류신 및 이소류신 분해; 발린, 류신 및 이소류신 생합성; 트립토판 대사; 글리세롤인지질 대사; 리놀레산 대사; 아라키돈산 대사; 초기 담즙산 생합성; 및 지방산 대사가 임상적 관련성을 시사한다. 상기 결과는 상기 대사 과정의 조절 장애가 간암 발병의 핵심 메커니즘임을 시사한다.The results show that tyrosine metabolism; Phenylalanine metabolism; Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis; Valine, leucine and isoleucine decomposition; Valine, leucine and isoleucine biosynthesis; Tryptophan metabolism; Glycerol phospholipid metabolism; Linoleic acid metabolism; Arachidonic acid metabolism; Early bile acid biosynthesis; And fatty acid metabolism suggest clinical relevance. These results suggest that the metabolic control disorder is a key mechanism of liver cancer development.

상기 결과에서 대조군(기준시점 및 7년간 간암에 걸리지 않음)에 비해 HCC 군(기준시점 암에 걸리지 않았으나 7년간 간암이 발병함)에서 분지형 아미노산과 방향족 아미노산이 모두 유의하게 높았다. 상기 결과는 분지형 아미노산과 방향족 아미노산의 생합성이 증가하고, 분지형 아미노산의 분해가 증가하고, 분지형 아미노산을 산화하는 혈청 카르니틴의 증가를 부분적으로 반영하는 간암의 병리학적 진행을 시사한다.The results showed that both branched and aromatic amino acids were significantly higher in the HCC group than in the control group (baseline and 7 years). These results suggest that the biosynthesis of branched amino acids and aromatic amino acids is increased, the breakdown of branched amino acids is increased, and the pathological progress of liver cancer, which partially reflects the increase of serum carnitine, which oxidizes branched amino acids.

또한, 상기 결과에서 올레아미드가 HCC 군과 정상 대조군의 차별적인 혈청 지질임을 시사한다. 구체적으로, HCC 군은 대조군보다 낮은 수준의 올레아미드를 나타냈고, 이는 올레아미드가 간암 발병률의 독립적인 영향 인자임을 시사한다. 또한, 상기 결과에서 5-하이드록시헥산과 안드로스테론 황산염은 간암 발병률의 독립적인 영향 인자임을 시사한다.In addition, the above results suggest that oleamide is a distinct serum lipid of the HCC group and the normal control group. Specifically, the HCC group showed lower levels of oleamide than the control group, suggesting that oleamide is an independent influential factor in the incidence of liver cancer. In addition, the above results suggest that 5-hydroxyhexane and androsterone sulfate are independent influential factors of hepatocellular carcinoma incidence.

결론적으로, 상기 결과는 간에서 만들어지는 효소인 AST, 방향족 아미노산의 일종인 타이로신, lysoPC(16:1) 및 lysoPC(20:3), 지방산 대사 산물인 5-하이드록시헥산 및 안드로스테론 황산염, 및 담즙산의 일종인 TUDCA는 간암 발병률의 독립적인 영향 인자임을 시사한다.In conclusion, the results show that AST, an enzyme produced in the liver, tyrosine, lysoPC (16: 1) and lysoPC (20: 3) which are aromatic amino acids, 5-hydroxyhexane and androsterone sulfate, TUDCA, one of the bile acids, is an independent influential factor in the incidence of liver cancer.

또한, 상기 결과에서 7년의 추적 기간 동안 이전의 연구와 유사하게 분지형 아미노산과 방향족 아미노산, lysoPC, 뿐만 아니라, 담즙산 생합성 및 리놀레산, 아라키돈산 및 지방산 대사 조절이 간암 발생과 관련이 있음을 시사한다.In addition, in the above results, similar to previous studies, it is suggested that the regulation of bile acid biosynthesis and linoleic acid, arachidonic acid and fatty acid metabolism, as well as branched amino acids and aromatic amino acids, lysoPC, .

또한, 상기 결과에서 HCC 군에서 관찰된 고도 불포화된 lysoPC의 감소는 아라키돈산 수준이 암 및 종양 발생을 유도하는 염증 촉진에 관여할 수 있음을 시사한다.In addition, the above results suggest that the decrease in polyunsaturated lysoPC observed in the HCC group suggests that arachidonic acid levels may be involved in promoting inflammation leading to cancer and tumorigenesis.

