KR20180114859A - 고면역원성 다량체 항원 단백질의 제조방법 및 이를 위한 식물체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고(高)면역원성 다량체 항원 단백질의 제조방법 및 이를 위한 식물체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 항원성 단백질을 포함하는 면역 반응 도메인(immune response domain), 항체 Fc 단편(Fc antibody fragment)을 포함하는 표적 결합 도메인(target binding domain), 및 IgM 또는 IgA 유래 테일피스(tailpiece)를 포함하는 다량체화 도메인(polymerization domain)을 포함하는 키메릭 항원(chimeric antigen)을 발현하는 형질전환 식물체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환 식물체로부터 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 면역원성 다량체 항원 단백질의 제조방법과 이를 위한 식물체에 대한 것이다.
본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법을 통해 안전하고 경제적으로 목적 단백질을 대량 생산 할 수 있으며, 이에 의해 제조된 면역원성 다당체 항원 단백질은 거대 4차원 구조를 지님으로서 면역 반응 증폭(boosting) 효과가 뛰어나서, 면역보조제(adjuvant)의 사용 없이도, 숙주 동물에서 항체 생성 능력이 뛰어나므로 산업상 이용가능성이 높다.
본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법을 통해 안전하고 경제적으로 목적 단백질을 대량 생산 할 수 있으며, 이에 의해 제조된 면역원성 다당체 항원 단백질은 거대 4차원 구조를 지님으로서 면역 반응 증폭(boosting) 효과가 뛰어나서, 면역보조제(adjuvant)의 사용 없이도, 숙주 동물에서 항체 생성 능력이 뛰어나므로 산업상 이용가능성이 높다.
Description
본 발명은 고(高)면역원성 다량체 항원 단백질의 제조방법 및 이를 위한 식물체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 항원성 단백질을 포함하는 면역 반응 도메인(immune response domain), 항체 Fc 단편(Fc antibody fragment)을 포함하는 표적 결합 도메인(target binding domain), 및 IgM 또는 IgA 유래 테일피스(tailpiece)를 포함하는 다량체화 도메인(polymerization domain)을 포함하는 키메릭 항원(chimeric antigen)을 발현하는 형질전환 식물체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환 식물체로부터 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 면역원성 다량체 항원 단백질의 제조방법과 이를 위한 식물체에 대한 것이다.
백신은 병원균 감염에 대한 방어를 목적으로 항원에 대한 면역반응을 생성하도록 하기 위해 사용되는 의약품으로서 최근 개발되고 있는 백신들은 주로 재조합 단백질(recombinant protein)을 항원으로 사용하고 있다. 재조합 단백질은 사균 백신이나 약독화 생백신에 비하여 부작용이 적고 안전하지만 면역원성이 낮으므로 감염 방어에 충분한 면역력을 생성하기 위해 면역보조제를 함께 사용한다. 면역보조제는 그 스스로는 특이적인 항원-항체 면역반응을 가지지 않으면서 백신 항원에 대한 면역 반응을 자극시켜 증강된 면역력을 유도할 수 있는 일종의 백신 첨가제로서 라틴어로 ‘돕다’또는‘강화하다’라는 뜻을 가진‘adjuvare'에서 유래되었다.
현재 유럽 및 미국에서 승인을 받아 백신에 사용되고 있는 면역보조제로는 알루미늄염, MF59, AS03, AS04 등이 있다. 1926년에 디프테리아 톡소이드 백신의 면역보조제로 개발된 알루미늄염은 현재 가장 널리 사용되는 면역 보조제로서 지난 80여 년 동안 사람 백신에 거의 독점적으로 사용되고 있다. 알루미늄염은 여러 백신에 널리 사용되며 매우 안전한 것으로 생각되고 있지만 알러지 반응을 유발하고 신경독성도 있는 것으로 추정되고 있다. 또한 항체가 매개된 체액성 면역반응은 강하게 유도하나 세포성 면역반응은 거의 유도하지 못하며, 동결보존이 불가능하다는 단점이 있다. 상기와 같이, 예방 접종(또는 백신 접종, vaccination)을 할 때 면역보조제(adjuvant)를 사용하게 되는데, 이로 인해 부작용 [예를 들면, autism spectrum disorders (ASD)]과 allergy 등의 여러 가지의 부작용이 발생되는 문제를 가지고 있어 adjuvant free 백신에 대한 요구가 필요한 상황이다.
