KR20180121904A - 에프린 수용체 A2 (EphA2)-표적화된 도세탁셀-생성 나노-리포좀 조성물 - Google Patents

에프린 수용체 A2 (EphA2)-표적화된 도세탁셀-생성 나노-리포좀 조성물 Download PDF

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Abstract

도세탁셀 전달용 EphA2-표적화된 면역리포좀은 특정 유형의 암 치료에서 유용하다. 면역리포좀은 EphA2 표적화 모이어티 (예를 들면, scFv)를 포함할 수 있고 약 100 nm의 평균 크기를 갖는 리포좀 안에서 안정적인 염 형태로 도세탁셀 전구약물을 캡슐화할 수 있다. 나노리포좀 (면역리포좀 포함) 속으로 장입에 적합한 신규한 도세탁셀 전구약물은, EphA2-표적화된 독소루비신-생성 면역리포좀 요법의 제조용 신규한 및 다른 유용한 EphA2 표적화 모이어티와 함께, 제공된다. 하나 이상의 도세탁셀 전구약물을 캡슐화하는 나노리포좀, 및/또는 EphA2 결합 모이어티를 포함하고 하나 이상의 도세탁셀 전구약물을 캡슐화하는 면역리포좀 또는 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물은 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 암 치료용 환자에 투여에 유용하다.

Description

에프린 수용체 A2 (EphA2)-표적화된 도세탁셀-생성 나노-리포좀 조성물
교차-참조
본 특허 출원은, 그 전체가 참고로 본 명세서에서 각각 편입되는, 각각의 하기 계류 미국 가특허 출원에 우선권을 주장한다: 62/309,222 (2016년 3월 16일 출원), 62/322,940 (2016년 4월 15일 출원), 62/338,052 (2016년 5월 18일 출원), 62/419,012 (2016년 11월 8일 출원) 및 62/464,538 (2017년 2월 28일 출원).
서열 목록
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기술 분야
본 개시내용은, EphA2-양성 암의 치료에서 유용한, 에프린 수용체 A2 (EphA2)에 결합하고 도세탁셀을 전달하는 나노리포좀에 관한 것이다.
에프린 수용체는 신호전달을 매개하는 그리고 뉴런의 반발, 세포 이동 및 혈관신생에 연루되는 세포 대 세포 접착 분자이다. EphA2는 몇 개의 고체 종양에서 고도로 과발현된 세포-세포 접합 단백질의 에프린 계열의 일부이다. 에프린 수용체 A2 (EphA2)는 특정 고체 종양에서 과발현되고, 특정 암 병태에서 좋지 못한 예측과 관련된다. Eph 수용체는 N-말단 리간드 결합 도메인의 상동성에 기반하여 2 그룹 (A 및 B)로 분할된 티로신 키나제 수용체의 큰 계열로 구성된다. Eph 수용체는 세포 성장, 이동 및 분화를 제어하는 몇 개의 핵심 신호전달 경로에 관여된다. 이들 수용체는 그것의 리간드가 인접하는 세포의 표면에 결합한다는 점에서 독특하다. Eph 수용체 및 그것의 리간드는 발생 동안 발현의 특정 패턴을 표시한다. 예를 들어, EphA2 수용체는 배아 발생 동안 신경 시스템에서 그리고 또한 성인의 상피성 세포 증식의 표면상에 발현된다. EphA2는 또한, 리간드 에프린 A1을 통해 매개된, 혈관신생 및 종양 혈관형성에서 중요한 역할을 한다. 게다가, EphA2는 요상피, 유방, 위/GEJ, 두경부, 비-소세포 폐, 난소, 췌장 및 전립선 암종을 포함하는 다양한 인간 종양에서 과발현된다. EphA2의 발현은 또한 종양 혈관에서 역시 검출될 수 있다.
탁산이 치유적 또는 일시적 처방 셋팅 어느 한쪽에서 고체 종양을 치료하는데 널리 사용되는 반면, 요법의 일선 또는 후선에서, 도세탁셀 용량-반응 관계의 분석은 더 고 용량이 고 반응으로 이어질 것이고 또한 더 고 독성으로 이어질 것이라는 것을 강하게 시사한다. 이것은 유사하게 정상 조직에서 고 노출로 이어지는 도세탁셀의 장기 및 세포 특이성의 결핍 그리고 간접적으로 더 고 용량을 요구하는 상대적으로 짧은 순환 반감기에 관련된다. 특정 암 병태의 개선된 치료를 허용하는 치료적 탁산 조성물이 필요하다.
요약
출원인은, 향상된 투과도 및 유지를 통해 장기 특이성을 활용할 수 있는, 뿐만 아니라 나노리포좀 막에 공유 결합된 EphA2 표적화 모이어티를 통해 세포 특이성을 활용할 수 있는, 종양에 도세탁셀 전달용 신규한 EphA2 표적화된 나노리포좀을 발견하였다.
자유 도세탁셀의 약동학적 제한 및 세포 특이성의 결핍 처리의 목표로, 우리는, 광범위한 종양에서 과발현되는 에프린 수용체 A2 (EphA2)에 대해 표적화된, 신규한 도세탁셀-기반된 나노리포좀을 개발하였다. 이들 EphA2-표적화된 도세탁셀-생성 리포좀은 고체 종양에서 축적 이후 도세탁셀의 지속 방출을 제공한다. 전임상 모델은 EphA2-표적화된 도세탁셀-생성 리포좀이 향상된 투과도 및 유지 효과를 통해 종양-특이적 축적, 그리고 리포좀의 표면에 콘주게이션된 특정 scFv 항체 단편을 가진 EphA2의 활성 표적화를 통해 세포 특이성을 활용한다는 것을 실증하였다.
약동학적 및 체내분포 연구는 자유 도세탁셀과 EphA2 표적화된 도세탁셀-생성 나노리포좀을 비교하기 위해 마우스 및 랫트에서 수행되었다. 만성 내성 연구는 전반적인 동물 건강, 뿐만 아니라 혈액학적 독성을 집중하여 설치류 및 비-설치류 모델에서 수행되었다. 유방, 폐 및 전립선 이종이식편의 몇 개의 세포-유래된 모델은 EphA2-표적화된 도세탁셀-생성 리포좀과 자유 (즉, 리포좀에서가 아닌) 도세탁셀 사이 차이를 평가하는데 사용되었다.
EphA2 표적화된 도세탁셀-생성 나노리포좀 조성물은 종양 부위에서 장기적인 노출로 자유 도세탁셀보다 상당히 더 긴 반감기를 가졌다. 만성 내성 연구에서, 특정 EphA2 표적화된 도세탁셀-생성 나노리포좀 조성물은, 자유 도세탁셀 및 검출불가능한 혈액 독성에 대하여 20 mpk에 비교된, 적어도 120 mpk (즉, mg 약물 / kg 동물 체중)의 최대 용인된 용량을 가진 자유 도세탁셀보다 6-7 배 더 양호하게 용인되는 것으로 알려졌다. 등독성 투약에서, 특정 EphA2 표적화된 도세탁셀-생성 나노리포좀 조성물 50 mpk는 몇 개의 유방, 폐 및 전립선 이종이식편 모델에서 도세탁셀 10 mpk보다 더 큰 활성을 보여주었다.
우리는, 장기 및 세포 표적화를 가능하게 하는, 장기적인 순환 시간 및 느리고 지속된 약물 방출 동력학을 가진 신규한 EphA2 표적화된 도세탁셀 나노리포좀을 개발하였다. 특정 EphA2 표적화된 도세탁셀-생성 나노리포좀 조성물은 설치류 및 비-설치류 모델에서 자유 도세탁셀로 치료시 관측된 혈액학적 독성을 극복할 수 있었다. 특정 EphA2 표적화된 도세탁셀-생성 나노리포좀 조성물은 또한 몇 개의 세포 유래된 이종이식편 모델에서 종양 퇴행을 유도 또는 종양 성장을 제어할 수 있었고, 대부분의 모델에서 자유 도세탁셀보다 더욱 활성인 것으로 밝혀졌다.
생체외 세포에 표적화된 리포좀의 결합은 큰 패널 세포주에서 유세포측정을 이용하여 평가되었다. 3D 스페로이드는 표적화 뿐만 아니라 리포좀 침투를 평가하는데 사용되었다. 생체내 리포좀 미세분포 표적화의 효과를 시험하기 위해, 1차 및 전이성 종양 보유 동물은 2개의 상이한 친유성 형광 염료로 표지된 EphA2-표적화된 리포좀 (EphA2-Ls) 및 비-표적화된 리포좀 (NT-Ls)의 혼합물로 주사되었다. 조직은 형광 현미경검사를 이용하여 평가되었다. 효능에 EphA2-표적화의 기여를 평가하기 위해, 4개 위 이종이식편 모델은, 자유 도세탁셀에 비교된 경우, 시험된 EphA2 표적화된 도세탁셀-생성 나노리포좀 조성물 또는 비-표적화된 버전의 약물 어느 한쪽으로 치료되었다.
세포 현탁액 모델에서, 우리는, 리포좀 세포 회합에서 100-배 초과 증가로, EphA2-Ls에 대하여 고수준의 특이성을 관측하였다. 3D 스페로이드 검정은 EphA2-Ls가 EphA2+ 스페로이드를 결합 및 침투시키고, 반면 비-표적화된 리포좀이 최소 침투를 보여준다는 것을 나타냈다. EphA2-Ls/NT-Ls 혼합물의 주사 이후 삼중 음성 유방 및 식도 종양 모델에서 조직 미세분포 분석은 리포좀의 미세분포에서 표적 매개된 시프트를 보여주었다. EphA2-Ls는 병변 이내 더 깊이 침투하였고 반면 NT-Ls는 미세맥관구조에 가까운 영역에서 높은 수준으로 침착하였다. 미세분포에서 상기 표적 매개된 시프트는 또한, 파종성 종양 세포를 잠재적으로 매칭시키는 분포의 패턴으로, 폐 전이 모델에서 관측되었다. 동일한 동물에서, 표적화는 정상 장기 예컨대 간, 비장 및 피부내 미세분포에 영향을 주지 않았다. 위 및 식도 암의 4개 모델은 세포 표적화와 종양 성장 조절 사이 잠재적인 링크를 시험하는데 사용되었다. 도세탁셀 전구약물을 캡슐화하는 비-표적화된 리포좀 및 EphA2 표적화된 도세탁셀-생성 나노리포좀 조성물이 모두 대부분의 모델에서 퇴행으로 이어지는 종양 성장을 제어할 수 있는 반면, 4개 모델 중 3개에서, 25 mpk에서 도세탁셀 전구약물을 캡슐화하는 비-표적화된 리포좀과 EphA2 표적화된 도세탁셀-생성 나노리포좀 조성물 사이 통계적으로 유의차가 있었다. 바이오마커 분석은 표적화를 매개하는데 필요한 핵심 파라미터를 평가 진행중이다.
결론적으로, 데이터는 2D 세포 현탁액, 3D 스페로이드, 및 1차 뿐만 아니라 생체내 전이성 종양 모델에서 표적화의 명백한 입증을 시사한다. 생체내 효능 데이터는 몇 개의 위 암 모델에서 종양 성장 조절 및 퇴행에 EphA2 표적화의 기여의 입증을 보여주었다.
도 1A는 EphA2 결합 모이어티 (항-EphA2 scFv PEG-DSPE)를 포함하는 도세탁셀-생성 리포좀의 개략도이다.
도 1B는 포획제로서 수크로스 옥타설페이트 (SOS)를 포함하는 리포좀 속에 도세탁셀 전구약물 장입의 공정, 및 도세탁셀 생성의 공정을 보여주는 개략도이다. 저 pH 환경과 조합된 경우 리포좀 내측에서 염의 불용해성은 활성 도세탁셀에 미성숙한 전환을 감소 또는 예방하기 위해 전구약물을 안정화시킬 수 있다.
도 2A는 특정 도세탁셀 전구약물의 합성에 대한 화학 반응 도식이다.
도 2B는 도세탁셀 전구약물의 선택된 예를 보여주는 차트이다.
도 2C는 PEG-DSG-E의 합성을 보여주는 반응 도식이다.
도 3A는 바람직한 도세탁셀 전구약물에 대하여 37℃에서 가수분해 프로파일을 보여주는 개략도이다. 가수분해 프로파일은 실시예 11의 방법을 이용하여 수득될 수 있다.
도 3B는 특정 도세탁셀 전구약물에 대한 가수분해 프로파일이다.
도 3C는 특정 도세탁셀 전구약물에 대한 가수분해 프로파일이다.
도 3D는 특정 도세탁셀 전구약물에 대한 가수분해 프로파일이다.
도 3E는 특정 도세탁셀 전구약물에 대한 가수분해 프로파일이다.
도 3F는 특정 도세탁셀 전구약물에 대한 가수분해 프로파일이다.
도 4A는 EphA2 표적화된 도세탁셀-생성 나노리포좀 조성물을 제조하는데 사용될 수 있는 EphA2 결합 모이어티에서 유용한 다양한 CDR 서열을 보여준다.
도 4B는 EphA2 표적화된 도세탁셀-생성 나노리포좀 조성물을 제조하는데 사용될 수 있는 scFv용 아미노산 서열 및 상응하는 인코딩 DNA 서열이다. DNA 서열은 인코딩된 scFv를 발현시키는 포유류 (예를 들면, 인간 또는 설치류) 세포에 의해 절단제거되는 N-말단 선도 서열을 추가로 인코딩한다.
도 4C는 EphA2-표적화된 도세탁셀-생성 리포좀을 제조하는데 사용될 수 있는 scFv용 아미노산 서열 및 상응하는 인코딩 DNA 서열이다. DNA 서열은 인코딩된 scFv를 발현시키는 포유류 (예를 들면, 인간 또는 설치류) 세포에 의해 절단제거되는 N-말단 선도 서열을 추가로 인코딩한다.
도 4D는 EphA2-표적화된 도세탁셀-생성 리포좀을 제조하는데 사용될 수 있는 scFv용 아미노산 서열 및 상응하는 인코딩 DNA 서열이다. DNA 서열은 인코딩된 scFv를 발현시키는 포유류 (예를 들면, 인간 또는 설치류) 세포에 의해 절단제거되는 N-말단 선도 서열을 추가로 인코딩한다.
도 4E 는, 실시예 2-9에서 사용된, EphA2 표적화된 도세탁셀-생성 나노리포좀 조성물 EphA2-ILs에서 scFv EphA2 결합 모이어티용 아미노산 서열 및 상응하는 인코딩 DNA 서열이다.
도 4F 는 EphA2-표적화된 도세탁셀-생성 리포좀을 제조하는데 사용될 수 있는 scFv용 아미노산 서열 및 상응하는 인코딩 DNA 서열이다. DNA 서열은 인코딩된 scFv를 발현시키는 포유류 (예를 들면, 인간 또는 설치류) 세포에 의해 절단제거되는 N-말단 선도 서열을 추가로 인코딩한다.
도 4G 는 EphA2-표적화된 도세탁셀-생성 리포좀을 제조하는데 사용될 수 있는 scFv용 아미노산 서열 및 상응하는 인코딩 DNA 서열이다. DNA 서열은 인코딩된 scFv를 발현시키는 포유류 (예를 들면, 인간 또는 설치류) 세포에 의해 절단제거되는 N-말단 선도 서열을 추가로 인코딩한다.
도 4H 는 EphA2-표적화된 도세탁셀-생성 리포좀을 제조하는데 사용될 수 있는 scFv용 아미노산 서열 및 상응하는 인코딩 DNA 서열이다. DNA 서열은 인코딩된 scFv를 발현시키는 포유류 (예를 들면, 인간 또는 설치류) 세포에 의해 절단제거되는 N-말단 선도 서열을 추가로 인코딩한다.
도 4I는 EphA2-표적화된 도세탁셀-생성 리포좀을 제조하는데 사용될 수 있는 scFv용 아미노산 서열 및 상응하는 인코딩 DNA 서열이다. DNA 서열은 인코딩된 scFv를 발현시키는 포유류 (예를 들면, 인간 또는 설치류) 세포에 의해 절단제거되는 N-말단 선도 서열을 추가로 인코딩한다.
도 4J는 실시예 4에서 사용된 아미노산 서열, 및 상응하는 인코딩 DNA 서열이다.
도 5는 종양, 비장 및 간에서 화합물 3 수준의 DTX (도세탁셀) 및 도세탁셀 전구약물을 보여주는 그래프이다
도 6A는 스위스 웹스터 마우스에서 EphA2-표적화된, 도세탁셀 생성 면역리포좀 (41scFv-ILs-DTXp3)의 내성을 보여주는 그래프이다.
도 6B는 스위스 웹스터 마우스에서 자유 도세탁셀의 내성을 보여주는 그래프이다.
도 7A는 SUM-159 이종이식편 모델에서 EphA2-표적화된, 도세탁셀 생성 면역리포좀 (40scFv-ILs-DTXp3)의 항종양 효능을 보여주는 그래프이다.
도 7B는 SUM-149 이종이식편 모델에서 EphA2-표적화된, 도세탁셀 생성 면역리포좀 (40scFv-ILs-DTXp3)의 항종양 효능을 보여주는 그래프이다.
도 7C는 MDA-MB-436 이종이식편 모델에서 EphA2-표적화된, 도세탁셀 생성 면역리포좀 (40scFv-ILs-DTXp3)의 항종양 효능을 보여주는 그래프이다.
도 7D는 SUM-159 이종이식편 모델에서 EphA2-표적화된, 도세탁셀 생성 면역리포좀 (40scFv-ILs-DTXp3)의 내성을 보여주는 그래프이다.
도 7E는 SUM-149 이종이식편 모델에서 EphA2-표적화된, 도세탁셀 생성 면역리포좀 (40scFv-ILs-DTXp3)의 내성을 보여주는 그래프이다.
도 7F는 MDA-MB-436 이종이식편 모델에서 EphA2-표적화된, 도세탁셀 생성 면역리포좀 (40scFv-ILs-DTXp3)의 내성을 보여주는 그래프이다.
도 8A는 MDA-MB-436 이종이식편 모델에서 EphA2-표적화된, 도세탁셀 생성 면역리포좀 (40scFv-ILs-DTXp3)에 비교하여 비-표적화된 도세탁셀-생성 리포좀 (NT-Ls-DTXp3)의 항종양 효능을 보여주는 그래프이다.
도 8B는 MDA-MB-436 이종이식편 모델에서 EphA2-표적화된, 도세탁셀 생성 면역리포좀 (40scFv-ILs-DTXp3)에 비교하여 비-표적화된 도세탁셀-생성 리포좀 (NT-Ls-DTX)의 내성을 보여주는 그래프이다.
도 8C는 OE-19 이종이식편 모델에서 EphA2-표적화된, 도세탁셀 생성 면역리포좀 (46scFv-ILs-DTXp3)에 비교하여 비-표적화된 도세탁셀-생성 리포좀 (NT-Ls-DTXp3)의 항종양 효능을 보여주는 그래프이다.
도 8D는 MKN-45 이종이식편 모델에서 EphA2-표적화된, 도세탁셀 생성 면역리포좀 (46scFv-ILs-DTXp3)에 비교하여 비-표적화된 도세탁셀-생성 리포좀 (NT-Ls-DTXp3)의 항종양 효능을 보여주는 그래프이다.
도 8E는 OE-21 이종이식편 모델에서 EphA2-표적화된, 도세탁셀 생성 면역리포좀 (46scFv-ILs-DTXp3)에 비교하여 비-표적화된 도세탁셀-생성 리포좀 (NT-Ls-DTXp3)의 항종양 효능을 보여주는 그래프이다.
도 8F는 OE-19, MKN-45, 및 OE-21 이종이식편 모델에 대하여 재성장하기 위한 최대 반응 및 시간의 분석에 의해 보여진 바와 같이 EphA2-표적화된, 도세탁셀 생성 면역리포좀 (46scFv-ILs-DTXp3)에 비교하여 비-표적화된 도세탁셀-생성 리포좀 (NT-Ls-DTXp3)의 항종양 효능을 보여주는 그래프이다.
도 8G는 SK-LMS-1 이종이식편 모델에서 NT-LS-DTXp3 대 46scFv-ILs-DTXp3의 항종양 효능을 보여주는 그래프이다.
도 9는 A549 이종이식편 모델에서 EphA2-표적화된, 도세탁셀 생성 면역리포좀 (41scFv-ILs-DTXp3)의 항종양 효능을 보여주는 그래프이다.
도 10A는 DU-145 이종이식편 모델에서 EphA2-표적화된, 도세탁셀 생성 면역리포좀 (46scFv-ILs-DTXp3)의 항종양 효능을 보여주는 그래프이다.
도 10B는 DU-145 이종이식편 모델에서 EphA2-표적화된, 도세탁셀 생성 면역리포좀 (46scFv-ILs-DTXp3)의 항종양 효능을 보여주는 그래프이다.
도 11은 생체외 3D 스페로이드에서 EphA2 표적화를 보여주는 그래프이다.
도 12A는 어느 한쪽 EphA2-표적화된 면역리포좀 (EphA2-ILs) 및 비-표적화된 리포좀 (NT-Ls) 혼합물 또는 1C1의 하나의 꼬리 정맥 주사를 받았던 동물로부터 수득된 데이터의 그래프이다. 모든 조직은 주사 24시간 후 수집되었다.
도 12B는 비-표적화된 도세탁셀-생성 나노리포좀 조성물에 비교하여 EphA2 표적화된 도세탁셀-생성 나노리포좀 조성물의 리포좀 공국재화 분석을 보여주는 그래프이다.
도 12C는 식도 암 OE-19 이종이식편 모델에서 EphA2 표적화의 리포좀 비율계 분석을 보여주는 이미지이다.
도 12D는 EphA2 표적화된 도세탁셀-생성 나노리포좀 조성물 및 비-표적화된 도세탁셀-생성 나노리포좀 조성물 혼합물의 하나의 꼬리 정맥 주사를 받았던 동물로부터 수득된 데이터의 그래프인 EphA2 표적화의 리포좀 비율계 분석을 보여주는 그래프이다. 모든 조직은 24시간 후 수집되었다.
도 12E는 삼중 음성 유방 암의 동소이식으로 이식된 전이성 모델에서 EphA2 표적화의 리포좀 비율계 분석을 보여주는 이미지이다.
도 12F는 삼중 음성 유방 암의 정맥내로 주사된 전이성 모델에서 EphA2 표적화의 리포좀 비율계 분석을 보여주는 이미지이다.
도 13A는 동소 OVCAR-8 이종이식편 모델에서 EphA2 표적화된 도세탁셀-생성 나노리포좀 조성물의 항종양 효능을 보여주는 그래프이다.
도 13B는 OVCAR-8 세포주를 발현시키는 가우시아 루시퍼라아제를 생성하는데 사용된 렌티바이러스 작제물을 보여주는 그래프이다
도 13C는 OVCAR-8 세포주를 발현시키는 가우시아 루시퍼라아제를 생성하는데 사용된 형질감염 프로토콜을 보여주는 그래프이다
도 14A는 실시예 13에서 마우스에 EphA2-표적화된 도세탁셀-생성 리포좀 투여후 경시적으로 도세탁셀의 농도를 보여주는 그래프이다.
도 14B는 실시예 13에서 마우스에 EphA2-표적화된 도세탁셀-생성 리포좀 투여후 경시적으로 지질의 농도를 보여주는 그래프이다.
도 14C는 실시예 13에서 마우스에 EphA2-표적화된 도세탁셀-생성 리포좀 투여후 경시적으로 도세탁셀/지질 비를 보여주는 그래프이다.
도 15는 프로트롬빈 시간 (PT), 활성화된 부분적인 트롬보플라스틴 시간 (APTT), 및 46scFv-ILs-DTXp3, NT-Ls-DTXp3 또는 자유 도세탁셀의 스프래그 다우리 랫트 투여된 효과의 피브리노겐 수준을 보여주는 일련의 그래프이다
도 16A는 EphA2 표적화된-ILs-DTXp3의 투여시 다양한 이종이식편 모델에서 최대 종양 퇴행을 도시하는 그래프이다.
