KR20180120763A - 항TNFα 항체 및 이의 기능성 단편 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 종양 괴사 인자 알파(TNFα)와 결합할 수 있는 항체 분자 및 이의 기능성 단편과, 이의 제조를 위한 방법, 그리고 이의 치료적 용도에 관한 것이다.

Description

항TNFα 항체 및 이의 기능성 단편
본 발명은 종양 괴사 인자 알파(TNFα)에 결합할 수 있는 항체 분자 및 이의 기능성 단편, 이의 제조를 위한 방법, 그리고 이의 치료적 용도에 관한 것이다.
TNFα는 면역계 세포에 의해 방출되고 이와 상호작용하는 동형 삼량체의 전염증 사이토카인이다. TNFα는 또한 다수의 인간 질환, 예컨대 류머티즘성 관절염, 크론병, 궤양성 대장염 및 다발성 경화증과 같은 만성 질환에서 상향 조절되는 것으로 보인다.
TNFα에 대한 항체는 내독성 쇼크의 예방 및 치료를 위해 제안되어 왔다(Beutler et aL Science, 234, 470-474, 1985). Bodmer외 다수(Critical Care Medicine, 21 , S441 -S446, 1993) 그리고 Wherry외 다수(Critical Care Medicine, 21 , S436-S440, 1993)는 패혈성 쇼크의 치료에 있어서 항TNFα 항체의 치료적 잠재성을 논의하고 있다. 패혈성 쇼크의 치료에 있어서 항TNFα 항체의 사용도 또한 Kirschenbaum외 다수(Critical Care Medicine, 26, 1625-1626, 1998)에 의해 논의되고 있다. 콜라겐 유도성 관절염은 항TNFα모노클로날 항체를 사용하여 효과적으로 치료될 수 있다(Williams et al. (PNAS-USA, 89, 9784-9788, 1992)).
류머티즘성 관절염과 크론병의 치료에 있어서 항TNFα 항체의 용도가 Feldman외 다수(Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini외 다수(Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997) 그리고 Feldman외 다수(Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997)에 의해 논의되고 있다. 앞서 이러한 치료에 사용되었던, TNFα에 대한 항체는 일반적으로 미국 특허 제5,919,452호에 기술된 것과 같은 키메라 항체이다.
TNFα에 대한 모노클로날 항체는 선행 기술에 개시되어 있다. Meager외 다수(Hybridoma, 6, 305-311, 1987)는 재조합 TNFα에 대한 쥐 모노클로날 항체를 기술하고 있다. Fendly외 다수(Hybridoma, 6, 359-370, 1987)는 TNFα상 중화 에피토프를 제한함에 있어 재조합 TNFα에 대한 쥐의 모노클로날 항체의 용도를 기술한 바 있다. 게다가, 국제특허출원공보 WO 92/11383에는 재조합 항체, 예컨대 TNFα에 특이적인 CDR-이식 항체가 개시되어 있다. Rankin외 다수(British J. Rheumatology, 34, 334-342, 1995)는 류머티즘성 관절염 치료에 있어서 이러한 CDR-이식 항체의 용도를 기술하고 있다. 미국 특허 제5,919,452호는, 항TNFα 키메라 항체와, TNFα 존재와 연관된 병상을 치료함에 있어서 이의 용도를 개시하고 있다. 또한 항TNFα 항체는 문헌(Stephens외 다수(Immunology, 85, 668-674, 1995), GB-A-2 246 570, GB-A-2 297 145, 미국 특허 제8,673,310호, US 2014/0193400, EP 2 390 267 B1, 미국 특허 제8,293,235호, 동 제8,697,074호, WO 2009/155723 A2 및 WO 2006/131013 A2)에 개시되어 있다.
선행 기술의 재조합 항TNFα 항체 분자는 초가변 영역 또는 CDR의 기원인 항체에 비하여, 일반적으로 TNFα에 대해 감소한 친화성을 가진다. 현재 시판되고 있는 TNFα 억제제 모두는 매주 또는 이보다 더 긴 시간 간격으로 정맥 내 또는 피하 볼루스 주사로 투여되는 관계로, 처음에 고 농도로 투여되었다가 다음 주사가 행하여질 때까지 그 농도가 꾸준히 감소하게 된다.
현재 승인된 항TNFα 바이오의약품은 (i) 키메라 IgG 항 인간 모노클로날 항체인 인플릭시맙(Remicade®; Wiekowski M et al: "Infliximab (Remicade)", Handbook of Therapeutic Antibodies, WILEY-VCH; Weinheim, 2007-01-01, p.885-904); (ii) IgG1 Fc와 TNFR2의 이량체 융합 단백질인 에타너셉트(Enbrel®); (iii) 전체가 인간의 모노클로날 항체(mAb)인 아달리무맙(Humira®; Kupper H et al: "Adalimumab (Humira)", Handbook of Therapeutic Antibodies, WILEY-VCH; Weinheim, 2007-01-01, p.697-732); (iv) PEG화 Fab 단편인 세르톨리주맙(Cimzia®; Melmed G Y et al: "Certolizumab pegol", Nature Reviews. Drug Discovery, Nature Publishing Group, GB, Vol. 7, No. 8, 2008-08-01, p.641 -642); (v) 인간 IgGIK 모노클로날 항체인 골리무맙(Simponi®; Mazumdar S et al: "Golimumab", mAbs, Landes Bioscience, US, Vol. 1, No. 5, 2009-09-01 , p.422-431)를 포함한다. 그러나 다양한 바이오시밀러(biosimilar)가 개발 중에 있으며, Remsima로 공지된 인플릭시맙 모의체가 이미 유럽에서 승인을 받은 상태이다.
인플릭시맙은 TNFα에 대한 친화성이 비교적 작으며(KD > 0.2 nM; Weir et al., 2006, Therapy 3: 535) L929 검정에서 제한된 중화 효능을 보인다. 뿐만 아니라, 인플릭시맙은 사이노몰거스(Cynomolgus) 또는 레서스(Rhesus) 원숭이에서 교차 반응성을 거의 보이지 않는다. 그러나 항TNFα 항체의 경우, 원숭이 유래 TNFα와의 교차 반응성은 (다수의 측면에서 인간이 처한 상황을 반영하는) 영장류를 이용한 동물 실험을 감안하였을 때 매우 요망된다.
에타너셉트는 2가 분자이지만, 큰 항원-바이오의약품 복합체가 형성되는 것이 방지되도록 에타너셉트 분자 1개당 삼량체 1개 비율로 TNFα와 결합한다(Wallis, 2008, Lancet Infect Dis, 8: 601). 이는 단핵구 내 LPS 유도성 사이토카인 분비를 억제하지 못한다(Kirchner et al., 2004, Cytokine, 28: 67).
세르톨리주맙의 효능은 인플릭시맙의 효능보다 약간 더 크지만, 아직 만족스러운 정도는 아니다. 세르톨리무맙은 MLR에서 T 세포 증식을 억제하지 않는다(Vos et al., 2011, Gastroenterology, 140: 221).
EP2623515 A1은, 인간화 항TNFα 항체와 이의 항원 결합 단편(Fab)을 개시하고 있다. 개시된 실시예들로부터 명확해지는 바와 같이, 생성된 인간화 Fab 단편의 효능은 L929 중화 검정에 있어서 인플릭시맙의 효능과 거의 동일하다(표 2 및 표 5 참조). 교차 반응성에 대해 시험된 유일한 항TNFα IgG 항체는 레서스 TNFα에 단지 약하게 결합할 뿐이다([0069]; 도 3 참조). TNFα와의 교차 반응성은 시험되지 않았다. 그러나 인간 TNFβ와도 약하게 결합한다(도 3 참조). 즉 EP2623515 A1은, L929 세포 내 TNFα 유도성 세포자살을 억제할 잠재성이 인플릭시맵의 L929 세포 내 TNFα 유도성 세포자살을 억제할 잠재성보다 더 크고, 레서스 TNFα와 사이노몰거스 TNFα와 교차 반응을 하는, 항TNFα 항체 또는 이의 기능성 단편을 개시하고 있지 않다.
WO 2012/007880 A2는, 하나 이상의 표적(예컨대 TNFα)에 결합하는 단일 항원 결합 도메인 하나 이상, 링커 및 중합체 분자 하나 이상을 포함하는 융합 단백질 형태의 변형 단일 도메인 항원 결합 분자(SDAB)를 개시하고 있다. 단지 주어진 구체적 실시예가 SDAB-01이라 지칭되는데, 이는 TNFα와 결합하고, 가요성 링커로 연결되어 있는 항원 결합 도메인 2개와, 위치 특이적 PEG화를 지지하는 C-말단 시스테인을 포함한다(도 3 참조). WO 2012/007880 A2는, L929 세포 기반 중화 검정에서 인플릭시맙과 같은 공지의 TNFα 항체에 대한 SDAB-01의 효능을 비교하지 못하거나, 또는 기타 SDAB-01 특이 매개변수, 예컨대 TNFα-TNFRI/II 상호작용을 차단하는 효능과, TNFβ와의 결합 특이성에 비한 TNFα와의 결합 특이성을 평가하지 못한다. 인간 TNFα가 과발현되는 다발성 관절염에 대한 유전자 이식 마우스 모델에서 SDAB-01 처리 및 인플릭시맙 처리가 비교되는 검정에 있어서(54 페이지 실시예 8 참조), 이 SDAB-01 처리 및 인플릭시맙 처리는 둘다 관절염의 악화를 예방함에 있어 유사하게 효과적인 것으로 보인다(도 17 및 도 18 참조). 그러나 이 실시예에서 제공된 투여량은 SDAB-01의 분자량이 인플릭시맙의 분자량의 절반에도 못미친다는 점에서 잘 못 설정된 것이었다. 따라서 WO 2012/007880 A2는 L929 세포에서 TNFα 유도성 세포자살 억제 효능이 인플릭시맙의 TNFα 유도성 세포자살 억제 효능보다 큰 항TNFα 항체를 개시하고 있지 않다.
WO 2015/144852 A1은, "scFv1"으로 명명되는 항 TNFα scFv의 특성들을 연구한 것이다. 이 scFv는 PK-15 세포 검정에서 인플릭시맙의 TNFα 중화 능에 버금가는 TNFα 중화 능을 보였다([0236] 참조). 뿐만 아니라, scFv는 레서스 마카크(rhesus macaque) 원숭이와 사이노몰거스 원숭이 유래 TNFα와 약간의 교차 반응성을 보이는 것으로 파악된다(실시예 8 참조). WO 2015/144852 A1에 친화성 데이터는 보고되어 있지 않다. 그러나, 단지 중간 정도의 친화성(KD=157 pM; Urech et al. 2010 Ann Rheum Dis 69:443 참조)을 가지는 것으로 공지된 단일 사슬 항체 단편 DLX105(ESBA 105라고도 공지됨)은, scFv1이 보이는 TNFα와의 결합성보다 더 큰 TNFα와의 결합성을 보인다(WO 2015/144852 A1의 도 1 참조). 따라서 WO 2015/144852 A1은 인간 TNFα에 대한 친화성(KD < 125 pM)이 큰 항TNFα 항체를 개시하고 있지 않다.
WO 2015/065987 A1은, 항TNFα 항체, 항IL-6 항체, 그리고 이 TNFα와 IL-6 둘다와 결합하는 이중 특이적 항체를 기술하고 있다. 임의의 항TNFα 항체는, 사이노몰거스 유래 TNFα와의 교차 반응성을 약간 보였다(도 17). 그러나 항TNFα 항체는 L929 중화 검정에서 인플릭시맙의 효능보다 유의미하게 더 작은 효능을 보였다([0152]; 도 5 참조). 그러므로 WO 2015/065987 A1은 L929 세포에서의 TNFα 유도성 세포자살 억제 효능이 인플릭시맙의 L929 세포 내 TNFα 유도성 세포자살 억제 효능보다 큰 항TNFα 항체를 개시하고 있지 않다.
문헌(Drugs in R&D, Vol. 4 No. 3, 2003, pages 174-178)은, 친화성이 큰 모노클로날 항TNFα 항체인 인간화 항체 "Humicade" (CDP 571; BAY 103356)를 기술하고 있다. 그러나 Humicade가 L929 세포 내 TNFα 유도성 세포자살을 억제하는 효능은 제한적인 것으로 보인다(예컨대 US 2003/0199679 A1의 [0189] 참조). 그러므로 본 참고문헌은 L929 세포에서의 TNFα 유도성 세포자살 억제 효능이 인플릭시맙의 L929 세포 내 TNFα 유도성 세포자살 억제 효능보다 큰 항TNFα 항체를 개시하고 있지 않다.
문헌(Saldanha J W et al: "Molecular Engineering I: Humanization", Handbook of Therapeutic Antibodies, Chapter 6, 2007-01-01, WILEY-VCH, Weinheim, p.119-144)은, CDR 이식, 재표면처리(resurfacing)/베니어링(veneering), SDR 이동 및 역면역화 기술을 비롯하여 모노클로날 항체를 인간화하기 위한 상이한 기법들을 개시하고 있다.
만성 염증성 질환, 예컨대 염증성 내장 장애를 치료하기 위한 개선된 분자가 필요하다. 항체 분자는 적어도 (i) 인간 TNFα에 대한 높은 친화성(즉 KD < 1 nM, 구체적으로 KD < 100 pM)을 가지고, (ii) L929 세포 내 TNFα 유도성 세포자살 억제 효능이 크며, (iii) LPS 유도성 사이토카인 분비를 억제하는 효능이 크고, (iv) 사이노몰거스 및 레서스 유래 TNFα에 대한 친화성이 상당하며(예컨대 KD < 1 nM), (v) 열 언폴딩 실험(thermal unfolding experiment)에서 측정되는 바와 같이 가변 도메인의 용융 온도가 높아야(예컨대 Tm이 적어도 60℃, 구체적으로 적어도 63℃, 더욱 구체적으로 적어도 66℃이어야) 한다.
본 출원의 발명자들은, 임의의 항TNFα 항체와 이의 기능성 단편이, 예컨대 인간 TNFα에 대한 친화성이 크고(KD < 1 nM, 구체적으로 KD < 100 pM), L929 세포 내 TNFα 유도성 세포자살 억제 효능이 인플릭시맙의 L929 세포 내 TNFα 유도성 세포자살 억제 효능과 유사하며, 구체적으로는 이보다 더 크며, LPS 유도성 사이토카인 분비 억제 효능이 아달리무맙의 LPS 유도성 사이토카인 분비 억제 효능보다 더 크고/크거나, 사이노몰거스 원숭이(마카카 파시큘라리스(Macaca fascicularis)) 및/또는 레서스 마카크스(마카카 뮬라타(Macaca mulatta))와 같은 동물 유래 TNFα에 대한 친화성이 상당한(KD < 1 nM) 것과 같이 유리한 특성들 2가지 이상을 조합하여 보인다는 것을 발견하였다. 뿐만 아니라, 항체와 이의 기능성 단편은, TNFβ와 유의미한 정도로 결합하지 않았고, 가변 도메인의 열 언폴딩 검정에서 측정된 바와 같이 유의미한 안정성을 보이지 않았다는 점에서 TNFα에 특이적이었다.
본 발명은 항체 분자와 이의 기능성 단편을 제공한다.
그러므로 본 발명은 하기 항목 (1) 내지 항목 (47)에 정의된 특허 대상에 관한 것이다:
(1) 인간 종양 괴사 인자 알파(TNFα)에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 기능성 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 기능성 단편은 (i) 서열 번호 1에 보인 아미노산 서열에 따른 아미노산 서열을 가지는 CDR1 영역, 서열 번호 2에 보인 아미노산 서열에 따른 아미노산 서열을 가지는 CDR2 영역, 그리고 서열 번호3에 보인 아미노산 서열에 따른 아미노산 서열을 가지는 CDR3 영역을 포함하는 VL 도메인과, (ii) 서열 번호 4에 보인 아미노산 서열에 따른 아미노산 서열을 가지는 CDR1 영역, 서열 번호 5에 보인 아미노산 서열에 따른 아미노산 서열을 가지는 CDR2 영역, 그리고 서열 번호 6에 보인 아미노산 서열에 따른 아미노산 서열을 가지는 CDR3 영역을 포함하는 VH 도메인을 포함하는, 항체 또는 이의 기능성 단편.
(2) 항목 (1)의 항체 또는 기능성 단편으로서, 상기 항체 또는 기능성 단편은 (i) 서열 번호 7에 보인 아미노산 서열을 가지는 CDR1 영역, 서열 번호 2에 보인 아미노산 서열을 가지는 CDR2 영역, 그리고 서열 번호 8에 보인 아미노산 서열을 가지는 CDR3 영역을 포함하는 VL 도메인과, (ii) 서열 번호 9에 보인 아미노산 서열을 가지는 CDR1 영역, 서열 번호 10에 보인 아미노산 서열을 가지는 CDR2 영역, 그리고 서열 번호 11에 보인 아미노산 서열을 가지는 CDR3 영역을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 기능성 단편.
(3) 항목 (1) 및 (2) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, 상기 항체 또는 기능성 단편은 서열 번호 12 내지 서열 번호 14에 보인 아미노산 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 기능성 단편.
(4) 항목 (1) 내지 (3) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, 상기 항체 또는 기능성 단편은 서열 번호 15 내지 서열 번호 17에 보인 아미노산 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 기능성 단편.
(5) 항목 (1) 내지 (4) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 기능성 단편은 인간 TNFα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 기능성 단편.
(6) 항목 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 기능성 단편은 TNFβ에 유의미하게 결합하지 않는 항체 또는 기능성 단편.
(7) 항목 (1) 내지 (6) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, 상기 항체 또는 기능성 단편은
(i) 1 nM 미만, 구체적으로 750 pM 미만, 더욱 구체적으로 100 pM 미만의 해리 상수(KD)로 인간 TNFα와 결합하고;
(ii) 마카카 뮬라타 TNFα 및 마카카 파시큘라리스 TNFα와 교차 반응을 하며;
(iii) L929 검정에 의해 측정되는 바와 같이 TNFα 유도성 세포자살 억제 효능이 인플릭시맙의 TNFα 유도성 세포자살 억제 효능의 적어도 10%, 구체적으로 인플락시맙의 효능보다 더 크고/크거나;
(iv) 화학양론(항체 : TNFα삼량체) 적어도 2로 인간 TNFα삼량체와 결합할 수 있는, 항체 또는 기능성 단편.
(8) 항목 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, 인간 TNFα와 100 pM 미만, 구체적으로 75 pM 미만의 KD로 결합하는 항체 또는 기능성 단편.
(9) 항목 (1) 내지 (8) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, 마카카 뮬라타 유래 TNFα와 1 nM 미만의 KD로 결합하는 항체 또는 기능성 단편.
(10) 항목 (1) 내지 (9) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, 마카카 파시큘라리스 유래 TNFα와 1 nM 미만의 KD로 결합하는 항체 또는 기능성 단편.
(11) 항목 (1) 내지 (10) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, L929 검정에서 측정된 항체 또는 기능성 단편의 TNFα 유도성 세포자살 억제 효능이, L929 검정에서 측정된 인플릭시맙의 TNFα 유도성 세포자살 억제 효능에 비하여 5 이상이고(상대적 효능), 상기 상대적 효능은 L929 검정에 있어서 인플릭시맙의 IC50 값(ng/mL) 대 L929 검정에 있어서 scFv 형태 항체의 IC50 값(ng/mL)의 비율인 항체 또는 기능성 단편.
(12) 항목 (1) 내지 (11) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, scFv 형태 항체의 가변 도메인 용융 온도는 시차주사형광측정법에 의해 측정되었을 때 적어도 60℃인 항체 또는 기능성 단편.
(13) 항목 (1) 내지 (12) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, scFv 형태 항체의 가변 도메인 용융 온도는 시차주사형광측정법에 의해 측정되었을 때 적어도 63℃인 항체 또는 기능성 단편.
(14) 항목 (1) 내지 (13) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, 용융 온도는 시차주사형광측정법에 의해 측정되었을 때 적어도 66℃인 항체 또는 기능성 단편.
(15) 항목 (1) 내지 (14) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, 5회 연속 동결-해동 주기 이후 단량체 함량 손실률이 0.2% 미만인 항체 또는 기능성 단편.
(16) 항목 (1) 내지 (15) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, 2일, 구체적으로 적어도 1주, 더욱 구체적으로 적어도 2주, 가장 구체적으로 적어도 4주 동안 4℃에 보관한 후 단량체 함량 손실률이 1% 미만인 항체 또는 기능성 단편.
(17) 항목 (1) 내지 (16) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, 억제 ELISA에서 측정되는 바와 같이, 이 항체 또는 기능성 단편이 인간 TNFα 및 TNFα 수용체 I(TNFRI) 사이 상호작용을 차단하는 효능이 인플릭시맙이 인간 TNFα 및 TNFα 수용체 I(TNFRI) 사이 상호작용을 차단하는 효능에 비하여 적어도 2이고(상대적 효능), 상기 상대적 효능은 인플릭시맙의 IC50 값(ng/mL) 대 scFv 형태 항체의 IC50 값(ng/mL)의 비율인 항체 또는 기능성 단편.
(18) 항목 (1) 내지 (17) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, 억제 ELISA에서 측정되는 바와 같이, 이 항체 또는 기능성 단편이 인간 TNFα 및 TNFα 수용체 II(TNFRII) 사이 상호작용을 차단하는 효능이 인플릭시맙이 인간 TNFα 및 TNFα 수용체 II(TNFRII) 사이 상호작용을 차단하는 효능에 비하여 적어도 2이고(상대적 효능), 상기 상대적 효능은 인플릭시맙의 IC50 값(ng/mL) 대 scFv 형태 항체의 IC50 값(ng/mL)의 비율인 항체 또는 기능성 단편.
(19) 항목 (1) 내지 (18) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, 혼합 백혈구 반응에서 말초 혈액 단핵구의 세포 증식을 억제할 수 있는 항체 또는 기능성 단편.
(20) 항목 (1) 내지 (19) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, CD14+ 단핵구 유래 인터루킨-1β의 LPS 유도성 분비를 억제할 수 있는 항체 또는 기능성 단편.
(21) 항목 (20)의 항체 또는 기능성 단편으로서, 인터루킨-1β의 LPS 유도성 분비를 억제하기 위한 IC50 값은 1 nM 미만인 항체 또는 기능성 단편.
(22) 항목 (21)의 항체 또는 기능성 단편으로서, 인터루킨-1β의 LPS 유도성 분비를 억제하기 위한 IC50 값은 몰을 기준으로 아달리무맙의 인터루킨-1β의 LPS 유도성 분비를 억제하기 위한 IC50 값보다 더 작은 항체 또는 기능성 단편.
