KR20180127344A - 단백질 A 결합 펩타이드, 항-EphA2 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

단백질 A 결합 펩타이드, 항-EphA2 항체 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20180127344A
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제임스 디. 막스
대릴 드럼몬드
멜리사 게디
드미트리 키르포틴
니라즈 콜리
알렉세이 루고프스키
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더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
메리맥 파마슈티컬즈, 인크.
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Abstract

본 개시내용에 의해서 항체에 유용한 특성을 부여하는 CDR 및 인간 프레임워크 영역을 포함하는 항체(예를 들어, scFv)가 제공된다. 특정 실시형태에서, 이러한 특성은 열안정성(예를 들어, 증가된 용융 온도), 스타필로코쿠스 아우레우스 단백질 A에 대한 효율적인 결합, 또는 둘 모두를 포함한다. 특정 양상에서, 항체는 종양 연관 항원 EphA2에 특이적으로 결합하는 내재화 항체이다.

Description

단백질 A 결합 펩타이드, 항-EphA2 항체 및 이의 사용 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2016년 3월 16일자로 출원된 미국 가출원 제62/309,365호, 2016년 3월 16일자로 출원된 미국 가출원 제62/309,383호, 및 2016년 3월 16일자로 출원된 미국 가출원 제62/309,374호에 대한 우선권을 주장하고, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.
도입부
암 세포는 특정 세포 표면 항원, 예를 들어 세포 표면 수용체의 발현 또는 과별현을 비롯한, 다양한 단백질을 보통 비정상적으로 발현시킨다. 이러한 비정상적으로 발현된 단백질은 치료 항체를 위한 표적으로서 활용될 수 있고, 다수의 암 상에서 발현된 세포 표면 수용체에 특이적인 항체는 표적화된 면역치료제의 개발을 위해서 이용되어 왔다. 항체-약물 접합체(면역리포솜 및 면역독소 포함), 및 항체-표적화된 핵산 전달 비히클을 비롯한 다수의 이러한 치료제는 세포 표면 항원에 결합할 뿐만 아니라 결합 시 세포 내로의 내재화를 겪는 항체를 요구한다. 예를 들어, 화학치료제와 접합된 암 세포에 의해서 발현된 세포 표면 수용체를 인식하는 항체가 호지킨 림프종(브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin)) 및 전이성 유방암(아도-트라스투주맙 엠탄신(ado-trastuzumab emtansine))을 치료하는 데 현재 사용된다.
치료 표적화를 위해서 고려되는 세포 표면 수용체(그것은 몇몇 암에서 비정상적으로 발현된다고 공지되어 있음)는 EphA2이다. 미국 특허 제US 9,220,772호에 기술된 바와 같이, 항-EphA2 scFv 항체는 먼저 인간 유방암 세포를 사용하여 항체를 내재화화기 위한 일반 단계 선택 및 EphA2의 세포외 도메인을 발현시키는 효모에 결합시키기 위한 선택을 포함하는 다단계 스크리닝 공정을 사용하여 단리되었다. 항체 D2-1A7은 EphA2를 발현시키는 세포에 의해서 강하게 내재화되는 scFv를 차단하는 리간드로서 식별되었다.
항체 안정성은 유용한 특성이고, 이는 견고하고 규모 확대 가능한 항체 제조 공정을 가능하게 한다. 추가로, 치료 용도를 위한 항체의 제조를 용이하게 하기 위해서, 항체는 친화도 수지를 사용하여 정제될 수 있는 것이 바람직하다. 대부분의 치료 항체의 경우, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A 친화도 크로마토그래피가 초기의 중요한 단계인데, 그 이유는 그것이 복합 용액, 예컨대, 수확된 세포 배양 유체로부터 선택적이고 효율적으로 항체에 결합하여 단일 단계로 산물 불순물의 99.5% 초과를 제거하고, 상당한 바이러스 클리어런스를 제공할 수 있기 때문이다.
세포 표면 수용체에 결합하고, 산업 생산 및 의학적 용도에 적합한 안정성 및 다른 제조 특성을 나타내는 새로운 항체에 대한 필요성이 계속적으로 존재한다. 본 명세서에 개시된 신규의 조작된 항체는 이러한 요구를 다루고, 추가 이점을 제공한다.
본 개시내용은 항체에 유용한 특성을 부여하는 CDR 및 인간 프레임워크 영역을 포함하는 항체(예를 들어, scFv)를 제공한다. 특정 실시형태에서, 이러한 특성은 열안정성(예를 들어, 증가된 용융 온도), 스타필로코쿠스 아우레우스 단백질 A에 대한 효율적인 결합, 또는 둘 모두를 포함한다. 특정 양상에서, 항체는 종양 연관 항원 EphA2에 특이적으로 결합하는 내재화 항체이다.
본 개시내용은 열-안정성인(67℃ 이상 또는 70℃ 이상의 융융 온도를 나타내는) 내재화 항-EphA2 항체(Ab)(예를 들어, scFv)를 제공한다. 또한 스타필로코쿠스 아우레우스 단백질 A에 대해서 상당한 결합(예를 들어, 예를 들어, 실시예 1의 검정을 사용하여, 에스. 아우레우스 단백질 A(이하 "단백질 A") 수지 상에 로딩된 Ig의 적어도 50%, 60%, 또는 70%가 결합하고, 수지 상에 보유되는 정도로)을 나타내는 Ab(예를 들어, scFv)가 제공된다. 목적하는 단백질 A 결합 특성을 부여하는 폴리펩타이드, 뿐만 아니라 이러한 단백질 A-결합 펩타이드를 함유하는 항체(예를 들어, scFv); 목적하는 단백질 A 결합 특성을 부여하는 VH CDR2 폴리펩타이드, 뿐만 아니라 이를 함유하는 항체(예를 들어, scFv); 목적하는 열안정성 특성을 제공하는 VH 및 VL 프레임워크 폴리펩타이드(컨센서스 프레임워크 서열), 뿐만 아니라 이러한 프레임워크 서열을 갖는 항체(예를 들어, scFv); 및 이러한 단백질-A 결합 펩타이드, VH CDR2 폴리펩타이드 및 열안정성 향상 프레임워크의 조합물을 갖는 Ab(예를 들어, scFv)가 제공된다. 또한, 개시된 Ab는 상업적인 규모의 리포솜 접합 및 다른 제조 공정, 뿐만 아니라 치료 용도에 바람직한 다른 특성을 나타낸다.
따라서, 상업적인 제조 및 의학적 용도를 위해서 설계 및 개작된 항-EphA2 항체, 뿐만 아니라 관련된 접합체, 조성물 및 이의 방법이 개시된다. 사용 방법은 리포솜 치료제, 뿐만 아니라 진단제를 위한 표적화 성분으로서 그리고 스크리닝 방법에서의 사용을 포함한다.
따라서, 본 개시내용은 항-A형 에프린 수용체 2(anti-Ephrin type-A)(EphA2) 항체를 제공하며, 이 항체는
하기를 포함하는 VH:
아미노산 서열 SYAMH(서열번호 17)를 포함하는 VH CDR1;
하기 17개 아미노산의 서열을 포함하는 VH CDR2:
X17ISPX18GX19NX20YYADSVKG(서열번호 18)(식 중,
X17은 A 또는 V이고;
X18은 A, D, H, N, P, S 또는 T이고;
X19는 A, R, H, N 또는 P이고;
X20은 K 또는 T임); 및
아미노산 서열 ASVGATGPFDI(서열번호 19)를 포함하는 VH CDR3; 및
하기를 포함하는 VL:
아미노산 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 20)를 포함하는 VL CDR1;
아미노산 서열 GENNRPS(서열번호 21)를 포함하는 VL CDR2; 및
아미노산 서열 NSRDSSGTHLTV(서열번호 22)를 포함하는 VL CDR3
을 포함하고;
여기서 항체는 EphA2의 세포외 도메인에 면역특이적으로 결합한다.
본 개시내용은 또한 단백질 A에 결합하는 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서 폴리펩타이드는 하기 식의 아미노산 서열을 포함한다:
a) Xa X17IS Xb X18GX19N X20(서열번호 198)(식 중,
Xa는 S, T 또는 A이고;
X17은 A 또는 V이고;
Xb는 P, R, N 또는 H이고,
X18 및 X19는 임의의 아미노산이고, 일부 실시형태에서 X18은 A, D, H, N, P, S 또는 T이고/이거나; 식 중, X19는 A, R, H, N 또는 P이고;
X20은 K 또는 T임);
b) Xa V I S Xb X18 G X19 N X20(서열번호 199)(식 중,
Xa는 S 또는 T이고,
Xb는 P, R 또는 N이고,
X18은 임의의 아미노산이고, 일부 실시형태에서는 A, D, H, N, P, S 또는 T이고;
X19는 H, N, R, T, A, D, P 또는 S이고;
X20은 K 또는 T임);
c) Xa V I S Xb X18 G X19 N X20 (서열번호 200)(식 중,
Xa는 S 또는 T이고,
Xb는 P, R 또는 N이고,
X18은 임의의 아미노산이고, 일부 실시형태에서는 A, D, H, N, P, S 또는 T이고;
X19는 H, N, R 또는 T이고;
X20은 T 또는 K임);
또는
d) Xa X17 I S Xb X18 G X19 N X20 (서열번호 201)(식 중,
Xa는 S 또는 T이고,
X17은 V이고;
Xb는 P이고,
X18은 임의의 아미노산이고, 일부 실시형태에서는 A, D, H, N, P, S 또는 T이고;
X19는 H, N, R 또는 T이고, 일부 실시형태에서는 A, R, H, N 또는 P이고;
X20은 T 또는 K임).
관련 실시형태에서, 단백질 A 결합 펩타이드는 서열번호 177 내지 197 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질 A 결합 펩타이드는 하기를 포함한다:
SYAMH(서열번호 17)의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
서열번호 177 내지 201 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 A 결합 서열; 및
ASVGATGPFDI(서열번호 19)의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3.
본 개시내용은 또한 VH 및 VL을 포함하는 항체를 제공하고, 여기서 VH는 상기에 기술된 바와 같은 단백질 A 결합 펩타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체는 하기 중 적어도 하나의 프레임워크 영역을 포함한다:
(a) 아미노산 서열 QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 1)(식 중, X1은 E가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VH 프레임워크 영역 1(VH FR1), 및/또는
(b) 아미노산 서열 WVRQAPGKGLEWVX2(서열번호 2)(식 중, X2는 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VH 프레임워크 영역 2(VH FR2); 또는 (여기서 항체는 서열번호 177 내지 201 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 A 결합 펩타이드를 포함함), 아미노산 서열 WVRQAPGKGLEWV(서열번호 202)를 포함하는 인간 VH 프레임워크 영역 2(VH FR2), 및/또는
(c) 아미노산 서열 X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(서열번호 3)(식 중, X3은 Q가 아닌 아미노산이고, X4는 V가 아닌 아미노산이고, X5는 G가 아닌 아미노산이고, X6은 R이 아닌 아미노산이고, X7은 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VL 프레임워크 영역 1(VL FR1), 및/또는
(d) 아미노산 서열 X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(서열번호 4)(식 중, X8은 Q가 아닌 아미노산이거나, 또는 X9는 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VL 프레임워크 영역 1(VL FR1), 및/또는
(e) 아미노산 서열 WYQQX10PGTAPKLLIY(서열번호 5)(식 중, X10은 L이 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VL 프레임워크 영역 2(VL FR2), 및/또는
(f) 아미노산 서열 GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(서열번호 6)(식 중, X11은 F가 아닌 아미노산이거나, X12는 K가 아닌 아미노산이거나, X13은 A가 아닌 아미노산이거나, 또는 X14는 L이 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VL 프레임워크 영역 3(VL FR3), 및/또는
(g) 아미노산 서열 GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(서열번호 7)(식 중, X15는 F가 아닌 아미노산이거나, X16은 K가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VL 프레임워크 영역 3(VL FR3).
특정 실시형태에서, 항체는 아미노산 서열 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 8)를 포함하는 VH FR1을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체는 아미노산 서열 WVRQAPGKGLEWVA(서열번호 9) 또는 WVRQAPGKGLEWVT(서열번호 10)를 포함하는 VH FR2를 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체는 아미노산 서열 X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(서열번호 3)를 포함하는 VL FR1을 포함하고, 식 중, X3은 Q가 아닌 아미노산이고, X4는 V가 아닌 아미노산이고, X5는 G가 아닌 아미노산이고, X6은 R이 아닌 아미노산이고, X7은 S가 아닌 아미노산이다. 특정 실시형태에서, 항체는 아미노산 서열 X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(서열번호 3)를 포함하는 VL FR1을 포함하고, 식 중, X3은 S이고, X4는 E이고, X5는 V이고, X6은 T이고, X7은 T이다. 특정 실시형태에서, 항체는 아미노산 서열 X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(서열번호 4)를 포함하는 VL FR1을 포함하고, 식 중, X8은 Q가 아닌 아미노산이고, X9는 S가 아닌 아미노산이다. 특정 실시형태에서, 항체는 아미노산 서열 X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(서열번호 4)를 포함하는 VL FR1을 포함하고, 식 중, X8은 S이거나 X9는 T이다. 특정 실시형태에서, 항체는 아미노산 서열 X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(서열번호 4)를 포함하는 VL FR1을 포함하고, 식 중, X8은 S이고, X9는 T이다. 특정 실시형태에서, 항체는 아미노산 서열 WYQQX10PGTAPKLLIY(서열번호 5)를 포함하는 VL FR2를 포함하고, 식 중, X10은 L이 아닌 아미노산이다. 특정 실시형태에서, 항체는 아미노산 서열 WYQQX10PGTAPKLLIY(서열번호 5)를 포함하는 VL FR2를 포함하고, 식 중, X10은 K이다. 특정 실시형태에서, 항체는 아미노산 서열 GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(서열번호 6)를 포함하는 VL FR3을 포함하고, 식 중, X11은 F가 아닌 아미노산이고, X12는 K가 아닌 아미노산이고, X13은 A가 아닌 아미노산이고, X14는 L이 아닌 아미노산이다. 특정 실시형태에서, 항체는 아미노산 서열 GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(서열번호 6)를 포함하는 VL FR3을 포함하고, 식 중, X11은 S이거나, X12는 S이거나, X13은 T이거나, X14는 A이다. 특정 실시형태에서, 항체는 아미노산 서열 GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(서열번호 7)를 포함하는 VL 프레임워크 영역 3(VL FR3)이고, 식 중, X15는 F가 아닌 아미노산이고, X16은 K가 아닌 아미노산이다. 특정 실시형태에서, 항체는 아미노산 서열 GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(서열번호 7)를 포함하는 VL FR3을 포함하고, 식 중, X15는 S이거나, X16은 G이다. 특정 실시형태에서, 항체는 아미노산 서열 GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(서열번호 7)를 포함하는 VL 프레임워크 영역 3(VL FR3)을 포함하고, 식 중, X15는 S이고, X16은 G이다.
특정 실시형태에서, 항체는 하기를 포함한다:
아미노산 서열 QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 1)(식 중, X1은 E가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VH 프레임워크 영역 1(VH FR1);
아미노산 서열 WVRQAPGKGLEWVX2(서열번호 2)(식 중, X2는 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 VH 프레임워크 영역 2(VH FR2);
아미노산 서열 X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(서열번호 3)(식 중, X3은 Q가 아닌 아미노산이고, X4는 V가 아닌 아미노산이고, X5는 G가 아닌 아미노산이고, X6은 R이 아닌 아미노산이고, X7은 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 VL 프레임워크 영역 1(VL FR1);
아미노산 서열 WYQQX10PGTAPKLLIY(서열번호 5)(식 중, X10은 L이 아닌 아미노산임)를 포함하는 VL 프레임워크 영역 2(VL FR2); 및
아미노산 서열 GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(서열번호 6)(식 중, X11은 F가 아닌 아미노산이고, X12는 K가 아닌 아미노산이고, X13은 A가 아닌 아미노산이고, X14는 L이 아닌 아미노산임)를 포함하는 VL 프레임워크 영역 3(VL FR3).
특정 실시형태에서, 항체는 하기를 포함한다:
아미노산 서열 QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 1)(식 중, X1은 E가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VH 프레임워크 영역 1(VH FR1);
아미노산 서열 WVRQAPGKGLEWVX2(서열번호 2)(식 중, X2는 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 VH 프레임워크 영역 2(VH FR2);
아미노산 서열 X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(서열번호 4)(식 중, X8은 Q가 아닌 아미노산이거나, 또는 X9는 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 VL 프레임워크 영역 1(VL FR1); 및
아미노산 서열 GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(서열번호 7)(식 중, X15는 F가 아닌 아미노산이고, X16은 K가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VL 프레임워크 영역 3(VL FR3).
특정 실시형태에서, 항체는 시차 주사 형광측정법(differential scanning fluorimetry)을 사용하여 측정되는 경우 67℃ 이상의 용융 온도(Tm)를 갖는다.
특정 실시형태에서, 항체는 단일 쇄 Fv(scFv), IgG, Fab, (Fab)2, 또는 (scFv')2이다. 특정 실시형태에서, 항체는 scFv이다. 특정 실시형태에서, 항체는 인간 항체 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체는 VH, VL 및 프레임워크를 포함하는 scFv이고, 여기서
VH는 하기를 포함하고:
아미노산 서열 SYAMH(서열번호 17)를 갖는 VH CDR1;
하기 18개의 아미노산 서열 중 하나를 갖는 VH CDR2:
(I) VISPAGNNTYYADSVK(서열번호 23),
(II) VISPAGRNKYYADSVK(서열번호 24),
(III) VISPDGHNTYYADSVK(서열번호 25),
(IV) VISPHGRNKYYADSVK(서열번호 26),
(V) VISRRGDNKYYADSVK(서열번호 27),
(VI) VISNNGHNKYYADSVK(서열번호 28),
(VII) VISPAGPNTYYADSVK(서열번호 29),
(VIII) VISPSGHNTYYADSVK(서열번호 30),
(IX) VISPNGHNTYYADSVK(서열번호 31),
(X) AISPPGHNTYYADSVK(서열번호 32),
(XI) VISPTGANTYYADSVK(서열번호 33),
(XII) VISPHGSNKYYADSVK(서열번호 34),
(XIII) VISNNGHNTYYADSVK(서열번호 35),
(XIV) VISPAGTNTYYADSVK(서열번호 36),
(XV) VISPPGHNTYYADSVK(서열번호 37),
(XVI) VISHDGTNTYYADSVK(서열번호 38),
(xvii) VISRHGNNKYYADSVK(서열번호 39), 또는
(xviii) VISYDGSNKYYADSVK(서열번호 40); 및
아미노산 서열 ASVGATGPFDI(서열번호 19)를 갖는 VH CDR3;
여기서 VH CDR은 다음 아미노에서 카복실 말단 순서: VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3으로 존재하고,
그리고
VL은 하기를 포함하고:
아미노산 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 20)를 갖는 VL CDR1;
아미노산 서열 GENNRPS(서열번호 21)를 갖는 VL CDR2, 및
아미노산 서열 NSRDSSGTHLTV(서열번호 22)을 갖는 VL CDR3;
여기서
VL CDR은 다음 아미노에서 카복실 말단 순서: VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3으로 존재하고;
scFv 프레임워크는 하기를 포함하고:
VH FR1 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 8)
VH FR2 WVRQAPGKGLEWVA(서열번호 9)
VH FR3 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(서열번호 11)
VH FR4 WGQGTLVTVSS(서열번호 12)
VL FR1 SSELTQPPSVSVAPGQTVTITC(서열번호 13)
VL FR2 WYQQKPGTAPKLLIY(서열번호 14)
VL FR3 GVPDRFSGSSSGTSASLTITGAQAEDEADYYC(서열번호 15)
및
VL FR4 FGGGTKLTVLG(서열번호 16),
그리고 여기서 항체는 A형 에프린 수용체 2(EphA2)의 세포외 도메인에 면역특이적으로 결합한다.
특정 실시형태에서, scFv VH는 VL에 대한 아미노 말단이다.
특정 실시형태에서, scFv는 적어도 약 67℃의 Tm을 나타낸다. 특정 실시형태에서, scFv는 적어도 약 70℃의 Tm을 나타낸다.
특정 실시형태에서, scFv는 VH와 VL을 결합하는 링커를 포함하고, 여기서 링커는 하기로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 41),
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 42),
GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 43),
ASTGGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (서열번호 44),
GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(서열번호 45),
TPSHNSHQVPSAGGPTANSGTSGS(서열번호 46), 및
GGSSRSSSSGGGGSGGGG(서열번호 47).
특정 실시형태에서, scFv 링커는 아미노산 서열 ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 41)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체는 VH 및 VL을 포함하고, 여기서 VH는 VH 및 VL의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VH는 서열번호 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173 또는 175의 아미노산 서열에 대해서 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 관련 실시형태에서, 이들 항체의 VL은 서열번호 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174 또는 176의 아미노산 서열에 대해서 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 항체는 C-말단에서, Gly Gly Ser Gly Gly Cys(서열번호 54)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체; 및 항체에 접합된 모이어티를 포함하는 항체 접합체를 제공한다. 특정 실시형태에서, 모이어티는 지질성 나노입자이다. 특정 실시형태에서, 지질성 나노입자는 리포솜이다. 특정 실시형태에서, 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 모이어티는 치료제를 포함한다. 특정 실시형태에서, 치료제는 세포독성제이다. 특정 실시형태에서, 모이어티는 검출 가능한 표지를 포함한다. 특정 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 생체내 영상화제이다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 항체 또는 접합체; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 비경구 투여를 위해서 제형화된다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 조성물을 용기 내에 포함하는 키트를 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 scFv를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 항체의 가변 경쇄 폴리펩타이드, 가변 중쇄 폴리펩타이드, 또는 둘 모두를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 핵산 및 핵산에 작동 가능하게 연결된 진핵생물 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 발현 벡터를 포함하는 비-인간 숙주 세포를 제공한다. 특정 실시형태에서, 세포는 가변 경쇄 폴리펩타이드, 가변 중쇄 폴리펩타이드 또는 둘 모두를 발현시킨다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 EphA2-발현 암을 갖는 대상체의 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 EphA2-발현 암을 갖는 대상체에게 본 개시내용의 항체, 항체 접합체, 또는 항체 및/또는 항체 접합체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 EphA2-발현 암의 치료에서 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 본 개시내용의 항체 및/또는 항체 접합체를 포함한다.
본 개시내용은 EphA2-발현 암의 치료에서의 조성물의 용도를 제공하며, 여기서 조성물은 본 개시내용의 항체 및/또는 항체 접합체를 포함한다.