도 16B는 10 mg/kg 자유 도세탁셀 또는 50 mg/kg EphA2-표적화된-ILs-DTXp3 투여된 다양한 이종이식편 모델에서 최대 종양 퇴행을 도시하는 그래프이다.
EphA2-표적화된 나노리포좀은, 향상된 투과도 효과를 통해 장기 특이성 및 EphA2 표적화를 통해 세포 특이성을 활용하는, 암 세포 및/또는 종양에 (예를 들면, 캡슐화된 도세탁셀 전구약물로서) 도세탁셀을 전달하는데 사용될 수 있다. 우리는, 향상된 투과도 효과를 통해 장기 특이성 및 EphA2 표적화를 통해 세포 특이성을 활용하는, 신규한 EphA2-표적화된 도세탁셀 나노리포좀을 개발하였다.
"EphA2"는, 에프린-A 리간드에 의해 활성화될 수 있고 결합할 수 있는 수용체 티로신 키나제, 또한 "상피성 세포 키나제 (ECK)"로서 지칭된, 에프린 유형-A 수용체 2를 지칭한다. 용어 "EphA2"는 EphA2의 임의의 자연 발생 동형체를 지칭할 수 있다. 인간 EphA2의 아미노산 서열은 유전자은행 수탁 번호 NP_004422.2로서 기록된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "EphA2 양성"는 세포 (또는 그와 같은 암 세포를 포함하는 종양을 가진 환자)당 적어도 약 3000 EphA2 수용체를 갖는 암 세포를 지칭한다. EphA2 양성 세포는 세포당 Eph-A2 표적화된 리포좀을 특이적으로 결합시킬 수 있다. 특히, EphA2 표적화된 리포좀은 세포당 적어도 약 3000 이상 EphA2 수용체를 갖는 EphA2 양성 암 세포에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 비-표적화된 리포좀은 "Ls" 또는 "NT-Ls"로서 특정될 수 있다. Ls (또는 NT-Ls)는 도세탁셀 전구약물과 무관하게 비-표적화된 리포좀을 지칭할 수 있다. "Ls-DTX'"는, 본 명세서에서 개시된 그들 도세탁셀 전구약물에 대한 등가물 또는 대안적인 구현예를 포함하는, 임의의 적합한 도세탁셀 전구약물을 함유하는 리포좀을 지칭한다. "NT-Ls-DTX"는, 본 명세서에서 개시된 그들 도세탁셀 전구약물에 대한 등가물 또는 대안적인 구현예를 포함하는, 임의의 적합한 도세탁셀 전구약물을 캡슐화하는 표적화 모이어티 없는 리포좀을 지칭한다. 특별한 도세탁셀 전구약물을 포함하는 비-표적화된 리포좀의 예는 [y]가 본 명세서에서 특정된 특별한 화합물 번호를 지칭하는 포멧 "Ls-DTXp[y]" 또는 "NT-DTXp[y]"로 특정될 수 있다. 예를 들어, 달리 나타내지 않는 한, Ls-DTXp1은, 항체 표적화 모이어티 없이, 본 명세서에서 화합물 1의 도세탁셀 전구약물을 함유하는 리포좀이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 표적화된 면역리포좀은 "ILs"로서 지정될 수 있다. "ILs-DTXp"의 인용은 표적화 모이어티, 예컨대 scFv를 포함하는 표적화된 도세탁셀-생성 면역리포좀의 임의의 구현예 또는 변동을 지칭한다. 본 명세서에서 개시된 ILs는 생물학적 에피토프 결합용 모이어티, 예컨대 면역리포좀의 에피토프-결합 scFv 부분을 포함하는 면역리포좀을 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 인용된 ILs는 EphA2 결합 면역리포좀을 지칭한다 (대안적으로 "EphA2-ILs"로 칭함). 용어 "EphA2-ILs"는 본 명세서에서 EphA2에 결합하기 위해 표적화된 모이어티를 가진 본 개시내용에 의해 가능해진 면역리포좀을 지칭한다. ILs는 EphA2에 결합하는 모이어티를 갖는 (예를 들면, EphA2를 결합시키는 임의의 scFv 서열을 이용하는) EphA2-ILs를 포함한다. 바람직한 표적화된 도세탁셀-생성 면역리포좀은 ILs-DTXp3, ILs-DTXp4, 및 ILs-DTXp6을 포함한다. 반대 표시가 없으면, 이들은 EphA2 결합 모이어티 및 화합물 3, 화합물 4 또는 화합물 6 (각각)의 캡슐화 도세탁셀 전구약물을 가진 면역리포좀을 포함한다. EphA2-ILs는 도세탁셀 전구약물과 무관하게 면역리포좀 (예를 들면, 도세탁셀 전구약물 없이 포획제 예컨대 수크로스 옥타설페이트를 캡슐화하는 면역리포좀)을 지칭할 수 있고 포함할 수 있다.
약어 포멧 "[x]scFv-ILs-DTXp[y]"는, 본 명세서에서 특정된 특별한 화합물 번호 ([y])를 갖는 도세탁셀 전구약물 ("DTXp")를 캡슐화하는 또는 달리 함유하는 리포좀에 부착된, 특별한 서열 식별 번호: [x]에서 특정된 아미노산 서열을 갖는 scFv "표적화" 모이어티를 포함하는 면역-리포좀 ("ILs")의 예를 기재하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 달리 나타내지 않는 한, 표적화된 ILs용 scFv 서열은 EphA2 표적에 결합할 수 있다.
용어 "NT-Ls"는 표적화 모이어티 없이 본 개시내용에 의해 가능해진 비-표적화된 리포좀을 지칭한다. 용어 "NT-LS-DTXp3"는 도세탁셀 전구약물 ("DTX'")를 캡슐화하는 본 개시내용에 의해 가능해진 비-표적화된 리포좀을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "mpk"는 동물에 투여된 용량으로 mg / kg 체중을 지칭한다.
바람직하게는, 면역리포좀 (ILs) 또는 비-표적화된 리포좀 (Ls 또는 NT-LS)는 투여시 원하는 혈장 반감기를 제공하기 위해 리포좀 소포의 하나 이상의 성분에 부착된 PEG의 (즉, 페길화된) 적합한 양을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 지질, PEG 지질 유도체 및 지질 소포의 외측에서 EphA2 결합 모이어티를 포함하는 지질 소포 안에서 캡슐화된 도세탁셀 전구약물을 포함하는 EphA2 -표적화된 도세탁셀-생성 리포좀이다.
일부 구현예에서, EphA2 결합 모이어티는 지질 소포 안에서 지질에 공유 결합된 scFv 모이어티이다. 일부 구현예에서, 도세탁셀 전구약물은 식 (I)의 화합물이다:
Figure pct00001
식 중 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 저급 알킬이고, n은 정수 2-3임.
일부 구현예에서, EphA2 결합 모이어티는 서열 식별 번호: 40 또는 서열 식별 번호: 41의 CDRs를 포함하는 scFv 모이어티이다. 일부 구현예에서, EphA2 결합 모이어티는 서열 식별 번호: 41의 서열을 포함하는 scFv 모이어티이다.
일부 구현예에서, 지질 소포는 스핑고미엘린, 콜레스테롤 및 PEG-DSG를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 소포는 스핑고미엘린, 콜레스테롤 및 PEG-DSG를 약 4.4: 1.6: 1의 중량비로 포함한다.
일부 구현예에서, 리포좀은 식 (I)의 도세탁셀-생성 전구약물을 캡슐화한다:
Figure pct00002
식 중 R1 및 R2 각각은 C1-C3 알킬이고, n은 2 또는 3임. 일부 구현예에서, 도세탁셀-생성 전구약물은 식 (I)의 화합물을 수크로스 옥타설페이트로 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 도세탁셀 전구약물은 리포좀에서 캡슐화된 화합물 1-3 중 어느 하나의 수크로스 옥타설페이트 염이다.
일부 구현예에서, 리포좀은 리포좀에서 총 스핑고미엘린에 대하여 중량 기준으로 약 1: 142의 비로 scFv-PEG-DSPE로서 PEG-DSPE에 공유 결합된 scFv 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 최종 리포좀에서 약물-대-인지질 비는 약물 장입이 도세탁셀 당량에 기반되는 경우 250 g 도세탁셀 당량/mol 인지질 초과이고, 바람직하게는 250-350 g/mol이다.
일부 구현예에서, 저장 완충액의 pH는 중성 미만, 바람직하게는 4-6.5, 및 더욱 바람직하게는 5-6이다.
일부 구현예에서, EphA2 결합 모이어티는 서열 식별 번호: 41로 구성되는 scFv로서 EphA2에서 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, EphA2 결합 모이어티는 서열 식별 번호: 41로 구성되는 scFv를 가진 EphA2에 결합을 위하여 경쟁한다.
일 구현예에서, 본 발명은 필요로 하는 인간 환자에 있어서 암의 치료 방법에서 리포좀의 용도이고, 상기 방법은 인간 환자에 약제학적 조성물에서 리포좀의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 고체 종양, 유방, 위, 식도, 폐, 전립선 및 난소 암으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 삼중 음성 유방 암 (TNBC)이다. 일부 구현예에서, 암은 위, 위식도 접합 또는 식도 암종이다. 일부 구현예에서, 암은 소세포 폐암 또는 비-소세포 폐암이다. 일부 구현예에서, 암은 난소 암, 자궁내막 암종 또는 요상피 암종이다. 일부 구현예에서, 암은 전립선 선암이다. 일부 구현예에서, 암은 두경부의 편평상피 세포 암종 (SCCHN)이다. 일부 구현예에서, 암은 췌관 선암 (PDAC)이다. 일부 구현예에서, 암은 GIST, 데스모이드 종양 및 다형성 횡문근육종을 제외한 연조직 육종 하위유형이다.
일부 구현예에서, 리포좀은 서열 식별 번호: 41의 서열을 포함하는 EphA2 결합 scFv 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 리포좀은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 도세탁셀 전구약물을 포함한다: 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 및 화합물 6. 일부 구현예에서, 도세탁셀 전구약물은 화합물 3이다. 일부 구현예에서, 도세탁셀 전구약물은 화합물 6이다.
일부 구현예에서, 혈액학적 독성은 자유 도세탁셀의 것 미만이다. 일부 구현예에서, 리포좀에서 전달된 도세탁셀의 용량의 혈액학적 독성은 자유 도세탁셀의 동일한 용량의 것 미만이다.
도세탁셀의 전달용 EphA2-표적화된 리포좀
도 1A는 (예를 들면, 약 100 nm의 정도에서 리포좀 크기를 갖는) 도세탁셀 전구약물을 캡슐화하는 페길화된 EphA2 표적화된, 나노-크기의 면역리포좀 (나노리포좀)의 구조를 보여주는 개략도이다. 면역리포좀은 (예를 들면, 공유 결합된 PEG-DSPE 모이어티를 통해) 리포좀에 결합된, 에프린 A2 (EphA2) 표적화된 모이어티, 예컨대 scFv를 포함할 수 있다. 도세탁셀 전구약물을 캡슐화하는 페길화된 EphA2 표적화된 리포좀은, 본 명세서에서 기재된 전구약물의 형태로 도세탁셀을 함유하는, 페길화된 리포좀에 EphA2 수용체를 인식하는 단일 쇄 Fv (scFv) 항체 단편을 공유 콘주게이션시킴으로써 창출될 수 있어, 면역리포좀 약물 생성물 (도 1A)를 초래한다. (본 명세서에서 "EphA2-ILs-DTX"로 지정된) 도세탁셀 전구약물을 캡슐화하는 페길화된 EphA2 표적화된 리포좀의 하나의 특정 예에서, 지질 막은 에그 스핑고미엘린, 콜레스테롤, 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세릴 메톡시폴리에틸렌 글라이콜 에테르 (PEG-DSG)로 구성될 수 있다. 나노리포좀은 수성 완충된 용액, 예컨대 인간에 비경구 투여를 위하여 제형화된 멸균 약제학적 조성물에서 분산될 수 있다.
도 1A의 EphA2 표적화된 나노리포좀은, 수크로소페이트 (수크로스 옥타설페이트) 염으로서, 겔화된 또는 침전된 상태로 본 명세서에서 개시된 화합물을 함유하는, 수성 공간을 캡슐화하는, 직경이 대략 110 nm인, 바람직하게는 단일라멜라 지질 이중층 소포이다. 실시예 1은 도세탁셀 전구약물을 캡슐화하는 페길화된 EphA2 표적화된 리포좀의 제조 방법을 기재한다.
도세탁셀 전구약물은 저장 동안 그리고 온전한 리포좀이 일반적인 순환에 있는 동안 리포좀 내측에서 안정화될 수 있지만, 리포좀으로부터 방출시 활성 도세탁셀에 빠르게 (예를 들면, t½= ~10 시간) 가수분해되고 순환 혈액의 환경에 진입하고 있다. 도 1B는 본 명세서에서 개시된 바와 같이 도세탁셀 전구약물 화합물을 가진 도세탁셀 나노생성기의 묘사이다. 도세탁셀 전구약물은, 비-가용성 형태로 안정화되는 전기화학적 구배를 이용하여, 중산성 pH에서 장입될 수 있고 리포좀의 산성 내측에서 포획될 수 있다. 리포좀으로부터 방출시, 도세탁셀 전구약물은 중성 pH에서 단순 염기-매개된 가수분해에 의해 활성 도세탁셀로 후속적으로 전환된다.
도세탁셀 전구약물 화합물
도세탁셀 전구약물을 캡슐화하는 페길화된 EphA2 표적화된 리포좀은 하나 이상의 적합한 도세탁셀 전구약물을 캡슐화할 수 있다. 바람직하게는, 도세탁셀 전구약물은 에스테르 결합을 통해 도세탁셀의 2' 또는 7 위치 하이드록실 기에 도입된 약염기 예컨대 3차 아민을 포함하여 도세탁셀 전구약물을 형성한다. 리포좀 속으로 장입에 적합한 바람직한 2'- 도세탁셀 전구약물은 산성 pH에서 비교적으로 고 안정성을 특징으로 하지만 효소-독립적 가수분해를 통해 생리적 pH에서 도세탁셀로 전환한다.
도 1B에서 나타낸 바와 같이, 2'-에스테르 결합의 화학 환경은 상대적으로 낮은 pH에서 안정적이지만 가수분해를 통해 생리적 pH에서 빠르게 자유 도세탁셀을 방출시킬 도세탁셀 전구약물을 수득하기 위해 체계적으로 조정될 수 있다. 도세탁셀 전구약물은 포획제 예컨대 다중황산화된 폴리올, 예를 들어, 수크로스 옥타설페이트와 안정적 복합체를 형성함으로써 상대적으로 낮은 pH에서 리포좀 속으로 장입된다. 포획제 수크로스 옥타설페이트는, 그것의 아민 염, 예컨대 디에틸아민 염 (DEA-SOS), 또는 트리에틸아민 염 (TEA-SOS)의 용액으로서, 리포좀 내측에서 포함될 수 있다. 포획제의 아민 염의 용도는 리포좀 속으로 전구약물 장입을 보조하는 막관통 이온 구배 창출을 그리고 또한 전구약물-장입된 리포좀이 그것의 해부상의 표적에 도달하기 전에 도세탁셀로의 미성숙한 전환으로부터 전구약물 유지에 양호한 산성 리포좀내 환경 유지를 돕는다. 그와 같은 방식으로 리포좀 내부 도세탁셀 전구약물의 캡슐화는 환자의 신체 이내 리포좀으로부터 방출시 도세탁셀의 pH 유발된 방출의 실제적인 적용을 허용한다. 따라서, 도세탁셀-전구약물을 캡슐화하는 리포좀은 도세탁셀 나노생성제로 불릴 수 있다.
리포좀 장입 및 캡슐화에 적합한 도세탁셀 전구약물은 도세탁셀 전구약물 화합물의 가수분해 프로파일 평가에 의해 결정될 수 있다. 가수분해 프로파일은 실시예 11의 방법을 이용하여 수득될 수 있다. 리포좀에서 캡슐화에 바람직한 도세탁셀 전구약물은 pH 2.5에서 (예를 들면, 10% 미만, 5% 미만, 더욱 바람직하게는 1% 미만, 또는 4 이상 일후 활성화된 약물을 수득하는 검출가능한 에스테르 가수분해 없는) 고 안정성을 포함하는 (예를 들면, 20 mM HEPES 완충액에서) 37 ℃에 가수분해 프로파일, 그러나 pH 7.5 (생리적 pH)에서 도세탁셀을 형성하기 위한 급속 및 완전한 가수분해 (예를 들면, 24 시간후 활성화된 약물을 형성하기 위한 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 본질적으로 완전한 에스테르 가수분해)를 갖는다. 도 3A는, 실시예 11의 방법을 이용하여, 리포좀 속으로 장입에 적합한 도세탁셀 전구약물에 대하여 37℃에서 가수분해 프로파일을 설명한다. pH 2.5에서, 도세탁셀 전구약물은 도세탁셀 화합물을 형성하기 위해 최소 (바람직하게는 약 10% 미만, 더욱 바람직하게는 약 5% 미만) 가수분해를 경험한다. 도 3A에서 영역 (200)은 경시적으로 가수분해 %에 대하여 값의 바람직한 범위를 설명한다. pH 7.5에서, 도세탁셀 전구약물은 바람직하게는 도세탁셀을 형성하기 위해 고 수준의 가수분해 (바람직하게는 24 시간 후 적어도 약 50%, 더욱 바람직하게는 24 시간 후 적어도 약 60% 가수분해)를 경험한다. 도 3A에서, 박스 (100)은, 실시예 11의 방법을 이용하여, pH 7.5에서 도세탁셀 전구약물의 가수분해를 위한 바람직한 값의 범위를 보여준다. 예를 들어, 20 mM HEPES 완충액내 37 ℃에 도세탁셀 전구약물 프로파일은 pH 2.5에서 4 일 후 활성화된 약물을 수득하는 무 검출가능한 에스테르 가수분해 그리고 pH 7.5에서 24 시간 후 활성화된 약물을 형성하기 위해 본질적으로 완전한 에스테르 가수분해를 포함할 수 있다. 화합물
바람직하게는, 도세탁셀 전구약물은, 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 식 (I)의 화합물이고, 여기에서 R1, R2 및 n은 (예를 들면, 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 다양한 pH 값에서 가수분해 프로파일에 의해 측정된 경우) 원하는 리포좀 장입 및 안정성 특성, 뿐만 아니라 원하는 도세탁셀 생성을 제공하기 위해 선택된다. 도세탁셀 전구약물 (DTX') 화합물은 리포좀 안에 약제학적으로 허용가능한 염 (예를 들면, 적합한 포획제 예컨대 설폰화된 폴리올을 가진 염)을 형성할 수 있다. 일부 예에서, R1 및 R2가 독립적으로 H 또는 저급 알킬 (바람직하게는 C1-C4 선형 또는 분지형 알킬, 가장 바람직하게는 C2 또는 C3)이고, n이 정수 (바람직하게는 1-4, 가장 바람직하게는 2-3)인 식 (I)의 화합물. 도세탁셀 전구약물의 예는 또한 하기의 식 (III)에서 개시된 방식으로 치환되는 식 (I)내 2' 치환체 -O-(CO)-(CH2)nN(R1)(R2)를 갖는 도세탁셀 유사체 화합물을 포함한다: 미국특허 4,960,790 (Stella 등 저 (1989년 3월 9일 출원), 본 명세서에서 참고로 그 전문이 편입됨)
Figure pct00003
식 (I)의 화합물을 포함하는, 도세탁셀 전구약물은 도 2A에서 반응 도식을 사용하여 제조될 수 있다. 도세탁셀 전구약물의 2 특정 제조는 실시예 10A (화합물 3) 및 실시예 10B (화합물 4)에서 기재된다. 도세탁셀 전구약물의 다른 예는 2'-(2-(N,N'-디에틸아미노)프로피오닐)-도세탁셀 또는 7-(2-(N,N'-디에틸아미노)프로피오닐)-도세탁셀을 포함한다.
식 (I)의 바람직한 도세탁셀 전구약물 화합물은 pH 2.5에 비교된 pH 7.5에서 화합물 (예를 들면, 실시예 11의 가수분해 검정을 이용하여, pH 2.5에서 가수분해 속도에 비교된 pH 7.5에서 도세탁셀로의 도세탁셀 전구약물의 최대 가수분해 속도를 가진 선택 도세탁셀 전구약물)에 대하여 충분히 높은 상대 가수분해 속도 그리고 pH 7.5에서 급속 가수분해 속도를 제공하기 위해, (n)이 2 또는 3인 화합물을 포함한다 도 3C-3F는 도세탁셀 전구약물의 다양한 예에 대하여 가수분해 프로파일을 보여준다.
EphA2 표적화된 scFv 모이어티
도세탁셀-생성 리포좀은 EphA2 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 표적화 모이어티는 본 명세서에서 개시된 도세탁셀-생산 리포좀을 표적하기 위해 리포좀에 공유 결합될 수 있는 단백질, 단일 쇄 Fv ("scFv")일 수 있다. scFv는, 전형적으로 VH 및 VL CDRs로 구성되는 기능성 항원 결합 부위의 형성을 허용하는 링커 펩타이드를 통해, VH 및 VL이 서로에 대해서 공유결합되는 단일 폴리펩타이드 쇄로 구성될 수 있다. Ig 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은, "상보성 결정 영역" 또는 "CDRs"로도 불리는, 3 초가변 영역으로 교대하는 복수의 "프레임워크" 영역 (FR)으로 구성된다. 프레임워크 영역 및 CDRs의 정도는 공공 데이터베이스에서 발견된 서열에 대한 상동성에 기반하여 정의될 수 있다. 참조, 예를 들어, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. 카밧 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed. U.S. Dept. Health and Human Services, Public Health Services, Bethesda, MD (1987). 본 명세서에서 사용된 모든 scFv 서열 넘버링은 카밧 등에 의해 정의된 바와 같다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한, 용어 "항-EphA2 scFv"는 EphA2, 바람직하게는 EphA2의 ECD에 면역특이적으로 결합하는 scFv를 지칭한다. EphA2-특이적 scFv는 EphA2 단백질에서 존재하지 않는 항원에 면역특이적으로 결합하지 않는다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 scFv는 표 1에서 제시된 VH FR1, VH FR2, VH FR3, VL FR1, VL FR2, 및 VL FR3의 하나 또는 임의의 조합을 포함한다. 일 구현예에서, scFv는 아래 표 1의 모든 프레임워크를 함유한다.
Figure pct00004
특정 측면에서, 본 명세서에서 개시된 scFv는 열안정성, 예를 들면, scFv가 강력한 및 확장가능한 제조에 잘 맞는 정도이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "열안정성" scFv는, 예를 들면, 시차 주사 형광측정법 (DSF)를 이용하여 측정된 경우, 적어도 약 70 ℃의 용융 온도 (Tm)을 갖는 scFv이다.
바람직한 항-EphA2 scFv는 EphA2 폴리펩타이드의 세포외 도메인, 즉, 유전자은행 수탁 번호 NP_004422.2 또는 UniProt 수탁 번호 P29317에서 제시된 서열의 적어도 아미노산 잔기 25 내지 534를 포함하는 EphA2 단백질의 일부에 결합한다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 항-EphA2 scFv는 표 2에서 제시된 바와 같은 서열을 가진 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3 각각을 포함한다. VH CDR2 서열 (CDRH2로도 칭함)이 표 2에서 제시된 18 상이한 VH CDR2 서열로부터 선택된 어느 하나일 수 있다는 것을 주목한다.
Figure pct00005
특정 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 scFv는 내재화 항-EphA2 scFv이다. 적절한 조건 하에 살아있는 세포의 표면에 존재하는 EphA2 분자 및 상기의 ECD에 그와 같은 scFv의 결합은 scFv의 내재화를 초래한다. 내재화는 세포의 세포-막-결합된 내측에 세포 막의 외측과 접촉된 scFv의 수송을 초래한다. 내재화 scFvs는, 예를 들면, 치료 적용을 위하여, 예를 들면, 약물, 독소, 효소, 나노입자 (예를 들면, 리포좀), DNA, 등의 표적화된 전달용 비히클로서 용도를 찾는다.
