KR20180115967A - FCoV, CCoV 및 TGEV를 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

FCoV, CCoV 및 TGEV를 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 검출 방법 Download PDF

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Abstract

고양이 코로나바이러스(feline coronavirus: FCoV), 개 코로나바이러스(canine coronavirus: CCoV) 및 돼지 전염성위장염바이러스(transmissible gastroenteritis virus: TGEV)를 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 검출 방법을 제공한다. 이에 의하면 1회의 검사만으로 상기 3종의 바이러스를 구분하여 검출할 수 있으므로, 고양이에게 감염 가능한 여러 장관계 염증성 질병을 일으키는 바이러스의 감염을 효율적으로 진단할 수 있다.

Description

FCoV, CCoV 및 TGEV를 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 검출 방법{Primer for detecting FCoV, CCoV and TGEV simultaneously and detecting method using the same}
고양이 코로나바이러스(FCoV), 개 코로나바이러스(CCoV) 및 돼지 전염성위장염바이러스(TGEV)를 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.
고양이 코로나바이러스(feline coronavirus), 개 코로나바이러스(canine coronavirus) 및 돼지 전염성위장염바이러스(transmissible gastroenteritis virus)는 전세계적으로 분포하는 바이러스로서, 모두 고양이에 감염이 가능한 바이러스이다. 특히 고양이 코로나바이러스가 고양이에 감염되는 경우, 단순한 장관계 염증에 국한되지 않고, 전신성 질병인 고양이 전염성 복막염으로 진행될 수 있고, 전염성 복막염은 예후가 매우 불량하다. 그러나, 전염성 복막염은 특이적인 임상증상과 임상병리학 검사상의 변화(진단을 위한 특이적인 지표)가 없어 진단하기 어렵고, 상기 3종의 바이러스들의 유사한 항원성으로 인해 1회의 검사만으로 고양이 코로나바이러스를 진단하는 기법이 개발되어 있지 않다. 따라서, 한 번의 검사만으로 상기 3종의 바이러스들을 구분하여 동시 검출이 가능한 방법을 개발할 필요성이 있었다.
일 양상은 FCoV, CCoV 및 TGEV를 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
다른 양상은 FCoV, CCoV 및 TGEV를 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트를 이용한 검출 방법을 제공한다.
일 양상은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머는 고양이 코로나바이러스(feline coronavirus: FCoV), 개 코로나바이러스(canine coronavirus: CCoV) 또는 돼지 전염성위장염바이러스(transmissible gastroenteritis virus: TGEV)의 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 핵산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 FCoV, CCoV 또는 TGEV의 막 단백질 유전자 서열의 일부와 결합하는 것일 수 있다. 상기 프라이머는 따라서 FCoV, CCoV 또는 TGEV의 막 단백질 유전자 서열의 일부를 증폭하기 위한 프라이머일 수 있다. 이들 프라이머 세트는 증폭 반응액에 동시에 존재하여 표적 핵산과의 혼성화 및 연장이 이루어질 수 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 프라이머 세트는 상기 제1 프라이머 내지 제4 프라이머 또는 그 외의 다른 프라이머 또는 다른 핵산이 포함된 조성물을 사용한 PCR에서도 서로 간섭을 일으키지 않고 표적 핵산을 증폭할 수 있는 효과를 갖는 것일 수 있다.
상기 제1 프라이머 및 제4 프라이머는 표적 서열을 증폭하기 위한 정방향 프라이머로 이용되는 것일 수 있다. 상기 제2 프라이머 및 제3 프라이머는 표적 서열을 증폭하기 위한 역방향 프라이머로 이용되는 것일 수 있다. 상기 제1 및 제2 프라이머는 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 특정 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 기능할 수 있다. 상기 제1 및 제3 프라이머는 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 특정 표적 서열을 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 기능할 수 있다. 상기 제4 및 제2 프라이머는 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 특정 표적 서열을 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 기능할 수 있다. 상기 제4 및 제3 프라이머는 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 특정 표적 서열을 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 기능할 수 있다. 프라이머 쌍으로서 기능하는 프라이머가 다른 경우, 해당 프라이머 쌍에 의해 증폭되는 표적 핵산도 다를 수 있다.