도 3 및 4에서 번호 1 내지 22에 의해서 식별된 scFv는 서열 목록에서 scFv1 내지 scFv22로서 식별된 상응하는 아미노산 서열을 포함하고, 동일한 식별 방식이 scFv1 내지 scFv22의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 위해서 사용된다. 핵산 서열은 암호화된 scFv를 발현시키는 포유동물(예를 들어, 인간 또는 설치류) 세포에 의해서 절단되는 N-말단 리더 서열을 추가로 암호화한다. 도 1, 3 및 4에서 사용되는 경우, "F5"는 scFv F5를 나타낸다. "TS1"은 scFv TS1을 나타낸다. "TS1*"은 scFv TS1*(TS1*의 VL은 TS1의 VL과 동일하고, 이와 같이 도 1에 나타낸 것을 주목함)을 나타내고, "A7"은 scFv D2-1A7을 나타낸다.
도 1은 단백질 A 결합 검정(실시예 1 참조)의 결과를 나타낸 도면. scFv는 scFv F5, scFv TS1, scFv TS1*, 및 D2-1A7의 VH 및 VL 영역을 함께 연결함으로써 생성되었다. 도면에 나타낸 바와 같이, scFv F5, scFv TS1, scFv TS1* 및 D2-1A7과 함께, 이들 혼성체 scFv가 단백질 A 결합 검정을 사용하여서 스크리닝되었다. 바람직한 단백질 A 결합 특성을 나타내는 F5 scFv가 양성 대조군으로서 사용되었다. scFv D1-2A7은 음성 대조군으로서 사용되었다.
도 2, 패널 A 내지 D는 scFv TS1의 CDR-H2 변이체의 50,000개 초과의 별개의 클론을 함유하도록 설계된 일련의 scFv의 FACS 분류의 결과를 나타낸 도면. CDR-H2 변이체는 표적화된 돌연변이유발을 사용하여 생성되었다. 패널 A는 1 라운드의 FACS 후의 비염색된 효모를 나타낸다. 패널 B는 1라운드의 FACS 후 염색된 효모, 형광 표지된 단백질 A(x-축) 및 EphA2(y-축)에 대한 Ab를 나타낸다. 이어서 단리된 클론을 다시 분리하였다. 패널 C는 비염색된 효모를 나타내는 반면, 패널 D는 FLAG(상표명) 에피토프(x-축) 및 EphA2(y-축)에 대한 표지된 Ab로 염색된 효모를 나타낸다.
도 3은 EphA2의 단백질 A 결합 검정의 결과를 나타낸 도면. CDR-H2 변이체 scFv는 포유동물 일시적 시스템 중에서 가용성 단백질로서 표현되었고, 단백질 A 결합은 단백질 A 결합 검정을 사용하여 측정되었다. F5 scFv가 양성 대조군으로서 사용되었고, TS1이 음성 대조군으로서 사용되었다.
도 4, 패널 A 내지 C는 EphA2를 발현시키는 세포주에 대한 Ab의 결합 및 내재화에 관련된 데이터를 나타낸 도면. CLIA 검정을 사용하여 3개의 세포주에서 결합 및 내재화하는 능력에 대해서 항체를 평가하였다(실시예 5). ErbB2에 결합하는 (그리고 EphA2에 결합하지 않는) F5 scFv가 음성 대조군으로서 사용되었고, 모든 데이터를 scFv TS1의 결합 및 내재화에 정규화하였다.
도 5는 본 명세서에 기술된 scFv, scFv 링커, N-말단 펩타이드, C-말단 태그, 태그를 갖는 C-말단 링커, C-말단 시스테인-함유 서열, 및 EphA2의 예의 서열을 제공한 도면. scFv1 내지 scFv22의 아미노산 서열에서의 밑줄은 링커의 아미노산 서열(ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 41)을 나타내고, 여기서 밑줄친 서열에 대해서 N-말단인 아미노산 서열은 VH 아미노산 서열이고, 밑줄친 서열에 대해서 C-말단인 아미노산 서열은 VHL 아미노산 서열이다.
새롭고 유용한 항체(예를 들어, 단일 쇄 항체, 예를 들어, scFv)가 제공된다. 또한 항체를 포함하는 접합체, 조성물 및 키트가 제공된다. 예를 들어, 면역리포솜의 제조에서의 Ab의 사용 방법이 또한 제공된다.
정의
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항체"("Ab")는 면역특이적 항원 결합, 즉 CDR에 의해서 매개된 항원 결합을 나타내는 면역글로불린(예를 들어, 단일 쇄 항체, 예를 들어, 단일 쇄 가변 단편("scFv"))으로부터 수득되거나 또는 유래된 상보성 결정 영역("CDR")을 포함하는 면역글로불린("Ig"), 또는 항원-결합 Ig 단편 또는 다른 항원-결합 펩타이드이다. 자연 발생 Ab는 일반적으로 적어도 2개의 중쇄 및 적어도 2개의 경쇄 둘 모두를 포함하는 적어도 4개의 폴리펩타이드를 포함하지만, 단일(경) 쇄(예를 들어, 벤스 존스 단백질(Bence Jones protein))를 함유하거나 또는 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 함유하는 특정 포유동물 Ab가 공지되어 있다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류될 수 있고, 이것은 이번에는 자연 발생 인간 Ig 부류, 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다. 전형적인 IgG, IgD 또는 IgE 인간 Ab의 예는 두 쌍의 폴리펩타이드 쇄(각각의 쌍은 하나의 "경"쇄 및 하나의 "중"쇄를 가짐)로 구성된 테트라머의 구조 단위를 갖는 것이다.
"인간 항체"("인간 Ab")는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 임의의 특정 방법에 의해서 생산될 항체를 필요로 하지 않거나 또는 자연 발생 항체를 필요로 하지 않는다. 더욱이, "인간 항체"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 인간 항체의 아미노산 서열(예를 들어, CDR, 프레임워크)을 포함하는 것을 지칭하고, 여기서 CDR 및/또는 프레임워크는 자연에서 함께 발생하지 않는다(즉, 자연 발생하지 않는다).
"항-EphA2 Ab"는 EphA2, 예를 들어, EphA2의 ECD에 면역특이적으로 결합하는 Ab를 지칭한다. EphA2-특이적 Ab는 EphA2 단백질에 존재하지 않는 항원에 면역특이적으로 결합하지 않는다.
"CDR"은 상보성 결정 영역을 나타낸다.
"CLIA"는 킬레이팅된 리간드-유도된 내재화 검정을 나타낸다.
"DiI5"는 염료 1,1'-다이옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도다이카보사이아닌-5,5'-다이설폰산을 나타낸다.
"DOD-트라이-NTA"는 문헌[Huang, et al, "Facile Synthesis of Multivalent Nitrilotriacetic Acid (NTA) and NTA Conjugates for Analytical and Drug Delivery Applications", Bioconjugate Chemistry, 2006, vol. 17, p. 1692-1600]에 기술된 바와 같은 다이옥타데실아미노-트라이-NTA 화합물(화합물 12)을 나타낸다. NTA는 니트릴로트라이아세트산을 나타낸다.
"DSF"는 시차 주사 형광측정법을 나타낸다.
"DSPE"는 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민을 나타낸다.
"ECD"는 막관통 단백질의 세포외 도메인을 지칭한다.
"EphA2"는 "상피 세포 카이나제(ECK)"라고도 지칭되는, 에프린-A 리간드에 결합하고, 그것에 의해서 활성화될 수 있는 수용체 타이로신 카이나제인 막관통 단백질인 A형 에프린 수용체 2를 지칭한다. 용어 "EphA2"는 EphA2의 임의의 자연 발생 아이소폼을 지칭할 수 있다. 인간 EphA2의 아미노산 서열은 젠뱅크 수탁 번호(GenBank Accession No.) NP_004422.2로서 기록된다.
"에피토프"는 Ab가 면역특이적으로 결합하는 항원 상의 부위, 예를 들어 EphA2 ECD 상의 부위이다. "에피토프"는 인접 아미노산 또는 단백질을 형성하는 폴리펩타이드 쇄의 접힘(예를 들어, 3차 접힘)에 의해 나란히 놓이는 비인접 아미노산 둘 모두로부터 형성될 수 있다.
"Fab"는 가변 도메인 및 제1 불변 도메인을 비롯한 Ig의 항원 결합 단편(제조 방법에 무관)을 나타낸다.
"FACS"는 형광 활성화 세포 분류를 나타낸다.
"His6"은 헥사히스티딘 펩타이드를 나타낸다.
"HSPC"는 수소화 소이 포스파티딜콜린을 나타낸다.
"Ig"는 면역글로불린을 나타낸다. Ig 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이라고도 불리는 3개의 초가변 영역과 교번하는 복수의 "프레임워크" 영역(FR)으로 구성된다. 프레임워크 영역 및 CDR의 양은 공공 데이터에서 발견되는 서열에 대한 상동성을 기반으로 정의될 수 있다(예를 들어, 문헌["Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 4th ed. U.S. Dept. Health and Human Services, Public Health Services, Bethesda, MD (1987)] 참고). 본 명세서에서 사용된 모든 Ab 서열 넘버링은 코바트 등에 의해서 정의된 바와 같다.
"IgG"는 G 아이소타입의 면역글로불린을 나타낸다.
"단리된"은 그 실체가 자연 발생할 수 있거나 또는 그것이 제조 또는 합성될 수 있다는 점에서 상이한 환경에서 존재하는 관심 실체(예를 들어, 단백질, 예를 들어 Ab)를 지칭한다. "단리된" 실체는 그것이 제조된 세포 또는 반응 용기에서 그것에 동반된 성분의 전부 또는 일부로부터 분리된다. 대상체 Ab는 실질적으로 순수할 수 있다. "실질적으로 순수한"은 총 조성물의 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 99% 초과가 관심 실체(예를 들어, 본 명세서에 개시된 항-EphA2 Ab)인 조성물을 지칭할 수 있다.
"Mal-PEG-DSPE"는 말레이미도-PEG(2000)-DSPE(1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌 글리콜)-2000]를 나타낸다.
"MFI"는 중간 형광 강도를 나타낸다.
"NTA(Ni)"는 니켈-니트릴로트라이아세트산을 나타낸다.
"PBS"는 인산염 완충 식염수를 나타낸다.
"PEG"는 폴리에틸렌 글리콜을 나타낸다.
"PEG-DSPE"는 메톡시-PEG(2000)-다이스테아로일포스파티딜에탄올아민을 나타낸다.
"scFv"는 단일 폴리펩타이드 쇄로 구성된 단백질인 단일 쇄 Fv를 나타내는데, 여기서 VH와 VL은 전형적으로는 VH 및 VL CDR로 구성된 기능적 항원 결합 부위의 형성을 허용하는 링커 펩타이드를 통해서 서로에 공유 연결된다.
"SEC"는 크기 배제 크로마토그래피를 나타낸다.
"SM"은 스핑고마이엘린을 나타낸다.
"Tm"은 용융 온도를 나타낸다.
"TS1"은 하기에 개시된 바와 같은 scFv-TS1을 나타낸다.
"TS1*"은 하기에 개시된 바와 같은 scFv-TS1*을 나타낸다.
"VH"는 Ig 중쇄의 가변 영역을 나타내는데, 이것은 VH 폴리펩타이드라고도 지칭될 수 있다.
"VL"는 Ig 경쇄의 가변 영역을 나타내는데, 이것은 VL 폴리펩타이드라고도 지칭될 수 있다.
항체
본 개시내용에 의해서 Ab에 유용한 특성을 부여하는 프레임워크 서열 및 CDR 서열을 포함하는 항-EphA2 Ab가 제공된다. 예로 제시된 Ab가 scFv이지만, 본 명세서에 개시된 CDR 및 인간 프레임워크 서열은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM Ab에 용이하고 이롭게 혼입될 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 특성은 안정성(예를 들어, 열안정성, 예를 들어, 65℃ 초과, 67℃ 이상, 또는 적어도 약 70℃의 용융 온도), 30% 이상, 40% 이상, 또는 50% 이상의 단백질에 대한 결합 또는 둘 모두를 포함한다.
프레임워크 영역
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 scFv는 VH FR1, VH FR2, VH FR3, VL FR1, VL FR2 및 VL FR3의 하나 또는 임의의 조합물을 포함하고, 여기서,
VH FR1은 아미노산 서열 QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 1)(식 중, X1은 E가 아닌 아미노산이고, 특정 실시형태에서 X1은 Q임)을 포함하는 인간 VH FR1이고;
VH FR2는 아미노산 서열 WVRQAPGKGLEWVX2(서열번호 2)(식 중, X2는 S가 아닌 아미노산이고, 특정 실시형태에서 X2는 A임)를 포함하는 인간 VH FR2이고;
VL FR1은 아미노산 서열 X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(서열번호 3)(식 중, X3은 Q가 아닌 아미노산이고, X4는 V가 아닌 아미노산이고, X5는 G가 아닌 아미노산이고, X6은 R이 아닌 아미노산이고, X7은 S가 아닌 아미노산이고, 특정 실시형태에서 X4는 V이고, X5는 G이고, X6은 R임)를 포함하는 인간 VL FR1이고;
특정 실시형태에서, VL FR1은 아미노산 서열 X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(서열번호 4)(식 중, X8은 Q가 아닌 아미노산이고, 식 중, X9는 S가 아닌 아미노산이고, 특정 실시형태에서 X8은 S이고/이거나 X9는 T임)를 포함하는 인간 VL FR1이고;
VL FR2는 아미노산 서열 WYQQX10PGTAPKLLIY(서열번호 5)(식 중, X10은 L이 아닌 아미노산이고/이거나, 특정 실시형태에서 X10은 K임)를 포함하는 인간 VL FR2이고;
그리고
VL FR3은 아미노산 서열 GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(서열번호 6)(식 중, X11은 F가 아닌 아미노산이거나, X12는 K가 아닌 아미노산이거나, X13은 A가 아닌 아미노산이거나, X14는 L이 아닌 아미노산이고, 특정 실시형태에서 X11은 S이고/이거나, X12는 S이고/이거나, X13은 T이고/이거나, X14는 A임)를 포함하는 인간 VL FR3이고;
특정 실시형태에서 VL FR3은 아미노산 서열 GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(서열번호 7)(식 중, X15은 F가 아닌 아미노산이거나, X16은 K가 아닌 아미노산이고, 특정 실시형태에서 X15는 S이고/이거나 X16은 G임)를 포함하는 인간 VL FR3이다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 Ab는 표 1에 제시된 바와 같은 VH FR1, VH FR2, VH FR3, VL FR1, VL FR2 및 VL FR3의 하나 또는 임의의 조합물을 포함한다. 일 실시형태에서, Ab는 scFv이고, 표 1의 프레임워크 모두를 함유한다.
Figure pct00001
특정 양상에서, 본 명세서에 개시된 Ab(예를 들어, scFv)는 예를 들어, Ab가 강인하고, 규모 확대 가능한 제조에 양호하게 적합하도록, 열안정성이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "열안정성" Ab는 예를 들어, 시차 주사 형광측정법(DSF)을 사용하여 측정되는 경우 70℃ 이상의 용융 온도(Tm)를 갖는 Ab이다. 적합한 용융 온도를 갖는 예시적인 Ab는 하기 실험 부분에 기술된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 Ab는 예를 들어, 실시예 1에 기술된 검정을 사용하여 결정되는 경우, 30%, 40%, 또는 이롭게는 50% 이상의 단백질 A에 대한 결합을 나타낸다.
EphA2 결합
특히 관심이 있는 항체는 EphA2 폴리펩타이드의 세포외 도메인, 즉, 젠뱅크 수탁 번호 NP_004422.2 또는 유니프로트 수탁 번호(UniProt Accession No.) P29317에 제시된 서열의 적어도 아미노산 잔기 25 내지 534에 걸쳐 존재하는 EphA2 단백질의 부분에 결합하는 항-EphA2 Ab를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-EphA2항체(예를 들어, scFv)는 각각 표 2A에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함한다. 다른 실시형태에서 VH CDR2 서열(CDRH2라고도 지칭됨)은 표 2B에 제시된 18종의 상이한 VH CDR2 서열로부터 선택된 임의의 것일 것이다.
[표 2A]
Figure pct00002
표 2A 및 3에서 VH CDR2의 경우: X17은 A 또는 V이고; X18은 A, D, H, N, P, S 또는 T이고; X19는 A, R, H 또는 P이고; X20은 K 또는 T이다. 특정 실시형태에서: X17은 A이거나; X18은 H 또는 P이거나; X19는 R 또는 P이다. 특정 실시형태에서: X17은 V이고; X18은 H 또는 P이고; X19는 R 또는 N이고; X20은 K 또는 T이다. 특정 실시형태에서: X17은 V이고; X18은 H 또는 D이고; X19는 H 또는 N이고; X20은 T이다.
적합한 VH CDR2 서열의 18개의 특정 예가 표 2B에 제시되어 있다:
[표 2B]
Figure pct00003
본 개시내용에 의해서 제공된 scFv의 예는 도 5에 제공된다. 도 5는 scFv1 내지 scFv22의 아미노산 서열, 뿐만 아니라, 상응하는 암호화 핵산 서열을 제공한다. scFv2 내지 scFv22 각각의 아미노산 서열에서의 밑줄은 링커의 아미노산 서열(ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 41)을 나타낸다. scFv1 내지 scFv22의 밑줄친 아미노산 서열에 대해서 N-말단인 아미노산 서열은 scFv의 VH 폴리펩타이드의 아미노산 서열이다. scFv1 내지 scFv22의 밑줄친 아미노산 서열에 대해서 C-말단인 아미노산 서열은 scFv의 VL 폴리펩타이드의 아미노산 서열이다.
따라서, 본 개시내용은 VH 및 VL을 갖는 항체(scFv 포함)를 제공하고, 여기서 VH는 도 5에 제시된 바와 같은 scFv1 내지 scFv22 중 어느 하나의 VH와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 본 개시내용은 또한 VH 및 VL을 포함하는 항체(scFv 포함)를 제공하고, 여기서 VH는 도 5에 제시된 바와 같은 scFv1 내지 scFv22 중 어느 하나의 VH 및 VL의 VH 및 VL에 대해서 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 개시내용은 또한 VH 및 VL을 갖는 항체(예컨대, scFv)를 제공하고, 여기서 VH 및 VL 각각은 도 5의 scFv의 VH 및 VL의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 포함한다.
도 5의 scFv1 내지 scFv22의 VH 및 VL의 아미노산 서열은 하기와 같다: scFv1의 VH 및 VL(각각 서열번호 133 및 134), scFv2의 VH 및 VL(각각 서열번호 135 및 136), scFv3의 VH 및 VL(각각 서열번호 137 및 138), scFv4의 VH 및 VL(각각 서열번호 139 및 140), scFv5의 VH 및 VL(각각 서열번호 141 및 142), scFv6의 VH 및 VL(각각 서열번호 143 및 144), scFv7의 VH 및 VL(각각 서열번호 145 및 146), scFv8의 VH 및 VL(각각 서열번호 147 및 148), scFv9의 VH 및 VL(각각 서열번호 149 및 150), scFv10의 VH 및 VL(각각 서열번호 151 및 152), scFv11의 VH 및 VL(각각 서열번호 153 및 154), scFv12의 VH 및 VL(각각 서열번호 155 및 156), scFv13의 VH 및 VL(각각 서열번호 157 및 158), scFv14의 VH 및 VL(각각 서열번호 159 및 160), scFv15의 VH 및 VL(각각 서열번호 161 및 162), scFv16의 VH 및 VL(각각 서열번호 163 및 164), scFv17의 VH 및 VL(각각 서열번호 165 및 166), scFv18의 VH 및 VL(각각 서열번호 167 및 168), scFv19의 의 VH 및 VL(각각 서열번호 169 및 170), scFv20의 VH 및 VL(각각 서열번호 171 및 172), scFv21의 VH 및 VL(각각 서열번호 173 및 174), 또는 scFv22의 VH 및 VL(각각 서열번호 175 및 176).
본 개시내용은 또한 서열번호 60[scFv1], 서열번호 62[scFv2], 서열번호 64[scFv3] 서열번호66[scFv4], 서열번호 68[scFv5], 서열번호 70[scFv6], 서열번호 72[scFv7]. 서열번호 74[scFv8], 서열번호 76[scFv9], 서열번호 78[scFv10], 서열번호 80[scFv11], 서열번호 82[scFv12], 서열번호 84[scFv13], 서열번호 86[scFv14], 서열번호 88[scFv15], 서열번호 90[scFv16], 서열번호 92[scFv17], 서열번호 94[scFv18], 서열번호 96[scFv19], 서열번호 98[scFv20], 서열번호 100[scFv21], 또는 서열번호 102[scFv22]의 아미노산 서열에 대해서 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 scFv, 뿐만 아니라 이들을 암호화하는 핵산을 제공한다. 본 개시내용은 또한 서열번호 60[scFv1], 서열번호 62[scFv2], 서열번호 64[scFv3] 서열번호66[scFv4], 서열번호 68[scFv5], 서열번호 70[scFv6], 서열번호 72[scFv7]. 서열번호 74[scFv8], 서열번호 76[scFv9], 서열번호 78[scFv10], 서열번호 80[scFv11], 서열번호 82[scFv12], 서열번호 84[scFv13], 서열번호 86[scFv14], 서열번호 88[scFv15], 서열번호 90[scFv16], 서열번호 92[scFv17], 서열번호 94[scFv18], 서열번호 96[scFv19], 서열번호 98[scFv20], 서열번호 100[scFv21], 또는 서열번호 102[scFv22]의 아미노산 서열을 갖는 scFv, 뿐만 아니라 이들을 암호화하는 핵산을 제공한다.
본 개시내용은 또한 단백질 A에 결합하는 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서 폴리펩타이드는 항체(예를 들어, scFv) 내에 존재할 수 있고, 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Xa X17IS Xb X18GX19N X20(서열번호 198)
식 중,
Xa는 S, T 또는 A이고;
X17은 A 또는 V이고;
Xb는 P, R, N 또는 H이고,
X18 및 X19는 임의의 아미노산이고;
X20은 K 또는 T이다.
일 실시형태에서, 폴리펩타이드(이것은 항체(예를 들어, scFv) 내에 존재할 수 있음)는 서열번호 198의 아미노산 서열을 포함하고, 식 중, X18은 A, D, H, N, P, S 또는 T이고; X19는 A, R, H, N 또는 P이다.
일 실시형태에서, 이러한 폴리펩타이드는 N-말단으로부터 C-말단으로, 하기를 포함한다:
SYAMH(서열번호 17)의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
서열번호 198의 식의 단백질 A 결합 서열(식 중, X18은 임의의 아미노산이거나, 또는 A, D, H, N, P, S 또는 T이고; 식 중, X19는 임의의 아미노산이거나 또는 A, R, H, N 또는 P임); 및
ASVGATGPFDI(서열번호 19)의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3.