본 명세서에서 기재된 특정 scFvs는 단일 쇄 Fv scFvs 예를 들면, scFvs 또는 (scFv')2s이다. 그와 같은 scFvs에서, VH 및 VL 폴리펩타이드는 어느 한쪽 직접적으로 또는 아미노산 링커를 통해 2 배향의 어느 한쪽 (즉, VL로 VH N-말단, 또는 VH로 VL N-말단)으로 서로에 대해서 연결된다. 그와 같은 링커는, 예를 들면, 길이가 1 내지 50, 5 내지 40, 10 내지 30, 또는 15 내지 25 아미노산일 수 있다. 특정 구현예에서, 아미노산 링커의 잔기의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 100%가 세린 (S) 및/또는 글리신 (G)이다. 적합한 예시적인 scFv 링커는 하기 서열을 포함하거나 상기로 이루어진다:
ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열 식별 번호: 32),
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열 식별 번호: 33),
GGGGSGGGGSGGGGS (서열 식별 번호: 34),
ASTGGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(서열 식별 번호: 35),
GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (서열 식별 번호: 36),
TPSHNSHQVPSAGGPTANSGTSGS (서열 식별 번호: 37), 및
GGSSRSSSSGGGGSGGGG (서열 식별 번호: 38).
예시적인 내재화 항-EphA2 scFv는 scFv TS1 (서열 식별 번호: 40)이다. scFv TS1에서, 그리고 본 명세서에서 개시된 특정 다른 scFvs에서, scFv의 VH는 scFv의 아미노 말단이고 이탤릭체로 표시된 링커에 의해 VL에 연결된다. scFvs의 CDRs는 밑줄쳐지고 하기 순서로 나타난다: VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3.
도세탁셀-생성 EphA2-표적화된 리포좀은 하기에서 보여진 하나 이상의 EphA2 표적화된 scFv 서열을 또한 포함할 수 있다: 도 4B ("D2-1A7 DNA"로 지정된 서열 식별 번호: 56의 DNA 서열에 의해 인코딩된, "D2-1A7"로 지정된, 서열 식별 번호: 41), 또는 도 4C ("TS1 DNA"로 지정된 서열 식별 번호: 43의 DNA 서열에 의해 인코딩된, "TS1"로 지정된, 서열 식별 번호: 40), 또는 도 4D ("scFv2 DNA"로 지정된 서열 식별 번호: 45의 DNA 서열에 의해 인코딩된, "scFv2"로 지정된, 서열 식별 번호: 44), 또는 도 4E ("scFv3 DNA"로 지정된 서열 식별 번호: 47의 DNA 서열에 의해 인코딩된, "scFv3"로 지정된, 서열 식별 번호: 46), 또는 도 4F ("scFv8 DNA"로 지정된 서열 식별 번호: 49의 DNA 서열에 의해 인코딩된, "scFv8"로 지정된, 서열 식별 번호: 48), 또는 도 4G ("scFv9 DNA"로 지정된 서열 식별 번호: 51의 DNA 서열에 의해 인코딩된, "scFv9"로 지정된, 서열 식별 번호: 50) 또는 도 4H ("scFv10 DNA"로 지정된 서열 식별 번호: 53의 DNA 서열에 의해 인코딩된, "scFv10"로 지정된, 서열 식별 번호: 52) 또는 도 4I ("scFv13 DNA"로 지정된 서열 식별 번호: 55의 DNA 서열에 의해 인코딩된, "scFv13"로 지정된, 서열 식별 번호: 54).
VH CDR2가 표 2에서 상기 제시된 임의의 18 상이한 CDRH2 서열로부터 선택되는 scFv TS1의 변이체가 또한 제공된다.
본 명세서에서 제공된 정보를 이용하여, 본 명세서에서 개시된 scFvs는 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 제공된 아미노산 서열은 scFvs를 인코딩하는 적절한 핵산 서열을 결정하는데 사용될 수 있고 핵산 서열은 그 다음 하나 이상의 scFvs를 발현시키는데 사용된다. 핵산 서열(들)은 표준 방법에 따라 다양한 발현 시스템에 대하여 특별한 코돈 "선호"를 반영하기 위해 최적화될 수 있다.
본 명세서에서 제공된 서열 정보를 이용하여, 핵산은 수많은 표준 방법에 따라 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 합성은 상업적으로 입수가능한 고상 올리고뉴클레오타이드 합성 기계에서 편리하게 수행되거나, 예를 들어, 고상 포스포르아미다이트 트리에스테르 방법을 이용하여, 수작업으로 합성된다. 일단 본 명세서에서 개시된 scFv를 인코딩하는 핵산이 합성되면, 표준 방법에 따라 증폭 및/또는 클로닝될 수 있다.
본 명세서에서 개시된 scFvs를 인코딩하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 (구성적 또는 유도성일 수 있는) 프로모터에 scFv를 인코딩하는 핵산을 작동가능하게 연결시킴, 그리고 작제물을 발현 벡터에 편입시켜 재조합 발현 벡터를 생성함으로써 달성될 수 있다. 벡터는 원핵생물, 진핵생물, 또는 양쪽에서 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 기능적으로 적절하게 배향된 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 그리고 scFv를 인코딩하는 핵산의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 함유한다. 벡터는 적어도 하나의 독립적인 종결자 서열, 예를 들면, 셔틀 벡터에서 발견된 바와 같이, 양쪽 진핵생물 및 원핵생물에서 카셋트의 복제를 허용하는 서열, 그리고 양쪽 원핵 및 진핵 시스템용 선택 마커를 함유하는 일반적인 발현 카셋트를 선택적으로 함유한다.
클로닝된 핵산의 발현의 고 수준을 수득하기 위해 전사를 유도하기 위한 강한 프로모터, 번역 개시용 리보솜 결합 부위, 및 전사/번역 종결자를, 각각 서로에 그리고 단백질-인코딩 서열에 대해서 기능성 배향으로, 함유하는 발현 플라스미드를 작제하는 것이 공통이다. scFv 유전자(들)은, 확인, 정제 및 조작을 용이하게 하기 위해 scFv (예를 들면 scFv)의 C-말단 단부 또는 N-말단 단부에서, 태그 서열, 예를 들면, FLAG™ 또는 His6의 첨가를 허용하는 발현 벡터 속에 또한 아클론화될 수 있다. 일단 scFv를 인코딩하는 핵산이 단리되고 클로닝되면, 다양한 재조합으로 조작된 세포에서 핵산을 발현시킬 수 있다. 그와 같은 세포의 예는 박테리아, 효모, 사상균, 곤충, 및 포유류 세포를 포함한다.
본 명세서에서 개시된 scFv의 단리 및 정제는 구성적으로 및/또는 유도시 단백질을 발현시키기 위해 세포 유전자 변형의 용해물로부터, 또는 정제와 합성 반응 혼합물로부터 단리에 의해, 예를 들면, (예를 들면, 단백질 A 또는 단백질 G를 이용하는) 친화성 크로마토그래피에 의해 달성될 수 있다. 단리된 scFv는 단백질 정제에서 정상적으로 이용된 투석 및 다른 방법에 의해 추가로 정제될 수 있다.
본 개시내용은 또한 주제 scFvs를 생산하는 세포를 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 본 명세서에서 개시된 scFv를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산으로 유전적으로 변형되는 재조합 숙주 세포를 제공한다. DNA는, 예를 들면, 박테리아 (예를 들면, 박테리오파아지), 효모 (예를 들면 사카로마이세스 또는 피치아) 곤충 (예를 들면, 배큘로바이러스) 또는 포유류 발현 시스템으로 클로닝된다. 하나의 적합한 기술은 섬유상 박테리오파아지 벡터 시스템을 이용한다. 참조,. 예를 들면, US 5,885,793; US 5,969,108; 및 US6,512,097.
EphA2-표적화된 나노리포좀용 EphA2 표적화 서열의 추가의 예는 하기에서 개시된 서열을 포함한다: Zhou 등 미국특허 번호 9,220,772, 참고로 편입됨.Zhou 등은 EphA2의 에피토프를 특이적으로 결합시키는 단리된 단클론성 항체를 개시하고, 여기서 상기 에피토프는 하기를 포함하는 항체에 의해 구체적으로 결합된다: 하기를 포함하는 가변 중쇄 (VH) 폴리펩타이드: 아미노산 서열 SYAMH (서열 식별 번호: 9)를 포함하는 VH CDR1, 하기를 포함하는 VH CDR2: 아미노산 서열 VISYDGSNKYYADSVKG (서열 식별 번호: 27), 및 하기를 포함하는 VH CDR3: 아미노산 서열 ASVGATGPFDI (서열 식별 번호: 28); 및 하기를 포함하는 가변 경쇄 (VL) 폴리펩타이드: 아미노산 서열 QGDSLRSYYAS (서열 식별 번호: 29)를 포함하는 VL CDR1, 아미노산 서열 GENNRPS (서열 식별 번호: 30)을 포함하는 VL CDR2, 및 하기를 포함하는 VL CDR3: 아미노산 서열 NSRDSSGTHLTV (서열 식별 번호: 31).
EphA2 표적화된 scFv 아미노산 서열은 말레이미드-활성화된 PEG-DSPE에 EphA2 (scFv)를 이용하여 리포좀에 부착될 수 있다. 예를 들어, scFv-PEG-DSPE 약물 서브스턴스는 scFv의 C-말단 시스테인 잔기를 통해 말레이미드 PEG-DSPE에 콘주게이션된 완전 인간화된 단일 쇄 항체 단편 (scFv)일 수 있다. 일부 예에서, EphA2 표적화된 scFv는, 미셀 구조를 형성하기 위해 상호작용하는, 리포폴리머 지질, Mal-PEG-DSPE에 안정적인 티오에테르 결합을 통해 공유적으로 콘주게이션된다. 바람직하게는, scFv는 당화되지 않는다.
도세탁셀의 전달용 EphA2-표적화된 리포좀 제조
도세탁셀 전구약물은 상이한 접근법을 통해 리포좀에 장입될 수 있다. 원격 장입 방법은 고 장입 효능 및 양호한 확장성을 가능하게 한다. 전형적으로, 리포좀은 구배-형성 이온 및 약물-침전제 또는 약물-복합제를 포함할 수 있는 장입 보조제 (포획제)에서 제조된다. 리포좀외 장입 보조제는, 예를 들면, 정용여과에 의해 제거되어 리포좀 이중층을 거쳐 이온 구배를 생성한다. 선택된 약물은 지질 이중층을 교차할 수 있고, 이온 구배를 희생하여 리포좀 내부에 축적할 수 있고 장입 보조제와 복합체 또는 침전물을 형성할 수 있다. 리포좀 지질이 주위 온도에서 겔 상태이면, 장입은 리포좀 막이 액체 결정성 상태인 상승된 온도에서 영향받는다. 약물 장입이 완전한 경우, 리포좀은 장입된 약물이 강직한 막 안에 유지될 수 있도록 빠르게 냉각된다. 약물 장입 단계에서 관여된 임의의 인자는 장입 효능에 영향을 미칠 수 있다.
EphA2 표적화된 나노-리포좀은 DSPE-PEG-Mal 모이어티에 scFv를 콘주게이션하는데 효과적인 조건 하에 Eph-A2 결합 scFv를 DSPE-PEG-Mal과 조합시킴으로써 수득될 수 있다. DSPE-PEG-Mal 콘주게이트는 다중황산화된 폴리올 장입 보조제 및 다른 지질 성분과 조합되어 지질 소포로 캡슐화된 다중황산화된 폴리올을 함유하는 리포좀을 형성할 수 있다.
도 1B를 재차 참조로, 약물은 포획제를 캡슐화하는 리포좀 속에 장입될 수 있다. 약물 방출 속도는, 전구약물의 가수분해를 향한 안정성이 할 수 있는 바와 같이, 포획제의 유형 및 농도 가변화에 의해 제어될 수 있다. 포획제의 예는 비제한적으로 암모늄 수크로스옥타설페이트 (SOS), 디에틸암모늄 SOS (DEA-SOS), 트리에틸암모늄 SOS (TEA-SOS), 및 디에틸암모늄 덱스트란 설페이트를 포함한다. 포획제의 농도는 원하는 약물 장입 특성을 제공하기 위해 선택될 수 있고, 원하는 약물 대 지질 비에 의존하여 250 mN 내지 2 N 다양할 수 있다. 포획제 용액의 노르말농도 (N)은 그것의 약물-복합화 반대 이온의 원자가에 좌우되고 반대 이온 몰농도 및 그것의 원자가의 산물이다. 예를 들어, SOS가 8가 이온인, DEA-SOS 용액의 노르말농도는 SOS 몰 농도 8배와 같다. 따라서, 1 N SOS는 0.125 M SOS와 같다. DEA-SOS가 포획제로서 사용되는 경우, 농도는 바람직하게는 0.5 N 내지 1.5 N, 가장 바람직하게는 0.85 N 내지 1.2 N 범위이다 1.1 N로 TEA-SOS를 사용하는 제형은 인지질의 몰당 도세탁셀 당량 전구약물의 300-800 그램을 함유하는 최종 제형을 초래할 수 있다. 이것은 250 mg 도세탁셀 당량/m2의 용량으로 환자에 8 내지 22 mg 총 지질/kg (302-806 mg/m2)인 지질의 용량을 초래한다. 최종 제형은 250-400 g 도세탁셀 당량/mol 인지질의 바람직한 약물-대-인지질 비를 갖는다
도세탁셀 전구약물은 직접적으로, 또는 다른 가용화 시약 예컨대 200, 300, 또는 400 (PEG-200, PEG-300, PEG-400)의 평균 분자량을 가진 헥사(에틸렌 글리콜) (PEG6) 또는 폴리(에틸렌 글리콜)의 존재 하에 어느 한쪽 산성 완충액에 용해될 수 있다. 임의의 상황 하에, 염기성 조건은 염기성 조건 하에 가수분해하는 도세탁셀 전구약물용 가용화 공정에서 회피되어야 한다.
탁산 전구약물 장입에 사용된 리포좀은, 예를 들면, 에탄올 주사 수화 및 막 압출 방법에 의해 제조된다. 지질 성분은 원하는 특성을 제공하기 위해 선택될 수 있다.
일반적으로, 다양한 지질 성분은 리포좀을 만들기 위해 사용될 수 있다. 지질 성분은 일반적으로, 비제한적으로 (1) 미충전된 지질 성분, 예를 들면, 콜레스테롤, 세라미드, 디아실글리세롤, 아실폴리(에테르) 또는 알킬폴리(에테르) 및 (2) 중성 인지질, 예를 들면, 디아실포스파티딜콜린, 디알킬포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 및 디아실포스파티딜에탄올아민을 포함한다. 다양한 지질 성분은 하나 이상의 원하는 기능을 이행, 변형 또는 부여하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 인지질은 주요한 소포-형성 지질로서 사용될 수 있다. 콜레스테롤의 봉입체는 막 강직성/경직성 유지 및 약물 누출 감소에 유용하다. 폴리머-콘주게이션된 지질은 간 및 비장에 의해 감소하는 리포좀 청소능을 통해 순환의 수명을 증가시키기 위해, 또는, 순환 확대 효과의 부재 하에, 저장 동안 응집에 대해 리포좀의 안정성을 개선하기 위해 리포좀 제형에서 사용될 수 있다.
바람직하게는, 리포좀은 미충전된 지질 성분, 중성 인지질 성분 및 폴리에틸렌 (PEG)-지질 성분을 포함한다. 바람직한 페길화된 지질 성분은 PEG(몰 중량 2,000)-디스테아로일글리세롤 (PEG-DSG) 또는 N-팔미토일-스핑고신-1-{석시닐[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)2000]} (PEG-세라미드)이다. 예를 들어, 지질 성분은 (예를 들면, PEG-DSG의 원하는 양으로 3: 2 몰비에서 스핑고미엘린 및 콜레스테롤을 포함하는) 적합한 몰비에서 에그 스핑고미엘린, 콜레스테롤, PEG-DSG를 포함할 수 있다. PEG-DSG의 양은 바람직하게는 총 리포좀 인지질의 10 mol% (예를 들면, 4-10 mol%)의 양, 또는 미만, 예컨대, 총 인지질의 8 mol % 미만, 및 바람직하게는 총 인지질의 5-7 mol %로 편입된다. 또 다른 구현예에서, 스핑고미엘린 (SM) 리포좀은 주어진 몰비 예컨대 3: 2: 0.03에서 스핑고미엘린, 콜레스테롤, 및 PEG-DSG-E로 구성되는 제형에서 이용된다. 이러한 제형에서 사용된 중성 인지질 및 PEG-지질 성분은 산 가수분해에 대해 일반적으로 더욱 안정적이고 저항성이다. 스핑고미엘린 및 디알킬포스파티딜콜린은 바람직한 인지질 성분의 예이다. 더 구체적으로, 37 ℃ 초과 상전이 온도 (Tm)을 가진 인지질이 바람직하다. 이들은, 비제한적으로, 에그-유래된 스핑고미엘린, 1,2-디-O-옥타데실-sn-글리세로-3-포스포콜린, N-스테아로일-D-에리트로-스핑고실포스포릴콜린, 및 N-팔미토일-D-에리트로-스핑고실포스포릴콜린을 포함한다. 리포좀 제형의 선택은 특정 조건 하에 특정 전구약물의 안정성 및 제조의 비용에 좌우된다.
탁산 전구약물은 바람직하게는 5-40 mM 완충액의 존재 하에 바람직하게는 4 내지 6 범위의 산성 pH에서 리포좀 속에 장입된다. 적합한 산성 완충액은 비제한적으로, 2-(N-모폴리노)에탄설폰산 (MES), 옥살산, 석신산, 마놀산, 글루타르산, 푸마르산, 시트르산, 이소시트르산, 아코니트산, 및 프로판-1,2,3-트리카복실산을 포함한다. 상이한 약물 장입 방법은 리포좀 속에 탁산 전구약물의 효율적인 장입을 용이하게 하기 위해 개발되어 왔다. 일 구현예에서, 전구약물 용액은 먼저 실온에서 리포좀과 혼합되고, 이어서 상승된 온도에서 pH 조정 및 인큐베이션된다. 또 다른 구현예에서, 전구약물 용액 및 리포좀의 pH는 원하는 장입 pH로 먼저 조정되고, 원하는 장입 온도로 사전-가온되고, 그 다음 혼합 및 인큐베이션된다. 더욱 또 다른 구현예에서, 전구약물은 먼저 고 농도에서 80% PEG6 용액에 용해되고, 사전-가온된 리포좀 속에 부분씩 첨가된다. 추가 구현예에서, 전구약물은 먼저 80% PEG400에 용해되고, 덱스트로스 MES 완충액내 약 8% PEG400으로 희석되고, 먼저 실온에서 리포좀과 혼합되고, 그 다음 최대 장입 온도 가온된다.
미캡슐화된 다중황산화된 폴리올 물질은 조성물로부터 제거될 수 있다. 그 다음, 다중황산화된 폴리올 장입 보조제 (바람직하게는 TEA-SOS 또는 DEA SOS)를 함유하는 리포좀은, 리포좀 속에 탁산 또는 탁산 전구약물을 장입하는데 효과적인, 바람직하게는 리포좀 안에서 캡슐화된 다중황산화된 폴리올과 안정적인 염을 형성하는 조건 하에, 적합한 탁산 또는 탁산 전구약물, 예컨대 식 (I)의 도세탁셀 전구약물, 바람직하게는 화합물 3, 화합물 4 또는 화합물 6의 도세탁셀 전구약물과 접촉될 수 있다. 동시에, 장입 보조제 반대 이온 (예를 들면, TEA 또는 DEA)는 약물이 리포좀 속으로 장입됨에 따라 리포좀을 이탈한다. 마지막으로, 미캡슐화된 약물 (예를 들면, 도세탁셀 전구약물)은 리포좀을 포함하는 조성물로부터 제거된다. 리포좀 약물 장입의 방법은 하기에서 기재되어 있다: 미국 특허 번호 8,147,867 (2005년 5월 2일 출원, 참고로 편입됨).
리포좀 조성물 제조에 적합한 방법의 예는 압출, 역상 증발, 초음파처리, 용매 (예를 들면, 에탄올) 주사, 마이크로유동화, 세제 투석, 에테르 주사, 및 탈수/재수화를 포함한다. 리포좀의 크기는 저압 압출에 사용된 막의 기공 크기 또는 마이크로유동화 또는 임의의 다른 적합한 방법에서 이용된 통과의 압력 및 수 제어에 의해 제어될 수 있다. 일 구현예에서, 원하는 지질은 박막 수화에 의해 또는 에탄올 주사에 의해 최초 수화되고 후속적으로 정의된 기공 크기; 가장 통상적으로 0.05 μm, 0.08 μm, 또는 0.1 μm의 막을 통한 압출에 의해 크기화된다. 바람직하게는, 리포좀은 약 90-120 nm, 더욱 바람직하게는 약 110 nm의 평균 직경을 갖는다.
실시예
달리 나타내지 않는 한, "EphA2-Ls-DTX"로 지정된 예시적인 EphA2 표적화된 도세탁셀-생성 나노리포좀 조성물은 아래 실시예에서 기재된 바와 같이 시험되었다. 구체적으로 (달리 나타내지 않는 한) 아래 실시예에서 실험은 46scFv-ILs-DTXp3으로 지정된 EphA2-Ls-DTX 표적화된 리포좀의 대표적인 예로 수득되었다. 46scFv-ILs-DTXp3은, 약 4.4: 1.6: 1의 중량비로 에그 스핑고미엘린, 콜레스테롤 및 PEG-DSG로부터 형성된 지질 소포에서 캡슐화된, 본 명세서에서 화합물 3으로 지정된 식 (I)의 화합물을 포함하고, 또한 지질 소포에서 인지질의 총량의 약 1: 35 내지 1: 285 (예를 들면, 1: 36 내지 1: 284), 또는 바람직하게는 약 1: 142의 중량비로 PEG-DSPE에 공유 결합된 서열 식별 번호: 46의 scFv 모이어티를 포함한다. 하기에서: 일부 실시예 (도7A, 7B, 7C, 7D, 7E, 7F, 8A 및 8B, 및 본 명세서에서 상응하는 실시예), 40scFv-ILs-DTXp3 EphA2-표적화된 도세탁셀-생성 면역리포좀은 (실시예 설명에서 부가되는 제형에 대한 약물 대 지질 비 -정보 그리고 % PEG-DSG에서 차이를 제외하고 46scFv-ILs-DTXp3과 동일한 리포좀 조성물을 포함하는) 데이터를 수득하는데 사용되었다. 일부 예 (도 6A, 6B 및 9)에서 41scFv-ILs-DTXp3 EphA2-표적화된 도세탁셀-생성 면역리포좀은 (실시예 설명에서 부가되는 제형에 대한 약물 대 지질 비 -정보 그리고 % PEG-DSG에서 차이를 제외하고 46scFv-ILs-DTXp3과 동일한 리포좀 조성물을 포함하는) 데이터를 수득하는데 사용되었다. 일부 예에서, 미셀에서 scFv 대 PEG-DSPE의 몰비는 약 1: 4이다. 일부 예에서, scFv의 분자량은 약 26 kDa이고, PEG-DSPE의 분자량은 약 2.8 kDa일 수 있다. 일부 예에서, scFv 및 총 PEG-DSPE의 중량비는, 약 2.25-2.5: 1의 비를 포함하는, 약 2: 1 내지 3: 1이다. EphA2-Ls-DTX 리포좀은, 완충액 시스템 (예를 들면, 시트르산 및 시트르산나트륨), 등장성 제제 (예를 들면, 염화나트륨) 및 희석제로서 멸균수 비히클 (예를 들면, 주사용수)를 포함하는, 약물 생성물을 형성하기 위해 적합한 조성물에서 제형화될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예가 본 명세서에서 개시되는 동안, 이들 대표적인 예는 본 개시내용 변형의 제조 및 사용을 가능하게 한다.
실시예 1: EphA2 표적화된 도세탁셀 생성 리포좀 제조
실시예 1A 수크로스 옥타설페이트 디에틸아민 염 (DEA-SOS)의 제조
단계1 팩킹 및 컨디셔닝: Dowex 50Wx8-200 컬럼.큰 컬럼 (50 mm X 300 mm)에서 350 g Dowex 50WX8-200 음이온 교환 수지를 장입하고, 1200 ml 1M 수산화나트륨, 1600 ml 탈이온수, 1200 ml 3 M 염산, 1600 ml 탈이온수로 연속적으로 수지를 세정한다.