(23) 항목 (1) 내지 (22) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, CD14+ 단핵구 유래 TNFα의 LPS 유도성 분비를 억제할 수 있는 항체 또는 기능성 단편.
(24) 항목 (23)의 항체 또는 기능성 단편으로서, TNFα의 LPS 유도성 분비 억제를 위한 IC50 값은 1 nM 미만인 항체 또는 기능성 단편.
(25) 항목 (24)의 항체 또는 기능성 단편으로서, TNFα의 LPS 유도성 분비를 억제하기 위한 IC50 값은 몰을 기준으로 아달리무맙의 TNFα의 LPS 유도성 분비를 억제하기 위한 IC50 값보다 더 작은 항체 또는 기능성 단편.
(26) 항목 (1) 내지 (25) 중 어느 하나의 항체로서, 면역글로불린 G(IgG)인 항체.
(27) 항목 (1) 내지 (25) 중 어느 하나의 기능성 단편으로서, 단일 사슬 가변 단편(scFv)인 기능성 단편.
(28) 항목 (27)의 기능성 단편으로서, 상기 scFv는 서열 번호 18 내지 서열 번호 20에 보인 아미노산 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어져 있으며, 구체적으로 상기 scFv는 서열 번호 20에 보인 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어져 있는 기능성 단편.
(29) 항목 (1) 내지 (25) 중 어느 하나의 기능성 단편으로서, 다이아바디(diabody)인 기능성 단편.
(30) 서열 번호 12 내지 서열 번호 14에 보인 아미노산 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열 번호 14에 보인 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인과, 서열 번호 15 내지 서열 번호 17에 보인 아미노산 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열 번호 17에 보인 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함하는 항체에 대한 인간 TNFα상 에피토프와 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하고, 구체적으로 상기 항체 또는 기능성 단편은 상기 항목 (1) 내지 (25)에 언급된 특징들 중 하나 이상을 보이는 항체 또는 이의 기능성 단편.
(31) 항목 (1) 내지 (30) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, (i) 서열 번호 33 내지 서열 번호 35의 서열들(표 6 참조)을 가지는 각각의 인간 Vκ1 공통 서열의 아미노산과 상이한, 상기 항체 또는 기능성 단편의 가변 경 도메인의 구조 영역(framework region) I 내지 III 중 아미노산의 수와, (ii) 서열 번호 36 내지 서열 번호 39의 서열들(표 7 참조)로부터 선택되는 서열로서 가장 유사한 인간 λ 생식계열 기반 서열 중 아미노산과 상이한, 상기 항체 또는 기능성 단편의 가변 경도메인의 구조 영역 IV 중 아미노산의 수의 합은 7 미만, 바람직하게 4 미만인 항체 또는 기능성 단편.
(32) 항목 (1) 내지 (31) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편으로서, 상기 항체 또는 기능성 단편의 가변 경 도메인의 구조 영역 I 내지 III은, 서열 번호 33 내지 서열 번호 35의 서열을 가지는 인간 Vκ1 공통 서열로 이루어져 있고, 구조 영역 IV는 서열 번호 36 내지 서열 번호 39의 서열들로부터 선택되는 λ 생식계열 기반 서열로 이루어져 있는, 항체 또는 기능성 단편.
(33) 항목 (1) 내지 (32) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편을 암호화하는 핵산.
(34) 항목 (33)의 핵산을 포함하는 벡터 또는 플라스미드.
(35) 항목 (33)의 핵산 또는 항목 (34)의 벡터나 플라스미드를 포함하는 세포.
(36) 항목 (1) 내지 (32) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편을 제조하는 방법으로서, 항체 또는 기능성 단편을 암호화하는 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 배지 중에서 항목 (35)의 세포를 배양하는 단계와, 세포 또는 배지로부터 항체 또는 기능성 단편을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
(37) 항목 (1) 내지 (32) 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편과, 선택적으로는 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
(38) 항목 (1) 내지 (32) 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 항체 또는 기능성 단편으로서, TNFα 관련 장애나 질환, 구체적으로 염증성 장애나 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 항체 또는 기능성 단편.
(39) 항목 (38)에 따라 사용되기 위한 항체 또는 기능성 단편으로서, 상기 TNFα 관련 장애나 질환은 이하 "치료될 장애들" 섹션에 나열된 질환 및 장애 목록으로부터 선택되는 항체 또는 기능성 단편.
(40) 항목 (38) 또는 (39)에 따라 사용되기 위한 항체 또는 기능성 단편으로서, 상기 방법은 항체 또는 기능성 단편을 대상체에 경구 투여하는 단계를 포함하는 항체 또는 기능성 단편.
도 1: 인간화 과정의 계략도.
도 2: scFv의 정제된 인간화 scFv 제제(2.5 g/L)의 SE-HPLC 크로마토그램. scFv 단량체는 8.5분 내지 9.5분의 체류 시간을 두고 용리되는 한편, 이량체 scFv는 약 7.8분 내지 약 8.3분의 체류 시간을 두고 용리되고, 완충제 성분들은 10분을 초과하는 시간을 두고 용리된다. 컬럼 사적(dead volume)으로부터 각각의 scFv 단량체에 이르기까지에 대응하는 모든 피크는 응집물/올리고머로서 합하여져, 상대적 피크 면적 산정시 사용되었다.
도 3: scFv 구조체 3개의 DSF 측정으로부터 얻어진 열 언폴딩 곡선. 각각의 구조체에 대하여 2회의 측정치들을 보였다. 이때 얻어진 Tm 값은, 데이터를 Boltzmann 등식에 피팅(fitting)시켜 전이의 중간 지점을 구함으로써 측정되었다: 16-19-B11-sc01: 67.8℃; 16-19-B11-sc02: 66.4℃; 및 16-19-B11-sc06: 64.6℃.
도 4: L929 검정에 있어서 scFv가 인간 TNFα를 중화하는 효능. scFv와 기준 항체인 인플릭시맙에 대한 용량-반응 곡선을 보여준다. scFv 및 인플릭시맙의 최고 농도뿐만 아니라, 음성 대조군 최고 농도는 성장% 100% 및 0%로 설정되었다.
도 5: L929 검정에 있어서 인간 이외의 영장류와 인간의 TNFα를 중화하는, scFv의 효능. 인간, 사이노몰거스 원숭이 및 레서스 원숭이 TNFα의 중화에 관한 용량-반응 곡선을 보여준다. scFv 최고 농도와 음성 대조군 최고 농도는 성장% 100% 및 0%로 설정되었다.
도 6은, 항TNF 가변 도메인 16-19-B1-sc06을 포함하는 4중 특이적 항체 구조체 PRO357(특이성 (3))을 사용하는, MATCH 형태의 TNF-결합 화학양론 측정 결과를 도시한다.
본 발명은 인간 TNFα와 결합할 수 있는 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것이다.
본 출원의 문맥 중 "항체"라는 용어는, IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD 군(또는 이것들의 임의의 하위 군)에 속하는 단백질로서 정의되는 "면역글로불린(Ig)"과 동의어로 사용되며, 종래에 공지된 모든 항체와 이의 기능성 단편을 포함한다. 본 발명의 문맥 중 항체/면역글로불린의 "기능성 단편"은 상기 항목 (1) 내지 (30)에 언급된 부모 항체의 특성들 중 하나 이상을 본질적으로 유지하는, 이러한 부모 항체의 항원 결합 단편 또는 기타 유도체로서 정의된다. 항체/면역글로불린의 "항원 결합 단편"은, 항원 결합 영역을 보유하는 단편(예컨대 IgG의 가변 영역)으로서 정의된다. 항체의 "항원 결합 영역"은 통상 항체의 초가변 영역(들) 하나 이상, 즉 CDR-1, -2 및/또는 -3 영역에서 발견된다. 본 발명의 "항원 결합 단편"은 F(ab')2 단편 및 Fab 단편의 도메인을 포함한다. 본 발명의"기능성 단편"은 scFv, dsFv, 다이아바디, 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 및 Fc 융합 단백질을 포함한다. F(ab')2 및 Fab는 CH1 도메인과 CL 도메인 사이에 발생하는 분자간 이황화 상호작용이 최소화되거나 완전히 소실되도록 조작될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 2기능성 또는 다기능성 구조체의 일부일 수 있다. 예컨대 항체 또는 이의 기능성 단편은 하나의 결합 특이성을 보이는 복사체 다수를 포함하는 구조체, 예컨대 2가 다이아바디, F(ab')2 또는 IgG이나, 또는 4가 구조체, 예컨대 4가 테트라바디 또는 TandAb의 형태를 취할 수 있다. 대안적으로 항체 또는 이의 기능성 단편은 결합 특이성을 2개 이상 포함하는 구조체의 일부일 수 있는데, 예컨대 특이성을 2개 이상 포함하는 이중 특이적 다이아바디 또는 융합 단백질일 수 있다. 마지막으로 항체 또는 이의 기능성 단편은 하나 이상의 항체 기반 결합 도메인, 예컨대 본 발명에 의한 항체 또는 기능성 단편과, 하나 이상의 비 항체 기반 기능성 도메인, 예컨대 비 항체 기반 표적화 도메인 및 효과기 도메인, 예컨대 독소를 포함하는 다기능성 구조체의 일부일 수 있다.
본 발명에 바람직한 기능성 단편은 scFv 및 디이아바디이다.
scFv는, 가변 경 도메인("VL")과 가변 중 도메인("VH")이 펩티드 결합에 의해 연결되어 있는 단일 사슬 Fv 단편이다.
다이아바디는 각각이 링커 등을 통해 서로간에 접합되어 있는 가변 영역을 가지고, 통상 2개의 VL과 2개의 VH를 함유하는 단편들(이하 다이아바디 형성 단편이라 지칭함) 2개로 이루어진 이량체이다. 다이아바디 형성 단편은 VL 및 VH, VL 및 VL, VH 및 VH 등, 바람직하게 VH 및 VL로 이루어진 것들을 포함한다. 다이아바디 형성 단편 중 가변 영역들을 연결하는 링커는 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 동일 단편 내 가변 영역들 간 비공유 결합 형성을 막기에 충분히 짧다. 이러한 링커의 길이는 당 업자에 의해 적당히 결정될 수 있지만, 통상적으로는 2개 ~ 14개 아미노산, 바람직하게는 3개 ~ 9개 아미노산, 특히 4개 ~ 6개 아미노산일 수 있다. 이 경우, 동일 단편상에 제시되는 VL 및 VH는 다른 단편과의 이량체가 형성될 수 있도록 동일 사슬상 VL 및 VH 간에 비공유 결합이 형성되는 것을 막고, 단일 사슬 가변 영역 단편의 형성을 막기에 충분히 짧은 링커를 통해 연결되어 있다. 이량체는 다이아바디 형성 단편들 사이의 공유 결합 또는 비공유 결합 중 어느 하나를 통하거나, 또는 공유결합과 비공유결합 둘다를 통해 형성될 수 있다.
더욱이 다이아바디 형성 단편은 링커 등을 통해 연결되어, 단일 사슬 다이아바디(sc(Fv)2)를 형성할 수 있다. 약 15개 ~ 약 20개의 아미노산으로 이루어진 긴 링커를 사용하여 다이아바디 형성 단편들을 연결함으로써, 동일한 사슬상에 존재하는 다이아바디 형성 단편들 간에 비공유 결합들이 형성되어 이량체가 형성될 수 있다. 다이아바디를 제조하기 위한 원리와 동일한 원리를 바탕으로, 중합 항체, 예컨대 삼량체 또는 사량체는 또한 3개 이상의 다이아바디 형성 단편들을 접합시킴으로써 제조될 수 있다.
바람직하게 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 TNFα에 특이적으로 결합한다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체 또는 이의 기능성 단편은, 이 항체 또는 기능성 단편이 인간 TNFα와 하나 이상의 기준 분자(들) 사이를 구별할 수 있을 때 인간 TNFα를 "특이적으로 인지하는" 것 또는 인간 TNFα에"특이적으로 결합하는" 것이다. 바람직하게 기준 분자들 각각과의 결합에 대한 IC50값은, 구체적으로 실시예 2의 2.1.4 섹션에 기술된 바와 같이 TNFα와의 결합에 대한 IC50값보다 적어도 1000배 더 크다. 가장 일반적인 형태일 때 (그리고 한정된 기준이 언급되지 않을 때) "특이적 결합"은, 예컨대 당 분야에 공지된 특이성 검정 방법에 따라 측정되는 바와 같이, 인간 TNFα 및 무관한 생물분자 간을 구별하는, 항체 또는 기능성 단편의 능력을 지칭한다. 이러한 방법으로서는 웨스턴 블럿팅 및 ELISA 검사를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예컨대 표준 ELISA 검정이 수행될 수 있다. 통상적으로 결합 특이성 측정은 단일 기준 생물분자가 아니라, 약 3개 내지 약 5개의 무관한 생물분자(예컨대 분유, BSA, 트랜스페린 등) 세트를 사용하여 수행된다. 하나의 구현예에서, 특이적 결합이란, 항체 또는 단편이 인간 TNFα와 인간 TNFβ 간을 구별하는 능력을 지칭한다.
본 발명의 항체 또는 본 발명의 기능성 단편은 VL 도메인과 VH 도메인을 포함한다. VL 도메인은 CDR1 영역(CDRL1), CDR2 영역(CDRL2), CDR3 영역(CDRL3) 및 구조 영역들을 포함한다. VH 도메인은 CDR1 영역(CDRH1), CDR2 영역(CDRH2), CDR3 영역(CDRH3) 및 구조 영역들을 포함한다.
"CDR"이란 용어는, 주로 항원 결합에 기여하는 항체 가변 도메인들 내 초가변 영역 6개 중 하나를 지칭한다. CDR 6개에 대해 가장 일반적으로 사용되는 정의들 중 하나가 Kabat E.A.외 다수(1991)("Sequences of proteins of immunological interest"NIH Publication 91-3242)에 의해 제공되었다. 본원에 사용된 바와 같이, CDR에 관한 Kabat의 정의는 오로지 경쇄 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3(CDR L1, CDR L2, CDR L3 또는 L1, L2, L3)에뿐만 아니라, 중쇄 가변 도메인의 CDR2 및 CDR3(CDR H2, CDR H3, 또는 H2, H3)에도 적용된다. 그러나 본원에 사용된 바와 같은 중쇄 가변 도메인의 CDR1(CDR H1 또는 H1)은 하기 잔기들에 의해 한정된다(Kabat 번호메김): CDR1은 26번 위치에서 시작되어 36번 위치에서 끝난다.
VL 도메인의 CDR1 영역은 서열 번호 1에 보인 아미노산 서열에 의한 아미노산 서열로 이루어져 있다. 바람직하게 VL 도메인의 CDR1 영역은 서열 번호 7, 서열 번호 21 및 서열 번호 22의 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어져 있다. 가장 바람직하게 VL 도메인의 CDR1 영역은 서열 번호 7에 보인 아미노산 서열로 이루어져 있다.
VL 도메인의 CDR2 영역은 서열 번호 2에 보인 아미노산 서열에 의한 아미노산 사열로 이루어져 있다.
VL 도메인의 CDR3 영역은 서열 번호 3에 보인 아미노산 서열에 의한 아미노산 서열로 이루어져 있다. 바람직하게 VL 도메인의 CDR3 영역은 서열 번호 8, 서열 번호 23 및 서열 번호 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어져 있다. 가장 바람직하게 VL 도메인의 CDR3 영역은 서열 번호 8에 보인 아미노산 서열로 이루어져 있다.
VH 도메인의 CDR1 영역은 서열 번호 4에 보인 아미노산 서열에 의한 아미노산 서열로 이루어져 있다. 바람직하게 VH 도메인의 CDR1 영역은 서열 번호 9, 서열 번호 25 및 서열 번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어져 있다. 가장 바람직하게 VH 도메인의 CDR1 영역은 서열 번호 9에 보인 아미노산 서열로 이루어져 있다.
VH 도메인의 CDR2 영역은 서열 번호 5에 보인 아미노산 서열에 의한 아미노산 서열로 이루어져 있다. 바람직하게 VH 도메인의 CDR2 영역은 서열 번호 10, 서열 번호 27 및 서열 번호 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어져 있다. 가장 바람직하게 VH 도메인의 CDR2 영역은 서열 번호 10에 보인 아미노산 서열로 이루어져 있다.
VH 도메인의 CDR3 영역은 서열 번호 6에 보인 아미노산 서열에 의한 아미노산 서열로 이루어져 있다. 바람직하게 VH 도메인의 CDR3 영역은 서열 번호 11 및 서열 번호 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어져 있다. 가장 바람직하게 VH 도메인의 CDR3 영역은 서열 번호 11에 보인 아미노산 서열로 이루어져 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 기능성 단편은 (i) 서열 번호 1에 보인 아미노산 서열에 의한 아미노산 서열을 가지는 CDR1 영역, 서열 번호 2에 보인 아미노산 서열에 의한 아미노산 서열을 가지는 CDR2 영역, 그리고 서열 번호 3에 보인 아미노산 서열에 의한 아미노산 서열을 가지는 CDR3 영역을 포함하는 VL 도메인과, (ii) 서열 번호 4에 보인 아미노산 서열에 의한 아미노산 서열을 가지는 CDR1 영역, 서열 번호 5에 보인 아미노산 서열에 의한 아미노산 서열을 가지는 CDR2 영역, 그리고 서열 번호 6에 보인 아미노산 서열에 의한 아미노산 서열을 가지는 CDR3 영역을 포함하는 VH 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 기능성 단편은 (i) 서열 번호 7에 보인 아미노산 서열을 가지는 CDR1 영역, 서열 번호 2에 보인 아미노산 서열을 가지는 CDR2 영역, 그리고 서열 번호 8에 보인 아미노산 서열을 가지는 CDR3 영역을 포함하는 VL 도메인과, (ii) 서열 번호 9에 보인 아미노산 서열을 가지는 CDR1 영역, 서열 번호 10에 보인 아미노산 서열을 가지는 CDR2 영역, 그리고 서열 번호 11에 보인 아미노산 서열을 가지는 CDR3 영역을 포함하는 VH 도메인을 포함한다.
더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 기능성 단편은 서열 번호 12 내지 서열 번호 14에 보인 아미노산 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열 번호 14에 보인 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인을 포함한다. 더욱 바람직한 또 다른 구현예에서, 항체 또는 기능성 단편은 서열 번호 15 내지 서열 번호 17에 보인 아미노산 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열 번호 17에 보인 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함한다. 가장 바람직하게 본 발명의 항체 또는 본 발명의 기능성 단편은
(i) 서열 번호 12 내지 서열 번호 14에 보인 아미노산 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열 번호 14에 보인 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인과, (ii) 서열 번호 15 내지 서열 번호 17에 보인 아미노산 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열 번호 17에 보인 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, 기능성 단편은 서열 번호 12 내지 서열 번호 14에 보인 아미노산 서열들로부터 선택되는 아미노산, 구체적으로 서열 번호 14에 보인 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인과, 서열 번호 15 내지 서열 번호 17에 보인 아미노산 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열 번호 17에 보인 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함하는 단일 사슬 항체의 것(scFv)이다. VH 도메인과 VL 도메인은 바람직하게 펩티드 링커에 의해 결합된다. 펩티드 링커(이하 "링커A"라 지칭됨)의 길이는 통상 약 10개 내지 약 30개 아미노산, 더욱 바람직하게 약 15개 내지 약 25개 아미노산이다. 링커A는 통상 Gly 및 Ser 잔기들을 포함하지만, 다른 아미노산들도 또한 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 링커는 서열 GGGGS(서열 번호 30)의 반복부를 다수 개 포함하는데, 예컨대 서열 번호 31에 보인 아미노산 서열의 연속적 반복부를 2개 내지 6개, 또는 3개 내지 5개, 또는 4개 포함한다. 가장 바람직하게 링커A는 서열 번호 32에 보인 아미노산 서열로 이루어져 있다. scFv는 하기 구조, 즉
VL-링커A-VH; 또는
VH-링커A-VL
를 가질 수 있다(다만, N-말단은 좌측이고, C-말단은 우측임)
가장 바람직하게 기능성 단편은 서열 번호 18 내지 서열 번호 20의 아미노산 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열 번호 20에 보인 아미노산 서열로 이루어진 단일 사슬 항체(scFv)이다.
특히 바람직한 또 다른 구현예에서, 기능성 단편은 서열 번호 12 내지 서열 번호 14에 보인 아미노산 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열 번호 14에 보인 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인과, 서열 번호 15 내지 서열 번호 17에 보인 아미노산 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열 번호 17에 보인 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함하는 다이아바디이다. VH 도메인과 VL 도메인은 펩티드 링커에 의해 연결되어 있다. 펩티드 링커(이하 "링커B"라 지칭됨)의 길이는 바람직하게 약 2개 아미노산 내지 약 10개 아미노산, 더욱 바람직하게 약 5개 아미노산이다. 링커B는 통상 Gly와 Ser 잔기들을 포함하지만, 다른 아미노산들도 또한 포함할 수 있다. 가장 바람직하게 링커B는 서열 번호 30에 보인 아미노선 서열로 이루어져 있다.
다이아바디는, 바람직하게 이중 특이적 다이아바디, 즉 2개의 에피토프에 대해 유도된 다이아바디이다. 다이아바디는, 바람직하게 동종이량체이다. 다이아바디는 서로간에 비공유 결합된 폴리펩티드 사슬 2개로 이루어진 이종이량체일 수 있다. 2개의 단량체 사슬은 하기 구조, 즉
VL-링커B-VH* 및 VL*-링커B-VH;
VH-링커B-VL*, VH*-링커B-VL:
VL-링커B-VL* 및VH*-링커B-VH: 또는
VL*-링커B-VL 및 VH-링커B-VH*
를 가지는 폴리펩티드 사슬일 수 있다(다만 *는 제2 특이성을 나타냄).
더욱이 다이아바디 형성 단편은 링커A 등을 통해 연결되어 단일 사슬 다이아바디(sc(Fv)2)를 형성할 수 있다. 약 15개 내지 약 20개 아미노산으로 이루어진 긴 링커를 사용하여 다이아바디 형성 단위들을 접합시킬 때, 동일 사슬상에 존재하는 다이아바디 형성 단편들 사이에 비공유 결합이 형성되어 이량체로 형성될 수 있다. 단일 사슬 다이아바디들 배열의 예들로서는 이하, 즉
VH-링커B-VL*-링커A-VH 링커B-VL
VL-링커B-VH-링커A-VL-링커B-VH
를 포함한다.
바람직하게 본 발명의 다이아바디는 이하, 즉
VL-링커B-VH-링커A-VL-링커B-VH
의 구조를 가진다.