서열번호 198의 폴리펩타이드가 항체(예를 들어, scFv) 내에 존재하는 경우, 항체는 아미노산 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 20)를 포함하는 VL CDR1, 아미노산 서열 GENNRPS(서열번호 21)를 포함하는 VL CDR2 및 아미노산 서열 NSRDSSGTHLTV(서열번호 22)를 포함하는 VL CDR3을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서 폴리펩타이드가 항체(예를 들어, scFv)인 경우, 항체(예를 들어, scFv)는 VH FR1 및 VH FR2 중 하나 또는 둘 모두를 포함하고, 여기서 VH FR1은 QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 1)의 아미노산 서열을 포함하고, 식 중, X1은 E가 아닌 아미노산이고, 특정 실시형태에서 X1은 Q이고; VH FR2는 아미노산 서열 WVRQAPGKGLEWV(서열번호 202)을 포함한다. 이러한 항체(예를 들어, scFv)는 또한 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서 이러한 항체(예를 들어, scFv)는 표 1의 VH FR1, VH FR2, VH FR3, VL FR1, VL FR2, 및 VL FR3의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시내용은 단백질 A에 결합하는 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서 폴리펩타이드는 항체(예를 들어, scFv) 내에 존재할 수 있고, 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Xa V I S Xb X18 G X19 N X20(서열번호 199),
식 중,
Xa는 S 또는 T이고,
Xb는 P, R 또는 N이며,
X18은 임의의 아미노산이고;
X19는 H, N, R, T, A, D, P 또는 S이며;
X20은 K 또는 T이다.
일 실시형태에서, 폴리펩타이드(이것은 항체(예를 들어, scFv) 내에 존재할 수 있음)는 서열번호 199의 아미노산 서열을 포함하고, 식 중, X18은 A, D, H, N, P, S 또는 T이다.
일 실시형태에서, 폴리펩타이드(이것은 항체(예를 들어, scFv) 내에 존재할 수 있음)는 서열번호 199의 아미노산 서열을 포함하고, 식 중, X18은 A, D, H, N, P, S 또는 T이고; X19는 A, R, H, N 또는 P이다.
일 실시형태에서, 이러한 폴리펩타이드는 N-말단으로부터 C-말단으로, 하기를 포함한다:
SYAMH(서열번호 17)의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
서열번호 199의 식의 단백질 A 결합 서열(식 중, X18은 임의의 아미노산이거나, 또는 A, D, H, N, P, S 또는 T이고; 식 중, X19는 임의의 아미노산이거나 또는 A, R, H, N 또는 P임); 및
ASVGATGPFDI(서열번호 19)의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3.
서열번호 199의 폴리펩타이드가 항체(예를 들어, scFv) 내에 존재하는 경우, 항체는 아미노산 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 20)을 포함하는 VL CDR1, 아미노산 서열 GENNRPS(서열번호 21)를 포함하는 VL CDR2 및 아미노산 서열 NSRDSSGTHLTV(서열번호 22)를 포함하는 VL CDR3을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서 폴리펩타이드가 항체(예를 들어, scFv)인 경우, 항체(예를 들어, scFv)는 VH FR1 및 VH FR2 중 하나 또는 둘 모두를 포함하고, 여기서 VH FR1은 QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 1)의 아미노산 서열을 포함하고, 식 중, X1은 E가 아닌 아미노산이고, 특정 실시형태에서 X1은 Q이고; VH FR2는 아미노산 서열 WVRQAPGKGLEWV(서열번호 202)을 포함한다. 이러한 항체(예를 들어, scFv)는 또한 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서 이러한 항체(예를 들어, scFv)는 표 1의 VH FR1, VH FR2, VH FR3, VL FR1, VL FR2, 및 VL FR3의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시내용은 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서 폴리펩타이드는 단백질 A에 결합하는 항체(예를 들어, scFv) 내에 존재할 수 있고, 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Xa V I S Xb X18 G X19 N X20 (서열번호 200)
식 중,
Xa는 S 또는 T이고,
Xb는 P, R 또는 N이며,
X18은 임의의 아미노산이고;
X19는 H, N, R 또는 T이고;
X20은 T 또는 K이다.
일 실시형태에서, 폴리펩타이드(이것은 항체(예를 들어, scFv) 내에 존재할 수 있음)는 서열번호 200의 아미노산 서열을 포함하고, 식 중, X18은 A, D, H, N, P, S 또는 T이다. 일 실시형태에서, 폴리펩타이드(이것은 항체(예를 들어, scFv) 내에 존재할 수 있음)는 서열번호 200의 아미노산 서열을 포함하고, 식 중, X18은 A, D, H, N, P, S 또는 T이고; X19는 A, R, H, N 또는 P이다.
일 실시형태에서, 이러한 폴리펩타이드는 N-말단으로부터 C-말단으로, 하기를 포함한다:
SYAMH(서열번호 17)의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
서열번호 200의 식의 단백질 A 결합 서열(식 중, X18은 임의의 아미노산이거나, 또는 A, D, H, N, P, S 또는 T이고; 식 중, X19는 임의의 아미노산이거나 또는 A, R, H, N 또는 P임); 및
ASVGATGPFDI(서열번호 19)의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3.
서열번호 200의 폴리펩타이드가 항체(예를 들어, scFv) 내에 존재하는 경우, 항체는 아미노산 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 20)을 포함하는 VL CDR1, 아미노산 서열 GENNRPS(서열번호 21)를 포함하는 VL CDR2 및 아미노산 서열 NSRDSSGTHLTV(서열번호 22)를 포함하는 VL CDR3을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서 폴리펩타이드가 항체(예를 들어, scFv)인 경우, 항체(예를 들어, scFv)는 VH FR1 및 VH FR2 중 하나 또는 둘 모두를 포함하고, 여기서 VH FR1은 QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 1)의 아미노산 서열을 포함하고, 식 중, X1은 E가 아닌 아미노산이고, 특정 실시형태에서 X1은 Q이고; VH FR2는 아미노산 서열 WVRQAPGKGLEWV(서열번호 202)을 포함한다. 이러한 항체(예를 들어, scFv)는 또한 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서 이러한 항체(예를 들어, scFv)는 표 1의 VH FR1, VH FR2, VH FR3, VL FR1, VL FR2, 및 VL FR3의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시내용은 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서 폴리펩타이드는 단백질 A에 결합하는 항체(예를 들어, scFv) 내에 존재할 수 있고, 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Xa X17 I S Xb X18 G X19 N X20 (서열번호 201),
식 중,
Xa는 S 또는 T이고,
X17은 V이고;
Xb는 P이고,
X18은 임의의 아미노산이고;
X19는 H, N, R 또는 T이고;
X20은 T 또는 K이다.
일 실시형태에서, 폴리펩타이드(이것은 항체(예를 들어, scFv) 내에 존재할 수 있음)는 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함하고, 식 중, X18은 A, D, H, N, P, S 또는 T이다.
일 실시형태에서, 폴리펩타이드(이것은 항체(예를 들어, scFv) 내에 존재할 수 있음)는 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함하고, 식 중, X18은 A, D, H, N, P, S 또는 T이고; X19는 A, R, H, N 또는 P이다.
일 실시형태에서, 이러한 폴리펩타이드는 N-말단으로부터 C-말단으로, 하기를 포함한다:
SYAMH(서열번호 17)의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
서열번호 201의 식의 단백질 A 결합 서열(식 중, X18은 임의의 아미노산이거나, 또는 A, D, H, N, P, S 또는 T이고; 식 중, X19는 임의의 아미노산이거나 또는 A, R, H, N 또는 P임); 및
ASVGATGPFDI(서열번호 19)의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3.
서열번호 201의 폴리펩타이드가 항체(예를 들어, scFv) 내에 존재하는 경우, 항체는 아미노산 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 20)를 포함하는 VL CDR1, 아미노산 서열 GENNRPS(서열번호 21)를 포함하는 VL CDR2 및 아미노산 서열 NSRDSSGTHLTV(서열번호 22)를 포함하는 VL CDR3을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서 폴리펩타이드가 항체(예를 들어, scFv)인 경우, 항체(예를 들어, scFv)는 VH FR1 및 VH FR2 중 하나 또는 둘 모두를 포함하고, 여기서 VH FR1은 QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 1)의 아미노산 서열을 포함하고, 식 중, X1은 E가 아닌 아미노산이고, 특정 실시형태에서 X1은 Q이고; VH FR2는 아미노산 서열 WVRQAPGKGLEWV(서열번호 202)을 포함한다. 이러한 항체(예를 들어, scFv)는 또한 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서 이러한 항체(예를 들어, scFv)는 표 1의 VH FR1, VH FR2, VH FR3, VL FR1, VL FR2, 및 VL FR3의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다.
추가 실시형태에서, 본 개시내용은 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서 폴리펩타이드는 단백질 A에 결합하는 항체(예를 들어, scFv) 내에 존재할 수 있고, 도 5에 제시된 바와 같은 서열번호 177 내지 197로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 폴리펩타이드(폴리펩타이드는 항체(예를 들어, scFv) 내에 존재할 수 있음)는 서열번호 177 내지 197 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 이러한 폴리펩타이드는 N-말단으로부터 C-말단으로, 하기를 포함한다:
SYAMH(서열번호 17)의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
서열번호 177 내지 197 중 하나의 단백질 A 결합 서열; 및
ASVGATGPFDI(서열번호 19)의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3.
서열번호 177 내지 197의 폴리펩타이드가 항체(예를 들어, scFv) 내에 존재하는 경우, 항체는 아미노산 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 20)을 포함하는 VL CDR1, 아미노산 서열 GENNRPS(서열번호 21)를 포함하는 VL CDR2 및 아미노산 서열 NSRDSSGTHLTV(서열번호 22)를 포함하는 VL CDR3을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서 폴리펩타이드가 항체(예를 들어, scFv)인 경우, 항체(예를 들어, scFv)는 VH FR1 및 VH FR2 중 하나 또는 둘 모두를 포함하고, 여기서 VH FR1은 QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 1)의 아미노산 서열을 포함하고, 식 중, X1은 E가 아닌 아미노산이고, 특정 실시형태에서 X1은 Q이고; VH FR2는 아미노산 서열 WVRQAPGKGLEWV(서열번호 202)을 포함한다. 이러한 항체(예를 들어, scFv)는 또한 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR2, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL FR3 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서 이러한 항체(예를 들어, scFv)는 표 1의 VH FR1, VH FR2, VH FR3, VL FR1, VL FR2, 및 VL FR3의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 Ab는 내재화 항-EphA2 Ab이다. 적절한 환경 하에서 살아있는 세포의 외부 표면 상에 존재하는 EphA2 분자의 ECD에 대한 이러한 Ab의 결합은 Ab의 내재화를 초래하는데, 이는 세포의 세포-막-결합된 내부로의 Ab의 수송을 특징으로 한다. 내재화 Ab는 예를 들어, 치료 응용을 위한, 예를 들어 약물, 독소, 효소, 나노입자(예를 들어, 리포솜), DNA 등의 표적화된 전달을 위한 비히클로서의 용도가 발견된다.
본 명세서에 기술된 특정 Ab는 단일 쇄 Fv Ab, 예를 들어, scFv 또는 (scFv')2s이다. 이러한 Ab에서, VH 및 VL 폴리펩타이드는 직접 또는 아미노산 링커를 통해서 두 배향 중 하나로(즉, VL에 대해서 N-말단인 VH와 함께, 또는 VH에 대해서 N-말단인 VL과 함께) 서로에 결합된다. 이러한 링커는 예를 들어, 1 내지 50, 5 내지 40, 10 내지 30, 또는 15 내지 25개의 아미노산 길이로 존재할 수 있다. 특정 실시형태에서, 아미노산 링커의 잔기의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 100%는 세린(S) 및/또는 글리신(G)이다. 적합한 scFv 링커의 예는 하기 서열이거나 이를 포함할 수 있다:
ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 41),
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 42),
GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 43),
ASTGGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (서열번호 44),
GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(서열번호 45),
TPSHNSHQVPSAGGPTANSGTSGS(서열번호 46), 또는
GGSSRSSSSGGGGSGGGG(서열번호 47).
내재화 항-EphA2 Ab의 예는 scFv TS1을 포함한다:
Figure pct00004
상기 TS1에서, CDR은 밑줄 표시되어 있고, 하기 순서로 존재한다: VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3. 따라서, scFv TS1에서, 그리고 본 명세서에 개시된 특정 다른 scFv에서, scFv의 VH는 scFv의 아미노 말단에 존재하고, 링커(여기서 이탤릭체)에 의해서 VL에 연결된다.
scFv TS1의 변이체가 또한 제공되고, 여기서 모든 프레임워크 영역 및 TS1의 CDR은 VH CDR2(이것은 표 2B에서 상기에 제시된 18개의 상이한 CDRH2 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 CDR로 대체됨)를 제외하고는 변화되지 않는다.
Ab 생산 방법
본 명세서에 제공된 정보를 사용하여, 본 명세서에 개시된 Ab는 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 아미노산 서열을 사용하여 Ab를 암호화하는 적절한 핵산 서열을 결정하고, 이어서 이를 사용하여 Ab 중 하나 이상의 발현시킬 수 있다. 핵산 서열(들)을 최적화하여 표준 방법에 따라서 다양한 발현 시스템에 대한 특정 코돈 "선호"를 반영할 수 있다.
본 명세서에 제공된 서열 정보를 사용하여, 핵산은 다수의 표준 방법에 따라서 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 합성은 예를 들어, 고체상 포스포아미다이트 트라이에스터 방법을 사용하여 수동으로 합성되거나 또는 상업적으로 입수 가능한 고체 상 올리고뉴클레오타이드 합성 장치 상에서 편리하게 수행된다. 본 명세서에 개시된 Ab를 암호화하는 핵산은 합성된 후, 그것은 표준 방법에 따라서 증폭 및/또는 클로닝될 수 있다.
본 명세서에 개시된 Ab를 암호화하는 자연 또는 합성 핵산의 발현은 Ab를 암호화하는 핵산을 프로모터(이것은 구성적 또는 유도성일 수 있음)에 작동 가능하게 연결하고, 작제물을 발현 벡터 내에 혼입하여 재조합 발현 벡터를 생성함으로써 달성될 수 있다. 벡터는 원핵생물, 진핵생물 또는 둘 모두에서 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 Ab를 암호화하는 핵산의 발현의 조절에 유용한 기능적으로 적절하게 배향된 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열 및 프로모터를 함유한다. 벡터는 적어도 하나의 독립적인 종결인자 서열, 예를 들어 셔틀 벡터에서 발견되는 바와 같은, 진핵생물 및 원핵생물 둘 모두에서의 카세트의 복제를 허용하는 서열 및 원핵생물계 및 진핵생물계 둘 모두를 위한 선택 마커를 함유하는 제너릭(generic) 발현 카세트를 임의로 함유한다.
클로닝된 핵산의 높은 수준의 발현을 얻기 위해서, 전사를 안내하기 위한 강한 프로모터, 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전사/번역 종결인자(각각 서로에 대해서 그리고 단백질-암호화 서열에 대해서 기능성 배향으로)를 함유하는 발현 플라스미드를 작제하는 것이 일반적이다. Ab 유전자(들)는 또한 Ab(예를 들어, scFv)의 C-말단 단부 또는 N-말단 단부에서, 태그 서열, 예를 들어, FLAG(상표명) 또는 His6의 부가를 허용하는 발현 벡터 내로 서브클로닝되어 식별, 정제 및 조정을 가능하게 할 수 있다. Ab를 암호화하는 핵산이 단리 및 클로닝된 후, 그것은 다양한 재조합 방식으로 조작된 세포에서 핵산을 발현시킬 수 있다. 이러한 세포의 예는 박테리아, 효모, 곰팡이, 곤충 및 포유동물 세포를 포함한다.
본 명세서에 개시된 Ab의 단리 및 정제는 Ab를 분비하는 세포로부터의 배양물 상청액으로부터 단리한 후 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제함으로써 성취될 수 있거나, 또는 구성적으로 그리고/또는 유도 시에 단백질을 발현시키도록 유전자 변형된 세포의 용해물로부터, 또는 예를 들어, 친화도 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G를 사용)에 의해서, 정제와 함께, 합성 반응 혼합물로부터 단리될 수 있다. 단리된 Ab는 투석 및 단백질 정제에서 일반적으로 사용되는 다른 것에 의해서 추가로 정제될 수 있다.
본 개시내용은 또한 대상 Ab를 생산하는 세포를 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 Ab, 또는 이의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산으로 유전자 변형된 재조합 숙주 세포를 제공한다. DNA는 예를 들어, 박테리아(예를 들어, 박테리오파지, 효모(예를 들어, 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 피치아(Pichia)), 곤충류(예를 들어, 바쿨로바이러스) 또는 포유동물 발현계 내에서 클로닝된다. 적합한 한 기술은 필라멘트성 박테리오파지 벡터계를 사용한다(예를 들어, 미국 특허 제5,885,793호; 제US 5,969,108호; 및 제US　6,512,097호 참조).
Ab 변형
본 개시내용은 목적하는 특징으로 제공하도록, 예를 들어 대상체에서 조직 및/또는 세포의 특이적 유형으로(예를 들어, 종양으로)의 전달을 용이하게 하도록, 혈청 반감기를 증가시키도록, 항암 활성도를 추가하도록, 그 밖의 것을 가능하게 하도록 변형된 Ab(및 Ab를 암호화하는 핵산)를 포함한다. 본 명세서에 개시된 Ab는 변형되거나 변형되지 않고 제공될 수 있고, 인간 Ab로서 예시되지만, 인간화된 Ab 또는 키메라 Ab로서 쉽게 변형 및 제조될 수 있다. Ab(예를 들어, scFv)를 변형시키는 한 방식은 Ab를 구성하는 폴리펩타이드 쇄의 N- 및/또는 C-말단에서 또는 Ab의 임의의 아미노산(내부 아미노산 포함)에 하나 이상의 추가 요소를 접합(예를 들어, 연결)하는 것이다. 이러한 추가 요소는 예를 들어, 리포솜, 또 다른 단백질, 검출 가능한 표지(예를 들어, 예를 들어, 방사성 동위원소, 검출 가능한 산물을 생성하는 효소, 형광 단백질, 발색 단백질, 염료, 형광 방출 금속, 화학발광 화합물 등), 약물 및/또는 담체 분자를 포함한다. 임의로 이러한 접합은 Ab를 추가 요소(들)에 연결하는 링커 모이어티를 통해서이다.
하나 이상의 추가적인 요소로 변형된 본 명세서에 개시된 Ab는, 하나 이상의 추가적인 특징을 부여하기 위한 하나 이상의 추가적인 요소의 특성을 이용하면서 이의 결합 특이성을 보유한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 Ab는 치료 모이어티, 예컨대, 지질성 나노입자(예를 들어, 리포솜, 고체 지질성 나노입자, 또는 마이셀)의 외부 또는 화학치료제, 예컨대, 메이탄시노이드(maytansinoid)(예를 들어, DM1, 아도-트라스투주맙 엠탄신의 화학치료 모이어티) 또는 아우리스타틴(예를 들어, 모노메틸 아우리스타틴 E, 브렌툭시맙 베도틴의 화학치료 모이어티)에 대한 부착에 의해서 제형화된다. 지질성 마이크로입자에 부착되는 경우, Ab는 지질성 막 내로의 삽입에 적합한 지질에 접합된 중합체(예를 들어, 중합체의 말단)에 공유 접합될 수 있다. Ab-접합된 리포솜을 본 명세서에서 "면역리포솜(들)"이라 칭한다. 본 명세서에 개시된 Ab는 면역리포솜 표적화 성분으로서 작용할 수 있어서, 면역리포솜이 암 세포의 표면 상에서 EphA2에 특이적으로 결합하는 것을 가능하게 한다. 항암제, 예컨대, 소분자(예를 들어, 화학치료제), 또는 핵산(예를 들어, siRNA) 중 하나를 함유하도록 면역리포솜이 적재될 수 있다. 지질성 나노입자, 예컨대, 리포솜 및 면역리포솜의 제조 및 적재 방법은 예를 들어, 미국 특허 제US 2010/0068255호, 제US 2010/0008978호, 제US 2009/0171077호, 제US 2009/0155272호, 제US 2007/0116753호, 제US 2007/0110798호, 제US 2007/0031484호, 제US 2006/0147513호, 제US 2005/0112065호, 제US 2004/0037874호, 제US 2004/0209366호, 제US 2003/0003143호, 제US 7,135,177, US 7,022,336호, 제US 6,803,053호, 제US 6,528,087호, 제US 6,214,388호, 제US 6,210,707호, 제US 6,110,491호, 제US 5,980,935호, 제US 5,380,531호, 제US 7,507,407호, 제US 7,479,276호, 제US 7,462,603호에 기술되어 있다.
Ab에 접착되는 상기 요소 중 임의의 것은 링커, 예를 들어 가요성 링커, 예를 들어 펩타이드 링커 또는 폴리에틸렌 글리콜 링커를 통해서 Ab에 연결될 수 있다. 존재하는 경우, 링커 분자는 일반적으로 예를 들어, 지질성 나노입자의 표면에 결합하는 경우, Ab 및 연결된 모이어티가 Ab의 일부 가용성 이동을 허용하는 것을 가능하게 하기에 충분한 길이이다.
조성물
또한 본 개시내용에는 조성물, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 Ab 또는 접합체 중 임의의 것 또는 상기에 개시된 Ab 중 임의의 것을 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 양상에서, 조성물은 대상체(예를 들어, 인간)에서 암을 치료하는 데 있어서의 용도가 발견되며, 질환의 임의의 병기 동안 치료에 적합할 수 있다. 1개, 2개 또는 그 초과의 상이한 Ab를 함유하는 조성물이 약제학적 조성물로서 제공되고, 이를 필요로 하는 포유류(예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있다.
상기에 기술된 바와 같이, 리포솜은 본 명세서에 개시된 Ab와 상이한 하나 이상의 Ab를 함유할 수 있다. 리포솜은, 리포솜이 부착된 복수의 상이한 Ab를 갖고, 본 명세서에 개시된 Ab에 의해서 결합된 EphA2 에피토프에 더하여 적어도 하나의 추가적인 에피토프 또는 항원에 대해서 특이적이라는 점에서, 이중-특이적, 다중특이적 등일 수 있다.
조합물이 단일 제형으로 제공될 수 있거나 개별 제형으로서, 예를 들어 개별 용기에 제공될 수 있는데, 이것은 그 다음 키트로서 더 큰 용기에 포함될 수 있고, 여기서 개별 제형은 예를 들어, 단일 Ab 또는 복수의 상이한 Ab를 함유할 수 있다. 이러한 개별 제형은 투여 전에 조합되거나 개별 주사에 의해서 투여될 수 있다.
