KR20180128252A - Carbocyclic nucleosides derivatives and the antivirus compositions containing the same - Google Patents
Carbocyclic nucleosides derivatives and the antivirus compositions containing the same Download PDFInfo
- Publication number
- KR20180128252A KR20180128252A KR1020170063574A KR20170063574A KR20180128252A KR 20180128252 A KR20180128252 A KR 20180128252A KR 1020170063574 A KR1020170063574 A KR 1020170063574A KR 20170063574 A KR20170063574 A KR 20170063574A KR 20180128252 A KR20180128252 A KR 20180128252A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- mmol
- formula
- reduced pressure
- under reduced
- reaction
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/16—Purine radicals
- C07H19/167—Purine radicals with ribosyl as the saccharide radical
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
본 발명은 카보사이클릭 뉴클레오사이드 유도체 및 이를 포함하는 항바이러스제에 관한 것이다. The present invention relates to a carbocyclic nucleoside derivative and an antiviral agent comprising the same.
바이러스는 인류의 건강을 위협하는 수많은 난치병들에 대한 대표적인 원인 중 하나로서, 전 세계적으로 이를 예방 또는 치료하기 위해 막대한 자본을 투자하고 있다. 최근에는 치쿤군야 바이러스(Chickungunya Virus), 사스 바이러스(SARS virus), 메르스 바이러스 (MERS virus) 및 지카바이러스(Zika virus) 등의 난치성 RNA 바이러스들이 인류에게 심각한 위험을 초래하고 있어 이들의 증식을 억제할 수 있는 바이러스 치료제의 개발이 시급한 상황이지만, 현재 이 바이러스들을 효과적으로 억제할 수 있는 치료제 또는 예방제가 전무한 실정이다.Viruses are one of the leading causes of many intractable diseases that pose a threat to the health of human beings, and they are investing heavily in capital to prevent or treat them worldwide. In recent years, intractable RNA viruses such as Chickungunya virus, SARS virus, MERS virus and Zika virus have posed a serious risk to mankind and inhibited their proliferation. Although there is an urgent need for the development of antiviral drugs, currently there are no antiviral drugs or prophylactics that can effectively inhibit these viruses.
한편, 항바이러스제들은 다양한 기전(mechanism)을 통해 바이러스를 억제할 수 있는데, 그 중 다음과 같은 두 가지 기전은 바이러스를 효과적으로 억제하는데 사용될 수 있는 것으로 알려져 있다.Antiviral agents, on the other hand, can inhibit the virus through a variety of mechanisms, including the following two mechanisms that can be used to effectively suppress the virus.
첫 번째는, S-adenosylhomocysteine(이하, SAH) 가수분해효소(hydrolase)를 억제하는 것이다.The first is to inhibit S-adenosylhomocysteine (hereinafter, SAH) hydrolase.
SAH 가수분해효소는 NAD+를 조효소로 이용하는 테트라머(tetramer) 형태의 효소로서, SAH를 아데노신(adenosine, Ado)과 호모시스테인(homocysteine, Hcy)으로 가역적으로 가수분해하는 역할을 하며, 생체내 단백질, 지질, 핵산뿐만 아니라 히스타민, 노르에피네프린같은 체내물질들의 메틸화(methylation)에 매우 중요한 효소이다.SAH hydrolytic enzyme is a tetramer type enzyme that uses NAD + as a coenzyme. It plays a role of reversible hydrolysis of SAH to adenosine (Ado) and homocysteine (Hcy) Lipid and nucleic acids as well as methylation of substances in the body such as histamine and norepinephrine.
이러한 SAH 가수분해효소의 억제는 SAH의 축적을 유발하며, 과잉의 SAH는 순차적으로 S-adenosylmethionine(AdoMet)-dependent transmethylase의 억제 및 바이러스 mRNA의 캡핑(capping)를 억제하여 바이러스의 복제에 필요한 단백질이 제대로 만들어지지 못하게 하기 때문에, 결과적으로 항바이러스 효과를 나타내게 된다.Inhibition of SAH hydrolytic enzymes induces accumulation of SAH. Excess SAH sequentially inhibits the inhibition of S-adenosylmethionine (AdoMet) -dependent transmethylase and capping of virus mRNA, It prevents the virus from being properly produced, resulting in an antiviral effect.
대부분의 동물 DNA 바이러스뿐만 아니라 RNA 바이러스도 mRNA 캡핑에 메틸화 효소(viral mRNA guanosine N7-methytransferases, O-2′-methytransferase)가 필수적이므로, SAH 가수분해효소는 광범위 항바이러스제의 개발에 있어서 필수적인 요소로 간주된다. 즉, RNA 바이러스 치료제의 개발과 SAH 가수분해효소 저해제의 개발은 높은 상관성을 갖고 있는 것으로 여겨진다.Since viral mRNA guanosine N7-methytransferases (O-2'-methytransferases) are essential for mRNA encapsulation as well as most animal DNA viruses, SAH hydrolase is considered to be an essential element in the development of broad- spectrum antiviral agents do. That is, the development of a therapeutic agent for RNA viruses and the development of a SAH hydrolase inhibitor are considered to have a high correlation.
두 번째는, 바이러스 RNA 중합효소(polymerase)를 저해하는 것이다.The second is to inhibit the viral RNA polymerase.
RNA 바이러스들은 기질인 Nucleoside-5’-triphosphate(NTP)가 RNA 중합효소(polymerase)에 의해 RNA 사슬(chain)로 삽입되어 복제된다. 따라서, RNA 중합효소를 저해하는 물질 또한 항바이러스제 역할을 할 수 있으며, 체내에서 3인산염(triphosphate)으로 전환되어 바이러스 RNA 중합효소를 선택적으로 억제하거나 바이러스 RNA 사슬로 직접 삽입되어 연쇄종결반응(chain termination)을 유도하는 물질을 이용하면 효과적인 항바이러스제를 개발할 수 있을 것으로 여겨진다.RNA viruses are replicated by inserting the substrate Nucleoside-5'-triphosphate (NTP) into the RNA chain by RNA polymerase. Therefore, a substance that inhibits RNA polymerase can also act as an antiviral agent and can be converted into triphosphate in the body to selectively inhibit viral RNA polymerase or directly inserted into a viral RNA chain to perform chain termination ) Can be used to develop an effective antiviral agent.
다만, 항바이러스제가 RNA 중합효소의 저해제 기능도 갖는 경우 선택성을 높이는 것이 어렵기 때문에, 바이러스뿐 아니라 정상세포에도 독성을 나타낼 수 있다.However, since it is difficult to increase selectivity when an antiviral agent also has an inhibitory function of an RNA polymerase, it may exhibit toxicity to normal cells as well as viruses.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 SAH 가수분해효소를 억제하는 기능을 갖고 있어 바이러스를 효과적으로 억제할 수 있으면서도, 체내 독성이 거의 없어, 바이러스의 억제와 바이러스성 질환의 예방 및 치료에 매우 적합하게 활용될 수 있는 신규 카보사이클릭 뉴클레오사이드(carbocyclic nucleoside) 유도체를 제공하는 것이다.Accordingly, a problem to be solved by the present invention is to provide a pharmaceutical composition which is capable of effectively inhibiting a virus because it has a function of inhibiting SAH hydrolase, has little toxicity in the body, is well suited for the inhibition of viruses and for the prevention and treatment of viral diseases And to provide novel carbocyclic nucleoside derivatives that can be utilized.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The present invention has been made in view of the above problems, and it is an object of the present invention to provide a method of manufacturing the same.
상술한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 카보사이클릭 뉴클레오사이드(carbocyclic nucleoside) 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 A로 표현된다.In order to solve the above-mentioned problems, a carbocyclic nucleoside derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to an embodiment of the present invention is represented by the following formula (A).
<화학식 A>≪ Formula (A)
상기 화학식 A에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 불소이고, B는 하기 화학식 B-1 또는 B-2이다.In the formula (A), R 1 and R 2 are each independently hydrogen or fluorine, and B is B-1 or B-2.
<화학식 B-1><Formula B-1>
상기 화학식 B-1에서, X1는 염소, 수산기, 아미노기 또는 알킬아미노기이고, Y1는 수소 또는 아미노기이다.In the above formula (B-1), X 1 is chlorine, a hydroxyl group, an amino group or an alkylamino group, and Y 1 is a hydrogen atom or an amino group.
<화학식 B-2><Formula B-2>
상기 화학식 B-2에서, X2는 수산기 또는 아미노기이고, Y2는 수소, 메틸기 또는 할로겐이다.In the above formula (B-2), X 2 is a hydroxyl group or an amino group, and Y 2 is hydrogen, a methyl group or a halogen.
상기 R1은 불소일 수 있다.The R < 1 > may be fluorine.
상기 화학식 A는 하기 화학식 5a 또는 화학식 5b일 수 있다.The formula (A) may be represented by the following formula (5a) or (5b).
<화학식 5a>≪ Formula 5a &
<화학식 5b>≪ Formula 5b >
상술한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 실시예에 따른 카보사이클릭 뉴클레오사이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 항바이러스제는 하기 화학식 A로 표현된다.An antiviral agent comprising a carbocyclic nucleoside derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to another embodiment of the present invention for solving the above-mentioned problems is represented by the following formula (A).
<화학식 A>≪ Formula (A)
상기 화학식 A에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 불소이고, B는 하기 화학식 B-1 또는 B-2이다.In the formula (A), R 1 and R 2 are each independently hydrogen or fluorine, and B is B-1 or B-2.
<화학식 B-1><Formula B-1>
상기 화학식 B-1에서, X1는 염소, 수산기, 아미노기 또는 알킬아미노기이고, Y1는 수소 또는 아미노기이다.In the above formula (B-1), X 1 is chlorine, a hydroxyl group, an amino group or an alkylamino group, and Y 1 is a hydrogen atom or an amino group.
<화학식 B-2><Formula B-2>
상기 화학식 B-2에서, X2는 수산기 또는 아미노기이고, Y2는 수소, 메틸기 또는 할로겐이다.In the above formula (B-2), X 2 is a hydroxyl group or an amino group, and Y 2 is hydrogen, a methyl group or a halogen.
상기 R1은 불소일 수 있다.The R < 1 > may be fluorine.
상기 화학식 A는 하기 화학식 5a 또는 화학식 5b일 수 있다.The formula (A) may be represented by the following formula (5a) or (5b).
<화학식 5a>≪ Formula 5a &
<화학식 5b>≪ Formula 5b >
본 발명으로 체내 독성이 거의 없는 신규 항바이러스제로서의 개발이 이루어질 수 있을 것이라 판단되며, 이는 향후 대표적 국가지식기반사업인 신약개발 분야 발달에 큰 기여를 할 수 있으며 국민 건강이 향상되는 효과를 기대할 수 있음은 물론 경제 발달에 이바지할 수 있다고 예상된다.The present invention can be considered as a new antiviral agent having little toxicity in the body. This can contribute to the development of the new drug development field, which is a representative national knowledge base, and can improve the public health. But also contribute to economic development.
도 1 내지 도 3은 실험 결과들을 정리한 것이다.1 to 3 show the results of experiments.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.Advantages and features of the present invention and methods of achieving them will become apparent with reference to the embodiments described in detail below. The present invention may, however, be embodied in many different forms and should not be construed as being limited to the embodiments set forth herein. Rather, these embodiments are provided so that this disclosure will be thorough and complete, and will fully convey the scope of the invention to those skilled in the art. Is provided to fully convey the scope of the invention to those skilled in the art, and the invention is only defined by the scope of the claims.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 일 실시예에 따른 카보사이클릭 뉴클레오사이드(carbocyclic nucleoside) 유도체는 하기 화학식 A로 표현될 수 있다.A carbocyclic nucleoside derivative according to an embodiment of the present invention may be represented by the following formula (A).
<화학식 A>≪ Formula (A)
상기 화학식 A에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 불소이고, B는 하기 화학식 B-1 또는 B-2일 수 있다.In the formula (A), R 1 and R 2 are each independently hydrogen or fluorine, and B may be represented by the following formula (B-1) or (B-2).
<화학식 B-1><Formula B-1>
상기 화학식 B-1에서, X1는 염소, 수산기(hydroxy group), 아미노기(amino group) 또는 알킬아미노(alkylamino group)기이고, Y1는 수소 또는 아미노기일 수 있다.In the above formula (B-1), X 1 is chlorine, a hydroxy group, an amino group or an alkylamino group, and Y 1 may be hydrogen or an amino group.
상기 알킬아미노기는 -NHMe, -NHEt 등의 모노알킬아미노기(-NHR) 또는 -NMe2, -NMeEt, -NEt2 등의 다이알킬아미노기(-NR2)일 수 있다.The alkylamino group may be a monoalkyl amino group (-NHR), or -NMe 2, -NMeEt, -NEt 2, such as a dialkyl amino group (-NR 2), such as -NHMe, -NHEt.
<화학식 B-2><Formula B-2>
상기 화학식 B-2에서, X2는 수산기 또는 아미노기이고, Y2는 수소, 메틸기(methyl group) 또는 할로겐일 수 있다.In the above formula (B-2), X 2 is a hydroxyl group or an amino group, and Y 2 may be hydrogen, a methyl group or a halogen.
구체적으로, 상기 화학식 A에서, R1은 불소이고, B는 상기 화학식 B-1일 수 있다.Specifically, in the above formula (A), R 1 may be fluorine, and B may be the above formula (B-1).
더욱 구체적으로는, 상기 화학식 A로 표현되는 카보사이클릭 뉴클레오사이드 유도체는 하기 화학식 5a로 표현되는 화합물 또는 화학식 5b로 표현되는 화합물일 수 있다.More specifically, the carbocyclic nucleoside derivative represented by the above formula (A) may be a compound represented by the following formula (5a) or a compound represented by the following formula (5b).
<화학식 5a>≪ Formula 5a &
<화학식 5b>≪ Formula 5b >
상기 화학식 A로 표현되는 카보사이클릭 뉴클레오사이드 유도체는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 제공될 수 있다. 염으로는 약학적으로 허용되는 다양한 유기산 또는 무기산에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 적합한 유기산으로는, 예를 들면 사복시산, 포스폰산, 술폰산, 아세트산, 프로피온산, 옥탄산, 데칸산, 글리콜산, 락트산, 푸마르산, 숙신산, 아디프산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 글루탐산, 아스파르트산, 말레산, 벤조산, 살리실산, 프탈산, 페닐아세트산, 벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 메틸황산, 에틸황산, 도데실황산 등을 사용할 수 있고, 적합한 무기산으로는, 예를 들면 염산, 황상 등의 할로겐산 또는 인산 등을 사용할 수 있다.The carbocyclic nucleoside derivative represented by the above formula (A) may be provided in the form of a pharmaceutically acceptable salt. Salts are useful as acid addition salts formed by various pharmaceutically acceptable organic or inorganic acids. Suitable organic acids include, for example, organic acids such as formic acid, phosphonic acid, acetic acid, propionic acid, octanoic acid, decanoic acid, glycolic acid, lactic acid, fumaric acid, succinic acid, adipic acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, glutamic acid, There may be used maleic acid, benzoic acid, salicylic acid, phthalic acid, phenylacetic acid, benzenesulfonic acid, 2-naphthalenesulfonic acid, methylsulfuric acid, ethylsulfuric acid and dodecylsulfuric acid. Suitable inorganic acids include, for example, Or phosphoric acid can be used.
다만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 카보사이클릭 뉴클레오사이드 유도체는 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물 형태로도 제공될 수 있다.However, the present invention is not limited thereto. The carbocyclic nucleoside derivative of the present invention may be provided in the form of all salts, hydrates and solvates which can be prepared by conventional methods.
본 발명의 일 실시예에 따른 항바이러스제는 상술한 카보사이클릭 뉴클레오사이드 유도체를 유효 성분으로서 포함할 수 있다.The antiviral agent according to one embodiment of the present invention may include the above-mentioned carbocyclic nucleoside derivative as an active ingredient.
항바이러스제란 바이러스의 활성, 복제 등을 억제하는 것뿐만 아니라, 바이러스에 의해 유발되는 모든 질환들의 예방 및/또는 치료 용도로도 사용될 수 있는 약학적 조성물을 의미한다.An antiviral agent means a pharmaceutical composition which can be used not only for inhibiting the activity and replication of a virus but also for preventing and / or treating all diseases caused by viruses.
상기 바이러스는, 예를 들면 치쿤군야 바이러스(Chickungunya Virus, CHIKV), 샘리키 삼림열 바이러스(Semliki Forrest Virus, SFV), 메르스 바이러스(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, MERS-CoV), 사스 바이러스(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus, SARS-CoV), 말동맥염 바이러스(Equine Arteritis Virus, EAV), 마우스간염 바이러스(Mouse Hepatitis Virus, MHV), 신드비스 바이러스(Sindbis Virus, SINV) 등의 RNA 바이러스를 포함할 수 있다.The virus may be, for example, Chickungunya Virus (CHIKV), Semliki Forrest Virus (SFV), Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), Severe Acute Viruses such as Respiratory Syndrome Coronavirus (SARS-CoV), Equine Arteritis Virus (EAV), Mouse Hepatitis Virus (MHV), and Sindbis Virus (SINV).
상술한 카보사이클릭 뉴클레오사이드 유도체를 포함하는 항바이러스제는 SAH 가수분해효소를 저해하는 것을 주요 기전으로 하여 바이러스를 효과적으로 억제하는 약학적 조성물일 수 있다.The antiviral agent comprising the above-described carbocyclic nucleoside derivative may be a pharmaceutical composition that effectively inhibits the virus by inhibiting the SAH hydrolase.
상기 항바이러스제는 전신적 또는 국부적으로 투여될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여를 위해 일반적으로 사용될 수 있는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 부형제(또는 희석제)를 사용하여 제형화될 수 있다. 이하, 부형제 및 제형 방법에 대해 구체적으로 예시하지만, 이들 예로 한정되는 것은 아니다.The antiviral agent may be administered systemically or locally and may be formulated using excipients (or diluents) such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants that can be generally used for oral or parenteral administration . Hereinafter, the excipient and the formulation method will be specifically exemplified, but are not limited thereto.