용어 "뉴클레오티드 (nucleotide)"는 DNA, RNA, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 그 혼성체(hybrid)일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예는 메틸화, 탈아미노화, 캡화, 천연 뉴클레오티드의 하나 이상의 동족체로의 치환, 또는 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 따라서 상기 뉴클레오티드는 아데닌, 시토신, 티민, 구아닌, 및 우라실 이외에도, 이노신(inosine) 등의 리보뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 또한 상기 뉴클레오티드는 검출 가능한 표지가 부착된 것일 수 있다. 검출 가능한 표지는 광학적 표지, 전기적 표지, 방사능 표지, 기질을 검출 가능한 물질로 전환할 수 있는 효소, 억제된 (quenched) FRET 쌍 염료, 또는 이들에 부착된 물질, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 프라이머는 10 내지 30, 10 내지 25, 10 내지 24, 10 내지 23, 10 내지 22, 10 내지 21, 10 내지 20, 10 내지 19, 10 내지 18, 10 내지 17, 10 내지 16, 10 내지 15, 12 내지 25, 12 내지 24, 12 내지 23, 12 내지 22, 12 내지 21, 12 내지 20, 12 내지 19, 12 내지 18, 12 내지 17, 12 내지 16, 12 내지 15, 14 내지 25, 14 내지 24, 14 내지 23, 14 내지 22, 14 내지 21, 14 내지 20, 14 내지 19, 14 내지 18, 14 내지 17, 14 내지 16, 14 내지 15, 15 내지 25, 15 내지 20, 15 내지 17, 17 내지 25, 17 내지 23, 또는 17 내지 20 nt의 길이를 갖는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기한 프라이머 세트를 포함하는, 시료 중의 FCoV, CCoV 또는 TGEV를 동시에 검출하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소들을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 상기 프라이머 세트 외에도, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(dEPC-water), 또는 멸균수를 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 검출 가능한 표지 물질 및 표지 물질의 검출에 필요한 시약을 포함하거나, 뉴클레오티드를 염색하기 위한 물질을 포함할 수 있다.
다른 양상은 상기한 프라이머 세트 또는 조성물을 포함하는, 시료 중의 FCoV, CCoV 또는 TGEV를 동시에 검출하기 위한 키트를 제공한다.
상기 키트는 FCoV, CCoV 또는 TGEV의 표적 서열을 검출할 수 있는 마이크로어레이일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 상기한 프라이머 세트 또는 조성물을 이용하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 상술한 프라이머 세트 또는 그와 상보적인 서열, 또는 그에 대응되는 핵산 서열이 기판 또는 막 등의 고정상에 부착되어 있는 것일 수 있다. 또는 상술한 프로브, 결합 물질 또는 표지 물질이 기판 또는 막 등의 고정상에 부착되어 있는 것일 수 있다. 상기 키트는 상기 고정상을 2개 이상 포함할 수 있다. 상기 고정상에 부착된 물질에 따라, 상기 표적 서열이 상기 고정상에 부착될 수 있다. 예를 들면, 상기 고정상에 상기 표지 물질이 부착되어 있는 경우, 상기 결합 물질이 부착된 상기 증폭된 표적 서열은 상기 고정상에 부착될 수 있고, 또한 상기 고정상에 상기 프로브가 부착된 경우, 상기 프로브에 상보적인 서열을 갖는 상기 증폭된 표적 서열이 상기 고정상에 부착될 수 있다.
상기 키트는 표적 핵산의 PCR에 의한 증폭과 그 증폭 산물을 라인 블롯팅에 의하여 검출하기 위한 것일 수 있다. 본 명세서에 있어서, "라인 블롯팅 (line blotting)"이란 올리고뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드 프로브가 평행선 (밴드 모양)으로 공유적으로 부착되어 있는 막에서 표적 핵산과 프로브의 혼성화를 수행하고, 그 혼성화 산물을 검출하는 것을 포함한다. 상기 검출은 프로브에 부착된 검출 가능한 표지 물질에 의하는 것일 수 있다. 표적 핵산의 구분은 각 프로브의 밴드(band)의 위치에 의하여 이루어질 수 있다.