본 명세서에 개시된 Ab 또는 면역리포솜은 약제학적으로 허용 가능한 담체 중에 제형화될 수 있고, 예를 들어 기술된 방법에서 사용하기 위해서 비경구 투여를 위해서 제형화될 수 있다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, Ab가 액체 주사제로서 투여되는 경우(예를 들어, 정맥내 주사에 적합한 경우), Ab 제형은 염(예를 들어, 긴장성을 조정하기 위해서) 완충제, 보존제, 아미노산, 및 다른 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제 중 하나 이상 또는 전부를 포함하는 멸균성의 비-발열성 수성 용액일 수 있고, 예를 들어, 즉시 사용 투여형으로서 또는 재구성 가능한 저장 안정성 분말 또는 액체로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제US 20090208422호에 기술된 바와 같이 전달 강화 전달(convection enhanced delivery)을 통한 투여를 위한 제형이 존재할 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 치료 유효량의 대상체 항체, 뿐만 아니라 필요에 따라서, 임의의 다른 사용성 성분을 포함할 수 있다. "치료 유효량"은 단일 용량으로, 일련의 동일하거나 또는 상이한 항체 또는 조성물의 부분으로서의 개인에 대한 그러한 양의 투여가 대상체에서 암성 세포의 증식 및/또는 전이를 감소시키거나 또는 다른 검출 가능한 치료 이익을 제공하기에 유효함을 의미한다. 항체의 이러한 치료 유효량 및 세포 성장에 대한 이의 영향은 하나 이상의 다른 요법(예를 들어, 면역요법, 화학요법, 방사선 요법 등)과 함께 세포 성장의 협동적 및/또는 상승작용적 저해를 포함한다. 하기에 언급된 바와 같이, 치료 유효량은 투여 치료요법 및 대상체의 병태의 진단 분석(예를 들어, EphA2에 대해서 특이적인 항체를 사용하여 세포 표면 에피토프의 존재 또는 부재에 대한 모니터링) 등과 관련하여 조정될 수 있다.
양 및 투여량
실제 용량은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 확인될 수 있다. 투여량은 사용되는 특정 화합물의 농도, 대상체의 병태, 및 대상체의 체중, 뿐만 아니라 병의 중증도 및 질환의 병기를 비롯한 다양한 인자에 좌우될 수 있다. 투여량은 특정 화합물의 투여와 동반될 수 있는 임의의 부정적인 부작용의 존재, 본성 및 정도에 의해서 결정될 것이다. 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 연령, 체중, 성별, 영양 상태, 투여 시기, 약물 상호작용 및 병태의 중증도를 기반으로 하는 조정이 필수적일 수 있고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 일상적인 실험으로 확인될 수 있을 것이다. 치료 유효량은 또한 치료 이익 효과가 항체의 임의의 독성 또는 유해한 효과보다 큰 것이다.
본 개시 내용의 문맥에서 대상체, 예를 들어 인간에게 투여되는 조성물의 양은 타당한 시간 프레임에 걸쳐서 동물에서 예방적 또는 치료 반응을 달성하기에 충분해야 하고, 투여 목적, 치료될 개인의 건강 및 물리적 상태, 연령, 목적하는 해결 정도, 항체 조성물의 제형, 의학적 상황의 의사의 평가 및 다른 관련된 인자에 따라서 달라진다. 다라서, 그 양은 비교적 넓은 범위를 포함할 것이 지만, 그럼에도 불구하고 상기에 언급된 바와 같이 대상체의 다양한 특징을 통해서 일상적으로 결정될 수 있다고 예견된다.
예로서, 대상 항체의 치료적 또는 예방적 유효량에 대한 비제한적인 범위는 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 20㎎/㎏, 예를 들어, 약 1㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏이다.
약제학적 제형 중의 항체의 농도는 중량 기준으로 약 0.1% 미만, 통상적으로 적어도 약 2% 내지 20% 내지 50% 이상만큼 달라질 수 있고, 선택된 특정 투여 모드 및 환자의 요구에 따라서, 주로 유체 부피, 점도 등을 고려하여 선택될 것이다.
또한, 적합한 용량 및 투여 치료요법은 목적하는 성장 저해 또는 면역억제 반응에 영향을 준다고 공지된 항암제 또는 면역억제제와의 비교에 의해서 결정될 수 있다. 이러한 투여량은 유의한 부작용 없이, 세포 성장의 저용량 저해를 유발하는 투여량을 포함한다. 적절한 용량에서 그리고 특정 화합물의 적절한 투여를 사용하여, 본 개시내용의 화합물은 예를 들어, 세포 성장의 부분적인 저해로부터 본질적으로 완전한 저해까지의 광범위한 세포내 효과를 제공할 수 있다. 투여량 치료는 단일 용량 스케줄 또는 다수 용량 스케줄(예를 들어, 증가 및 유지 용량)일 수 있다. 하기에 제시된 바와 같이, 대상 조성물은 다른 작용제와 함께 투여될 수 있고, 따라서 용량 및 치료요법은 이러한 맥락에서뿐만 아니라 대상체의 요구와 일치하게 달라질 수 있다.
조합 요법
임의의 광범위한 암 요법이 본 개시내용의 항체를 갖는 조성물 중에서 조합될 수 있다. 예를 들어, 화학요법 치료 또는 생물학적 반응 변형제 치료에서 사용되는 작용제가 항체, 예컨대, 면역리포솜을 포함하는 약제학적 조성물 중에 존재할 수 있다.
화학치료제는 암 세포의 증식을 감소시키고, 세포독성제 및 세포증식억제제를 포함하는 비-단백질성 화합물이다. 화학치료제의 비제한적인 예는 알킬화제, 나이트로소우레아, 항대사제, 항종양제, 항생제, 식물(예를 들어, 빈카) 알칼로이드, 핵산, 예컨대, 저해성 핵산(예를 들어, siRNA), 및 스테로이드 호르몬을 포함한다.
항대사제는 예를 들어, 엽산 유사체, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 아데노신 데아미나제 저해제를 포함한다.
적합한 자연 산물 및 이의 유도체(예를 들어, 빈카 알칼로이드, 항종양제, 항생제, 효소, 림포카인 및 에피포도필로톡신)이 항암제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 탁산, 예컨대, 파클리탁셀, 뿐만 아니라 임의의 활성 탁산 유도체, 예컨대, 도세탁셀, 또는 탁산 전구-약물 예컨대 2'-(2-(N,N'-다이에틸아미노)프로피온일)-파클리탁셀, 7-(2-(N,N'-다이에틸아미노)프로피온일)-파클리탁셀, 2'-(2-(N,N'-다이에틸아미노)프로피온일)-도세탁셀 또는 7-(2-(N,N'-다이에틸아미노)프로피온일)-도세탁셀이 적합하다.
다른 항-증식성 세포독성제는 나벨벤, CPT-11(이리노테칸), 아나스트라졸, 레트라졸, 카페시타빈, 렐록사핀, 사이클로포스파미드, 이포사미드, 및 드롤록사핀이다. 항증식성 활성을 갖는 미소관 영향제가 또한 사용에 적합하다. 호르몬 조절제 및 스테로이드(합성 유사체 포함)가 사용에 적합하다.
방법
치료 방법
본 개시내용의 항체는 다양한 암에서의 치료 용도가 발견된다. 암을 갖거나, 갖는 것으로 예상되거나, 암의 발달 위험이 있는 대상체가 본 명세서에 기술된 요법 및 진단을 위해서 고려된다.
"치료"는 숙주에게 영향을 주는 병태와 연관된 증상의 적어도 개선이 달성된다는 것을 의미하고, 여기서 개선은 넓은 의미에서 치료될 병태와 연관된 파라미터, 예를 들면, 증상의 크기에서의 적어도 감소를 지칭하는 데 사용된다. 이와 같이, 치료는 또한 숙주가 병태, 또는 적어도, 이러한 병태를 특징으로 하는 증상을 더 이상 겪지 않도록 병리학적 상태, 또는 적어도, 이와 연관된 증상이 완전하게 저해되거나, 예를 들어, 발생이 예방되거나, 또는 중단되는, 예를 들어, 종결되는 상황을 포함한다. 따라서 치료는 (i) 예방, 즉, 임상 증상이 발생하지 않도록 유도, 예를 들어, 유해한 상태까지의 질환 진행의 예방을 비롯한 임상 증상의 발생 위험의 감소; (ii) 저해, 즉, 예를 들어 종양 부하(tumor load)를 감소시키기 위한 임상 증상의 발달 또는 추가 발달의 중지, 예를 들어, 활성 질환의 완화 또는 완전한 저해(감소는 검출 가능한 암성 세포(예를 들어, 전이성 암세포)의 제거를 포함할 수 있음); 및/또는 (iii) 경감, 즉, 임상 증상의 퇴행 유발을 포함한다.
다양한 대상체가 이들 방법에 따라 치료될 수 있다. 일반적으로, 이런 대상체는 "포유류" 또는 "포유동물"이고, 여기서 이들 용어는 육식동물(예를 들어, 개와 고양이), 쥐목(예를 들어, 마우스, 기니 피그 및 래트), 및 영장류(예를 들어, 인간, 침팬지 및 원숭이)를 비롯한 포유류 내에 있는 유기체를 기술하는 넓은 의미로 이용된다. 다수의 실시형태에서, 대상체는 인간일 것이다.
관련 실시형태에서, 치료될 대상체는 종양 연관된 항원 및/또는 EphA2를 발현시키는(예를 들어, 과발현시키는) 암을 갖는다. 항원은 암 세포 표면 에서 발현되고 종종, 상응하는 비-암성 세포보다 높은 수준으로 존재한다. 이러한 양상은 EphA2를 발현시키거나 제시하는 세포가 본 개시내용의 항체를 이용한 치료에 순응할 수 있다는 점에서, 본 개시내용의 방법의 문맥에서 이로울 수 있다. 항체는 예를 들어, 요법이 항원의 존재가 검출되지 않는 시점에서 시작되고, 따라서 제한하는 것으로 의도되지 않는 대상체에 투여될 수 있다. 또한, 질환 증상의 첫 번째 징후에 앞서, 가능한 질환의 첫 번째 징후에서, 또는 질환의 진단 전후에 항체 요법을 개시하는 것이 가능하다.
암
본 개시내용의 항-EphA2 항체 조성물 및/또는 항-EphA2 항체 접합체 조성물은 특히 암성 세포가 세포외 접근 가능한 세포 표면 상에서 EphA2를 제시하는, 항암 요법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 항체 조성물 및/또는 치료 항체 접합체 조성물은 암성 세포의 증식을 감소시키기 위해서, 예를 들어, 종양 크기를 감소시키기 위해서, 암 부하를 감소시키기 위해서, 전이를 감소시키기 위해서 그리고/또는 환자에서 임상적 결과를 개선시키기 위해서 대상체(예를 들어, 인간 환자)에게 투여될 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 암에 관련된 방법은 예를 들어, 단독으로 또는 항암 백신 또는 요법과 조합으로 항체 요법의 사용을 포함한다.
항체 요법에 특히 순응하는 암은 본 명세서에 기술된 진단 방법 및 관련 기술 분야에 공지된 다른 것과 유사한 방법에 의해서 식별될 수 있다.
항암 요법이 상기에 기술된 항체 조성물의 투여를 포함하는 경우, 항암 요법은 전이성 암을 비롯하여, 대상 항체에 의해 결합되는 세포-표면 접근 가능한 및/또는 용매-노출된 에피토프를 발현시키는 암성 세포에 특별하게 지향될 수 있다.
요법에 순응하는 EphA2-발현 암의 예는 고체 종양, 반고체 종양, 및 액체 종양을 포함한다. 요법에 순응하는 EphA2-발현 암의 예는 유방, 뇌, 난소, 방광, 전립선, 췌장, 식도, 폐(예를 들어, 비소세포 폐암), 및 위의 EphA2 양성 암을 포함하지만, 이들로 필수적으로 제한되지 않고, 결장, 음문, 피부(예를 들어, 흑색종), 신장 및 신경교종(예를 들어, 다형성 신경교아종, 성상세포종), 백혈병, 및 림프종을 포함할 수 있다.
EphA2는 비암성 세포에 비해서 암 세포 상에서 더 높은 수준으로 발현될 수 있지만, 이것은 본 명세서에 개시된 요법의 제한이 아니라는 것을 주목해야 한다.
본 명세서에 개시된 방법에 의한 요법에 순응할 수 있는 EphA2-발현 암종은 식도 암종, 간세포 암종, 기저 세포 암종(피부 암의 한 형태), 편평 세포 암종(다양한 조직), 이행상피암(방광의 악성 신생물)을 비롯한 방광 암종, 기관지 암종, 대장 암종, 결장직장 암종, 위 암종, 폐의 소세포 암종과 비-소세포 암종을 비롯한 폐 암종, 부신피질 암종, 갑상선 암종, 췌장 암종, 유방 암종, 난소 암종, 전립선 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 낭종암, 수질 암종, 신장 세포 암종, 유방 관상피내암 또는 담관 암종, 융모암종, 정상피종, 태생성 암종, 윌름 종양, 자궁경부 암종, 자궁 암종, 고환 암종, 골원성 암종, 상피 암종 및 코인두암종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 개시된 방법에 의한 치료에 순응할 수 있는 EphA2-발현 육종은 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 척색종, 골원성 육종, 골육종, 혈관육종, 내피세포육종, 림프관육종, 림프관혈관내피세포육종, 활막종, 중피종, 유잉 육종, 평활근육종, 횡문근육종, 및 다른 연조직 육종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 개시된 방법에 의한 치료에 순응할 수 있는 추가적인 EphA2-발현 고체 종양은 신경교종, 성상세포종, 수아종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희돌기교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종 및 망막아종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 개시된 방법에 의한 치료에 순응할 수 있는 EphA2-발현 백혈병은 a) 만성 골수증식성 증후군(chronic myeloproliferative syndrome)(다능성 조혈 줄기 세포의 신생물 장애); b) 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia)(다능성 조혈 줄기 세포 또는 제한된 계통 잠재력의 조혈 세포의 신생물 변형; c) B-세포 CLL, T-세포 CLL 전림프구성 백혈병, 및 모양 세포성 백혈병을 비롯한 만성 림프성 백혈병(CLL; 면역학적으로 미성숙하고 기능적으로 부적격한 작은 림프구의 클론 증식); 및 d) 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia)(림프구의 축적을 특징으로 함)이 포함되지만 이들로 제한되지 않는다. 본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 림프종은 B-세포 림프종(예를 들어, 버킷 림프종); 호지킨 림프종; 비-호지킨 림프종 등을 포함되지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 개시된 방법에 따른 치료에 순응할 수 있는 다른 암은 비정형성 수막종(뇌), 섬 세포 암종(췌장), 수질 암종(갑상선), 간엽종(장), 간세포 암종(간), 간아종(간), 투명 세포 암종(신장) 및 종격 신경섬유종을 포함한다.
본 명세서에서 개시된 방법을 사용한 치료에 순응할 수 있는 암의 다른 예는 상피 및 신경외배엽 기원의 EphA2-발현 암을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 상피 기원의 EphA2-발현 암의 예는 소세포 폐암, 유방암, 수정체 암, 결장암, 췌장암, 신장암, 간암, 난소암 및 관지 상피 암을 포함되지만 이들로 제한되지 않는다. 본 개시내용의 방법은 EphA2를 과발현시키는 것으로 공지된 암 세포를 치료하는데 사용될 수 있다.
신경외배엽 기원의 EphA2-발현 암의 예는 유잉 육종, 척추 종양, 뇌 종양, 유아의 텐트상 미분화 신경외배엽성 종양(supratentorial primitive neuroetodermal tumor), 낭포성 암종, 점액성 세관 방추 세포형 암종(mucinous tubular and spindle cell carcinoma), 신장 종양, 종격 종양, 신경아교종, 신경아세포종, 및 청장년에서의 육종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 암 요법과의 조합
상기에 언급된 바와 같이, 방법의 또 다른 특징은 항체가 하나 이상의 다른 요법과 조합하여 대상체에에 투여될 수 있다는 점이다. 이러한 요법은 조성물 중에서 조합되거나 또는 또는 대상 항체에 접합될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 항체(예를 들어, 접합체로서, 또는 리포솜 또는 다른 지질성 나노입자 내에)와 물리적으로 조합되는 것에 더하여, 하나 이상의 항암제, 예컨대, 상기 표 4에 열거된 것은 본 명세서에서 개시된 항체의 투여와 동시에, 또는 투여 전 또는 후에 함께 투여될 수 있다.
항체 조성물의 투여 이외의 요법 또는 치료는 대상 항체의 투여와 동시에, 또는 투여 전 또는 후에 5시간 그 이상, 예를 들어, 10시간, 15시간, 20시간 또는 그 이상까지 어느 시점에든 투여될 수 있다. 대상 항체 및 기타 치료적 개입(therapeutic intervention)은 예를 들어, 순차적으로 투여되거나 적용되고, 여기서 대상 항체는 또 다른 치료적 치료 전 또는 후에 투여된다. 대상 항체 및 다른 요법은 예를 들어, 동시에 투여되고, 여기서 대상 항체 및 제2 요법은 예를 들어, 동일한 시점에 투여되고, 이때 제2 요법은 2개의 별개의 제형으로서 대상 항체와 함께 투여되거나, 또는 개체에 투여되는 단일 조성물로 조합될 수 있는 약물이다. 순차적으로 또는 동시에 투여되는 지의 여부에 관계없이, 상기에 예시된 바와 같이, 이들 치료는 본 개시내용의 목적을 위해서 함께 또는 조합으로 투여되는 것으로 간주된다.
대상 항체와 함께 투여될 수 있거나 투여되지 않을 수 있는 추가적인 표준 항암 치료제는 면역요법, 화학치료제 및 수술(예를 들어, 하기에 더욱 상세하게 기술된 것)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 또한, 대상 항체의 치료적 투여는 또한 항암 요법으로의 대상체의 치료적 치료 후일 수 있고, 여기서 항암 요법은 예를 들어, 수술, 방사선 요법, 화학치료제의 투여 등일 수 있다. 본 명세서에서 개시된 것 이외의 항체, 특히 표적 세포의 보체-매개된 사멸, 및/또는 항체-의존성 세포 세포독성-매개된 사멸을 제공할 수 있는 단클론성 항체가 또한 사용될 수 있다.
예를 들어, 대상 항체는 하나 이상의 화학치료제(예를 들어, 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손(CHOP))와 조합하여, 그리고/또는 방사선 치료와 조합하여 그리고/또는 외과적 개입(예를 들어, 종양을 제거하기 위해 수술 전 또는 수술 후), 방사선 요법, 골수 이식, 생물학적 반응 변형제 치료, 및 전술한 것의 특정 조합물과 조합하여 투여될 수 있다. 방사선 요법은 외부에서 적용된 공급원, 예를 들어, 빔으로부터, 또는 작은 방사성 공급원의 이식에 의해 전달되는 X-선 또는 감마선을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
투여 경로
이들 방법을 실시함에 있어서, 투여 경로(대상 항체가 대상체 내로 이동되는 경로)는 달라질 수 있는데, 여기서 대상 항체에 대한 대표적인 투여 경로는 하기에 더욱 상세하게 기술된다. 대상 항체는 단독으로 또는 상기에 기술된 조합으로, (예를 들어, 비경구, 정맥내, 근육내, 척추강내, 심실내, 또는 피하 투여에 의해) 전신으로 투여되거나, 또는 체강(body cavity) 또는 내강, 또는 기관 내로 국소(예를 들어, 종양내 투여(예를 들어, 고형 종양 내로, 림프종 또는 백혈병에서 침범된 림프절 내로, 또는 예를 들어 미국 특허 제US 20090209937호에 개시된 바와 같이 뇌 내로 전달 강화 전달에 의해), 고형 종양을 공급하는 혈관 내로 투여 등에 의해 국소 종양 부위에서) 투여될 수 있다. 이들 상이한 투여 경로는 주사 또는 주입에 의해 수행될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제형은 항산화제, 완충제, 세균 발육 저지제, 및 제형이 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되도록 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성과 비-수성, 등장성 무균 주사 용액, 및 현탁제, 용해제, 농후제, 안정제, 및 보존제를 포함할 수 있는 수성과 비-수성 무균 현탁액을 포함한다. 이들 제형은 단위-용량 또는 다중-용량의 밀봉된 용기, 예컨대, 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용 직전에 주사를 위해 단지 무균 액상 부형제, 예를 들어, 물의 첨가 만을 필요로 하는 동결-건조된(동결건조된) 상태로 보관될수 있다. 주사 용액 및 현탁액은 상기에 기술된 종류의 무균 분말, 과립, 및 정제로부터 제조될 수 있다. 비경구 투여 가능 조성물을 제조하는 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있거나 자명할 것이다.
요법의 투여는 목적하는 기간에 걸쳐서 반복될 수 있고, 예를 들어 약 1일 내지 약 5일의 기간 또는 수 일, 예를 들어 약 5일마다 1회, 1개월, 2개월 등에 걸쳐서 반복될 수 있다. 그것은 또한 다른 치료 개입, 예컨대, 암성 세포를 제거하기 위한 수술 개입 이전에, 개입 시기에, 또는 개입 후에 투여될 수 있다. 항체는 또한 조합 요법의 부분으로서 투여될 수 있는데, 여기서 면역요법, 암 화학요법 또는 방사선 요법 중 적어도 하나가 대상체에게 투여된다(상기에 보다 상세하게 기술된 바와 같음).
검출 방법
본 개시내용은 대상체에서의 생물학적 샘플에서 또는 대상체로부터 단리된 샘플에서 예를 들어, EphA2-발현 세포 상에서 EphA2를 검출하는 방법을 제공한다. 방법은 진단 및 예후 목적 둘 모두에 유용하다. 대상 방법은 일반적으로 세포를 함유하는 샘플을 본 개시내용의 항체 또는 항체 접합체와 접촉시키는 단계; 및 샘플에서 세포에 대한 항체 또는 항체 접합체의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 세포는 시험관 내에 존재할 수 있는데, 여기서 세포는 암 세포를 갖는 것으로 예상되는 대상체, 암 치료를 겪은 대상체 또는 치료에 대한 민감성에 대해서 시험되는 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 중에 존재한다. 세포는 생체 내에 존재할 수 있는데, 여기서 세포는 암 세포를 갖는 것으로 예상되는 대상체, 치료를 겪은 대상체 또는 치료에 대한 민감성에 대해서 시험되는 대상체 중에 존재한다.
본 명세서에 기술된 검출 검정을 사용하여 대상체가 항체-기반 요법을 사용한 요법에 더 순응성인 암을 갖는지 덜 순응성인 암을 갖는지를 결정할 뿐만 아니라 대상체에서 치료의 진전을 모니터링할 수 있다. 그것을 또한 사용하여 다른 조합의 과정을 평가할 수 있다. 따라서, 진단 검정은 의사에 의한 요법 및 치료 치료요법의 선택에 대한 정보를 제공할 수 있다.
항체는 면역진단 기술을 통해서 EphA2-발현 암성 세포를 갖거나 갖는 것으로 예상되는 대상체의 생물학적 샘플에서 EphA2를 발현시키는 세포를 검출하는 데 사용될 수 있다. 이러한 진단법은 하기에서 추후에 개시되는 요법에 순응성인 환자를 식별하고/하거나 요법에 대한 반응을 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
적합한 면역진단 기술은 시험관내 및 생체내(영상화) 방법 둘 모두를 포함하지만 이들로 필수적으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 항-EphA2 항체는 검출 가능하게 표지되고, EphA2의 세포 표면 발현을 특징으로 하는 암을 갖는다고 예상되는 대상체에게 투여되고, 본 기술 분야에서 사용 가능한 영상화 방법을 사용하여 검출되는 검출 가능하게 표지된 항체에 결합될 수 있다.