바람직하게 링커B는 서열 번호 30에 보인 아미노산 서열로 이루어져 있고/있거나, 링커A는 서열 번호 32에 보인 아미노산 서열로 이루어져 있다. 가장 바람직하게 링커B는 서열 번호 30에 보인 아미노산 서열로 이루어져 있으며, 링커A는 서열 번로 32에 보인 아미노산 서열로 이루어져 있다.
다이아바디를 제조하기 위한 원리와 동일한 원리에 입각하여, 3개 이상의 다이아바디 형성 단편을 연결함으로써 중합 항체, 예컨대 삼량체 또는 사량체도 또한 제조될 수 있다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 면역글로불린, 바람직하게 면역글로불린 G(IgG)이다. 본 발명의 IgG의 하위 군은 제한되지 않지만, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 바람직하게 본 발명의 IgG는 하위 군 1의 IgG, 즉 IgG1 분자이다.
친화성
본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 인간 TNFα에 대한 친화성이 크다. "KD"란 용어는, 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다. 통상적으로 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은, 예컨대 BIACORE Instrument사의 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술을 이용하여 측정되는 바와 같이, 대략 2x10-10 M, 바람직하게 1x10-10 M 미만, 바람직하게 5x10-11 M 미만, 또는 심지어 이보다 작은 해리 평형 상수(KD)로 인간 TNFα에 결합한다. 구체적으로 KD의 측정은 실시예 2의 2.1.1 섹션에 기술된 바와 같이 수행된다.
사이노몰거스 원숭이 또는 레서스 마카크스 원숭이 유래 TNFα에 대한 교차 반응성
특정 구현예들에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 사이노몰거스 원숭이(마카카 파시큘라리스) 및/또는 레서스 마카크스(마카카 뮬라타)와 같은 동물 유래 TNFα에 대하여 상당한 친화성을 가진다. 항인간 TNFα항체의 전임상 시험, 예컨대 독성 연구가, 바람직하게 이러한 동물로써 수행되기 때문에, 이러한 사실은 유리하게 작용한다. 그러므로 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은, 바람직하게 사이노몰거스 원숭이 및/또는 레서스 마카크스와 같은 동물 유래 TNFα와 교차 반응성이다. 친화성 측정은 실시예 2의 2.1.1 섹션에 기술된 바와 같이 수행된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 마카카 파시큘라리스 유래 TNFα와 교차 반응성이다. 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은, 바람직하게 인간 TNFα에 대한 친화성과 20배 미만, 구체적으로 10배 미만, 더욱더 구체적으로 5배 미만으로 상이한, 마카카 파시큘라리스 TNFα에 대한 친화성을 가진다. 통상적으로 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 마카카 파시큘라리스 유래 TNFα와 해리 평형 상수(KD)로 결합하는데, 이 경우 (i) 마카카 파시큘라리스 유래 TNFα와의 결합에 대한 KD 대 (ii) 인간 TNFα와의 결합에 대한 KD의 비율 R엠.파시큘라리스는 20 미만이다.
Figure pct00001
R엠.파시큘라리스은, 바람직하게 20 미만, 구체적으로 10 미만, 더욱더 구체적으로 5 미만이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 마카카 뮬라타 유래 TNFα와 교차 반응성이다. 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은, 바람직하게 인간 TNFα에 대한 친화성과 20배 미만, 구체적으로 10배 미만으로 상이한, 마카카 뮬라타 TNFα에 대한 친화성을 가진다. 통상적으로 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 마카카 뮬라타 유래 TNFα와 해리 평형 상수(KD)로 결합하는데, 이 경우 (i) 마카카 뮬라타 유래 TNFα와의 결합에 대한 KD 대 (ii) 인간 TNFα와의 결합에 대한 KD의 비율 R엠.뮬라타는 20 미만이다.
Figure pct00002
R엠.뮬라타는, 바람직하게 20 미만, 구체적으로 10 미만이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 마카카 파시큘라리스 유래 TNFα 및 마카카 뮬라타 유래 TNFα와 교차 반응성이다. 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은, 바람직하게 인간 TNFα에 대한 친화성과 20배 미만, 구체적으로 10배 미만, 더욱더 구체적으로 5배 미만으로 상이한, 마카카 파시큘라리스 TNFα에 대한 친화성을 가지고, 바람직하게 인간 TNFα에 대한 친화성과 20배 미만, 구체적으로 10배 미만으로 상이한, 마카카 뮬라타 TNFα에 대한 친화성을 가진다. 항체 또는 기능성 단편의 비율 R엠.파시큘라리스은, 바람직하게 20 미만, 구체적으로 10 미만, 더욱더 구체적으로 5 미만이고, 항체 또는 기능성 단편의 비율 R엠.뮬라타는, 바람직하게 20 미만, 구체적으로 10 미만이다.
L929 세포의 TNFα 유도성 세포자살을 억제하는 효능
본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 L929 세포의 TNFα 유도성 세포자살을 억제하는 효능이 큰데, 이는 공지의 항체 인플릭시맙 효능의 적어도 10% 크다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 인플릭시맙의 L929 세포의 TNFα 유도성 세포자살 억제 효능보다 더 큰, L929 세포의 TNFα 유도성 세포자살 억제 효능을 가진다.
인플릭시맙 효능에 상대적인 효능은 본 출원의 실시예 2, 2.1.2 섹션에 기술된 바와 같은 L929 검정에서 측정될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 기능성 단편의 상대적 효능은 인플릭시맙 효능의 적어도 10%만큼, 구체적으로 인플릭시맙 효능보다 적어도 10%만큼 더 큰데, 바람직하게 인플릭시맙 효능보다 1.5 이상, 바람직하게 2 이상, 더욱 바람직하게 3 이상, 더욱 바람직하게 5 이상, 더욱 바람직하게 7.5 이상 또는 심지어 10 이상이고, 여기서 상대적 효능은 (ii) L929 검정에 있어서 본 발명의 항체 또는 기능성 단편의 IC50 값에 비한 (i) L929 검정에 있어서 인플릭시맙의 IC50 값이고, IC50은 L929 세포의 TNFα 유도성 세포자살 최대 억제의 50%를 달성하는 데에 필요한 각각의 분자의 농도(ng/mL)를 나타낸다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편의 상대적 효능은 인플릭시맙 효능의 적어도 10%만큼, 구체적으로 인플릭시맙 효능보다 적어도 10%만큼 더 큰데, 바람직하게 인플릭시맙 효능보다 1.5 이상, 바람직하게 2 이상, 더욱 바람직하게 3 이상, 더욱 바람직하게 5 이상, 더욱 바람직하게 7.5 이상 또는 심지어 10 이상이고, 여기서 상대적 효능은 (ii) L929 검정에 있어서 본 발명의 항체 또는 기능성 단편의 IC50 값에 비한 (i) L929 검정에 있어서 인플릭시맙의 IC50 값이고, IC50값은 L929 세포의 TNFα 유도성 세포자살 최대 억제의 90%를 달성하는 데에 필요한 각각의 분자의 농도(ng/mL)를 나타낸다.
LPS 유도성 사이토카인 분비의 억제
통상적으로 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 단핵구로부터의 LPS 유도성 사이토카인 분비를 억제할 수 있다. 단핵구로부터의 LPS 유도성 사이토카인 분비는 실시예 7에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 CD14+ 단핵구로부터의 LPS 유도성 인터루킨-1β 분비를 억제할 수 있다. LPS 유도성 인터루킨-1β 분비를 억제하기 위한 IC50 값은, 바람직하게 1 nM 미만 및/또는 100 pg/mL 미만이다. LPS 유도성 인터루킨-1β 분비 억제를 위한 IC50 값은, 바람직하게 몰 기준 및/또는 용적당 중량 기준으로, 아달리무맙의 LPS 유도성 인터루킨-1β 분비 억제를 위한 IC50 값보다 더 작다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 CD14+ 단핵구로부터의 LPS 유도성 TNFα 분비를 억제할 수 있다. LPS 유도성 TNFα 분비를 억제하기 위한 IC50 값은, 바람직하게 1 nM 미만 및/또는 150 pg/mL 미만이다. LPS 유도성 TNFα 분비 억제를 위한 IC50 값은, 몰 기준 및/또는 용적당 중량 기준으로, 아달리무맙의 LPS 유도성 TNFα 분비 억제를 위한 IC50 값보다 더 작다.
세포 증식의 억제
본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 통상적으로 혼합 림프구 반응에서 말초 혈액 단핵 세포의 세포 증식을 억제할 수 있다. 세포 증식의 억제는 실시예 6에 기술된 바와 같이 확인될 수 있다. 예컨대 본 발명의 scFv 또는 다이아바디의 항체 또는 기능성 단편 자극 지수(stimulation index)(실시예 6에 따라 측정됨)는, 바람직하게 5 미만, 더욱 바람직하게 4.5 미만이다. 특정 구현예들에서, 예컨대 본 발명의 IgG의 항체 자극 지수는 4 미만 또는 심지어 3 미만이다.
TNFα 및 TNF 수용체 간 상호작용의 억제
통상적으로 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 인간 TNFα 및 TNF 수용체 I(TNFRI) 간 상호작용을 억제할 수 있다. 인간 TNFα 및 TNFRI 간 상호작용의 억제는 이하 실시예 2의 2.1.3 섹션에 기술된 바와 같이 억제 ELISA에서 측정될 수 있다.
억제 ELISA에서 측정되는 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편의 인간 TNFα 및 TNFRI 간 상호작용을 억제하는 효능은, 인플릭시맙의 인간 TNFα 및 TNFRI 간 상호작용을 억제하는 효능에 비하여(상대적 효능) 바람직하게 적어도 2인데, 이 경우 상기 상대적 효능은 인플릭시맙의 IC50 값(ng/mL) 대 항체 또는 이의 기능성 단편의 IC50 값(ng/mL)의 비율이다.
통상적으로 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 인간 TNFα 및 TNF 수용체 II(TNFRII) 간 상호작용을 억제할 수 있다. 인간 TNFα 및 TNFRII 간 상호작용의 억제는 이하 실시예 2의 2.1.3 섹션에 기술된 바와 같이 억제 ELISA에서 측정될 수 있다.
억제 ELISA에서 측정되는 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편의 인간 TNFα 및 TNFRII 간 상호작용을 억제하는 효능은, 인플릭시맙의 인간 TNFα 및 TNFRII 간 상호작용을 억제하는 효능에 비하여(상대적 효능) 바람직하게 적어도 2, 더욱 바람직하게 적어도 3인데, 이 경우 상기 상대적 효능은 인플릭시맙의 IC50 값(ng/mL) 대 항체 또는 이의 기능성 단편의 IC50 값(ng/mL)의 비율이다.
화학양론 및 가교
본 발명의 항체 또는 기능성 단편은, 통상 인간 TNFα삼량체와 화학양론(항체: TNFα삼량체) 적어도 2로 결합할 수 있다. 화학양론(항체: TNFα삼량체)은, 바람직하게 2 이상 또는 적어도 2.5 또는 적어도 3이다. 하나의 구현예에서, 화학양론(항체: TNFα삼량체)은 약 3이다. 화학양론(항체: TNFα삼량체)은 이하 실시예 4에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 인간 TNFα와 복합체를 형성할 수 있는데, 여기서 이 복합체는 TNFα 분자 적어도 2개와 항체 또는 기능성 단편 분자 적어도 3개를 포함한다. 본 구현예에 따른 기능성 단편(예컨대 다이아바디)은 TNFα에 대한 별도의 결합 부위 적어도 2개를 포함한다. 복합체 형성은 이하 실시예 5에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 항체는 IgG로서, TNFα와 적어도 600 kDa의 복합체를 형성할 수 있다. 다른 구현예에서, 기능성 단편은 다이아바디로서, TNFα와 적어도 300 kDa의 복합체를 형성할 수 있다.
표적 선택성
임의의 구현예들에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 표적 선택성이 큰데, 즉 이는 TNFα와 TNFβ를 구별할 수 있다. 실시예 2의 2.1.4 섹션에 기술된 바와 같은 경쟁 ELISA에서 측정된 바에 따르면, 바람직하게 TNFβ의 IC50 값은 TNFα의 IC50 값보다 적어도 1000배 크다. 실시예 2의 2.1.4 섹션에 기술된 바와 같은 경쟁 ELISA에서 측정된 바에 따르면, TNFβ의 IC50 값은 TNFα의 IC50 값보다, 더욱 바람직하게 적어도 5000배, 가장 바람직하게 적어도 10,000배 더 크다.
발현 수율과 리폴딩(refolding) 수율
다른 구현예들에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편, 바람직하게 scFv 또는 다이아바디는 세균과 같은 미생물이나 기타 세포 내에서 고수율로 재조합 발현될 수 있다. 바람직하게 이.콜라이(E.coli) 내에서의 발현 수율은, 실시예 2에 기술된 바와 같이 측정되었을 때, 적어도 0.25 g/L이다. 이는 특히 기능성 단편, 예컨대 scFv에 적용된다.
실시예 2에 기술된 바와 같이 측정된 리폴딩 수율은 적어도 5 mg/L, 더욱 바람직하게 적어도 10 mg/L, 더욱 바람직하게 적어도 15 mg/L, 그리고 가장 바람직하게 적어도 20 mg/L이다. 이는 특히 기능성 단편, 예컨대 scFv에 적용된다.
안정성
통상적으로 본 발명의 항체 또는 기능성 단편, 바람직하게 scFv 또는 다이아바디는 안정성이 크다. 안정성은 상이한 방법에 의해 평가될 수 있다. 실시예 2의 2.2.4 섹션에 기술된 바와 같이 시파주사형광측정법(DSF)에 의해 측정되는, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편의 가변 도메인의 "용융 온도" Tm은, 바람직하게 적어도 60℃, 더욱 바람직하게 적어도 63℃, 가장 바람직하게 적어도 66℃이다. 본원에 사용된 바와 같은 "가변 도메인의 용융 온도"란, 서열 VL-링커A-VH [여기서 링커A의 아미노산 서열은 서열 번호 32에 보인 아미노산 서열로 이루어짐]로 이루어진 scFv의 용융 온도를 지칭한다. 예컨대 scFv와 상이한 형태인 항체, 예컨대 IgG의 가변 도메인의 용융 온도는, 상기 정의된 바와 같이 IgG의 대응 scFv의 용융 온도로서 정의된다.
4℃에서 4주동안 보관한 후 단량체 함량의 손실률(농도 10 g/L; 처음 단량체 함량 = 95% 초과)(실시예 2, 2.2.5 섹션에 기술된 바와 같이 분석적 크기별 배제 크로마토그래피에 의해 측정)은, 바람직하게 5% 미만, 더욱 바람직하게 3% 미만, 더욱 바람직하게 1% 미만, 가장 바람직하게 0.5% 미만이다. -20℃에서 4주동안 보관한 후 단량체 함량의 손실률(농도 10 g/L; 처음 단량체 함량 = 95% 초과)(실시예 2, 2.2.5 섹션에 기술된 바와 같이 분석적 크기별 배제 크로마토그래피에 의해 측정)은, 바람직하게 5% 미만, 더욱 바람직하게 3% 미만, 더욱 바람직하게 1% 미만, 가장 바람직하게 0.5% 미만이다. -65℃에서 4주 동안 보관한 후 단량체 함량의 손실률(농도 10 g/L; 처음 단량체 함량 = 95% 초과)(실시예 2, 2.2.5 섹션에 기술된 바와 같이 분석적 크기별 배제 크로마토그래피에 의해 측정)은, 바람직하게 5% 미만, 더욱 바람직하게 3% 미만, 더욱 바람직하게 1% 미만, 가장 바람직하게 0.5% 미만이다.
5회 연속 동결-해동 주기를 거친 후 단량체 손실률은 실시예 2에 기술된 바와 같이 측정될 때, 5% 미만, 더욱 바람직하게 1% 미만, 더욱 바람직하게 0.5% 미만, 가장 바람직하게 0.2% 미만, 예컨대 0.1% 또는 0.0%이다.
항체 및 기능성 단편
본 발명의 특정 구현예들은 본원에 기술된 항체의 기능성 단편에 관한 것이다. 기능성 단편으로서는 F(ab')2 단편, Fab 단편, scFv, 다이아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게 기능성 단편은 단일 사슬 항체(scFv) 또는 다이아바디이다. 더욱 바람직하게 scFv 또는 다이아바디의 비-CDR 서열은 인간 서열이다.
바람직하게 인간에서 면역원성 발현 잠재성을 최소화하기 위해, 선택된 수용 스캐폴드는 인간 공통 서열들 또는 인간 생식계열 서열들로부터 유래하는 구조 영역들로 이루어진다. 구체적으로 가변 경 도메인의 특정 구조 영역 I 내지 III은 서열 번호 33 내지 서열 번호 35에 의한 인간 Vκ1 공통 서열과, 서열 번호 36 내지 서열 번호 39의 서열들로부터 선택되는 λ 생식계열 기반 서열의 구조 영역 IV로 이루어져 있다. 인간 공통 잔기 또는 인간 생식계열 잔기가 아닌 잔기들은 면역 반응을 일으킬 수 있으므로, 각각의 가변 도메인(VH 또는 VL) 중 이러한 잔기들의 수는 가능한한 적어야 하는데, 바람직하게는 7개 이하, 더욱 바람직하게는 4개 이하, 가장 바람직하게는 0개이어야 한다.
바람직하게 항체는 모노클로날 항체이다. 본원에 사용된 바와 같은 "모노클로날 항체"란 용어는, 하이브리도마 기술을 통해 제조된 항체에 제한되지 않는다. "모노클로날 항체"란 용어는, 이항체가 제조되는 방법에 의하지 않고 단일 클론, 예컨대 임의의 진핵세포, 원핵세포 또는 파아지 클론으로부터 유래하는 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체는 당 분야에 공지된 다양한 기술, 예컨대 하이브리도마 사용, 재조합 및 파아지 전시 기술, 또는 이것들의 병행법을 사용하여 제조될 수 있다(Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" CSH Press 1988, Cold Spring Harbor N.Y.).
인간에 있어서 항TNFα 항체를 생체 내 사용하는 것과 관련한 구현예들을 비롯한 다른 구현예들에서, 키메라, 영장류화, 인간화 또는 인간 항체가 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체는 인간 항체이거나 인간화 항체이고, 더욱 바람직하게는 모노클로날 인간 항체이거나 모노클로날 인간화 항체이다.
본원에 사용된 바와 같은 "키메라"항체란 용어는, 인간 면역글로불린 이외의 면역글로불린, 예컨대 래트 또는 마우스 항체로부터 유래하는 가변 서열들과, 인간 면역글로불린 주형으로부터 통상 선택되는 인간 면역글로불린 불변 영역들을 가지는 항체를 지칭한다. 키메라 항체를 제조하기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예컨대 본원에 전체로서 참조로 인용되어 있는 문헌(Morrison, 1985, Science 229(4719): 1202-7; Oi et al, 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125: 191 -202; 미국 특허 제5,807,715호; 동 제4,816,567호; 및 동 제4,816,397호)을 참조한다.
인간 이외의 동물의 면역글로불린으로부터 유래하는 최소한의 서열들을 함유하는, 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(예컨대 항체의 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 기타 표적 결합 종속 서열)을 생성함으로써, 인간 이외의 동물의 항체(예컨대 마우스 항체)를 인간의 항체와 더욱 유사하게 만들기 위한, 상이한 재조합 방법들이 당 업자에 의해 이용될 수 있다. 생성된 재조합 항체는 일반적으로 적어도 하나, 통상 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 CDR 영역 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 이외의 동물의 면역글로불린의 CDR 영역에 대응하고, FR 영역 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열, 구체적으로 인간 면역글로불린 공통 서열의 FR이다. CDR 이식 항체는 요망되는 항원과 결합하는 것으로서, 인간 이외의 종에서 원천적으로 생성된 항체에서 유래하는 상보성 결정 영역(CDR)과, 인간 면역글로불린 분자 유래 구조 영역(FR) 하나 이상을 가지는 항체 분자이다(EP 239400; PCT 특허출원 공보 WO 91/09967; 미국 특허 제5,225,539호; 동 제5,530,101호 및 동 제5,585,089호). 종종 "인간화"라고 칭하여지는 과정에서, 인간 구조 영역 내 구조 영역 잔기(framework residue)들은 항원 결합을 변경, 바람직하게 개선하기 위해 CDR 공여 항체로부터 유래하는 대응 잔기들로 추가 치환될 것이다. 이러한 구조 영역 치환(framework substitution)은 당 분야에 널리 공지된 방법, 예컨대 항원 결합에 중요한 구조 영역 잔기들을 동정하기 위한 CDR 및 구조 영역 잔기들의 상호작용 모델링과, 특정 위치에 있는 흔치않은 구조 영역 잔기들을 동정하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다. 예컨대 본원에 전체로서 참조로 인용되어 있는 각각의 문헌(Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7 and Queen et al, 미국 특허 제5,530, 101호; 동 제5,585,089호; 동 제5,693,761호; 동 제5,693,762호; 및 동 제6,180,370호)을 참조한다. 항체는 당 분야에 공지된 추가의 기술 다수(예컨대 베니어링 또는 재표면처리(EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol, 28:489-498; Studnicka et al, 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91 :969-973))와, 사슬 셔플링(chain shuffling)(미국 특허 제5,565,332호)(이 문헌들은 모두 전체로서 본원에 참조로 인용됨)을 이용함으로써 더욱 인간의 것에 가깝게 만들어질 수 있다. CDR 이식 또는 인간화 항체는 또한, 통상 선택된 인간 면역글로불린 주형의 것인 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 최소한의 부분을 포함할 수도 있다.
몇몇 구현예들에서, 인간화 항체는 문헌(Queen et al, 미국 특허 제5,530, 101호; 동 제5,585,089호; 동 제5,693,761호; 동 제5,693,762호; 및 동 제6,180,370호(이들 문헌은 각각 전체로서 참조로 인용됨))에 기술된 바와 같이 제조된다.