다른 양상은 제1 내지 제4 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 준비하는 단계; 상기 프라이머 세트를 개체로부터 분리된 시료에 접촉시켜 시료 중 포함된 표적 핵산과 상기 프라이머의 혼성화 산물을 얻는 단계; 상기 혼성화 산물의 프라이머를 연장시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계; 및 상기 표적 핵산의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 고양이 FCoV, CCoV 및 TGEV를 동시에 검출하는 방법을 제공한다.
상기 증폭은 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction; PCR)일 수 있다. 본 명세서에 있어서, "PCR"이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법으로서, 혼성화와 변성을 위한 열순환 (thermal cycle)을 포함하는 것일 수 있다. 이러한 PCR 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR 방법에는 한 번에 하나의 표적만을 증폭하는 단일 PCR과 한 번에 복수의 표적을 증폭하는 다중 PCR이 포함된다. 다중 PCR에서는 복수의 프라이머 쌍이 이용된다. 또한 다중 PCR에서 어느 한 표적 서열의 증폭에 이용되는 프라이머는 그 표적 서열의 증폭에만 이용되는 것이 아니라, 다중 PCR 중의 어느 다른 표적 서열의 증폭에 중복적으로 이용되는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 FCoV, CCoV 및 TGEV를 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 검출 방법에 의하면 1회의 검사만으로 상기 3종의 바이러스를 구분하여 검출할 수 있으므로, 고양이에게 감염 가능한 여러 장관계 염증성 질병을 일으키는 바이러스의 감염을 효율적으로 진단할 수 있다.
도 1은 FCoV, CCoV 및 TGEV의 막 단백질 유전자에 대한 다중 PCR에서 S1 내지 S4 프라이머가 결합하는 위치와 그 산물의 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 2는 FECV RM (GenBank accession no. FJ938051), FIPV UCD1 (GenBank accession no. AB086902), FIPV 79-1146 (GenBank accession no. DQ010921), FECV 79-1683 (GenBank accession no. JN634064), CCoV (GenBank accession no. DQ431022), 및 TGEV (GenBank accession no. FJ755618)의 막 단백질 서열을 나타내고, 이들 막 단백질 유전자 서열에 대하여 S1 내지 S4 프라이머가 특이적으로 결합하는 위치를 나타낸다.
도 3은 S1, S2, S3 및 S4 프라이머를 이용하여 FCoV, CCoV, 및 TGEV를 다중 RT-PCR로 증폭시키고, 그 산물을 전기영동한 패턴을 나타낸다.
도 4는 CCoV-특이적 서열, TGEV-특이적 서열 및 이들의 공통 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 벡터를 이용하여 다중 PCR을 실시하고, 이때 표적 서열의 양에 따른 밴드의 강도를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
생물학적 재료