상기 결과는 대조군에 비해 HCC 군에서 간세포 아포토시스(apoptosis)의 표지자인 혈청 ALT의 수준이 유의하게 증가함을 보여주었다. 또한, 간암이 발생하기 전에 HCC 군에서 TUDCA 수치가 증가하면 UPR에 의한 간세포 아포토시스를 감소시키는 보상 기전이 될 수 있음을 시사한다.These results showed that the level of serum ALT, a marker of hepatocyte apoptosis in the HCC group, was significantly increased compared to the control group. In addition, it is suggested that increased TUDCA levels in the HCC group before hepatocarcinogenesis may be a compensatory mechanism to reduce hepatocyte apoptosis by UPR.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive. For example, each component described as a single entity may be distributed and implemented, and components described as being distributed may also be implemented in a combined form.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is defined by the appended claims, and all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and their equivalents should be construed as being included within the scope of the present invention.

Claims (8)

(a) 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계;
(b) 상기 생물학적 시료에서 타이로신(tyrosine), AST(aspartate aminotransferase), lysoPC(16:1), lysoPC(20:3), 올레아미드(oleamide), 5-하이드록시헥산(5-hydroxyhexanoic acid), 안드로스테론 황산염(androsterone sulfate), 및 TUDCA(tauroursodeoxycholic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체 농도를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 측정된 대사체의 수준을 정상 대조군 시료에서의 측정값과 비교하는 단계;를 포함하는 간암의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법.(a) obtaining a biological sample from a subject;
(b), wherein the biological sample contains tyrosine, aspartate aminotransferase (AST), lysoPC (16: 1), lysoPC (20: 3), oleamide, 5-hydroxyhexanoic acid, Measuring at least one metabolite concentration selected from the group consisting of androsterone sulfate, and tauroursodeoxycholic acid (TUDCA); And
(c) comparing the level of the measured metabolite to the measured value in a normal control sample. 제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 ALT(alanine aminotransferase), γ-GTP(γ-glutamyl transpeptidase), 류신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 및 아라키돈산(arachidonic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체 농도를 더 측정하는 방법.The method according to claim 1,
In step (b), the concentration of one or more metabolites selected from the group consisting of alanine aminotransferase (ALT),? -Glutamyl transpeptidase (? -GTP), leucine, phenylalanine and arachidonic acid / RTI &gt; 제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 L-팔미토일카르니틴(L-palmitoylcarnitine), LPA(16:0) 및 LPA(18:1)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체 농도를 더 측정하는 방법.The method according to claim 1,
Wherein the concentration of at least one metabolite selected from the group consisting of L-palmitoylcarnitine, LPA (16: 0) and LPA (18: 1) is further measured in the step (b). 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
기준시점으로부터 7년 이후 간암의 발병 가능성을 판단하는 진단 방법.4. The method according to any one of claims 1 to 3,
Diagnostic method to determine the likelihood of liver cancer after 7 years from baseline. 타이로신(tyrosine), AST(aspartate aminotransferase), lysoPC(16:1), lysoPC(20:3), 올레아미드(oleamide), 5-하이드록시헥산(5-hydroxyhexanoic acid), 안드로스테론 황산염(androsterone sulfate), 및 TUDCA(tauroursodeoxycholic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 간암 발병 위험도 진단용 키트.It has been reported that tyrosine, aspartate aminotransferase (AST), lysoPC (16: 1), lysoPC (20: 3), oleamide, 5-hydroxyhexanoic acid, androsterone sulfate , And TUDCA (tauroursodeoxycholic acid). The kit for diagnosing the risk of liver cancer. 제5항에 있어서,
상기 정량장치는 크로마토그래피 및 질량분석기인 키트.6. The method of claim 5,
Wherein the quantification device is a chromatography and mass spectrometer. 제5항에 있어서,
ALT(alanine aminotransferase), γ-GTP(γ-glutamyl transpeptidase), 류신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 및 아라키돈산(arachidonic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체에 대한 정량장치를 더 포함하는 키트.6. The method of claim 5,
Further comprises a quantification device for at least one metabolite selected from the group consisting of ALT (alanine aminotransferase), γ-GTP (γ-glutamyl transpeptidase), leucine, phenylalanine and arachidonic acid The kit. 제5항에 있어서,
L-팔미토일카르니틴(L-palmitoylcarnitine), LPA(16:0) 및 LPA(18:1)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대사체에 대한 정량장치를 더 포함하는 키트.
6. The method of claim 5,
The kit further comprises a quantification device for at least one metabolite selected from the group consisting of L-palmitoylcarnitine, LPA (16: 0) and LPA (18: 1).
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