단계 2 수크로스 옥타설페이트 (SOS) 용액: 격렬한 와동과 함께 50 섭씨에 50-ml 원심 튜브에서 15 ml 탈이온수에 30.0 g 나트륨 수크로스 옥타설페이트를 용해시킨다. 용액은 0.2 μm 막을 통해 주사기 여과된다.
단계 3 단계 1에서 제조된 Dowex 컬럼상에 SOS 용액을 장입시킨다. 컬럼을 탈이온수로 용출시킨다. 풀 A로서 전도도 50 ~100 mS/cm, 및 풀 B로서 100 mS/cm 초과 분획을 수집한다. 풀 B내 SOS를 디에틸아민으로 즉시 적정하여 6.7~7.1의 최종 pH로 만든다. 풀 B의 pH가 pH 7.1을 지나가는 경우에서, 풀 A로부터 산성 SOS를 이용하는 pH는 저하된다. SOS 농도는 설페이트 검정에 의해 결정되고 적정 데이터에 의해 확인된다.
실시예 1B PEG-DSG-E의 제조
PEG-DSG-E는 리포좀에 노출된 가수분해 조건에 덜 불안정성이도록 설계된 에테르 지질 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 신규한 콘주게이트이다. 카바메이트 링커 및 에테르 지질의 사용으로 인해, PEG-DSG-E는 온화한 산성 조건 하에 더욱 안정적이고 가수분해에 의해 야기된 PEG의 손실을 방지한다.
물질: 1,2-디옥타데실-sn-글리세롤: CAS: 82188-61-2, BACHEM 제; 메톡시-PEG-NH2: Cat# 12 2000-2, RAPP Polymere 제; P-니트로페닐 클로로포르메이트: CAS: 7693-46-1 Aldrich 제
합성 절차: PEG-DSG-E는 도2C에서 보여진 경로에 따라 합성된다. 상세한 절차는 아래와 같이 기재된다.
단계 1: 1,2-디옥타데실-sn-글리세롤의 활성화.p-니트로페닐 클로로포르메이트 (582 mg, 2.88 mmol, 1.05 당량)을 35 ml 디클로로메탄내 1,2-디옥타데실-sn-글리세롤 (1.642 g, 2.75 mmol) 및 트리에틸아민 (402.5 μl, 2.89 mmol)의 용액에 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반시킨다. 미정제 혼합물 (RH1: 79)를 TLC (헥산/에틸 아세테이트, 3/1)로 분석한다. TLC는 대부분의 개시 물질 1,2-디옥타데실-sn-글리세롤이 활성화된 에스테르 RH1: 79로 전환되는 것을 나타낸다.
단계 2: PEG의 콘주게이션.10 ml 디클로로메탄내 메톡시-PEG-NH2 (5g, 2.5 mmol)의 용액을 RH1: 79의 반응 혼합물 속에 실온에서 붓는다. 혼합물을 Ar로 퍼징하고 혼합물을 실온에서 밤새 교반시킨다. 반응 혼합물을 약 10 ml로 농축시킨다. 격렬한 교반과 함께 80 ml 무수 디에틸 에테르 첨가에 의해 조 생성물을 침전시킨다. 혼합물을 -20 섭씨에서 1 시간 동안 배치시키고, 그 다음 여과시키고 필터 케이크를 수집한다. 필터 케이크를 10 ml 디클로로메탄에 용해시키고 생성물을 재차 80 ml 무수 디에틸 에테르로부터 -20 섭씨에서 침전시킨다. 필터 케이크를 10 ml 디클로로메탄에 용해시키고 용액을 80 g 실리카겔 컬럼에 장입시킨다. 조 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제시킨다. 이동상 A: 클로로포름, B: 메탄올. 용출 세그먼트: 단계 1: 0% B ~ 10% B 6 CV; 단계 2: 10% ~ 15 % B 2 CV.UV 및 ELSD에 의해 검출된 모든 피크를 수집한다. 분획 #18 ~ 22는 RH1: 81A로서 풀링되고; #24 ~ 40은 RH1: 81B로서 풀링된다. 수율, RH1: 81A, 2.5 g. RH1: 81B, 1.8 g.
반응 혼합물의 TLC 분석은 전개 용매: 클로로포름/메탄올, 9/1, v/v로 수행되었다. 1H NMR 스펙트럼은 RH1: 81A가 원하는 콘주게이트이라는 것을 나타낸다.
실시예 1C 리포좀의 제조
리포좀은 에탄올 주사 - 압출 방법에 의해 제조된다. 스핑고미엘린 (SM) 리포좀에 대하여, 지질은 스핑고미엘린, 몰비 3: 2로 콜레스테롤, 그리고 스핑고미엘린의 6-8 mol%의 양으로 PEG-DSG로 구성된다. 간단히, 30 ml 리포좀 제조를 위하여, 지질은 70 섭씨에 50-ml 둥근바닥 플라스크에서 3 ml 에탄올에 용해된다. DEA-SOS (27 ml, 0.65-1.1N)은 70 섭씨 수조에서 65 섭씨 초과로 가온되고 격렬한 교반 하에서 지질 용액과 혼합되어 50-100 mM 인지질을 갖는 현탁액을 제공한다. 수득된 우유빛 혼합물은 그 다음, 예를 들면, 65-70 ℃에서 0.2 μm 및 0.1 μm 폴리카보네이트 막을 통해 써모배럴 리펙스 압출기 (Northern Lipids, Canada)를 이용하여, 반복적으로 압출된다. 인지질 농도는 포스페이트 검정에 의해 측정된다. 입자 직경은 동적 광 산란에 의해 분석된다. 이러한 방법에 의해 제조된 리포좀은 크기 약 95 ~115 nm를 갖는다.
실시예 1D 수용성 약물용 장입 방법
단계 1: 탈이온수로 평형화된 세파로스 CL-4B 컬럼 상에 DEA-SOS 리포좀 (컬럼 용적의 5% 미만)을 장입시킨다. 리포좀의 완전한 흡수를 기다리고, 그 다음 탈이온수로 컬럼을 용출시키고 통과액의 전도도를 모니터링한다.
단계 2: 통과액의 탁도에 따라 리포좀 분획을 수집한다. 다수의 리포좀은 0의 전도도를 낸다. 40 μS/cm보다 더 높은 전도도를 가진 꼬리 분획을 폐기한다.
단계 3: 리포좀 내부에서 DEA-SOS 농도에 의존하는, 7.5-17 wt% 덱스트로스의 최종 농도를 수득하기 위해 리포좀 속으로 50 wt% 덱스트로스의 즉시 첨가에 의해 오스몰농도 균형을 맞추고 리포좀 용적을 측정한다. 완충액은 그것의 완충 pH 범위 및 수용력으로부터 선택된다. 약물 장입 pH는 6을 초과하지 않아야 한다.
단계 4: 농축된 완충액, HCl, 및 NaOH 사용에 의해 리포좀의 pH를 조정한다. 최종 완충액 강도는 5 mM 내지 30 mM 범위이다.
단계 5: 포스페이트 검정에 의해 지질 농도를 분석하고 주어진 투입 약물/지질 비에 필요한 지질의 양을 계산한다.
단계 6: 리포좀 용액에 사용된 것과 동일한 완충액을 가진 7.5-17 wt% 덱스트로스내 약물 용액을 제조한다. 상이한 전구약물 사이 비교를 가능하게 하기 위해, 첨가된 약물의 양은 칭량된 전구약물 염 형태의 양으로부터 보정하기 위해 변환 인자를 이용하는 도세탁셀 중량 당량에 기반되었다 (표 3).
단계 7: 약물 및 리포좀 용액을 혼합하여 원하는 약물/인지질 비 (예를 들면, 150, 200, 300, 450, 또는 600 g 도세탁셀 당량 / 몰 인지질)을 달성하고, 그 다음 일정하게 진탕하면서 15 ~ 30 분 동안 70 섭씨 (또는 원하는 온도)에서 인큐베이션한다.
단계 8: 장입 혼합물을 빙수욕에서 15 분 동안 식힌다.
단계 9: 리포좀의 일부를 PD-10 컬럼상에 장입시키고 MES 완충액 염수 (MBS) pH 5.5, 또는 시트레이트 완충액 염수 pH 5.5, 또는 HBS pH 6.5로 평형화시키고 동일한 완충액으로 용출되게 하고, 리포좀을 수집한다. 양쪽 정제된 및 미정제된 리포좀을 다음 단계 분석을 위하여 유지시킨다.
단계 10: 컬럼 샘플 이전 및 이후 양쪽에 대하여 포스페이트 검정에 의해 인지질 농도를 측정한다.
단계 11: 컬럼 샘플 이전 및 이후 양쪽에 대하여 HPLC에 의해 약물 농도를 분석한다.
단계 12: 캡슐화 효율은 하기와 같이 계산되고: [약물/인지질 (컬럼 이후)]/[약물/인지질 (컬럼 이전)]*100 그리고 약물의 그램/mol 인지질로서 기재된다.
리포좀에서 장입된 약물의 양은 리포좀에서 도세탁셀 당량 / mol 인지질로서 표현된다. 아미노 도세탁셀 하이드로클로라이드 염의 주어진 양에서 도세탁셀 당량을 계산하기 위해, 아래 표 3으로부터 변환 인자를 염의 계량된 양과 곱셈한다. 예를 들어, 화합물 1의 1 g은 1 g X 0.786 = 0.786 g의 도세탁셀에 맞먹는다. 유사하게 화합물 3의 2 g은 2 g X 0.819 = 1.638 g의 도세탁셀에 맞먹는다.
Figure pct00006
실시예 1E 단쇄 폴리에틸렌 글리콜 이용에 의한 물내 난용성 (1 mg/ml 미만) 약물의 장입 방법
이 방법에서, 헥사(에틸렌 글리콜) (PEG6)은 초저 수용성 (1 mg/ml 미만)을 갖는 약물의 가용화 및 장입용 예로서 사용된다. 분자량 200 ~ 500 달톤을 가진 다른 단쇄 PEGs가 또한 동일한 목적을 위하여 작동할 수 있다고 여겨진다. 40 mg/ml로 탈이온수 (용적 기준)내 80% PEG6에서 약물을 가용화시킨다. 리포좀을 70 섭씨로 사전-가온시키고 용액을 지속적으로 약물 장입 전 교반시킨다. 그 다음 약물 PEG6 용액을 리포좀에 소량씩 8회 8 분 동안 1 분 간격으로 첨가한다. 장입 혼합물을 70 섭씨에서 또 다른 22 분 동안 인큐베이션시키고 빙욕에서 15 분 동안 냉각시킨다. 자유 약물을 PD-10 컬럼에서 리포좀으로부터 pH 5.5 MES 완충액 염수 또는 pH 5.5 시트레이트 완충액 염수를 용출 용액으로서 이용함으로써 분리시킨다. 포스페이트 검정 및 HPLC 분석에 의해 컬럼 이전 및 이후 약물/지질 비를 결정한다. 캡슐화 효율 하기와 같이 계산한다: [약물/인지질 (컬럼 이후)]/[약물/인지질 (컬럼 이전)]*100
실시예 1F PEG400 이용에 의한 약물 장입 방법
이 실시예에서, PEG400은 탁산 전구약물용 가용화제로서 더욱 비싼 PEG6을 대체하는데 사용된다. 이 방법은 화합물 4 리포좀 제조용 프로토콜에 의해 예시된다.
파트 1: 약물 용액의 제조
1. 395 mg 화합물 4를 250 ml 유리 병에서 계량한다.
2. 10 ml 80% PEG400, pH 2.8 용액을 첨가하고 이어서 134 μl의 3 M HCl 용액을 첨가한다.
3. 상기 혼합물을 50 ℃ 수조에서 약 10 분 동안 간헐적 진탕과 함께 가온시킨다. 화합물 4의 맑은 용액은 수득된다.
4. 90 ml 5 mM MES 5% 덱스트로스 pH 3.8 용액 첨가에 의해 용액을 10 X 희석시킨다. 최종 용액 pH는 4.5이다.
5. 희석된 용액을 65 ℃로 가온시키고, 용액을 1 μm PES 막을 통해 여과시킨다.
파트 2: SOS-리포좀의 제조
1. 리포좀 제형: SM/Chol/PEG-DSG = 3/2/0.24 mol/mol/mol, 1.1 M DEA-SOS, 크기: 99.7 nm.
2. 40 μS/cm 이하 잔여 전도도로 세파로스 CL-4B상의 겔 크로마토그래피에 의해 외부 SOS를 제거한다.
3. 45wt% 덱스트로스를 리포좀에 첨가하여 최종 12% 덱스트로스를 수득한다.
4. 1 M pH 5.4 시트레이트 용액을 리포좀에 최종 20 mM로 첨가한다
5. 포스페이트 검정에 의해 포스페이트 농도를 결정한다
파트 3: 화합물 4의 장입
1. 화합물 4 용액을 파트 2에서 제조된 리포좀과 600 g/mol의 약물/지질 비로 실온에서 혼합시킨다.
2. 혼합물을 70 ℃에서 테플론 박-벽 튜우빙에 의해 만들어진 열 교환기를 통해 펌핑하여 혼합물이 65 ℃ 초과로 2 분 이내 가온되는 것을 확실히 한다.
3. 장입 혼합물을 70 ℃에서 30분 동안 교반하면서 인큐베이션시킨다.
4. 빙수에 담겨진 열 교환기를 통해 이들을 펌핑함으로써 빠르게 장입된 리포좀을 냉각시킨다.
파트 4: 정제 및 농축화
1. 자유 화합물 4를 접선 유동 여과 (TFF)에 의해 제거하고 완충액을 시트레이트 완충액 염수 pH 5.5로 교환한다
2. 리포좀을 TFF에 의해 농축시키고, 그 다음 리포좀을 1 μm, 0.45 μm, 및 0.2 μm PES 막을 통해 순차적으로 여과시킨다.
실시예 1G 항체-지질 콘주게이트의 제조
항체-PEG-지질 콘주게이트는 항체-연결된 리포좀을 형성하는데 사용된다. 이들은 편리한 시스템 (예를 들면 포유류 세포)에서 발현된 scFv 단백질로 시작하여 제조될 수 있고, 예를 들면, 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 또는 임의의 다른 적합한 방법에 의해 정제될 수 있다. 콘주게이션을 유효화하기 위해, scFv 단백질은 시스테인 잔기를 함유하는 C-말단 서열로 설계된다. scFv-PEG-지질 콘주게이트, 예컨대 scFv-PEG-DSPE의 제조는 문헌 (Nellis 등 Biotechnology Progress, 2005, vol. 21, p. 205-220; Nellis 등 Biotechnology Progress, 2005, vol. 21, p. 221-232; 미국 특허 번호 6,210,707)에서 기재된다. 예를 들어, 하기 프로토콜은 사용될 수 있다:
단계 1: 2시간 동안 4 °C에서 pH 6.0 CES 완충액 (10 mM 시트르산나트륨, 1 mM EDTA, 144 mM 염화나트륨)에 대해 scFv 단백질 원액을 투석시킨다.
단계 2: 1시간 동안 37 °C에서 20 mM 2-메르캅토에탄아민의 존재 하에 pH 6.0 CES 완충액에서 항체를 감소시킨다.
단계 3: Sephadex G-25 컬럼에서 감소된 항체를 정제시킨다.
단계 4: 2시간 동안 실온에서 pH 6.0 CES 완충액내 4 몰 과잉의 말레이미드-PEG-DSPE로 감소된 항체를 인큐베이션시킨다. 0.5 mM의 최종 농도로 시스테인 첨가에 의해 반응을 ?칭시킨다.
단계 5: Amicon 교반 세포 농축기에서 콘주게이션 혼합물을 농축시킨다.
단계 6: Ultrogel AcA44 컬럼에서 자유 항체로부터 콘주게이트를 분리시킨다.
단계 7: 콘주게이트를 SDS-PAGE에 의해 분석한다.
실시예 1H 표적화된 리포좀의 제조
항체-표적화된 리포좀은 항체의 열적 안정성에 의존하여 30분 동안 60 C에 또는 12시간 동안 37 ℃에 수성 완충액에서 리포좀으로 항체-PEG-지질 콘주게이트 (실시예 1G) 인큐베이팅에 의해 제조될 수 있다. 미셀 콘주게이트의 지질 부분은 자체를 리포좀 이중층 속으로 자발적으로 삽입한다. 참조, 예를 들면, 미국특허 번호 6,210,707 (1998년 5월 12일 출원되고 본 명세서에서 참고로 편입됨). 리간드 삽입된 리포좀은, 예를 들면, 세파로스 CL-4B 컬럼상의 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제되고 지질 농도용 포스페이트 검정 및 항체 정량화용 SDS-PAGE에 의해 분석된다.
실시예 1I 삼중수소 표지된 리포좀의 제조
지질 이중층 (삼중수소-표지된 리포좀)에서 비-교환가능한 삼중수소 표지된 지질, 3H-콜레스테를릴 헥사데실 에테르 (3H-CHDE)를 가진 약물 장입된 리포좀은 양쪽 약물 및 지질의 약동학 동시 모니터링을 허용한다. 다양한 포획 시약을 가진 상이한 제형의 삼중수소-표지된 리포좀은 압출 방법에 의해 제조된다. 삼중수소-표지된 "비어있는" 리포좀 (즉, 약물을 함유하지 않는 리포좀) 제조용 일반 프로토콜은, 예를 들어, 아래와 같을 수 있다.
1. 12-mL 유리 바이알을 클로로포름/메탄올 (2/1, v/v), 그 다음 아세톤으로 깨끗이 하고, 바이알을 히팅 건으로 건조시킨다.
2. 톨루엔내 1 mL 상업적으로 입수가능한 3H-CHDE 용액을 유리 바이알에 이동시킨다. 30 분 동안 실온에서 아르곤의 스트림으로 용액을 건조시키고, 밤새 오일 펌프 진공 하에 바이알을 비운다.
3. 제형에 따라 지질을 계량하고, 3H-CHDE를 함유하는 바이알 속에 이들을 첨가한다.
4. 1 mL 200-프루프 에탄올을 지질 바이알 속에 첨가하고 최대 70 ℃ 가열시켜 맑은 용액이 수득되는 때까지 지질을 용해시킨다.
5. 따듯한 지질 용액을 10 mL 사전-가온된 포획 시약 용액에 첨가한다. 15분 동안 70 ℃에서 혼합물 교반을 유지시켜 다중-라멜라 소포 (MLV)를 생산한다.
6. 원하는 리포좀 크기 (예를 들면, 약 110 nm)가 달성되는 때까지 70 ℃에서 적절한 기공 크기 (예를 들어, 0.2 μm, 0.1 μm, 및 0.08 μm )를 가진 폴리카보네이트 트랙-에칭된 막 필터를 통해 MLVs를 반복적으로 통과시킨다. 압출된 리포좀을 4 ℃에서 유지시킨다.
도세탁셀 전구약물은 약물의 특성에 의존하여 실시예 1D-F에서 기재된 방법에 따라 삼중수소-표지된 리포좀 속에 장입된다. 표적화 항체는 실시예 1H에서 기재된 방법에 의해 약물 장입된 리포좀 속에 삽입된다.
실시예 2: 마우스내 삼중 음성 유방 암 이종이식편 모델에서 도세탁셀 및 EphA2 표적화된 도세탁셀-생성 나노리포좀 조성물의 약물 체내분포.
본 실시예는 EphA2-표적화된 도세탁셀-생성 면역리포좀의 약물 체내분포를 기재하고 도세탁셀은 인간 삼중 음성 유방 암 MDA-MB-231의 이종이식편 모델에서 연구되었다.
MDA-MB-231 세포는 Asterand Bioscience로부터 수득되었고 37 ℃, 5% CO2에서 5% 소태아 혈청, 10 mM HEPES, 5 μg/ml 인슐린, 1 μg/ml 하이드로코르티손, 50 U/ml 페니실린 G, 및 50 μg/mL의 스트렙토마이신 설페이트로 보충된 RPMI 배지에서 번식되었다.
EphA2-ILs-DTX 면역리포좀은, 실시예 1에서 기재된 바와 같이 315 도세탁셀 당량/몰 인지질의 약물/지질 비에서 화합물 3으로 장입되고 제조된, 포획된 1.1N TEA-SOS를 함유하는, 에그 스핑고미엘린, 콜레스테롤 (3: 2 몰비) 및 5 mol % PEG-DSG로 구성된 지질 부분, 그리고 리포좀의 외부에 부착된 서열 식별 번호: 40의 scFv를 가진, 40scFv-ILs-DTXp3이었다.
SCID 베이지 동종접합성 암컷 마우스 (5-6 주령)은 Charles River로부터 수득되었다. 마우스는 30% 성장 인자 감소된 Matrigel® 매트릭스 (Corning, cat. # 354230)으로 보충된 PBS에 현탁된 0.5 x 106 세포를 함유하는 0.08 mL의 현탁액으로 유선-우측 흉부 지방 패드 속에 동소이식으로 접종되었다. 종양이 200 mm3 내지 350 mm3 크기를 달성하였던 경우 동물은 하기 방법에 따라 처리 그룹으로 배정되었다. 동물은 종양 크기에 따라 등급화되었고, 감소하는 종양 크기의 6 카테고리로 분할되었다. 4 동물/그룹의 처리 그룹은 각각의 크기 카테고리로부터 한마리 동물을 무작위로 선택함으로써 형성되었고, 이로써 각각의 처리 그룹에서 모든 종양 크기는 동등하게 표시되었다. 처리 아암 및 희생 시점은 표 4에서 요약된다. 각각의 그룹은 3 동물로 구성된다. "Mpk"는 약물의 mg / kg 동물 체중을 나타낸다.
Figure pct00007
동물은 50 mpk에서 40scFv-ILs-DTXp3 또는 10 mpk에서 자유 도세탁셀의 하나의 꼬리 정맥 주사를 받았다. 각각의 시점에서, 동물은 희생되었고 종양, 간 및 비장은 수집되었고 플래시 냉동되었다.
모든 조직 샘플은 해동되었고, 계량되었고, 그 다음 0.25% 트리플루오로아세트산을 함유하는 40% 아세토니트릴의 용액에서 Bullet Blender (Next Advance, Inc., Averill Park, NY)를 이용하여 기계적으로 균질화되었다. 산은 화합물 3의 pH 안정화용 용매에서 포함되었다. 상기 표적 조직 농도는 총 균질물 (즉 조직 플러스 용매)의 밀리리터당 200 mg의 조직이었지만; 낮은 조직 중량 (<100 mg)의 경우에서, 최종 조직 농도는 100 mg/mL이었다.
균질화된 조직 샘플은 화합물 3 및 DTX를 개별적으로 측정하기 위해 2 생체분석적 검정을 이용하여 분석되었다. 양쪽 방법은 탠덤 질량 분광분석 검출 (LC-MS/MS)와 고압 액체 크로마토그래피 검정을 사용한다. 피분석물, 화합물 3 및 DTX는 전기분무 이온화를 이용하는 양성 이온 방식으로 다중 반응 모니터링 (MRM)에 의해 양쪽 검정에서 검출되었다. 균질화된 조직 샘플은, 암컷 CD-1 리튬 헤파린처리된 마우스 혈장 (Bioreclamation, LLC, Westbury, New York) 및 200 mM 인산나트륨 완충액 (pH 2.5)의 3: 2 혼합물인, 산성화된 혈장 매트릭스 속으로 화합물 3 또는 DTX를 스파이킹함으로써 제조된 추출된 보정 표준 및 품질관리 (QC) 샘플을 이용하여 화합물 3 및 DTX에 대하여 정량화되었다. 화합물 3 및 DTX에 대하여 보정 범위는 15.0 - 5,000 ng/mL 및 3.00 - 1,000 ng/mL, 각각이었다. 산성화된 혈장 QCs는 화합물 3에 대하여 45.0, 375 및 3,750 ng/mL에서 그리고 DTX에 대하여 9.00, 75.0 및 750 ng/mL에서 제조되었다. 보정 곡선은 피분석물/내부 표준 (IS) 피크 면적 반응 비 대 명목 농도 (ng/mL) 그리고 1/농도2의 계량 인자를 가진 계량된 선형 회귀를 이용하여 생성되었다.