한편, 단백질 치료제는 최근에 매우 효과적인 약제의 중요한 부류로 등장하였으며, 이들 부류 내에서 IgG isotype 항체(Ab)의 Fc 도메인이 다른 단백질에 결합 된 Fc-기반 융합 단백질(Fc-융합체)이 가장 유망성을 가지는 것으로 고려되고 있다. Ab의 Fc 영역은, 균형 잡힌 면역반응을 위한 임계치를 설정하는 활성화 및/또는 억제 신호 전달 경로를 겨냥하는 특정 FcγR을 활성화시키는 능력으로 인해 방어적 면역을 위한 보조제(adjuvant)에서 항원(Ag) 전달체로서 점점 더 연구되고 있다. 그러나, Fc를 사용하여 면역 세포에 Ag를 전달하는 기존의 접근법은 단량체 구조 때문에 다수의 FcγR과 가교 결합할 수 없다는 단점을 갖는데, 즉 세포 신호 전달을 향상시키는데 있어서는 높은 친화성으로 다수의 FcγR과 가교 결합하는 것이 필요한데 이를 할 수 없다는 단점을 가진다. 대부분의 FcγR(FcγRI 제외)는 Ab에 대한 높은 결합력으로만 상호 작용할 수 있고, 이로서 면역복합체(항원-항체 복합체, IC)로서 면역계에 제공된다. 이에 따라서 Ag와 Fc 영역을 융합시킨 Fc-융합체들을 다량체화(polymerization)하고자 하는 시도가 있었지만, 실질적으로 성과를 거두지 못하였다.‘David N. A. Mekhaiel et al., (2011)’에 따르면 기존에도 CHO-K1의 동물 세포를 이용하여 Fc-융합체를 육량체로 고분자화하여 발현시킨 연구가 있었으나, 고분자 Fc-융합체는 이의 이량체 또는 단량체 대응물보다 유의적으로 면역원성이 낮았으며, 이는 중요한 Fc-수용체와 상호 작용하는 능력이 감소되었기 때문인 것으로 보고된 바 있다(David N. A. Mekhaiel et al., Polymeric human Fc-fusion proteins with modified effector functions, Scientific Reports 1, Article number: 124 (2011)). 이처럼 Ag를 결합한 Fc-융합체를 고분자화하였을 때 오히려 이의 단량체들보다 면역원성(immunogenicity)이 떨어지는 문제점들이 보고되고 있는 실정이다.