FIPV (strain 79-1146; ATCC number VR-990) 및 CCoV (strain 1-71; ATCC number VR-809) 균주는 ATCC(Manassas, VA, USA)에서 구매하였고, 기준 바이러스(reference virus)로서 이용하였다. FIPV (n = 3), FECV (n = 3), CCoV (n = 3), TGEV (n = 8), 고양이 면역부전 바이러스 (feline immu-nodeficiency virus)(FIV; n = 3), 고양이 백혈병 바이러스 (feline leukemia virus)(FeLV; n = 2), 고양이 파보 바이러스 (feline parvovirus)(FPV; n = 4), 개 파보 바이러스 (canine parvovirus)(CPV; n = 2), 지아르디아 종 (Giardia spp.)(n = 2), 및 트리코모나스 종 (Trichomonas spp.)(n = 2)의 야외 분리주들은 충북 대학교 수의과 대학 부속 병원 또는 아이오와 주립 대학 수의학 진단 실험실(ISUVDL) 또는 수의 메디컬 센터(ISUVMC)에서 제공받았다; 상기의 분리주들은 시험에서 분석적 특이성(analytic specificity)을 평가하는데 사용되었다. FIPV의 모든 야외 분리주들은 유출형(wet-type) FIP를 갖는 고양이로부터 분리되었고, FECV는 임상적으로 건강한 고양이의 대변으로부터 분리되었다. CCoV, TGEV, FIV, FeLV, FPV, CPV, 지아르디아 종 및 트리코모나스 종은, 일반적인 진단적 절차에 의해 해당하는 질병을 갖고 상기 언급된 병원체에 대해 양성인 동물(즉, 개, 돼지, 또는 고양이)의 혈액 또는 대변으로부터 분리되었다. 상기 진단 절차는 현미경 검사, ELISA (SNAP®Parvo or Giardia test, IDEXX, Westbrook, ME,USA), 및 PCR (Pratelli et al., 1999; Kim et al., 2000; Pereira et al.,2000; Gookin et al., 2002; Crawford et al., 2005; Gomes-Keller et al.,2006; Garcia Rde et al., 2011)로 수행하였다. 모든 분리주들의 동정은 PCR 및 서열 분석으로 확인하였다.
3종의 바이러스를 동시 검출하기 위한 프라이머 서열의 설계
각각의 바이러스에서 높은 상호간의 서열 유사성을 갖는 막 단백질 유전자 서열을 프라이머 설계를 위해 이용하였다. 먼저 FECV-RM(항원형 Ⅰ; GenBank accession no. FJ943764), FIPV UCD1 (항원형 I; GenBank accession no. FJ943771), FECV 79-1683 (항원형 II; GenBank accession no. AB086904), FIPV 79-1146 (항원형 II; GenBank accession no. DQ010921), CCoV(GenBank accession no. DQ431022), 및 TGEV (GenBank accession no. FJ755618)에 대하여, CLC SEQUENCEVIEWER, version 4.6.2 (CBS Interactive, San Francisco, CA, USA)를 이용하여 서열 정렬(sequence alignment)을 수행하였다.
상기 결과를 토대로, 상기 모든 바이러스들의 공통 서열에 결합하는 공통 프라이머 쌍 S1(서열번호 1, 정방향 프라이머) 및 S2(서열번호 2, 역방향 프라이머)와, CCoV-특이적 프라이머(S3, 서열번호 3, 역방향 프라이머), 및 TGEV-특이적 프라이머(S4, 서열번호 4, 정방향 프라이머) 총 4종의 프라이머를 설계하였다. 가장 낮은 깁스 (Gibbs) 자유 에너지 (△G)를 갖고, 가장 낮은 2차 구조의 가능성을 나타내는 서열을 프라이머 서열로 선택하였다. 프라이머의 서열 특이성 및 그의 프라이밍 조건(즉, 프라이머의 ΔG 값 및 헤어핀 또는 다이머 형성)은 BLAST 분석 및 DNAMAN 소프트웨어(Lynnon, Pointe-Claire, Quebec, Canada)로 검증하였다. 아래 표 1은 상기 4종의 프라이머의 정보를 나타낸다.
<표 1>
Figure pat00001
상기 프라이머들은 도 1과 같이 각 바이러스 유전자 서열과 혼성화하여 PCR 산물을 만들어낼 수 있다.
RT- PCR
Gene-SpinTMViralDNA/RNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 바이러스 RNA들을 추출하였다. 바이러스 RNA는 Power cDNA Synthesis Kit (iNtRON)를 이용, 무작위 6개 염기 프라이머로 첫 번째 가닥의 cDNA로 역전사하였다.