화합물 3에 대하여 샘플 추출은 IS, 파클리탁셀을 함유하는 200 μL의 산성화된 아세토니트릴과 조직 균질물의 50 μL 분취액 혼합에 의해 단백질 침전을 이용한다. 수득한 용액은 철저하게 와동되고 그 다음 10 분 동안 14,000 rpm 및 4 oC에서 원심분리된다. 상청액의 50 μL 분취액은 제거되고 자동시료주입기 바이알에서 12% 아세토니트릴 및 0.1% 포름산을 함유하는 200 μL의 물과 혼합된다. 수득한 용액의 10 μL 분취액은 주사된다. 추출된 화합물 3 샘플의 LC-MS/MS 분석은 CTC Analytics PAL 자동시료주입기 및 TSQ Quantum Ultra 질량 분광분석기 (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts)를 가진 Finnigan Surveyor MS Pump Plus 시스템을 이용하여 수행된다. 크로마토그래피 분리는 하기에서 달성된다: Atlantis dC18, 2.1 x 150 mm 컬럼 (파트 번호: 186001301, Waters Corporation, Milford, Massachusetts) (30 oC 컬럼 온도, 400 μL/분의 유량, 및 11.0 분의 실행 시간으로 포름산을 함유하는 물/아세토니트릴의 구배를 이용함).
도세탁셀 (DTX)용 분석은 균질화된 조직의 50 μL 분취액, 산성화된 메탄올내 50 μL의 파클리탁셀 IS, 900 μL의 1% 트리플루오로아세트산, 및 4.0 mL의 n-부틸 클로라이드: 아세토니트릴 (4: 1)이 유리 스크류-최상부 튜브에서 함께 첨가되는 액체-액체 추출 (LLE) 절차를 이용한다. 튜브는 테플론-라이닝된 캡으로 캡핑되었고, 와동되었고, 15 분 동안 회전되었고, 그 다음 3,000 rpm 및 4 oC에서 15 분 동안 원심분리되어 액상을 분리시켰다. 드라이아이스/아세톤 배쓰에서 수성상 냉동 후, n-부틸 클로라이드: 아세토니트릴 층은 신규한 유리 스크류-최상부 튜브 속에 쏟아부어지고 35 oC에서 질소 하에 증발된다. 잔기는 2.5 M 포름산과 75 μL의 30% 아세토니트릴에서 재구성되고 3,200 rpm 및 4 oC에서 20 분 동안 원심분리되어 불용성 물질을 분리시킨다. 수득한 상청액은 자동시료주입기 바이알에 전달되었고 20 μL 분취액은 주사되었다. 추출된 DTX 샘플의 LC-MS/MS 분석은 Agilent 1200 시리즈 HPLC 시스템 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) 및 AB Sciex API 3000 질량 분광분석기 (AB Sciex, Framingham, MA)를 이용하여 수행된다. 크로마토그래피 분리는 하기에서 달성된다: Atlantis dC18, 2.1 x 150 mm 컬럼 (파트 번호: 186001301, Waters Corporation, Milford, Massachusetts) (30 oC 컬럼 온도, 400 μL/분의 유량, 및 13.0 분의 실행 시간으로 포름산을 함유하는 물/아세토니트릴의 구배를 이용함). 도 5는 MDA-MB-231에서 측정된 종양, 비장 및 간내 DTX (도세탁셀) 및 화합물 3 (도세탁셀 전구약물) 수준을 보여주는 그래프이다. 40scFv-ILs-DTXp3은 화합물 3에서 나타낸 바와 같이 종양에서 장기적인 노출을 보여준다. 자유 도세탁셀에 비교된 경우, 40scFv-ILs-DTXp3은 나중 시점에서 시작하는 도세탁셀의 축적으로 이어졌지만 최대 일 10 (240 시간) 지속되었다. 도세탁셀/화합물 3 비에서 변화는 종양 부위에서 그러나 간 및 비장에서 더 적은 정도로 화합물 3의 도세탁셀로의 지속된 전환을 시사한다.
실시예 3: EphA2-표적화된 리포좀은 스페로이드로서 배양된 EphA2-발현 세포를 특이적으로 결합 및 침투시킨다.
이 연구에서, 우리는 침투 깊이로 상기 표적에 리포좀 결합의 효과 분석의 목적으로 종양 속에 리포좀 침투의 생체외 3차원 (3D) 모델을 확립하였다. 우리는 EphA2 표적화가 고도로 특이적이었고 리포좀-스페로이드 회합이 EphA2+ 세포로 인큐베이션된 경우 EphA2 표적화된 리포좀에서만 보여졌다는 것을 알아내었다. 형광 지질 표지 DiIC18(3)-DS 및 DiIC18(5)-DS를 포함하는 시험 리포좀은 아래 실시예 4에서 기재된 바와 같이 제조되었다.
세포 배양
BT474-M3 세포는 Hermes Bioscience (San Francisco, CA)로부터 선물이었다 OVCAR-8 세포는 National Cancer Institute (Bethesda, MD)로부터 수득되었다. NCI-H1993은 미국 종균 협회 (Manassas, VA) 출신이었다. 세포주는 RPMI에서 배양되었고; 세포 통로용 배양 배지는 10% FBS 플러스 페니실린/스트렙토마이신으로 보충되었고, 일상적인 배양 통과는 트립신화에 의한 것이었다. 모든 이미지형성 실험에 대하여 사용된 배양 배지는 페놀 레드 자유 RPMI이었다. 세포는 37 ℃에서 5% CO2내 배양 또는 IncuCyte ZOOM™ 실험을 위하여 인큐베이션되었다.
스페로이드 형성용 시험
세포주가 스페로이드로서 성장할 지를 결정하기 위해, 5000 세포는 완전한 배지내 Costar 7007 U-바닥, 초-저 접착 96-웰 플레이트 (Corning, Corning NY)에서 플레이팅되었고 4 일의 배양을 허용하여 스페로이드를 확립하였다. 세포 플레이팅의 이러한 방법은 스페로이드로 모든 후속적인 실험에 대하여 사용되었다.
리포좀 흡수에서 수용체 표적화 입증용 시험
완전한 배양 배지는 웰들의 바닥에 세포의 부드러운 스피닝 다운후 플레이트로부터 제거되었고, 위약 비 약물 장입된 형광 태그된 리포좀 (DiIC18(3) - Thermofisher Scientific, D-282)를 함유하는 (페니실린/스트렙토마이신으로 보충된) 무혈청, 페놀-레드-자유 배지로 대체되었다 DilC18(3)-Ls는 25 μM 인지질의 최종 농도에서 어느 한쪽 표적화되었거나 (46scFv-ILs) 또는 비-표적화되었다 (NTLs). 음성 대조군 웰은 무혈청 배지 단독을 받았다. 플레이트는 IncuCyte ZOOM™ 속에 장입전 웰들의 바닥에서 스페로이드를 집중하기 위해 간단히 방사되었다. 스캐닝은 리포좀의 첨가 1 시간 내에 착수하였고 최소 18 시간 동안 매 30-45 분 계속하도록 계획되었다.
리포좀 흡수에서 수용체 밀도의 효과용 시험
사용된 세포주는 모두 스페로이드를 형성할 수 있었다: NCI-H1993 (폐), OVCAR-8 (난소), 및 BT474-M3 (유방). U-바닥 플레이트에서 배양물은 수용체 표적화용 시험에 대해 실시된 것처럼 무혈청, 페놀-레드 자유 배지에서 이미지형성 리포좀 흡수전 4 일 동안 확립하게 되었다. 표적화 리간드 46scFV를 가진 형광적으로-콘주게이션된 리포좀은 25 μM 인지질의 최종 농도에서 적용되었다.
IncuCyte ZOOM™으로부터 이미지의 분석
이미지는 각각의 시점에서 각각의 웰에 대하여 쌍으로 된 형광 및 위상 콘트라스트 이미지를 가진 TIFF 포멧으로 IncuCyte ZOOM™으로부터 전해졌다. 인하우스 MATLAB (Mathworks, Natick MA) 스크립트는 이미지를 분석하는데 사용되었다. 요약하면, 스페로이드는 모서리 검출 알고리즘를 이용하여 위상-콘트라스트 이미지에 기반하여 세그먼트화되었고, 스페로이드의 주변은 형태적 오퍼레이터 예컨대 밀폐 및 구멍 충전을 이용하여 추가로 정제되었고, 매칭된 형광 이미지 파일에서 적색 형광 신호의 강도는 추출되었고, 스페로이드의 주변으로부터 적색 신호의 평균 강도는 계산되었다. 평균 형광 강도와 스페로이드 모서리까지 거리 사이 관계는 리포좀 침투를 추정하는데 사용된다. 주변으로부터 거리 플롯에서 유래된 AUC 대 신호 강도는 각각의 측정된 시점에 대하여 계산되었다.
스페로이드 배양물내 EphA2의 수준 검정
이미지형성 실험의 완료시, 96 웰 배양판은 IncuCyte ZOOM™으로부터 제거되었고 얼음상에 셋팅되었다. 다중 웰들로부터 스페로이드는 풀링되었고 차가운 PBS에서 린스되었다. 세포는 4 ℃에 30 분 냉각된 BioPlex 세포용해 버퍼 (Bio-Rad, Hercules CA)에서 용해되었고, 그 다음 -80 ℃에 저장되었다. 인간 EphA2용 ELISA 검정은 제조자의 지침 (R&D Systems, Minneapolis MN) 그리고 BSA 표준을 가진 BCA 검정 (Pierce/ThermoFisher, Waltham MA)에 의해 측정된 총 단백질에 비해 표시된 값에 따라 운영되었다.
스페로이드에 의한 표적화된 리포좀 흡수는 EphA2 발현을 요구한다
리포좀 흡수의 관찰은 IncuCyte ZOOM™ 데이터 시각 도구를 이용하여 수행되었다. 형광 신호는 스페로이드의 주변에서 먼저 보여졌고 시간에 따라 중심을 향해 연장될 것이었다. 리포좀 세포 결합은 EphA2+ 세포에서 그리고 EphA2-표적화된 리포좀을 이용하여 단지 보여졌다. 비-표적화된 리포좀은 EphA2 수준과 무관하게 스페로이드의 표면 또는 내측에서 어느 한쪽 형광을 보여주지 않았다. 초저 EphA2 발현을 가진 세포주 (예를 들면 BT474-M3)은 이들 실험에서 허용된 ~24 시간 기간에 걸쳐 스페로이드를 취득하지 못했다.
IncuCyte ZOOM™으로 획득된 이미지는 세포가 표적화된, Dil-5-표지된 리포좀으로 인큐베이션 전 (23 시간 시점) 스페로이드를 형성하도록 되었던 대표적인 실험의 완료에서 2 세포주 (NCI-H1993, 및 BT474-M3)에 대하여 수득되었다. 어느 한쪽 적색 형광 이미지 또는 위상 콘트라스트 이미지를 함유하는 원 데이터 파일은 대표적인 실험의 완료에서 리포좀 흡수의 정도를 보여주기 위해 겹쳐졌다. 이들 이미지는 형광 채널에 대하여 동일한 척도를 이용하여 창출되었다. EphA2의 측정된 수준은 NCI-H1993 스페로이드에서 24 pg/μg 총 단백질 및 BT474-M3 스페로이드에서 2 pg/μg이었다.
인지질 성분에 비해 표적화 분자의 다양한 농도로 리포좀의 흡수는 최고 리포좀 흡수를 가진 세포주에서 가장 명확히 시각화되었다. 표적화된 리포좀으로 25 시간 (연구 끝) 인큐베이션에서 NCI-H1993 스페로이드.
3D 종양 스페로이드에서 EphA2-리포좀 침투의 동력학
평균 형광 강도 (MFI)의 분석은 포화 도달 없이 마지막 분석된 시점까지 지속하였던 점진적인 리포좀 흡수를 보여주었다. 점진적인 증가는 스페로이드에서 더 깊은 층을 침투하는 리포좀 뿐만 아니라 세포에 의해 양쪽 리포좀 결합/내재화를 반영한다.
실시예 4: 마우스내 식도 암 이종이식편 모델 및 전이성 유방 암 모델에서 정상 조직 및 종양내 EphA2 표적화된 리포좀, 비-표적화된 리포좀 및 EphA2 항체의 미세분포.
EphA2 표적화된 비 약물 장입된 리포좀 (46scFv-Ls), 비-표적화된 리포좀 (NT-Ls) 및 EphA2 항체 1C1 (서열 식별 번호: 39 클론 1C1, 공개된 PCT 특허 출원 PCT/US06/34894에서 개시됨, 2008년 8월 4일 출원됨)의 미세분포는 인간 식도 암종 OE-19의 이종이식편 모델의 종양 및 정상 조직에서 그리고 삼중 음성 유방 암 MDA-MB-231의 전이성 모델의 종양 및 폐에서 연구되었다.
OE-19 세포는 European Collection of Cell Cultures (Salisbury, UK) Asterand Bioscience로부터 수득되었다. MDA-MB-231은 Asterand Bioscience로부터 수득되었다. 세포는 37°C, 5% CO2에서 5% 소태아 혈청, 10 mM HEPES, 5 μg/ml 인슐린, 1 μg/ml 하이드로코르티손, 50 U/ml 페니실린 G, 및 50 μg/mL의 스트렙토마이신 설페이트로 보충된 RPMI1640 배지에서 번식되었다.
OE-19 모델에 대하여, NCR nu/nu 동종접합성 무흉선 숫컷 누드 마우스 (5-6 주령)은 Taconic으로부터 수득되었다. 5 마우스 / 그룹은 PBS에 현탁된 10 x 106 세포를 함유하는 0.1 mL의 현탁액으로 옆구리에서 이소성으로 접종되었다. 종양이 150 mm3 내지 350 mm3 크기를 달성하였던 경우 동물은 리포좀 혼합물 또는 EphA2 IgG 항체 (1C1, 서열 식별 번호: 39로서 포함됨)로 주사되었다.
전이성 삼중 음성 유방 암의 2 모델은 MDA-M-231 세포주에 기반하여 사용되었다. 1) 암 세포의 정맥내 접종을 통해 생성된 전이성 병변 (MDA-MB-231 IV 모델) 2) 폐에서 전파 및 병변 발생에 충분한 시간을 제공하는 유선 지방 패드에서 암 세포의 낮은 수의 동소 이식을 통해 생성된 전이성 병변 (MDA-MB-231 동소이식).
MDA-MB-231 IV 모델에 대하여, NCR nu/nu 동종접합성 무흉선 암컷 누드 마우스 (5-6 주령)은 Taconic으로부터 수득되었다. PBS에 현탁된 0.5 x 106 MDA-MB-231 세포는 3 마우스에서 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사되었다. 동물은 세포 주사후 4 주에서 희생되었고, 폐는 전이성 병변의 분석을 위하여 추출되었다.
MDA-MB-231 동소이식 모델에 대하여, SCID 베이지 암컷 마우스 (5-6 주령)은 Taconic으로부터 수득되었다. 5 마우스는 유선 지방 패드에서 동소이식으로 양측으로 접종되었다. 각각의 샘에 대하여, PBS에 현탁된 0.5 x 106 세포를 함유하는 0.2 mL의 현탁액은 30 % 성장 인자 감소된 Matrigel® 매트릭스 (Corning, cat. # 354230)으로 보충되었다. 전이의 개연성을 증가시키기 위해, 각각의 동물은 양측으로 접종되었고 2개의 1차 종양을 가졌다. 동물은 세포 접종후 8 주에서 희생되었고 종양 및 폐는 1차 종양 및 전이성 병변의 분석을 위하여 추출되었다
생체내 리포좀 미세분포에서 표적화의 효과를 시험하기 위해, 희생 24 시간 전, 동물은 2개의 상이한 친유성 형광 염료 DiIC18(5)-DS 및 DiIC18(3)-DS, 각각 (EphA2-ILs/NT-Ls 그룹)으로 표지된 1 마이크로몰/리포좀 유형/동물의 용량에서 EphA2 표적화된 비 약물 장입된 위약 리포좀 및 비-표적화된 비 약물 장입된 위약 리포좀의 혼합물로 주사되었다 DiIC18(5)와 DiIC15(3) 사이 형광에서 차이에 대하여 제어하기 위해, 각각의 모델로부터 1마리 동물은 조직 (NT-Ls/NT-Ls 그룹)에서 동등하게 분포시켜야 하는 비-표적화된 리포좀의 혼합물로 주사되었다.
제2 그룹의 동물은 5 mg/kg bw에서 항-EphA2 항체 클론 1C1 (서열 식별 번호: 39)로 주사되었다.
비 약물 장입된 리포좀은 에탄올 주사 - 압출 방법에 의해 제조된다. 스핑고미엘린 (SM) 리포좀에 대하여, 지질은, 0.3 mol %의 총 인지질의 비에서 첨가된 어느 한쪽 DiIC18(3)-DS (DiI3-Ls), 또는 DiIC18(5)-DS (DiI5-Ls) 형광 지질 표지와, 스핑고미엘린, 콜레스테롤 및 PEG-DSG (3: 2: 0.24 몰 부)로 구성된다. 간단히, 30 ml 리포좀 제조를 위하여, 지질은 70 섭씨에 50-ml 둥근바닥 플라스크에서 3 ml 에탄올에 용해된다. HEPES-완충 식염수 (5 mM HEPES, 144 mM NaCl, pH 6.5)는 70 섭씨 수조에서 65 초과 섭씨로 가온되고 격렬한 교반 하에서 지질 용액과 혼합되어 50-100 mM 인지질을 갖는 현탁액을 제공한다. 수득된 우유빛 혼합물은, 예를 들면, 65-70 ℃에서 0.2 μm 및 0.1 μm 폴리카보네이트 막에 써모배럴 리펙스 압출기 (Northern Lipids, Canada)를 이용하여, 그 다음 반복적으로 압출된다. 인지질 농도는 포스페이트 검정에 의해 측정된다. 입자 직경은 동적 광 산란에 의해 분석된다. 이러한 방법에 의해 제조된 리포좀은 크기 약 95 ~115 nm를 갖는다. 항-EphA2 scFv 단백질은 포유류 세포 배양에서 발현되었고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었고, 1: 4 단백질/mal-PEG-DSPE 몰비로 수용액에서 말레이미드-종결된 리포폴리머, mal-PEG-DSPE에 C-말단 시스테인 잔기를 통해 콘주게이션되었다. 수득한 미셀 scFv-PEG-DSPE 콘주게이트는 Ultrogel AcA34상의 겔 크로마토그래피 (Sigma, USA)에 의해 정제되었다. 표적화된 DiI3-Ls 또는 DiI5-Ls는 40scFv-ILs에 대하여 10-12 g/mol 인지질, 및 46scFv-ILs에 대하여 5 g/mol 인지질의 scFv/리포좀 비에서 항체의 열적 안정성에 의존하여 30분 동안 60 ℃에서 미셀 항-EphA2 scFv-PEG-DSPE 콘주게이트로 인큐베이션에 의해 제조되었다. 리간드 삽입된 리포좀은 세파로스 CL-4B 컬럼에서 정제되고 지질 농도용 포스페이트 검정 및 항체 정량화용 SDS-PAGE에 의해 분석된다.
OE-19 모델에 대하여, 46scFv-ILs는 사용되었다. MDA-MB-231 모델에 대하여, 40scFv-ILs 리포좀은 사용되었다 (모든 조직은 주사후 24 시간 수집되었다. 마우스는 CO2로 질식에 의해 한번에 하나 희생되었고, 조직은 수집 직전 10-15 ml PBS로 살포되었다. 절제된 조직은 동물당 3 동결절편을 가진 OCT 배지에서 냉동되었다: 1) 심장, 폐, 간, 비장; 2) 종양, 결장, 신장, 뇌; 3) 피부.모든 냉동된 조직 및 저온 유지 장치 섹션은 -80 ℃에 저장되었다. MDA-MB-231 동소이식 모델에 대하여, 폐 및 종양은 절제되었고 하나의 OCT 블록에서 냉동되었다. MDA-MB-231 IV 모델에 대하여, 단지 폐가 절제되었고 동물당 하나의 OCT 블록에서 냉동되었다. 리포좀 주사된 그룹에 대하여, 냉동 섹션은 4% 파라포름알데하이드로, 10 분 고착 전 실온 5-10 분에서 설정하게 되었다. 샘플은 TBS로 린스되었고, 핵은 DaVinci Green Diluent (BioCare Medical, Concord CA)에서 희석된 Hoescht 33342 (Invitrogen/ThermoFisher, Grand Island NY)로 대조염색되었다. 샘플은 TBS로 린스되었고, Prolong Gold (Invitrogen)에서 실장되었고, 이미지형성 전 밤새 셋팅되었다.
1C1 그룹 (서열 식별 번호: 39)에 대하여, 추가의 단계는 항체를 염색하기 위해 수행되었다. 요약하면, 저온 유지 장치 섹션은 차가운 NBF로, 10 분 고착전 실온에서 5-10 분 위치해 있었다. 샘플은 TBS-T로 린스되었고, 그 다음 비특이적 결합은 Background Sniper (BioCare)로, 10 분 차단되었다. TBS-T로 또 다른 린스 이후, 인간 IgG는, 4°C에 습도 챔버에서 밤새 인큐베이션 하면서, DaVinci Green 희석제내 5 μg/ml 염소-항-인간 IgG (감마-쇄 특이적; Vector Laboratories, Burlingame CA)로 검출되었다. 대조 슬라이드의 연속 섹션은 염소 항-토끼 IgG의 동등 농도로 병렬적으로 인큐베이션되었다. TBS-T로 세정후, 결합된 항-인간 또는 항-토끼 항체는 20 μg/ml Alexa647-콘주게이션된 당나귀 항-염소 IgG H+L (Invitrogen)으로, 30 분, 실온 검출되었다. 이들 샘플은 Hoescht 33342로 대조염색되었고 리포좀의 가시화에 대하여 기재된 바와 같이 Prolong Gold에서 실장되었다.
이미지는 20X 배율에서 AperioFL Scanscope (Leica Biosystems, Buffalo Grove IL)로 수집되었다. 각각의 채널은 DAPI (Hoescht-염색된 핵), SPOR-B (DiI3 리포좀), 및 CY5 (DiI5 리포좀, Alexa647-콘주게이션된 항체)용 필터로 독립적으로 수집되었다. 인간 IgG 1C1의 가시화에 대하여, 항-토끼 IgG로 염색된 대조 슬라이드는 시험 샘플을 위하여 사용된 동일한 설정으로 이미지화되었다.
리포좀 침착의 정량화 그리고 표적화된 및 비-표적화된 리포좀의 중첩의 정도의 비교는 Matlab (Mathworks, Natick, MA)를 이용하여 개발된 인하우스 알고리즘 및 사용자 인터페이스를 이용하여 실시되었다. 요약하면, 핵 염색 세그먼트화에 의해 결정된 종양 또는 정상 장기 이내 조직 영역은 200x200μm의 타일 및 상응하는 형광 이미지로부터 추출된 EphA2-표적화된 리포좀 및 비-표적화된 리포좀의 평균 강도로 세분되었다. 비율계 이미지형성은 단일 픽셀 수준에서 2 채널의 비 계산에 의해 수행되었다. 이미지는 10 마이크론 / 픽셀의 해상도로 개방되었고, 비는 노이즈를 여과 제거하기 위해 적용되었던 3 내지 10 범위의 크기를 가진 중앙 필터 이외 계산되었다. 클론 1C1 (서열 식별 번호: 39)가 별개의 동물에 주사되었다는 것을 고려하면, 리포좀과 IgGs 사이 비교는 육안 검사를 이용하여 실시되었다.