구 "생체내 영상화"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 전체 살아있는 포유류에서 항체(예를 들어, 검출 가능하게 표지된 2D6)의 존재를 검출하는 방법을 지칭한다. 광학적으로 검출 가능한 단백질, 예컨대, 형광 항체 및 루시페라제-접합된 항체가 생체내 영상화에 의해서 검출될 수 있다. 생체내 영상화는 포유류의 2-D뿐만 아니라 3-D 영상을 제공하기 위해서 사용될 수 있다. 방사성 표지된 항체는, 예를 들어, 대상체에 투여되고, 대상체는 감마 카메라로 영상화될 수 있다. 전하-커플링된 장치 카메라, CMOS, 또는 3D 단층촬영기(tomographer)가 생체내 영상화를 수행하기 위해서 사용될 수 있다. 컴퓨터 계산된 단층촬영, 자기 공명 영상화, 초음파 검사, 양전자 방출 단층촬영, 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(single-photon emission computed tomography: SPECT) 등이 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 상기에 기술된 바와 같은 다수의 생체내 영상화 방법으로부터의 정보가 대상체에서 암 세포에 대한 정보를 제공할 수 있다.
방법이 시험관내에서 행해지는 경우, 생물학적 샘플은 혈액 샘플(전혈, 혈청 등 포함), 조직, 전체 세포(예를 들어, 무손상 세포) 및 조직 또는 세포 추출물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 암 세포가 존재할 수 있는 임의의 샘플일 수 있다. 예를 들어, 검정은 조직학적 조직 샘플에서 살아있는 세포 또는 세포 상에서의 EphA2의 검출을 포함할 수 있다. 특히, 검출은 살아있는 세포의 세포외 표면 상에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 조직 샘플은 (예를 들어, 포르말린 처리에 의해서) 고정될 수 있고, 지지체 내에(예를 들어 파라핀 내에) 포매되거나 또는 냉동된 비고정된 조직으로 제공될 수 있다.
검정은 광범위한 형태, 예컨대, 경쟁, 직접 반응 또는 샌드위치 유형 검정을 가질 수 있다. 예는 웨스턴 블롯; 응집반응 시험; 효소-표지된 및 매개된 면역검정, 예컨대, 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA); 바이오틴/아비딘 유형 검정; 방사성면역검정; 면역전기영동; 면역침전 등을 포함한다. 반응은 일반적으로 항체에 접합된 검출 가능한 표지를 포함한다. 표지는 형광성, 화학발광성, 방사성, 효소 및/또는 염료 분자, 또는 샘플 중의 항원과 그것과 반응하는 항체 또는 항체들 간의 복합체의 형성을 검출하기 위한 다른 방법인 것을 포함한다. 고체 지지체가 사용되는 경우, 고체 지지체는 항체가 지지체에 충분히 고정되도록 적합한 결합 조건 하에서 통상적으로 먼저 고체상 성분과 반응된다. 커플링제, 예컨대, 단백질(예를 들어, 혈청 알부민(예를 들어, 소 혈청 알부민(BSA)), 키홀 림펫 헤모사이아닌, 면역글로불린 분자, 티로글로불린, 오브알부민), 다당류, 폴라락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체 등을 사용하여 고체 지지체에 대한 고정화를 가능하게 할 수 있다.
검정은 용액 중에서 수행될 수 있어서, 항체 및 항원은 침전 조건 하에서 복합체를 형성한다. 항체-코팅된 입자는 적합한 결합 조건 하에서 표적 항원을 함유하는 것으로 예상되는 생물학적 샘플과 접촉되어 입자-항체-항원 복합체 응집물(이것은 세척 및/또는 원심분리를 사용하여 샘플로부터 침전 및 분리될 수 있음)의 형성을 제공할 수 있다. 반응 혼합물은 분석하여 다수의 표준 방법 중 임의의 것, 예컨대, 상기에 기술된 면역진단 방법을 사용하여 항체-항원 복합체의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다.
본 개시내용의 검정은 예를 들어, EphA2-발현 암성 세포의 검출 방법으로서, 살아있는 세포에 의한 본 개시내용의 항체 및/또는 항체 접합체의 세포 흡수를 검출하는 검정을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 및/또는 항체 접합체가 EphA2를 발현시키는 세포에 의해서 내재화되는 경우, EphA2를 발현시키는 세포를 함유한다고 예상되는 샘플은 이러한 항체와 접촉되고, 항체 및/또는 항체 접합체의 내재화를 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 세척 후에, 내재화된 항체는 세포와 함께 함유된 이의 표지를 통해서 검출될 수 있다(예를 들어, FACS, 분광계, 방사성 동위원소, 카운터 등). 내재화 항체는 또한 미국 특허 제US　7,045,283호에 기술된 바와 같이 선택될 수 있다.
본 개시내용의 항체를 비롯한, 상기에 기술된 검정 시약은 상기에 기술된 바와 같은 면역검정을 수행하기 위해서, 적합한 지시서 및 다른 필요한 시약과 함께 키트 내에 제공될 수 있다. 키트는 또한 사용되는 특정 면역검정에 따라서 적합한 표지 및 다른 포장된 시약 및 물질(즉, 세척 완충제 등)을 함유할 수 있다. 표준 면역검정, 예컨대, 상기에 기술된 것이 이들 키트를 사용하여 수행될 수 있다.
하기 실시예는 제한이 아닌 예시로서 제공된다.
실시예
실시예 1 - D2-1A7 열안정성 및 단백질 A 결합
D2-1A7 scFv를 열안정성 및 단백질 A 수지에 대한 결합에 대해서 프로파일링하였다.
열안정성 결정은 하기와 같이 수행된 시차 주사 형광(DSF)에 의해서 수행하였다: 25㎕의 10μM scFv 및 1X PBS 중의 1X 시프로(Sypro)(등록상표) 오렌지(Orange)(시그마(Sigma))를 1℃/분의 속도로 20℃로부터 90℃로 가열하고, 생성된 형광 데이터를 수집하였다. 가열 및 형광 데이터 생성을 IQ5 실시간 검출 시스템(바이오-라드(Bio-Rad)(등록상표))을 사용하여 수행하였다. 데이터를 그래프패드(GraphPad)(등록상표) 프리즘 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 보고된 Tm은 1차 미분의 최대 값에서의 온도이다.
다수의 샘플에 대한 단백질 A 결합을 하기와 같이 결정하였다: 포유동물 세포에 의해서 발현된 scFv를 15분 동안 4000g에서의 원심분리에 의해서 배양물로부터 수득하고 세포를 제거하였다. 상청액에서의 scFv 역가를 포르테바이오(Fortebio)를 사용하여 결정하였다. 단백질 A 결합을 96웰 단백질 A 플레이트(단백질 A 96웰 단백질 정제 플레이트(지이 헬쓰케어: 라이프 사이언시스(GE Healthcare: Life Sciences), 단백질 A HP 멀티트랩(MultiTrap)(등록상표))를 사용하여 검정하였는데, 이것은 다공성 바닥을 갖는 웰 중에 단백질 A-접합된 수지를 함유하여, 웰 내의 액체가 원심분리 또는 흡입을 통해서 하부로부터 수집되는 것이 가능하다. 플레이트의 각각의 웰을 1X PBS로 세척하고, 250㎍의 단백질을 함유하는 상청액을 각각의 웰에 적재하였다. 이어서 상청액을 10mbar의 압력을 갖는 진공 매니폴드(와트만(Whatman)(등록상표))를 사용하여 단백질 A 수지로부터 분리하고, 각각의 웰로부터의 통과액을 표준 96웰 플레이트의 빈 웰에 별도로 수집하였다. 이어서 단백질 A 플레이트의 웰을 600㎕의 1X PBS(pH 7.6)로 세척하였다. 수지-결합된 Ab를 용리하기 위해서, 200㎕의 0.1M 아세트산을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 3 내지 10분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 제2 플레이트 상에 놓아서 용리물을 포획하고, 100 x g에서 2분 동안 원심분리하고, 20㎕의 1M 트리스, pH 8.0을 첨가하여 용리물 중에서 Ab를 중화시켰다. 단백질 A 결합의 백분율을 결정하기 위해서, 통과액 중에 남아있는 scFv의 농도를 본래 적재된 단백질의 양(250ug)과 비교하였다.
결론: 65℃의 측정된 Tm은 효율적이고 상업적으로 생산성인 리포솜 접합을 위해서 허용 가능하지 않게 낮고, 10% 미만의 측정된 단백질 A 결합은 상업적인 생산을 위해서 허용 가능하지 않게 낮다.
실시예 2 - T m 을 개선시키도록 조작된 프레임워크
Tm을 비롯한 안정성 특징을 증가시키기 위한 초기 접근법으로서, D2-1A7의 CDR을 상이한 Ig 프레임워크에 그래프팅하였다. D2-1A7의 중쇄 가변 영역의 프레임워크는 IGHV3-30이다. VH3은 일반적으로 매우 안정하고, 전형적으로 단백질 A에 대한 결합에 대해서 안정성을 갖고, 치료적 Ab를 위해서 일반적으로 사용되는 프레임워크이다. 따라서 VH3 패밀리 내의 중쇄를 보유하지만, IGHV3-23 골격(가장 일반적인 아이소타입임) 상에 D2-1A7의 중쇄를 그래프팅하기로 결정하였다. 추가로, 두 안정화 돌연변이를 IGHV3-23 프레임워크: E6Q 및 S49A 내에 만들었다.
D2-1A7의 경쇄 가변 영역의 프레임워크는 IGVλ3-19인데, 이것은 자연 인간 Ab 레퍼토리에서 일반적으로 발견되지 않고, 따라서 보다 일반적인 프레임워크 IGVλ1-40(이것은 IGVH3-23과 가장 빈번하게 쌍을 이루는 것으로 발견됨)에 D2-1A7 경쇄 CDR을 그래프팅하기로 결정하였다. 2개의 열안정성 변이체, TS1 및 TS2를 설계하였다. 상동성 모델링을 기반으로, 위치 1 및 22가 항원과 상호작용한다고 생각되었고, 따라서 두 변이체 모두를 D2-1A7에서 이들 위치(Q1S, S22T)에서 생성된 잔기를 갖도록 복귀 돌연변이화하였다. TS1에서, 표면 상에서의 전하를 조정하면서(V3E, R18T), 안정성에 중요하다고 생각되는 소수성 포켓이 보유되었다(G13V, L78A), 아미노산 서열을 미경험 서열의 레퍼토리와 비교하였고, L39K(TS1) F65S(둘 모두), K66G(TS2) 또는 K66S(TS1) 및 A74T(TS1)를 비롯한 컨센서스 아미노산을 도입하였다.
Figure pct00005
결론: TS1은 Tm에서의 6도 증가로 열안정성에서 상당한 향상을 나타내었다. 이러한 클론은 사용 또는 단백질 A 결합을 개선시키기 위한 추가 조작에 적절하다.
실시예 3 - 단백질 A 결합을 예방하는 영역의 식별
scFv의 열안정성을 71도로 개선시키면서, 그 다음 제조를 용이하게 하기 위해서 단백질 A 친화도를 Ab 내에서 조작하였다. VH3 프레임워크는 단백질 A에 결합할 수 있다고 문헌에 널리 보고되어 있다. TS1을 VH3-23 프레임워크 상에서 조작하였지만, 예상치 못하게 단백질 A에 잘 결합하지 않았다. 중쇄의 가변 영역 내에서, FR1, CDR2 및 FR3 내의 잔기가 단백질 A 결합에 관여되는 것으로 나타났다. TS1의 구조적 분석은 결합에 중요한 것으로 보이는 위치: H15, H17, H19, H57, H59, H64, H65, H66, H68, H70, H81, H82a, H82b에서 생식계열로부터 벗어난 아미노산을 나타내지 않았다. 생식계열 서열을 고려할 때, 어느 아미노산이 단백질 A와 Ab 간의 상호작용에 부정적으로 영향을 미치는 지가 명확하지 않아서, 단백질 A 결합 검정을 개발하였다.
D2-1A7, TS1, TS1* 및 F5의 이종으로 쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄를 포함하는 일련의 변이체 scFv를 설계 및 제조하였다. CDR-H2 서열의 효과를 직접적으로 시험하기 위해서, TS1의 CDR-H2를 F5(TS1*)의 CDR-H2로 대체하여 scFv를 또한 제조하였다. 변이체는 포유동물 세포에서 일시적으로 발현되었고, 발현된 scFv 역가를 생물층 간섭계법(bio-layer interferometry)(포르테바이오(등록상표))을 사용하여 정량분석하였다. 단백질 A 결합 검정을 실시예 1에 기술된 바와 같이 96웰 플레이트에서 수행하였다. 통과액 중에 남아있는 scFv의 양을 생물층 간섭계법을 사용하여 결정하였고, 단백질 A 수지에 결합한 scFv의 백분율을 계산하고, 결과를 플로팅하였다(도 1).
결론: F5는 단백질 A에 대한 75% 결합을 나타내었다. TS1은 29%의 단백질 A 결합을 나타내었는데, 이는 상업적인 제조를 위해서 허용 가능하다고 간주되는 50% 한계치보다 훨씬 낮다. EphA2 결합을 없애면서, TS1 내로의 F5 CDR-H2의 그래프트(scFv TS1*을 산출함)는 단백질 A 결합의 상당한 개선(65%)을 나타내었는데, 이는 TS1의 CDR-H2가 단백질 A 결합에 대해서 부정적인 효과를 부여함을 시사한다.
실시예 4 - 효모 디스플레이를 사용한 CDR-H2 설계 및 scFv 선택
TS1CDRH2의 일련의 변이체를 문헌[Xu et al., (2013) mAbs, 5:2, 237-254]에 기술된 바와 같은 효모 디스플레이를 위해서 제조하여; EphA2 결합을 보유하고, 개선된 단백질 A 결합을 나타내는 클론에 대해서 스크리닝하였다. 50,000개의 별개의 CDRH2 서열을 초과하게 포함하도록 세트를 설계하였다. 세트에서 scFv 각각은 이의 C-말단에서 혼입된 FLAG(상표명) 에피토프 태그(DYKDDDDK - 서열번호 49)를 갖는다. 세트는 EphA2 결합에 기여하는 것으로 예상되는 CDR-H2 위치뿐만 아니라 단백질 A 결합에 중요하다고 생각되는 CDR-H2에서 다양성을 포함하였다. 이어서 설계를 비면역 환자 레퍼토리의 NCBI뿐만 아니라 NGS 서열결정으로부터 다운로딩되고, 고도로 보존된 잔기를 보존하도록 조정된 인간 Ab 레퍼토리의 데이터베이스와 비교하였다. 궁극적으로, CDRH2 잔기 VH49, VH50, VH52A, VH53, VH55 및 VH57를 돌연변이유발에 대해서 식별하였다. 다시 인간 레퍼토리에 의해서 안내된 바와 같이, 아미노산의 하위세트 만이 대부분의 위치를 위해서 선택되었다(표 4 참조). 그 결과 53,460개의 별개의 서열을 포함하도록 설계된 일련의 scFv를 생성하고 시험하였다.
Figure pct00006
바람직한 특성을 갖는 것을 단리시키기 위하여 효모 세포 표면 상에서 개별적으로 발현되는 scFv의 세트의 신속한 선택은 벡톤 디켄슨(Becton Dickenson)(등록상표)(BD) 아리아(Aria)(등록상표) 시스템 상에서의 효모의 FACS 분류를 사용하여 수행하였다. 유도된 효모 세포를 200nM의 EphA2와 함께 His6 태그 및 10㎍/㎖의 형광 표지된 단백질 A와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 FACS 완충제(1x PBS, 0.5% BSA, pH 7.4)로 2회 세척하여 미결합 항원을 제거하였다. 이어서 항원-결합 세포 및 단백질 A-결합 세포를 2㎍/㎖의 알렉사(Alexa)647 표지된 M2 항-FLAG(상표명) Ab 및 2㎍/㎖의 알렉사 488 표지된 항-His6 Ab와 함께 30분 동안 인큐베이션시켰다. 2회 세척 후에, 세포를 FACS 완충제 중에서 재현탁하고, BD FACSCalibur(등록상표) 기계를 사용하여 형광 신호를 측정하였다. 중간 형광 강도를 플로조(FlowJo)(등록상표) 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. EphA2 MFI(항-His6-알렉사 488)를 발현 MFI(항-Flag-알렉사 647)에 대해서 정규화하였다. 제1 라운드의 선택을 위해서 EphA2 및 단백질 A 결합 둘 모두에 대한 선택을 수행하였고(도 2, 패널 B), 이것은 집단의 낮은 백분율을 산출하였다. 재조합 EphA2에 결합된 집단이 식별되게 하기 위해서, 단리된 클론을 EphA2 결합에 대해서 재선택하였다(도 2, 패널 D).
결론: 목적하는 특징을 나타내는 클론을 수득하였다.
실시예 5 - 열안정성, EphA2 결합/내재화 및 단백질 A 결합에 대한 scFv의 특징규명
효모 상에서 디스플레이되는 경우 단백질 A 및 EphA2 결합에 대해서 양성인 scFv를 서열결정하고, Expi293F(상표명) 세포(인비트로젠(Invitrogen)(등록상표)) 중에서 가용성 단백질로서 일시적으로 발현시켰다. 이어서 이것을 실시예 1에 기술된 바와 같이 단백질 A 결합에 대해서 측정하였다. 실시예 4에 기술된 바와 같이 수득된 22개의 독특한 변이체를 시험하였고, 20% 내지 80% 범위의 단백질 A 결합을 나타내었다(도 3). 22개의 scFv(scFv1 내지 scFv22) 아미노산 및 암호화 핵산 서열을 도 5에 제공한다.
시험된 22개의 scFv 중에서, 15개는 단백질의 적어도 50%가 단백질 A에 결합하였고, 따라서 이들을 추가 특징규명을 위해서 선택하였다. 모든 변이체의 Tm을 DSF를 사용하여 측정하였다. 모두는 아니지만 4개의 scFv는 65℃를 2℃ 초과하게 초과하는(즉, 적어도 67℃) 바람직한 Tm을 가졌다. 7개는 70℃ 이상의 보다 더 바람직한 Tm을 가졌다.
Figure pct00007
결합 및 내재화 검정:
이들 변이체 scFv의 항-EphA2 활성도를 시험하기 위해서, 이들 Ab로 외부 장식된 리포솜의 결합 및 내재화를 EphA2를 발현시키는 세포주 상에서 검정하였다. 신속한 고-처리율 킬레이팅된 리간드-유도된 내재화 검정(CLIA)(Nielsen et al., BMC immunology, 2006, 7:24)을 사용하여 결합 및 내재화 평가를 위해서 항-EphA2-scFv-표적화된 리포솜을 스크리닝하였다. 높은 수준의 EphA2 수용체를 발현시키는 2개의 세포주, OVCAR-3 및 U-251, 뿐만 아니라 뮤린 EphA2-발현 마우스 세포주, CT-26(뮤린 EphA2에 대한 교차-반응성이 조작된 scFv에 의해서 보유되는지를 시험하기 위해서)을 시험하였다. 각각의 scFv의 c-말단 His6 태그에 의한 니켈-결합을 통해서, scFv를 NTA(Ni) 접합된 지질을 포함하는 형광 표지된 리포솜(DiI5-NTA 리포솜)에 결합시켰다.
시험 리포솜 및 내재화 검정의 준비
DiI5-NTA 리포솜을 하기와 같이 제조하였다. NTA 접합된 지질, DOD-트라이-NTA를 문헌[Huang et al., Bioconjugate chemistry, 2006, vol. 17, p. 1592-1600]에 기술된 바와 같이 합성하였다. 수소화 소이 포스파티딜콜린(HSPC), 콜레스테롤, 메톡시-PEG(2000)-다이스테아로일포스파티딜에탄올아민(PEG-DSPE), DOD-트라이-NTA, 및 형광 지질 염료, Dil5(써모피셔(ThermoFisher)(등록상표) 인비트로젠(등록상표) 몰레큘러 프로브스(Molecular Probes)(상표명), cat. # D12370)을 각각 100:66.7:5:0.5:0.3의 몰비로 클로로폼 용액 중에서 조합하고, 그 용액을 진공 하에서 건조물로 증발시켜 지질 필름을 형성하였다. 필름을 HEPES-완충 생리 염수("HBS-6.5" - 5mM HEPES, 144mM NaCl pH 6.5) 중에서 68℃에서 수화시키고, 생성된 지질 현탁액을 동결(드라이 아이스-아세톤) 및 해동(68C)의 수 회 사이클에 적용하고, 리펙스(Lipex)(상표명) 써모배럴 압출기(노던 리피즈(Northern Lipids), 캐나다 소재)를 사용하여 200㎚(6회) 및 100㎚(10회)의 기공 크기를 갖는 2개의 적층된 폴리카보네이트 막(와트만 뉴클레오포어(Whatman Nuclepore), 미국 소재)을 통해서 압출하였다. 이러한 프로토콜은 전형적으로 100 내지 110㎚의 z-평균 크기 및 0.1 미만의 다분산 지수를 갖는 단일층 소포체(unilamellar vesicle)를 생산한다. 압출된 리포솜을 실온으로 급랭하고, HBS-6.5로 용리되는 세파덱스(Sephadex)(등록상표) G-75(지이 헬쓰케어) 칼럼 상에서의 겔-크로마토그래피에 의해서 정제하고, 이어서 0.2-㎛ 필터를 통한 여과에 의해서 멸균화하였다. 이어서 리포솜 인지질의 농도를 분광광도법 포스포몰리브데이트 방법을 사용한 산 소화 후에 결정하였다. 세포와의 인큐베이션 전에, 리포솜을 행크 평형 염 용액(HBSS) 중에서 0.4mM 인지질로 희석시키고, NiSO4를 0.1mM로 첨가하였다. 헥사히스티딘 scFv를 25㎍/㎖의 scFv의 농도로 세포 배양 배지(하기 참조) 중에서 희석시키고, 동일한 부피의 리포솜 용액과 혼합하였다("형광 NTA-리포솜/scFv 혼합물").