경구 투여를 위한 고형 제형은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함할 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화학식 A의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제형은, 예를 들면 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 들 수 있으며, 액상 제형은 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.Solid formulations for oral administration may include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain one or more excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose sucrose), lactose, gelatin, and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like may also be used. Examples of liquid formulations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups, and the like. The liquid formulations may contain various excipients such as water, liquid paraffin, which are simple diluents commonly used, Flavoring agents, fragrances, preservatives, and the like.
비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 유제, 흡입제, 좌제 등을 포함할 수 있다. 주사제는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트 등과 같은 에스테르 등의 멸균된 수성 용제, 비수성 용제 및 현탁제를 포함할 수 있고, 좌제는 기제로서 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등을 포함할 수 있다. 또한, 국소 적용을 위해 본 발명의 항바이러스제를 연고나 크림으로 제형화할 수도 있다.Formulations for parenteral administration may include injections, emulsions, inhalants, suppositories, and the like. The injectable preparation may contain sterilized aqueous solvents such as propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, esters such as ethyl oleate, non-aqueous solvents and suspensions, and the suppositories may contain witepsol, Macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin, and the like. In addition, the antiviral agent of the present invention may be formulated into ointments or creams for topical application.
상기 항바이러스제의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간 등의 다수의 인자에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 또한 투여 경로는 환자의 상태 및 그의 중증도에 따라 변화할 수 있다.The preferred dosage of the antiviral agent varies depending on a number of factors such as the condition and weight of the patient, the severity of the disease, the type of the drug, the route of administration and the period of time, but may be suitably selected by those skilled in the art. The route of administration may also vary depending on the condition of the patient and its severity.
본 발명의 카보사이클릭 뉴클레오사이드 유도체는 RNA 바이러스에 대한 항바이러스 효능을 갖는 동시에 체내 독성이 거의 없는 생체친화적인 특성을 갖기 때문에(실험예 참조), 바이러스의 억제와 바이러스성 질환의 예방 및/또는 치료에 매우 적합한 약학적 조성물로서 사용될 수 있다.Since the carbocyclic nucleoside derivative of the present invention has antiviral efficacy against RNA viruses and has biocompatible properties with little toxicity in the body (see Experimental Example), it is possible to inhibit viruses and prevent and / Or as a pharmaceutical composition that is well suited for treatment.
제조예Manufacturing example 1 One
무수 THF(300ml)에 브롬화구리 디메틸설파이드 복합체(CuBr/Me2S complex)(933mg, 4.54mmol)를 녹인 뒤 -78℃에서 1.0M 비닐마그네슘 브로마이드/THF 용액(vinylmagnesium bromide 1.0M solution in THF)(69.3 ml, 69.3mmol)과 헥사메틸포스포아미드(hexamethylphosphoramide, HMPA)(33.4ml, 192mmol)를 첨가하였다. 무수 THF(180ml)에 디-시클로펜테논(D-cyclopentenone)(5g, 32.4mmol)과 클로로트리메틸실란(TMSCl)(20.6ml, 162mmol)을 함께 녹인 후 이것을 반응 플라스크에 서서히 적가한 후 -78℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되었음을 TLC로 확인한 후, 포화 암모늄 클로라이드(NH4Cl) 수용액을 가하고 수용액층을 에틸아세테이트로 추출한 뒤 유기층을 분액하였다. 분리된 유기층을 물과 브라인(brine)으로 충분히 세척한 후, 황산 마그네슘(MgSO4)으로 건조시키고, 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축하였다. 농축된 잔류물을 실리카젤 크로마토그래피를 통해 분리 정제하여 제1 중간체(4.48g, 76%)를 얻었다.(CuBr / Me 2 S complex) (933 mg, 4.54 mmol) was dissolved in anhydrous THF (300 ml) at -78 ° C. and then a 1.0 M solution of vinylmagnesium bromide in THF 69.3 ml, 69.3 mmol) and hexamethylphosphoramide (HMPA) (33.4 ml, 192 mmol). D-cyclopentenone (5 g, 32.4 mmol) and chlorotrimethylsilane (TMSCl) (20.6 ml, 162 mmol) were dissolved together in anhydrous THF (180 ml), and the mixture was slowly added dropwise to the reaction flask. Lt; / RTI > for 2 h. After completion of the reaction was confirmed by TLC, an aqueous solution of saturated ammonium chloride (NH 4 Cl) was added thereto. The aqueous layer was extracted with ethyl acetate, and the organic layer was separated. The separated organic layer was washed thoroughly with water and brine, dried over magnesium sulfate (MgSO 4 ), and filtered under reduced pressure to remove the remaining solid and then concentrated under reduced pressure. The concentrated residue was purified by silica gel chromatography to obtain a first intermediate (4.48 g, 76%).
상기 제1 중간체(4.7g, 26.0mmol)를 메탄올(100mL)에 녹인 후 0℃에서 소듐보로하이드라이드(NaBH4)(1.1g, 28.6mmol)을 첨가하였다. 같은 온도에서 반응 혼합물을 30분 동안 교반한 뒤, 물과 소량의 아세트산으로 중화시키고 수용액층을 에틸아세테이트로 추출한 뒤 유기층을 분액하였다. 분리된 유기층을 물과 브라인(brine)으로 충분히 세척한 후, 황산 마그네슘(MgSO4)으로 건조시키고, 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축하였다. 농축된 잔류물을 실리카젤 크로마토그래피를 통해 분리 정제하여 제2 중간체(4.6g, 97%)를 얻었다.The first intermediate (4.7 g, 26.0 mmol) was dissolved in methanol (100 mL) and sodium borohydride (NaBH 4 ) (1.1 g, 28.6 mmol) was added at 0 ° C. The reaction mixture was stirred at the same temperature for 30 minutes, and neutralized with water and a small amount of acetic acid. The aqueous layer was extracted with ethyl acetate, and the organic layer was separated. The separated organic layer was washed thoroughly with water and brine, dried over magnesium sulfate (MgSO 4 ), and filtered under reduced pressure to remove the remaining solid and then concentrated under reduced pressure. The concentrated residue was purified by silica gel chromatography to obtain a second intermediate (4.6 g, 97%).
상기 제2 중간체(4.6g, 25.2mmol)를 DMF(30 mL)에 녹인 후 이미다졸(imidazole)(8.6g, 126.2mmol)과 클로로터트부틸디페닐실란(TBDPSCl) (10.4g, 37.8mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고 물을 가한 후, 디에틸에테르로 추출한 뒤 유기층을 분액하였다. 분리된 유기층을 물과 브라인(brine)으로 충분히 세척한 후, 황산 마그네슘(MgSO4)으로 건조시키고, 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축하였다. 농축된 잔류물을 실리카젤 크로마토그래피를 통해 분리 정제하여 제3 중간체(10.2g, 92%)를 얻었다.The imidazole (8.6 g, 126.2 mmol) and chlorotetrabutyldiphenylsilane (TBDPSCl) (10.4 g, 37.8 mmol) were dissolved in DMF (30 mL), and the second intermediate (4.6 g, 25.2 mmol) At 0 < 0 > C. The reaction mixture was stirred at room temperature for 1 hour, water was added, and the mixture was extracted with diethyl ether and the organic layer was separated. The separated organic layer was washed thoroughly with water and brine, dried over magnesium sulfate (MgSO 4 ), and filtered under reduced pressure to remove the remaining solid and then concentrated under reduced pressure. The concentrated residue was purified by silica gel chromatography to obtain a third intermediate (10.2 g, 92%).
상기 제3 중간체(10.0g, 23.6mmol)를 THF(125mL)에 녹인 후 2.0M 보레인 디메틸설파이드 콤플렉스/THF 용액(borane-dimethyl sulfide complex 2.0M solution in THF)(35.5mL, 71.0mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한 뒤 0℃에서 과붕산소듐(sodium perborate)(7.2g, 71.0mmol)을 넣고 서서히 물(30mL)을 점적하였다. 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반한 후, 수용액층을 에틸아세테이트로 추출한 뒤 유기층을 분액하였다. 분리된 유기층을 물과 브라인(brine)으로 충분히 세척한 후, 황산 마그네슘(MgSO4)으로 건조시키고, 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축하였다. 농축된 잔류물을 실리카젤 크로마토그래피를 통해 분리 정제하여 제4 중간체(7.5g, 72%)를 얻었다.The tertiary intermediate (10.0 g, 23.6 mmol) was dissolved in THF (125 mL), and a borane-dimethyl sulfide complex 2.0 M solution in THF (35.5 mL, 71.0 mmol) Lt; 0 > C. The reaction mixture was stirred at room temperature for 4 hours, then sodium perborate (7.2 g, 71.0 mmol) was added at 0 ° C and water (30 mL) was slowly added thereto. After the reaction mixture was stirred at room temperature for 12 hours, the aqueous layer was extracted with ethyl acetate, and the organic layer was separated. The separated organic layer was washed thoroughly with water and brine, dried over magnesium sulfate (MgSO 4 ), and filtered under reduced pressure to remove the remaining solid and then concentrated under reduced pressure. The concentrated residue was purified by silica gel chromatography to obtain a fourth intermediate (7.5 g, 72%).
상기 제4 중간체(7.5g, 17.0mmol)를 THF(200mL)에 녹인 후 0℃에서 1.0M 테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드/THF 용액(tetra-n-butylammonium fluoride 1.0M solution in THF)(51.0mL, 51.1mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반한 후, 용매를 감압하여 제거한 뒤 농축된 잔류물은 실리카젤 크로마토그래피를 통해 분리 정제하여 제5 중간체(3.3g, 93%)를 얻었다.The fourth intermediate (7.5g, 17.0mmol) of was dissolved in THF (200mL) at 0 ℃ 1.0M tetra - n - butylammonium fluoride / THF solution (tetra- n -butylammonium fluoride 1.0M solution in THF) (51.0 mL, 51.1 mmol). The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 hours, and the solvent was removed under reduced pressure. The concentrated residue was separated and purified by silica gel chromatography to obtain a fifth intermediate (3.3 g, 93%).
상기 제5 중간체(3.3g, 16.3mmol)를 염화메틸렌(40mL)에 녹인 후 0℃에서 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)(0.2g, 1.6mmol), 트리에틸아민 (triethylamine)(6.8mL, 48.9mmol) 그리고 클로로터트부틸디페닐실란(TBDPSCl) (4.9g, 17.9mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 물을 가하여 반응을 종결시킨 후, 수용액층을 염화메틸렌으로 추출한 뒤 유기층을 분액하였다. 유기층을 물과 브라인(brine)으로 충분히 세척한 후, 황산 마그네슘(MgSO4)으로 건조시키고, 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축하였다. 농축된 잔류물을 실리카젤 크로마토그래피를 통해 분리 정제하여 제6 중간체(5.7g, 80%)를 얻었다.4-Dimethylaminopyridine (DMAP) (0.2 g, 1.6 mmol) and triethylamine (6.8 mL, 48.9 mmol) were dissolved in 40 mL of methylene chloride. mmol) and chlorotetrabutyldiphenylsilane (TBDPSCl) (4.9 g, 17.9 mmol). The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 hours. After water was added to terminate the reaction, the aqueous layer was extracted with methylene chloride, and the organic layer was separated. The organic layer was washed thoroughly with water and brine, dried over magnesium sulfate (MgSO 4 ), and filtered under reduced pressure to remove the remaining solid, which was then concentrated under reduced pressure. The concentrated residue was purified by silica gel chromatography to obtain a sixth intermediate (5.7 g, 80%).
상기 제6 중간체(5.0g, 11.3mmol)를 염화메틸렌(25mL)에 녹인 후 실온에서 N-메틸몰포린 N-옥사이드(N-methylmorpholine N-oxide)(2.0g, 17.0mmol), 4 Å molecular sieves(1.0g) 및 테트라프로필암모늄 퍼루테네이트(tetrapropylammonium perruthenate)(0.2g, 0.5mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 후, 셀라이트(Celite)와 실리카젤 패드를 통해 감압 여과하여 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축하였다. 농축된 잔류물을 실리카젤 크로마토그래피를 통해 분리 정제하여, 하기와 같은 1H-NMR 스펙트럼을 갖는 하기 화학식 1의 화합물(4.8g, 98%)을 얻었다.After dissolving the sixth intermediate (5.0 g, 11.3 mmol) in methylene chloride (25 mL), N-methylmorpholine N-oxide (2.0 g, 17.0 mmol) and 4 molecular sieves (1.0 g) and tetrapropylammonium perruthenate (0.2 g, 0.5 mmol) were added. The reaction mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, then filtered through Celite and silica gel pad under reduced pressure to remove the remaining solid and then concentrated under reduced pressure. The concentrated residue was separated and purified by silica gel chromatography to obtain 4.8 g (98%) of a compound represented by the following formula (1) having a 1 H-NMR spectrum as described below.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.64 (m, 4 H), 7.41 (m, 6 H), 4.57 (d, J = 5.6 Hz, 1 H), 4.17 (m, 1 H), 3.72 (m, 3 H), 2.73 (dd, J = 8.8, 18.4 Hz, 1 H), 2.61 (m, 1 H), 2.03 (dt, J = 1.6, 17.6 Hz, 1 H), 1.68 (m, 1 H), 1.43 (s, 3 H), 1.33 (s, 3 H), 1.05 (s, 9 H) 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 )? 7.64 (m, 4 H), 7.41 (m, 6 H), 4.57 (d, J = 5.6 Hz, m, 3 H), 2.73 ( dd, J = 8.8, 18.4 Hz, 1 H), 2.61 (m, 1 H), 2.03 (dt, J = 1.6, 17.6 Hz, 1 H), 1.68 (m, 1 H ), 1.43 (s, 3 H), 1.33 (s, 3 H), 1.05 (s, 9 H)
<화학식 1>≪ Formula 1 >
제조예Manufacturing example 2-1 2-1
제조예 1에서 합성한 화학식 1의 화합물(4.2g, 9.5mmol)을 무수 THF에 녹인 뒤, 클로로트리에틸실란(TESCl)(16.7mL, 99.2mmol)을 적가하고 -78℃로 냉각시켰다. 냉각된 혼합물에 1.0M 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드/THF 용액 (LiHMDS 1.0M solution in THF)(50mL, 50mmol)을 서서히 적가한 뒤, 30분간 동일 조건에서 반응물을 교반하여 실릴 에놀 에테르화 시켰다. 반응이 종결되었음을 TLC로 확인한 뒤, 반응 혼합물을 포화 암모늄 클로라이드(NH4Cl) 수용액을 가하고 수용액층을 에틸아세테이트로 추출한 뒤 유기층을 분액하였다. 분리된 유기층을 물과 브라인(brine)으로 충분히 세척한 후, 황산 마그네슘(MgSO4)으로 건조시키고, 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축하였다. 이 농축된 잔류물을 무수 아세토나이트릴에 녹인 후, 0℃로 냉각시켰다. 냉각된 혼합물에 1-클로로메틸-4-플루오로-1,4-디아조니아비사이클로 [2.2.2]옥탄 비스(테트라플루오로보레이트)(상표명 Selectfluor®)(10.15g, 28.65mmol)를 1.5 당량 적가한 뒤 동일 조건에서 15시간 동안 교반하여 플루오로화된 화합물의 혼합물을 얻었다. Compound (1) (4.2 g, 9.5 mmol) synthesized in Preparation Example 1 was dissolved in anhydrous THF, and chlorotriethylsilane (TESCl) (16.7 mL, 99.2 mmol) was added dropwise and cooled to -78 ° C. To the cooled mixture, a 1.0 M lithium bis (trimethylsilyl) amide / THF solution (LiHMDS 1.0M solution in THF) (50 mL, 50 mmol) was slowly added dropwise and the reaction was stirred for 30 minutes under the same conditions for silylenol etherification. After confirming that the reaction was completed by TLC, the reaction mixture was added with an aqueous solution of saturated ammonium chloride (NH 4 Cl), the aqueous layer was extracted with ethyl acetate, and the organic layer was separated. The separated organic layer was washed thoroughly with water and brine, dried over magnesium sulfate (MgSO 4 ), and filtered under reduced pressure to remove the remaining solid and then concentrated under reduced pressure. The concentrated residue was dissolved in anhydrous acetonitrile and then cooled to 0 < 0 > C. To the cooled mixture was added a solution of 1-chloromethyl-4-fluoro-1,4-diazoniabicyclo [2.2.2] octane bis (tetrafluoroborate) (Selectfluor ® ) (10.15 g, 28.65 mmol) The mixture was stirred for 15 hours under the same conditions to obtain a mixture of fluorinated compounds.
상기 혼합물의 생성 반응이 종결된 것을 TLC에서 확인한 후, 반응 혼합물에 포화 암모늄 클로라이드(NH4Cl) 수용액을 가하여 수용액층을 에틸아세테이트로 추출한 뒤 유기층을 분액하였다. 분리된 유기층을 물과 브라인(brine)으로 충분히 세척한 후, 황산 마그네슘(MgSO4)으로 건조시키고 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축하였다. 농축된 잔류물은 실리카젤 크로마토그래피를 통해 분리 정제하여, 하기와 같은 1H NMR 스펙트럼을 갖는 하기 화학식 2a의 화합물(3.7g, 84%)을 얻었다.After confirming that the reaction for producing the mixture was completed by TLC, an aqueous solution of saturated ammonium chloride (NH 4 Cl) was added to the reaction mixture, the aqueous layer was extracted with ethyl acetate, and the organic layer was separated. The separated organic layer was washed thoroughly with water and brine, dried over magnesium sulfate (MgSO 4 ), and filtered under reduced pressure to remove the remaining solid, which was then concentrated under reduced pressure. The concentrated residue was separated and purified by silica gel chromatography to obtain the compound of the following formula (2a) (3.7 g, 84%) having the 1 H NMR spectrum as described below.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.65 (m, 4 H), 7.39 (m, 6 H), 5.43 (dd, J = 50.6, 7.14 Hz, 1 H), 4.77 (m, 1 H), 4.46 (m, 1 H), 3.74 (m, 2 H), 2.51 (m, 1 H), 1.79 (m, 2 H), 1.45 (s, 3 H), 1.29 (s, 3 H), 1.03 (s, 9 H) (디올 형태로 평형을 이룬 물질로 추정되는 피크와 섞여있음.) 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3 )? 7.65 (m, 4 H), 7.39 (m, 6 H), 5.43 (dd, J = 50.6, 7.14 Hz, 3H), 1.29 (s, 3H), 1.03 (m, 2H), 1.46 s, 9 H) (mixed with a peak estimated to be equilibrated in diol form).