OE-19 모델에서, 우선적인 체내분포를 보여주었던 기관 이내 전반적인 리포좀 침착 (NT-Ls 및 46scFv-ILs)의 분석은 간, 비장 및 종양을 포함하는 특정 기관이고 모든 다른 수집된 기관에서 수준을 상당히 저하시킨다 (도 12A). 리포좀은 간 및 비장 이내 특정 조직 하위-구획에서 그리고 진피 및 피하 피부의 표면에서 더 낮은 수준에서 침착되었다. 정상 장기에서, EphA2 표적화는 대부분의 분석된 기관내 동일한 영역에서 공국재화된 리포좀 및 46scFv-ILs 및 NT-Ls의 미세분포에 상당히 영향을 주지 않았다. 리포좀의 미세분포에서 표적 매개된 시프트를 분석하기 위해, 우리는 이미지의 비율계 분석을 수행하였다. 이러한 분석은 리포좀 침착이 오류성 비 최소화에 충분히 높은 조직에서 단지 유의미하다. 따라서, 우리는 간, 비장 및 종양에 대하여 비율계 분석을 수행하였다. 정상 조직과 달리, 종양 EphA2에서 표적화는 리포좀 미세분포에 영향을 미쳤다. 비-표적화된 리포좀의 것에 비교된 46scFv-ILs 국재화의 분석은, 비-표적화된 리포좀보다 2 내지 3 배 더욱 표적화된 일부 영역으로, 미세분포에서 상당한 시프트를 보여준다. 리포좀 평균 형광 강도의 공간적 분포 및 공국재화의 정량화는 모든 동물에서 46scFv-ILs를 향해 대각선을 거쳐 상당한 시프트를 보여준다. 시프트는 주로 하부 침착 영역에서 보여졌다 (도 12B). NT-Ls에 대한 46svFv-ILs의 비가 표시되고 종양에서 구체적으로 코어에서 더 높은 비를 보여주는 비율계 이미지의 분석.
도 12B는 EphA2 표적화의 리포좀 비율계 분석을 보여주는 그래프이다. 도 12C는 EphA2 표적화의 리포좀 비율계 분석을 보여주는 이미지이다.
장기 수준에서, 1C1 항체 (서열 식별 번호: 39)는 NT-Ls 또는 EphA2-KLs의 침착의 패턴과 상이한 고 확산 방식으로 대부분의 분석된 기관에 체내분포하였다. 1C1 (서열 식별 번호: 39)는 표피에서 고 염색을 보여주었고, 반면 46svFv-ILs는 진피에서 주로 위치하였다.
양쪽 전이성 모델은 폐에서 상이한 크기의 다중 병변의 외관을 초래하였다. MDA-MB-231 IV는 대부분의 폐가 침윤성 확산 종양에 의해 대체되는 광범위한 전이성 부하를 갖는다. MDA-MB-231 동소이식에서, 전이성 부하는 MDA-MB-231 IV 미만이었고 조직학적으로 확인가능한 미세 또는 거대 병변의 외관을 통해 별개이었다.
양쪽 모델에서, NT-Ls/NT-Ls 그룹의 동물의 분석은 종양의 또는 전이성 병변의 동일한 영역에서 양쪽 리포좀의 침착을 보여주었다. 리포좀 평균 형광 강도의 공간적 분포 & 공국재화의 정량화는 모든 동물에서 40scFv-ILs를 향해 대각선을 거쳐 상당한 시프트를 보여준다 (도 12D). 비율계 분석은 1에 가까운 비를 보여주었다. 1차 종양에서 EphA2 표적화는 리포좀 미세분포에 영향을 미쳤다. 비-표적화된 리포좀의 것에 비교된 40scFv-ILs 국재화의 분석은, 비-표적화된 리포좀보다 2 내지 5 배 더 표적화된 일부 영역으로, 미세분포에서 상당한 시프트를 보여준다 (도 12E). 유사한 패턴은 40svFv-ILs가 전이성 병변 또는 주변 병변 영역내 폐에서 널리 침착하였던 폐 전이성 병변에서 보여졌다. 전이성 폐 병변에서 리포좀 침착의 이러한 패턴은 양쪽 모델 MDA-MB231 IV (도 12F) 및 MDA-MB-231 동소이식 (도 12E)에서 보여졌다.
실시예 5: 마우스내 삼중 음성 유방 암 이종이식편에서 40scFv-ILs-DTXp3의 생체내 항종양 효능
40scFv-ILs-DTXp3의 항종양 효능은 인간 삼중 음성 유방 암 (TNBC) 세포주 SUM-159, SUM-149 및 MDA-MB-436의 이종이식편 모델에서 연구되었다. MDA-MB-436은 미국 종균 협회 (Rockville, MD)로부터 수득되었고 37 ℃, 5% CO2에서 10% 소태아 혈청, 50 U/ml 페니실린 G, 및 50 μg/mL의 스트렙토마이신 설페이트로 보충된 L15 배지에서 번식되었다. SUM-159 및 SUM-149 세포주는 Asterand Bioscience로부터 수득되었고 37 ℃, 5% CO2에서 5% 소태아 혈청, 10 mM HEPES, 5 μg/ml 인슐린, 1 μg/ml 하이드로코르티손, 50 U/ml 페니실린 G, 및 50 μg/mL의 스트렙토마이신 설페이트로 보충된 Ham's F-12 배지에서 번식되었다.
NCR nu/nu 동종접합성 무흉선 숫컷 누드 마우스 (4-5 주령, 중량 적어도 16 g)은 Taconic으로부터 수득되었다. 마우스는 30% 성장 인자 감소된 Matrigel® 매트릭스 (Corning, cat. # 354230)으로 보충된 PBS에 현탁된 10 x 106 세포를 함유하는 0.1 mL의 현탁액으로 유선-우측 흉부 지방 패드 속에 동소이식으로 접종되었다. 종양이 150 mm3 내지 350 mm3 크기를 달성하였던 경우 동물은 하기 방법에 따라 처리 그룹으로 배정되었다. 동물은 종양 크기에 따라 등급화되었고, 감소하는 종양 크기의 6 카테고리로 분할되었다. 8 동물/그룹의 처리 그룹은 각각의 크기 카테고리로부터 한마리 동물을 무작위로 선택함으로써 형성되었고, 이로써 각각의 처리 그룹에서 모든 종양 크기는 동등하게 표시되었다.
하기 처리 아암은, SUM-159 및 SUM-149 이종이식편 모델에 대하여 형성되어 왔다: 1) 대조군 (HEPES-완충 식염수 pH 6.5); 2) 주사당 용량 10 mg/kg으로 도세탁셀; 3) 주사당 용량 50 mg/kg으로 40scFv-ILs-DTXp3.
MDA-MB-436 이종이식편 모델에 대하여: 1) 대조군 (HEPES-완충 식염수 pH 6.5); 2) 주사당 용량 10 mg/kg으로 도세탁셀; 3) 주사당 용량 12.5 mg/kg으로 40scFv-ILs-DTXp3; 4) 주사당 용량 25 mg/kg으로 40scFv-ILs-DTXp3, 5) 주사당 용량 50 mg/kg으로 40scFv-ILs-DTXp3.
동물은 4 꼬리 정맥 주사를, 7 일의 간격으로 받았다.
EphA2-ILs-DTX 면역리포좀은, 실시예 1에서 기재된 바와 같이 450 도세탁셀 당량/몰 인지질의 약물/지질 비에서 화합물 3으로 장입되고 제조된, 포획된 1.1N TEA-SOS를 함유하는, 에그 스핑고미엘린, 콜레스테롤 (3: 2 몰비) 및 8 mol % PEG-DSG로 구성된 지질 부분, 그리고 리포좀의 외부에 부착된 서열 식별 번호: 40의 scFv를 가진, 40scFv-ILs-DTXp3이었다.
주사 농축된 도세탁셀 (Accord Healthcare Inc., 20 mg/ml 알코올 용액)은 1 mg/ml로 PBS내 투여에 앞서 용해되었다.
동물 중량 및 종양 크기는 매주 2회 모니터링되었다. 종양 진행은 1 주 2회 최대 (길이) 및 최소 (폭) 축을 따라 종양의 촉진 및 캘리퍼스 측정으로 모니터링되었다. 종양 크기는 하기 식을 이용하여 캘리퍼스 측정으로부터 매주 2회 결정되었다 (Geran, R.I., 등, 1972 Cancer Chemother. Rep. 3: 1-88):
종양 용적 = [(길이) x (폭)2] / 2
처리-관련된 독성을 평가하기 위해, 동물은 매주 2회 또한 계량되었다. 그룹에서 종양이 마우스 체중의 10%에 도달하였던 경우, 그룹에서 동물은 안락사되었다. 그룹에 거쳐 평균 종양 용적은 함께 플롯팅되었고 경시적으로 비교되었다.
도 7A, 7B 및 7C에서 나타낸 바와 같이, 40scFv-ILs-DTXp3은 모두 3 이종이식편 모델에서 도세탁셀의 동일 독성 용량에 비교하여 상당히 더 강한 항종양 효능을 갖는다. 처리 관련된 독성은 동물의 체중의 역학에 의해 평가되었다 (도 7D, 7E 및 7F). 어느 그룹도 상대적으로 느린 하기 성장 모델에서 임의의 상당한 독성을 드러내지 않았다: SUM-149 및 MDA-MB-436.모든 처리된 그룹에서 동물의 중량은 대조군 그룹에 비교할만 하였고 일관되게 증가하고 있었다. 반면 중증 도세탁셀 및 중간 정도 40scFv-ILs-DTXp3 독성은 더욱 공격성 모델, SUM-159에서 관측되었다.
도 7A는 SUM-159 이종이식편 모델에서 항종양 효능 40scFv-ILs-DTXp3을 보여주는 그래프이다. 도 7B는 SUM-149 이종이식편 모델에서 항종양 효능 40scFv-ILs-DTXp3을 보여주는 그래프이다. 도 7C는 MDA-MB-436 이종이식편 모델에서 항종양 효능 40scFv-ILs-DTXp3을 보여주는 그래프이다. 도 7D는 SUM-159 이종이식편 모델에서 40scFv-ILs-DTXp3의 내성을 보여주는 그래프이다. 도 7E는 SUM-149 이종이식편 모델에서 40scFv-ILs-DTXp3의 내성을 보여주는 그래프이다. 도 7F는 MDA-MB-436 이종이식편 모델에서 40scFv-ILs-DTXp3의 내성을 보여주는 그래프이다.
실시예 6: 마우스내 다중 환자-유래된 및 세포-유래된 이종이식편 모델에서 EphA2 표적화된 DTXp3 장입된 나노치료제의 생체내 항종양 효능
EphA2 표적화된 DTXp3 장입된 나노치료제의 항종양 효능은 4 주 동안 매주 50 mg/kg의 용량으로 29 이종이식편 모델에서 연구되었다. 환자 유래된 모델은 협력자 예컨대 RPCI 및 Texas Tech University로부터 또는 판매인 예컨대 Jacks Lab으로부터 수득되었다. 추가로, 21 모델에서 50 mg/kg으로 EphA2-표적화된-ILs-DTXp3은 10 mg/kg의 동일독성 또는 상위-독성 용량으로 자유 도세탁셀과 비교하여 연구되었다.
동물 중량 및 종양 크기는 매주 2회 모니터링되었다. 종양 진행은 1 주 2회 최대 (길이) 및 최소 (폭) 축을 따라 종양의 촉진 및 캘리퍼스 측정으로 모니터링되었다. 종양 크기는 하기 식을 이용하여 캘리퍼스 측정으로부터 매주 2회 결정되었다 (Geran, R.I., 등, 1972 Cancer Chemother. Rep. 3: 1-88):
종양 용적 = [(길이) x (폭)2] / 2
최대 종양 퇴행은 TV가 종양 용적인 하기 식에 따라 계산되었다:
최대 종양 퇴행 = [(최소 TV - 일 0에서 TV) / 일 0에서 TV] x 100
도 17A에서 나타낸 바와 같이, EphA2 표적화된 DTXp3 장입된 나노치료제는 시험된 모델의 50% 초과의 종양 퇴행을 유발시킨다. 완전한 종양 퇴행 (-100%)는 시험된 동물의 95/250 (39%)에서 보여졌고, 부분적인 종양 퇴행 (-30% 이상)은 112/250 (44.8%)에서 보여졌고 무 종양 퇴행은 단지 43/250 (18%)에서 보여졌다. 도17B에서 나타낸 바와 같이, 10/21 모델 (48%)에서 EphA2-표적화된-ILs-DTXp3은 자유 도세탁셀보다 상당히 우월하였다. 모델의 나머지에서 EphA2-표적화된-ILs-DTXp3은 자유 도세탁셀에 유사하였다. 자유 도세탁셀이 EphA2-표적화된-ILs-DTXp3에 비교하여 상당히 더 종양 퇴행을 초래하였던 모델은 없었다.
실시예 7: 마우스내 삼중 음성 유방 암에서 40scFv-ILs-DTXp3 대 비-표적화된 NT-LS-DTXp3 및 위/식도 및 육종 이종이식편에서 46scFv-ILs-DTXp3 대 비-표적화된 NT-LS-DTXp3의 생체내 항종양 효능.
40scFv-ILs-DTXp3의 항종양 효능은 인간 삼중 음성 유방 암 (TNBC) 세포주 MDA-MB-436의 이종이식편 모델에서 비-표적화된 버전 NT-LS-DTXp3 그리고 위/식도 인간 세포주 OE-19, MKN-45 및 OE-21의 이종이식편 모델에서 46scFv-ILs-DTXp3과 비교되었다. MDA-MB-436은 미국 종균 협회 (Rockville, MD)로부터 수득되었고, OE-19, OE-21은 European Collection of Cell Cultures (Salisbury, UK)로부터 수득되었고 MKN-45는 German collection of Microorganisms and cell cultures (Braunschweig, Germany)로부터 수득되었다.
MDA-MB-436은 37 ℃, 5% CO2에서 10% 소태아 혈청, 50 U/ml 페니실린 G, 및 50 μg/mL의 스트렙토마이신 설페이트로 보충된 L15 배지에서 번식되었다. OE-19, MKN-45 및 OE-21은 37 ℃, 5% CO2에서 10% 소태아 혈청, 50 U/ml 페니실린 G, 및 50 μg/mL의 스트렙토마이신 설페이트에서 보충된 RPMI1640 배지에서 번식되었다.
NCR nu/nu 동종접합성 무흉선 숫컷 누드 마우스 (4-5 주령, 중량 적어도 16 g)은 Taconic으로부터 수득되었다. MDA-MB-436에 대하여, 마우스는 30% 성장 인자 감소된 Matrigel® 매트릭스 (Corning, cat. # 354230)으로 보충된 PBS에 현탁된 10 x 106 세포를 함유하는 0.1 mL의 현탁액으로 유선-우측 흉부 지방 패드 속에 동소이식으로 접종되었다. 위/식도 및 육종 모델에 대하여, 마우스는 OE-19, OE-21, MKN-45 및 SKLMS-1 각각에 대하여 5 x 106 세포, 5 x 106 세포, 5 x 106 및 6 x 106 세포를 함유하는 0.2 mL의 현탁액으로 옆구리에서 이소성으로 접종되었다. 모든 모델에 대하여 세포는 PBS에 현탁되었다. 종양이 150 mm3 내지 350 mm3 크기를 달성하였던 경우 동물은 하기 방법에 따라 처리 그룹으로 배정되었다. 동물은 종양 크기에 따라 등급화되었고, 감소하는 종양 크기의 3 카테고리로 분할되었다. 5-8 동물/그룹의 처리 그룹은 각각의 크기 카테고리로부터 한마리 동물을 무작위로 선택함으로써 형성되었고, 이로써 각각의 처리 그룹에서 모든 종양 크기는 동등하게 표시되었다.
MDA-MB-436에 대하여, 하기 처리 아암은 형성되어 왔다: 1) 대조군 (HEPES-완충 식염수 pH 6.5); 2) 주사당 용량 50 mg/kg으로 NT-LS-DTXp3; 3) 주사당 용량 50 mg/kg으로 40scFv-ILs-DTXp3.동물은 4 꼬리 정맥 주사를, 7 일의 간격으로 받았다.
모델 MDA-MB-436에 대하여, EphA2-ILs-DTX 면역리포좀은, 실시예 1에서 기재된 바와 같이 450 도세탁셀 당량/몰 인지질의 약물/지질 비에서 화합물 3으로 장입되고 제조된, 포획된 1.1N TEA-SOS를 함유하는, 에그 스핑고미엘린, 콜레스테롤 (3: 2 몰비) 및 8 mol % PEG-DSG로 구성된 지질 부분, 그리고 리포좀의 외부에 부착된 서열 식별 번호: 40의 scFv를 가진, 40scFv-ILs-DTXp3이었다.
위 모델이 더욱 감수성이기 때문에 우리는 더 낮은 용량을 사용하였다. OE-19, MKN-45 및 OE-21에 대하여, 하기 처리 아암은 형성되어 왔다: 1) 대조군 (HEPES-완충 식염수 pH 6.5); 2) 주사당 용량 25 mg/kg으로 NT-LS-DTXp3; 3) 주사당 용량 25 mg/kg으로 46scFv-ILs-DTXp3 (46scFv-ILs-DTXp3).
육종 모델은 DTX에 저항성인 것으로 공지되었고 더 높은 용량으로 시험 처리되었다. 하기 처리 아암은 형성되어 왔다: 1) 대조군 (HEPES-완충 식염수 pH 6.5); 2) 주사당 용량 50 mg/kg으로 NT-LS-DTXp3; 3) 주사당 용량 50 mg/kg으로 46scFv-ILs-DTXp3 (46scFv-ILs-DTXp3).
동물 중량 및 종양 크기는 매주 1회 또는 2회 모니터링되었다. 종양 진행은 1 주 2회 최대 (길이) 및 최소 (폭) 축을 따라 종양의 촉진 및 캘리퍼스 측정으로 모니터링되었다. 종양 크기는 하기 식을 이용하여 캘리퍼스 측정으로부터 매주 2회 결정되었다 (Geran, R.I., 등, 1972 Cancer Chemother. Rep. 3: 1-88):
종양 용적 = [(길이) x (폭)2] / 2
처리-관련된 독성을 평가하기 위해, 동물은 매주 2회 또한 계량되었다. 그룹에서 종양이 마우스 체중의 10%에 도달하였던 경우, 그룹에서 동물은 안락사되었다.
MDA-MB-436에 대하여, 그룹에 거쳐 평균 종양 용적은 함께 플롯팅되었고 경시적으로 비교되었다.
OE-19, MKN-45 및 OE-21에 대하여, 최대 반응 및 재성장까지 시간은 TV가 종양 용적인 하기 식에 따라 계산되었다:
최대 반응 = [(최소 TV - 일 0에서 TV) / 일 0에서 TV] x 100
재성장까지 시간 = 일 0에서 TV가 4 배 TV 성장하는 시간
도 8A는 40scFv-ILs-DTXp3이 MDA-MB-436 이종이식편 모델에서 비-표적화된 버전 NT-LS-DTXp3에 비교하여 상당히 더 강한 항종양 효능을 갖는다는 것을 보여준다.
처리 관련된 독성은 동물의 체중의 역학에 의해 평가되었다 (도 8B). 어느 그룹도 임의의 상당한 독성을 드러내지 않았다. 모든 처리된 그룹에서 동물의 중량은 대조군 그룹에 비교할만 하였고 일관되게 증가하고 있었다.
도 8C, 도 8D 및 도 8E는 46scFv-ILs-DTXp3이 OE-19, MKN-45 및 OE-21 이종이식편 모델 각각에서 비-표적화된 버전 NT-LS-DTXp3에 비교하여 상당히 더 강한 항종양 효능을 갖는다는 것을 보여준다. 46scFv-ILs-DTXp3은 대부분의 모델에서 성장까지 시간에서 상당히 더 높은 반응 및/또는 유의미한 증가를 보여준다 (도 8F).
도 8A는 MDA-MB-436 이종이식편 모델에서 40scFv-ILs-DTXp3에 비교된 NT-LS-DTXp3의 항종양 효능을 보여주는 그래프이다. 도 8B는 MDA-MB-436 이종이식편 모델에서 NT-LS-DTXp3 대 40scFv-ILs-DTXp3의 내성을 보여주는 그래프이다. 도 8C는 OE-19 이종이식편 모델에서 NT-LS-DTXp3 대 46scFv-ILs-DTXp3의 항종양 효능을 보여주는 그래프이다. 도 8D는 MKN-45 이종이식편 모델에서 NT-LS-DTXp3 대 46scFv-ILs-DTXp3의 항종양 효능을 보여주는 그래프이다. 도 8E는 OE-21 이종이식편 모델에서 NT-LS-DTXp3 대 46scFv-ILs-DTXp3의 항종양 효능을 보여주는 그래프이다. 도 8F는 OE-19, OE-21 및 MKN-45 이종이식편 모델에서 NT-LS-DTXp3 대 46scFv-ILs-DTXp3의 항종양 효능을 보여주는 그래프이다. 도 8G는 SK-LMS-1 이종이식편 모델에서 NT-LS-DTXp3 대 46scFv-ILs-DTXp3의 항종양 효능을 보여주는 그래프이다.
실시예 8: 마우스내 비-소세포 폐암 이종이식편 모델에서 41scFv-ILs-DTXp3의 생체내 항종양 효능
41scFv-ILs-DTXp3의 항종양 효능은 인간 비-소세포 폐암 세포주의 이종이식편 모델에서 연구되었다. A549는 미국 종균 협회 (Rockville, MD)로부터 수득되었고 37°C, 5% CO2에서 10% 소태아 혈청, 50 U/ml 페니실린 G, 및 50 μg/mL의 스트렙토마이신 설페이트로 보충된 RPMI1640 배지에서 번식되었다.
NCR nu/nu 동종접합성 무흉선 숫컷 누드 마우스 (5-6 주령)은 Charles River로부터 수득되었다. 마우스는 PBS에 현탁된 5 x 106 세포를 함유하는 0.2 mL의 현탁액으로 옆구리 이소성으로 접종되었다. 종양이 150 mm3 내지 200 mm3 크기를 달성하였던 경우 동물은 하기 방법에 따라 처리 그룹으로 배정되었다. 동물은 종양 크기에 따라 등급화되었고, 감소하는 종양 크기의 6 카테고리로 분할되었다. 8 동물/그룹의 처리 그룹은 각각의 크기 카테고리로부터 한마리 동물을 무작위로 선택함으로써 형성되었고, 이로써 각각의 처리 그룹에서 모든 종양 크기는 동등하게 표시되었다. 하기 처리 아암은 형성되어 왔다 1) 대조군 (HEPES-완충 식염수 pH 6.5); 2) 주사당 용량 10 mg/kg으로 도세탁셀; 3) 주사당 용량 50 mg/kg으로 40scFv-ILs-DTXp3.
동물은 4 꼬리 정맥 주사를, 7 일의 간격으로 받았다. EphA2-ILs-DTX 면역리포좀은, 실시예 1에서 기재된 바와 같이 315 도세탁셀 당량/몰 인지질의 약물/지질 비에서 화합물 3으로 장입되고 제조된, 포획된 1.1N TEA-SOS를 함유하는, 에그 스핑고미엘린, 콜레스테롤 (3: 2 몰비) 및 5 mol % PEG-DSG로 구성된 지질 부분, 그리고 리포좀의 외부에 부착된 서열 식별 번호: 41의 scFv를 가진, 41scFv-ILs-DTXp3이었다.
리포좀은 실시예 1 버전 40scFv-ILs-DTXp3에 따라 제조되었다. 1.주사 농축된 도세탁셀 (Accord Healthcare Inc., 20 mg/ml 알코올 용액)은 1 mg/ml로 PBS내 투여에 앞서 용해되었다.
종양 크기는 매주 2회 모니터링되었다. 종양 진행은 1 주 2회 최대 (길이) 및 최소 (폭) 축을 따라 종양의 촉진 및 캘리퍼스 측정으로 모니터링되었다. 종양 크기는 하기 식을 이용하여 캘리퍼스 측정으로부터 매주 2회 결정되었다 (Geran, R.I., 등, 1972 Cancer Chemother. Rep. 3: 1-88):
종양 용적 = [(길이) x (폭)2] / 2
그룹에 거쳐 평균 종양 용적은 함께 플롯팅되었고 경시적으로 비교되었다.
도 9에서 나타낸 바와 같이, 41scFv-ILs-DTXp3은 A549 모델에서 도세탁셀의 동일 독성 용량에 비교하여 상당히 더 강한 항종양 효능을 갖는다. 도 9는 A549 이종이식편 모델에서 항종양 효능 41scFv-ILs-DTXp3을 보여주는 그래프이다.