인큐베이션/이미다졸로의 세척(이것은 His6/Ni 복합체를 파괴하여, 외부(내재화되지 않은) 히스티딘-태깅된 scFv를 방출 및 제거함) 전 및 후에 세포의 형광을 측정함으로써, 내재화된 Ab의 백분율을 정량분석한다. 시험 세포(인간 암 세포주 OVCAR-3 및 U-251 및 뮤린 암 세포주 CT-26)를 10% FBS, 1x 페니실린/스트렙토마이신, 및 L-글루타민이 보충된 RPMI-640 세포 배양 배지 중에서 접착 상태로 90% 컨플루언스까지 성장시키고, 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 수거하였다. 세포 현탁액을 100,000개 세포/웰로 96-웰 "V"자형 바닥 형상의 폴리프로필렌 세포 배양 플레이트 내에 분배하고, 세포를 1X PBS로 세척하고, 이어서 100㎕의 형광 NTA-리포솜/scFv 혼합물 중에 재현탁하였다. 플레이트를 플레이트 밀봉 테이프로 덮고, 광으로부터 보호하고, 4시간 동안 37℃에서 5% CO2 분위기에서 진탕기 상에서 인큐베이션시켰다. 세포를 원심분리에 의해서 펠릿화하고, 상청액을 흡입하고, 200㎕/웰의 PBS 중에서의 재현탁에 의해서 임의의 비결합된 세포외 리포솜을 제거하거나 또는 0.25M 이미다졸(pH 7.5)을 함유하는 200㎕/웰의 PBS로의 재현탁에 의해서 비결합 세포외 리포솜 및 표면-결합 리포솜(내재화화되지 않은 리포솜)을 제거함으로써 세포를 2회 세척하였다. 세포-연관된 리포솜의 상대적인 양을 FACS(Cy5 형광 채널)에 의해서 평가하였다. "결합"량은 세포 표면-결합된 리포솜 및 내재화된 리포솜 둘 모두를 포함하였고, 이미다졸 세척이 없는 세포 형광에 비례하였다. 그것을 도 4에서 scFv TS1로 장식된 매칭된 리포솜에 의한 리포솜 결합에 상대적인 백분율로서 나타낸다. 내재화 데이터는 총 세포 연관된 리포솜의 백분율로서의 내재화된 리포솜의 양을 나타낸다. 대부분의 클론은 TS1과 유사한 인간 및 뮤린 EphA2에 대한 결합 및 내재화를 보유하였다(도 4). 단지 하나의 시험된 클론, scFv-12(및 F5 음성 대조군)은 EphA2에 결합하지 않았다.
결론: 시험된 22개의 새로운 클론 중 21개(scFv-12를 제외한 모두)는 허용 가능한 결합 및 내재화 특성을 갖는 것으로 식별되었다. 22개 중 18개(scFv 1 내지 4, 6 내지 13, 15 내지 16, 및 18 내지 21)는 67℃ 이상의 Tm을 갖는 목적하는 열안정성을 갖는 바람직한 열안정성을 나타낸 반면, 이들 중 10개(scFv 1 내지 3, 8 내지 11, 13, 15 및 18)는 또한 보다 상업적으로 선호되는 열안정성 기준을 충족하였고, 각각은 70℃ 이상의 Tm을 나타내었다.
실시예 6 - 항-EphA2 scFv의 접합 안정성 시험
선택된 scFv를 이의 C-말단에서 재조합 방식으로 변형시켜 His6 태그를 제거하고, 리포솜 부착을 위해서 개작된 C-말단 펩타이드 -- Gly Gly Ser Gly Gly Cys(서열번호 54)를 첨가하였다. 이들 변형된 scFv는 scFv의 것에 상응하는 명칭에 의해서 식별되며, 이들은 그 뒤에 문자 C로부터 유래되었다. PEG-DSPE(지질중합체)에 대한 Ab의 접합(미국 특허 제6,210,707호에 기술된 방법 사용)(생성된 지질중합체-접합된 scFv는 항원에 결합하는 능력(항원-결합 친화도로서 측정됨), 뿐만 아니라 효율적으로 그리고 결합 특성(다수의 결합된 scFv를 통해서 항원에 결합하는 리포솜의 총 친화도로서 측정되고, 하기에서 결합활성(avidity)이라 지칭됨)을 잃어버리지 않으면서, 리포솜의 외부 막으로 (지질중합체의 DSPE 부분을 통해서) 삽입되는 지질중합체 접합체의 능력을 보유함(외부로 노출된 PEG-테더링된 scFV를 남김))을 다음으로 시험하였다.
지질중합체 링커에 대한 scFv의 접합: 정제된 scFv 용액을 pH 6.0 내지 6.2로 조정된 15mM의 L-시스테인, 5mM의 EDTA로 30℃에서 1시간 동안 처리하여 각각의 scFv의 카복시-말단 시스테인 잔기의 싸이올기를 환원/활성화시켰다. 과량의 시스테인을 접합 완충제(5mM 시트레이트, 1mM EDTA, 140mM NaCl, pH 6.0)로 용리되는 세파덱스(등록상표) 칼럼 상에서의 겔-크로마토그래피에 의해서 제거하였다. 다음으로, Ab를 하기와 같이 지질중합체 링커, 말레이미도-PEG(2000)-DSPE(mal-PEG-DSPE, 아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids), cat. # 880126)에 접합하였다. 수성 마이셀 스톡 용액 형태의 Mal-PEG-DSPE(아반티)를 처리된 scFv에 첨가하여 4:1의 지질/단백질 몰비를 달성하였다. 2 내지 4시간 동안 실온에서 교반하면서 혼합물을 인큐베이션시키고, 0.5mM의 최종 농도에서 5분 동안 시스테인으로 미반응 말레이미드를 켄칭시킴으로써 반응을 중단시켰다. 켄칭된 반응 믹스를 울트라겔(Ultrogel) AcA34 중력 칼럼 상에서 크로마토그래피하고, 280㎚에서의 용리 단백질 농도 판독을 사용하여 S10C-6.5 완충제(100g/L 저 엔도톡신 수크로스, 10mM 시트르산 USP, NaOH로 pH 6.5로 조정됨)로 용리시켰다. 정제된 scFv -PEG-DSPE 접합체를 함유하는 제1(공극 부피) 단백질 피크를 수집하였다. scFv-PEG-DSPE 접합체의 순도를 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해서 평가하였다.
시험 리포솜의 제조 및 리포솜 막 내로의 scFv 지질중합체 접합체의 삽입: 각각 100:66.7:8:0.3 몰비의 에그(egg) 스핑고마이엘린(ESM, NOF, 일본 소재, NM-10), 콜레스테롤(아반트 폴라 리피즈(Avant Polar Lipids), #770100), 메톡시-PEG(2000)-다이스테아로일글리세롤(PEG-DSG, NOF, 일본 소재, 선브라이트(Sunbright) GS-020), 및 DiI5(실시예 5 참조)를 70℃에서 무수 에탄올 중에 용해시키고, 교반하면서 70℃에서 10 부피의 CS-250 완충제(250mM 수성 NaCl, 5mM 시트레이트, pH 5.5) 중에 100mM 인지질의 최종 농도로 희석시켰다. 지질 현탁액을 실시예 5에서 상기에 기술된 바와 같이 70℃에서 200㎚ 및 100㎚ 폴리카보네이트 막 필터를 통해서 압출하고, 압출된 물질을 실온으로 냉각시키고, 리포솜을 CS-250 완충제의 10 부피 교환을 통해서 미니크로스(MiniKros)(등록상표) 중공 섬유 카트리지(스펙트럼 래보러토리즈(Spectrum Laboratories), MWCO 500kD)를 사용하여 탄젠트 유동 투석여과에 의해서 정제하고, 0.2-㎛ 멸균 필터를 통해서 통과시켰다. 이러한 프로토콜은 전형적으로 100 내지 110㎚의 z-평균 크기 및 0.1 미만의 다분산 지수를 갖는 단일층 소포체 ("Dil5-SM 리포솜")를 생산한다. scFv-PEG-DSPE 접합체의 막 삽입 이전에, 리포솜을 세파덱스(등록상표) G-25 칼럼(PD-10, 지이 헬쓰케어) 상에서의 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 덱스트로스-시트레이트 완충제(17% 수성 덱스트로스, 20mM 시트레이트, pH 5.7) 중에서 교환시켰다.
이어서 scFv-PEG-DSPE 접합체를 덱스트로스-시트레이트 완충제 중의 Dil5-SM 리포솜과 혼합하여 10 내지 12g/㏖의 단백질/인지질 비를 달성하였다. 혼합물을 60℃로 신속하게 가열하고, 교반하면서 이 온도에서 30분 동안 유지시켰다. 이어서 혼합물을 얼음 상에서 급랭하고, 막-삽입된 scFv-PEG-DSPE 접합체를 갖는 리포솜을 시트레이트 염수 완충제로 용리되는 세파로스(상표명) CL-4B(지이 헬쓰케어)의 칼럼 상에서의 겔-크로마토그래피에 의해서 임의의 잔류하는 비-삽입된 접합체로부터 분리하였다. scFv-연결된 리포솜을 칼럼의 공극 부피 내에 수집하고, 각각 상기에 기술된 바와 같이 포르테바이오(등록상표)를 사용하여 시험관내 항원 결합 결합활성에 대해서 분석하고, 세포형광측정기(cytofluorimetry)를 사용하여 세포 흡수에 대해서 분석하였다. 리포솜 상의 scFv의 존재를 확인하고, SDS-PAGE에 의해서 정량분석하였다.
포르테바이오(등록상표)를 통한 EphA2 결합 분석
첨부된 c-말단 His6을 갖는 인간 EphA2를 암호화하는 핵산을 발현 벡터 pCEP4(인비트로젠(등록상표) # V044-50) 내에서 클로닝하고, 폴리에틸렌이민 형질주입 이후에 프리스타일(FreeStyle)(상표명) 293 세포(인비트로젠(등록상표) #K900001)에서 일시적으로 발현시켰다. His6-태깅된 재조합 인간 EphA2 단백질을 Ni-NTA 세파로스(상표명) 수지(퀴아젠(등록상표), 미국 소재)를 사용하여 세포 배양 배지로부터 정제하였다. 포르테바이오(등록상표) 옥텟 레드(Octet Red) 96 시스템(포르테바이오(등록상표)-팔(Pall)(등록상표) # 18-5116)에 대한 항-His 센서를 his-태깅된 재조합, 인간 EphA2로 10㎍/㎖의 단백질 농도에서 300초 동안 코팅하고, 배경 실시를 PBS 중에서 60초 동안 수행하였다. scFv-PEG-DSPE 접합체의 경우, 이어서 센서를 PBS, pH 7.4 중의 2.5㎍/㎖(연구 1) 또는 4.0㎍/㎖(연구 2)의 접합체와 함께 인큐베이션시키고, 회합 곡선의 기울기를 3 내지 13초의 인큐베이션에서 결정하고, 완충제 만을 갖는 배경에 대해서 수정하고, 변이체에 걸쳐서 비교하였다. ScFv-연결된 리포솜을 0.025mM의 리포솜 인지질에서 PBS 중에서 센서와 함께 인큐베이션시키고, 회합 곡선의 기울기를 3 내지 20초의 인큐베이션에서 결정하고, 완충제 만을 갖는 배경에 대해서 수정하고, 변이체에 걸쳐서 비교하였다.
결과를 표 6에서 하기에 나타내는데, 여기서 A열은 scFv 식별인자를 나타내고; B열은 scFv/지질중합체 링커 접합체의 백분율 수율을 나타내고; C열은 백분율 scFv-접합체(리포솜-접합되지 않음) EphA2 결합 온-레이트(on-rate)를 제공하고; D열은 백분율 scFv-접합된-리포솜 EphA2 결합 온-레이트를 나타내고; E열(연구 1) 및 F열(연구 2)은 열 스트레스 이후에 scFv-접합체(리포솜-결합되지 않음)에 남아있는 백분율 항원 결합 온-레이트를 제공한다.
Figure pct00008
결론: 모든 시험된 클론은 잘 접합하였지만, 그러나 scFv 4C, 7C, 11C, 16C 및 19C는 접합의 열 스트레스 후 10% 미만의 항원 결합을 나타내었다.
실시예 7 - 제조 가능성에 대한 선택된 변이체의 분석
실시예 6의 실험과 병용하여, 9개의 클론(및 대조군으로서 모 클론 TS1)을 시험하여 상업적인 제조에 대한 적합성을 결정하였다. 저 발현, 저 단백질 A 결합 능력 또는 고 응집물 함량을 갖는 분자를 제거하도록 스크리닝 전략을 설계하였다. scFv를 프리스타일(상표명) 293 세포(인비트로젠(등록상표) #K900001)에서 1L 규모에서 일시적으로 발현시켰고, 단백질 A를 정제하고, pH 6.0으로 중화시켰다. 결과를 표 7에 요약한다.
Figure pct00009
모든 Ab 역가를 생물층 간섭계법(포르테바이오(등록상표))를 사용하여 계산하였다. 응집물의 백분율을 하기와 같이 SEC를 사용하여 측정하였다. 러닝(running) 완충제로서 50mM 인산나트륨(+ 0.4M 과염소산나트륨) pH 7.0을 사용하여 50㎍의 샘플을 TSKgel(등록상표) SuperSW3000 칼럼(토소(Tosoh)(등록상표) 바이오사이언스(Bioscience)) 상에 주입하였다. 오토 샘플러, 바이너리 펌프 및 다이오드 어레이 검출기가 구비된 애질런트(등록상표) 1100 HPLC를 사용하여 모든 측정을 수행하였다. 데이터를 켐스테이션(상표명)(애질런트(등록상표)) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
단백질 A 결합 능력에서의 배수 개선(TS1C와의 비교)을 실시예 1에 기술된 바와 같이 측정하였다.
평가된 제1 기준은 scFv의 발현 수준이었다. 항체는 전형적으로 안정하게 형질감염된 세포주(예를 들어, 중국 햄스터 난소 - "CHO" 세포)에서 제조되었다. 그러나, 일시적인 발현을 통해서 수득된 역가는 안정하게 형질감염된 세포에서 발현 거동을 예측한다. 상기 표 7에 나타난 바와 같이, 새로운 Ab 중 다수는 훨씬 더 양호한 역가(TS1C에 비교할 경우 약 2-배 또는 더 양호한 개선)를 가졌다. 중화 손실은 일부 변이체에 대해서 약간 더 높았지만, 모든 최종 정제 수율은 TS1C와 비교할 때 대등하거나 더 양호하였다. 최종적으로, 성공적인 하류 공정 개발을 위해서, 낮은 응집물 함량을 갖는 것이 바람직하다. 모든 변이체의 중화 후 응집물 함량은 대등하였고, 허용 가능하였다. scFv-2C 및 scFv-4C를 제외하고, 이들 새로운 Ab는 훨씬 개선된 발현, 응집 및 단백질 A 결합 능력을 가졌다. 모두를 접합 공정 동안 안정성에 대해서 추가로 특징규명하였다.
결론: 모든 시험된 클론(클론 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11 및 13)은 시험된 파라미터에 대해서 허용 가능한 상업적인 개발 가능성을 나타내었다.
등가물
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 일상적인 실험을 넘어서지 않는 것을 사용하여 본 명세서에 기술된 구체적인 실시형태의 다수의 등가물을 인식할 것이거나 확인하고 실시할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 상기 개시내용 및 하기 청구범위에 의해서 포함되도록 의도된다. 특정 실시형태(및 인용 청구항)에 개시된 실시형태의 임의의 조합이 본 개시내용의 범주 내에 포함되는 것으로 고려된다.
참고문헌의 포함 　
본 명세서에 지칭된 미국 및 외국 특허 및 계류 중인 특허 출원 및 간행물 각각 및 모두의 개시내용은 이들의 전문이 본 명세서에 참고로 구체적으로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA MERRIMACK PHARMACEUTICALS, INC. <120> PROTEIN A BINDING POLYPEPTIDES, ANTI-EPHA2 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF <130> WO/2017/160775 <140> PCT/US2017/022188 <141> 2017-03-13 <150> US 62/309,374 <151> 2016-03-16 <150> US 62/309,365 <151> 2016-03-16 <150> US 62/309,383 <151> 2016-03-16 <160> 202 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa may be any amino acid except Glu. <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Xaa Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa may be any amino acid except Ser. <400> 2 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Xaa 1 5 10 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> 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sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa may be any amino acid except Leu. <400> 5 Trp Tyr Gln Gln Xaa Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 6 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa may be any amino acid except Phe. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa may be any amino acid except Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa may be any amino acid except Ala. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa may be any amino acid except Leu. <400> 6 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Xaa Xaa Ser Gly Thr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Leu Xaa Ile Thr Gly Xaa Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 7 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa may be any amino acid except Phe. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa may be any amino acid except Lys. <400> 7 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Xaa Xaa Ser Gly Thr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 8 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 9 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 10 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Thr 1 5 10 <210> 11 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 11 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 12 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 13 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 13 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 14 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 15 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 15 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 16 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 1 5 10 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 17 Ser Tyr Ala Met His 1 5 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa may be Ala or Val. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa may be Ala, Asp, His, Asn, Pro, Ser or Thr. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa may be Ala, Arg, His or Pro. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa may be Lys or Thr. <400> 18 Xaa Ile Ser Pro Xaa Gly Xaa Asn Xaa Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 19 Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 20 Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 21 Gly Glu Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 22 Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His Leu Thr Val 1 5 10 <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 23 Val Ile Ser Pro Ala Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 24 Val Ile Ser Pro Ala Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 25 Val Ile Ser Pro Asp Gly His Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 26 Val Ile Ser Pro His Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 27 Val Ile Ser Arg Arg Gly Asp Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 28 Val Ile Ser Asn Asn Gly His Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 29 Val Ile Ser Pro Ala Gly Pro Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 30 Val Ile Ser Pro Ser Gly His Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 31 Val Ile Ser Pro Asn Gly His Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 32 Ala Ile Ser Pro Pro Gly His Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 33 Val Ile Ser Pro Thr Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 34 Val Ile Ser Pro His Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 35 Val Ile Ser Asn Asn Gly His Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 36 Val Ile Ser Pro Ala Gly Thr Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 37 Val Ile Ser Pro Pro Gly His Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 38 Val Ile Ser His Asp Gly Thr Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 39 Val Ile Ser Arg His Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 40 Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 41 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 41 Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 <210> 42 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 42 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 43 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 44 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 44 Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala 20 <210> 45 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 45 Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ala 20 <210> 46 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 46 Thr Pro Ser His Asn Ser His Gln Val Pro Ser Ala Gly Gly Pro Thr 1 5 10 15 Ala Asn Ser Gly Thr Ser Gly Ser 20 <210> 47 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 47 Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly <210> 48 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr 145 150 155 160 Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly 180 185 190 Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 195 200 205 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp 210 215 220 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His Leu 225 230 235 240 Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 245 250 <210> 49 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 49 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 50 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 50 Ala Gly Ser Thr 1 <210> 51 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 51 Ala Val Asp Glu Gly 1 5 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 52 Cys Asp Gly His Asn Pro Arg Ser Thr Tyr 1 5 10 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 53 Ala Asp Gly His Asn Pro Arg Ser Thr 1 5 <210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 54 Gly Gly Ser Gly Gly Cys 1 5 <210> 55 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 55 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Arg Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Met Thr Ser Asn Ala Phe Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser 130 135 140 Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val 145 150 155 160 Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Gly 165 170 175 Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile 180 185 190 Tyr Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 195 200 205 Phe Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala 210 215 220 Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser 225 230 235 240 Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 245 250 <210> 56 <211> 762 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid. <400> 56 caagtgcagc tggtcgaatc cggaggggga ctggtgcagc cgggaggctc actcagactg 60 tcctgcgccg cttcgggctt cactttccgc tcgtacgcta tgagctgggt ccgccaagcc 120 cccggaaagg gattggaatg ggtgtccgcc attagcggac ggggcgataa cacgtactac 180 gcggacagcg tcaaaggcag attcaccatt agccgagata acagcaagaa taccctgtac 240 ctccaaatga atagcctcag ggccgaggac acggctgtgt actactgcgc aaaaatgacc 300 tccaacgcat ttgcgttcga ctactgggga cagggaaccc tggtcaccgt gtcatcggca 360 tcgactggag ggggaggctc tggaggaggg ggatcgggtg gcggagggtc gggcggagga 420 ggctcacagt ccgtgttgac ccaaccgccg tcagtgtccg gagcgccagg gcagcgggtc 480 accatctcct gcactggatc gtcatcgaac atcggcgcgg gttacggcgt gcactggtat 540 cagcagctgc cgggaaccgc tcctaagctc ctgatctacg gcaacactaa tcggccatcg 600 ggagtgcctg accgctttag cggtttcaaa tccggaactt cagcgagcct ggccatcact 660 ggtctgcaag ccgaggatga agcggactac tactgccaat cgtatgattc ctcgctgtcc 720 gggtgggtgt tcggcggggg aactaagctg accgtgctgg gt 762 <210> 57 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 57 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr 145 150 155 160 Val Ser Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Ile Tyr Gly 180 185 190 Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 195 200 205 Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp 210 215 220 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His Leu 225 230 235 240 Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 245 250 <210> 58 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid. <400> 58 caagtgcagc tgcagcagtc cggaggggga gtggtgcagc cgggacggtc actcagactg 60 tcctgcgccg cttcgggctt cactttctcc tcgtacgcta tgcattgggt ccgccaagcc 120 cccggaaagg gattggaatg ggtggcagtg attagctacg acggctcgaa caagtactac 180 gcggacagcg tcaaaggcag attcaccatt agccgagata acagcaagaa taccctgtac 240 ctccaaatga atagcctcag ggccgaggac acggctgtgt actactgcgc acgcgcgtca 300 gtcggcgcaa cgggtccatt cgacatctgg ggacagggaa ccatggtcac cgtgtcatcg 360 gcatcgactg gagggggagg ctctggagga gggggatcgg gtggcggagg gtcgggcgga 420 ggaggctcat catccgagtt gacccaagat ccggccgtgt ccgtggcgct ggggcagact 480 gtctccatca cttgccaagg agactcactg cgctcctact acgcctcgtg gtatcagcag 540 aaaccgggac aggctcctct gctcgtgatc tacggcgaaa acaatcggcc atcgggaatc 600 cctgaccgct ttagcggttc gagctccgga aacactgcga gcctgaccat cactggtgcc 660 caagccgagg atgaagcgga ctactactgc aactcgcggg attcctccgg gacccacctg 720 accgtgttcg gcgggggaac taagctgacc gtgctgggt 759 <210> 59 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid. <400> 59 caagtgcagc tggtgcagtc cggaggggga ctggtgcagc cgggaggctc actcagactg 60 tcctgcgccg cttcgggctt cactttctcc tcgtacgcta tgcattgggt ccgccaagcc 120 cccggaaagg gattggaatg ggtggcagtg attagctacg acggctcgaa caagtactac 180 gcggacagcg tcaaaggcag attcaccatt agccgagata acagcaagaa taccctgtac 240 ctccaaatga atagcctcag ggccgaggac acggctgtgt actactgcgc acgcgcgtca 300 gtcggcgcaa cgggtccatt cgacatctgg ggacagggaa ccctggtcac cgtgtcatcg 360 gcatcgactg gagggggagg ctctggagga gggggatcgg gtggcggagg gtcgggcgga 420 ggaggctcat catccgagtt gacccaaccc ccgtccgtgt ccgtggcccc ggggcagact 480 gtcactatca cttgccaagg agactcactg cgctcctact acgcctcgtg gtatcagcag 540 aaaccgggaa ccgctcctaa actcctgatc tacggcgaaa acaatcggcc atcgggagtg 600 cctgaccgct ttagcggttc gagctccgga acttctgcga gcctgaccat cactggtgcc 660 caagccgagg atgaagcgga ctactactgc aactcgcggg attcctccgg gacccacctg 720 accgtgttcg gcgggggaac taagctgacc gtgctgggt 759 <210> 60 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 60 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Pro Ala Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr 145 150 155 160 Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly 180 185 190 Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 195 200 205 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp 210 215 220 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His Leu 225 230 235 240 Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 245 250 <210> 61 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid. <400> 61 caagtgcagc tggtgcagtc cggaggggga ctggtgcagc cgggaggctc actcagactg 60 tcctgcgccg cttcgggctt cactttctcc tcgtacgcta tgcattgggt ccgccaagcc 120 cccggaaagg gactggaatg ggtgagcgtg attagcccgg cgggcaacaa cacctattat 180 gcggacagcg tcaaaggcag attcaccatt agccgagata acagcaagaa taccctgtac 240 ctccaaatga atagcctcag ggccgaggac acggctgtgt actactgcgc acgcgcgtca 300 gtcggcgcaa cgggtccatt cgacatctgg ggacagggaa ccctggtcac cgtgtcatcg 360 gcatcgactg gagggggagg ctctggagga gggggatcgg gtggcggagg gtcgggcgga 420 ggaggctcat catccgagtt gacccaaccc ccgtccgtgt ccgtggcccc ggggcagact 480 gtcactatca cttgccaagg agactcactg cgctcctact acgcctcgtg gtatcagcag 540 aaaccgggaa ccgctcctaa actcctgatc tacggcgaaa acaatcggcc atcgggagtg 600 cctgaccgct ttagcggttc gagctccgga acttctgcga gcctgaccat cactggtgcc 660 caagccgagg atgaagcgga ctactactgc aactcgcggg attcctccgg gacccacctg 720 accgtgttcg gcgggggaac taagctgacc gtgctgggt 759 <210> 62 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 62 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Pro Ala Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr 145 150 155 160 Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly 180 185 190 Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 195 200 205 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp 210 215 220 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His Leu 225 230 235 240 Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 245 250 <210> 63 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid. <400> 63 caagtgcagc tggtgcagtc cggaggggga ctggtgcagc cgggaggctc 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Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly 180 185 190 Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 195 200 205 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp 210 215 220 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His Leu 225 230 235 240 Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 245 250 <210> 67 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid. <400> 67 caagtgcagc tggtgcagtc cggaggggga ctggtgcagc cgggaggctc actcagactg 60 tcctgcgccg cttcgggctt cactttctcc tcgtacgcta tgcattgggt ccgccaagcc 120 cccggaaagg gactggaatg ggtgaccgtg attagcccgc atggccgcaa caaatattat 180 gcggacagcg tcaaaggcag attcaccatt agccgagata acagcaagaa taccctgtac 240 ctccaaatga atagcctcag ggccgaggac acggctgtgt actactgcgc acgcgcgtca 300 gtcggcgcaa cgggtccatt cgacatctgg ggacagggaa ccctggtcac cgtgtcatcg 360 gcatcgactg gagggggagg ctctggagga gggggatcgg gtggcggagg gtcgggcgga 420 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Ser 130 135 140 Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr 145 150 155 160 Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly 180 185 190 Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 195 200 205 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp 210 215 220 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His Leu 225 230 235 240 Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 245 250 <210> 75 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid. <400> 75 caagtgcagc tggtgcagtc cggaggggga ctggtgcagc cgggaggctc actcagactg 60 tcctgcgccg cttcgggctt cactttctcc tcgtacgcta tgcattgggt ccgccaagcc 120 cccggaaagg gactggaatg ggtgaccgtg attagcccga gcggccataa cacctattat 180 gcggacagcg tcaaaggcag attcaccatt agccgagata acagcaagaa taccctgtac 240 ctccaaatga atagcctcag ggccgaggac