<화학식 2a>≪ EMI ID =
제조예Manufacturing example 2-2 2-2
출발물질로서 화학식 1의 화합물이 아닌 제조예 2-1에서 합성한 화학식 2a의 화합물(2.5g, 5.4mmol)을 사용한 점을 제외하고는 제조예 2-1과 동일한 과정을 진행하여, 하기와 같은 1H NMR 스펙트럼을 갖는 하기 화학식 2b의 화합물(1.6g, 61%)을 얻었다.The same procedure was followed as in Production Example 2-1, except that the compound of Formula 2a (2.5 g, 5.4 mmol) synthesized in Production Example 2-1, which was not the compound of Formula 1, was used as the starting material, To obtain the compound of the following formula (2b) (1.6 g, 61%) having 1 H NMR spectrum.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.69 (m, 4 H), 7.40 (m, 6 H), 4.35 (dd, J = 3.6, 7.6 Hz, 1 H), 4.30 (m, 1 H), 4.21 (br, s, 1 H), 3.78 (ddd, J = 6.4, 10.4, 3.2 Hz, 2 H), 2.88 (br, s, 1 H), 2.65 (m, 1 H), 1.96 (m, 1 H), 1.71 (m, 1 H), 1.54 (s, 3 H), 1.33 (s, 3 H), 1.04 (s, 9 H) 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 )? 7.69 (m, 4 H), 7.40 (m, 6 H), 4.35 (dd, J = 3.6, 7.6 Hz, (Br s, 1H), 2.65 (m, 1H), 1.96 (m, 1 H), 3.78 (ddd, J = 6.4, 10.4, 3.2 Hz, 2H) H), 1.71 (m, 1H), 1.54 (s, 3H)
<화학식 2b>(2b)
제조예Manufacturing example 3-1 3-1
제조예 2-1에서 합성한 화학식 2a의 화합물(2.5g, 5.4mmoL)을 메탄올에 녹인 뒤, -40℃로 냉각시켰다. 냉각시킨 용액에 소듐보로하이드라이드(NaBH4)(1.45g, 38.4mmol)을 천천히 첨가하였다. 이후 동일 조건에서 반응물을 교반한 후, TLC로 반응 종결을 확인한 뒤 반응 혼합물에 포화 암모늄 클로라이드(NH4Cl) 수용액을 가하고 수용액층을 에틸아세테이트로 추출한 뒤 유기층을 분액하였다. 분리된 유기층을 물과 브라인(brine)으로 충분히 세척한 후, 황산 마그네슘(MgSO4)으로 건조시키고 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축하였다. 이를 통해 생성된 알코올 화합물을 실리카젤 크로마토그래피로 분리 정제하여 얻은 중간체(2.54g, 76%)를 무수 피리딘 (pyridine)에 녹인 뒤, 0℃로 냉각시켰다. 냉각된 혼합물에 무수 트리플루오로메탄설폰산(trifluoromethanesulfonic anhydride)(3.26ml, 19.36mmol)을 적가한 뒤, 동일 조건에서 30분 동안 교반하여 트리플루오로메틸설폰산화 시켰다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 뒤, 반응 혼합물에 포화 암모늄 클로라이드(NH4Cl) 수용액을 가하고 수용액층을 에틸아세테이트로 추출한 뒤 유기층을 분액하였다. 분리된 유기층을 물과 브라인(brine)으로 충분히 씻어준 후, 황산 마그네슘(MgSO4)으로 건조시키고 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축하였다. 이를 통해 얻은 트리플루오로메틸설폰산화 화합물과 소듐아지드(NaN3) 10당량을 무수 DMF에 혼합한 뒤, 100℃로 가열한 상태에서 교반하여 아지드화 시켰다. 4시간 가량 교반한 후, TLC로 반응이 종결됨을 확인하고 물을 가한 뒤, 수용액층을 에틸아세테이트로 추출한 후에 유기층을 분액하였다. 분리된 유기층을 물과 브라인(brine)으로 충분히 세척한 후, 황산 마그네슘(MgSO4)으로 건조시키고 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축하였다. 이를 통해 얻은 아지드 화합물을 실리카젤 크로마토그래피를 통하여 분리 정제하여 얻어진 화합물을 메탄올에 용해시켰다. 해당 용액에 팔라듐/탄소를 적당량 첨가하고 반응용기를 수소치환을 하여 수소화 반응을 진행시켜 아지드기를 아민기로 환원시켰다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 뒤, 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거하고 감압 농축시켜, 하기와 같은 1H NMR 스펙트럼을 갖는 하기 화학식 3a의 화합물(1.6 g, 61%)을 얻었다. Compound (2a) (2.5 g, 5.4 mmol) synthesized in Preparation Example 2-1 was dissolved in methanol and cooled to -40 ° C. Sodium borohydride (NaBH 4 ) (1.45 g, 38.4 mmol) was slowly added to the cooled solution. Thereafter, the reaction mixture was stirred under the same conditions, and after completion of the reaction was confirmed by TLC, an aqueous solution of saturated ammonium chloride (NH 4 Cl) was added to the reaction mixture, the aqueous layer was extracted with ethyl acetate, and the organic layer was separated. The separated organic layer was washed thoroughly with water and brine, dried over magnesium sulfate (MgSO 4 ), and filtered under reduced pressure to remove the remaining solid, which was then concentrated under reduced pressure. The resulting alcohol compound was separated and purified by silica gel chromatography to obtain an intermediate (2.54 g, 76%) which was dissolved in pyridine anhydride and cooled to 0 ° C. Trifluoromethanesulfonic anhydride (3.26 ml, 19.36 mmol) was added dropwise to the cooled mixture, and the mixture was stirred for 30 minutes under the same conditions to perform trifluoromethylsulfone oxidation. After completion of the reaction was confirmed by TLC, an aqueous solution of saturated ammonium chloride (NH 4 Cl) was added to the reaction mixture, the aqueous layer was extracted with ethyl acetate, and the organic layer was separated. The separated organic layer was washed thoroughly with water and brine, dried over magnesium sulfate (MgSO 4 ), and filtered under reduced pressure to remove the remaining solid and then concentrated under reduced pressure. The resulting trifluoromethylsulfone compound and 10 equivalents of sodium azide (NaN 3 ) were mixed in anhydrous DMF, and the mixture was stirred under heating at 100 ° C. After stirring for about 4 hours, it was confirmed that the reaction was terminated by TLC. After adding water, the aqueous layer was extracted with ethyl acetate, and the organic layer was separated. The separated organic layer was washed thoroughly with water and brine, dried over magnesium sulfate (MgSO 4 ), and filtered under reduced pressure to remove the remaining solid, which was then concentrated under reduced pressure. The azide compound thus obtained was isolated and purified by silica gel chromatography, and the resulting compound was dissolved in methanol. An appropriate amount of palladium / carbon was added to the solution, and the hydrogenation reaction was carried out by hydrogen substitution in the reaction vessel to reduce the azide group to an amine group. After the completion of the reaction was confirmed by TLC, the remaining solid was removed by filtration under reduced pressure, and the filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain 1.6 g (61%) of a compound of the following formula (3a) having the following 1 H NMR spectrum.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.69 (m, 4 H), 7.40 (m, 6 H) 4.75 (dt, J = 2.8, 53.2 Hz, 1 H), 4.36 (m, 2 H), 3.78 (m, 2 H), 3.26 (m, 1 H), 2.30 (m, 1 H), 1.88 (m, 2 H), 1.51 (s, 3 H), 1.30 (s, 3 H), 1.06 (s, 9 H) 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.69 (m, 4 H), 7.40 (m, 6 H) 4.75 (dt, J = 2.8, 53.2 Hz, 1 H), 4.36 (m, 2 H), 3.78 (s, 3 H), 1.30 (s, 3 H), 1.06 (s, 3 H) , 9 H)
<화학식 3a>≪ EMI ID =
제조예Manufacturing example 3-2 3-2
출발물질로서 화학식 2a의 화합물이 아닌 제조예 2-2에서 합성한 화학식 2b의 화합물(2.117g, 4.636mmoL)을 사용하고, 소듐보로하이드라이드 환원 반응의 온도조건을 0℃ 이하로 맞추며, 아지드화 반응에서 소듐아지드를 1.89g, 29.04mmol로 사용하고 온도를 60℃로 가열한 점을 제외하고는 제조예 3-1과 동일한 과정을 진행하여, 하기와 같은 1H NMR 스펙트럼을 갖는 하기 화학식 6b의 화합물(1.28g, 60%)을 얻었다.(2.117 g, 4.636 mmol) synthesized in Preparation Example 2-2, which was not the compound of Formula 2a, was used as the starting material, the temperature condition of the sodium borohydride reduction was adjusted to 0 ° C or lower, The procedure of Preparation Example 3-1 was repeated except that 1.89 g of sodium azide was used as the azide and 29.04 mmol of the azide was used and the temperature was heated to 60 ° C to obtain the following 1 H NMR spectrum To obtain the compound of
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.69 (m, 4 H), 7.40 (m, 6 H), 4.35 (dd, J = 3.6, 7.6 Hz, 1 H), 4.30 (m, 1 H), 4.21 (br, s, 1 H), 3.78 (ddd, J = 6.4, 10.4, 3.2 Hz, 2 H), 2.88 (br, s, 1 H), 2.65 (m, 1 H), 1.96 (m, 1 H), 1.71 (m, 1 H), 1.54 (s, 3 H), 1.33 (s, 3 H), 1.04 (s, 9 H) 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 )? 7.69 (m, 4 H), 7.40 (m, 6 H), 4.35 (dd, J = 3.6, 7.6 Hz, (Br s, 1H), 2.65 (m, 1H), 1.96 (m, 1 H), 3.78 (ddd, J = 6.4, 10.4, 3.2 Hz, 2H) H), 1.71 (m, 1H), 1.54 (s, 3H)
<화학식 3b>≪ EMI ID =
제조예Manufacturing example 4-1 4-1
제조예 3-1에서 합성한 화학식 3a의 화합물(300mg, 0.65mmol)을 5-아미노-4,6-디클로로피리미딘(5-amino-4,6-dichloropyrimidine)(1.85g, 11.27mmol) 및 디이소프로필에틸아민(DIPEA)(6.54mL, 37.57mmol)과 n-부탄올 (n-butanol)에 혼합시킨 뒤, 마이크로웨이브를 사용하여 170℃로 가열한 후 12시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 뒤, 반응 혼합물을 메탄올과 혼합하여 감압농축 시킨 후, 잔류물을 실리카젤 크로마토그래피로 분리 정제하여 중간체(964mg, 66%)를 얻었다. 상기 중간체를 아세트산 디에톡시메틸(diethoxymethyl acetate)에 녹인 후, 마이크로웨이브를 사용하여 140℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 뒤, 반응 혼합물을 메탄올과 혼합하여 감압농축 시킨 뒤, 실리카젤 크로마토그래피로 분리 정제하여, 하기와 같은 1H NMR 스펙트럼을 갖는 하기 화학식 8a의 화합물(240mg, 61.6%)을 얻었다.(300 mg, 0.65 mmol) synthesized in Production Example 3-1 was reacted with 5-amino-4,6-dichloropyrimidine (1.85 g, 11.27 mmol) and di diisopropylethylamine (DIPEA) (6.54mL, 37.57mmol) and n - butanol was heated to 170 ℃ using that later, microwave mixing the (n -butanol) was stirred for 12 hours. After confirming that the reaction was completed by TLC, the reaction mixture was mixed with methanol and concentrated under reduced pressure. The residue was separated and purified by silica gel chromatography to obtain an intermediate (964 mg, 66%). The intermediate was dissolved in diethoxymethyl acetate and stirred at 140 ° C for 3 hours using a microwave. After that the checking by TLC the reaction was completed, the reaction mixture was mixed with methanol to having a 1 H NMR spectrum as described below, to obtain separation in the back was concentrated under reduced pressure, silica gel chromatography, compounds of
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.78 (s, 1 H), 8.32 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 7.68 (m, 4 H), 7.4 (m, 6 H), 5.18 (m, 1 H), 5.08 (m, 2 H), 4.62 (m, 1 H), 3.81 (m, 2 H), 2.64 (m, 1 H), 1.95 (m, 2 H), 1.59 (s, 3 H), 1.34 (s, 3 H), 1.06 (s, 9 H) 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 )? 8.78 (s, 1H), 8.32 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.68 1 H), 1.95 (m, 2H), 1.59 (s, 1H), 5.08 (m, 2H), 4.62 3 H), 1.34 (s, 3 H), 1.06 (s, 9 H)
<화학식 4a>≪ Formula 4a &
제조예Manufacturing example 4-2 4-2
제조예 3-2에서 합성한 화학식 3b의 화합물(250mg, 0.52mmol)을 1,4-디옥산(1,4-dioxane)(50mL)에 녹인 후, 4,6-디클로로-5-포르아미도피리미딘(120mg, 0.65mmol) 및 트리에틸아민(trimethylamine)(0.55ml, 3.86mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 2일 동안 가열 환류시킨 후, 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 뒤, 반응 혼합물을 감압농축 시켰다. 잔류물을 실리카젤 크로마토그래피로 분리 정제하여 중간체를 얻었다. 상기 중간체에 아세트산 디에톡시메틸(diethoxymethyl acetate)(5mL)를 넣은 후 140℃에서 12시간 정도 교반시켰다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 뒤, 반응 혼합물을 메탄올과 같이 혼합하여 감압농축 시킨 후, 실리카젤 크로마토그래피로 분리 정제하여 하기와 같은 1H NMR 스펙트럼을 갖는 하기 화학식 4b의 화합물(100mg, 31%)을 얻었다.The compound of Formula 3b (250 mg, 0.52 mmol) synthesized in Preparation Example 3-2 was dissolved in 1,4-dioxane (50 mL), and 4,6-dichloro-5- (120 mg, 0.65 mmol) and trimethylamine (0.55 ml, 3.86 mmol) were added. After the reaction mixture was refluxed for 2 days, the reaction was terminated by TLC, and the reaction mixture was concentrated under reduced pressure. The residue was separated and purified by silica gel chromatography to obtain an intermediate. Diethoxymethyl acetate (5 mL) was added to the intermediate, followed by stirring at 140 ° C for about 12 hours. After that the checking by TLC the reaction was completed, a mixture as the reaction mixture with methanol to having a 1 H NMR spectrum as described below, to obtain separated then concentrated under reduced pressure, silica gel chromatography, compounds of formula 4b (100mg, 31%) ≪ / RTI >
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.80 (s, 1 H), 8.25 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 7.70 (m, 4 H), 7.40 (m, 6 H), 5.35 (m, 1 H), 5.16 (superimposed dd, J = 6.8 Hz, 1 H), 4.54 (superimposed dd, J = 6.4 Hz, 1 H), 3.80 (m, 2 H), 2.96 (m, 1 H), 2.08 (m, 1 H), 1.84 (m, 1 H), 1.61 (s, 3H), 1.33 (s, 3 H), 1.07 (s, 9 H) 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 )? 8.80 (s, 1H), 8.25 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.70 m, 1 H), 5.16 (superimposed dd, J = 6.8 Hz, 1H), 4.54 (superimposed dd, J = 6.4 Hz, 1H), 3.80 (S, 3 H), 1.33 (s, 3 H), 1.07 (s, 9 H)
<화학식 4b><Formula 4b>
제조예Manufacturing example 5-1 5-1
제조예 4-1에서 합성한 화학식 4a의 화합물(200mg, 0.336mmol)을 메탄올에 녹인 후, 0℃에서 트리플루오로아세트산(TFA)(5mL)과 물이 1:1로 혼합된 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 뒤, 반응이 종결됨을 TLC로 확인하고 감압농축 시켰다. 농축된 잔류물을 실리카젤 크로마토그래피로 분리 정제하여 중간체(80mg, 75.4%)를 얻었다.The compound of Formula 4a (200 mg, 0.336 mmol) synthesized in Production Example 4-1 was dissolved in methanol, and a solution of trifluoroacetic acid (TFA) (5 mL) and water at 1: 1 was added dropwise at 0 ° C . After the reaction mixture was stirred at room temperature for 2 hours, it was confirmed by TLC that the reaction was terminated and concentrated under reduced pressure. The concentrated residue was separated and purified by silica gel chromatography to obtain an intermediate (80 mg, 75.4%).
상기 중간체(70mg, 0.22mmol)를 터트부탄올(tert-butanol)에 녹인 후, 고온밀폐용기(stainless steel bomb reactor)에 옮겼다. 이 혼합액에 포화 암모니아/터트부탄올을 적가한 후, 반응용기를 밀폐시키고 120℃에서 15시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 후, 반응 혼합물을 메탄올로 희석시킨 뒤 감압농축 시켰다. 농축된 잔류물을 실리카젤 크로마토그래피로 분리 정제하여, 하기와 같은 1H NMR 스펙트럼을 갖는 하기 화학식 5a의 화합물(55mg, 84.6%)을 얻었다.Tert after the intermediate (70mg, 0.22mmol) was dissolved in butanol (tert -butanol), was transferred to a high-temperature closed container (stainless steel bomb reactor). Saturated ammonia / butanol was added dropwise to the mixed solution, and the reaction vessel was sealed and stirred at 120 ° C for 15 hours. After confirming that the reaction was completed by TLC, the reaction mixture was diluted with methanol and concentrated under reduced pressure. The concentrated residue was separated and purified by silica gel chromatography to obtain the following compound of formula (5a) (55 mg, 84.6%) having 1 H NMR spectrum as described below.