실시예 9: 마우스내 전립선 및 난소 암 이종이식편 모델에서 41scFv-ILs-DTXp3의 생체내 항종양 효능
41scFv-ILs-DTXp3의 항종양 효능은 인간 전립선 및 난소 암 세포주의 이종이식편 모델에서 연구되었다. DU-145는 미국 종균 협회 (Rockville, MD)로부터 수득되었고, OVCAR-8은 National Cancer Institute (Bethesda, MD)로부터 수득되었다. 양쪽 세포주는 37°C, 5% CO2에서 10% 소태아 혈청, 50 U/ml 페니실린 G, 및 50 μg/mL의 스트렙토마이신 설페이트로 보충된 RPMI 배지에서 번식하였다.
복강에서 OVCAR-8 세포의 동소이식 모니터링을 가능하게 하기 위해, OVCAR-8 세포는 Targeting Systems (El Cajon, CA)로부터 수득된 가우시아 루시퍼라아제 (GLUC) 발현 렌티바이러스 상청액으로 감염되었다 (도13B). 간단히, 도 13B는 통상적으로 사용된 바이러스 생산 및 감염 프로토콜의 다이어그램을 보여준다. 바랬던 세포주의 감염 (MOI ~ 10) 및 퓨로마이신 선택 (2 주, 1ug/ml)시, 생물발광 검정은 배지에서 GLUC 발현을 평가하는데 사용되었다. 분비된 GLUC용 측정 원리는 하기에서 미리 기재되었다: Chung 등 PLOS One 2009, Dec 15;4(12): e8316.그러나, Targeting Systems로부터 적응된 및 변형된 프로토콜 (도 13C)은 사용되었고 도 2에서 기재된다. 간단히, 샘플 어느 한쪽 혈장 또는 배지는 96-웰 플레이트에 전달되었다. Gluc 활성은 플레이트 발광분석기 (MLX 발광분석기, Dynex technologies, Chantilly, VA)를 이용하여 측정되었다. 발광분석기는 PBS내 100 mL의 100 mM 코엘렌테라진 (CTZ, Nanolight, Pinetop, AZ)를 자동으로 주사하도록 셋팅되었고 광자 카운트는 10 초 동안 획득되었다. 검정은 세포의 생체외 평가용 상청액으로 사용되었고, 종양 부하의 생체내 모니터링용 혈장에서 사용되었다. 요약하면, 혈액 샘플은 복재 채혈을 통해 매주 수집되었고, 혈액은 원심분리되었고 혈장은 추출되었다. 상기에 기재된 바와 같이 생물발광 검정은 신호 안정성을 확보하기 위해 수집과 동일자로 사용되었다.
OVCAR-8 실험에 대하여, NCR nu/nu 동종접합성 무흉선 암컷 누드 마우스 (5-6 주령)은 Charles River로부터 수득되었다. 마우스는 RPMI에 현탁된 0.5 x 106 세포를 함유하는 0.3 mL의 현탁액으로 복강내로 접종되었다. 동물은 GLUC 평가를 위하여 매주 채혈되었다. 종양 부하가 혈장 GLUC 수준의 20 ng/ml에 도달하였던 경우, 동물은 하기 방법에 따라 처리 그룹으로 배정되었다. 가변성이 질환 진행인 것을 고려하면, 동물은 롤링 방식에서 다양한 그룹에 배정되었고 어느 한쪽 대조군 또는 46svFV-ILs-DTXp3 그룹으로 무작위화되었다. 하기 처리 아암은 형성되어 왔다 1) 염수 (HEPES-완충 식염수 pH 6.5); 2) 주사당 20 mg/kg의 용량으로 46scFv-ILs-DTXp3 (46scFv-ILs-DTXp3 20mpk).
도 13A에서 나타낸 바와 같이, 20 mg/kg으로 46scFv-ILs-DTXp3은 처리의 지속기간 내내 종양 성장의 억제를 지속적으로 유도하였다.
DU-145 실험에 대하여, NCR nu/nu 동종접합성 무흉선 암컷 누드 마우스 (5-6 주령)은 Charles River로부터 수득되었다. 마우스는 50% 성장 인자 감소된 Matrigel® 매트릭스 (Corning, cat. # 354230)으로 보충된 RPMI에 현탁된 3.3 x 106 세포를 함유하는 0.2 mL의 현탁액으로 옆구리에서 이소성으로 접종되었다. 종양이 150 mm3 내지 200 mm3 크기를 달성하였던 경우 동물은 하기 방법에 따라 처리 그룹으로 배정되었다. 동물은 종양 크기에 따라 등급화되었고, 감소하는 종양 크기의 4 카테고리로 분할되었다. 6 동물/그룹의 처리 그룹은 각각의 크기 카테고리로부터 한마리 동물을 무작위로 선택함으로써 형성되었고, 이로써 각각의 처리 그룹에서 모든 종양 크기는 동등하게 표시되었다. 하기 처리 아암은 형성되어 왔다 1) 염수 (HEPES-완충 식염수 pH 6.5); 2) 주사당 용량 10 mg/kg으로 도세탁셀 (DTX 10mpk); 3) 주사당 용량 25 mg/kg으로 46scFv-ILs-DTXp3 (46scFv-ILs-DTXp3 25mpk) 4) 주사당 용량 50 mg/kg으로 46scFv-ILs-DTXp3 (46scFv-ILs-DTXp3 50mpk).
동물은 4 꼬리 정맥 주사를, 7 일의 간격으로 받았다. 주사 농축된 도세탁셀 (Accord Healthcare Inc., 20 mg/ml 알코올 용액)은 1 mg/ml로 PBS내 투여에 앞서 용해되었다. 종양 크기는 매주 1회 내지 2회 모니터링되었다. 종양 진행은 1 주 2회 최대 (길이) 및 최소 (폭) 축을 따라 종양의 촉진 및 캘리퍼스 측정으로 모니터링되었다. 종양 크기는 하기 식을 이용하여 캘리퍼스 측정으로부터 매주 2회 결정되었다 (Geran, R.I., 등, 1972 Cancer Chemother. Rep. 3: 1-88):
종양 용적 (TV)= [(길이) x (폭)2] / 2
최대 반응은 TV가 종양 용적인 하기 식을 이용하여 계산되었다:
최대 반응 = [(최소 TV - 일 0에서 TV) / 일 0에서 TV] x 100
그룹에 거쳐 단일 종양 용적은 함께 플롯팅되었고 경시적으로 비교되었다.
도 10A 및 10B에서 나타낸 바와 같이, 50 mg/kg의 bw로 46scFv-ILs-DTXp3은 DU-145 모델에서 동일독성 용량 10 mg/kg의 자유 도세탁셀에 비교하여 상당히 더 강한 항종양 효능을 갖는다. 도 10A는 DU-145 이종이식편 모델에서 항종양 효능 46scFv-ILs-DTXp3을 보여주는 그래프이다. 도 10B는 DU-145 이종이식편 모델에서 항종양 효능 46scFv-ILs-DTXp3을 보여주는 그래프이다.
실시예 10: 스위스 웹스터 마우스에서 41scFv-ILs-DTXp3 및 자유 도세탁셀의 생체내 내성.
본 실시예는 NCR nu/nu 마우스에서 연구된 자유 도세탁셀의 그리고 EphA2 표적화된 도세탁셀 나노리포좀 (46scFv-ILs-DTXp3)의 생체내 내성을 기재한다.
스위스 웹스터 동종접합성 암컷 마우스 (5-6 주령)은 Charles River Laboratory로부터 수득되었다. 동물은 꼬리 정맥 주사를, 시험된 용량으로 시험된 화합물의 7 일의 간격으로 받았다 (표 5: 실험 설계). 41scFv-ILs-DTXp3 용량은 동등 도세탁셀 중량으로 표시된다.
Figure pct00008
EphA2-ILs-DTX 면역리포좀은, 실시예 1에서 기재된 바와 같이 315 도세탁셀 당량/몰 인지질의 약물/지질 비에서 화합물 3으로 장입되고 제조된, 포획된 1.1N TEA-SOS를 함유하는, 에그 스핑고미엘린, 콜레스테롤 (3: 2 몰비) 및 6 mol % PEG-DSG로 구성된 지질 부분, 그리고 리포좀의 외부에 부착된 서열 식별 번호: 41의 scFv를 가진, 41scFv-ILs-DTXp3이었다. 동물은 특정 용량으로 41scFv-ILs-DTXp3 또는 자유 도세탁셀의 꼬리 정맥 주사를 받았다. 동물 중량 및 성능 상태 스코어는 1주 3 내지 4회 마우스의 임상 관찰에 기반하여 모니터링되었다 (임상 관찰 표). 중증 독성을 경험하는 동물은 IACUC 프로토콜에 따라 안락사된다. 마우스의 30% 초과가 중증 독성을 경험하면 시험된 용량은 용인되지 않은 것으로 간주된다.
Figure pct00009
167 mpk로 41scFv-ILs-DTXp3의 3 용량 후, 그룹의 모든 동물은 처리 종결 및 동물 안락사를 요구하는 사전-궤양화 적열상태의 외관을 가진 건조 비늘상 피부를 가졌다. 123mpk로 41scFv-ILs-DTXp3은 안락사를 요구하지 않았고 수화 크렘으로 처리되지 않았던 더욱 경도의 피부 건조화 및 비늘화를 보여주었다. 이러한 발견을 고려하면 스위스 웹스터 마우스에서 41scFv-ILs-DTXp3으로 매주 처리용 최대 용인된 용량은 123 mpk로 확인된다. 양쪽 그룹에 대하여, 체중 손실은 경도 <10%이었다.
용량 23 및 26 mpk에서 자유 도세탁셀의 3 용량 후, 그룹의 모든 동물은 10% 내지 15% 범위의 중량 손실 그리고 과민증 (접촉시 발성)의 징후 그리고 주사의 부위 (부푼 꼬리)에서 국부 독성의 입증을 가졌다. 이들 징후는 용량 제한 독성으로 간주되는 지연 또는 차단 처리를 요구하는 중증으로 간주되었다. 20 mpk로 도세탁셀은 양호하게 용인되었고 임의의 검출가능한 중량 손실 또는 임의의 독성 징후로 이어지지 않았다. 이들 발견을 고려하면 스위스 웹스터 마우스에서 자유 도세탁셀로 매주 처리용 최대 용인된 용량은 20 mpk이다.
도 6A는 스위스 웹스터 마우스에서 41scFv-ILs-DTXp3의 내성을 보여주는 그래프이다. 도 6B는 스위스 웹스터 마우스에서 자유 도세탁셀의 내성을 보여주는 그래프이다.
실시예 11: 도세탁셀 전구약물의 합성
식 (I)의 도세탁셀 전구약물은, 도 2A에서 보여진 반응 도식을 포함하는, 다양한 반응 방법에 의해 제조될 수 있다. 2 화합물의 대표적인 합성예는 아래 제공된다. 이들 또는 다른 도세탁셀 전구약물, 및 이들의 다양한 약제학적으로 허용가능한 염은 다양한 적합한 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 도 2B에서 표는 특정 도세탁셀 전구약물의 예의 대표적인 목록을 제공한다.
실시예 11A: 2'-O-(4-디에틸아미노 부타노일) DTX 하이드로클로라이드 (화합물 3)의 합성
도세탁셀 (DTX) (0.25 g, 0.31 mmol), 4-디에틸아미노 부티르산 하이드로클로라이드 (0.12 g, 0.62 mmol), EDAC.HCl (0.12 g, 0.62 mmol), 및 DMAP (0.08 g, 0.62 mmol)은 모두 Ar 하에 15 mL 바이알 속에 계량되었다. 이것에 6 mL의 무수 DCM은 Ar 하에 rt에서 첨가되었고 rt에서 18시간 동안 교반되었다. 18 시간 교반 후 HPLC는 잔존하는 미반응된 57% DTX와 43% 생성물을 보여준다. 추가의 양의 4-디에틸아미노 부티르산 하이드로클로라이드 (0.15 g, 0.77 mmol)은 첨가되었고 교반은 추가의 24 시간 동안 계속되었다. HPLC는 잔존하는 미반응된 8% DTX와 91% 생성물을 보여준다. 반응은 중단되었고 12 g 카트리지에 직접적으로 장입되었고 FCC는 3-12% MeOH/CHCl3을 이용하여 수행되었다. 분획 30-49는 함께 풀링되었고, 2-프로판올내 0.5 mL의 0.05N HCl은 첨가되었고 30 ℃ 하에 증발되어 0.19 g의 백색 고형물 (63% 수율)을 제공한다.
HNMR: δ = 8.11 (d, 2H), 7.65-7.57 (m, 1H), 7.56-7.46 (m, 2H), 7.45-7.29 (m, 5H), 6.29-6.12 (m, 1H), 5.99 (d, 1H), 5.68 (d, 1H), 5.58-5.40 (m, 1H), 5.31 (d, 1H), 5.24 (s, 1H), 4.96 (d, 1H), 4.38-4.08 (m, 5H), 3.91 (d, 1H), 3.20-2.30 (m, 3H), 2.70-2.52 (m, 2H), 2.50-2.42 (m, 2H), 2.25-2.05 (m, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.92-1.78 (m, 2H), 1.75 (s, 3H), 1.50-1.35 (m, 9H), 1.32 (s, 9H), 1.30-1.20 (m, 6H), 1.12 (s, 3H) ppm. ppm.MS (ESI) m/z: 949.4 [M]+
실시예 11B: 2'-O-[4-(N,N-디메틸아미노) 부타노일] DTX 하이드로클로라이드 (화합물 4)의 합성
도세탁셀 (DTX) (0.28 g, 0.34 mmol), N,N-디메틸아미노부티르산 하이드로클로라이드 (0.07 g, 0.43 mmol), EDAC.HCl (0.13 g, 0.69 mmol) 및 DMAP (0.05 g, 0.41 mmol)은 모두 Ar 하에 15 mL 바이알 속에 계량되었다. 이것에 7 mL의 무수 DCM은 첨가되었고 혼합물은 rt에서 18시간 동안 교반되었다. 18 시간 후 HPLC는 3% 부산물 및 잔존하는 3%의 DTX와 94% 생성물을 보여준다. 반응 잔기는 12 g 카트리지에 직접적으로 장입되었고 FCC는 5-50% 2-프로판올/CHCl3을 이용하여 수행되었다. 분획 22-41은 함께 풀링되었고, 2-프로판올내 0.5 mL의 0.05N HCl은 첨가되었고 40 ℃ 하에 증발되어 백색 고형물 계량 0.16 g (48% 수율)을 제공하였다. DTX의 생성물로의 양호한 전환에도 불구하고 상대적으로 저수율은 짐작컨대 2-프로판올내 생성물의 좋지 못한 용해도에 기인되었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3+ (CD3)2SO): δ = 8.02 (d, 2H), 7.60-7.42 (m, 6H), 7.38-7.25 (m, 4H), 7.24-7.12 (m, 1H), 6.92 (d, 1H), 6.40-5.88 (m, 1H), 5.53 (d, 1H), 5.35-5.21 (m, 1H), 5.20-5.08 (m, 2H), 4.85 (d, 1H), 4.74 (d, 1H), 4.26 (s, 1H), 4.13 (dd, 3H), 3.74 (d, 1H), 3.56 (s, 1H), 3.16-2.74 (m, 3H), 2.64-2.48 (m, 7H), 2.49-2.00 (m, 5H), 1.84-1.68 (m, 4H), 1.62 (m, 3H), 1.30 (s, 9H), 1.07 (s, 3H), 1.02 (s, 3H) ppm.MS (ESI) m/z: 921.4 [M]+
실시예 12. 완충액내 가수분해용 절차
원하는 농도 (전형적으로 80 μg/mL 용액을 수득하기 위해 16 μL)를 제공하기 위해 필요에 따라 DMSO내 약물의 10 mg/mL 용액의 용적은 유리 시험관 또는 4 mL 바이알에 배치된다. 추가의 DMSO (예를 들면 16 μL의 약물 용액을 이용하는 경우 64 μL)는 4 %의 최종 총 DMSO 농도를 수득하기 위해 또한 첨가될 수 있다. DMSO 용액은 간단 와동에 의해 혼합되고, 그 다음 pH 7.5에 대하여 2 mL (20 mM) HEPES 완충액 그리고 pH 2.5에 대하여 2 mL의 (20 mM) 인산염 완충액은 첨가되고 혼합물은 재차 와동된다. 초기 pH는 HCl 또는 NaOH의 첨가에 의해 조정될 수 있다. 20 mM 완충액의 사용은 더 나은 pH 제어를 제공하는 것 그리고 인큐베이션 동안 pH 이동을 피한다는 것으로 알려졌다.
그 다음 약물의 완충액 용액의 100 μL 분취액은 HPLC 바이알에
전달되고 37 ℃ 수조에서 인큐베이션된다. 잔존 용액은 pH의 모니터링을 위하여 4 mL 바이알에서 37 ℃에 또한 인큐베이션된다.
각각의 시점에서 아세토니트릴 (ACN)내 900 μL의 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)는 HPLC 바이알에 첨가되고 내용물은 와동된다. 바이알은 그 다음 HPLC 분석을 위하여 4 ℃에서 자동시료주입기 랙에 배치된다.
시간 제로 데이터 포인트는 5 mL의 0.1% TFA/ACN (8 μg/mL)내 4 μL DMSO 스톡의 용액으로부터 전형적으로 수득된다.
HPLC 분석은, 1 mL./분의 유량, 50 μL 주사 용적, 25 ℃의 컬럼 온도를 이용하고 227 nm에서 UV 검출을 가진, SYNERGI 4 마이크론 극성 RP-80A, 250x4.6 mm 컬럼에서 수행된다. 대부분의 화합물은 수성 0.1% TFA에서 30 내지 66 % 아세토니트릴 13 분 구배 (방법 A), 이어서 30%로 1 분 역 구배 및 30%에서 6 분 동안 유지를 이용하여 분석된다. 체류 시간이 이러한 방법에 너무 길면, 30 내지 90% 아세토니트릴의 20 분 구배 (방법 B), 이어서 30%로 1 분 복귀 및 30%에서 9 분 동안 유지는 이용된다.
가수분해의 정도는 아래 표 7에서 상대 피크 면적에 기반하여 % DTX 형성으로서 보고된다.
Figure pct00010
실시예 13. 완충된 혈장에서 가수분해용 절차
인간 혈장 (Valley Biomedical Inc, Winchester, VA 제 HP 1055; Na 시트레이트로 보존된 풀링된 인간 혈장)은 침전물을 제거하기 위해 원심분리된다. 1.5 mL 원심 튜브에 0.9 mL의 혈장 및 40-50 μL의 pH 7.5, 0.9 M HEPES 완충액 (40-50 mM의 최종 농도 및 7.5의 pH)가 첨가된다. 이것은 역전에 의해 혼합되고, 그 다음 튜브는 37 ℃로 가온된다. 그 다음 약물의 10 mg/mL DMSO 용액의 7.2 μL는 첨가되고 (80 ug/mL 최종 농도) 그리고 내용물은 역전에 의해 혼합된다. 혈장내 용액은 그 다음 1.5 mL 원심 튜브에 분주되고 37 ℃ 배쓰에 배치된다. 각각의 시점에서 아세토니트릴 (ACN)내 900 μL의 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)는 튜브에 첨가된다. 내용물은 와동 혼합되고 그 다음 5분 동안 13,000 rpm으로 원심분리된다. 상청액은 완충액내 가수분해용 절차 하에 기재된 바와 같이 HPLC에 의해 분석된다. 시간 제로 데이터 포인트는 5 mL의 0.1% TFA/ACN (8 μg/mL)내 4 μL DMSO 스톡의 용액으로부터 수득된다. 결과는, 완충액내 가수분해용 절차를 이용하여, 4% DMSO를 가진 50 mM Hepes 완충액 (pH 7.5)에서 80 μg/mL에 대하여 수득된 것과 전형적으로 비교된다.
실시예 14. 마우스에서 EphA2-표적화된 도세탁셀-생성 리포좀의 약동학
실험적 동물의 관리 및 처리는 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) 지침, Protocol MAP004에 따랐다. 6-8 주령된 암컷 스위스 웹스터 마우스는 Charles River Laboratories (Wilmington, MA)로부터 수득되었다. 실시예 1에서 제조된 리포좀은 약동학 연구를 위하여 사용되었다. 각각의 리포좀 제형에 대하여, 3 마우스의 그룹은 주어진 용량 (2-50 mg/kg)에서 삼중수소-표지된 리포좀으로 투약되었다. 혈액 샘플 (30-60 μL)는 하기와 같이 특정된 시점에서 복재 정맥을 통해 리튬 헤파린 코팅된 튜브 속에 수집되었다: 5 분, 1.5 시간, 4 시간, 8 시간, 24 시간.48 시간 시점에서, 대략 400 μL 혈액은 말단 심장 출혈을 통해 수집되었다. 혈액 샘플은 (10 분 이내) 12,000 rpm으로 5분 동안 4 ℃에서 즉시 원심분리되었다. 혈장 샘플은 그 다음 제거되었고 3 이상 희석 인자와 200 mM pH 2.5 인산염 완충액으로 안정화되었다. 안정화된 샘플은 방사능 계수 및 약물 농도 측정을 위하여 분리되었다. 지질용 시간 데이터에 대한 농도, 화합물 3, 및 약물 지질 비는 NCA 모델을 이용하는 Phoenix 소프트웨어에 의해 분석되었다. 상이한 리포좀 제형의 PK 결과는 표 8에서 요약된다. 상이한 약물 대 인지질 (D/L) 비에서 리포좀 Ls-DTXp3, 및 상이한 %PEG-DSG에서 면역리포좀 46scFv-Ils-DTXp3의 제형은 평가되었다.
Figure pct00011
46scFv-ILs-DTXp3-300의 약동학 프로파일은 약물 대 시간, 지질 대 시간, 및 약물/지질 비 대 시간 각각에 대하여 도 14A, 14B 및 14C에서 보여진다. 실험적 데이터는 실선으로서 보여진 비-구획적 분석으로 구비된다.
실시예 15. 랫트에서 자유 도세탁셀 대 46scFv-ILs-DTXp3으로 만성 치료에 의해 유도된 혈액학적 독성 및 응고 파라미터
이 연구의 목적은 매주 1회 정맥내 주입 (4 용량)에 의해 주어진 경우 숫컷 랫트에서 46scFv-ILs-DTXp3 및 자유 도세탁셀 노출에서 비롯하는 탁산 유도된 혈액학적 독성을 평가하는 것이었다. 연구 설계는 아래와 같았다:
Figure pct00012
하기 파라미터 및 종점은 이 연구에서 평가되었다: 임상 징후, 체중, 음식 소비, 임상 병리학 파라미터 (혈액학, 응고, 임상 화학, 및 요검사), 종합 검시 발견, 및 조직병리적 시험.
혈액은 경정맥 (일 18 = 3번째 용량후 일 4) 또는 복부 대동맥으로부터 이소플루란 마취후 (연구 종결 = 4번째 용량후 일 9) 수집되었다. 일 18에서, 단지 혈액학 샘플은 350 g 미만 계량된 랫트에 대하여 수집되었다. 수집후, 샘플은 적절한 가공용 실험실에 전달되었다. 동물은 혈액 전 밤새 절식되었다.
혈액 샘플은 하기 특정된 파라미터에 대하여 분석되었다: 적혈구 수치, 헤모글로빈 농도, 적혈구용적률, 평균 혈구 용적, 적혈구 분포 폭, 평균 혈구 헤모글로빈 농도, 평균 혈구 헤모글로빈, 망상적혈구 수치 (무수), 혈소판 수치, 백혈구 수치, 중성구 수치 (무수), 림프구 수치 (무수), 단핵구 수치 (무수), 호산구 수치 (무수), 호염기구 수치 (무수), 큰 미염색된 세포.