몇몇 구현예들에서, 항TNFα 항체는 인간 항체이다. 완전한 "인간"항TNFα 항체는 인간 환자의 치료적 처치에 요망된 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "인간 항체"는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 가지는 항체를 포함하고, 인간 면역글로불린 라이브러리 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린이 유전자이식된 동물로서, 내부적으로 면역글로불린을 발현하지 않는 동물로부터 단리된 항체를 포함한다. 인간 항체는 당 분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대 인간 면역글로불린 서열로부터 유래하는 항체 라이브러리를 사용하는 전술된 파아지 전시 방법에 의해 제조될 수 있다. 미국 특허 제4,444,887호 및 동 제4,716,111호; 그리고 PCT 국제출원 공개공보 WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; 및 WO 91/10741(이들 문헌은 각각 전체로서 본원에 참조로 인용됨)를 참조한다. 인간 항체는 또한 내부 기능성 면역글로불린을 발현할 수 없되, 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 유전자이식 마우스를 사용하여 제조될 수도 있다. 예를 들어 PCT 국제출원 공개공보 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 미국 특허 제5,413,923호; 동 제5,625,126호; 동 제5,633,425호; 동 제5,569,825호; 동 제5,661,016호; 동 제5,545,806호; 동 제5,814,318호; 동 제5,885,793호; 동 제5,916,771호; 및 동 제5,939,598 호(이들 문헌은 각각 전체로서 본원에 참조로 인용됨)를 참조한다. 선택된 에피토프를 인지하는 완전한 인간 항체는 "안내 선택(guided selection)"이라 칭하여지는 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 이 접근법에서, 선택된 인간 이외의 동물의 모노클로날 항체, 예컨대 마우스 항체는 동일 에피토프를 인지하는 완전한 인간 항체의 선택을 안내하는 데에 사용된다(Jespers et al, 1988, Biotechnology 12:899-903).
몇몇 구현예들에서, 항TNFα 항체는 영장류화 항체이다. "영장류화 항체"란 용어는, 원숭이의 가변 영역들과 인간의 불변 영역들을 포함하는 항체를 지칭한다. 영장류화 항체를 제조하기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예컨대 본원에 전체로서 참조로 인용되어 있는 미국 특허 제5,658,570호; 동 제5,681,722호; 및 동 제5,693,780호를 참조한다.
몇몇 구현예들에서, 항TNFα 항체는 유도체화 항체이다. 유도체화 항체는, 예컨대(그러나 제한적이지 않은) 예컨대 당화, 아세틸화, 페그화, 인산화, 아미드화, 공지의 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백 분해 절단, 세포 리간드 또는 기타 단백질에의 결합 등(항체 접합에 관한 논의는 이하 참조)에 의해 변형된다. 다수의 화학 변형들 중 임의의 것은 공지의 기술, 예컨대 특이 화학 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사합성 등(이에 한정되는 것은 아님)에 의해 수행될 수 있다. 추가로 유도체는 하나 이상의 비 전통적 아미노산을 함유할 수 있다.
또 다른 양태들에 있어서, 항TNFα 항체는, 예컨대 US 2007/0280931에 기술된 바와 같이, 자체의 초가변 영역 중 하나 이상에 아미노산이 하나 이상 삽입되어 있다.
항체 접합체
몇몇 구현예들에서, 항TNFα 항체는, 예컨대 임의의 유형의 분자와 항체의 공유 결합(다만 이 공유 결합은 TNFα와의 결합을 방해하지 않음)에 의해 변형된 항체 접합체이다. 효과기 기를 항체에 접합하기 위한 기술은 당 분야에 널리 공지되어 있다(예컨대 문헌(Hellstrom et al., Controlled Drag Delivery, 2nd Ed., at pp. 623-53 (Robinson et al., eds., 1987)); Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119-58 and Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics 83:67-123)을 참조함).
하나의 예에서, 항체 또는 이의 단편은 선택적으로 다른 단백질의 아미노산 서열(또는 이의 일부, 바람직하게는 단백질 중 적어도 10개, 적어도 20개 또는 적어도 50개의 아미노산으로 이루어진 부분)에 대해 N-말단 또는 C-말단 쪽에서 공유 결합(예컨대 펩티드 결합)을 통해 융합된다. 바람직하게 항체 또는 이의 단편은 항체 불변 도메인의 N-말단에서 다른 단백질에 결합한다. 예컨대 WO 86/01533 및 EP 0392745에 기술된 바와 같이, 재조합 DNA 방법은 이러한 융합체를 제조하는 데에 사용될 수 있다. 다른 예에서, 효과기 분자는 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있다. 이러한 유형의 효과기 분자로서 적합한 효과기 분자의 예들은 중합체, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물, 예컨대 WO 2005/117984에 기술된 것들을 포함한다.
몇몇 구현예들에서, 항TNFα 항체는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 기와 결합할 수 있다. 예컨대 만일 항체가 항체 단편이면, PEG기는 임의의 이용 가능한 아미노산 측쇄나 말단 아미노산 작용기(항체 단편 내에 위치), 예컨대 임의의 유리 아미노, 이미노, 티올, 하이드록실 또는 카복실 기를 통헤 결합될 수 있다. 이러한 아미노산은 항체 단편 내에 자연 발생할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 단편 내에 조작되어 들어갈 수 있다. 예컨대 미국 특허 제5,219,996호를 참조한다. 2개 이상의 PEG 분자를 결합하는 데에 다수의 부위가 사용될 수 있다. 바람직하게 PEG기는 항체 단편 내에 위치하는 시스테인 잔기 적어도 하나의 티올기를 통해 공유 결합된다. 티올기가 결합점으로 사용되는 경우, 적당히 활성화된 효과기 기, 예컨대 선택적 티올 유도체, 예컨대 말레이미드 및 시스테인 유도체가 사용될 수 있다.
다른 예에 있어서, 항TNFα 항체 접합체는, 예컨대 EP0948544에 개시된 방법에 따라 PEG(폴리(에틸렌글리콜))가 공유 결합되어 있는, PEG화된(즉 PEG를 가지는) 변형 Fab'단편이다. 문헌(Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, New York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris and S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D. C, 1997); and Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam and A. Dent, eds., Grove Publishers, New York, 1998); 및 Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:531 - 545)도 또한 참조한다.
약학 조성물과 치료
질환의 치료는 임의의 임상 병기에 있거나 징후를 보이는 어떤 질환이 임의의 형태로 발생하였다고 이미 진단된 환자를 치료하는 것; 어떤 질환의 증상 또는 징후의 개시 또는 진화 또는 심각화 또는 악화를 지연시키는 것; 및/또는 어떤 질환을 예방하고/예방하거나 심각성을 감소시키는 것을 포함한다.
항TNFα 항체 또는 이의 기능성 단편이 투여되는"대상체" 또는 "환자"는 포유동물, 예컨대 영장류 이외의 포유동물(예컨대 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 또는 영장류(예컨대 원숭이 또는 인간)일 수 있다. 임의의 양태들에서, 인간은 소아 환자이다. 다른 양태들에서, 인간은 성인 환자이다.
항TNFα 항체와, 선택적으로는 하나 이상의 추가 치료제, 예컨대 이하 기술된 제2의 치료제를 포함하는 조성물이 본원에 기술되어 있다. 본 조성물은 통상 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 멸균 약학 조성물의 일부로서 공급된다. 이 조성물은 (조성물을 환자에게 투여할 때 요망되는 방법에 따라) 임의의 적합한 형태를 취할 수 있다.
항TNFα 항체와 기능성 단편은 다양한 경로, 예컨대 경구, 경피, 피하, 비내, 정맥 내, 근육 내, 척추강 내, 국소 또는 국부 경로에 의해 환자에 투여될 수 있다. 임의의 주어진 경우에 있어서 가장 적합한 투여 경로는, 특정 항체, 대상체, 그리고 질환의 성질과 심각성, 대상체의 신체 조건에 따라서 달라질 것이다. 통상적으로 항TNFα 항체 또는 이의 기능성 단편은 정맥 내 투여될 것이다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 경구 투여된다. 만일 투여가 경구 경로를 통하여 이루어지면, 기능성 단편은 바람직하게 단일 사슬 항체(scFv), 다이아바디 또는 IgG이다.
통상의 구현예들에서, 항TNFα 항체 또는 기능성 단편은 약학 조성물 중 정맥 내 투여를 허용하기에 충분한 농도, 즉 체중 1 kg당 0.5 mg 내지 체중 1 kg당 20 mg으로 존재한다. 몇몇 구현예들에서, 본원에 기술된 조성물과 방법에 사용하기 적합한 항체 또는 단편의 농도는 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 1 1 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 또는 상기 수치들 중 임의의 수치 사이의 범위에 속하는 농도, 예컨대 1 mg/kg 내지 10 mg/kg, 5 mg/kg 내지 15 mg/kg, 또는 10 mg/kg 내지 18 mg/kg을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
항TNFα 항체 또는 기능성 단편의 유효 용량은 단일 투여(예컨대 볼루스 투여), 복수 투여 또는 연속 투여당 약 0.001 mg 내지 약 750 mg의 범위, 또는 단일 투여(예컨대 볼루스 투여), 복수 투여 또는 연속 투여당 혈청 중 농도 0.01 ㎍/ml 내지 5000 ㎍/ml를 달성하는 범위, 또는 치료중인 병태, 투여 경로 및 대상체 나이, 체중 및 상태에 따라서 이 범위들 중 임의의 유효 범위 또는 그 안에 포함되는 수치만큼일 수 있다. 임의의 구현예들에서, 각각의 용량은 체중 1 킬로그램당 약 0.5 mg 내지 약 50 mg, 또는 체중 1 킬로그램당 약 3 mg 내지 약 30 mg의 범위일 수 있다. 항체는 수용액으로서 제제화될 수 있다.
약학 조성물은 편리하게 용량당 소정량의 항TNFα 항체 또는 기능성 단편을 함유하는 단위 투여형으로 제공될 수 있다. 이러한 단위는 0.5 mg 내지 5 g, 예컨대 1 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 750 mg, 1000 mg, 또는 이러한 수치들 중 임의의 것 2개로 사이의 임의의 범위, 예컨대 10 mg 내지 1000 mg, 20 mg 내지 50 mg, 또는 30 mg 내지 300 mg(이에 한정되는 것은 아님)만큼을 함유할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는, 예컨대 치료될 병태 또는 투여 경로에 따라서 다양한 형태를 취할 수 있다.
항TNFα 항체 또는 이의 기능성 단편의 유효 투여량, 투여의 총 횟수, 그리고 치료 기간의 길이를 결정하는 것은 당 업자의 능력 범위 안에 있으며, 표준적 용량 증량 연구(dose escalation study)를 통해 결정될 수 있다.
본원에 기술된 방법에 적합한 항TNFα 항체 및 기능성 단편의 치료 제제는, 원하는 정도의 순도를 가지는 항체와, 선택적으로는 당 분야에 통상적으로 사용되는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(본원에서는 이것들을 모두 "담체"라 칭함), 즉 완충제, 안정화제, 보존제, 등장제, 비이온성 세제, 항산화제 및 기타 여러가지 첨가제를 혼합함으로써, 동결건조된 제제 또는 수용액으로서 보관되도록 제조될 수 있다. 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980))을 참조한다. 이러한 첨가제는 적용된 투여량과 농도에서 피투여자에게 무독성이어야 한다.
완충제는 pH를 생리적 조건과 근사한 범위로 유지하는 것을 돕는다. 완충제는 약 2 mM 내지 약 50 mM의 범위의 농도로 존재할 수 있다. 적합한 완충제는 유기산 및 무기산 둘다와, 이것들의 염, 예컨대 시트르산염 완충제(예컨대 시트르산일나트륨-시트르산이나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산삼나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산일나트륨 혼합물 등), 숙신산염 완충제(예컨대 숙신산-숙신산일나트륨 혼합물, 숙신산-수산화나트륨 혼합물, 숙신산-숙신산이나트륨 혼합물 등), 주석산염 완충제(예컨대 주석산-주석산나트륨 혼합물, 주석산-주석산칼륨 혼합물, 주석산-수산화나트륨 혼합물 등), 푸마르산염 완충제(예컨대 푸마르산-푸마르산일나트륨 혼합물, 푸마르산-푸마르산이나트륨 혼합물, 푸마르산일나트륨-푸마르산이나트륨 혼합물 등), 글루콘산염 완충제(예컨대 글루콘산-글리콘산나트륨 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-글리콘산칼륨 혼합물 등), 옥살산염 완충제(예컨대 옥살산-옥살산나트륨 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-옥살산칼륨 혼합물 등), 젖산염 완충제(예컨대 젖산-젖산나트륨 혼합물, 젖산-수산화나트륨 혼합물, 젖산-젖산칼륨 혼합물 등), 그리고 아세트산염 완충제(예컨대 아세트산-아세트산나트륨 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등)를 포함한다. 또한 인산염 완충제, 히스티딘 완충제 및 트리메틸아민 염, 예컨대 트리스가 사용될 수 있다.
보존제는 미생물 성장을 지연시키기 위해 첨가될 수 있으며, 0.2 %(w/v) 내지 1 %(w/v)의 범위의 양으로 첨가될 수 있다. 적합한 보존제는 페놀, 벤질알코올, 메타크레졸, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 옥타데실디메틸베닐 암모늄 염화물, 벤잘코늄 할로겐화물(예컨대 염화물, 브롬화물 및 요오드화물), 헥사메토늄 염화물, 그리고 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 사이클로헥산올, 그리고 3-펜탄올을 포함한다. 종종 "안정화제"라고도 공지된 등장제는 액체 조성물의 등장성을 보장하기 위해 첨가될 수 있으며, 다가 당 알코올, 바람직하게 3가 또는 이 이상의 당 알코올, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 솔비톨 및 만니톨을 포함한다. 안정화제란, 증량제로부터 첨가제, 즉 치료제를 용해하거나 치료제가 용기 벽에 부착되는 것 또는 변성되는 것의 예방을 돕는 첨가제에 이르기까지의 기능을 포괄할 수 있는 넓은 카테고리의 부형제를 지칭한다. 통상의 안정화제는 (상기 나열된) 다가 당 알코올; 아미노산, 예컨대 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-루신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등, 유기 당 또는 당 알코올, 예컨대 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 솔비톨, 자일리톨, 리비톨, 미오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등, 예컨대 사이클리톨, 예컨대 이노시톨; 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 황함유 환원제, 예컨대 우레아, 글루타치온, 티옥산, 티오글리콜산나트륨, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 티오황산나트륨; 저분자량 폴리펩티드(예컨대 10개 이하의 잔기로 이루어진 펩티드); 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈 단당체, 예컨대 자일로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스; 이당체, 예컨대 락토스, 말토스, 수크로스; 및 삼당체, 예컨대 라피노스; 그리고 다당체, 예컨대 덱스트란일 수 있다. 안정화제는 활성 단백질 1 중량부당 0.1 내지 10,000 중량 범위로 존재할 수 있다.
비이온성 계면활성제 또는 세제("습윤제"로도 공지됨)는 치료제의 용해를 도울뿐만 아니라 치료제가 진탕 유도 응집(이는 또한 제제가 단백질 변성을 일으키지 않고 전단 표면 응력에 노출되는 것을 허용할 수 있음)이 일어나는 것을 막기 위해 첨가된다. 적합한 비이온성 계면활성제로서는 폴리솔베이트(20, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), Pluronic 폴리올, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노에테르(TWEEN®-20, TWEEN®-80 등)를 포함한다. 비이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml, 또는 약 0.07 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 범위로 존재할 수 있다.
추가의 다양한 부형제로서는 증량제(예컨대 전분), 킬레이트화제(예컨대 EDTA), 항산화제(예컨대 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E), 프로테아제 억제제 및 조용매를 포함한다.
본원의 제제는 또한 항TNFα 항체 또는 이의 기능성 단편 이외에 제2의 치료제를 함유할 수도 있다. 적합한 제2 치료제의 예들이 이하에 제공되었다.
투약 계획은 다수의 임상 요인들, 예컨대 질환의 유형, 질환의 심각성, 그리고 환자의 항TNFα 항체 또는 기능성 단편에 대한 감수성에 따라 1개월에 1회로부터 매일에 이르기까지 다양할 수 있다. 특정 구현예들에서, 항TNFα 또는 이의 기능성 단편은 매일, 매주 2회, 1주에 3회, 하루 걸러, 5일마다, 10일마다, 2주마다, 3주마다, 4주마다 또는 1개월에 1회, 또는 상기 수치들 중 임의의 것 2개 사이의 임의의 범위, 예컨대 4일마다 내지 매달, 10일마다 내지 2주마다, 또는 1주에 2회 내지 3회 등으로 투여된다.
투여될 항TNFα 항체 또는 기능성 단편의 투여량은 특정의 항체, 대상체, 그리고 질환의 성질과 심각성, 대상체의 신체 조건, (예컨대 제2의 치료제가 사용되는지 여부와 같은) 치료 계획, 그리고 선택된 투여 경로에 따라 달라질 것이고; 적당한 투여량은 당 업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
항TNFα 항체 또는 이의 기능성 단편의 최적량과 개별 투여형들의 최적 투여 간격은 치료중인 병태의 성질과 정도, 투여 형태, 투여 경로 및 투여 부위, 그리고 치료중인 특정 대상체의 나이와 상태에 의해 결정될 것이고, 전문의는 궁극적으로 적용될 적당한 투여량을 결정할 것임이 당 업자에 의해 인지될 것이다. 이러한 투여는 적당한한 자주 반복될 수 있다. 만일 부작용이 일어나면, 투여량 및/또는 투여 횟수는 보통의 임상 실무에 따라서 변경 또는 감소될 수 있다.
치료될 장애
본 발명은 대상체에 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 기능성 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체 내 인간 TNFα 관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. "TNFα 관련 장애" 또는 "TNFα 관련 질환"이란 용어는, TNFα의 참여를 필요로 하는 임의의 장애, 증상 또는 병상이 개시, 진행 또는 지속되는 것을 지칭한다. 예시적 TNFα 관련 장애로서는, 일반적 염증의 만성 및/또는 자가면역 상태, 일반적 면역 매개성 염증 장애, 염증성 CNS 질환, 눈, 관절, 피부, 점막, 중추신경계, 위장관, 비뇨기관 또는 폐에 발명한 염증성 질환, 일반적 포도막염 상태, 망막염, HLA-B27+ 포도막염, 베쳇병, 안구건조증후군, 녹내장, 쇼그렌 증후군, 진성 당뇨병(당뇨병성 신경병증 포함), 인슐린 저항성, 일반적 관절염 상태, 류머티즘성 관절염, 골관절염, 반응성 관절염 및 라이터 증후군, 청소년 관절염, 강직성 척추염, 다발성 경화증, 길랑-바레 증후군, 중증 근무력증, 근위축성측삭경화증, 유육종증, 사구체신염, 만성 신장질환, 방광염, 건선(건선성 관절염 포함), 화농성한선염, 지방층염, 괴저성농피증, SAPHO 증후군(윤활막염, 여드름, 농포증, 골비대증 및 골염), 여드름, 스윗 증후군, 천포창, 크론병(장외 징후 포함), 궤양성 대장염, 기관지 천식, 과민성 폐렴, 일반 알레르기, 알레르기성 비염, 알레르기성 축농증, 만성 폐색성 폐질환(COPD), 폐 섬유증, 베게너 육아종증, 카와사키 증후군, 거대세포성 동맥염, 척-스트라우스 혈관염, 결절성 다발동맥염, 화상, 이식편 대 숙주 징환, 숙주 대 이식편 반응, 장기 또는 골수 이식후 거부 현상, 일반적 혈관염의 전신 및 국소 상태, 전신 및 피부 홍반성낭창, 다발성근염 및 피부근염, 경피증, 임신중독증, 급성 및 만성 췌장염, 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 수술후 염증, 예컨대 눈 수술(예컨대 백내장(수정체 치환) 수술 또는 녹내장 수술) 후 염증, 관절 수술(관절경 수술 포함), 관절 관련 구조(예컨대 인대) 수술, 구강 및/또는 치아 수술, 최소 침습성 심혈관 수술(예컨대 PTCA, 죽종절제술, 스텐트치환), 복강경 및/또는 내시경 복부 수술 및 산부인과 수술, 내시경 비뇨기과 수술(예컨대 전립선 수술, 요관경검사, 방광경검사, 간질성 방광염), 또는 일반적 수술기주위 염증(예방), 물집 피부염, 호중구 피부염, 중독성표피박리증, 농포성피부염, 뇌 말라리아, 용혈성요독증후군, 이종이식편거부, 중이염, 독사교상, 결절홍반, 골수이형성증후군, 원발 경화성담괌염, 혈청음성척추관절염, 자가면역 용혈성 빈혈, 구강안면 육아종증, 증식성화농성구구내염, 아프타구내염, 지도모양 혀, 이동성 구내염(migratory stoimatitis), 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 벨 마비, 크로이펠트-야콥병 및 일반적 신경퇴행성 병태
암 관련 골용해, 암 관련 염증, 암 관련 통증, 암 관련 악액질, 골전이, 급성 및 만성 통증 형태(이것들이 TNFα의 중심 효과 또는 말초 효과에 의하여 유발된 것인지와 이것들이 염증으로 분류되는지 여부와 상관없음), 통각수용통증형태 또는 신경병증성 통증형태, 좌골신경통, 요통, 손목터널증후군, 복합부위통증증후군(CRPS), 통풍, 대상포진후신경통, 섬유근육통, 국부통증상태, 전이성 종양으로 인한 만성 통증 증후군, 월경곤란증
을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
치료될 특정 장애들로서는 일반적 관절염 상태, 류머티즘성 관절염, 골관절염, 반응성 관절염 청소년 관절염; 건선, 예컨대 건선성 관절염; 염증성 장 질환, 예컨대 크론병, 궤양성 대장염, 예컨대 직장염, S자 결정염, 좌측 대장염, 확장성 대장염 및 범대장염, 불확정성 대장염, 미세 대장염, 예컨대 콜라겐성 및 림프구성 대장염, 결합조직질환에 있어서의 대장염, 우회성 대장염(diversion colitis), 게실병의 대장염, 호산구성 대장염 및 낭염을 포함한다.
병행 요법 및 기타 양태들
바람직하게 항TNFα 항체 또는 이의 기능성 단편으로 치료중인 환자는 또한 종래의 다른 약물로도 치료된다. 예컨대 염증성 장 질환이 발병한 환자, 특히 중간 정도에서 중증의 질환이 발병한 환자라면 또한, 통상 메살라진 또는 이의 유도체나 전구약물, 코르티코스테로이드, 예컨대 부데소니드 또는 프레드니솔론(경구 또는 정맥 내 투여), 면역억제제, 예컨대 아자티오프린/6-머캅토퓨린(6-MP) 또는 메토트렉세이트, 사이클로스포린 또는 타크롤리무스로도 치료된다. 환자에게 공동 투여될 수 있는 기타 약물로서는 생체약물, 예컨대 인플릭시맙, 아달리무맙, 에타너셉트, 세르톨리주맙 페골 등을 포함한다. 안정적이고 더욱 오랫동안 관해를 유지하기 위하여 환자에게 공동 투여될 수 있는 추가의 약물로서는 면역억제제(예컨대 아자티오프린/6-MP 또는 메토트렉세이트 또는 경구 사이클로스포린)를 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태는, 상기 정의된 바와 같은 항TNFα 항체 또는 기능성 단편의 염증을 완화하기 위한 용도이다.