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.26 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.20 (s, 1 H), 5.11 (dt, J = 3.6, 55.2 Hz, 1 H), 4.99 (ddd, J = 3.2, 9.6, 26.4 Hz, 1 H), 4.75 (m, 1 H), 4.04 (m, 1 H), 3.71 (m, 2 H), 2.38 (m, 1 H), 1.89 (m, 2 H) 1 H NMR (400 MHz, CD 3 OD) δ 8.26 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.20 (s, 1 H), 5.11 (dt, J = 3.6, 55.2 Hz, 1 H), 4.99 ( ddd, J = 3.2, 9.6, 26.4 Hz, 1 H), 4.75 (m, 1 H), 4.04 (m, 1 H), 3.71 (m, 2 H), 2.38 (m, 1 H), 1.89 (m , 2 H)
<화학식 5a>≪
제조예Manufacturing example 5-2 5-2
출발물질로서 화학식 4a의 화합물이 아닌 제조예 4-2에서 합성한 화학식 4b의 화합물(100mg, 0.3mmol)을 사용하고, 아민화 반응시에 90℃에서 약 3시간 동안 교반한 점을 제외하고는 제조예 5-1과 동일한 과정을 진행하여, 하기와 같은 1H NMR 스펙트럼을 갖는 하기 화학식 5b의 화합물(30mg, 32%)을 얻었다.Except that the compound of the formula 4b (100 mg, 0.3 mmol) synthesized in Production Example 4-2, which was not the compound of the formula 4a, was used as a starting material and the mixture was stirred at 90 ° C for about 3 hours during the amination reaction The procedure of Preparation Example 5-1 was repeated to give the compound of
1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 8.27 (d, J = 2.1 Hz, 1 H), 8.20 (s, 1 H), 5.28 (m, 1 H), 4.76 (m, 1 H), 4.06 (m, 1 H), 3.71 (m, 2 H), 2.64 (m, 1 H), 1.98 (m, 1 H), 1.79 (m, 1 H) 1 H NMR (300 MHz, CD 3 OD) δ 8.27 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 8.20 (s, 1H), 5.28 (m, 1H), 4.76 (m, 1H), 4.06 , 1H), 1.98 (m, 1H), 1.79 (m, 1H)
<화학식 5b>≪
실험예Experimental Example 1 - 항바이러스 활성 및 세포독성 실험 1 - Antiviral activity and cytotoxicity experiments
본 발명의 카보사이클릭 뉴클레오사이드 유도체의 항바이러스 활성 및 세포독성을 알아보기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다.In order to examine the antiviral activity and cytotoxicity of the carbocyclic nucleoside derivative of the present invention, the following experiment was conducted.
Vero E6 세포들을 배양한 후, CHIKV(Chikungunya Virus) LS3와 SFV(Semliki Forrest Virus)로 감염시키고 적정하여 CHIKV 접종물 및 SFV 접종물을 각각 수득하였다.Vero E6 cells were cultured and infected with CHIKV (Chikungunya Virus) LS3 and SFV (Semliki Forrest Virus) and titrated to obtain CHIKV inoculum and SFV inoculum, respectively.
제조예 5-1에서 합성한 화학식 5a의 화합물을 1% FCS(fetal calf serum) 및 항생제를 포함하는 IMDM(Iscove's modified Dulbecco's medium)에 200μM로 희석하였다. Vero E6 세포들을 각 웰(well)당 2 x 104개의 세포가 포함되도록 96-웰 플레이트(plate)에 배양하였다. 세포들을 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 후, 각 웰에 상기 화합물 희석액 50μl를 주입하고, 2% FCS를 포함하는 EMEM(Eagle's minimal essential medium) 100μl 및 상기 CHIKV 접종물 50μl과 혼합하였다. 이후, 3 dpi(day postinfection)에서 바이러스에 의해 유발된 CPE(Cytopathic Effect) 및 화합물의 부작용에 의해 발생하는 세포들간의 생존도 차이를 CellTiter 96 Aqueous nonradioactive cell proliferation assay(Promega)를 사용하여 분석하였다. 화합물 처리에 의한 세포독성은 바이러스 접종물 대신 일반적인 배지를 주입한 점을 제외하고는 위와 동일한 방법으로 세포를 배양하여 확인하였다.The compound of
Graphpad Prism 5 software를 사용하여, CPE에 대한 세포 생존도 및 화합물 부작용에 대한 세포 생존도 각각의 결과를 기초로 50% 유효 농도(EC50) 및 50% 세포독성 농도(CC50)를 각각 계산하였다. EC50은 병원체(바이러스)의 50%가 억제되기 위한 화합물의 최소 농도를 나타내며, CC50은 숙주 세포의 50프로가 사멸될 때의 화합물 농도를 나타낸다. 특정 바이러스에 대한 화합물의 상대적인 효능 정도는 선택도로 정의하였다(SI; CC50/EC50).Using Graphpad Prism 5 software, cell viability for CPE and cell viability for compound adverse events were calculated for 50% effective concentration (EC 50 ) and 50% cytotoxic concentration (CC 50 ), respectively, based on the respective results . EC 50 represents the minimum concentration of the compound for which 50% of the pathogen (virus) is inhibited, and CC 50 represents the concentration of the compound when 50 pro of the host cell is killed. The degree of relative efficacy of the compounds against a particular virus was defined as selective (SI; CC 50 / EC 50 ).
또한, SFV 접종물과 혼합한 점을 제외하고는 위와 동일한 방법으로 실험을 수행하여 화학식 5a의 화합물의 SFV에 대한 EC50, CC50 및 SI 값을 계산하였으며, 제조예 5-2에서 합성한 화학식 5b의 화합물을 사용한 점을 제외하고는 위의 CHIKV에 대한 실험을 동일하게 진행하여 화학식 5b의 화합물의 EC50, CC50 및 SI 값을 계산하였다.Further, experiments were carried out in the same manner as above except that the compounds were mixed with the inoculum of SFV to calculate the EC 50 , CC 50 and SI values for the SFV of the compound of the
표 1은 위와 같은 방법으로 계산된 EC50, CC50 및 SI 값을 나타낸 것이다.Table 1 shows the EC 50 , CC 50 and SI values calculated by the above method.
표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 카보사이클릭 뉴클레오사이드 유도체는 RNA 바이러스인 CHIKV 및 SFV에 대해 낮은 EC50 및 숙주 세포에 대해 높은 CC50을 갖기 때문에, 바이러스의 억제와 바이러스성 질환의 예방 및 치료에 매우 적합한 약학적 조성물로서 활용될 수 있음을 알 수 있다.As shown in Table 1, since the carbocyclic nucleoside derivative of the present invention has a low EC 50 for the RNA viruses CHIKV and SFV and a high CC 50 for the host cells, the inhibition of the virus and the prevention of viral diseases And as a pharmaceutical composition that is well suited for treatment.
실험예Experimental Example 2 - 2 - SAHSAH 가수분해효소 저해 효능 실험 Hydrolytic enzyme inhibitory effect experiment
본 발명의 카보사이클릭 뉴클레오사이드 유도체의 SAH 가수분해효소 저해 효능을 알아보기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다.In order to examine the SAH hydrolase inhibitory effect of the carbocyclic nucleoside derivative of the present invention, the following experiment was conducted.
50mM 인산나트륨(pH 8.0)과 AdoHcy 가수분해효소(모노머로서 2μM; 테트라머로서 5μM)의 반응 혼합물(250μl)을 각각 제조예 5-1에서 합성한 화학식 5a의 화합물 및 제조예 5-2에서 합성한 화학식 5b의 화합물과 함께 37℃에서 10분 동안 사전배양(preincubation)하였다. 사전배양 후, 100μM의 AdoHcy를 가하여 반응을 개시하였으며, 20분 동안 반응이 이루어지도록 하였다. 이후, 반응 혼합물을 200μM DTNB에서 추가적으로 배양하고, 생성물인 TNB(5-thio-2-nitrobenzoic acid)의 412nm에서의 최대 흡광도를 분광광도계(spectrophotometer)로 측정하였다. 측정한 최대 흡광도와 TNB의 몰흡광계수(molar extinction coefficient)(ε412 = 13700 M- 1 cm- 1)를 이용하여 화학식 5a의 화합물 및 화학식 5b의 화합물의 IC50값을 계산하였다. A reaction mixture (250 μl) of 50 mM sodium phosphate (pH 8.0) and an AdoHcy hydrolase (2 μM as a monomer; 5 μM as a tetramer) was mixed with the compound of
표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 카보사이클릭 뉴클레오사이드 유도체는 SAH 가수분해효소에 대해 낮은 IC50 값을 갖기 때문에, SAH 가수분해효소 저해 기전을 통해 항바이러스 효과를 갖는 약학적 조성물로서 적합한 물질로 활용될 수 있음을 알 수 있다.As shown in Table 2, since the carbocyclic nucleoside derivative of the present invention has a low IC 50 value against the SAH hydrolase, it is suitable as a pharmaceutical composition having an antiviral effect through the SAH hydrolase inhibiting mechanism It can be seen that it can be used as a material.
본 발명의 다른 실시예에 따른 카보사이클릭 뉴클레오사이드(carbocyclic nucleoside) 유도체는 하기 화학식 a로 표현될 수 있다.A carbocyclic nucleoside derivative according to another embodiment of the present invention can be represented by the following formula (a).
<화학식 a><Formula a>
상기 화학식 a에서, n은 2이고, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 불소이며, B는 하기 화학식 b-1 또는 b-2이고, P는 수소 또는 포스포아미데이트(phosphoamidate)기일 수 있다. In Formula (a), n is 2, R 1 and R 2 are each independently hydrogen or fluorine, B is the following formula b-1 or b-2, and P is hydrogen or a phosphoamidate group.
<화학식 b-1><Formula b-1>
상기 화학식 b-1에서, X1는 염소, 수산기(OH group), 아미노기(amino group) 또는 알킬아미노(alkylamino group)기이고, Y1는 수소 또는 아미노기일 수 있다.In the above formula (b-1), X1 may be chlorine, an OH group, an amino group or an alkylamino group, and Y1 may be a hydrogen atom or an amino group.
상기 알킬아미노기는 -NHMe, -NHEt 등의 모노알킬아미노기(-NHR) 또는 -NMe2, -NMeEt, -NEt2 등의 다이알킬아미노기(-NR2)일 수 있다.The alkylamino group may be a monoalkylamino group (-NHR) such as -NHMe or -NHEt or a dialkylamino group (-NR2) such as -NMe2, -NMeEt or -NEt2.
<화학식 b-2><Formula b-2>
상기 화학식 b-2에서, X2는 수산기 또는 아미노기이고, Y2는 수소, 메칠기(methyl group) 또는 할로겐일 수 있다.In the above formula (b-2), X2 is a hydroxyl group or an amino group, and Y2 may be hydrogen, a methyl group or a halogen.
구체적으로, 상기 화학식 a에서, R1은 불소이고, B는 상기 화학식 b-1이며, P는 수소일 수 있다.Specifically, in the above formula (a), R1 is fluorine, B is the above formula (b-1), and P may be hydrogen.
더욱 구체적으로는, 상기 화학식 a로 표현되는 카보사이클릭 뉴클레오사이드 유도체는 후술하는 제조 방법에 기재된 화학식 5a로 표현되는 화합물 또는 화학식 5b로 표현되는 화합물일 수 있다.More specifically, the carbocyclic nucleoside derivative represented by Formula (a) may be a compound represented by Formula (5a) or a compound represented by Formula (5b) described in the following production method.
이하에서는 상기 카보사이클릭 뉴클레오사이드 유도체의 제조 방법에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, the production method of the carbocyclic nucleoside derivative will be described in detail.
물질 1의 제조 방법Method for producing substance 1
참조 문헌 [1] Tetrahedron: Asymmetry, 2002, 13, 1189-1193 과 [2] J. Med. Chem . 2001, 44, 3985-3993 를 참고하여 합성 가능하다.References [1] Tetrahedron: Asymmetry, 2002, 13, 1189-1193 and [2] J. Med. Chem . 2001, 44, 3985-3993.
물질 2a, 2b의 제조 방법Method for producing substances 2a and 2b
앞서 합성한 물질 1 (6 g, 24.8 mmol) 을 무수 THF에 녹인 뒤, 클로로트리에틸실란 (TESCl) (16.7 mL, 99.2 mmol)을 적가하고 -78 oC로 냉각시킨다. 냉각된 혼합물에 1.0 M 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드/THF 용액 (LiHMDS 1.0 M solution in THF) (50 mL, 50 mmol)을 서서히 적가한 뒤, 30 분간 동일 조건에서 반응을 잘 교반시켜 실릴 에놀 에테르화 시켜 준다. 반응이 종결되었음을 TLC로 확인한 뒤, 반응 혼합물을 포화 암모늄 클로라이드 (NH4Cl) 수용액으로 반응을 종결시키고 수용액층을 아세트산 에틸로 추출한 뒤 유기층을 분액한다. 분리된 유기층을 물과 brine으로 충분히 씻어준 후, 황산 마그네슘 (MgSO4)으로 건조시키고, 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축한다. 이 농축된 잔류물을 무수 DMF 에 녹인 후, 0 oC로 냉각시킨다. 냉각된 혼합물에 1-클로로메틸-4-플루오로-1,4-디아조니아비사이클로 [2.2.2]옥탄 비스(테트라플루오로보래이트) (상표명 Selectfluor®) (10.15 g, 28.65 mmol) 를 1.5 당량 적가한 뒤 동일 조건에서 15 시간 동안 교반하게 되면 플루오로화된 화합물인 3a와 3b를 각각 3:1의 비율로 생성 (NMR에서 비율로 확인)된다. 반응이 종결된 것을 TLC에서 확인되면, 반응 혼합물을 포화 암모늄 클로라이드 (NH4Cl) 수용액으로 반응을 종결시키고 수용액층을 아세트산 에틸로 추출한 뒤 유기층을 분액한다. 분리된 유기층을 물과 brine으로 충분히 씻어준 후, 황산 마그네슘 (MgSO4)으로 건조시키고 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축한다. 농축된 잔류물은 실리카젤 크로마토그래피등을 통하여 분리 정제하여 2a (6.591 g, 58%) 와 2b (3.078 g, 27%)를 각각 얻을 수 있다.The previously synthesized substance 1 (6 g, 24.8 mmol) was dissolved in anhydrous THF, and then chloro-ethyl triethylsilane (TESCl) (16.7 mL, 99.2 mmol) was added dropwise and cooled to -78 ° C. To the cooled mixture was slowly added dropwise a 1.0 M lithium bis (trimethylsilyl) amide / THF solution (LiHMDS 1.0 M solution in THF) (50 mL, 50 mmol) and the reaction was stirred well under the same conditions for 30 minutes to obtain silylenol ether It makes me angry. After confirming the completion of the reaction by TLC, the reaction mixture is quenched with an aqueous solution of saturated ammonium chloride (NH 4 Cl), the aqueous layer is extracted with ethyl acetate, and the organic layer is separated. The separated organic layer was washed with water and brine, dried over magnesium sulfate (MgSO 4 ), and filtered under reduced pressure to remove the remaining solid, which was then concentrated under reduced pressure. The concentrated residue is dissolved in anhydrous DMF and then cooled to 0 ° C. To a cooled mixture was added 1-chloromethyl-4-fluoro-1,4-diazoniabicyclo [2.2.2] octane bis (tetrafluoroborate) (Selectfluor ® ) (10.15 g, 28.65 mmol) And the mixture is stirred under the same conditions for 15 hours to produce fluorinated compounds 3a and 3b at a ratio of 3: 1, respectively (confirmed by NMR). When the reaction is confirmed by TLC, the reaction mixture is quenched with an aqueous solution of saturated ammonium chloride (NH 4 Cl), the aqueous layer is extracted with ethyl acetate, and the organic layer is separated. The separated organic layer was washed thoroughly with water and brine, dried over magnesium sulfate (MgSO 4 ), filtered off under reduced pressure, and the residue was removed under reduced pressure. The concentrated residue was purified by silica gel chromatography or the like to obtain 2a (6.591 g, 58%) and 2b (3.078 g, 27%), respectively.
2a:1H NMR (400 MHz, CDCl3) 5.29 (dd, J = 8.2, 49.5 Hz, 1 H), 4.70 (t, J = 5.7 Hz, 1 H), 4.20 (dd, J = 2.4, 6.1 Hz, 1 H), 3.61 (dd, J = 1.6, 8.6 Hz, 1 H) 3.38-3.41 (m, 1 H), 2.75 (d, J = 8.2 Hz, 1 H), 1.41 (s, 3 H), 1.30 (s, 3 H), 1.06 (s, 9 H) 2a: 1 H NMR (400 MHz , CDCl 3) 5.29 (dd, J = 8.2, 49.5 Hz, 1 H), 4.70 (t, J = 5.7 Hz, 1 H), 4.20 (dd, J = 2.4, 6.1 Hz , 1H), 3.61 (dd, J = 1.6, 8.6 Hz, 1H) 3.38-3.41 (m, 1 H), 2.75 (d, J = 8.2 Hz, 1 H), 1.41 (s, 3 H), 1.30 (s, 3 H), 1.06 (s, 9 H)
2b:1H NMR (600 MHz, CDCl3) 5.21-5.36 (ddd, J = 1.3, 4.5, 50.8 Hz, 1 H,), 4.55 (d, J = 5.9 Hz, 1 H), 4.50 (d, J = 5.9 Hz, 1 H), 3.63 (d, J = 2.2 Hz, 2 H), 2.52-2.58 (m, 1 H), 1.41 (s, 3 H), 1.33 (s, 3 H), 1.13 (s, 9 H) 2b: 1 H NMR (600 MHz , CDCl 3) 5.21-5.36 (ddd, J = 1.3, 4.5, 50.8 Hz, 1 H,), 4.55 (d, J = 5.9 Hz, 1 H), 4.50 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 3.63 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 2.52-2.58 (m, 1H), 1.41 , 9 H)
물질 2c의 제조 방법Method for producing substance 2c
위에서 합성한 물질 2a (3.29 g, 12.6 mmol)를 상기 명시된 물질 1에서 물질 2a, 2b로의 합성과정을 동일하게 진행하면 2c (2.95 g, 84%)를 합성할 수 있다.2c (2.95 g, 84%) can be synthesized by proceeding in a similar manner to the synthesis of the above-synthesized substance 2a (3.29 g, 12.6 mmol) from the above-mentioned substance 1 to the substances 2a and 2b.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) 4.72 (t, J = 6.1 Hz, 1 H), 4.35-4.38 (m, 1 H), 3.68 (d, J = 8.6 Hz, 1 H), 3.68 (d, J = 8.6 Hz, 1 H) 3.46 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 2.67 (d, J = 17.4 Hz, 1 H), 1.42 (s, 3 H), 1.33 (s, 3 H), 1.05 (s, 9 H). (디올 형태로 평형을 이룬 물질로 추정되는 피크와 섞여있음.) 1 H NMR (500 MHz, CDCl 3) 4.72 (t, J = 6.1 Hz, 1 H), 4.35-4.38 (m, 1 H), 3.68 (d, J = 8.6 Hz, 1 H), 3.68 (d, J = 8.6 Hz, 1 H) 3.46 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 2.67 (d, J = 17.4 Hz, 1 H), 1.42 (s, 3 H), 1.33 (s, 3 H), 1.05 (s, 9 H). (Mixed with a peak estimated to be equilibrated in diol form).