매주 1회 10 분 정맥내 주입 자유 도세탁셀 10mpk는 3번째 용량후 일 4에서 혈액학적 프로파일의 모든 성분의 광범위한 감소로 범혈구감소증을 유도하였고 부분적으로 4번째 및 최종 용량후 10 일에서 지속하였다. 스프래그-다우리 랫트에서 총 4 용량에 대하여 10, 20, 및 40 mg/kg/용량의 용량으로 46scFv-ILs-DTXp3의 매주 1회 10 분 정맥내 주입 자유 도세탁셀은 적혈구 검출가능한 효과 그리고 백혈구에서 가변 효과가 없는 상당히 덜한 혈액학적 독성을 초래하였다. 46scFv-ILs-DTXp3의 효과는 양족 분석된 시점 (3번째 용량후 일 4 및 4번째 용량후 일 10)에서 40 mpk의 최고 용량에서 단지 보여졌다.
Figure pct00013
Figure pct00014
매주 40 mg/kg에서 NT-LS-DTXp3으로 처리된 스프래그 다우리 랫트의 추가의 그룹은 응고에서 EphA2 표적화-매개된 효과의 잠재적인 존재를 시험하는데 사용되었다. 모든 시험된 그룹으로부터 연구의 끝에 수집된 혈액 샘플은 하기를 포함하는 응고-관련된 파라미터에 대하여 분석되었다: 프로트롬빈 시간 (PT), 활성화된 부분적인 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 및 피브리노겐 수준. 도 15는 PT, APTT 및 피브리노겐 평균 및 모든 그룹에 대한 평균의 표준 오차. 46scFv-ILs-DTXp3 또는 NT-Ls-DTXp3의 효과는 PT, APTT 및 피브리노겐에서 상대적으로 낮은 효과를 가진 자유 도세탁셀과 매우 유사하였다.
실시예 16. 신규한 EphA2-표적화된 도세탁셀 항체 지향된 나노치료제 (ADN)
탁산은, 요법의 일선 또는 후선에서, 어느 한쪽 치유 또는 일시적 처방 셋팅에서 고체 종양을 치료하는데 널리 사용된다. 도세탁셀 용량-반응 관계의 분석은 더 높은 용량이 더 큰 반응으로 이어질 것이지만, 더 높은 용량이 또한 더 높은 독성으로 이어질 것을 강하게 시사한다. 이것은, 더 높은 용량을 간접적으로 요구하는, 정상 조직에서 높은 노출 및 상대적으로 짧은 순환 반감기로 이어지는 도세탁셀의 장기 및 세포 특이성의 결핍에 유사하게 관련된다. 자유 도세탁셀의 약동학적 제한 및 세포 특이성의 결핍을 다루는 목표로, 우리는, 광범위한 종양에서 과발현되는, 에프린 수용체 A2 (EphA2) (46scFv-ILs-DTXp3)에 대해 표적화된 도세탁셀을 전달하는 신규한 리포좀을 개발하였다. 46scFv-ILs-DTXp3은 고체 종양내 축적 이후 도세탁셀의 지속 방출을 제공한다. 전임상 모델은 46scFv-ILs-DTXp3이 향상된 투과도 및 유지 효과를 통한 종양-특이적 축적, 및 리포좀의 표면에 콘주게이션된 특이적 scFv 항체 단편으로 EphA2의 활성 표적화를 통한 세포 특이성을 활용한다는 것을 실증하였다.
약동학적 및 체내분포 연구는 46scFv-ILs-DTXp3을 자유 도세탁셀에 비교하기 위해 마우스 및 랫트에서 수행되었다. 만성 내성 연구는 전반적인 동물 건강, 뿐만 아니라 혈액학적 독성을 집중하여 설치류 및 비-설치류 모델에서 수행되었다. 유방, 폐 및 전립선 이종이식편의 몇 개의 세포-유래된 모델은 46scFv-ILs-DTXp3과 자유 도세탁셀 사이 차이를 평가하는데 사용되었다.
전임상 시험에서, 46scFv-ILs-DTXp3은 종양 부위에 장기적인 노출로 자유 도세탁셀보다 상당히 더 긴 반감기를 가졌다. 만성 내성 연구에서, 46scFv-ILs-DTXp3은 자유 도세탁셀에 대하여 20 mg/kg에 비교하여, 적어도 120 mg/kg의 최대 용인된 용량으로 자유 도세탁셀보다 6-7 배 더 양호하게 용인되고 검출가능한 혈액 독성이 없는 것을 알려졌다. 동등독성 투약에서, 46scFv-ILs-DTXp3 50 mg/kg은 몇 개의 유방, 폐 및 전립선 이종이식편 모델에서 도세탁셀 10 mg/kg보다 더 큰 활성을 보여주었다.
결론적으로, 우리는 장기 및 세포 표적화를 가능하게 하기 위해 장기적인 순환 시간 및 느리고 지속된 약물 방출 동력학을 가진 신규한 EphA2 표적화된 도세탁셀 나노리포좀을 개발하였다. 46scFv-ILs-DTXp3은 설치류 및 비-설치류 모델에서 자유 도세탁셀로 치료시 관측된 혈액학적 독성을 극복할 수 있었다. 46scFv-ILs-DTXp3은 또한 몇 개의 세포-유래된 이종이식편 모델에서 종양 퇴행을 유도할 수 있거나 종양 성장을 제어할 수 있었고, 대부분의 모델에서 자유 도세탁셀보다 더욱 활성인 것으로 알려졌다.
스프래그-다우리 랫트는 총 네 (4) 용량으로 10, 20, 및 40 mg/kg/용량 46scFv-ILs-DTXp3 또는 10 mg/kg 도세탁셀의 매주 1회 10 분 정맥내 주입이 제공되었다. 유의미한 효과는 응고 파라미터에서 보여지지 않았다. 활성화된 부분적인 트롬보플라스틴 시간 (APTT)는, 비히클 대조군에 비교하여, 연구 (일 30)의 끝에 40 mg/kg 46scFv-ILs-DTXp3 및 10 mg/kg 도세탁셀을 받았던 랫트에 대하여 단축되었다. 프로트롬빈 시간 (PT)는 40 mg/kg/용량으로 46scFv-ILs-DTXp3을 받았던 동물에서 약간 증가되었다. 피브리노겐은 이들 치료에 의해 영향받지 않았다. 현미경적으로 언급된 (데이터 도시되지 않음) 조혈 및 림프양 변화와 상관된, 적혈구 및 백혈구 파라미터에서 용량-의존적 변화는 관측되었다. 10 mg/kg 도세탁셀에 대조로, 중성구 수준에서 임의의 용량 수준으로 46scFv-ILs-DTXp3의 효과는 없었다.
비글 개에서 총 네 (4) 용량으로 1, 3, 및 9 mg/kg/용량 46scFv-ILs-DTXp3의 매주 1회 1 시간 정맥내 주입은 혈액학 또는 임의의 응고 파라미터에서 효과를 갖지 않았다.
46scFv-ILs-DTXp3은 순환에서 단지 저수준의 생체이용가능한 자유 도세탁셀, 그리고 종양에서 활성 약물의 상승된 수준을 초래하는 느리고 지속된 약물 방출을 표시하였다. 이러한 표적화된 나노제형은, 최소 호중구감소증, 도세탁셀의 현행 상업적 폴리소르베이트 제형의 용량-제한 독성을 포함하는, 양호한 독성 프로파일을 표시하였다. 46scFv-ILs-DTXp3은 또한 동등독성 투약에서 또는 미만에서 자유 도세탁셀에 비교된 다중 전임상 이종이식편 모델에서 우월한 항종양 활성을 실증하였다.
실시예 17. EphA2-표적화된 도세탁셀 리포좀의 임상 시험
EphA2-표적화된 도세탁셀 리포좀의 임상 연구는 고체 종양을 가진 환자에서 EphA2-표적화된 도세탁셀 리포좀의 활성을 평가하기 위해 수행된다. EphA2-표적화된 도세탁셀 리포좀은 최대 용인된 용량 (MTD)이 확립되는 때까지 단일요법으로서 평가될 것이다. EphA2-표적화된 도세탁셀 리포좀은 각각의 21 일 사이클의 제1 일에서 90 분에 걸쳐 IV 주입에 의해 투여될 것이다.
포함 기준:
연구에서 포함에 적격이기 위해 환자는 하기 암 중 하나를 가져야 하고, 이를 위하여 환자는 어느 한쪽으로 임상 이득을 부여하기 위해 공지된 모든 요법에 불내성이었거나 상기 요법을 받았다
· 요상피 암종
· 위/위식도 접합/식도 암종 (G/GEJ/E)
· 두경부의 편평상피 세포 암종 (SCCHN)
· 난소 암
· 췌관 선암 (PDAC)
· 전립선 선암 (PAC)
· 비-소세포 폐암 (NSCLC)
· 소세포 폐암 (SCLC)
· 삼중 음성 유방 암 (TNBC)
· 자궁내막 암종
· GIST, 데스모이드 종양 및 다형성 횡문근육종을 제외한 연조직 육종 하위유형
추가의 포함 기준
· 고지에 의한 동의를 제공할 수 있음, 또는 그렇게 할 수 있고 의지가 있는 법률 대표를 가짐
· ≥ 18 세
· 생검을 잘 받아들이고 전처리 생검을 경험할 의지가 있는 암성 병변의 이용가능성
· 0 또는 1의 ECOG 성능 상태
· 하기에 의해 입증된 바와 같이 적절한 골수 비축:
o ANC > 1,500/μl (성장 인자에 의해 지지되지 않음) 및
o 혈소판 수 > 100,000/μl
o 헤모글로빈 > 9 g/dL
· 환자는 정상 기관 제한 이내 프로트롬빈 시간 (PT), 활성화된 부분적인 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) 및 국제 정상화 비율 (INR)에 의해 입증된 바와 같이 적절한 응고 기능을 가져야 한다.
· 하기에 의해 입증된 바와 같이 적절한 간 기능:
o 혈청 총 빌리루빈 ≤ ULN
o 아스파르테이트 아미노기전달효소 (AST) 및 알라닌 아미노기전달효소 (ALT) ≤ 2.5 x ULN.
o 알칼리성 포스파타제 ≤ 2.5 x ULN, 상승된 알칼리성 포스파타제가 뼈 전이에 기인하지 않는 한.
o 알칼리성 포스파타제가 >2.5 x ULN인 경우에서 환자는 아스파르테이트 아미노기전달효소 (AST) 및 알라닌 아미노기전달효소 (ALT) ≤ 1.5 x ULN이면 포함에 적격이다.
· 혈청/혈장 크레아티닌 < 1.5 x ULN에 의해 입증된 바와 같이 적절한 신장 기능
· 탈모증을 제외하고, 임의의 선행 수술, 방사선요법 또는 다른 항신생물성 요법의 효과부터 CTCAE v4.03 등급 1, 기준선 이하까지 회복됨.
· 출산 잠재력의 여성 또는 가임 남성 및 그들의 파트너는 성교를 기꺼이 금욕해야 하거나 연구 동안 그리고 EphA2-표적화된 도세탁셀 리포좀의 마지막 용량 이후 6 개월 동안 피임의 효과적인 형태를 기꺼이 사용해야 한다. 진정한 금욕 이외에 효과적인 피임의 허용가능한 방법은 하기를 포함한다: 1) 피임의 경구, 주사된 또는 이식된 호르몬 방법의 확립된 사용, 2) 콘돔 또는 살정자 포옴/겔/크림/좌약을 가진 폐쇄성 캡을 포함하는, 피임의 자궁내 디바이스 (IUD) 또는 자궁내 시스템 (IUS), 장벽 방법의 배치, 3) 사정액에서 정자의 부재의 적절한 사후 정관절단술 문서화로 남성 불임화 (연구에서 여성 환자를 위하여, 정관절제된 파트너는 그 대상체를 위한 단독 파트너이어야 한다)
제외 기준
· 연구 등록의 6 개월 이내 도세탁셀로 사전 치료
· 임신 또는 수유
· 아스피린을 제외하고 전신 항응고 (예를 들면 와파린, 헤파린, 저분자량 헤파린, 항-Xa 억제제, 등)으로 치료
· 혈액구토, 흑색변, 혈변, ≥ 등급 2 객혈, 또는 육안적 혈뇨의 임의의 증거
· 선천성 출혈성 장애의 임의의 이력
· 조사자의 의견에서 시험에 환자의 참여를 손상시키거나 연구 결과에 영향을 주는, 투약의 제1 계획된 날에 또는 선별 방문 동안 활성 감염의 또는 불명열 > 38.5 ℃를 가진 존재. 조사자의 재량으로, 종양 열을 가진 환자는 등록될 수 있다
· 공지된 CNS 전이
· EphA2-표적화된 도세탁셀 리포좀, 또는 도세탁셀의 성분에 공지된 과민증
· EphA2-표적화된 도세탁셀 리포좀으로 사전 치료
· 임의의 징후 또는 질환 상태에 대하여 조절 승인을 받지 않았던 임의의 조사적 제제 그리고 등급 1 또는 기준선으로 분해된 모든 선행 임상적으로 상당한 치료 관련된 독성으로, 투약의 제1 계획된 날에 앞서, 어느 것이 더 짧든, 28 일 또는 5 반감기 이내, 치료를 받음
· EphA2-표적화된 도세탁셀 리포좀의 제1 계획된 용량에 앞서 14 일 이내 임의의 표준 화학요법 또는 방사선을 포함하는 다른 최근 항종양 요법을 받음 (또는 가장 최근 요법의 임의의 실제의 독성으로부터 아직 회복되지 않음)
· EphA2-표적화된 도세탁셀 리포좀의 제1 계획된 용량에 앞서 이러한 약물의 5 반감기의 기간 (예를 들면 베바시주맙에 대하여 100 일, 라무시루맙에 대하여 75 일) 이내 항-VEGF/VEGFR 활성을 갖기 위해 공지된 임의의 항-암 약물을 받음
· 하기를 포함하는, 임상적으로 상당한 심장 질환: NYHA 부류 III 또는 IV 울혈성 심장기능상실, 불안정한 협심증, 계획된 제1 용량의 6 개월 이내 급성 심근경색증, 부정맥 필요 요법 (다형성 심실빈맥 포함, 기외수축, 소수의 전도 비정상, 또는 제어된 및 양호 치료된 만성 심방세동 예외)
· 조사자에 의해 간주된 대로 임의의 다른 이유로 이 임상 연구에서 참여에 적절한 후보가 아닌 환자
· 장기 또는 동종이계 골수 또는 주변 혈액 줄기 세포 이식을 받았던 환자
· EphA2-표적화된 도세탁셀 리포좀의 계획된 시작에 앞서 지난 4 주 동안 10mg 매일 프레드니손 당량 초과 코르티코스테로이드의 만성 용도
· CYP3A의 강한 억제제의 수반되는 용도
등급 2 이상의 주변 신경병증을 가진 환자
<110> MERRIMACK PHARMACEUTICALS, INC. <120> EPHRIN RECEPTOR A2 (EPHA2)- TARGETED DOCETAXEL-GENERATING NANO-LIPOSOME COMPOSITIONS <130> 100.1106 <150> US 62/309,222 <151> 2016-03-16 <150> US 62/322,940 <151> 2016-04-15 <150> US 62/338,052 <151> 2016-05-18 <150> US 62/419,012 <151> 2016-11-08 <150> US 62/464,538 <151> 2017-02-28 <160> 56 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically Generated Sequence <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically Generated Sequence <400> 2 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Thr 1 5 10 <210> 3 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically Generated Sequence <400> 3 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 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gcagcggcgg ctgctgataa 840 840 <210> 46 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically Generated Sequence <400> 46 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Val Ile Ser Pro Asp Gly His Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr 145 150 155 160 Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala 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ggatcgggtg gcggagggtc gggcggagga 480 ggctcatcat ccgagttgac ccaacccccg tccgtgtccg tggccccggg gcagactgtc 540 actatcactt gccaaggaga ctcactgcgc tcctactacg cctcgtggta tcagcagaaa 600 ccgggaaccg ctcctaaact cctgatctac ggcgaaaaca atcggccatc gggagtgcct 660 gaccgcttta gcggttcgag ctccggaact tctgcgagcc tgaccatcac tggtgcccaa 720 gccgaggatg aagcggacta ctactgcaac tcgcgggatt cctccgggac ccacctgacc 780 gtgttcggcg ggggaactaa gctgaccgtg ctgggtcgta cggtggcggc gcccagtcac 840 catcatcatc accactgata a 861 <210> 48 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically Generated Sequence <400> 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Val Ile Ser Pro Ser Gly His Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 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Generated Sequence <400> 50 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Val Ile Ser Pro Asn Gly His Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr 145 150 155 160 Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly 180 185 190 Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 195 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gccaaggaga ctcactgcgc tcctactacg cctcgtggta tcagcagaaa 600 ccgggaaccg ctcctaaact cctgatctac ggcgaaaaca atcggccatc gggagtgcct 660 gaccgcttta gcggttcgag ctccggaact tctgcgagcc tgaccatcac tggtgcccaa 720 gccgaggatg aagcggacta ctactgcaac tcgcgggatt cctccgggac ccacctgacc 780 gtgttcggcg ggggaactaa gctgaccgtg ctgggtggcg gcagcggcgg ctgctgataa 840 840 <210> 52 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically Generated Sequence <400> 52 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Pro Pro Gly His Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Thr Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr 145 150 155 160 Val Thr Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly 180 185 190 Glu Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 195 200 205 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp 210 215 220 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His Leu 225 230 235 240 Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Gly Gly Cys <210> 53 <211> 816 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically Generated Sequence <400> 53 atgggctggt ctctgatcct gctgttcctg gtggccgtgg ccacgcgtgt gctctcgcaa 60 gtgcagctgg tgcagtccgg agggggactg gtgcagccgg gaggctcact cagactgtcc 120 tgcgccgctt cgggcttcac tttctcctcg tacgctatgc attgggtccg ccaagccccc 180 ggaaagggac tggaatgggt gagcgcgatt agcccgccgg gccataacac ctattatgcg 240 gacagcgtca aaggcagatt caccattagc cgagataaca gcaagaatac cctgtacctc 300 caaatgaata gcctcagggc cgaggacacg gctgtgtact actgcgcacg cgcgtcagtc 360 ggcgcaacgg gtccattcga catctgggga cagggaaccc tggtcaccgt gtcatcggca 420 tcgactggag ggggaggctc tggaggaggg ggatcgggtg gcggagggtc gggcggagga 480 ggctcatcat ccgagttgac ccaacccccg tccgtgtccg tggccccggg gcagactgtc 540 actatcactt gccaaggaga ctcactgcgc tcctactacg cctcgtggta tcagcagaaa 600 ccgggaaccg ctcctaaact cctgatctac ggcgaaaaca atcggccatc gggagtgcct 660 gaccgcttta gcggttcgag ctccggaact tctgcgagcc tgaccatcac tggtgcccaa 720 gccgaggatg aagcggacta ctactgcaac tcgcgggatt cctccgggac ccacctgacc 780 gtgttcggcg ggggaactaa gctgaccgtg ctgggt 816 <210> 54 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically Generated Sequence <400> 54 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 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cgtgatctac ggcgaaaaca atcggccatc gggaatccct 660 gaccgcttta gcggttcgag ctccggaaac actgcgagcc tgaccatcac tggtgcccaa 720 gccgaggatg aagcggacta ctactgcaac tcgcgggatt cctccgggac ccacctgacc 780 gtgttcggcg ggggaactaa gctgaccgtg ctgggtggcg gcagcggcgg ctgctgataa 840 840

Claims (30)

  1. 하나 이상의 지질, PEG 지질 유도체 및 상기 지질 소포의 상기 외측에서 EphA2 결합 모이어티를 포함하는 지질 소포 안에서 캡슐화된 도세탁셀 전구약물을 포함하는, EphA2 -표적화된 도세탁셀-생성 리포좀.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 EphA2 결합 모이어티가 상기 지질 소포 안에서 지질에 공유 결합된 scFv 모이어티인, 리포좀.
  3. 청구항 1 내지 2 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도세탁셀 전구약물이 식 (I)의 화합물인, 리포좀
    Figure pct00015

    식 중 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 저급 알킬이고, n은 정수 2-3임.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EphA2 결합 모이어티가 서열 식별 번호:40 또는 서열 식별 번호:41의 상기 CDRs를 포함하는 scFv 모이어티인, 리포좀.
  5. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EphA2 결합 모이어티가 서열 식별 번호:41의 상기 서열을 포함하는 scFv 모이어티인, 리포좀.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 소포가 스핑고미엘린, 콜레스테롤 및 PEG-DSG를 포함하는, 리포좀.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 소포가 스핑고미엘린, 콜레스테롤 및 PEG-DSG를 약 4.4:1.6:1의 중량비로 포함하는, 리포좀.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포좀이 식 (I)의 도세탁셀-생성 전구약물을 캡슐화하는, 리포좀
    Figure pct00016

    식 중 R1 및 R2 각각은 C1-C3 알킬이고, n은 2 또는 3임.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도세탁셀-생성 전구약물이 식 (I)의 상기 화합물을 수크로스 옥타설페이트로 캡슐화하는, 리포좀.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도세탁셀 전구약물이 리포좀에서 캡슐화된 화합물 1 내지 3 중 어느 하나의 수크로스 옥타설페이트 염인, 리포좀.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포좀이 상기 리포좀내 상기 총 스핑고미엘린에 대해 중량 기준으로 약 1:142의 비로 scFv-PEG-DSPE로서 PEG-DSPE에 공유 결합된 상기 scFv 모이어티를 추가로 포함하는, 리포좀.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서 상기 최종 리포좀내 상기 약물-대-인지질 비가 상기 약물 장입이 도세탁셀 당량에 기반되는 경우 250 g 초과 도세탁셀 당량/ mol 인지질, 및 바람직하게는 250-350 g/mol인, 리포좀.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서 상기 저장 완충액의 상기 pH가 중성 미만, 바람직하게는 4-6.5, 및 더욱 바람직하게는 5-6인, 리포좀.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EphA2 결합 모이어티가 서열 식별 번호:41로 구성되는 scFv로서 EphA2에서 상기 동일한 에피토프에 결합하는, 리포좀.
  15. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EphA2 결합 모이어티가 서열 식별 번호:41로 구성되는 scFv와 EphA2에 대한 결합에 대하여 경쟁하는, 리포좀.
  16. 필요로 하는 인간 환자에 있어서 암의 치료 방법에서 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 따른 리포좀의 용도로서, 상기 방법이 약제학적 조성물로 상기 리포좀의 치료적 유효량을 상기 인간 환자에 투여하는 것을 포함하는, 용도.
  17. 청구항 14에 있어서, 상기 암이 유방, 고체 종양, 위, 식도, 폐, 전립선 및 난소 암으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 용도.
  18. 청구항 14에 있어서, 상기 암이 삼중 음성 유방 암 (TNBC)인, 용도.
  19. 청구항 14에 있어서, 상기 암이 위, 위식도 접합 또는 식도 암종인, 용도.
  20. 청구항 14에 있어서, 상기 암이 소세포 폐암 또는 비-소세포 폐암인, 용도.
  21. 청구항 14에 있어서, 상기 암이 난소 암, 자궁내막 암종 또는 요상피 암종인, 용도.
  22. 청구항 14에 있어서, 상기 암이 전립선 선암인, 용도.
  23. 청구항 14에 있어서, 상기 암이 연조직 암종 또는 상기 두경부의 편평상피 세포 암종 (SCCHN)인, 용도.
  24. 청구항 14에 있어서, 상기 암이 췌관 선암 (PDAC)인, 용도.
  25. 청구항 14 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포좀이 서열 식별 번호:41의 상기 서열을 포함하는 EphA2 결합 scFv 모이어티를 포함하는, 용도.
  26. 청구항 14 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포좀이 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 상기 도세탁셀 전구약물을 포함하는, 용도:화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 및 화합물 6.
  27. 청구항 22에 있어서, 상기 도세탁셀 전구약물이 화합물 3인, 용도.
  28. 청구항 22에 있어서, 상기 도세탁셀 전구약물이 화합물 6인, 용도.
  29. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서 상기 혈액학적 독성이 자유 도세탁셀의 것 미만인, 리포좀.
  30. 청구항 14 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포좀에서 전달된 도세탁셀의 상기 용량의 상기 혈액학적 독성이 자유 도세탁셀의 상기 동일한 용량의 것 미만인, 용도.
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