또한, 현재 단백질 산업이 증가하면서 재조합 단백질은 사용 목적과 생산 규모에 따라서 여러 종류의 발현시스템으로 생산되고 있다. 생물학적 숙주에 따라 상기 발현시스템에는 여러 종류가 있는데, 대표적으로 많이 쓰이는 것은 대장균이나 효모와 같은 미생물을 이용하거나, 동물세포를 이용하는 방법 등이 있다. 당단백질의 경우 대부분 고등 진핵세포인 동물세포가 숙주세포로 사용되고 있다. 그러나 동물세포의 경우 사용 배지가 고가인데다 단백질의 생산 수율이 낮고 배양이 까다롭다는 단점 때문에 비 당단백질의 경우 대부분 미생물이 숙주로 사용되고 있다. 특히, 대장균 발현 시스템은 유전자 조작이 용이하고 경제적인 방법으로 널리 알려져 있다. 그러나, 사이토카인(cytokine)과 같은 진핵 세포 유래의 단백질을 생산하고자 할 경우에는 당화(glycosylation) 등과 같은 번역 후 수식이 불가능하고, 배양 배지로의 단백질 분비가 어려우며, 많은 단백질의 경우에서 이황화결합(disulfide bond)의 접힘(folding)이 제대로 이루어지지 않아 불용체(inclusion body)와 같은 불용성 단백질 형태로 생산되어 활성을 갖지 못하는 등의 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 면역보조제 비첨가 백신(adjuvant free vaccine) 생산에 관해 연구하던 중, Ag를 결합한 Fc-융합체를 소포체저장을 유도하며 식물에서 발현시키는 본 발명 특유의 방식을 이용하면 상기 Fc-융합체가 거대분자구조를 이루는 다량체로 발현될 뿐만 아니라 면역보조제 없이도 고(高)면역 반응을 일으키는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 (a) 항원성 단백질을 포함하는 면역 반응 도메인(immune response domain), 항체 Fc 단편(Fc antibody fragment)을 포함하는 표적 결합 도메인(target binding domain), 및 IgM 또는 IgA 유래 테일피스(tailpiece)를 포함하는 다량체화 도메인(polymerization domain)을 포함하는 키메릭 항원(chimeric antigen)을 발현하는 형질전환 식물체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환 식물체로부터 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 면역원성 다량체 항원 단백질의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 면역원성 다량체 항원 단백질 및 이를 포함하는 백신조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항원성 단백질을 포함하는 면역 반응 도메인(immune response domain), 항체 Fc 단편(Fc antibody fragment)을 포함하는 표적 결합 도메인(target binding domain), 및 IgM 또는 IgA 유래 테일피스(tailpiece)를 포함하는 키메릭 항원(chimeric antigen)을 발현하도록 작제된 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환 시키는 단계를 포함하는 면역원성 다량체 항원 단백질을 생산하는 형질전환 식물의 제조방법과 상기 방법으로 제조된 식물체를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 항원성 단백질을 포함하는 면역 반응 도메인(immune response domain), 항체 Fc 단편(Fc antibody fragment)을 포함하는 표적 결합 도메인(target binding domain), 및 IgM 또는 IgA 유래 테일피스(tailpiece)를 포함하는 다량체화 도메인(polymerization domain)을 포함하는 키메릭 항원(chimeric antigen)을 발현하는 형질전환 식물체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환 식물체로부터 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 면역원성 다량체 항원 단백질의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 면역원성 다량체 항원 단백질 및 이를 포함하는 백신조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항원성 단백질을 포함하는 면역 반응 도메인(immune response domain), 항체 Fc 단편(Fc antibody fragment)을 포함하는 표적 결합 도메인(target binding domain), 및 IgM 또는 IgA 유래 테일피스(tailpiece)를 포함하는 키메릭 항원(chimeric antigen)을 발현하도록 작제된 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환 시키는 단계를 포함하는 면역원성 다량체 항원 단백질을 생산하는 형질전환 식물의 제조방법과 상기 방법으로 제조된 식물체를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 항원성 단백질을 포함하는 면역 반응 도메인(immune response domain), 항체
Fc
단편(Fc antibody fragment)을 포함하는 표적 결합 도메인(target binding domain), 및
IgM
또는
IgA
유래 테일피스(tailpiece)를 포함하는
다량체화
도메인(polymerization domain)을 포함하는
키메릭
항원(chimeric antigen)을 발현하는 형질전환 식물체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 형질전환 식물체로부터 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 면역원성
다량체
항원 단백질의 제조방법을 제공한다.
(a) 단계에서는 본 발명 특유의 방법으로 발현하도록 서열을 구성한 키메릭 항원을 발현하는 형질전환 식물체를 제조한다.
본 발명에서 용어‘키메릭 항원(chimeric antigen)’은 항원과 항체 Fc 단편의 융합체(이하에서, Fc-융합체로 칭함)를 백본(backbone)으로 하여 식물특이적 다량체화를 유도하기 위한 임의의 서열 조작(부가, 결실, 치환 등을 모두 포함하는 의미)을 가한 항원 단백질을 의미하는 것으로, 바람직하게 하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는 것을 특징으로 한다: (i) 항원성 단백질을 포함하는 면역 반응 도메인(immune response domain, IRD), (ii) 항체 Fc 단편(Fc antibody fragment)을 포함하는 표적 결합 도메인(target binding domain, TBD), 및 (iii) IgM 또는 IgA 유래 테일피스(tailpiece)를 포함하는 다량체화 도메인(polymerization domain, PD).