물질 3a의 제조 방법Method for producing material 3a
물질 2a (3.33 g, 12.8 mmol)를 메탄올에 녹인 뒤, 0 oC 이하로 충분히 냉각시켜준다. 냉각시킨 용액에 소듐보로하이드라이드 (NaBH4) (1.45 g, 38.4 mmol)을 천천히 첨가한다. 이후 동일 조건에서 반응을 교반시키고 TLC로 반응 종결을 확인한 뒤, 반응 혼합물을 포화 암모늄 클로라이드 (NH4Cl) 수용액으로 반응을 종결시키고 수용액층을 아세트산 에틸로 추출한 뒤 유기층을 분액한다. 분리된 유기층을 물과 brine으로 충분히 씻어준 후, 황산 마그네슘 (MgSO4)으로 건조시키고 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축한다. 생성된 알코올 화합물을 실리카젤 크로마토그래피등으로 분리정제한 중간체 (2.54g, 76%)를 무수 피리딘 (pyridine)에 녹인 뒤, 0 oC 로 냉각시켜준다. 냉각된 혼합물에 무수 트리플루오로메탄설폰산 (trifluoromethanesulfonic anhydride) (3.26 ml, 19.36 mmol)을 적가한 뒤, 동일 조건에서 30 분 교반시켜 트리플루오로메틸설폰산화 시켜준다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 뒤, 반응 혼합물을 포화 암모늄 클로라이드 (NH4Cl) 수용액으로 반응을 종결시키고 수용액층을 아세트산 에틸로 추출한 뒤 유기층을 분액한다. 분리된 유기층을 물과 brine으로 충분히 씻어준 후, 황산 마그네슘 (MgSO4)으로 건조시키고 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축한다. 생성된 트리플루오로메틸설폰산화 화합물과 소듐아지드 (NaN3) (1.89 g, 29.04 mmol)를 무수 DMF에 혼합한 뒤, 60 oC 로 가열상태에서 교반시켜 아지드화 시킨다. 4 시간 가량 교반한 뒤, TLC로 반응이 종결됨을 확인하고 물로 반응을 종결시킨 뒤, 수용액층을 아세트산 에틸로 추출한 뒤 유기층을 분액한다. 분리된 유기층을 물과 brine으로 충분히 씻어준 후, 황산 마그네슘 (MgSO4)으로 건조시키고 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축한다. 얻어진 아지드 화합물을 실리카젤 크로마토그래피등을 통하여 분리정제하고, 얻어진 화합물 (4.07 g, 42%)을 메탄올에 용해시킨다. 해당 용액에 팔라듐/탄소를 적당량 첨가하고 반응용기를 수소치환을 하여 수소화 반응을 진행시켜 아지드기를 아민기로 환원시킨다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 뒤, 반응이 종결되면 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거하고 감압 농축시키게 되면 원하는 물질 3a를 얻을 수 있다. 얻어진 물질 3a는 분리정제과정 없이 다음 과정으로 진행한다.The material 2a (3.33 g, 12.8 mmol) is dissolved in methanol and cooled to below 0 ° C sufficiently. Sodium borohydride (NaBH 4 ) (1.45 g, 38.4 mmol) is slowly added to the cooled solution. Thereafter, the reaction is stirred under the same conditions, and the reaction is terminated by TLC. The reaction mixture is then quenched with an aqueous solution of saturated ammonium chloride (NH 4 Cl), the aqueous layer is extracted with ethyl acetate, and the organic layer is separated. The separated organic layer was washed thoroughly with water and brine, dried over magnesium sulfate (MgSO 4 ), filtered off under reduced pressure, and the residue was removed under reduced pressure. The resulting alcohol compound was separated and purified by silica gel chromatography or the like (2.54 g, 76%) was dissolved in anhydrous pyridine and cooled to 0 ° C. Trifluoromethanesulfonic anhydride (3.26 ml, 19.36 mmol) was added dropwise to the cooled mixture, and the mixture was stirred under the same conditions for 30 minutes to give trifluoromethylsulfone oxidation. After confirming that the reaction is terminated by TLC, the reaction mixture is quenched with an aqueous solution of saturated ammonium chloride (NH 4 Cl), the aqueous layer is extracted with ethyl acetate, and the organic layer is separated. The separated organic layer was washed thoroughly with water and brine, dried over magnesium sulfate (MgSO 4 ), filtered off under reduced pressure, and the residue was removed under reduced pressure. The resulting trifluoromethylsulfone oxide compound and sodium azide (NaN 3 ) (1.89 g, 29.04 mmol) were mixed in anhydrous DMF and stirred at 60 ° C under heating to azide. After stirring for about 4 hours, the reaction was terminated by TLC. After completion of the reaction with water, the aqueous layer was extracted with ethyl acetate and the organic layer was separated. The separated organic layer was washed thoroughly with water and brine, dried over magnesium sulfate (MgSO 4 ), filtered off under reduced pressure, and the residue was removed under reduced pressure. The obtained azide compound was isolated and purified by silica gel chromatography or the like, and the obtained compound (4.07 g, 42%) was dissolved in methanol. An appropriate amount of palladium / carbon is added to the solution, and the reaction vessel is subjected to hydrogen substitution to proceed the hydrogenation reaction, thereby reducing the azide group to an amine group. After completion of the reaction, the reaction mixture is filtered to remove the remaining solid, and the filtrate is concentrated under reduced pressure to obtain the desired substance 3a. The resulting material 3a proceeds to the next step without separation and purification.
1H NMR (600 MHz, CDCl3) d 4.96 (dt, J =52.5, 3.3 Hz, 1 H), 4.31-4.36 (m, 2 H), 3.48-3.54 (m, 2 H), 3.27 (td, J = 4.1, 28.4 Hz, 1 H), 2.24-2.34 (m, 1 H), 1.80 (s, 2 H), 1.45 (s, 3 H), 1.26 (s, 3 H), 1.16 (s, 9 H) 1 H NMR (600 MHz, CDCl 3) d 4.96 (dt, J = 52.5, 3.3 Hz, 1 H), 4.31-4.36 (m, 2 H), 3.48-3.54 (m, 2 H), 3.27 (td, J = 4.1, 28.4 Hz, 1 H), 2.24-2.34 (m, 1 H), 1.80 (s, 2 H), 1.45 (s, 3 H), 1.26 (s, 3 H), 1.16 (s, 9 H)
물질 3b의 제조 방법Method for producing substance 3b
위에서 합성한 물질 2b (5.2 g, 19.97 mmol)를 상기 명시된 물질 2a에서 물질 3a로의 합성과정과 동일하게 진행하면 3b (3.24 g, 62%)를 합성할 수 있다.3b (3.24 g, 62%) can be synthesized by proceeding in the same manner as in the synthesis of the above-synthesized substance 2b (5.2 g, 19.97 mmol) from the above-mentioned substance 2a to substance 3a.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 4.59 (dt, J = 52.7, 6.0 Hz, 1 H), 4.48, (t, J = 4.02 Hz, 1 H), 4.15 (dd J = 6.42, 4.23 Hz, 1 H), 3.50 (m, 2 H), 2.40 (m, 1 H), 1.48 (s, 3 H), 1.27 (s, 3 H), 1.16 (s, 9 H) 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3) d 4.59 (dt, J = 52.7, 6.0 Hz, 1 H), 4.48, (t, J = 4.02 Hz, 1 H), 4.15 (dd J = 6.42, 4.23 Hz, 3 H), 1.16 (s, 3 H), 1.16 (s, 3 H), 3.50 (m,
물질 3c의 제조 방법Method for producing substance 3c
위에서 합성한 물질 2c (4.95 g, 17.79 mmoL)를 상기 명시된 물질 2a에서 물질 3a로의 합성과정과 동일하게 진행하면 3c (2.98 g, 60%)를 합성할 수 있다. 단, 케톤을 알코올화 시키는 반응에서 소듐보로하이드라이드 (NaBH4) 대신 리튬보로하이드라이드 (LiBH4)를 사용하며, 아지드화 반응에서 소듐아지드를 10당량 사용하고 온도를 100 oC로 올려야 하며, 교반시간을 15 시간 정도로 늘려주어야 한다.3c (2.98 g, 60%) can be synthesized by proceeding in the same manner as in the synthesis of the above-synthesized substance 2c (4.95 g, 17.79 mmol) from the above-mentioned substance 2a to substance 3a. However, sodium beam hydride in the reaction of alcohol screen a ketone (NaBH 4) instead of lithium to view it hydride (LiBH 4) the uses, Oh the azide reaction of sodium azide to 10 times the amount used and the temperature at 100 o C And the stirring time should be increased to about 15 hours.
1H NMR (800 MHz, CDCl3) d 4.45-4.46 (m, 1 H), 4.25-4.27 (m, 1 H), 3.58 (dd, J = 4.5, 9.2 Hz, 1 H), 3.54 (dd, J = 5.1, 9.2 Hz, 1 H), 3.35-3.38 (m, 1 H), 2.56-2.59 (m, 1 H), 1.94 (bs, 3 H), 1.47 (s, 3 H), 1.28 (s, 3 H), 1.18 (s, 9 H) 1 H NMR (800 MHz, CDCl 3 ) d 4.45-4.46 (m, 1H), 4.25-4.27 (m, 1H), 3.58 (dd, J = 4.5, 9.2 Hz, 1H) J = 5.1, 9.2 Hz, 1 H), 3.35-3.38 (m, 1 H), 2.56-2.59 (m, 1 H), 1.94 (bs, 3 H), 1.47 (s, 3 H), 1.28 (s , 3 H), 1.18 (s, 9 H)
물질 4a의 제조 방법Method for producing substance 4a
위에서 합성한 물질 3a (982 mg, 3.757 mmol)과 5-아미노-4,6-디클로로피리미딘 (5-amino-4,6-dichloropyrimidine) (1.85 g, 11.27 mmol), 디이소프로필에틸아민 (DIPEA) (6.54 mL, 37.57 mmol)을 n-부탄올 (n-butanol)에 혼합시킨 뒤, 마이크로웨이브등을 사용하여 170 oC 로 가열하여 4 시간 정도 교반시킨다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 뒤, 반응 혼합물을 메탄올과 같이 혼합하여 감압농축 시킨 뒤, 잔류물을 실리카젤 크로마토그래피등으로 분리정제하여 중간체 (964 mg, 66%)를 얻을 수 있다. 이 중간체를 아세트산 디에톡시메틸 (diethoxymethyl acetate)에 녹인 후, 마이크로웨이브등을 사용하여 140 oC에서 3시간 정도 교반시킨다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 뒤, 반응 혼합물을 메탄올과 같이 혼합하여 감압농축 시킨 뒤, 실리카젤 크로마토그래피등으로 분리정제하면 물질 4a (643 mg, 65%)를 얻을 수 있다.(982 mg, 3.757 mmol), 5-amino-4,6-dichloropyrimidine (1.85 g, 11.27 mmol) and diisopropylethylamine (DIPEA ) (6.54 mL, 37.57 mmol) of n - using the back were mixed in butanol (n -butanol), microwave, etc., heated to 170 o C and the mixture was stirred for 4 hours. After confirming that the reaction was completed by TLC, the reaction mixture was mixed with methanol and concentrated under reduced pressure. The residue was purified by silica gel chromatography or the like to obtain an intermediate (964 mg, 66%). The intermediate is dissolved in diethoxymethyl acetate, and the mixture is stirred at 140 ° C for 3 hours using a microwave or the like. After confirming that the reaction was completed by TLC, the reaction mixture was mixed with methanol, concentrated under reduced pressure, and then purified by silica gel chromatography or the like to obtain substance 4a (643 mg, 65%).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.74 (s, 1 H), 8.34 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 5.28-5.43 (dt, J = 52.8, 2.8 Hz, 1 H), 5.12-5.23 (m, 2 H), 4.61 (t, J = 5.0 Hz, 1 H), 3.65-3.69 (m, 1 H), 3.61 (t, J = 9.2 Hz, 1 H), 2.56-2.71 (m, 1 H), 1.56 (s, 3 H), 1.32 (s, 3 H), 1.17 (s, 9 H) 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.74 (s, 1 H), 8.34 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 5.28-5.43 (dt, J = 52.8, 2.8 Hz, 1 H), 5.12 -5.23 (m, 2 H), 4.61 (t, J = 5.0 Hz, 1 H), 3.65-3.69 (m, 1 H), 3.61 (t, J = 9.2 Hz, 1 H), 2.56-2.71 (m , 1 H), 1.56 (s, 3 H), 1.32 (s, 3 H), 1.17 (s, 9 H)
물질 4b의 제조 방법Method for producing substance 4b
위에서 합성한 물질 3b (1.592 g, 6.09 mmol)를 상기 명시된 물질 3a에서 물질 4a로의 합성과정과 동일하게 진행하면 4b (943 mg, 39%)를 합성할 수 있다.4b (943 mg, 39%) can be synthesized by proceeding in the same manner as in the synthesis of the above-synthesized substance 3b (1.592 g, 6.09 mmol) from the above-described substance 3a to the compound 4a.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.72 (s, 1 H), 8.15 (s, 1 H), 5.59 (dt, J = 53.6, 8.42 Hz, 1 H), 5.05 (t, J = 5.52 Hz, 1 H), 4.91 (m, 1 H), 4.69 (m, 1 H), 3.63 (m, 1 H), 2.56 (m, 1 H), 1.59 (s, 3 H), 1,30 (s, 3 H), 1.22 (s, 9 H) 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ 8.72 (s, 1 H), 8.15 (s, 1 H), 5.59 (dt, J = 53.6, 8.42 Hz, 1 H), 5.05 (t, J = 5.52 Hz , 1.91 (m, 1H), 4.69 (m, 1H), 3.63 (m, 1H), 2.56 , 3 H), 1.22 (s, 9 H)
물질 4c의 제조 방법Method for producing substance 4c
위에서 합성한 물질 3c (182 mg, 0.625 mmol)를 상기 명시된 물질 3a에서 물질 4a로의 합성과정과 동일하게 진행하면 7c (223 mg, 50%)를 합성할 수 있다. 단, 첫 번째 반응단계에서 온도를 200 oC로 올려야 하고 교반시간을 7 시간 정도로 늘려주어야 한다.7c (223 mg, 50%) can be synthesized by proceeding in the same manner as in the synthesis of the above synthesized substance 3c (182 mg, 0.625 mmol) from the above-mentioned substance 3a to the substance 4a. However, in the first reaction step, the temperature should be increased to 200 ° C and the agitation time should be increased to about 7 hours.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.76 (s, 1 H), 8.76 (s, 1 H), 8.29 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 5.26-5.37 (m, 1 H), 5.11 (t, J = 6.9 Hz, 1 H), 4.59-4.64 (m, 1 H), 3.64-3.74 (m, 2 H), 2.81-2.96 (m, 1 H), 1.58 (s, 3 H), 1.33 (s, 3 H), 1.20 (s, 9 H) 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ 8.76 (s, 1 H), 8.76 (s, 1 H), 8.29 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 5.26-5.37 (m, 1 H), 5.11 (t, J = 6.9 Hz , 1 H), 4.59-4.64 (m, 1 H), 3.64-3.74 (m, 2 H), 2.81-2.96 (m, 1 H), 1.58 (s, 3 H) , 1.33 (s, 3 H), 1.20 (s, 9 H)
물질 5a의 제조 방법Method for producing
위에서 합성한 물질 4a (220 mg, 0.54 mmol)를 터트부탄올 (tert-butanol)에 녹인 후, 고온밀폐용기 (stainless steel bomb reactor)에 옮긴다. 혼합액에 포화 암모니아/터트부탄올(제3 부탄올)을 적가한 후, 반응용기를 밀폐시키고 120 oC에서 15 시간 정도 교반시킨다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 뒤, 반응 혼합물을 메탄올로 희석시킨 뒤 감압농축 시킨다. 농축된 잔류물은 THF에 녹인 후 혼합액에 트리플루오로아세트산 (TFA)과 물이 2:1로 혼합된 용액을 적가한다. 반응 혼합물을 60 oC 에서 15 시간 가량 교반시킨 뒤, 반응이 종결됨을 TLC로 확인하고 감압농축 시킨다. 농축된 잔류물을 실리카젤 크로마토그래피등으로 분리정제하여 최종 물질 5a (66 mg, 43%)를 얻을 수 있다.The material 4a (220 mg, 0.54 mmol) synthesized above was dissolved in tert- butanol and transferred to a stainless steel bomb reactor. Saturated ammonia / tert-butanol (tert-butanol) is added dropwise to the mixture, the reaction vessel is sealed and stirred at 120 ° C for about 15 hours. After confirming that the reaction is completed by TLC, the reaction mixture is diluted with methanol and then concentrated under reduced pressure. The concentrated residue is dissolved in THF, and a solution of trifluoroacetic acid (TFA) and water (2: 1) is added dropwise to the mixture. The reaction mixture was stirred at 60 ° C for about 15 hours, and then the reaction was terminated by TLC and concentrated under reduced pressure. The concentrated residue is purified by silica gel chromatography or the like to obtain the