단일(singleplex) 및 동시 다중(multiplex) PCR은 동일한 조건에서 수행하였다. 모든 PCR 증폭은 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3; 25℃), 1.5 mM MgCl, 200 μM의 각각의 dNTP, 10 μM의 각각의 프라이머, 5 단위의 Taq 폴리머레이즈 (iNtRON), 및 2 μL의 주형을 포함하는 총 50 μL에서 수행하였다. PCR은 TaKaRa Thermal Cycler Dice (TaKaRa Bio, Otsu, Japan)를 이용하여 다음의 조건하에서 수행하였다: 94℃에서 3분, 이후, 94℃ 30초, 50℃ 30초, 및 72℃ 40초의 35 사이클, 및 최종 연장 사이클 72℃ 5분. PCR 산물은 100 V에서 40분간 아가로스 겔 전기영동하여 분리하고, 이후 에티듐 브로마이드로 염색하여 자외선 하에서 관찰하였다. 앰플리콘(amplicon)의 예측된 크기는 380 bp (공통), 209 bp (CCoV-특이적), 및 452 및 623 bp (TGEV-특이적)이었다.
분석적 민감도 및 특이도
분석 민감도 (즉, 검출 한계)를 평가하기 위해, 각각의 PCR 산물 (공통 [S1 및 S2] 380 bp, CCoV-특이적 [S1 및 S3] 209 bp 및 TGEV-특이적 [S4 및 S2] 623 bp)을 pDrive vector (Qiagen Inc., Valencia, CA)에 제조사의 지시에 따라 클로닝하였다. 클로닝 산물은 시퀀싱으로 검증하였다. 플라스미드 DNA는 QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)를 이용하여 정제하고, 분광광도계 (spectrophotometry)로 정량하였다. 각각의 재조합 벡터는 DEPC 처리한 멸균 DW로 10배 연속 희석하였다. 분석적 민감도는 연속 희석된 재조합 벡터에 대한 단일(즉, 각 재조합 벡터에 대한 개별 PCR) 또는 다중 PCR로 3회 반복 수행하였다. 각각의 PCR 산물은 2% 아가로스 겔로 분리하였고, 에티듐 브로마이드로 염색하여 자외선 하에서 관찰하였다. 이미지의 밴드 강도는 SigmaScan Pro, version 6.0.0 (IBM, Chicago, IL, USA)를 이용하여 상응하는 수치 데이터로 변환시켰고, SigmaPlot version 12.5 (IBM)를 이용하여 분석하였다. 여러 단계의 희석액에 대한 전체적인 반응 효율(efficacy)과 정확도(fidelity)는 단일 분석 및 다중 분석 모두에서 비교 분석하였다.
분석 특이도는 각 분석에서 의도된 분석 표적을 제외한 개별 PCR 사이에서의 교차-반응성을 3회 반복 시험하여 평가하였다. 모든 각각의 PCR은 인식 특이성을 결정하기 위해 전술한 6종의 혈액 또는 장 병원체(즉, FIV, FeLV, FPV, CPV, giardia, and trichomonas)에 대하여 추가로 수행하였다.
결과
도 2와 같이, FCoV, CCoV, 및 TGEV를 검출하기 위한 동시 다중 RT-PCR에서 사용될 프라이머 4종을 선별하였다. 모든 바이러스의 공통 서열에 특이적인 프라이머 쌍 (S1 및 S2), CCoV 특이적 프라이머 (S3) 및 TGEV 특이적 프라이머 (S4)를 선별하였다. S1 및 S4는 정방향 프라이머로 사용되고, S2 및 S3은 역방향 프라이머로 이용된다. 각 프라이머의 ΔG 값 또는 모든 프라이머 쌍의 ΔG 값은 -5.40 내지 1.20 kcal/몰의 범위였다. 또한, S3 및 S4의 마지막 고유(unique) 뉴클레오타이드에 직접 연결된 3' 말단의 뉴클레오타이드는 이노신으로 치환되었다.