본 발명의 또 다른 양태는, 염증성 병태를 앓고 있는 환자에서 염증을 완화함에 사용되기 위한 상기 정의된 바와 같은 항TNFα 항체 또는 기능성 단편이다.
본 발명의 추가의 양태는, 염증성 병태의 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 정의된 바와 같은 항TNFα 항체 또는 기능성 단편 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 병태를 치료하는 방법이다. 염증성 병태는, 바람직하게 전술된 병태들 중 하나이다.
본 발명의 추가의 양태는, 염증성 병태의 예방을 필요로 하는 환자에게 상기 정의된 바와 같은 항TNFα 항체 또는 기능성 단편 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 병태를 예방하는 방법이다. 염증성 병태는, 바람직하게 전술된 병태들 중 하나이다.
Figure pct00003
Figure pct00004
실시예
실시예 1: 인간 TNFα에 대하여 유도된 토끼 항체의 생성
1. 결과
1.1 면역화
정제 재조합 인간 TNFα(Peprotech, Cat. No. 300-01A)로 토끼를 면역화하였다. 항원에 대한 폴리클로날 혈청 항체의 검출 가능한 결합을 여전히 보이는 각 토끼의 혈청에 대한 최고 희석율(역가)을 측정함으로써, 면역화 과정 중 항원에 대한 체액성 면역 반응의 세기를 정질 평가하였다. 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA, 2.2.1 참조)을 이용하여, 부동화된 재조합 인간 TNFα에 대한 혈청 항체의 역가를 평가하였다. ELISA에서 여전히 (백그라운드 대조군으로서 사용되었던 비변형(naive)의 무관한 동물로부터 유래하는 혈청으로 얻어지는 신호보다 적어도 3배 더 센) 양의 신호를 나타내는 혈청을 10 x 106-배 희석하였을 때 3마리 토끼 모두 매우 큰 역가를 보였다. 더욱이 상이한 토끼 혈청이 TNFα의 생물 활성을 억제하는 능력을 마우스 L929 세포 기반 검정을 이용하여 평가하였다(2.2.3 참조). 3가지 혈청은 모두 마우스 L929 섬유아세포의 TNFα 유도성 세포자살을 억제하였다. 3번 토끼가 가장 큰 중화 활성을 보였다(혈청을 1:155,000로 희석시 50% 억제(IC50)를 달성함). 3번 토끼에 비하여 2번 토끼와 1번 토끼는 대략 3배 내지 20배 더 작은 활성을 보였다(혈청을 1:55,500 및 1:7,210으로 희석시 각각 50% 억제에 도달함)
3마리 동물 모두의 비장으로부터 단리한 림프구를 후속되는 히트 동정(hit identification) 절차를 위해 선택하였다. L929 검정에서 TNFα의 생물 활성을 억제하는 효능을 바탕으로 동물들에 우선순위를 매겼다. 즉 배양된 히트의 수가 가장 많은 것은 3번 토끼로부터 기원한 것이었고, 히트의 수가 가장 작은 것은 1번 토끼로부터 유래한 것이었다.
1.2 히트 동정
1.2.1 히트 분류(hit sorting)
히트 동정 절차에 들어가기 앞서서, 고 친화성 TNFα 결합 B 세포들을 특이적으로 검출하고 이의 분리를 허용하는 유세포분석 기반 분류 절차를 진행하였다(2.1 참조).
3마리 토끼 모두로부터 유래하는 총 33 x 106개의 림프구(단리된 총 림프구의 1.5%에 해당)를, 2회의 독립된 분류 캠페인을 통해 특성규명하였다. 분석된 세포 33 x 106개로부터 TNFα 특히 항체(IgG)를 발현하는 B 세포 총 3452개를 단리하였다. L929 검정에서 TNFα의 강한 억제를 보였던 혈청을 가진 토끼들로부터 더 많은 세포들이 단리되었던 것으로 보아, 클로닝된 림프구의 수는 3마리 토끼간에 상이하였다. 단리된 B 세포들 중 792개 클론은 1번 토끼로부터 유래하였고, 1,144개 클론은 2번 토끼로부터 유래하였으며, 1408개 클론은 3번 토끼로부터 유래하였다. 108개 클론은 바이알로부터 소량의 림프구를 최적으로 회수하는 것이 허용된 토끼 전부(3마리)로부터 얻어진 잔여 림프구의 혼합물로부터 얻어졌기 때문에, 이 클론들 108개에 대해서는 각각의 토끼 기원이 밝혀지지 않았다.
1.2.2 히트 스크리닝
고 처리량 배양의 규모는 개별 토끼 항체의 정제를 감안하지 않으므로, 스크리닝 단계 동안 얻어진 결과들은 항체 분비 세포(ASC)의 배양 상청액으로부터 유래하는 비정제 항체로 수행된 검정을 기반으로 한 것이었다. 이러한 상청액은 다수의 항체를 대상으로 서로에 대해 순위를 매기는 데에 사용되었지만, 결합 친화성을 제외하고 (에컨대 TNFα의 생물 활성 억제에 대하여) 절대값을 제공하지는 못하였다. 고 처리량 ELISA에서 ASC 상청액을 대상으로 재조합 인간 TNFα와의 결합에 대해 스크리닝하였다. TNFα 결합 상청액을 대상으로, ELISA를 통하여 사이노몰거스 원숭이 TNFα와의 결합(결합 역학)에 대해, 그리고 L929 검정에서 인간 TNFα의 생물 활성을 중화하는 잠재성에 대해 추가로 특성규명하였다. 결합 역학을 제외하고, 고 처리량 스크리닝의 보고 값들은 (용량-반응이 아닌) 단일 점 측정을 기반으로 "예" 또는 "아니오"의 대답으로서 해석되어야 한다. 항체 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 증폭 및 서열결정을 위해 선택한 클론 102개 전부에 대하여 사이노몰거스 원숭이 및 마우스 TNFα에 대한 친화성을 분석하였다.
1.2.2.1 인간 TNFα와의 결합
본 1차 스크리닝의 목표는, 인간 TNFα에 특이적인 항체를 생산하는 ASC 클론을 동정하는 것이다. 이를 위하여, 인간 TNFα에 대한 항체의 존재 여부에 대해 3452개 ASC 클론의 세포 배양 상청액을 ELISA로 분석하였다(2.2.1 참조). 사용된 ELISA 방법은 재조합 인간 TNFα에 결합한 IgG 하위 유형 항체의 "양"을 평가하는 것이지만, 항체의 친화성이나 농도에 대한 정보는 제공하지 못한다. 이 검정에서 894개 ASC 클론으로부터 유래한 상청액은 명확히 백그라운드를 넘었던 신호를 발생시켰다. 스크리닝에 있어서 히트율(hit rate)은 1번 토끼와 2번 토끼의 경우 유사하였는데, 1번 토끼로부터는 792개 중 153개의 히트(19.3%)가 동정되었고, 2번 토끼로부터는 1,144개 중 225개의 히트(19.7%)가 동정되었다. 3번 토끼는 이보다 유의미하게 더 높은 히트율(34.4%)을 보였는데, 이는 1408개 중 484개 히트의 동정을 달성하였다. 본 1차 스크리닝에서 동정된 894개의 히트는 모두 SPR(2차 스크리닝)에 의한 결합 역학 측정의 대상이 되었다.
1.2.2.2 TNFα 결합 역학
본 2차 스크리닝의 목표는 표면 플라스몬 공명(SPR, 2.2.2 참조)에 의해 1차 스크리닝에서 얻어진 각각의 히트에 대한 표적 결합 품질의 정량적 정보를 얻는 것이다. 1차 스크리닝 동안 사용된 ELISA와는 대조적으로, 이 방법은 시간의 함수로서 표적 결합 역학을 평가하였다. 이 방법은, 항체와 표적의 결합에 대한 속도 상수(ka)와 항체의 표적으로부터의 해리에 대한 속도 상수(kd)의 측정을 허용한다. 비율, 즉 kd/ka는 항체의 표적에 대한 친화성을 반영하는 평형 해리 상수(KD)를 제공한다. 1차 스크리닝에서 동정된 894개 히트의 인간 TNFα에 대한 결합 친화성을 839개의 모노클로날 토끼 항체에 대해 측정할 수 있었다. 나머지 55개의 항체에 대한 친화성은 측정될 수 없었는데, 그 이유는 ASC 상청액 중 항체의 농도가 각각의 환경에 있는 SPR 기구의 검출 한계에 못미쳤기 때문이었다. 측정될 수 있었던 항TNFα 항체 839개는 1.36 x 10-13 M 이하 내지 1.14 x 10-8 M의 범위의 해리 상수(KD)를 보였다. 분석된 항체 전부 중 63%의 KD는 0.5 nM 이하였다.
2번 토끼와 3번 토끼로부터 동정된 히트를 스크리닝하기 위한 KD 중앙값은 2.21 x 10-10 M 및 2.09 x 10-10 M로 유사하였던 반면에, 1번 토끼는 4.65 x 10-10 M로 상기 KD 중앙값들보다 약 2배 더 큰 KD 중앙값을 보였다. 오로지 중화 스크리닝 히트만을 고려하였을 때, 친화성 분포는 3마리 동물 모두에서 유사하였는데, 다만 KD 중앙값은 더 낮았다(KD 중앙값은 1.4 x 10-10 M 및 1.27 x 10-10 M 사이였음). 1번, 2번 및 3번 토끼에 대한 스크리닝 히트의 5%에 대해서는 친화성이 각각 0.041 nM, 0.029 nM 및 0.026 nM 이하인 것으로 측정되었다. 상청액의 2%에 있어서 친화성은 훨씬 낮은 피코몰 범위였다(6.2 pM, 7.9 pM 및 11 pM 이하). 2차 스크리닝으로부터 얻어진 고 친화성 항체의 월등한 수율은, 인간화 및 재포맷화(reformatting)에 가장 적당한 항체 선택에 대해 폭 넓은 기반을 제공하였다.
1.2.2.3 효능
효능 평가를 위해 세포 기반 검정(L929 검정)을 진행하였다(2.2.3 참조). 선택된 항체 894개 중 506개(56.6%)가 L929 검정에서 TNFα유도성 세포자살을 50% 초과하여 억제하였다. 역가 분석 중에 얻어진 결과들과 비슷하게, 중화 히트의 최고 %가 3번 토끼에서 달성되었고(히트율 62.8%), 그 다음에는 2번 토끼에서 달성되었으며(히트율 56.4%), 1번 토끼에서 최저 히트율(39.9%)이 달성되었다. 이와 같은 중화 항체의 친화성은 1.36 x 10-13 내지 1.19 x 10-9 M이었다.
1.2.2.4 종 교차 반응성(사이노몰거스 원숭이)
1차 스크리닝에서 동정된 894개 히트 모두를 사이노몰거스 원숭이 TNFα에 대한 종 교차 반응성에 대해 ELISA로 분석하였다(2.2.1 참조). 본 추가 스크리닝의 목적은, 사이노몰거스 원숭이 TNFα와 교차 반응하는 것으로 공지된 ASC 클론의 선택을 허용하는 것이었다. 사용된 ELISA 방법은 재조합 사이노몰거스 원숭이 TNFα에 결합한 IgG 하위 유형 항체의 "양"을 평가하는 것이지만, 항체의 친화성이나 농도에 대한 정보는 제공하지 못한다. 생산된 ASC 클론 414개(46%) 유래 상청액은 분명한 신호를 발생시켰다(광학 밀도(OD)=1). 사이노몰거스 원숭이 TNFα에 대해 교차 반응성인 히트의 %는 1번 토끼와 3번 토끼가 유사하였다(1번 토끼로부터는 153개 중 81개 히트(52.9%)가 동정되었고, 3번 토끼로부터는 484개 중 236개 히트(48.8%)가 동정되었음).
37.8%인 경우 2번 토끼는 약간 낮은 %의 교차 반응성 히트를 보였는데, 이는 225개 중 82개 히트의 동정을 달성하였다.
1.2.2.5 RT-PCR용 클론의 선택
히트 동정에 대한 전제조건으로서 토끼 항체의 유전자 서열 분석과 후속 인간화, 토끼 항체 가변 도메인을 암호화하는 유전 정보가 검색될 필요가 있다. 각각의 전령 RNA의 상보성 DNA(cDNA)로의 역전사(RT) 후, 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 이중 가닥 DNA 증폭에 의해 이 작업을 수행하였다. RT-PCR 대상 ASC 클론의 선택은 주로 친화성 및 중화 활성을 바탕으로 하였다. 추가 기준으로서 사이노몰거스 원숭이 TNFα에 대한 교차반응성을 고려하였다. RT-PCR에 의해 유전자 클로닝용 ASC 클론을 총 102개 선택하였다. 우선, (친화성의 측면에서) 최고 순위를 차지하였고(KD 80 pM 이하), L929 검정에서 TNFα의 생물 활성을 50% 초과하여 억제하였으며, 사이노몰거스 원숭이 TNFα에 유의미한 결합성을 보였던 ASC 93개를 선택하였다. 또한 TNFα 활성을 50% 초과하여 중화하였으되, 그럼에도 불구하고 사이노몰거스 원숭이 TNFα와는 결합하지 않았던, 최고 순위(KD 20 pM 이하) ASC 클론 9개 모두도 또한 선택하였다. 총 12개, 13개 및 66개의 ASC 클론을 1번 토끼, 2번 토끼 및 3번 토끼 각각으로부터 성공적으로 증폭 및 서열결정하였다.
1.2.2.6 원하는 특성들을 가지는 관련 클론의 동정
단리된 ASC 클론 패널의 유전적 다양성을 특성규명하기 위하여, 상보성 결정 영역(CDR)의 서열을 추출하여, 이를 대상으로 다수회의 서열 정렬을 실시하였고, 이로써 계통수 내 서열 클러스터링(sequence clustering)을 달성할 수 있었다.
하나의 밴드를 대상으로 한 이와 같은 분석은 인간화와 재포맷화 실험을 지향하여 수행될, 다양한 클론 서열 세트의 선택을 허용하는 한편, 이는 또한 토끼 내 공통된 부모 B 세포 클론을 공유하는 것으로 보였던 클론 서열의 상동성 클러스터를 동정하기도 하였다. 이러한 서열 클로스터의 전형적 특징은 CDR의 높은 서열 상동성과 약력학적 특성의 일관된 패턴이다. 4개의 클론 클러스터에 대한 이러한 특징 둘다를 표 2와 표 3에 요약하여 두었다. 이 서열 클러스터의 기능 보존에도 불구, 표 3의 공통 서열은 CDR의 임의의 가변성이 관용되는 관계로, 원하는 약력학적 프로필을 여전히 보임을 보여주고 있다.
Figure pct00005
Figure pct00006
1.2.2.7 사이노몰거스 원숭이 및 마우스 TNFα에 대한 교차 반응성(SPR에 의한 분석)
TNFα를 강력하게 중화하는 고 친화성 히트 수가 많음으로 말미암아, 히트 동정을 위한 ASC 클론의 선택을 가속화하기 위해 RT-PCR의 대상이 되었던 모노클로날 토끼 항체 전부에 대해 종 교차 반응성을 평가하였다. 사이노몰거스 원숭이 TNFα에 대한 친화성을 전술된 바와 유사하게 SPR 측정법으로 측정하였다(2.2.2 참조). 사이노몰거스 원숭이 TNFα에 대해 시험된 항체 93개의 친화성은 9.6 x 10-12 M 내지 2.1 x 10-9 M의 범위였다. 93개의 교차 반응성 항체 중 38개는 유사한 친화성으로(KD가 2배 미만으로 차이나도록) 인간 TNFα 및 사이노몰거스 TNFα와 결합하였다. 더욱이 인간과 사이노몰거스 간 친화성 차이는, 93개의 교차 반응성 항체 중 79개에 대해서는 20배 미만이었고, 이것들 중 62개에 대해서는 10배 미만이었는데, 이는 이 항체들을 사이노몰거스 원숭이 내에서 행하여지는 전임상 생성에 허용 가능한 것으로 만들어준다.
2. 방법
2.1 분류 검정
문헌(Lalor et al, Eur J lmmunol.1992;22.3001-2011)에 개략적으로 제시된 바와 같이, 토끼 림프 조직으로부터 항원 특이적 B 세포를 단리하기 위한 유세포분석 기반 분류 방법을 수행하였다
2.2 스크리닝 검정
2.2.1 TNFα 결합 ELISA(인간 및 사이노몰거스 원숭이 TNFα)
재조합 인간 TNFα(Peprotech, Cat. No. 300-01)를 96웰 미세역가 ELISA 평판상에 코팅하였다. ASC 배양 상청액 중 토끼 항체와, 부동화 TNFα의 결합을 2차 HRP 표지화 항토끼 IgG(Jacksonlmmuno Research, Cat. No. 111-035-046)로 검출하였다. TMB 기질(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, KPL, Cat. No. 53-00-00)을 첨가하였으며, H2S04를 첨가하여 발색 반응을 중지시켰다. 450 nm의 파장에서 미세역가 평판 판독기(Infinity reader M200 Pro, Tecan)를 사용하여 평판을 판독하였다.
상업적으로 이용 가능한 양성 대조군 항TNFα 토끼 폴리클로날 항체(AbD Serotec, Cat. No. 9295-0174)로 스크리닝 캠페인 동안의 검정 성능을 모니터링하였다. 이를 위하여, 각각의 스크리닝 평판상에서 양성 대조군 항체를 100 ng/ml 및 250 ng/ml로 2회 시험하였다. 각각의 평판에 대해 양성 대조군 반응의 확고성 및 정확성을 모니터링하였다. 마지막 검정 조건에서 신호 대 백그라운드 비율은, 양성 대조군(250 ng/ml)의 경우 30 내지 40이었으며, 양성 대조군의 변동계수(CV)는 10% 이하였다. 250 ng/ml의 양성 대조군 광학 밀도에 비하였을 때 광학 밀도가 100% 이상인 신호는 1차 스크리닝 히트인 것으로 간주하였다.
혈청 역가 측정을 위해, 전술된 바와 동일한 ELISA 환경을 이용하였다. 면역 혈청 결합 신호가 미처리의 무관한 동물의 혈청 결합 신호에 비하여 적어도 3배 더 컸을 때, 혈청 희석액은 양성인 것으로 간주하였다.
전술한 바와 유사한 ELISA를 이용하여 사이노몰거스 원숭이에 대한 종 교차 반응성을 측정하였다. 재조합 사이노몰거스 원숭이 TNFα(Sino Biological, Cat. No. 90018-CNAE)를 96웰 미세역가 ELISA 평판상에 코팅하였다. ASC 배양 상청액 중 토끼 항체와, 부동화 사이노몰거스 원숭이 TNFα의 결합을, 상기 지정한 바와 같이 HRP 표지화 2차 항체에 의해 검출하였다. 2번 토끼로부터 유래한 면역 혈청을 양성 대조군으로 사용하였다(희석율 1:80,000 및 1:320,000). 양성 대조군 반응의 확고성 및 정확성을 각각의 평판에 대해 모니터링하였다. 마지막 검정 조건에서 신호 대 백그라운드 비율은, 양성 대조군(희석율 1:80,000)의 경우 20 내지 30이었으며, 양성 대조군의 CV는 10% 이하였다.
2.2.2 SPR에 의해 분석한 TNFα(인간, 사이노몰거스 원숭이)에의 결합 역학
MASS-1 SPR 기기(Sierra Sensors)를 이용하는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 항체의 인간 TNFα 지향 결합 친화성을 측정하였다. 표준 시료 용액과, 기준 항체-항원 상호작용, 예컨대 인플릭시맙-TNFα 상호작용의 분석에 의해 기기 성능 품질 평가를 실시하였다.
친화성 스크리닝을 위하여, 토끼 IgG의 Fc 영역에 특이적인 항체(Bethyl Laboratories, Cat. No. A120-111A)를, 표준 아민 결합 방법을 이용하여 센서 칩(SPR-2 Affinity Sensor, High Capacity Amine, Sierra Sensors) 상에 부동화하였다. 부동화 항토끼 IgG 항체에 의해 ASC 상청액 중 토끼 모노클로날 항체를 포착하였다. 모노클로날 항체를 포착한 후, 인간 TNFα(Peprotech, Cat. No. 300-01)를 유세포에 주입하여(3분, 농도 90 nM), 센서 칩상에 포착된 IgG로부터 단백질이 5분 동안 해리될 수 있도록 허용하였다. 각각의 주입 주기가 끝난 후, 10 mM 글리신-HCl을 2회 주입하여 표면을 재생시켰다. 겉보기 해리 속도 상수(kd) 및 결합 속도 상수(ka)와, 1대1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델을 이용하는 MASS-1 분석 소프트웨어(Analyzer, Sierra Sensors)로 겉보기 해리 평형 상수(KD)를 산정하였고, 곡선 피팅의 품질에 대한 척도인 상대적 Chi2(피분석물의 외삽된 최고 결합 수준에 대해 정규화한 Chi2)를 기반으로 피팅 품질을 모니터링하였다. 히트 대부분에 있어서, 상대적 Chi2 값은 15% 이하였다. 만일 리간드 결합에 대한 반응 단위(RU)가 항체 포착에 대한 RU의 적어도 2%라면 결과들은 유효한 것으로 간주하였다. 리간드 결합에 대한 RU가 항체 포착에 대한 RU의 2% 미만인 시료들은, 포착된 항체에 TNFα가 특이적으로 결합하지 않음을 보이는 것으로 간주하였다.
사이노몰거스 원숭이 TNFα(Sino Biological, Cat. No. 90018-CNAE)에 대한 종 교차 반응성을, 동일한 검정 환경과 TNFα 농도를 이용하고, 동일한 품질 척도를 적용하여 측정하였다. 상대적 Chi2는, 분석된 ASC 상청액 대부분에 대해 15% 이하였다.