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.31 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.23 (s, 1 H), 5.36-5.39 (m, 1 H), 5.20-5.35 (td, J = 2.8, 53.6 Hz, 1 H), 5.05-5.16 (m, 1 H), 4.66-4.69 (m, 1 H), 3.64-3.71 (m, 2 H), 2.51-2.66 (m, 1 H), 1.55 (s, 3 H), 1.35 (s, 3 H), 1.22 (s, 9 H) 1 H NMR (400 MHz, CD 3 OD) δ 8.31 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.23 (s, 1 H), 5.36-5.39 (m, 1 H), 5.20-5.35 (td, J = 2.8, 53.6 Hz, 1H), 5.05-5.16 (m, 1H), 4.66-4.69 (m, 1H), 3.64-3.71 (m, 2H), 2.51-2.66 1.55 (s, 3 H), 1.35 (s, 3 H), 1.22 (s, 9 H)
물질 5b의 제조 방법Method for producing
위에서 합성한 물질 4b (1.1 g, 2.758 mmol)를 상기 명시된 물질 4a에서 물질 5a로의 합성과정과 동일하게 진행하면 5b (556 mg, 71%)를 합성할 수 있다.5b (556 mg, 71%) can be synthesized by proceeding in the same manner as in the synthesis of the above-synthesized substance 4b (1.1 g, 2.758 mmol) from the above-mentioned substance 4a to the
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.19 (s, 1 H), 8.18 (s, 1 H), 5.40 (dt, J = 54.2, 7.32 Hz, 1 H), 5.03 (m, 1 H), 4.59 (dd, J = 9.9, 5.3 Hz, 1 H), 4.07 (m, 1 H), 3.80 (d, J = 5.9 Hz, 2 H), 2.35 (m, 1 H) 1 H NMR (400 MHz, CD 3 OD) δ 8.19 (s, 1 H), 8.18 (s, 1 H), 5.40 (dt, J = 54.2, 7.32 Hz, 1 H), 5.03 (m, 1 H) , 4.59 (dd, J = 9.9,5.3 Hz, 1H), 4.07 (m, 1H), 3.80 (d, J = 5.9 Hz, 2H)
물질 5c의 제조 방법Method for producing
위에서 합성한 물질 4c (223 mg, 0.534 mmol)를 상기 명시된 물질 4a 에서 물질 5a로의 합성과정과 동일하게 진행하면 5c (99 mg, 61%)를 합성할 수 있다. 5c (99 mg, 61%) can be synthesized by proceeding in the same manner as in the synthesis of the above synthesized substance 4c (223 mg, 0.534 mmol) from the above-mentioned substance 4a to the
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.29 (s, 1 H), 8.21 (s, 1 H), 5.29-5.36 (m, 2 H), 4.66 (bs, 1 H), 3.75-3.79 (m, 1 H), 3.66-3.70 (m, 1 H), 2.80-2.89 (m, 1 H), 1.57 (s, 3 H), 1.34 (s, 3 H), 1.22 (s, 9 H) 1 H NMR (400 MHz, CD 3 OD)? 8.29 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 5.29-5.36 (m, 2H), 4.66 (bs, 1H), 3.75-3.79 3 H), 1.22 (s, 3 H), 1.22 (s, 3 H), 1.22
물질 5d의 제조 방법Method for producing
위에서 합성한 물질 4b (21 mg, 0.0527 mmol)를 메탄올에 용해시킨 뒤, 트리플루오로아세트산 과 물의 혼합 용액 (1:1) 등의 산성 조건에서 80 oC로 가열하며 15 시간 가량 교반시킨뒤, 반응이 종결됨을 TLC 등으로 확인하고 감압농축 시킨다. 농축된 잔류물을 실리카젤 크로마토그래피등으로 분리정제하여 최종 물질 5d (10 mg, 67%)를 얻을 수 있다.The material 4b (21 mg, 0.0527 mmol) synthesized above was dissolved in methanol, heated at 80 ° C under acidic conditions such as a mixed solution of trifluoroacetic acid and water (1: 1) and stirred for about 15 hours, The completion of the reaction is confirmed by TLC or the like, and the reaction is concentrated under reduced pressure. The concentrated residue is separated and purified by silica gel chromatography or the like to obtain the
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.3 (s, 1 H, D2O exchanged), 8.22 (s, 1 H), 8.03 (d, J = 3.66, 1 H), 4.92-5.24 (m, 2 H), 4.30 (m, 1 H), 3.84 (m, 1 H), 3.57 (d, J = 5.67, 2 H), 2.07-2.19 (m, 1 H) 1 H NMR (300 MHz, DMSO -d 6) δ 12.3 (s, 1 H, D2O exchanged), 8.22 (s, 1 H), 8.03 (d, J = 3.66, 1 H), 4.92-5.24 (m, J = 5.67, 2H), 2.07-2.19 (m, 1H), 4.30 (m, 1H)
물질 6a의 제조 방법Method for producing substance 6a
위에서 합성한 물질 4a (113 mg, 0.283 mmol)를 에탄올에 녹인 후, glass seal bomb에 옮긴다. 혼합액에 40% 메틸아민 수용액을 적가한 후, 반응용기를 밀폐시키고 상온에서 2 시간 정도 교반시킨다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 뒤, 반응 혼합물을 감압농축 시킨다. 농축된 잔류물은 THF에 녹인 후 혼합액에 트리플루오로아세트산 (TFA)과 물이 2:1로 혼합된 용액을 적가한다. 반응 혼합물을 50 oC 에서 30 시간 가량 교반시킨 뒤, 반응이 종결됨을 TLC로 확인하고 감압농축 시킨다. 농축된 잔류물을 실리카젤 크로마토그래피등으로 분리정제하여 최종 물질 6a (66 mg, 67%)를 얻을 수 있다.The material 4a (113 mg, 0.283 mmol) synthesized above was dissolved in ethanol and transferred to a glass seal bomb. To the mixed solution, 40% methylamine aqueous solution was added dropwise, the reaction vessel was sealed, and stirred at room temperature for about 2 hours. After confirming that the reaction is terminated by TLC, the reaction mixture is concentrated under reduced pressure. The concentrated residue is dissolved in THF, and a solution of trifluoroacetic acid (TFA) and water (2: 1) is added dropwise to the mixture. The reaction mixture was stirred at 50 ° C for about 30 hours, and the reaction was terminated by TLC and concentrated under reduced pressure. The concentrated residue is separated and purified by silica gel chromatography or the like to obtain the final substance 6a (66 mg, 67%).
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 8.28 (s, 1 H), 8.24 (s, 1 H), 5.15-528 (dt, J = 54.7, 3.85 Hz, 1 H), 4.96-5.04 (ddd, J = 29.55, 9.95, 3.25 Hz, 1 H), 4.75 (dd, J = 9.55, 6.80 Hz, 1 H), 4.28 (dd, J = 6.65, 4.90 Hz, 1 H), 3.83 (m, 1 H), 3.12 (bs, 3 H), 2.44-2.53 (m, 1 H) 1 H NMR (500 MHz, CD 3 OD)? 8.28 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 5.15-528 (dt, J = 54.7, 3.85 Hz, 1H), 4.96-5.04 J = 29.55, 9.95, 3.25 Hz, 1H), 4.75 (dd, J = 9.55,6.80 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 6.65, 4.90 Hz, 1H) ), 3.12 (bs, 3 H), 2.44-2.53 (m, 1 H)
물질 6b의 제조 방법Method for producing
위에서 합성한 물질 4c (223 mg, 0.535 mmol)를 상기 명시된 물질 4a 에서 물질 6a로의 합성과정과 동일하게 진행하면 6b (128 mg, 76%)를 합성할 수 있다.6b (128 mg, 76%) can be synthesized by proceeding in the same manner as in the synthesis of substance 4c (223 mg, 0.535 mmol) synthesized above in the same manner as in the synthesis of substance 6a from the above-mentioned substance 4a.
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 8.24 (s, 1 H), 8.20 (s, 1 H), 5.33 (m, 1H), 4.79 (dd, J = 10.3, 10.2 Hz, 1 H), 4.17 (s, 1 H), 3.81-3.90 (m, 2 H), 3.10 (bs, 3 H), 2.67 (m, 1 H) 1 H NMR (500 MHz, CD 3 OD)? 8.24 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 5.33 (m, 1H), 4.79 (dd, J = 10.3, 10.2 Hz, 1H) 3.17 (s, 1H), 3.81-3.90 (m, 2H), 3.10 (bs,
물질 7b의 제조 방법Method for producing
위에서 합성한 물질 5c (20 mg, 0.066 mmol)를 아세톤에 녹인 뒤, 촉매량의 황산을 0 oC에서 적가한 뒤, 상온에서 8시간 가량 교반시킨다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 후, 탄산수소소듐 (NaHCO3) 으로 중화시키고 반응 혼합물을 감압농축 시킨다. 농축된 잔류물을 실리카젤 크로마토그래피등으로 분리정제하여 2',3'-isopropylidene 화합물 (21 mg, 0.063 mmol)을 얻는다. 얻은 2',3'-isopropylidene 화합물 (21 mg, 0.063 mmol)과 디메틸아미노피리딘 (dimethylaminopyridine, DMAP) (0.7 mg, 0.058 mmol) 을 헥사메틸디실라잔 (hexamethyldisilazane, HMDS)을 용매로 하여 현탁액으로 만든 뒤, 상온에서 메탄설폰산 트리메틸실릴 (trimethylsilyl methanesulfonate, TMSOTf) (5 μL, cat.) 을 적가한 후, 75 oC 정도로 가열하며 2 시간 가량 교반한다. 이후, 반응 혼합물을 감압농축 시킨 뒤, 농축된 잔류물을 무수 THF에 녹인 후 혼합액에 디카본산 디터트뷰틸 (di-tert-butyl dicarbonate, Boc2O) (63 mg, 0.29 mmol) 을 적가한다. 해당 반응 혼합물을 4 시간 가량 상온에서 교반시킨후, 감압농축시킨다. 농축된 잔류물을 메탄올 : 트리에틸아민 (trimethylamine) = 5 : 1 혼합 용매에 녹인 후, 55 oC 정도로 가열하며 16시간 가량 교반한다. 반응이 종결됨을 TLC 등으로 확인 한 뒤, 감압농축 시킨다. 농축된 잔류물을 물로 희석시킨 뒤, 아세트산 에틸 (ethyl acetate)로 추출하여 유기층을 분액한다. 분리된 유기층을 물과 brine으로 충분히 씻어준 후, 황산 마그네슘 (MgSO4)으로 건조시키고 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축한다. 농축된 잔류물은 실리카젤 크로마토그래피등을 통하여 분리 정제하여 N, N-디(터트뷰틸 카본산) (N, N-diBoc) 화 된 중간체 (8 mg, 0.015 mmol) 와 N-터트뷰틸 카본산 (N-Boc) 화 된 중간체 (13 mg, 0.029 mmol) 을 얻을 수 있다. 이 두 중간체 (21 mg, 0.043 mmol) 을 무수 THF에 녹인 뒤, 염화 터트뷰틸마그네슘 1.0 M THF 용액 (tert-butylmagnesium chloride 1.0 M solution in THF) (0.215 ml, 0.215 mmol) 을 0 oC 에서 적가한다. 이 반응혼합물에 1-메틸에틸 N-[(S)-(2,3,4,5,6-오불화페녹시)페녹시포스피닐]-L-알라닌 (N-[(S)-(2,3,4,5,6-pentafluorophenoxy)phenoxyphosphinyl]-L-alanine 1-Methylethyl ester) (0.21 mg, 0.45 mmol) 을 무수 THF에 녹인 용액을 0 oC 에서 점적한 뒤, 반응혼합물을 상온에서 36 시간 가량 교반시킨다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 뒤, 반응 혼합물을 포화 암모늄 클로라이드 (NH4Cl) 수용액으로 반응을 종결시키고 수용액층을 아세트산 에틸로 추출한 뒤 유기층을 분액한다. 분리된 유기층을 물과 brine으로 충분히 씻어준 후, 황산 마그네슘 (MgSO4)으로 건조시키고 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축한다. 농축된 잔류물은 실리카젤 크로마토그래피등을 통하여 분리 정제하여, 중간체 (15 mg, 0.0215 mmol) 과 반응하지 않은 전구체 (10 mg, 0.0215 mmol) 을 얻을 수 있다. 이중, 반응이 진행된 중간체 (15 mg, 0.0215 mmol)를 포름산 수용액 (50 v/v%) 에 현탁시켜 상온에서 8 시간 가량 교반시켜 보호기 제거 반응을 진행한다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 뒤, 반응혼합물을 감압농축 시키고, 잔류물을 실리카젤 크로마토그래피등을 통하여 분리정제하면 화합물 7b (12 mg, 100%)를 얻을 수 있다.The material 5c (20 mg, 0.066 mmol) synthesized above was dissolved in acetone, and a catalytic amount of sulfuric acid was added dropwise at 0 ° C., followed by stirring at room temperature for about 8 hours. After confirming that the reaction is completed by TLC, it is neutralized with sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) and the reaction mixture is concentrated under reduced pressure. The concentrated residue is purified by silica gel chromatography or the like to obtain 2 ', 3'-isopropylidene compound (21 mg, 0.063 mmol). The obtained 2 ', 3'-isopropylidene compound (21 mg, 0.063 mmol) and dimethylaminopyridine (DMAP) (0.7 mg, 0.058 mmol) were dissolved in hexamethyldisilazane (HMDS) Then, trimethylsilyl methanesulfonate (TMSOTf) (5 μL, cat.) Was added dropwise at room temperature, and the mixture was heated to about 75 ° C. and stirred for about 2 hours. Then, after which the reaction mixture was concentrated under reduced pressure, the concentrated residue was added dropwise to the mixture solution was dissolved in anhydrous THF dicarboxylic acid di-tert-butyl (di- tert -butyl dicarbonate, Boc 2 O) (63 mg, 0.29 mmol). The reaction mixture is stirred at room temperature for about 4 hours and then concentrated under reduced pressure. The concentrated residue is dissolved in a mixed solvent of methanol: trimethylamine = 5: 1, heated to 55 ° C, and stirred for about 16 hours. After completion of the reaction is confirmed by TLC or the like, it is concentrated under reduced pressure. The concentrated residue is diluted with water, extracted with ethyl acetate, and the organic layer is separated. The separated organic layer was washed thoroughly with water and brine, dried over magnesium sulfate (MgSO 4 ), filtered off under reduced pressure, and the residue was removed under reduced pressure. The concentrated residue was separated by silica gel chromatography or the like to give the N, N - di (tert-butyl carbonic acid) (N, N -diBoc) an intermediate screen (8 mg, 0.015 mmol) and N - tert-butyl carboxylic acid ( N- Boc) intermediate (13 mg, 0.029 mmol). After dissolving the two intermediates (21 mg, 0.043 mmol) in anhydrous THF, 1.0 M THF solution of tert- butylmagnesium chloride 1.0 M solution in THF (0.215 ml, 0.215 mmol) was added dropwise at 0 ° C . To this reaction mixture was added 1-methylethyl N - [(S) - (2,3,4,5,6-octylphenoxy) phenoxyphosphinyl] -L-alanine (N - [(S) - , 3,4,5,6-pentafluorophenoxy) phenoxyphosphinyl] -L-alanine 1-Methylethyl ester (0.21 mg, 0.45 mmol) in anhydrous THF was added dropwise at 0 ° C., The mixture is stirred for about an hour. After confirming that the reaction is terminated by TLC, the reaction mixture is quenched with an aqueous solution of saturated ammonium chloride (NH 4 Cl), the aqueous layer is extracted with ethyl acetate, and the organic layer is separated. The separated organic layer was washed thoroughly with water and brine, dried over magnesium sulfate (MgSO 4 ), filtered off under reduced pressure, and the residue was removed under reduced pressure. The concentrated residue was purified by silica gel chromatography or the like to obtain a precursor (10 mg, 0.0215 mmol) which was not reacted with the intermediate (15 mg, 0.0215 mmol). The reaction intermediate (15 mg, 0.0215 mmol) is suspended in formic acid aqueous solution (50 v / v%) and stirred at room temperature for about 8 hours to carry out the protecting group elimination reaction. After confirming that the reaction was completed by TLC, the reaction mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel chromatography or the like to obtain