acggctgtgt actactgcgc acgcgcgtca 300 gtcggcgcaa 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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr 145 150 155 160 Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly 180 185 190 Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 195 200 205 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp 210 215 220 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His Leu 225 230 235 240 Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 245 250 <210> 77 <211> 804 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid. <400> 77 caagtgcagc tggtgcagtc cggaggggga ctggtgcagc cgggaggctc actcagactg 60 tcctgcgccg 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Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Val Ile Ser Pro Pro Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr 145 150 155 160 Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly 180 185 190 Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 195 200 205 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp 210 215 220 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His Leu 225 230 235 240 Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 245 250 <210> 93 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid. <400> 93 caagtgcagc tggtgcagtc cggaggggga ctggtgcagc cgggaggctc actcagactg 60 tcctgcgccg cttcgggctt cactttctcc tcgtacgcta tgcattgggt ccgccaagcc 120 cccggaaagg gactggaatg ggtgaccgtg attagcccgc cgggcagcaa caaatattat 180 gcggacagcg tcaaaggcag attcaccatt agccgagata acagcaagaa taccctgtac 240 ctccaaatga atagcctcag ggccgaggac acggctgtgt actactgcgc acgcgcgtca 300 gtcggcgcaa cgggtccatt cgacatctgg ggacagggaa ccctggtcac cgtgtcatcg 360 gcatcgactg gagggggagg ctctggagga gggggatcgg gtggcggagg gtcgggcgga 420 ggaggctcat catccgagtt gacccaaccc ccgtccgtgt ccgtggcccc ggggcagact 480 gtcactatca cttgccaagg agactcactg cgctcctact acgcctcgtg gtatcagcag 540 aaaccgggaa ccgctcctaa actcctgatc tacggcgaaa acaatcggcc atcgggagtg 600 cctgaccgct ttagcggttc gagctccgga acttctgcga gcctgaccat cactggtgcc 660 caagccgagg 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catccgagtt gacccaaccc ccgtccgtgt ccgtggcccc ggggcagact 480 gtcactatca cttgccaagg agactcactg cgctcctact acgcctcgtg gtatcagcag 540 aaaccgggaa ccgctcctaa actcctgatc tacggcgaaa acaatcggcc atcgggagtg 600 cctgaccgct ttagcggttc gagctccgga acttctgcga gcctgaccat cactggtgcc 660 caagccgagg atgaagcgga ctactactgc aactcgcggg attcctccgg gacccacctg 720 accgtgttcg gcgggggaac taagctgacc gtgctgggt 759 <210> 96 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 96 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Pro Pro Gly His Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr 145 150 155 160 Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly 180 185 190 Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 195 200 205 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp 210 215 220 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His Leu 225 230 235 240 Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 245 250 <210> 97 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid. <400> 97 caagtgcagc tggtgcagtc cggaggggga ctggtgcagc cgggaggctc actcagactg 60 tcctgcgccg cttcgggctt cactttctcc tcgtacgcta tgcattgggt ccgccaagcc 120 cccggaaagg gactggaatg ggtgagcgtg attagcccgc cgggccataa cacctattat 180 gcggacagcg 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actcctgatc tacggcgaaa acaatcggcc atcgggagtg 600 cctgaccgct ttagcggttc gagctccgga acttctgcga gcctgaccat cactggtgcc 660 caagccgagg atgaagcgga ctactactgc aactcgcggg attcctccgg gacccacctg 720 accgtgttcg gcgggggaac taagctgacc gtgctgggt 759 <210> 102 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 102 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Val Ile Ser Pro Gly Gly Pro Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 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cgggtccatt cgacatctgg ggacagggaa ccctggtcac cgtgtcatcg 360 gcatcgactg gagggggagg ctctggagga gggggatcgg gtggcggagg gtcgggcgga 420 ggaggctcat catccgagtt gacccaaccc ccgtccgtgt ccgtggcccc ggggcagact 480 gtcactatca cttgccaagg agactcactg cgctcctact acgcctcgtg gtatcagcag 540 aaaccgggaa ccgctcctaa actcctgatc tacggcgaaa acaatcggcc atcgggagtg 600 cctgaccgct ttagcggttc gagctccgga acttctgcga gcctgaccat cactggtgcc 660 caagccgagg atgaagcgga ctactactgc aactcgcggg attcctccgg gacccacctg 720 accgtgttcg gcgggggaac taagctgacc gtgctgggt 759 <210> 104 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 104 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu 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tcctgcgccg cttcgggctt cactttctcc tcgtacgcta tgcattgggt ccgccaagcc 120 cccggaaagg gattggaatg ggtggcagtg attagctacg acggctcgaa caagtactac 180 gcggacagcg tcaaaggcag attcaccatt agccgagata acagcaagaa taccctgtac 240 ctccaaatga atagcctcag ggccgaggac acggctgtgt actactgcgc acgcgcgtca 300 gtcggcgcaa cgggtccatt cgacatctgg ggacagggaa ccctggtcac cgtgtcatcg 360 gcatcgactg gagggggagg ctctggagga gggggatcgg gtggcggagg gtcgggcgga 420 ggaggctcat catccgagtt gacccaagat ccggccgtgt ccgtggcgct ggggcagact 480 gtctccatca cttgccaagg agactcactg cgctcctact acgcctcgtg gtatcagcag 540 aaaccgggac aggctcctct gctcgtgatc tacggcgaaa acaatcggcc atcgggaatc 600 cctgaccgct ttagcggttc gagctccgga aacactgcga gcctgaccat cactggtgcc 660 caagccgagg atgaagcgga ctactactgc aactcgcggg attcctccgg gacccacctg 720 accgtgttcg gcgggggaac taagctgacc gtgctgggt 759 <210> 106 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 106 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu 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actggtctgc aagccgagga tgaagcggac tactactgcc agtcgtacga ttcctccctc 720 tccgggtggg tgttcggcgg gggaactaag ctgaccgtgc tgggt 765 <210> 108 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 108 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Arg Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Met Thr Ser Asn Ala Phe Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser 130 135 140 Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Val 145 150 155 160 Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Glu 180 185 190 Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 195 200 205 Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu 210 215 220 Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His Leu Thr 225 230 235 240 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 245 250 <210> 109 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid. <400> 109 caagtgcagc tggtcgaatc cggaggggga ctggtgcagc cgggaggatc actcagactg 60 tcctgcgccg cttcgggctt cactttccgg tcgtacgcta tgtcctgggt ccgccaagcc 120 cccggaaagg gattggaatg ggtgtccgca attagcggac gcggcgataa cacttactac 180 gcggacagcg tcaaaggcag attcaccatt agccgagata acagcaagaa taccctgtac 240 ctccaaatga atagcctcag ggccgaggac acggctgtgt actactgcgc caagatgacc 300 tcgaacgcat ttgcgttcga ctactgggga cagggaaccc tggtcaccgt gtcatcggca 360 tcgactggag ggggaggctc tggaggaggg ggatcgggtg gcggagggtc 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caagtactac 180 gcggacagcg tcaaaggcag attcaccatt agccgagata acagcaagaa taccctgtac 240 ctccaaatga atagcctcag ggccgaggac acggctgtgt actactgcgc acgcgcgtca 300 gtcggcgcaa cgggtccatt cgacatctgg ggacagggaa ccatggtcac cgtgtcatcg 360 gcatcgactg gagggggagg ctctggagga gggggatcgg gtggcggagg gtcgggcgga 420 ggaggctcat catccgagtt gacccaaccg ccgtccgtgt ccgtggcccc cgggcagact 480 gtcactatca cttgccaagg agactcactg cgctcctact acgcctcgtg gtatcagcag 540 aaaccgggaa ccgctcctaa actcctgatc tacggcgaaa acaatcggcc atcgggagtg 600 cctgaccgct ttagcggttc gagctccgga acttctgcga gcctgaccat cactggtgcc 660 caagccgagg atgaagcgga ctactactgc aactcgcggg attcctccgg gacccacctg 720 accgtgttcg gcgggggaac taagctgacc gtgctgggt 759 <210> 112 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 112 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 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<210> 113 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid. <400> 113 caagtgcagc tgcagcagtc cggaggggga gtggtgcagc cgggacggtc actcagactg 60 tcctgcgccg cttcgggctt cactttctcc tcgtacgcta tgcattgggt ccgccaagcc 120 cccggaaagg gattggaatg ggtggcagtg attagctacg acggctcgaa caagtactac 180 gcggacagcg tcaaaggcag attcaccatt agccgagata acagcaagaa taccctgtac 240 ctccaaatga atagcctcag ggccgaggac acggctgtgt actactgcgc acgcgcgtca 300 gtcggcgcaa cgggtccatt cgacatctgg ggacagggaa ccatggtcac cgtgtcatcg 360 gcatcgactg gagggggagg ctctggagga gggggatcgg gtggcggagg gtcgggcgga 420 ggaggctcac aatccgtgtt gacccaaccg ccgtccgtgt ccggagcgcc cgggcagcgg 480 gtcaccatct cgtgcactgg ctcctcatcg aacatcggcg cgggctacgg cgtgcactgg 540 tatcagcagc tgccgggaac tgctcctaaa ctcctgatct acggcaacac caatcggcca 600 tcgggagtcc ctgaccgctt tagcggtttc aaatccggaa cctctgcgag cctggccatc 660 actggtctgc aagccgagga tgaagcggac tactactgcc aatcgtatga ttcctcactg 720 tccgggtggg tgttcggcgg gggaactaag ctgaccgtgc tgggt 765 <210> 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tcagcagaaa 540 ccgggacagg ctcctctgct cgtgatctac ggcgaaaaca atcggccatc gggaatccct 600 gaccgcttta gcggttcgag ctccggaaac actgcgagcc tgaccatcac tggtgcccaa 660 gccgaggatg aagcggacta ctactgcaac tcgcgggatt cctccgggac ccacctgacc 720 gtgttcggcg ggggaactaa gctgaccgtg ctgggt 756 <210> 116 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 116 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Arg Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr 145 150 155 160 Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly 180 185 190 Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 195 200 205 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp 210 215 220 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His Leu 225 230 235 240 Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 245 250 <210> 117 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid. <400> 117 caagtgcagc tggtcgaatc cggaggggga ctggtgcagc cgggaggctc actcagactg 60 tcctgcgccg cttcgggctt cactttctcc tcgtacgcta tgcattgggt ccgccaagcc 120 cccggaaagg gattggaatg ggtgtcggcc attagcggac ggggcgataa cacctactac 180 gcggacagcg tcaaaggcag attcaccatt agccgagata acagcaagaa taccctgtac 240 ctccaaatga atagcctcag ggccgaggac acggctgtgt actactgcgc acgcgcgtca 300 gtcggcgcaa cgggtccatt cgacatctgg ggacagggaa ccctggtcac cgtgtcatcg 360 gcatcgactg gagggggagg ctctggagga gggggatcgg gtggcggagg gtcgggcgga 420 ggaggctcat catccgagtt gacccaaccg ccgtccgtgt ccgtggcccc cgggcagact 480 gtcactatca cttgccaagg agactcactg cgctcctact acgcctcgtg gtatcagcag 540 aaaccgggaa cggctcctaa gctcctgatc tacggcgaaa acaatcggcc atcgggagtg 600 cctgaccgct ttagcggttc gagctccgga acttctgcga gcctgaccat cactggtgcc 660 caagccgagg atgaagcgga ctactactgc aactcgcggg attcctccgg gacccacctg 720 accgtgttcg gcgggggaac taagctgacc gtgctgggt 759 <210> 118 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide. <400> 118 Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg 1 5 10 15 Val Leu Ser Ser 20 <210> 119 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid. <400> 119 atgggctggt ctctgatcct gctgttcctg gtggccgtgg ccacgcgtgt gctctcgagc 60 <210> 120 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic 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PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 158 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Gly Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His 85 90 95 Leu Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 159 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 159 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Val Ile Ser Pro Ala Gly Pro Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 160 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 160 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Gly Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His 85 90 95 Leu Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 161 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 161 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Pro His Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 162 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 162 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Gly Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His 85 90 95 Leu Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 163 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 163 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Asn Asn Gly His Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 164 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 164 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Gly Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His 85 90 95 Leu Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 165 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 165 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Val Ile Ser Pro Pro Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 166 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 166 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Gly Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His 85 90 95 Leu Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 167 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 167 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Pro Ala Gly Thr Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 168 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 168 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Gly Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His 85 90 95 Leu Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 169 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 169 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Pro Pro Gly His Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 170 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 170 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Gly Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His 85 90 95 Leu Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 171 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 171 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Val Ile Ser His Asp Gly Thr Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 172 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 172 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Gly Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His 85 90 95 Leu Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 173 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 173 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Val Ile Ser Arg His Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 174 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 174 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Gly Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His 85 90 95 Leu Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 175 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 175 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Val Ile Ser Pro Gly Gly Pro Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 176 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 176 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Gly Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His 85 90 95 Leu Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 177 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 177 Ser Val Ile Ser Pro Ala Gly Asn Asn Thr 1 5 10 <210> 178 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 178 Ser Val Ile Ser Pro Ala Gly Arg Asn Lys 1 5 10 <210> 179 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 179 Thr Val Ile Ser Pro Asp Gly His Asn Thr 1 5 10 <210> 180 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 180 Thr Val Ile Ser Pro His Gly Arg Asn Lys 1 5 10 <210> 181 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 181 Ser Val Ile Ser Arg Arg Gly Asp Asn Lys 1 5 10 <210> 182 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 182 Ser Val Ile Ser Asn Asn Gly His Asn Lys 1 5 10 <210> 183 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 183 Ser Val Ile Ser Pro Ala Gly Pro Asn Thr 1 5 10 <210> 184 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 184 Thr Val Ile Ser Pro Ser Gly His Asn Thr 1 5 10 <210> 185 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 185 Thr Val Ile Ser Pro Asn Gly His Asn Thr 1 5 10 <210> 186 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 186 Ser Ala Ile Ser Pro Pro Gly His Asn Thr 1 5 10 <210> 187 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 187 Ala Val Ile Ser His His Gly Ser Asn Thr 1 5 10 <210> 188 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 188 Thr Val Ile Ser Pro Thr Gly Ala Asn Thr 1 5 10 <210> 189 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 189 Thr Val Ile Ser Pro Ala Gly Pro Asn Lys 1 5 10 <210> 190 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 190 Ser Val Ile Ser Pro His Gly Ser Asn Lys 1 5 10 <210> 191 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 191 Ser Val Ile Ser Asn Asn Gly His Asn Thr 1 5 10 <210> 192 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 192 Thr Val Ile Ser Pro Pro Gly Ser Asn Lys 1 5 10 <210> 193 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 193 Ser Val Ile Ser Pro Ala Gly Thr Asn Thr 1 5 10 <210> 194 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 194 Ser Val Ile Ser Pro Pro Gly His Asn Thr 1 5 10 <210> 195 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 195 Thr Val Ile Ser His Asp Gly Thr Asn Thr 1 5 10 <210> 196 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 196 Thr Val Ile Ser Arg His Gly Asn Asn Lys 1 5 10 <210> 197 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 197 Thr Val Ile Ser Pro Gly Gly Pro Asn Lys 1 5 10 <210> 198 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is S, T or A. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is A, or V. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is P, R, N or H. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid, and in some embodiments Xaa is A, D, H, N, P, S or T. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is any amino acid and in some embodiments Xaa is A, R, H, N or P. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is K or T. <400> 198 Xaa Xaa Ile Ser Xaa Xaa Gly Xaa Asn Xaa 1 5 10 <210> 199 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is S or T. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is P, R, or N. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid, and in some embodiments Xaa is A, D, H, N, P, S or T. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is H, N, R, T, A, D, P, or S. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is K or T. <400> 199 Xaa Val Ile Ser Xaa Xaa Gly Xaa Asn Xaa 1 5 10 <210> 200 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is S or T. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is P, R, or N. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid, and in some embodiments is A, D, H, N, P, S or T. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is H, N, R, or T. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is T or K. <400> 200 Xaa Val Ile Ser Xaa Xaa Gly Xaa Asn Xaa 1 5 10 <210> 201 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is S or T. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is V. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is P. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid, and in some embodiments is A, D, H, N, P, S or T. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is H, N, R, or T, and in some embodiments is A, R, H, N or P. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is T or K. <400> 201 Xaa Xaa Ile Ser Xaa Xaa Gly Xaa Asn Xaa 1 5 10 <210> 202 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 202 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 1 5 10

Claims (66)

  1. 항-A형 에프린 수용체 2(anti-Ephrin type-A receptor)(EphA2) 항체로서,
    VH 및 VL을 포함하되, 상기 VH는,
    아미노산 서열 SYAMH(서열번호 17)를 포함하는 VH CDR1;
    하기 17개 아미노산의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2:
    X17ISPX18GX19NX20YYADSVKG(서열번호 18),
    (식 중,
    X17은 A 또는 V이고;
    X18은 A, D, H, N, P, S 또는 T이고;
    X19는 A, R, H, N 또는 P이고;
    X20은 K 또는 T임);
    및
    아미노산 서열 ASVGATGPFDI(서열번호 19)를 포함하는 VH CDR3을 포함하고;
    상기 VL은,
    아미노산 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 20)를 포함하는 VL CDR1;
    아미노산 서열 GENNRPS(서열번호 21)를 포함하는 VL CDR2; 및
    아미노산 서열 NSRDSSGTHLTV(서열번호 22)를 포함하는 VL CDR3을 포함하며;
    상기 항체는 상기 EphA2의 세포외 도메인에 면역특이적으로 결합하는, 항-A형 에프린 수용체 2(EphA2) 항체.
  2. 폴리펩타이드로서, 단백질 A에 결합하고, 상기 폴리펩타이드는 하기 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드:
    a) Xa X17IS Xb X18GX19N X20(서열번호 198)(식 중,
    Xa는 S, T 또는 A이고;
    X17은 A 또는 V이고;
    Xb는 P, R, N 또는 H이고,
    X18 및 X19는 임의의 아미노산이고;
    X20은 K 또는 T임);
    b) Xa V I S Xb X18 G X19 N X20(서열번호 199)(식 중,
    Xa는 S 또는 T이고,
    Xb는 P, R 또는 N이고,
    X18은 임의의 아미노산이고;
    X19는 H, N, R, T, A, D, P 또는 S이고;
    X20은 K 또는 T임);
    c) Xa V I S Xb X18 G X19 N X20 (서열번호 200)(식 중,
    Xa는 S 또는 T이고,
    Xb는 P, R 또는 N이고,
    X18은 임의의 아미노산이고;
    X19는 H, N, R 또는 T이고;
    X20은 T 또는 K임);
    또는
    d) Xa X17 I S Xb X18 G X19 N X20 (서열번호 201)(식 중,
    Xa는 S 또는 T이고,
    X17은 V이고;
    Xb는 P이고,
    X18은 임의의 아미노산이고;
    X19는 H, N, R 또는 T이고;
    X20은 T 또는 K임).
  3. 제2항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 177 내지 197 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는,
    SYAMH(서열번호 17)의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
    서열번호 177 내지 201 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 A 결합 서열; 및
    ASVGATGPFDI(서열번호 19)의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드.
  5. VH 및 VL을 포함하는 항체로서, 상기 VH는 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 포함하는, 폴리펩타이드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체는 인간 또는 인간화된, 폴리펩타이드.
  7. 제5항에 있어서, 상기 항체는 인간 또는 인간화된, 폴리펩타이드.