도 3은 FCoV, CCoV, 및 TGEV를 다중 RT-PCR로 증폭시키고, 그 산물을 전기영동한 패턴을 나타낸다. 도 3과 같이 3종의 바이러스의 공통 서열 밴드가 S1 및 S2에 의해 증폭되었다(380 bp). CCoV는 공통 서열 이외에도 그의 유전자-특이적 서열이 S1 및 S3에 의해 증폭되었다(209 bp). TGEV는 4개의 서로 다른 밴드 사이즈가 관찰되었다: 공통 밴드(380 bp), S3 및 S4에 의한 밴드(452 bp), S2 및 S4에 의한 밴드(623 bp) 및 S1 및 S3에 의한 밴드(209 bp). 상기와 같이 각각의 프라이머에 의한 증폭이 표적 서열에 대하여 특이적이라는 것이 입증되었다. 또한 다른 임의의 병원균에 대하여 동일하게 반복된 실험에서, RT-PCR 산물이 나타난 실험이 없었다.
단일 및 다중 PCR의 분석적 민감도는 알려진 복제 수(copy number, molecules/ μL)를 갖는 연속적으로 희석된 재조합 벡터를 이용하여 측정하였다. 표 2에서와 같이, 다중 PCR의 추정 검출한계는 FCoV, CCoV 및 TGEV에 대하여 각각 780, 2800 및 550 카피였다. 동일한 농도의 표적들을 갖는 시료에 대하여, CCoV 및 TGEV에 대한 다중 분석은 단일 분석에 비교하여 바이러스의 농도가 10배 낮은 양성 결과를 나타냈다. 반면 FCoV에 대한 분석은 단일과 다중 형식 사이에서 동일한 검출 한계가 나타났다. 도 4와 같이, 각 재조합 벡터의 10배 연속 희석액을 이용한 다중 검사에 의해 산출된 표준 곡선은 상관 계수(R2)가 0.950-0.968이고, 27.57-47.95의 기울기를 갖는다.
<표 2>
Figure pat00002
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Primer for detecting FCoV, CCoV and TGEV simultaneously and detecting method using the same <130> pn117423 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcr primer <400> 1 ccagatatgt aatgttcggc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcr primer <400> 2 tttacatagt aagcccatcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcr primer <220> <221> variation <222> (17) <223> 17th base(Adenine) is substituted by Inosine <400> 3 aaagtgacac cagttgacac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcr primer <220> <221> variation <222> (19) <223> 19th base(adenine) is substituted by inosine <400> 4 tcatgtcgca atagcacaac 20

Claims (6)

  1. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 프라이머를 포함하는 프라이머 세트.
  2. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 준비하는 단계;
    상기 프라이머 세트를 개체로부터 분리된 시료에 접촉시켜 시료 중 포함된 표적 핵산과 상기 프라이머의 혼성화 산물을 얻는 단계;
    상기 혼성화 산물의 프라이머를 연장시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계; 및
    상기 표적 핵산의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 고양이 코로나바이러스(feline coronavirus), 개 코로나바이러스(canine coronavirus) 및 돼지 전염성위장염바이러스(transmissible gastroenteritis virus)를 동시에 검출하는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 시료 중 제1 및 제2 프라이머 쌍의 표적 핵산이 존재하고, 다른 프라이머 쌍에 의해 증폭되는 표적 핵산이 존재하지 않는 경우, 상기 시료 중 고양이 코로나바이러스가 존재한다고 판정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 시료 중 제1 및 제2 프라이머 쌍의 표적 핵산이 존재하고, 제1 및 제3 프라이머 쌍의 표적 핵산이 존재하고, 다른 프라이머 쌍에 의해 증폭되는 표적 핵산이 존재하지 않는 경우, 상기 시료 중 개 코로나바이러스가 존재한다고 판정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 시료 중 제1 및 제2 프라이머 쌍의 표적 핵산이 존재하고, 제1 및 제3 프라이머 쌍의 표적 핵산이 존재하고, 제4 및 제3 프라이머 쌍의 표적 핵산이 존재하고, 제4 및 제2 프라이머 쌍의 표적 핵산이 존재하는 경우, 상기 시료 중 돼지 전염성위장염바이러스가 존재한다고 판정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  6. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는, 고양이 코로나바이러스(feline coronavirus), 개 코로나바이러스(canine coronavirus) 및 돼지 전염성위장염바이러스(transmissible gastroenteritis virus)를 동시에 검출하기 위한 키트.
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