1H NMR (CD3OD, 500 MHz) : 8.17 (s, 1 H), 8.14 (s, 1 H), 7.33-7.14 (m, 5 H), 5.42 (ddd, J = 54.1, 6.35, 6.35 Hz, 1 H), 5.00 (ddd, J = 20.75, 8.05, 8.05 Hz, 1 H), 4.92 (ddd, J = 12.45, 6.25, 6.25 Hz, 1 H), 4.53 (dd, J = 9.3, 5.35 Hz, 1 H), 4.36 (t, J = 5.45 Hz, 2 H), 4.12 (dd, J = 4.5, 4.0 Hz, 1 H), 3.99-3.93 (m, 1 H), 2.59-2.49 (m, 1 H), 1.34 (d, J = 7 Hz, 3 H), 1.20 (d, J = 6.25 Hz, 3 H), 1.16(d, J = 6.25 Hz, 3 H) 1 H NMR (CD 3 OD, 500 MHz): 8.17 (s, 1 H), 8.14 (s, 1 H), 7.33-7.14 (m, 5 H), 5.42 (ddd, J = 54.1, 6.35, 6.35 Hz J = 9.3, 5.35 Hz, 1 H), 5.00 (ddd, J = 20.75, 8.05, 8.05 Hz, 1H), 4.92 (ddd, J = 12.45, 6.25, 6.25 Hz, 1H) 1 H), 3.99-3.93 (m, 1H), 2.59-2.49 (m, 1H), 4.36 (t, J = 5.45 Hz, 2H), 4.12 (dd, J = ), 1.34 (d, J = 7 Hz, 3 H), 1.20 (d, J = 6.25 Hz, 3 H), 1.16 (d, J = 6.25 Hz, 3 H)
물질 7a의 제조 방법Method for producing
위에서 합성한 물질 5b (100 mg, 0.35 mmol)를 상기 명시된 물질 5c 에서 물질 7b로의 합성과정과 동일하게 진행하면 7a (27 mg, 27%)를 합성할 수 있다.7a (27 mg, 27%) can be synthesized by proceeding in the same manner as in the synthesis of the above synthesized
1H NMR (CD3OD, 500 MHz) : 8.20 (s, 1 H), 8.18 (bs, 1 H), 7.38-7.18 (m, 5 H), 5.33 (ddd, J = 18.5, 9.7, 9.7 Hz, 1 H), 4.95 (ddd, J = 12.3, 6.15, 6.15 Hz, 1 H), 4.76 (dd, J = 9.95, 5.05 Hz, 1 H), 4.42-4.32 (m, 2 H), 4.19 (bs, 1 H), 3.92-3.86 (m, 1 H), 2.92-2.83 (m, 1 H), 1.33 (d, J = 7 Hz, 3 H), 1.20 (d, J = 6.2 Hz, 3 H), 1.17(d, J = 6.2 Hz, 3 H) 1 H NMR (CD 3 OD, 500 MHz): 8.20 (s, 1H), 8.18 (bs, 1H), 7.38-7.18 (m, 5H), 5.33 (ddd, J = 18.5, 9.7, 9.7 Hz , 4.95 (ddd, J = 12.3, 6.15, 6.15 Hz, 1H), 4.76 (dd, J = 9.95, 5.05 Hz, 1H), 4.42-4.32 (m, 2H), 4.19 , 1 H), 3.92-3.86 (m , 1 H), 2.92-2.83 (m, 1 H), 1.33 (d, J = 7 Hz, 3 H), 1.20 (d, J = 6.2 Hz, 3 H) , 1.17 (d, J = 6.2 Hz, 3 H)
물질 8a의 제조 방법Method for producing
3-메톡시아크릴산 메틸 (methyl 3-methoxyacrylate) (20 mL, 186 mmol)을 2 M 수산화소듐 수용액(103 ml) 에 넣고 상온에서 2시간 가량 교반시켜 완전히 용해시킨다. 이 반응혼합물을 2 M 염산 수용액으로 완전히 산성화시키고 여과하여 침전된 고체를 모은다. 앞에서 얻은 고체 유기산을 물에 녹인 후, 2 M 수산화소듐 수용액으로 중화시키면 소듐염 형태의 유기산을 얻을 수 있다. 이를 감압 데시케이터에서 오산화인 (phosphorus(V) oxide) 과 함께 3 일정도 건조시켜 준다. 건조된 유기산 소듐염 (6.20 g, 50 mmol)을 무수 디에틸에테르 (diethyl ether) 와 함께 현탁액으로 만든 후, 염화 티오닐 (thionyl chloride) (5.45 mL, 75 mmol)을 적가하고 4시간 가량 가열환류 시킨다. 그 후, 반응 혼합물을 30 oC 에서 15 시간 가량 교반하여 유기산염화물 (acid chloride)화 시킨다. 반응 혼합물을 상온으로 냉각시키고, 무수 디에틸에테르로 세척하면서 감압여과 한다. 얻어진 여과액을 질소기체 하에서 감압농축시키고 농축된 잔여물은 감압증류를 통하여 유기산염화물 (3.08 g, 51%)을 얻는다. 건조된 시안산 은 (silver cyanate) (8.44 g, 56.32 mmol)을 벤젠 (benzene)과 함께 현탁액을 만들어 준 뒤, 30 분간 가열환류 한다. 준비된 현탁액에 앞서 얻어진 유기산염화물 (1.45 g, 12.03 mmol) 을 적가하고 30 분 가량 가열환류시키면 이소시안산 (isocyanate)을 얻을 수 있고 이는 다른 과정 없이 반응 현탁액을 침전시킨 뒤, 상층액을 다음반응에 사용하도록 한다. 위에서 합성한 물질 3a (2.572 g, 9.84 mmol)을 DMF 에 용해시키고 -20 oC 이하로 충분히 냉각시킨다. 이 반응혼합물에 앞서 합성한 이소시안산 (45 mL, 19.68 mmol)을 점적하고 서서히 상온으로 가열되도록 하면서 15 시간 가량 교반시켜준다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인하고, 염화메틸렌 (methylene chloride) 로 세척하며 감압여과 후, 여과액을 감압농축시킨다. 이때 톨루엔, 에탄올 등과 함께 공비혼합물을 만들어서 충분히 감압농축시켜 잔여물이 고체화 되도록 한 뒤, 고체화된 잔여물을 실리카젤 크로마토그래피등으로 분리정제하면 중간체인 요소 유도체 (2.903 g, 76%)를 얻을 수 있다. 얻어진 요소 유도체를 1,4-디옥산에 녹인 후, 소량의 2 M 황산 수용액 (~1:10=2 M 황산:1,4-디옥산)을 적가한 뒤, 1시간 가량 가열환류시켜 요소 유도체의 고리화 반응과 보호기 제거 반응을 동시에 진행시킨다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 후, DOWEX 66 이온교환 수지(ion-exchange resin)와 같은 염기성 수지 (basic resin)등을 사용하여 반응 혼합물을 중화시키고 감압여과와 감압농축을 거쳐 얻어진 잔여물을 실리카젤 크로마토그래피등을 통하여 분리정제 하면 물질 8a (1.097 g, 56%)을 얻을 수 있다.3-methoxyacrylate (20 mL, 186 mmol) was added to a 2 M sodium hydroxide aqueous solution (103 mL) and stirred at room temperature for about 2 hours to dissolve completely. The reaction mixture is completely acidified with 2 M aqueous hydrochloric acid solution and collected by filtration. The solid organic acid obtained above is dissolved in water and neutralized with a 2 M aqueous sodium hydroxide solution to obtain an organic acid in the form of a sodium salt. This is dried in a vacuum desiccator for 3 days with phosphorus (V) oxide. The dried organic acid sodium salt (6.20 g, 50 mmol) was suspended in anhydrous diethyl ether and then thionyl chloride (5.45 mL, 75 mmol) was added dropwise. The mixture was heated to reflux for about 4 hours . Thereafter, the reaction mixture is stirred at 30 ° C for about 15 hours to form an organic acid chloride. The reaction mixture is cooled to room temperature and filtered under reduced pressure while washing with anhydrous diethyl ether. The obtained filtrate was concentrated under reduced pressure in a nitrogen gas, and the concentrated residue was distilled under reduced pressure to obtain an organic acid chloride (3.08 g, 51%). Dry silver cyanate (8.44 g, 56.32 mmol) is suspended in benzene and heated to reflux for 30 minutes. The organic acid chloride (1.45 g, 12.03 mmol) obtained above was added dropwise to the prepared suspension, and heated to reflux for 30 minutes to obtain isocyanate, which was precipitated without any further procedure. The supernatant was added to the next reaction Use. The material 3a (2.572 g, 9.84 mmol) synthesized above is dissolved in DMF and sufficiently cooled to below -20 ° C. To this reaction mixture was added isocyanic acid (45 mL, 19.68 mmol) synthesized previously, and the mixture was stirred for about 15 hours while being gradually heated to room temperature. The reaction is terminated by TLC, washed with methylene chloride, filtered under reduced pressure, and the filtrate is concentrated under reduced pressure. At this time, an azeotropic mixture with toluene, ethanol and the like was made and sufficiently concentrated under reduced pressure to solidify the residue. The solidified residue was purified by silica gel chromatography or the like to obtain an urea derivative (2.903 g, 76%) as an intermediate have. After the obtained urea derivative was dissolved in 1,4-dioxane, a small amount of a 2 M aqueous sulfuric acid solution (~1: 10 = 2 M sulfuric acid: 1,4-dioxane) was added dropwise, And the elimination reaction of the protecting group are simultaneously carried out. After confirming that the reaction was completed by TLC, the reaction mixture was neutralized using a basic resin such as DOWEX 66 ion-exchange resin, and the residue obtained through vacuum filtration and concentration under reduced pressure was purified by silica gel Separation and purification through chromatography or the like affords
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.69 (d, J = 8.08 Hz, 1 H), 5.68 (d, J = 8.04 Hz, 1 H), 5.02-5.18 (td, J = 55.28, 3.9 Hz, 1 H), 4.81-4.93 (m, 1 H), 4.46 (m, 1 H), 3.93 (t, J = 5.00 Hz, 1 H), 3.76 (m, 2 H), 2.30-2.41 (m, 1 H) 1 H NMR (400 MHz, CD 3 OD) δ 7.69 (d, J = 8.08 Hz, 1 H), 5.68 (d, J = 8.04 Hz, 1 H), 5.02-5.18 (td, J = 55.28, 3.9 Hz (M, 1H), 4.76 (m, 1H), 3.93 (t, J = 5.00 Hz, 1H), 3.76 (m, 2H), 2.30-2.41 1 H)
물질 8b, 8c의 제조 방법Method for producing
각각의 전구체 물질 3b (1.3 g, 4.97 mmol), 3c (1.942 g 6.952 mmol)에서 상기 명시된 물질 3a에서 물질 8a로의 합성 과정과 동일하게 진행하면 각각 8b (597 mg, 53%), 8c (1 g, 52%)를 얻을 수 있다.(597 mg, 53%), 8c (1 g (53%)), respectively, by proceeding in the same manner as in the synthesis of the precursor substance 3b (1.3 g, 4.97 mmol) and 3c , 52%).
8b 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.60 (d, J = 7.95 Hz, 1 H), 5.69 (d, J = 7.90 Hz, 1 H), 5.07-5.21 (ddd, J = 55.2, 6.85, 5.10 Hz, 1 H), 4.61-4.69 (ddd, J = 22.6, 8.75, 7.35 Hz, 1 H), 4.32 (dd, J = 9.00, 5.25 Hz, 1 H), 3.98 (t, J = 3.75 Hz, 1 H), 3.70 (m, 2 H), 2.24 (m, 1 H) 8b 1 H NMR (500 MHz, CD 3 OD) δ 7.60 (d, J = 7.95 Hz, 1 H), 5.69 (d, J = 7.90 Hz, 1 H), 5.07-5.21 (ddd, J = 55.2, 6.85 (Dd, J = 22.6, 8.75, 7.35 Hz, 1H), 4.32 (dd, J = 9.00, 5.25 Hz, 1H), 3.98 (t, J = 3.75 Hz, 1H), 4.61-4.69 , 1H), 3.70 (m, 2H), 2.24 (m, 1H)
8c 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.67 (dd, J = 8.15, 2.35 Hz, 1 H) 5.71 (d, J = 8.05 Hz, 1 H), 5.36, (dt, J = 17.7, 10.3 Hz, 1 H), 4.41 (dd, J = 10.7, 5.15 Hz, 1 H), 4.07 (m, 1 H), 3.73-3.82 (m, 2 H), 2.53 (m, 1 H) 8c 1 H NMR (500 MHz, CD 3 OD) δ 7.67 (dd, J = 8.15, 2.35 Hz, 1 H) 5.71 (d, J = 8.05 Hz, 1 H), 5.36, (dt, J = 17.7, 10.3 (M, 1H), 3.73-3.82 (m, 2H), 2.53 (m, 1H), 4.41 (dd, J = 10.7,5.15 Hz, 1H)
물질 9a의 제조 방법Method for producing
물질 8a (100 mg, 0.384 mmol)를 염화메틸렌 (methylene chloride)에 용해시킨 뒤 피리딘 (pyridine) (0.21 mL, 2.57 mmol)을 적가하고 0 oC 로 냉각시킨다. 냉각시킨 반응혼합물에 염화 벤조일 (benzoyl chloride) (0.27 mL, 2.31 mmol)을 점적한 뒤, 서서히 상온으로 가열하며 15 시간 가량 교반시킨다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 뒤, 물로 반응을 종결시키고 수용액 층을 염화메틸렌으로 추출한 뒤 유기층을 분액한다. 분리된 유기층을 물과 brine으로 충분히 씻어준 후, 황산 마그네슘 (MgSO4)으로 건조시키고 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축한다. 농축된 잔류물은 실리카젤 크로마토그래피등을 통하여 분리 정제하여 벤조일화 된 중간체 (164 mg, 75%)를 얻을 수 있다. 1,2,4-트리아졸 (1,2,4-triazole) (198 mg, 2.87 mmol) 을 무수 아세토니트릴에서 현탁액으로 만들고, 0 oC로 냉각시킨 뒤, 염화포스포릴 (phosphoryl chloride) (0.27 mL, 2.87 mmol)을 점적한다. 반응 혼합물을 0 oC 에서 30 분 가량 교반시킨 후 앞서 얻어진 중간체 (164 mg, 0.286 mmol)을 무수 아세토니트릴에 용해시킨 후 적가하고 뒤이어 트리에틸아민 (trimethylamine) (0.4 mL, 2.87 mmol)을 0 oC 에서 적가한다. 반응 혼합물은 서서히 상온으로 가열시키며 15 시간 가량 교반시켜준다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 뒤, 반응 혼합물을 감압 농축 시킨다. 농축된 잔여물을 염화메틸렌으로 희석시키고 소량의 물로 2번 가량 분액하여 잔여 1,2,4-트리아졸을 제거한다. 세척한 유기층을 감압 농축시킨 잔여물을 1,4-디옥산 (1,4-dioxane)에 용해시키고 밀폐가능한 반응용기로 옮긴 후, 포화 암모니아수를 용액의 20 v/v% 비율로 첨가한다. 반응 혼합물을 상온에서 2 시간 가량 교반시킨 후, 반응 혼합물을 감압 농축한다. 농축한 잔여물을 실리카젤 크로마토그래피 등으로 분리 정제하여 시토신 (cytosine) 으로 변환된 중간체 (42 mg, 26%)를 얻을 수 있다. 시토신 중간체 (42 mg, 0.0735 mmol)를 메탄올에 녹인 후, 밀폐가능한 반응용기로 옮긴 후 포화 암모니아/메탄올 용액을 첨가 한 뒤, 상온에서 2 일 가량 교반시킨 후 반응 혼합물을 감압 농축한다. 농축된 잔여물을 소량의 물로 희석시킨뒤 염화메틸렌으로 10번 가량 추출하여 잔여 벤조일 부가생성물을 제거하면 물질 9a (17 mg, 85%)을 얻을 수 있다.After dissolving
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.67 (d, J = 7.45, 1 H), 5.88 (d, J = 7.45, 1 H) 5.05-5.17 (dt, J = 55.4, 3.65 Hz, 1 H), 4.89-4.97 (ddd, J = 30.6, 10.2, 3.2 Hz, 1 H), 4.44 (dd, J = 10.4, 6.7 Hz, 1 H), 3.92 (t, J = 4.75 Hz, 1 H), 3.75 (m, 2 H), 2.36 (m, 1 H) 1 H NMR (500 MHz, CD 3 OD) δ 7.67 (d, J = 7.45, 1 H), 5.88 (d, J = 7.45, 1 H) 5.05-5.17 (dt, J = 55.4, 3.65 Hz, 1 H ), 4.89-4.97 (ddd, J = 30.6, 10.2, 3.2 Hz, 1 H), 4.44 (dd, J = 10.4, 6.7 Hz, 1 H), 3.92 (t, J = 4.75 Hz, 1 H), 3.75 (m, 2H), 2.36 (m, 1H)
물질 9b의 제조 방법Method for producing
물질 8c (100 mg, 0.359 mmol)를 상기 명시한 물질 8a에서 물질 9a로의 합성과정과 동일하게 진행하면 물질 9b (20 mg, 20%)를 얻을 수 있다. 단, 최종 단계에서 농축된 잔여물을 산성 수지 (acidic resin) 등으로 분리정제 하여야 한다.
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.62 (dd, J = 7.45, 2.35 Hz, 1 H), 5.90 (d, J = 7.40 Hz, 1 H), 5.51 (dt, J = 18.2, 10.0 Hz, 1 H), 4.37 (dd, J = 10.6, 5.25 Hz, 1 H), 4.06 (m, 1 H), 3.73-3.83 (m, 2 H), 2.54 (m, 1 H) 1 H NMR (500 MHz, CD 3 OD) δ 7.62 (dd, J = 7.45, 2.35 Hz, 1 H), 5.90 (d, J = 7.40 Hz, 1 H), 5.51 (dt, J = 18.2, 10.0 Hz , 3.17 (m, 1H), 3.73-3.83 (m, 2H), 2.54 (m, 1H), 4.37 (dd, J = 10.6,5.25 Hz, 1H)
물질 10a의 제조 방법Method for producing
물질 8a (40 mg, 0.15 mmol) 를 아세톤에 녹인 뒤, 촉매량의 황산을 0 oC에서 적가한 뒤, 상온에서 2 시간 가량 교반시킨다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 후, 탄산수소소듐 (NaHCO3) 으로 중화시키고 반응 혼합물을 감압농축 시킨다. 농축된 잔류물을 실리카젤 크로마토그래피등으로 분리정제하여 2',3'-isopropylidene 화합물 (45 mg, 0.15 mmol)을 얻는다. 중간체 2',3'-isopropylidene 화합물 (45 mg, 0.15 mmol)을 무수 THF에 녹인 뒤, 염화 터트뷰틸마그네슘 1.0 M THF 용액 (tert-butylmagnesium chloride 1.0 M solution in THF) (0.75 ml, 0.75 mmol) 을 0 oC 에서 적가한다. 이 반응혼합물에 1-메틸에틸 N-[(S)-(2,3,4,5,6-오불화페녹시)페녹시포스피닐]-L-알라닌 (N-[(S)-(2,3,4,5,6-pentafluorophenoxy)phenoxyphosphinyl]-L-alanine 1-Methylethyl ester) (68 mg, 0.15 mmol) 을 무수 THF에 녹인 용액을 0 oC 에서 점적한 뒤, 반응혼합물을 상온에서 36 시간 가량 교반시킨다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 뒤, 반응 혼합물을 포화 암모늄 클로라이드 (NH4Cl) 수용액으로 반응을 종결시키고 수용액층을 아세트산 에틸로 추출한 뒤 유기층을 분액한다. 분리된 유기층을 물과 brine으로 충분히 씻어준 후, 황산 마그네슘 (MgSO4)으로 건조시키고 감압여과를 통해 잔여 고체를 제거한 뒤 감압 농축한다. 농축된 잔류물은 실리카젤 크로마토그래피등을 통하여 분리 정제하여, 중간체 (28 mg, 0.0495 mmol) 과 반응하지 않은 전구체 (25 mg, 0.083 mmol) 을 얻을 수 있다. 이중, 반응이 진행된 중간체 (28 mg, 0.0495 mmol)를 포름산 수용액 (50 v/v%) 에 현탁시켜 상온에서 8 시간 가량 교반시켜 보호기 제거 반응을 진행한다. 반응이 종결됨을 TLC로 확인한 뒤, 반응혼합물을 감압농축 시키고, 잔류물을 실리카젤 크로마토그래피등을 통하여 분리정제하면 화합물 10a (24 mg, 90%)를 얻을 수 있다.