  8. 제1항 또는 제6항에 있어서, 상기 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프레임워크 영역을 포함하는, 항체:
    (a) 아미노산 서열 QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 1)(식 중, X1은 E가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VH 프레임워크 영역 1(VH FR1),
    (b) 아미노산 서열 WVRQAPGKGLEWVX2(서열번호 2)(식 중, X2는 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 VH 프레임워크 영역 2(VH FR2),
    (c) 아미노산 서열 X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(서열번호 3)(식 중, X3은 Q가 아닌 아미노산이고, X4는 V가 아닌 아미노산이고, X5는 G가 아닌 아미노산이고, X6은 R이 아닌 아미노산이고, X7은 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VL 프레임워크 영역 1(VL FR1),
    (d) 아미노산 서열 X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(서열번호 4)(식 중, X8은 Q가 아닌 아미노산이거나, 또는 X9는 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VL 프레임워크 영역 1(VL FR1),
    (e) 아미노산 서열 WYQQX10PGTAPKLLIY(서열번호 5)(식 중, X10은 L이 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VL 프레임워크 영역 2(VL FR2), 및
    (f) 아미노산 서열 GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(서열번호 6)(식 중, X11은 F가 아닌 아미노산이거나, X12는 K가 아닌 아미노산이거나, X13은 A가 아닌 아미노산이거나, 또는 X14는 L이 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VL 프레임워크 영역 3(VL FR3), 및
    (g) 아미노산 서열 GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(서열번호 7)(식 중, X15는 F가 아닌 아미노산이거나, 또는 X16은 K가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VL 프레임워크 영역 3(VL FR3).
  9. 제5항 또는 제7항에 있어서, 상기 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프레임워크 영역을 포함하는, 항체:
    (a) 아미노산 서열 QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 1)(식 중, X1은 E가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VH 프레임워크 영역 1(VH FR1),
    (b) 아미노산 서열 WVRQAPGKGLEWV(서열번호 202)를 포함하는 인간 VH 프레임워크 영역 2(VH FR2),
    (c) 아미노산 서열 X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(서열번호 3)(식 중, X3은 Q가 아닌 아미노산이고, X4는 V가 아닌 아미노산이고, X5는 G가 아닌 아미노산이고, X6은 R이 아닌 아미노산이고, X7은 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VL 프레임워크 영역 1(VL FR1),
    (d) 아미노산 서열 X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(서열번호 4)(식 중, X8은 Q가 아닌 아미노산이거나, 또는 X9는 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VL 프레임워크 영역 1(VL FR1), 및/또는
    (e) 아미노산 서열 WYQQX10PGTAPKLLIY(서열번호 5)(식 중, X10은 L이 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VL 프레임워크 영역 2(VL FR2), 및
    (f) 아미노산 서열 GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(서열번호 6)(식 중, X11은 F가 아닌 아미노산이거나, X12는 K가 아닌 아미노산이거나, X13은 A가 아닌 아미노산이거나, 또는 X14는 L이 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VL 프레임워크 영역 3(VL FR3), 및
    (g) 아미노산 서열 GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(서열번호 7)(식 중, X15는 F가 아닌 아미노산이거나, X16은 K가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VL 프레임워크 영역 3(VL FR3).
  10. 제1항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 8)를 포함하는 VH FR1을 포함하는, 항체.
  11. 제1항 또는 제6항에 있어서, 상기 VH FR2는 아미노산 서열 WVRQAPGKGLEWVA(서열번호 9) 또는 WVRQAPGKGLEWVT(서열번호 10)를 포함하는, 항체.
  12. 제1항 및 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(서열번호 3)를 포함하는 VL FR1을 포함하되, X3은 Q가 아닌 아미노산이고, X4는 V가 아닌 아미노산이고, X5는 G가 아닌 아미노산이고, X6은 R이 아닌 아미노산이고, X7은 S가 아닌 아미노산인, 항체.
  13. 제1항 및 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(서열번호 3)를 포함하는 VL FR1을 포함하되, X3은 S이고, X4는 E이고, X5는 V이고, X6은 T이고, X7은 T인, 항체.
  14. 제1항 및 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(서열번호 4)를 포함하는 VL FR1을 포함하되, X8은 Q가 아닌 아미노산이고, X9는 S가 아닌 아미노산인, 항체.
  15. 제1항 및 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(서열번호 4)를 포함하는 VL FR1이되, X8은 S이거나 또는 X9는 T인, 항체.
  16. 제1항 및 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(서열번호 4)를 포함하는 VL FR1이되, X8은 S이고, X9는 T인, 항체.
  17. 제1항 및 제5항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 WYQQX10PGTAPKLLIY(서열번호 5)를 포함하는 VL FR2를 포함하되, X10은 L이 아닌 아미노산인, 항체.
  18. 제1항 및 제5항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 WYQQX10PGTAPKLLIY(서열번호 5)를 포함하는 VL FR2를 포함하되, X10은 K인, 항체.
  19. 제1항 및 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(서열번호 6)를 포함하는 VL FR3을 포함하되, X11은 F가 아닌 아미노산이고, X12는 K가 아닌 아미노산이고, X13은 A가 아닌 아미노산이고, X14는 L이 아닌 아미노산인, 항체.
  20. 제1항 및 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(서열번호 6)를 포함하는 VL FR3을 포함하되, X11은 S이거나, X12는 S이거나, X13은 T이거나, 또는 X14는 A인, 항체.
  21. 제1항 및 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(서열번호 7)를 포함하는 VL 프레임워크 영역 3(VL FR3)을 포함하되, X15는 F가 아닌 아미노산이고, X16은 K가 아닌 아미노산인, 항체.
  22. 제1항 및 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(서열번호 7)를 포함하는 VL FR3이되, X15는 S이거나 또는 X16은 G인, 항체.
  23. 제1항 및 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(서열번호 7)를 포함하는 VL 프레임워크 영역 3(VL FR3)을 포함하되, X15는 S이고, X16은 G인, 항체.
  24. 제1항 또는 제6항에 있어서, 하기를 포함하는 항체:
    아미노산 서열 QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 1)(식 중, X1은 E가 아닌 아미노산임)를 포함하는 VH 프레임워크 영역 1(VH FR1);
    아미노산 서열 WVRQAPGKGLEWVX2(서열번호 2)(식 중, X2는 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 VH 프레임워크 영역 2(VH FR2);
    아미노산 서열 X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(서열번호 3)(식 중, X3은 Q가 아닌 아미노산이고, X4는 V가 아닌 아미노산이고, X5는 G가 아닌 아미노산이고, X6은 R이 아닌 아미노산이고, X7은 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 VL 프레임워크 영역 1(VL FR1);
    아미노산 서열 WYQQX10PGTAPKLLIY(서열번호 5)(식 중, X10은 L이 아닌 아미노산임)를 포함하는 VL 프레임워크 영역 2(VL FR2); 및
    아미노산 서열 GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(서열번호 6)(식 중, X11은 F가 아닌 아미노산이고, X12는 K가 아닌 아미노산이고, X13은 A가 아닌 아미노산이고, X14는 L이 아닌 아미노산임)를 포함하는 VL 프레임워크 영역 3(VL FR3).
  25. 제1항, 제6항 및 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는, 항체:
    아미노산 서열 QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 1)(식 중, X1은 E가 아닌 아미노산임)를 포함하는 VH 프레임워크 영역 1(VH FR1);
    아미노산 서열 WVRQAPGKGLEWVX2(서열번호 2)(식 중, X2는 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 VH 프레임워크 영역 2(VH FR2);
    아미노산 서열 X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(서열번호 4)(식 중, X8은 Q가 아닌 아미노산이거나, 또는 X9는 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 VL 프레임워크 영역 1(VL FR1); 및
    아미노산 서열 GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(서열번호 7)(식 중, X15는 F가 아닌 아미노산이고, X16은 K가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VL 프레임워크 영역 3(VL FR3).
  26. 제5항 또는 제7항에 있어서, 하기를 포함하는, 항체:
    아미노산 서열 QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 1)(식 중, X1은 E가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VH 프레임워크 영역 1(VH FR1);
    아미노산 서열 WVRQAPGKGLEWVX2(서열번호 2)(식 중, X2는 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 VH 프레임워크 영역 2(VH FR2);
    아미노산 서열 X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(서열번호 3)(식 중, X3은 Q가 아닌 아미노산이고, X4는 V가 아닌 아미노산이고, X5는 G가 아닌 아미노산이고, X6은 R이 아닌 아미노산이고, X7은 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 VL 프레임워크 영역 1(VL FR1);
    아미노산 서열 WYQQX10PGTAPKLLIY(서열번호 5)(식 중, X10은 L이 아닌 아미노산임)를 포함하는 VL 프레임워크 영역 2(VL FR2); 및
    아미노산 서열 GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(서열번호 6)(식 중, X11은 F가 아닌 아미노산이고, X12는 K가 아닌 아미노산이고, X13은 A가 아닌 아미노산이고, X14는 L이 아닌 아미노산임)를 포함하는 VL 프레임워크 영역 3(VL FR3).
  27. 제5항, 제6항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는, 항체:
    아미노산 서열 QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 1)(식 중, X1은 E가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VH 프레임워크 영역 1(VH FR1);
    아미노산 서열 WVRQAPGKGLEWVX2(서열번호 2)(식 중, X2는 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 VH 프레임워크 영역 2(VH FR2);
    아미노산 서열 X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(서열번호 4)(식 중, X8은 Q가 아닌 아미노산이거나, 또는 X9는 S가 아닌 아미노산임)를 포함하는 VL 프레임워크 영역 1(VL FR1); 및
    아미노산 서열 GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(서열번호 7)(식 중, X15는 F가 아닌 아미노산이고, X16은 K가 아닌 아미노산임)를 포함하는 인간 VL 프레임워크 영역 3(VL FR3).
  28. 제1항 및 제5항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 시차 주사 형광측정법(differential scanning fluorimetry)을 사용하여 측정되는 경우 67℃ 이상의 용융 온도(Tm)를 갖는, 항체.
  29. 제1항 및 제5항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 항체인, 항체.
  30. 제1항 및 제5항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단일 쇄 Fv(scFv), IgG, Fab, (Fab)2, 또는 (scFv')2인, 항체.
  31. 제1항 및 제5항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 scFv인, 항체.
  32. 제1항 및 제5항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH CDR2의 상기 X17은 V이고; X18은 H 또는 D이며; X19는 H 또는 N이고; X20은 T인, 항체.
  33. 제1항 및 제5항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH CDR2는 하기로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항체:
    a. VISPAGNNTYYADSVKG(서열번호 23),
    b. VISPAGRNKYYADSVKG(서열번호 24),
    c. VISPDGHNTYYADSVKG(서열번호 25),
    d. VISPHGRNKYYADSVKG(서열번호 26),
    e. VISRRGDNKYYADSVKG(서열번호 27),
    f. VISNNGHNKYYADSVKG(서열번호 28),
    g. VISPAGPNTYYADSVKG(서열번호 29),
    h. VISPSGHNTYYADSVKG(서열번호 30),
    i. VISPNGHNTYYADSVKG(서열번호 31),
    j. AISPPGHNTYYADSVKG(서열번호 32),
    k. VISPTGANTYYADSVKG(서열번호 33),
    l. VISPHGSNKYYADSVKG(서열번호 34),
    m. VISNNGHNTYYADSVKG(서열번호 35),
    n. VISPAGTNTYYADSVKG(서열번호 36),
    o. VISPPGHNTYYADSVKG(서열번호 37),
    p. VISHDGTNTYYADSVKG(서열번호 38),
    q. VISRHGNNKYYADSVKG(서열번호 39), 및
    r. VISYDGSNKYYADSVKG(서열번호 40).
  34. 항체로서,
    아미노-말단에서 카복시-말단 순서로 하기를 포함하는 VH 서열:
    (i) VH FR1 서열 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 1),
    (ii) VH CDR1 SYAMH(서열번호 10),
    (iii) VH FR2 서열 WVRQAPGKGLEWVT(서열번호 3) 또는
    VH FR2 서열 WVRQAPGKGLEWVA(서열번호 2) 중 어느 하나,
    (iv) VH CDR2 서열 X17ISPX18GX19NX20YYADSVKG(서열번호 11),
    (v) VH FR3 서열 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(서열번호 4),
    (vi) VH CDR3 서열 ASVGATGPFDI(서열번호 12),
    (vii) VH FR4 서열 WGQGTLVTVSS(서열번호 5),
    및
    아미노-말단에서 카복시-말단 순서로 하기를 포함하는 VL 서열:
    (viii) VL FR1 서열 SSELTQPPSVSVAPGQTVTITC(서열번호 6),
    (ix) VL CDR1 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 13),
    (x) VL FR2 서열 WYQQKPGTAPKLLIY(서열번호 7),
    (xi) VL CDR2 서열 GENNRPS(서열번호 14),
    (xii) VL FR3 서열 GVPDRFSGSSSGTSASLTITGAQAEDEADYYC(서열번호 8),
    (xiii) VL CDR3 서열 NSRDSSGTHLTV(서열번호 15),
    (xiv) VL FR4 서열 FGGGTKLTVLG(서열번호 9)
    을 포함하되,
    X17은 A 또는 V이고; X18은 A, D, H, N, P, S 또는 T이며; X19는 A, R, H 또는 P이고; X20은 K 또는 T인, 항체.
  35. 제34항에 있어서, 상기 VH CDR2는 하기로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항체:
    a. VISPAGNNTYYADSVKG(서열번호 23),
    b. VISPAGRNKYYADSVKG(서열번호 24),
    c. VISPDGHNTYYADSVKG(서열번호 25),
    d. VISPHGRNKYYADSVKG(서열번호 26),
    e. VISRRGDNKYYADSVKG(서열번호 27),
    f. VISNNGHNKYYADSVKG(서열번호 28),
    g. VISPAGPNTYYADSVKG(서열번호 29),
    h. VISPSGHNTYYADSVKG(서열번호 30),
    i. VISPNGHNTYYADSVKG(서열번호 31),
    j. AISPPGHNTYYADSVKG(서열번호 32),
    k. VISPTGANTYYADSVKG(서열번호 33),
    l. VISPHGSNKYYADSVKG(서열번호 34),
    m. VISNNGHNTYYADSVKG(서열번호 35),
    n. VISPAGTNTYYADSVKG(서열번호 36),
    o. VISPPGHNTYYADSVKG(서열번호 37),
    p. VISHDGTNTYYADSVKG(서열번호 38),
    q. VISRHGNNKYYADSVKG(서열번호 39), 및
    r. VISYDGSNKYYADSVKG(서열번호 40).
  36. 항체로서, VH 및 VL을 포함하되, 상기 VH 및 VL은,
    서열번호 60의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv1],
    서열번호 62의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv2],
    서열번호 64의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv3],
    서열번호 66의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv4],
    서열번호 68의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv5],
    서열번호 70의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv6],
    서열번호 72의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv7],
    서열번호 74의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv8],
    서열번호 76의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv9],
    서열번호 78의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv10],
    서열번호 80의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv11],
    서열번호 82의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv12],
    서열번호 84의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv13],
    서열번호 86의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv14],
    서열번호 88의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv15],
    서열번호 90의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv16],
    서열번호 92의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv17],
    서열번호 94의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv18],
    서열번호 96의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv19],
    서열번호 98의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv20],
    서열번호 100의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv21] 또는,
    서열번호 102의 VH 및 VL의 아미노산 서열[scFv22]과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  37. scFv인 항체로서,
    VH를 포함하되, 상기 VH는,
    아미노산 서열 SYAMH(서열번호 17)를 갖는 VH CDR1;
    하기 18개의 아미노산 서열 중 하나를 갖는 VH CDR2:
    (I) VISPAGNNTYYADSVKG(서열번호 23),
    (II) VISPAGRNKYYADSVKG(서열번호 24),
    (III) VISPDGHNTYYADSVKG(서열번호 25),
    (IV) VISPHGRNKYYADSVKG(서열번호 26),
    (V) VISRRGDNKYYADSVKG(서열번호 27),
    (VI) VISNNGHNKYYADSVKG(서열번호 28),
    (VII) VISPAGPNTYYADSVKG(서열번호 29),
    (VIII) VISPSGHNTYYADSVKG(서열번호 30),
    (IX) VISPNGHNTYYADSVKG(서열번호 31),
    (X) AISPPGHNTYYADSVKG(서열번호 32),
    (XI) VISPTGANTYYADSVKG(서열번호 33),
    (XII) VISPHGSNKYYADSVKG(서열번호 34),
    (XIII) VISNNGHNTYYADSVKG(서열번호 35),
    (XIV) VISPAGTNTYYADSVKG(서열번호 36),
    (XV) VISPPGHNTYYADSVKG(서열번호 37),
    (XVI) VISHDGTNTYYADSVKG(서열번호 38),
    (xvii) VISRHGNNKYYADSVKG(서열번호 39), 또는
    (xviii) VISYDGSNKYYADSVKG(서열번호 40); 및
    아미노산 서열 ASVGATGPFDI(서열번호 19)를 갖는 VH CDR3을 포함하며;
    상기 VH CDR은 하기 아미노에서 카복실 말단 순서: VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3으로 존재하고,
    그리고 상기 scFv는, VL을 더 포함하되, 상기 VL은,
    아미노산 서열 QGDSLRSYYAS(서열번호 20)를 갖는 VL CDR1;
    아미노산 서열 GENNRPS(서열번호 21)를 갖는 VL CDR2, 및
    아미노산 서열 NSRDSSGTHLTV(서열번호 22)을 갖는 VL CDR3을 더 포함하며;
    상기 VL CDR은 하기 아미노에서 카복실 말단 순서: VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3로 존재하고;
    상기 scFv는,
    VH FR1 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 8)
    VH FR2 WVRQAPGKGLEWVA(서열번호 9)
    VH FR3 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(서열번호 11)
    VH FR4 WGQGTLVTVSS(서열번호 12)
    VL FR1 SSELTQPPSVSVAPGQTVTITC(서열번호 13)
    VL FR2 WYQQKPGTAPKLLIY(서열번호 14)
    VL FR3 GVPDRFSGSSSGTSASLTITGAQAEDEADYYC(서열번호 15)
    및
    VL FR4 FGGGTKLTVLG(서열번호 16)를 포함하는 인간 프레임워크를 더 포함하며,
    그리고 상기 항체는 A형 에프린 수용체 2(EphA2)의 세포외 도메인에 면역특이적으로 결합하는, scFv인 항체.
  38. 제37항에 있어서, 상기 VH는 상기 VL에 대해서 아미노 말단인, scFv인 항체.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 scFv는 적어도 약 67℃의 Tm을 나타내는, scFv인 항체.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 scFv는 적어도 약 70℃의 Tm을 나타내는, scFv인 항체.
  41. 제1항 및 제5항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH는 상기 VL에 대해서 아미노 말단이고, 10 내지 30개 아미노산 길이의 폴리펩타이드 링커에 의해서 상기 VL에 결합된, 항체.
  42. 제1항 및 제5항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 하기로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항체:
    ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 41),
    GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 42),
    GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 43),
    ASTGGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (서열번호 44),
    GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(서열번호 45),
    TPSHNSHQVPSAGGPTANSGTSGS(서열번호 46), 및
    GGSSRSSSSGGGGSGGGG(서열번호 47).
  43. 제42항에 있어서, 상기 scFv 링커는 아미노산 서열 ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 41)를 포함하는, 항체.
  44. 항체로서, VH 및 VL을 포함하되, 상기 VH는 서열번호 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173 또는 175의 아미노산 서열에 대해서 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  45. 제44항에 있어서, 상기 VL은 서열번호 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174 또는 176의 아미노산 서열에 대해서 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  46. 항체로서, 하기 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 scFv인, 항체:
    서열번호 60[scFv1],
    서열번호 62[scFv2],
    서열번호 64[scFv3],
    서열번호66[scFv4],
    서열번호 68[scFv5],
    서열번호 70[scFv6],
    서열번호 72[scFv7].
    서열번호 74[scFv8],
    서열번호 76[scFv9],
    서열번호 78[scFv10],
    서열번호 80[scFv11],
    서열번호 82[scFv12],
    서열번호 84[scFv13],
    서열번호 86[scFv14],
    서열번호 88[scFv15],
    서열번호 90[scFv16],
    서열번호 92[scFv17],
    서열번호 94[scFv18],
    서열번호 96[scFv19],
    서열번호 98[scFv20],
    서열번호 100[scFv21], 또는
    서열번호 102[scFv22].
  47. 제1항 및 제5항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단에서, Gly Gly Ser Gly Gly Cys(서열번호 54)를 더 포함하는, 항체 또는 scFv.
  48. 제1항 및 제5항 내지 제47항 중 어느 한 항의 항체 또는 scFv; 및 상기 항체에 접합된 모이어티를 포함하는, 항체 접합체.
  49. 제48항에 있어서, 상기 모이어티는 지질성 나노입자인, 접합체.
  50. 제49항에 있어서, 상기 지질성 나노입자는 리포솜인, 접합체.
  51. 제48항에 있어서, 상기 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는, 접합체.
  52. 제48항에 있어서, 상기 모이어티는 치료제를 포함하는, 접합체.
  53. 제52항에 있어서, 상기 치료제는 세포독성제인, 접합체.
  54. 제48항에 있어서, 상기 모이어티는 검출 가능한 표지를 포함하는, 접합체.
  55. 제54항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 생체내 영상화제인, 접합체.
  56. 하기를 포함하는, 조성물:
    제1항 및 제5항 내지 제55항 중 어느 한 항의 항체, scFv 또는 항체 접합체; 및
    약제학적으로 허용 가능한 담체.
  57. 제56항에 있어서, 상기 조성물은 비경구 투여를 위해서 제형화된, 조성물.
  58. 제56항 또는 제57항의 조성물을 용기 내에 포함하는 키트.
  59. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 항체, 폴리펩타이드 또는 scFv를 암호화하는 핵산.
  60. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 항체 또는 scFv의 가변 경쇄 폴리펩타이드, 가변 중쇄 폴리펩타이드 또는 둘 모두를 암호화하는 단리된 핵산.
  61. 하기를 포함하는, 발현 벡터:
    제59항 또는 제60항의 핵산; 및
    상기 핵산에 작동 가능하게 연결된 진핵생물 프로모터.
  62. 제61항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  63. 제62항에 있어서, 상기 세포는 가변 경쇄 폴리펩타이드, 가변 중쇄 폴리펩타이드 또는 둘 모두를 발현시키는, 숙주 세포.
  64. EphA2-발현 암을 갖는 대상체의 치료 방법으로서,
    EphA2-발현 암을 갖는 대상체에게 제1항 및 제5항 내지 제55항 중 어느 한 항의 항체, scFv 또는 항체 접합체 또는 제56항 또는 제57항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, EphA2-발현 암을 갖는 대상체의 치료 방법.
  65. EphA2-발현 암의 치료에 사용하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 제1항 및 제5항 내지 제55항 중 어느 한 항의 항체, scFv 또는 항체 접합체 또는 제56항 또는 제57항의 조성물을 포함하는, 조성물.
  66. EphA2-발현 암의 치료에서의 조성물의 용도로서, 상기 조성물은 제1항 및 제5항 내지 제55항 중 어느 한 항의 항체, scFv 또는 항체 접합체 또는 제56항 또는 제57항의 조성물을 포함하는, 용도.
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