2.2.3 L929 섬유아세포 내 TNFα유도성 세포자살
마우스 L929 섬유아세포(ATCC/LGC Standards, Cat. No. CCL-1)를 사용하여 ASC 배양 상청액 유래 토끼 IgG가 재조합 인간 TNFα의 생물 활성을 중화하는 능력을 평가하였다. 1 ㎍/ml 악티노마이신 D를 첨가하여 L929 세포를 TNFα 유도성 세포자살에 대해 감작시켰다. 50% ASC 배양 상청액 및 100 pM(5.2 ng/ml) 인간 TNFα(Peprotech, Cat. No. 300-01) 존재 하에 세포를 96웰 편평 바닥 미세역가 평판에서 24시간 동안 배양하였다. 정제된 항체에 비하여 더 높은 농도의 TNFα가 히트 스크리닝을 위해 ASC 상청액 존재 하에 사용되어야 했다. WST-8(2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디설포페닐)-2H-테트라졸륨, 일나트륨 염) 세포 증식 시약(Sigma Aldrich, Cat. No. 96992)을 사용하는 비색 검정에 의하여 세포 생존율을 측정하였다. WST-8은 세포내 디하이드로게나아제에 의해 오렌지 포르마잔 생성물로 환원된다. 포르마잔 생성물의 양은 생 세포의 수와 직접적으로 비례한다. Softmax 데이터 분석 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하는 4-매개변수 로지스틱 곡선 피팅을 이용하여 데이터를 분석하였으며, 농도 36.2 ng/ml에서 TNFα 유도성 세포자살을 50%까지 중화하는 데에 필요한 인플릭시맙의 농도(IC50)를 산정하였다. 즉 본 검정에 대한 검출의 추산 하한치는 30 ng/ml 내지 40 ng/ml였다. TNFα를 차단할 잠재성은 모노클로날 항체의 농도에 의존적일 뿐만 아니라, 표적에 대한 항체의 친화성에도 의존적이므로, 이 값은 단지 검출 한계에 대한 대략적 추산치에 불과하였다. 그러나, 대부분의 ASC 상청액 중 IgG 농도는 농도 40 ng/ml보다 컸으므로, 본 검정의 감수성은 ASC 상청액을 스크리닝하는 데에 충분하였다. TNFα 유도성 세포자살의 50% 중화를 달성한 상청액을 양성인 것으로 간주하였다.
스크리닝 캠페인 중 확고한 검정 성능을 보장하기 위해, 양성 대조군 항체인 인플릭시맙을 각각의 스크리닝 평판 상에서 115 ng/ml(0.8 nM) 및 58 ng/ml(0.4 nM)로 2회씩 시험하였다. 양성 대조군에 대한 반응의 억제%와 정확도를 각 스크리닝 평판에 대하여 모니터링하였다. 각각의 평판에 대한 허용 기준을 하기와 같이 설정하였다: 농도 115 ng/ml일 때 양성 대조군 항체에 의한 억제율; 적어도 60% 및 변동 계수(CV); 20% 이하.
실시예 2: scFv의 인간화 및 제조
1. 결과
1.1 히트 동정 및 인간화에 대한 히트 선택
히트 스크리닝 중 부모 토끼 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 독특한 세트 73개를 검색한 다음, 서열 정렬에 의해 분석하였다. 개별 토끼 IgG 클론의 스크리닝 검정 결과와 서열 상동성을 바탕으로 하여, 히트 동정용 후보 30개를 선택하였다. 모노클로날 항체 29개를 제조하여, 친화성과 효능의 관점에서 최고의 성능을 보이는 클론을 인간화와 선두 후보(lead candidate) 제조용으로 선택하였다. 클론 선택에 대한 기준은, i) L929 검정에서 인간 TNFα의 중화, ii) 인간 TNFα에 대한 큰 친화성, iii) 사이노몰거스 및 레서스 원숭이 TNFα에 대하여 큰 교차 반응성, 그리고 iv) 서열 다양성이었다. 인간화를 위해, 클론 하나(16-19-B11), 즉 L929 검정에서 인간 TNFα를 중화하는 효능의 관점에서 최고 순위가 매겨지는 IgG들 중 하나를 선택하였다. 친화성에 있어서 임의의 상실은 인간화 및 scFv 형태로의 재포맷화의 결과로 예상될 필요가 있으므로, 결합 세기와 관련하여 가능한한 최대의 친화성이 요망되었다.
IgG 클론(No. 16-19-B11)에 대한 데이터를 이하 표 4에 요약하여 두었다.
1.2 인간화된 scFv 단편의 제조 및 선택
WO 2014/206561에 기술된 바와 같이, 상보성 결정 영역(CDR)을 암호화하는 서열을 CDR-루프 이식에 의해 인간 가변 도메인 스캐폴드 서열 상으로 컴퓨터내 가상 환경에서 이동시켰다. 뿐만 아니라, 추가의 아미노산이 공여 서열로부터 면역글로불린 도메인과 CDR 위치결정에 대해 구조적 관련성을 가지는 위치로 이동된 제2의 구조체를 토끼 클론 각각에 대해 제조하였다. (세균 발현에 대하여 최적화된 코돈 선호도를 가지는) 것으로서, 각각의 인간화 단일 사슬 항체 Fv(scFv)를 암호화하는 인공 유전자를 (대응하는 가변 경쇄 및 중쇄로부터) 합성하였다. 그 다음, 폴리펩티드를 생성한 후, 기술된 바와 유사한 검정을 이용하여 히트 동정 중에 특성규명하였다.
1.2.1 인간화 및 인간화된 scFv의 제조(API)
선택된 클론의 인간화는, WO 2014/206561에 기술된 바와 같이 토끼 CDR을 Vκ1/VH3 유형의 scFv 수용 구조상에 옮기는 과정을 포함하였다. 도 1에 개략적으로 도시한 이 과정에서, CDR 영역 6개의 아미노산 서열을 공여 서열(토끼 mAb) 상에서 동정한 다음, 이를 수용 스캐폴드 서열로 이식하였으며, 그 결과 "CDR 이식체"(클론 16-19-B11 sc01; 서열 번호 18 참조)라고 칭하여지는 구조체를 얻었다.
또한 2개의 추가 이식체(클론 16-19-B11 sc02 및 클론 16-19-B11 sc06: 각각 서열 번호 19 및 서열 번호 20 참조)를, 토끼 공여체에서 기원하는 아미노산의 추가 변형을 (CDR 위치 결정에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있고, 이로 말미암아 항원 결합에도 영향을 미칠 수 있는) 임의의 구조 영역 위치(framework position)에 포함하도록 디자인하였다(Borras et al., 2010; J. Biol. Chem., 285:9054-9066). 이처럼 인간화된 구조체를 "구조 이식체(STR)"라 지칭한다. 이와 같은 초기 구조체 3개에 대한 특성규명 데이터 비교가 STR 구조체의 유의미한 이점들을 규명하였을 경우, 추가의 변이체를 CDR이 이식된 VL과 STR이 이식된 VH를 포함하도록 디자인할 수 있었다. 이러한 조합은 종종 STR 이식체의 활성을 유지하기에 충분한 것으로 입증되었고(Borras et al. JBC. 2010;285:9054-9066), 인간 수용 스캐폴드 내 소수의 비인간 변경은 안정성 상실의 위험을 줄여줄 뿐만 아니라 면역원성에 대한 잠재성도 줄여주므로, 일반적으로 이 조합은 바람직할 것이다.
일단 이전 섹션에 기술된 컴퓨터 내 가상환경 구조체 디자인이 종료되면, 대응 유전자들이 합성되었고, 세균 발현 벡터가 구성되었다. 발현 구조체의 서열을 DNA 수준에서 동정하였고, 구조체를 포괄적인 발현 및 정제 프로토콜에 따라 제조하였다.
이.콜라이 내에서 단백질을 불용성 봉입체로서 이종 발현시켰다. 발현 배양액에 지수 성장 출발 배양액을 접종하였다. 상업적으로 이용 가능한 풍부 배지를 사용하여 궤도 진탕기 내 진탕 플라스크 내에서 배양을 수행하였다. 세포를 한정 OD600 2가 될 때까지 성장시켰으며, 이를 밤새 발현시켜 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG) 유도를 수행하였다. 발효를 마쳤을 때, 세포를 원심분리에 의해 수집한 다음, 초음파처리에 의해 균질화하였다. 이 시점에서, 세포 용해물의 SDS-PAGE 분석을 통해 상이한 구조체의 발현 수준을 측정하였다. 수회의 세정 단계를 포함하는 원심분리 프로토콜에 따라서, 균질화된 세포 펠릿으로부터 봉입체를 단리하여, 세포 파편과 기타 숙주 세포 불순물을 제거하였다, 정제된 붕입체를 변성 완충제(100 mM Tris/HCI pH 8.0, 6 M Gdn-HCl, 2 mM EDTA) 중에 용해하였으며, 자연적으로 폴딩된 단량체 scFv를 밀리그램 단위의 양만큼 생성시키는 확장가능 리폴딩 프로토콜에 의해 scFv를 리폴딩시켰다. 하기 단계들을 포함하는 표준 프로토콜을 이용하여 scFv를 정제하였다. 리폴딩 후 얻어진 생성물을 Capto L 아가로스(GE Healthcare)를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 포착하여, 정제 scFv를 얻었다. 초기 시험에서 친화성 및 효능 기준을 충족시켰던 선두 후보를, HiLoad Superdex75 컬럼(GE Healthcare)을 이용하는 폴리싱 크기별 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 정제 프로토콜에 후속하여, 단백질을 완충 염수 용액 중에 제제화하고, 하기에 기술된 바와 같이 다양한 생물물리학적 단백질 상호작용 및 생물학적 방법에 의해 특성규명하였다. 정제된 단백질의 회분에 대한 최종 수율을 측정하고, 이 값을 리폴딩 용적 1 L에 대해 정규화함으로써 상이한 구조체들의 생산가능성(producibility)을 비교하였다.
1.2.2 인간화된 scFv의 생물물리학적 특성규명
이하 섹션에 논의된 바와 같이 상이한 보고 지점(reporting point)에 이르기까지 scFv 구조체의 생산가능성과 안정성을 특성규명할 수 있었다.
이하에 설명된 바와 같이 임의의 기준에 대해 scFv를 관찰할 수 있었다.
생산가능성 기준은, 선택된 scFv 독립체가 선두 분자의 추후 개발을 지지하기에 충분한 양만큼 발현, 리폴딩 및 정제될 수 있도록 보장하여야 할 것이다. 한정된 기준은 발효 원액 1리터당 scFv 발현 수율(SDS-PAGE에 의해 평가됨)과, 포괄적 실험실 규모의 방법에서 달성되는 정제 수율(UV 분광분석법에 의해 정제된 단백질의 양을 측정함으로써 평가됨)이었는데, 이는 리폴딩 용액을 1 리터로 환원시켜 산정하였다.
안정성에 대한 기준은, 분자 제조 과정 중 응집 성향과, 보관 및 후속 취급시 이 분자들의 구조적 무결성을 평가하기 위한 것이다. SE-HPLC에 의해 측정된 단량체 함량은 정제 과정 중 분자들의 콜로이드 안정성 평가를 허용하였다(2.2.3). 후속 안정성 연구에서, 단량체 함량은 4주 이하의 지속기간에 걸쳐 1 mg/mL 및 10 mg/mL, 그리고 4℃, -20℃ 및 -65℃ 미만에서 시험될 수 있었다. 뿐만 아니라, 동결-해동 주기를 5회 반복한 후에 단백질의 콜로이드 안정성을 시험할 수 있었다. 선두 후보의 형태상 안정성에 대한 판독결과를 제공하기 위해 추가의 안정성 표시 매개변수로서 열 언폴딩 중간 점을 시차주사형광측정법(DSF)(2.2.4)으로 결정할 수 있었다.
1.2.2.1 생산가능성 평가
회분 방식의 진탕 플라스크 발효에 의해 선두 후보 scFv 분자를 발현시킨 후, 포괄적인 실험실 규모의 방법으로 정제하여, 추가 특성규명을 위한 단백질 시료를 얻을 수 있었다. 이 과정 중, 후보 분자들을 비교하고, 개발이 잠재적으로 어려울 수 있는 구조체를 동정하기 위해 몇몇 핵심 성능 매개변수를 모니터링할 수 있었다. 발현 역가를 원심분리에 의한 세포 수집 후 미정제 이.콜라이 용해물 수준을 바탕으로 측정하였다. 수집 중 약간의 세포 소실이 예상되었으나, 이 요인은 생산가능성의 더 보존적인 추산에 유리하도록 발현 수율 산정에 있어서 무시될 것으로 선택될 수 있었다. 쿠마시 염색 환원 SDS-PAGE 방법(2 2.1)은 특이성이 커서 시료 중 숙주 세포 단백질과 생성물의 구별을 허용하는 관계로, 용해물 중 scFv 생성물의 정량을 위해 이 방법을 선택할 수 있었다.
생산가능성을 평가하기 위한 두 번째 기준은, 리폴딩 용액 1 리터당 산정된 scFv의 정제 수율이다. 이 매개변수는, 단백질 리폴딩 단계를 포함하는 예측 제조 방법 중 잠재적 장애를 설명해준다. 거의 동일한 제조 방법들에 있어서 리폴딩 절차의 효율은 제한적인 것으로 판명되었으므로, 상이한 구조체의 성능을 한정된 리폴딩 용적에 대해 정규화한 생산가능성과 비교할 수 있었다. 수율을 산정하기 위하여, 각각의 회분으로부터 유래한 최종 단백질 시료를 UV 흡광도 측정법으로 정량한 다음(2.2.2), 이를 각각의 정제에 관한 실제 리폴딩 용적으로 나눌 수 있었다.
1.2.2.2 안정성 평가
scFv 구조체의 형태상 안정성, 단분산성 및 구조적 무결성 평가는, 개발가능성을 기준으로 상이한 분자들을 순위매김하기 위한 총체적 요소였다. 상이한 구조체의 유의미한 비교의 전제조건은, 유사한 품질을 가지는 정제 분자를 제조하는 것이었다. SE-HPLC에 의해 측정되는 기준 "단량체 순도"는 상이한 시험 물질들의 양립 가능한 품질을 보장하도록 의도되었다. SE-HPLC 분석 이외에, 단백질 순도 및 정체 확인을 위한 SDS-PAGE가 수행되었으며, 그 결과 시험된 제제들의 품질이 거의 동일하였음을 확인하였다.
scFv 정제에 관한 SE-HPLC 결과들은, 모든 제제가 단량체 함량이 상대적 피크 면적 적어도 97%가 되도록 97% 초과하는 순도로 정제될 수 있었음을 규명하였다(도 2).
분자 자체의 예상 형태 안정성을 기준으로 분자의 순위매김을 허용하기 위해 시차주사형광측정법(DSF)으로 선두 후보의 열 언폴딩 거동을 시험하였다. 형광도 미가공 데이터의 정규화된 플롯을 도 3(각 시료당 2회 측정한 값을 보여줌)에 보였다. 공조 언폴딩 거동이 관찰되었다. 3개의 분자, 즉 16-19-B11-sc01, 16-19-B11-sc02 및 16-19-B11-sc06은 각각 67.8℃; 66.4℃; 및 64.6℃의 Tm을 보였다.
안정성 평가의 두 번째 줄기에서, 4주의 지속기간에 걸쳐 상이한 온도에서 분자의 단분산성을 모니터링할 수 있었다. scFv 구조체는 단량체가 적어도 95%를 초과하고, 농도 10 mg/ml에서 각각의 시작 값을 기준으로 단량체의 5% 미만을 상실할 것으로 예상될 수 있었다. -65℃ 미만 및 -20℃에서 동결 상태에 있는 시료는 시간이 경과함에 따라서 오로지 최소의 차이만을 보일 것으로 예상될 수 있었다. scFv 구조체는 가장 엄격한 조건(4℃)에서 4주 동안 단량체의 0.5% 미만을 상실할 것으로 예상될 수 있었다. 뿐만 아니라, 37℃의 온도와 10 mg/ml의 scFv 농도에서 4주 이하 동안 응력 안정성 연구를 수행할 수 있었다. 이 조건에서 상이한 구조체들의 응집 성향은 더욱 엄격하게 구별될 것으로 예상되었다. 또한 scFv 시료를 반복해서 동결-해동할 수 있었다(총 5 주기). 분석적 SE-HPLC에 의한 단량체 함량의 정량 결과는 2개의 시료에 변화가 없음이 규명될 것임을 예상하게 해주었다.
추가로, 상이한 조건((A) 20℃에서 8 시간 동안 10 mg/ml; (B) 4℃에서 48 시간 동안 10 mg/ml; (C) 4℃에서 4 주 동안 10 mg/ml; 그리고 (D) 10 mg/ml에서 동결/해동 주기 진행) 하에서 (TNFα와 상이한 항원에 대해 유도된 제2의 특이성을 가지는) 이중 특이적 단일 사슬 다이아바디 중 scFv 구조체 2개의 단분산성을 모니터링하였다. 모든 경우에 있어 2.5% 미만((A), (B) 및 (D)의 경우에는 단지 1% 미만)의 단량체 손실이 관찰되었다.
UV 흡광도측정에 의한 정량을 지지해주는 데이터를 얻기 위해 scFv 3개를 대상으로 SDS-PAGE 분석을 수행하여, 시료 제제의 순도를 확인하였고, 이로써 함량을 정량함에 있어 특이성을 부여하였다. 본 분석의 다른 양태에 있어서, SDS-PAGE 결과들은, 안정성 연구(4℃ 및 농도 10 mg/ml에서 28일, -65℃ 미만의 온도에 보관하여 두었던 시료(제0일)와 비교) 도중 단백질 분해가 일어나지 않았음을 규명할 수 있었는데, 이는 발전 가능성의 측면에서 중요한 특징이다.
본 평가 범위 내에서 제안된 상이한 연구들이 단백질 안정성에 관한 별개의 기계론적 양태들을 다룬다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 단백질의 열 언폴딩 온도의 측정은, 고온 보관시 SE-HPLC에 의한 단분산성 측정 결과에 상보적인 결과들을 제공할 것이다. 두 방법이 잠재적 제품 수명과 안정성의 추산치를 제공하도록 디자인될 때, 다루어진 기작은 완전 상이하였다. 열 언폴딩에 의해 평가된 전이 중간 점(Tm)은 단백질 안정성에 대한 정질적 척도이다(ΔG의 열역학적 측정을 허용하지 않음). 매우 안정한(Tm이 높은) 단백질 도메인은 상온에서 자발적으로 언폴딩될 가능성이 적으므로, 언폴딩된 도메인의 상호작용에 의해 구동되는 불가역적 응집/침전 경향도 작다. 큰 도메인 안정성은 아미노산 잔기들의 조밀한 팩키징(packaging)을 보였는데, 이 또한 프로테아제 절단에 대한 저항성과 상관되어 있다. 다른 한편, SE-HPLC 평가는 단량체 분획과 가용성 올리고머/응집체 함량을 정량적으로 측정하였다. 이러한 가용성 올리고머는 종종 올바르게 폴딩된 단백질들 간 소수성 상호작용이나 정전기적 상호작용에 의해 구동되는, 비교적 느슨하고 가역적인 결합을 포함한다. 열 언폴딩에 의해 평가되는 바와 같은 Tm과, SE-HPLC에 의해 평가되는 바와 같은, (특히 "경계" 안정성을 보이는) 단백질의 올리고머/응집체 형성 성향 간에는 약간의 상관관계가 있었다. 임의의 역치 Tm(대략 60℃) 이상에서 항체 가변 도메인은 일반적으로 상온에서의 부분적 도메인 언폴딩으로 말미암은 단백 분해 및 응집/침전에 대하여 저항성을 가지기에 충분히 안정적이었다. 그러나 표면 잔기들의 소수성 상호작용 및/또는 정전기적 상호작용에 의해 구동되는 올리고머화는 여전히 진행될 수 있었다. 중요한 점은, 고온(예컨대 37℃)에서 가속화된 (응력) 안정성 연구에 있어서 올리고머 형성과 침전의 다양한 기작이 동시에 진행될 수 있었다는 점이다.
1.2.3. 인간화 scFv의 시험관 내 결합 및 활성에 관한 특성규명
이하에서 인간화된 scFv를 대상으로 자체의 표적 결합 특성과 효능에 대해 시험관 내에서 특성규명하였다. 인간 TNFα에 대한 결합 역학(ka, kd 및 KD)과, L929 섬유아세포의 TNFα 유도성 세포자살을 중화하는 효능을 분석하였다. 또한 사이노몰거스 원숭이(마카카 파시큘라리스)와 레서스 원숭이(마카카 뮬라타) TNFα 유도성 세포자살을 억제하는 효능뿐만 아니라, 인간 TNFα와 TNFRI/TNFRII 사이의 상호작용을 억제하는 효능(ELISA에 의해 분석), 그리고 TNFβ와의 결합에 대한 표적 선택성에 비한, TNFα와의 결합에 대한 표적 선택성을 분석할 수 있었다.
이하 결과들을 이해하기 위하여, 인간 가변 도메인 스캐폴드상으로의 토끼 CDR의 운반뿐만 아니라, 전체 크기 IgG에서 scFv 단편으로의 형태 변화 둘다는 약리학적 특성에 영향을 미칠 수 있음을 주목하는 것은 중요하다. 예컨대 임의의 친화성 상실은 일반적으로 인간화와 연관되어 있다. 또한 scFv의 크기가 IgG의 크기에 비해 더 작음으로 말미암아, scFv가 입체 장애를 통해 상호작용 파트너들을 방해하는 성질은 크게 줄어든다. 마지막으로, 그러나 역시 중요한 점은, scFv의 동종 3량체 TNFα와의 2가 결합 방식으로 말미암아, 부모 IgG의 친화성 역시 크다고 보고되었을 수 있다는 점에 주목하여야 한다는 것이다(?의 작위적 결과). 결과적으로, 부모 2가 토끼 IgG와 인간화된 1가 scFv 간 친화성을 비교할 때, 보고되는 "친화성 상실"은 과대평가된 것일 수 있다.
1.2.3.1 친화성
인간 TNFα에 대한 인간화 scFv의 친화성을 SPR 측정법에 의해 분석하였다(2.1.1 참조). 친화성을 각각의 scFv의 2배 연속 희석액을 사용하여 분석하였다. scFv를 토끼 모노클로날 항체로부터 얻었다. 전술한 바와 같이, 상이한 scFv 변이체를 제조하여, 이를 "CDR"(CDR) 및 "구조 이식체" (STR)라 명명하였다.
scFv 16-19-B11-sc01(CDR), 16-19-B11-sc02(STR) 및 16-19-B11-sc06(STR)은 각각 7.0 x 10-10 M, 2.2 x 10-10 M 및 5 9 x 10-11 M의 친화성으로 결합하였다.
1.2.3.2 효능
인간화된 scFv가 인간 TNFα를 중화하는 능력을 L929 검정을 이용하여 분석하였다(2.1.2 참조). TNFα 유도성 세포자살을 중화하는 효능(IC50 및 IC90)을 16-9-B11 유래 scFv에 대해 분석하였으며, 상이한 검정 평판으로부터 얻어진 IC50 및 IC90 값들의 직접 비교를 감안하느 기준 항체 인플릭시맙의 효능과 비교하였다. 인플릭시맙과 scFv의 상대적 IC50 및 IC90 값들을 질량 단위(ng/ml)로 산정하였다. 효능 분석을 상이한 날에 상이한 항체 단편 품목들을 사용하여 수 차례 수행하였다. 도 4는, scFv 3개 중 하나에 대한 한 차례 실험으로부터 얻어진 대표적 용량-반응 곡선을 보여준다.