1H NMR (CD3OD, 500 MHz) : 7.64 (d, J = 8.05 Hz, 1 H), 7.34-7.37 (m, 2 H), 7.17-7.24 (m, 3 H), 5.68 (d, J = 8.05 Hz, 1 H), 5.04 (ddd, J = 55, 3.9, 3.9 Hz, 1 H), 4.93-4.98 (m, 1 H), 4.89-4.92 (m, 1 H), 4.44 (dd, J = 9.7, 6.6 Hz, 1 H), 4.26 (t, J = 7 Hz, 2 H), 3.99 (t, J = 5.4 Hz, 1 H), 3.91-3.85 (m, 1 H), 2.51-2.57 (m, 1 H), 1.33 (d, J = 7 Hz, 3 H), 1.21 (d, J = 6.15 Hz, 6 H) 1 H NMR (CD 3 OD, 500 MHz): 7.64 (d, J = 8.05 Hz, 1 H), 7.34-7.37 (m, 2 H), 7.17-7.24 (m, 3 H), 5.68 (d, J = 8.05 Hz, 1 H), 5.04 (ddd, J = 55, 3.9, 3.9 Hz, 1 H), 4.93-4.98 (m, 1 H), 4.89-4.92 (m, 1 H), 4.44 (dd, J = 9.7,6.6 Hz, 1H), 4.26 (t, J = 7 Hz, 2H), 3.99 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 3.91-3.85 (m, 1H), 2.51-2.57 m, 1 H), 1.33 (d, J = 7 Hz, 3 H), 1.21 (d, J = 6.15 Hz,
물질 10b의 제조 방법Method for producing
물질 8c (30 mg, 0.10 mmol)를 상기 명시한 물질 8a에서 물질 10a로의 합성과정과 동일하게 진행하면 물질 10b (31 mg, 32%)를 얻을 수 있다.
1H NMR (CD3OD, 500 MHz) : 7.53 (dd, J = 8.05, 2.1 Hz, 1 H), 7.38-7.35 (m, 2 H), 7.25-7.18 (m, 3 H), 5.69 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 5.34 (ddd, J = 18.85, 9.7, 9.7 Hz, 1 H), 4.97 (ddd, J = 12.5, 6.2, 6.2 Hz, 1 H), 4.24-4.36 (m, 3 H), 4.08 (bs, 1 H), 3.87-3.90 (m, 1 H), 2.70-2.80 (m, 1 H), 1.34 (d, J = 7.15 Hz, 3 H), 1.22 (d, J = 6.25 Hz, 6 H) 1 H NMR (CD 3 OD, 500 MHz): 7.53 (dd, J = 8.05, 2.1 Hz, 1 H), 7.38-7.35 (m, 2 H), 7.25-7.18 (m, 3 H), 5.69 (d J = 8.1 Hz, 1H), 5.34 (ddd, J = 18.85, 9.7, 9.7 Hz, 1H), 4.97 (ddd, J = 12.5, 6.2, 6.2 Hz, 1H), 4.24-4.36 3 H), 4.08 (bs, 1 H), 3.87-3.90 (m, 1 H), 2.70-2.80 (m, 1 H), 1.34 (d, J = 7.15 Hz, 3 H), 1.22 (d, J = 6.25 Hz, 6 H)
세포, 바이러스, 물질의 준비Preparation of cells, viruses and substances
Vero E6 와 Vero CCL81 세포주는 Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM; Lonza) 에 8% foetal calf serum (FCS; PAA), 2 mM L-글루타민, 페니실린 (penicillin) 100 IU/ml, 스트렙토마이신 (streptomycin) 100 g/ml가 조합된 배지를 사용하여 항온항습배양기에서 37 °C, 5% 이산화탄소 조건에서 배양하였다. Vero E6 and Vero CCL81 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Lonza) supplemented with 8% fetal calf serum (FCS), 2 mM L-glutamine, 100 IU / ml penicillin, 100 g streptomycin / ml in the presence of 5% carbon dioxide at 37 ° C in a constant-temperature and constant-humidity incubator.
Vero 세포주는 Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM; Lonza) 에 8% FCS, 2 mM L-글루타민, 페니실린 (penicillin) 100 IU/ml, 스트렙토마이신 (streptomycin) 100 ?g/ml가 조합된 배지를 사용하여 상기 서술한 동일 조건에서 배양하였다.Vero cell lines were grown in medium supplemented with 8% FCS, 2 mM L-glutamine,
HuH7 세포주는 MDEM 에 8% FCS, 2 mM L-글루타민, 페니실린 (penicillin) 100 IU/ml, 스트렙토마이신 (streptomycin) 100 μg/ml, 1x non-essential amino acids (NEAA; Lonza) 가 조합된 배지를 사용하여 상기 서술한 동일 조건에서 배양하였다.HuH7 cell lines were grown in MDEM supplemented with 8% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 IU / ml penicillin,
MRC-5 세포주는 EMEM 에 8% FCS, 2 mM L-글루타민, 페니실린 (penicillin) 100 IU/ml, 스트렙토마이신 (streptomycin) 100 μg/ml, 1x NEAA 가 조합된 배지를 사용하여 상기 서술한 동일 조건에서 배양하였다.The MRC-5 cell line was cultured in EMEM under the same conditions described above using 8% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 IU / ml of penicillin, 100 μg / ml of streptomycin and 1 × NEAA Lt; / RTI >
바이러스 감염 시에는 EMEM 과 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazine-N''-2-ethanesulfonic acid (HEPES; Lonza) 에 2% FCS, mM L-글루타민, 페니실린 (penicillin) 100 IU/ml, 스트렙토마이신 (streptomycin) 100 μg/ml가 조합된 배지를 사용하였다.For viral infection, EMEM and 2% FCS, mM L-glutamine,
클론 유래 chikungunya 바이러스 (CHIKV LS3) 감염원은 Scholte 그룹이 발표한 PLOS ONE 8 (2013): e71047 에 서술된 방법으로 생산하였다.The clone-derived chikungunya virus (CHIKV LS3) infectious agent was produced by the method described in Scholte Group's PLOS ONE 8 (2013): e71047.
Zika 바이러스 (ZIKV) strain SL1602 는 Van Boheemen 그룹이 발표한 Sci . Rep. (2017) in press에 서술된 방법으로 수리남(Suriname)에서 돌아온 감염된 여행자로부터 분리 하였다.The Zika virus (ZIKV) strain SL1602 was produced by the Van Boheemen group Sci . Rep. (2017) in press from an infected traveler returning from Suriname.
Middle east respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV; strain EMC/2012)는 사우디아라비아 제다 (Jeddah) 의 Fakeeh 병원의 Dr. Soliman 의 환자 조직에서 분리 하였으며 (2012, Van Boheemen 그룹) 네덜란드 로테르담 (Rotterdam) 의 Erasmus 의료 센터에서 제공 받았다.Middle east respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV; strain EMC / 2012) was developed by Fakeeh Hospital of Jeddah, Saudi Arabia. Soliman was isolated from patient tissue (2012, Van Boheemen group) and received at the Erasmus Medical Center in Rotterdam, The Netherlands.
Severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS- CoV; strain Frankfurt 1)는 독일 프랑크푸르트 암 마인 (Frankfurt am Main) 의 Johann Wolfgang Goethe 대학의 H. F. Rabenau 와 H. W. Doerr 로부터 제공 받았다. (2006, Snijder 그룹)Severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV strain Frankfurt 1) was obtained from H. F. Rabenau and H. W. Doerr of Johann Wolfgang Goethe University in Frankfurt am Main, Germany. (2006, Snijder Group)
각 평가물질들은 DMSO에 용해시켜 20 mM 과 10 μM 로 사용하였다.Each of the evaluation materials was dissolved in DMSO and used at 20 mM and 10 μM.
감염원 CHIKV, MERS-CoV, SARS-CoV, ZIKV 을 사용한 실험은 모두 LUMC의 생물학적 안전도 3 레벨 시설에 있는 생물학적 안전캐비닛 안에서 시행하였다.Experiments using infectious agents CHIKV, MERS-CoV, SARS-CoV, and ZIKV were performed within the biological safety cabinet in the LUMC Biosafety Level 3 facility.
CPECPE -reduction assays-reduction assays
VeroE6 세포주는 96-well clusters 에 5,000 세포/well (CHIKV)가 되도록 각 well 에 100 μl 부피로 접종하였다. The VeroE6 cell line was inoculated in 96-well clusters at a concentration of 5,000 cells / well (CHIKV) in each well in a volume of 100 μl.
Vero (CCL81) 세포주는 96-well clusters에 5,000 세포/well (ZIKV) 가 되도록 접종하였다.The Vero (CCL81) cell line was inoculated into 96-well clusters at 5,000 cells / well (ZIKV).
MERS-CoV CPE reduction assays를 하기 위해, Vero, HuH7, MRC-5 세포주를 96-well clusters에 각각 20,000, 10,000, 15,000 세포/well 이 되도록 접종하였다.Vero, HuH7 and MRC-5 cell lines were inoculated in 96-well clusters at 20,000, 10,000 and 15,000 cells / well, respectively, for MERS-CoV CPE reduction assays.
SARS-CoV CPE reduction assays를 하기 위해, VeroE6 세포주를 96-well clusters에 10,000 세포/well 이 되도록 접종하였다.To perform the SARS-CoV CPE reduction assays, the VeroE6 cell line was inoculated into 96-well clusters at 10,000 cells / well.
각 세포주에 접종된 다음날 평가물질들을 시작 농도 100 μM에서 2배로 연속 희석 (serial dilution) 시킨 상기 서술한 바이러스 감염시 배지에 준비한 뒤, 기존의 96-well clusters에 있던 배지와 교환해주었다.On the next day after inoculation in each cell line, the evaluation materials were prepared in the above-described virus infection medium by serial dilution at a starting concentration of 100 [mu] M in duplicate, and then exchanged with the medium in the existing 96-well clusters.
각세포는 CHIKV (MOI 0.005), ZIKV (MOI 0.050), MERS-CoV (MOI 0.01 in HuH7, MOI 0.005 in Vero and MOI 0.03 in MRC-5 cells) 혹은 SARS-CoV (MOI 0.01)가 되게끔 동일 4회 반복 조건 (quadruplicate) 으로 감염시켰다.The cells were incubated in the same incubation medium for CHIKV (MOI 0.005), ZIKV (MOI 0.050), MERS-CoV (MOI 0.01 in HuH7, MOI 0.005 in Vero and MOI 0.03 in MRC-5 cells) or SARS-CoV (Quadruplicate).
감염되지 않은 세포의 경우 평가물질이 희석된 배지로 동일하게 처리 하였으며 동시적으로 세포독성실험(CC50 평가) 을 시행하였다.In the case of uninfected cells, the test material was treated with diluted media in the same manner, and a cytotoxicity test (CC 50 evaluation) was performed simultaneously.
바이러스는 96 시간 후 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) reagent (Promega)를 사용하여 colorimetric viability assays 를 진행하였다.After 96 hours, the virus was subjected to colorimetric viability assays using CellTiter 96 ® AQ ueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) reagent (Promega).
Assay는 2~2.5 시간 뒤 30 μl 37% formaldehyde를 처리하여 종결하였다.Assay was terminated by treatment with 30 μl 37% formaldehyde for 2 to 2.5 hours.
흡광도는 495 nm 에서 Berthold Mithras LB 940 plate reader를 사용하여 측정하였으며, 감염원과 평가물질을 처리 하지 않은 세포들로 정규화 (normalization)하였다.Absorbance was measured using a Berthold Mithras LB 940 plate reader at 495 nm and normalized to cells not treated with the infectious agent and the assessed material.
CC50 측정을 위해서 감염원과 평가물질을 처리 하지 않은 세포들로 정규화 (normalization)하였다.For the CC 50 measurement, normalization was performed on the infected cells and the untreated cells.
결과값들은 동일 4회 반복 조건에서 얻어진 값들의 평균값으로 나타내었으며 평균±표준편차로 표현하였다.The results were expressed as the mean value of the values obtained under the same 4-iteration conditions and expressed as mean ± standard deviation.
EC50 값들은 Graphpad Prism 을 사용하여 비선형 회귀(non-linear regression) 법을 사용하여 결정하였다.EC 50 values were determined using a non-linear regression method using Graphpad Prism.
실험 결과들은 도 1 내지 도 3에 정리되었다.The experimental results are summarized in Figs.
이상 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.While the present invention has been described in connection with certain exemplary embodiments, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.
Claims (1)
<화학식 a>
(상기 화학식 a에서, n은 2이고, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 불소이며, B는 하기 화학식 b-1 또는 b-2이고, P는 수소 또는 포스포아미데이트(phosphoamidate)기이다)
<화학식 b-1>
(상기 화학식 b-1에서, X1는 염소, 수산기(OH group), 아미노기(amino group) 또는 알킬아미노(alkylamino group)기이고, Y1는 수소 또는 아미노기이다.
상기 알킬아미노기는 -NHMe, -NHEt 등의 모노알킬아미노기(-NHR) 또는 -NMe2, -NMeEt, -NEt2 등의 다이알킬아미노기(-NR2)이다)
<화학식 b-2>
(상기 화학식 b-2에서, X2는 수산기 또는 아미노기이고, Y2는 수소, 메칠기(methyl group) 또는 할로겐이다)A carbocyclic nucleoside derivative represented by the following formula (a) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
<Formula a>
(Wherein, in the above formula (a), n is 2, R 1 and R 2 are each independently hydrogen or fluorine, B is the following formula b-1 or b-2 and P is hydrogen or a phosphoamidate group.
<Formula b-1>
(In the above formula (b-1), X1 is chlorine, an OH group, an amino group or an alkylamino group, and Y1 is hydrogen or an amino group.
The alkylamino group may be a monoalkylamino group (-NHR) such as -NHMe or -NHEt or a dialkylamino group (-NR2) such as -NMe2, -NMeEt or -NEt2,
<Formula b-2>
(In the above formula (b-2), X2 is a hydroxyl group or an amino group, and Y2 is hydrogen, a methyl group or a halogen)
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020170063574A KR20180128252A (en) | 2017-05-23 | 2017-05-23 | Carbocyclic nucleosides derivatives and the antivirus compositions containing the same |
PCT/KR2018/000644 WO2018131950A1 (en) | 2017-01-12 | 2018-01-12 | Carbocyclic nucleoside derivative and antiviral agent comprising same |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020170063574A KR20180128252A (en) | 2017-05-23 | 2017-05-23 | Carbocyclic nucleosides derivatives and the antivirus compositions containing the same |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020200037371A Division KR102202556B1 (en) | 2020-03-27 | 2020-03-27 | Carbocyclic nucleosides derivatives and the antivirus compositions containing the same |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20180128252A true KR20180128252A (en) | 2018-12-03 |
Family
ID=64743099
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020170063574A KR20180128252A (en) | 2017-01-12 | 2017-05-23 | Carbocyclic nucleosides derivatives and the antivirus compositions containing the same |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR20180128252A (en) |
-
2017
- 2017-05-23 KR KR1020170063574A patent/KR20180128252A/en active IP Right Grant
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2020233714B2 (en) | Methods for treating Arenaviridae and Coronaviridae virus infections | |
AU2020203055B2 (en) | Beta-D-2'-deoxy-2'alpha-fluoro-2'-beta-C-substituted-2-modified-N6-substituted purine nucleotides for HCV treatment | |
RU2720811C2 (en) | 4'-substituted nucleoside reverse transcriptase inhibitors and production thereof | |
EP3042910B1 (en) | 2'-spiro-nucleosides for use in the therapy of hepatitis c | |
SG174624A1 (en) | Compounds with the bicyclo[4.2.1]nonane system for the treatment of flaviviridae infections | |
JP2000501694A (en) | Heterocyclic-substituted cyclopentane compounds | |
CN112010916B (en) | Phosphoramidate derivatives of nucleoside compounds and uses thereof | |
CN112062800B (en) | Phosphoramidate derivatives of nucleoside compounds and uses thereof | |
EP4389750A1 (en) | Nucleoside derivatives and prodrugs thereof having viral growth inhibitory action | |
DK166355B (en) | ADENOSIN DERIVATIVES AND PHARMACEUTICAL PREPARATIONS CONTAINING SUCH DERIVATIVES | |
CN101384262B (en) | Use of pyrimidinedione derivative for preventing or treating hepatitis c | |
KR102202556B1 (en) | Carbocyclic nucleosides derivatives and the antivirus compositions containing the same | |
KR20180128252A (en) | Carbocyclic nucleosides derivatives and the antivirus compositions containing the same | |
JP2001504468A (en) | L-β-dioxolanuridine analogs and methods for treating and preventing viral infection | |
KR102202555B1 (en) | Carbocyclic nucleosides derivatives and the antivirus compositions containing the same | |
CA2975382C (en) | Design, synthesis and methods of use of acyclic fleximer nucleoside analogues having anti-coronavirus activity | |
CA2385349A1 (en) | Method for the treatment or prevention of viral infection using nucleoside analogues | |
KR20180083094A (en) | Carbocyclic nucleosides derivatives and the antivirus compositions containing the same | |
WO2020221894A1 (en) | Antiviral compounds | |
CA3190455A1 (en) | Cold medicine and antiviral medicine | |
EP1899352B1 (en) | 1- [2' , 3' -dideoxy-3' c- (hydroxymethyl) - beta-d-erythro-pentofuranosyl] cytosine derivatives as hiv inhibitors | |
MXPA97006942A (en) | Quimi compounds | |
CA2203672A1 (en) | L-ribofuranosyl nucleosides |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right |