1.2.3.3 종 교차 반응성(사이노몰거스 원숭이 및 레서스 원숭이 TNFα)
2가지 방법, 즉 1) L929 검정에서 사이노몰거스 원숭이 및 레서스 원숭이 TNFα를 중화하는 효능과, 2) SPR에 의해 사이노몰거스 원숭이 및 레서스 원숭이 TNFα에 대한 친화성을 측정하는 방법을 통하여, 최고 순위에 있는 scFv에 대한 종 교차 반응성을 확인할 수 있었다. 사이노몰거스 원숭이 및 레서스 원숭이 TNFα를 각각 이용하여, 인간 TNFα에 관해 전술된 바와 유사하게, 상이한 종으로부터 유래하는 TNFα를 중화하는 효능을 L929 검정을 통해 측정할 수 있었다(도 5 참조; 2.1.2 참조). 상기 두 종으로부터 유래하는 TNFα는 매우 유사한 L929 세포자살 유도 효능을 보일 것으로 예상되었다. 그러므로 동일 농도의 인간 TNFα 및 원숭이 TNFα를 종 교차 반응성 시험에 사용하였다. 뿐만 아니라, 사이노몰거스 원숭이 TNFα 및 레서스 원숭이 TNFα에 대한 결합 역학(SPR에 의해 분석)을, 인간 TNFα에 관한 검정과 유사한 검정을 통해 분석하였다(2.1.1 참조).
클론 16-19-B11로부터 유래한 scFv 모두는 사이노몰거스 원숭이 TNFα 및 레서스 원숭이 TNFα에 대한 교차 반응성을 보이는 것으로 예상되었다. 친화성은 사이노몰거스 원숭이와 레서스 원숭이 각각 유사할 것으로 예상되었다. 인간 TNFα 및 원숭이 TNFα 간 친화성 차이는 약 2배 내지 약 10배 이내일 것으로 예상되었다. 사이노몰거스 원숭이 TNFα, 레서스 원숭이 TNFα 및 인간 TNFα를 중화하는 효능은 각각의 TNFα에 대한 친화성과 상관되어 있는 것으로 예상되었다.
1.2.3.4 인간 TNFα-TNFRI/II 상호작용의 차단
L929 검정에 더하여, 각각의 인간화 scFv가 인간 TNFα 및 TNFRI/II 간 상호작용을 억제하는 효능을 ELISA에 의해 평가할 수 있었다(2.1.3 참조). L929 검정과 유사하게, 각각의 평판에 대한 각각의 IC50 값을, 각각의 평판에 대해 얻은 기준 분자 인플릭시맙 IC50 값에 대해 보정하고, 인플릭시밉과 scFv의 상대적 IC50 값 및 IC90 값을 질량 단위(ng/ml)로 산정하였다.
중화 검정은, 오로지 표적 차단 항체들이 효능 검정에 적용된 목표 농도보다 더 큰 평형 결합 상수(KD)(즉 KD > 목표 농도)로 자체의 표적과 결합할 경우에만 표적 차단 효능을 변별할 수 있었다. L929 검정을 위해서는 5 pM의 TNFα 농도를 적용하였던 반면에, TNFRI/II 억제 ELISA에서는 960 pM의 TNFα 농도를 적용하였다. 그러므로 이론상 L929 검정은 scFv들 간 효능을 5 pM을 초과하는 KD로 구별할 수 있었던 반면에, 억제 ELISA는 scFv들 간 효능을 오로지 960 pM을 초과하는 KD로 구별할 수 있었다. 분석된 scFv 모두는, 960 pM 이하의 KD를 보였고, 상이한 친화성을 보이는 (하지만 작용 기작은 유사한) scFv들 간 효능은 L929 검정에서만 구별할 수 있었다.
1.2.3.5 표적 특이성(TNFα에 대한 결합 선택성 대 TNFβ에 대한 결합 선택성)
scFv 각각과 TNFα의 결합을 최대의 절반 정도로 억제하는, TNFα의 잠재성에 비한 TNFβ의 잠재성(즉 상대적 잠재성)을 평가함으로써, TNFβ에 대한 scFv의 특이성에 비한 TNFα에 대한 scFv의 특이성을 확인할 수 있었는데, 이는 경쟁 ELISA에서 측정되었다(2.1.4 참조). 단백질 제조자에 의하여 재조합 인간 TNFβ의 품질을 1) 순도(SDS-PAGE 및 HPLC 분석에 의함) 및 2) 마우스 L929 세포독성 검정에 있어서의 생물 활성에 대해 분석하였다. scFv들 각각과 바이오틴화 TNFα의 상호작용을 비표지화 TNFα로 차단하였으며(이 경우 IC50 값은 60 ng/ml 내지 260 ng/ml), 이때 TNFβ는 시험된 TNFβ가 최고 농도(1250 ㎍/ml)일 때조차 그 어떤 유의미한 효과도 보이지 않을 것으로 예상되었다. 그러므로 분석된 scFv 모두는 TNFα와 특이적으로 결합하되, 이와 가장 닮은 상동체 TNFβ와는 그렇지 않을 것으로 예상되었다. TNFβ는 시험된 농도에서 scFv에 대한 TNFα 결합의 그 어떤 유의미한 억제도 보이지 않을 것으로 예상되었다. 그러므로 TNFα 결합을 최대의 절반 정도로 억제하는 데에 요구되는 TNFβ 농도는, 본 검정에 사용된 TNFβ의 최고 농도(1250 ㎍/ml)보다 유의미하게 더 높아야 했다. scFv와 TNFα의 결합을 최대의 절반 정도로 억제하는 데에 요구되는 TNFβ 농도와 TNFα 농도를 비교하였을 때, TNFβ와의 결합에 대한 선택성에 비한 TNFα와의 결합에 대한 선택성은, 시험된 모든 단편들에 있어서 대략 5000배 내지 20000배 유의미하게 더 클 것으로 예상되었다. 그러므로 scFv들 중 임의의 것의 표적을 벗어난 결합(off-target binding)은 일어날 가능성이 거의 없어 보였다.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
2. 방법
2.1 선두 특성규명 검정법
2.1.1 결합 역학 및 종 교차반응성(SPR에 의한 분석)
scFv의 인간 TNFα 지향 결합 친화성을, MASS-1 SPR 기구(Sierra Sensors)를 사용하는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다. SPR 검정의 성능을, 기준 항체 항원 상호작용, 예컨대 세르톨리주맙-TNFα 상호작용을 분석함으로써 정질 분석하였다. 페그화된 Fab 단편 세르톨리주맙이 scFv의 결합 방식과 유사한 1가 결합 방식을 보이는 것을 이유로, 이 세르톨리주맙을 기준으로서 선택하였다. scFv의 친화성 측정에 대한 검정 환경과 동일한 환경을 적용하여 TNFα에 대한 세르톨리주맙의 친화성 값은 9.94 x 10~ 11 M임을 확인하였다. 이 값은 공개된 KD 값, 즉 9.02 ± 1.43 x 10-11 M과 거의 일치하였다(BLA 세르톨리주맙; BLA 번호: 125160; 제출일: 2007년 4월 30일).
scFv의 친화성 측정을 위해 인간 TNFα(Peprotech, Cat. No. 300-01)를 아민 결합에 의해 센서 칩(SPR-2 Affinity Sensor, Amine, Sierra Sensors) 상에 부동화하여, 부동화 수준 50 RU 내지 100 RU에 도달하도록 하였다(SPR 분석 중 달성된 부동화 수준은 40 RU 내지 120 RU였음). 제1 단계에서, 오로지 하나의 scFv 농도(90 nM)를 적용하여 scFv의 친화성 스크리닝을 수행하였다. 두 번째 단계에서, 최고 성능의 scFv를 가려내기 위해, 상이한 농도의 피분석 시료 6개를 MASS-1 시스템 내 평행 채널 8개 각각에 동시 주입함으로써, 단일 주입 주기에서의 단일 주입 주기 역학(Single Injection Cycle Kinetics; SiCK)을 분석하였다. 친화성 스크리닝을 위하여, 인간화 scFv를 유세포에 농도 90 nM로 3분 동안 주입한 후, 12분 동안 해리를 모니터링하였다. 이후 더 정확한 친화성 측정을 위해, scFv의 2배 연속 희석액(45 nM에서 1.4 nM 범위)을 3분 동안 유세포에 주입한 후, 센서 칩상에 부동화되었던 TNFα로부터 단백질이 해리되도록 12분 동안 그대로 놔두었다. 겉보기 해리 속도 상수(kd)와 겉보기 결합 속도 상수(ka), 그리고 겉보기 해리 평형 상수(KD)를, 1대1 랭뮤어 결합 모델을 이용하는 MASS-1 분석 소프트웨어(Analyzer, Sierra Sensors)로 산정하였고, Chi2(곡선 피팅의 품질에 대한 척도)를 기반으로 피트 품질을 모니터링하였다. Chi2에 대한 값이 작을수록 1대1 랭뮤어 결합 모델에 대한 피팅은 더욱 정확한 것이었다. 친화성 스크리닝에 있어서, 만일 분석 농도에 대한 Chi2이 10 이하라면 결과들은 유효한 것으로 간주하였다. 몇 가지 scFv 농도가 분석되는 경우, 만일 시험된 모든 농도에 대한 평균 Chi2가 10 이하라면 결과들은 유효한 것으로 간주하였다. 허용 기준은 시험된 scFv 전부에 대해 충족되었다.
사이노몰거스 원숭이(Sino Biological, Cat. No. 90018-CNAE) 및 레서스 원숭이(R&D Systems, Cat. No. 1070-RM-025/CF) TNFα (Peprotech, Cat. No. 315-01A)에 대한 종 교차 반응성을, 인간 TNFα에 대하여 전술된 바와 동일한 검정 환경을 이용하고 동일한 품질 척도를 적용하여 분석하였다. 사이노몰거스 원숭이 및 레서스 원숭이에 있어서 TNFα의 부동화 수준은 각각 50 RU 내지 180 RU, 그리고 90 RU 내지 250 RU 범위로 달성되었다. 2배 연속 희석액(농도 범위 45 nM 에서 1.4 nM)을 사용하여 scFv를 분석하였다. 시험된 scFv 모두에 대한 평균 Chi2 값은 10 이하였다.
2.1.2 L929 섬유아세포에 있어서 TNFα 유도성 세포자살(scFv에 의한 인간 TNFα 및 인간 이외의 영장류 TNFα의 중화)
마우스 L929 섬유아세포(ATCC/LGC Standards, Cat. No. CCL-1)를 이용하여 scFv가 재조합 인간 TNFα의 생물 활성을 중화하는 능력을 평가할 수 있었다. 1 ㎍/ml 악티노마이신 D 를 첨가하여 TNFα 유도성 세포자살에 대해 L929 세포를 감작화하였다. 항TNFα 기준 항체 또는 scFv (3000 ng/ml ~ 0.05 ng/ml)와, 5 pM 재조합 인간 TNFα(Peprotech, Cat. No. 300-01)의 3배 연속 희석액을 실온에서 1 시간 동안 예비 항온처리하였다. 적용된 TNFα 농도(5 pM)는 L929 세포자살을 준 최대로 유도하였다(EC90). 효현제/억제제 혼합물을 첨가한 후, 세포를 24시간 동안 항온처리하였다. 세포 생존을, WST-8(2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디설포페닐)-2H-테트라졸륨, 일나트륨 염) 세포 증식 시약(Sigma Aldrich, Cat. No. 96992)을 사용하는 비색 검정에 의해 확인하였다. WST-8은 세포내 디하이드로게나아제에 의해 오렌지 포르마잔 생성물로 환원된다. 포르마잔 생성물의 양은 생 세포의 수와 직접적으로 비례한다. Softmax 데이터 분석 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하는 4-매개변수 로지스틱 곡선 피팅을 이용하여 데이터를 분석하였으며, TNFα 유도성 세포자살을 50% 및 90%까지 중화하는 데에 필요한 scFv 또는 기준 항체의 농도(IC50 및 IC90)를 산정하였다(도 4 참조). 상이한 날에 또는 상이한 검정 평판에 대해 수행된 실험들 간 IC50 값과 IC90 값을 거의 동일하게 만들기 위하여, IC50 값과 IC90 값을 기준 항체 인플릭시맙의 IC50 값과 IC90 값에 대해 보정하였다. 반응의 정확성을 제어하기 위해 용량-반응 곡선들을 두번씩 분석하였다. 표준 편차와 CV를 각각의 측정 지점에 대해 산정하였다(CV < 20%).
인간 TNFα를 대상으로 하는 검정의 환경과 동일한 환경 및 동일한 품질 척도를 이용 및 적용함으로써, 사이노몰거스 원숭이(Sino Biological, Cat. No. 90018-CNAE) 및 레서스 원숭이(R&D Systems, Cat. No. 1070-RM-025/CF) TNFα에 대한 종 교차 반응성을 측정하였다. 인간 대상 종 교차 반응성 시험과 유사하게, L929 세포자살을 준 최대로 유도하는 TNFα 농도(EC90)를 종 교차 반응성 시험에 적용하였다. 두 종으로부터 유래하는 TNFα는, 인간 TNFα가 L929 마우스 섬유아세포 세포자살을 유도하는 효능과 매우 유사한 효능을 보일 것으로 예상되었다. 결과적으로, 시험된 두 종에 대해 동일 농도(5 pM)의 TNFα가 사용되었다. 종 교차 반응성 시험 중 2회 측정 지점 대부분의 CV는 10% 이하일 것으로 예상되었다.
2.1.3 TNFα 억제 ELISA
리간드 결합에 대한 scFv의 억제 효과를 ELISA, 즉 TNFα와, TNFRI 및 TNFRII간 상호작용을 단지 재현하는 생화학적 방법을 이용하여 평가하였다.
1차 억제 ELISA를 위해서, 인간 IgG Fc 영역에 융합된 TNFRI의 세포 외 도메인(R&D Systems, Cat. No. 372-RI)을 96웰 Maxisorp ELISA 상에 0.5 ㎍/ml의 농도로 코팅하였다. 2차 억제 ELISA를 위해서, 인간 IgG Fc 영역에 융합된 TNFRII의 세포 외 도메인(R&D Systems, Cat. No. 372-RI)을 2 ㎍/ml의 농도로 코팅하였다. 모든 후속 단계들은 상기 두 검정이 모두 동일하였다. TNFRI 및 TNFRII와, TNFα의 결합을 확인하기 위해서, TNFα를 사용 전에 바이오틴화하였다. 바이오틴화된 인간 TNFα(960 pM, 50 ng/ml)를 우선 3배 연속 희석한 인간화 항TNFα scFv 및 인플릭시맙(10000 ng/ml ~ 0.2 ng/ml)과 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. TNFα/항체 단편 혼합물을, TNF 수용체 부동화 평판에 옮긴 다음, 바이오틴 결합 스트렙타비딘-HRP(SDT Reagents, Cat. No. SP40C)와 함께 실온에서 20분 동안 항온처리한 후, 차단되지 않은 TNFα와 부동화 TNFα 수용체의 결합 여부를 확인하였다. 3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질을 첨가한 결과, TNFRI 및 TNFRII와, TNFα의 결합에 비례하는 비색 판독결과가 얻어졌다. 비이오틴화된 TNFα를 경쟁 ELISA에 사용하기 전, 이의 생물 활성을 L929 검정을 통해 확인하였다. 바이오틴화 TNFα의 IC50은 미표지화 TNFα의 IC50과 유사하였다(데이터는 보이지 않음). 전술한 L929 검정과 유사하게, Softmax 데이터 분석 소프트웨어(Molecular Devices)를 이용한 4-매개변수 로지스틱 곡선 피팅을 통해 데이터를 분석하였으며, TNFα와 TNFR의 상호작용을 50% 및 90%까지 억제하는 데에 필요한 scFv의 농도(IC50 및 IC90)를 산정하였다. 상이한 날 또는 상이한 검정 평판에 대해 수행한 실험들 간 IC50 값 및 IC90 값을 바로 거의 동일하게 만들기 위해, IC50 값 및 IC90 값을 기준 항체 인플릭시맙의 IC50 값 및 IC90 값에 대해 보정하였다.
반응의 정확성을 제어하기 위해 용량-반응 곡선을 2회 분석하였다. 각각의 측정 지점에 대해 표준 편차와 CV를 산정하였다(CV < 25%).
2.1.4 표적 특이성
항TNFα scFv의 특이성을 확인하기 위해, 가장 상동성이 큰 과의 일원인 TNFβ에 대한 결합을 평가할 수 있다. 비표지화 TNFβ(Peprotech, Cat. No. 300-01 B) 및 TNFα(Peprotech, Cat. No. 300-01)에 의해 바이오틴화된 TNFα와 scFv의 상호작용이 억제될 잠재성을, 경쟁 ELISA에 의해 분석하였다. 이를 위하여 scFv를 96웰 Maxisorp ELISA 평판상에 1 ㎍/ml의 농도로 코팅하였다. 5배 연속 희석된 비표지화 TNFα(50 ㎍/ml ~ 0.00013 ㎍/ml) 또는 TNFβ(1250 ㎍/ml ~ 0.00013 ㎍/ml)의 존재 하에 이루어진, 코팅된 scFv와 바이오틴화된 TNFα(75 ng/ml)의 결합을, 전술한 바와 같은 바이오틴-결합 스트렙타비딘-HRP(SDT Reagents, Cat. No. SP40C)를 이용하여 확인하였다. Softmax 데이터 분석 소프트웨어(Molecular Devices)를 이용한 4-매개변수 로지스틱 곡선 피팅을 통해 용량-반응 곡선에 대한 TNFα 데이터를 분석하였으며, 바이오틴화 TNFα와 코팅된 scFv의 상호작용을 50%까지 차단하는 데에 필요한, 비표지화 TNFα의 농도(IC50)를 산정하였다. TNFβ는 바이오틴화 TNFα와 scFv 간 상호작용의 그 어떤 유의미한 억제를 보이지 않을 것으로 예상되었다. 각각의 scFv와 TNFα의 결합을 억제하기 위한, TNFα의 잠재성에 비한 TNFβ의 잠재성(즉 상대적 잠재성)을 정량하기 위하여, TNFα에 의해 상호작용을 억제할 때의 IC50에 비한 TNFβ에 의해 상호작용을 억제할 때의 IC50을 산정하였다. TNFβ가 대략 TNFα의 IC50보다 5000배 내지 20,000배 더 높은 농도로 사용될 때, 유의미한 억제는 관찰되지 않을 것으로 예상되었으므로, TNFβ와의 결합에 대한 선택성에 비하여 TNFα와의 결합에 대한 선택성은 5000배 내지 20,000배 유의미하게 더 큰 것으로 측정되었다. 반응의 정확성을 제어하기 위해 용량-반응 곡선을 2회 분석하였다. 각각의 측정 지점에 대해 표준 편차와 CV를 산정하였다(시험된 TNFα/β의 농도들 중 하나를 제외하고 모두에 대하여 CV는 25% 미만). scFv 모두는 이 기준을 충족할 것으로 예상되었다.
2.2 CMC 분석
2.2.1 환원 SDS-PAGE
도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)은 정질 특성규명에 사용되는 분석 기술로서 단백질 순도를 제어하기 위한 것이다. 미국 약전(USP)(USP 제1056장)에 따르면, 분석용 겔 전기영동은 약물 성분 중 단백질의 균일성을 동정 및 평가하기 위한 적당하고 통상적인 방법이라고 한다.
본 방법은 발효 후 발현 수율을 추론하기 위해 이.콜라이 용균물로부터 유래하는 scFv 생성물의 양을 정량하기 위하여 사용된다. 본 방법의 또 다른 응용예는, 시험 물질의 분자량(이론상 값)을 기반으로 이 물질의 정체를 확인하는 것이 있다. 지원의 목적으로 본 방법은 공정 관련 불순물(숙주 세포 단백질)과 생성물 관련 불순물(분해 생성물 또는 부산물)에 관하여 시험 시료의 순도를 정량하는 데에 사용된다.
상업적으로 이용 가능한 예비 성형 겔 시스템인 "Mini Protean"( Bio-Rad Laboratories Inc.로부터 입수)으로 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. "임의의 kD" 분석용 겔(#456-9036) 상에서 인간화 scFv를 분석하였다. 상기 두 경우에서, 제조자에 의해 권장되는 트리스/글리신 완충제 시스템을 사용하였다. 단백질 밴드들을 검출하기 위해, SimplyBlueTM 염색 용액(Life Technologies Corp., #LC6060)에 의한 쿠마시 염색 또는 Pierce 은 염색 키트(Thermo Fisher Scientific Inc., #24612)에 의한 은 염색 중 어느 하나를 이용하였다. 염색 절차를 위해 각각의 공급자의 프로토콜을 따랐다.
염색된 단백질 겔의 분석 및 기록작업을, 기록 시스템인 ChemiDoc XRS 시스템(Bio-Rad Laboratories Inc., #170-8265) 및 소프트웨어 Image Lab, 4.0.1 버전(Bio-Rad Laboratories Inc., # 170-9690)으로 수행하였다.
용균 시료의 역가 측정
숙주 세포 단백질 혼합물 중 관심 단백질의 특이적 검출을 위한 방법으로서 SDS-PAGE를 고려하였다. (미리 정한) 본 방법의 직선 범위에서 일련의 표준 시료 희석액을 모든 겔에 포함시켰다. (농도계에 의해 측정된) 밴드 진하기 대 표준 시료 공칭 농도의 직선 회귀를 이용하여 표준 곡선을 작성하였는데, 이 표준 곡선은 추후 시료 중 scFv 함량을 외삽하는 데에 사용하였다.
미지의 생성물 농도를 가지는 용균 시료를 상이한 희석율(희석 완충제 중 적어도 1:10)로 로딩하여 적어도 하나의 scFv 농도가 본 방법의 직선 범위 내에 들어가도록 만들었다. scFv의 측정된 밴드 진하기를 기반으로 생성물의 양을 산정하였으며, 시료 제제의 희석률을 이용하여 농도를 측정하였다. 표준 곡선의 선형 범위 내에 있던 모든 시료에 대해 구하여진 값들을 평균 내었다.
용균 시료의 정량을 위한 방법의 적합성에 관한 추가의 시험으로서, 용균 시료를 공지의 양만큼의 표준 시료로 스파이킹(spiking)하여 억제/향상 시험을 실시하였다. 희석 완충제 중 시료 희석율 1:10일 때 스파이크 회수율을 산정한 결과, 그 값은 95.4%임이 밝혀졌는데, 이의 정확도는 희석 완충제 중 표준 시료가 사용될 때 관찰되는 바와 동일한 수준이었다. 그러므로 세포 용균물 중 유의미한 기질 간섭은 관찰되지 않았고, 본 방법은 세포 용균물 중 scFv 함량을 정량하는 데에 적합한 것으로 간주되었다.
단백질 순도 및 함량
함량을 측정하는 방법의 적합성과, 이로 말미암은 시험 시료의 순도를 보여주기 위해, 기준 scFv에 대한 검출 하한치(LOD)를 (단백질 밴드를 동정함으로써) 눈으로 정하였으며(이때의 공칭 로딩량 0.02 ㎍), 각 래인의 진하기를 보여주는 히스토그램의 평가는 이 로딩량에서 신호 대 노이즈 비율이 대략 2임을 보였다. 뿐만 아니라, 농도계로 주요 밴드를 분석하여 정량을 위한 직선 범위를 결정하였다.
선형 회귀와 데이터를 피팅한 결과 결정계수(R2)는 0.9998이었는데, 이는 피팅의 품질이 우수하였음을 말해주는 것이다. 피트의 전반적인 품질 이외에, 각각의 개별 데이터 점의 상대 오차를 측정하여, 선택된 범위에서 본 방법이 적합한지(즉 적합성)를 기록하였다. 모든 데이터 점에 대한 상대 오차는 10% 이하였는데, 이는 본 방법의 정확도가 우수함을 말해주는 것이다.
2.2.2 280 nm에서의 UV 흡광도
280 nm에서 UV 흡광도를 측정하는 방법은 USP 제1057장에 개략적으로 기술된 바와 같은 총 단백질 검정이다. 단백질 용액은 방향족 아미노산이 존재할 때 파장 280 nm에서 UV 광선을 흡수한다. UV 흡광도는 단백질 중 티로신과 트립토판 잔기 함량의 함수로서, 단백질 농도에 비례한다. 미지의 단백질 용액의 흡광도를 분광분석기 상에서 Beer 법칙, 즉 A = ε*I*c[식중, 흡광도 A는 몰 흡광계수(ε), 흡광 경로 길이 및 물질의 농도의 곱에 해당함]을 적용함으로써 USP 제851장에 따라서 측정될 수 있었다. scFv에 대한 몰 흡광계수를 Vector NTI®(Life Technologies Corporation)로 산정하였다.
Nanoquant 평판(Tecan Group Ltd.)이 장착된 Infinity 판독기 M200 Pro로 UV 흡광도 측정을 수행하였다. 단백질 시료의 흡광도를 280 nm 및 310 nm 에서 측정하였는데, 이때 파장 310 nm는 280 nm 신호로부터 공제되는 기준 신호로서 사용하였다. 시료 기질의 잠재적 간섭성을 설명하기 위해, 각각의 측정시 블랭크 공제를 실시하였다. 얻어진 단백질 시료의 최종 흡광 신호를 사용하여 단백질 농도를 산정하는 데에 사용하였는데, 이때 Lambert-Beer 법칙을 적용하였다.
모든 측정은, 측정 범위 0 OD ~ 4 OD의 사양을 가지는 기구에 의해 수행하였는데, 이때 제조자에 의해 1% 미만의 재현가능성과, 3% 미만의 균일성이 지정되었다.
2.2.3 SE-HPLC(크기별 배제 고압 액체 크로마토그래피)
SE-HPLC는, USP 제621장에 개략적으로 기술되어 있는 바와 같이 고체 정지상과 액체 이동상을 바탕으로 하는 분리 기술이다. 이 방법은 분자의 크기와 형상을 기반으로 소수성인 정지상과 수성인 이동상을 활용하여 분자들을 분리한다. 분자의 분리는 특정 컬럼의 공극 체적(V0) 및 총 투과 체적(VT) 간에서 진행된다. 자동화 시료 주입기 및 검출 파장 280 nm로 설정된 UV 검출기가 장착된 Chromaster HPLC 시스템(Hitachi High-Technologies Corporation) 상에서 SE-HPLC에 의한 측정을 수행하였다. 이 장비를, 상기로부터 얻어진 크로마토그램 분석도 또한 지원하는 소프트웨어 EZChrom Elite(Agilent Technologies, Version 3.3.2 SP2)로 제어하였다. 단백질 시료를 원심분리로 투명하게 만든 후, 주입할 때까지 오토샘플러 내 6℃의 온도에 방치하여 두었다. scFv 시료 분석을 위해 컬럼 Shodex KW402.5-4F(Showa Denko Inc., #F6989201)를 사용하였는데, 이때 표준 완충 염수 이동상(50 mM 아세트산나트륨, pH 6.0, 250 mM 염화나트륨)의 권장 유속은 0.35 mL/분이었다. 주입당 목표 시료 로딩량은 5 ㎍이었다. UV 검출기(파장 280 nm)로 시료를 검출하였으며, 적합한 소프트웨어 슈트로 데이터를 기록하였다. 얻어진 크로마토그램을 V0 ~ VT의 범위에서 분석하였으며, 이때 용리 시간이 10분을 초과하는 기질 관련 피크들은 배제하였다.
본 방법의 실험실 내 정확도를 보장하기 위해, 통상 각 HPLC 순서의 시작점과 종점에서 표준 시료를 측정하였다. 이 시스템 적합성 시험에 사용된 표준 시료는, 회분으로 제조되어 각 측정 시점에 사용되도록 분액한 scFv였다.
2.2.3 DSF(시차주사형광측정법)
본 DSF 방법은 온도 의존적 단백질 언폴딩을 측정하기 위한 비 개요적 방법이다. MX Pro 소프트웨어 팩키지(Agilent Technologies)로 제어되고, 492 nm/610 nm로 설정된 여기/발광 필터가 장착된 MX3005P qPCR 장치(Agilent Technologies)로 DSF에 의한 열 언폴딩 온도 측정을 수행하였다. ThermoFast 96 백색 PCR 평판(Abgene; #AB-0600/W)에 반응을 구성하였다. 단백질의 언폴딩을 검출하기 위해, 상업적으로 이용 가능한 염료 SYPRO 오렌지(Molecular Probes; # S6650) 스톡 용액을 최종 희석률 1:1000으로 사용하였다. 언폴딩 측정을 위해 단백질 시료를 최종 농도 50 ㎍/mL가 될 때까지 표준 완충 염수 용액 중에 희석하였다. 25℃에서부터 시작하여 96℃까지 단계마다 1 ℃씩 30초의 지속 기간을 두며 상승하는 온도 프로그램에 의해 열 언폴딩을 수행하였다. 온도 프로그램이 진행되는 동안, 각 시료의 형광 발광도를 기록하였다. 기록된 미가공 데이터를 Microsoft Excel 템플릿(Niesen, Nature Protocols 2007, Vol. 2 No.9) 팩키지로 처리 및 평가한 다음, 전이의 중간 점(Tm)을 구하기 위해 형광도 데이터를 프로그램 GraphPad Prism(GraphPad Software, Inc.)을 이용하여 Boltzmann 등식에 피팅하였다.
언폴딩의 중간 점에 관한 신뢰할만하고 확고한 측정을 달성하기 위해, 적어도 2회의 측정을 수행하였다. 데이터 품질과 관련하여, 적합도(R2)가 0.9900을 초과하고, 95%의 Tm 신뢰도 구간이 0.5%보다 작은 측정치들만 고려하였다.
실험실 내 정확도 평가를 위해, 표준 시료(특성규명된 공지의 scFv)를 매 측정마다 포함시켜, 상이한 날의 검정 성능 비교를 수행할 수 있었다.
2.2.4 안정성 연구
상이한 scFv 구조체들의 안정성을, 이 scFv 분자들의 개발가능성에 대한 판독결과로서 평가하기 위하여, 단기 안정성 연구 프로토콜을 디자인할 수 있었다. 단백질 구조체를 단순 완충 염수 제제 중에 농축하여 목표 농도 1 mg/mL 및 10 mg/mL로 만들었다(상기 참조). SE-HPLC에 의해 단량체 함량을 측정한 결과, 순도가 성공 기준인 95%를 초과하여 넘었음을 확인하였다. 그 다음, 단백질 시료를 4주의 지속기간 동안 -65℃ 미만, -20℃, 4℃ 및 37℃에 보관하여 두었다가, 다양한 시점에서 분취액들을 분석하였다. 1차 판독결과를 SE-HPLC에 의해 분석하였는데, 이로써 가용성 고 분자량 올리고머와 응집체의 정량이 가능하였다. 지원을 위한 척도로서 단백질 함량을 280 nm에서의 UV 흡광도로 측정하였는데, 이는 보관 기간 동안 침전에 의해 단백질이 다량 소실되는지 여부에 대한 지표를 제공하였다. 보관을 위해서는 나사형 뚜껑을 가지는 튜브를 사용하였는데(Sarstedt, Cat. No. 72.692.005), 여기에는 분취액당 30 ㎍ 내지 1500 ㎍으로 채워져 있었다. 또한 분해 또는 공유 다량체 형성과 관련하여 구조체의 안정성을 보여주는 순도를 SDS-PAGE에 의해 측정하였다.
실시예 3: 인간화 다이아바디 및 IgG의 제조
VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA 배열형태 중 가변 도메인들을 정렬하여 단일 사슬 다이아바디 구조체를 디자인하였다. 이 구조체에 있어서 VLA 및 VHA 및 VLB 및 VHB 도메인들은 함께 TNFα 결합 부위를 이루었다. 가변 도메인들을 연결하는 펩티드 링커 L1 ~ L3을 글리신/세린 반복부로 구성하였다. 2개의 짧은 링커 L1 및 L3는 하나의 G4S 반복부로 구성하였던 반면에, 긴 링커 L2는 (G4S)4 서열로 구성하였다. 인간화 가변 도메인(실시예 2; 1.2.1)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 새로 합성하고, 이를 이.콜라이 발현에 적응시킨 벡터, 즉 pET26b(+) 골격(Novagen)을 기반으로 하는 벡터로 클로닝하였다. 실시예 2; 1.2.1에서 scFv에 대해 기술된 바와 같이 발현과 정제를 수행하였다.
가변 도메인을, 리더 서열과 각각의 불변 도메인을 함유하는 적합한 포유동물 발현 벡터, 예컨대 pFUSE-rlgG 벡터(Invivogen)에 클로닝하여 일시적 이종 발현을 도모함으로써 인간화된 IgG를 구성하였다. 중쇄와 경쇄를 암호화하는 벡터와 Freestyle™ MAX 시스템으로 CHO S 세포를 공동 형질감염시킴으로써 기능성 IgG의 일시적 발현을 수행하였다. 수 일동안 배양을 시키고 나서, 항체 분비 세포의 상청액을 회수하여 정제하였다. 그 다음, 분비된 IgG를 Protein A 세파로스(GE Healthcare)에 의해 친화성에 따라 정제하였다. 용리 분획들을 SDS-PAGE, UV 흡광도(280 nm) 및 SE-HPLC로 분석하였다.
실시예 2의 2.1.1 섹션에 기술된 바와 같이 Biacore사의 기기를 사용하여 항체 분자의 친화성을 분석할 수 있었다.
L929 검정(실시예 2의 2.1.2 섹션에 기술된 방법)을 통하여 항체 분자의 효능을 분석할 수 있었다.
실시예 4: TNFα 결합의 화학양론 측정
(특이성 기원 4개 중 하나로서 항TNF 가변 도메인 16-19-B11-sc06을 포함하는 4중 특이적 항체 구조체 PRO357 중) 16-19-B11의 TNFα에 대한 결합 화학양론을, SE-HPLC를 이용하여 측정하였다. 4중 특이적 구조체 및 TNFα를 2가지의 상이한 몰비, 즉 1:1 및 4.5:1의 몰비로 항온처리하였다. TNFα는 용액 중에 삼량체로서 존재하므로, 지정된 몰비는 TNFα삼량체에 대한 것이다. 즉 4.5:1의 비율에서 4중 특이적 구조체 중 16-19-B11의 결합 도메인은 과량으로 존재하고, 모든 TNFα삼량체 결합 위치들을 차지하여, TNFα삼량체 하나와 scFv 3개의 복합체를 이루게 되는 것이다. 그러나, 동 몰 조건 하에서는 이론상 TNFα 결합 부위 3개 전부를 포화시키는 16-19-B11의 결합 도메인은 충분한 만큼 존재하지 않는다. 그러므로 또한 복합체의 변이체로서 결합 도메인을 3개 미만 결합하여 포함하는 변이체가 예상되었다. TNFα와 4중 특이적 구조체를 RT에서 2 시간 동안 항온처리하여 복합체가 형성되도록 만들었다. 그 다음, 시료들을 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 각 시료 10㎕씩을 SE-HPLC 상에서 분석하였다. 50 mM 인산염 완충제(pH 6.5), 300 mM NaCl(용리액)을 0.35 mL/분의 유속으로 흘려보내면서 SE-HPLC 분석을 수행하였다. 용리된 단백질의 피크들을 파장 280 nm에서 검출하였다. 겉보기 분자량을 측정하기에 앞서 겔 여과 보정 키트(GE Healthcare; LMW, HMW)를 사용하여 컬럼을 보정하였다.
도 6의 아래 패널은, 4중 특이적 구조체와 TNFα가 동 몰량으로 포함될 때의 용리 프로필을 보여주는데, 이 용리 프로필은 TNFα삼량체 단독의 프로필 및 4중 특이적 구조체 단독의 프로필과 겹쳐졌다. 용액 중 TNFα의 삼량체화로 말미암아 이론상 각 삼량체 상에 존재하는 16-19-B11의 결합 도메인에 대한 등가의 결합 부위는 3개 이하로 존재할 것이므로, 4중 특이적 구조체는 제한적이었다. 이러한 조건 하에서, 3개의 복합체 종 모두(즉 3:1, 2:1, 1:1)를 동정하였다. 도 6의 위 패널은 4중 특이적 구조체를 과량 포함하는 복합체의 용리 프로필을 보여준다. 미결합 4중 특이적 구조체 잉여분은 예상 체류 시간으로 용리되었다. 복합체 형성으로 말미암아 TNFα 피크는 정량적으로 감소하다가 완전히 사라졌다. 이 복합체의 피크는 더 짧은 체류 시간을 지향하며 이동하였고, 이는 또한 동 몰 환경으로 이루어진 복합체의 최대 분자량에 의한 피크가 보일 때의 체류 시간과도 상관성이 있었다. 이러한 이유로, TNFα 상 모든 가용 결합 부위들을 16-19-B11가 차지하게 되는 관계로, 만일 4중 특이적 구조체가 과량으로 사용될 수 있다면 결합 화학양론은 3:1(16-19-B11:TNFα)이 되었다.
이처럼 정질적 관찰결과에 더하여, 겉보기 결합 화학양론은 또한 SE-HPLC에 의해 측정되는 바와 같이 복합체의 겉보기 MW를 기반으로 산정될 수도 있었다. 체류 시간을 기반으로 하기 등식에 따라서 겉보기 MW를 산정할 수 있었다:
Figure pct00010
실시예 5: 세포 증식의 억제
혼합 림프구 반응(MLR)에서 16-19-B11의 상이한 항체 형태들과 아달리무맙이 말초혈액단핵세포(PBMC)의 증식을 억제하는 능력을 시험하였다. 2명의 건강한 공여자로부터 얻은 PBMC를 96웰 평판에서 48 시간 동안 1:1 비율로 배양하였다(RPMI 1640)(37℃/5 % C02). 활성화 이후, 세포를 37℃/5 % C02에서 5일 더 항TNFα 항체 또는 IgG 대조군 항체(이것들 모두 최종 농도 10 ㎍/mL로)로 6회 반복 처리하였다. 항온처리 종료 24 시간 전에 각각의 웰에 BrdU(20 uL/웰)를 첨가하였으며, 상업적으로 이용 가능한 세포 증식 ELISA(Roche Diagnostics)를 이용하여 BrdU 흡수량을 측정함으로써 증식 여부를 확인하였다. 항체 처리된 세포와 미토마이신 C(25 ng/mL) 처리된 세포 간 BrdU 흡수 비를 산정함으로써 자극 지수를 결정하였다.
실시예 6: LPS 유도성 사이토카인 분비의 억제
RPMI 1640 중 CD14+ 단핵구를 96웰 평판에 접종한 다음, 가습 항온처리기 내 37℃/5 % CO2에서 16 시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 세포를 1 시간 동안 항TNFα 항체 또는 IgG 대조군 항체로 2회 반복 처리하였다(이때 외종 항체 농도는 2 ng/mL 내지 2000 ng/mL로 함). 단핵구를 세포 배양 배지로 3회 세정한 다음, 37℃/5% CO2에서 4 시간 동안 LPS(100 ng/mL)와 함께 항온처리하였다. 상업상 이용 가능한 ELISA 키트(R&D Systems)를 이용하여 세포 배양 상청액 중 IL-1β와 TNFα의 농도를 측정하였다.
Figure pct00011
Figure pct00012
SEQUENCE LISTING <110> Numab Innovation AG <120> Anti-TNFalpha-antibodies and functional fragments thereof <130> 112257P877PC <150> EP16000653.2 <151> 2016-03-17 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial CDR sequence; positions "X" indicate positions of limited diversity <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X (or Xaa) is placelholder for limited diversity consisting of amino acid residues E and Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X (or Xaa) is placelholder for limited diversity consisting of amino acid residues N and S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X (or Xaa) is placelholder for limited diversity consisting of amino acid residues A and S <400> 1 Gln Ala Ser Xaa Ser Ile Ser Xaa Trp Leu Xaa 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial CDR sequence <400> 2 Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Ile Ala Tyr Ile Tyr Pro Asp Tyr Gly Ile Thr Asp 180 185 190 Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ala 195 200 205 Gln Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Ser Tyr Tyr Ser Arg Gly Trp 225 230 235 240 Gly Ala His Tyr Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 245 250 255 Ser Ser <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial CDR sequence <400> 21 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial CDR sequence <400> 22 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial CDR sequence <400> 23 Gln Gly Tyr Tyr Tyr Ser Ser Ser Gly Asp Asp Asn Ala 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial CDR sequence <400> 24 Gln Gly Tyr Tyr Tyr Ser Asn Ser Gly Asp Asp Asn Ala 1 5 10 <210> 25 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<223> artificial linker sequence <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <223> generic linker sequence (GGGGS)n, with n being selected from 2, 3, 4, 5, and 6 <400> 31 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 32 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial linker sequence <400> 32 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 33 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody framework sequence <400> 33 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody framework sequence <400> 34 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 35 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody framework sequence <400> 35 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody framework sequence <400> 36 Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 1 5 10 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody framework sequence <400> 37 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody framework sequence <400> 38 Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ile Ile Leu 1 5 10 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial antibody framework sequence <400> 39 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 1 5 10

Claims (16)

  1. 인간 종양 괴사 인자 알파(TNFα)에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 기능성 단편으로서, 상기 항체 또는 기능성 단편은 (i) 서열 번호 1에 보인 아미노산 서열에 따른 아미노산 서열을 가지는 CDR1 영역, 서열 번호 2에 보인 아미노산 서열에 따른 아미노산 서열을 가지는 CDR2 영역, 그리고 서열 번호 3에 보인 아미노산 서열에 따른 아미노산 서열을 가지는 CDR3 영역을 포함하는 VL 도메인과, (ii) 서열 번호 4에 보인 아미노산 서열에 따른 아미노산 서열을 가지는 CDR1 영역, 서열 번호 5에 보인 아미노산 서열에 따른 아미노산 서열을 가지는 CDR2 영역, 그리고 서열 번호 6에 보인 아미노산 서열에 따른 아미노산 서열을 가지는 CDR3 영역을 포함하는 VH 도메인을 포함하는, 항체 또는 이의 기능성 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 기능성 단편은 (i) 서열 번호 7에 보인 아미노산 서열을 가지는 CDR1 영역, 서열 번호 2에 보인 아미노산 서열을 가지는 CDR2 영역, 그리고 서열 번호 8에 보인 아미노산 서열을 가지는 CDR3 영역을 포함하는 VL 도메인과, (ii) 서열 번호 9에 보인 아미노산 서열을 가지는 CDR1 영역, 서열 번호 10에 보인 아미노산 서열을 가지는 CDR2 영역, 그리고 서열 번호 11에 보인 아미노산 서열을 가지는 CDR3 영역을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 기능성 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 기능성 단편은
    (i) 1 nM 미만, 구체적으로 750 pM 미만, 더욱 구체적으로 100 pM 미만의 해리 상수(KD)로 인간 TNFα와 결합하고;
    (ii) 마카카 뮬라타(레서스) TNFα 및 마카카 파시큘라리스(사이노몰거스) TNFα와 교차 반응을 하며;
    (iii) TNFα 유도성 세포자살 억제 효능이 인플릭시맙의 TNFα 유도성 세포자살 억제 효능보다 더 크고;
    (iv) 시차주사형광측정법에 의해 측정되는 바와 같이 용융 온도가 적어도 60℃, 구체적으로 적어도 63℃, 더욱 구체적으로 적어도 66℃인 가변 도메인을 포함하며/포함하거나;
    (v) 화학양론(항체 : TNFα삼량체) 적어도 2로 인간 TNFα삼량체와 결합할 수 있는,
    항체 또는 이의 기능성 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인간 TNFα와 75 pM 미만의 KD로 결합하는 항체 또는 이의 기능성 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 기능성 단편은 서열 번호 14에 보인 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 기능성 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 기능성 단편은 서열 번호 17에 보인 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 기능성 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단일 사슬 가변 단편(scFv)인 항체 또는 이의 기능성 단편.
  8. 제7항에 있어서, 상기 scFv는 서열 번호 20에 보인 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 이의 기능성 단편.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역글로불린 G(IgG)인 항체 또는 이의 기능성 단편.
  10. 제8항에 의한 기능성 단편에 대한 에피토프와 본질적으로 동일한 에피토프와 결합하는, 항체 또는 이의 기능성 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 의한 항체 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산.
  12. 제11항에 의한 핵산을 포함하는 벡터 또는 플라스미드.
  13. 제11항에 의한 핵산 또는 제12항에 의한 벡터 또는 플라스미드를 포함하는 세포.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 의한 항체 또는 이의 기능성 단편을 제조하는 방법으로서, 항체 또는 기능성 단편을 암호화하는 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 배지 중에서 제13항에 의한 세포를 배양하는 단계와, 세포 또는 배지로부터 항체 또는 이의 기능성 단편을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 의한 항체 또는 이의 기능성 단편과, 선택적으로는 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  16. TNFα 관련 장애 또는 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 기능성 단편.
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