상기 (i)에서 면역 반응 도메인(immune response domain, IRD)은 항원성 단백질의 전체 또는 단편을 포함하여 실제적인 면역 반응, 즉 체액성 및/또는 세포성 면역(T 세포 반응)을 유도하는 부분을 지칭한다. 상기 항원성 단백질이란 폴리펩티드 또는 단백질 종류의 항원 물질을 지칭한다.
본 발명에서 용어 ‘항원’은 적당한 세포와 접촉하여 유입됨에 따라 민감성 및/또는 면역 반응성 상태를 유도시키고, 생체 내 또는 시험관 내에서 이와 같이 감작된 대상체의 면역 세포 및/또는 항체와 입증 가능한 방식으로 반응하는 모든 물질을 지칭한다. 본 발명에서 용어 '항원'은 '면역원'이라는 용어와 동일한 의미로 통칭되어 사용될 수 있으며, 바람직하게 숙주 면역 체계가 그 항원에 특이적인 분비성, 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 일으키도록 촉진할 수 있는 하나 또는 그 이상의 에피토프를 포함하는 분자를 의미한다. 또한 본 발명에서 용어 '항원성' 또는 '면역원성'은 상기 항원 또는 면역원의 성질을 뜻하는 것으로 분비성, 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 일으키는 성질을 의미한다.
상기 용어 '면역 반응'이란 동물 체내에 존재하는 자기방어체계로서, 외부로부터 침입해오는 각종 물질이나 생명체를 자기 자신과 구별해내어 이 침입자를 제거하는 생물학적 현상이다. 이러한 자기방어를 위한 감시체계는 크게 두 가지 기작에 의해 이루어지는데 하나는 체액성 면역, 그리고 다른 하나는 세포성 면역이다. 체액성 면역은 혈청 내에 존재하는 항체에 의해 이루어지는데, 항체는 침입한 외부 항원물질과 결합하여 그것을 제거하는 중요한 기능을 한다. 한편, 세포성 면역은 림프계에 속하는 몇 종류의 세포에 의해 이루어지는데 이러한 세포는 침입해온 세포나 조직을 직접 파괴하는 기능을 담당한다. 그리하여 체액성 면역은 주로 세포 외부에 존재하는 세균이나 바이러스, 단백질, 복합탄수화물과 같은 외부물질에 대해 효과적이며, 세포성 면역은 각종 기생충, 조직, 세포 내 감염, 암세포 등에 그 기능을 발휘한다. 이러한 이중 방어체계는 B 세포나 T 세포 등의 주로 두 종류 림프구에 의해 수행되는데 B 세포는 항체를 생산하고, T 세포는 세포성 면역에 가담하고 있다. 이러한 B 세포나 T 세포에 의한 면역 반응은 일단 체내로 침입한 항원에 대하여 반응을 하되, 반드시 같은 종류의 항원이 계속 존재하거나 반복 침입해 왔을 경우에 작용하는 면역체계이다. 따라서, 이러한 면역 반응은 특정 항원에 대한 특이한 반응이다. 이러한 항원특이적 면역 반응 이외에도 체내에는 어떤 항원에 대해 노출되어진 경험이 없는 경우라도 직접적으로 반응하여 공격세포를 파괴하는 일종의 자연 면역 반응도 있는데, 이러한 면역반응에는 neutrophil, macrophage, NK(natural killer) 세포 등이 관여하여 공격대상 세포의 종류에 별로 구애됨이 없이 다양한 기능을 발휘하는 것이 특징이다.
상기 '에피토프'는 복잡한 항원 분자 상의 가장 간단한 형태의 항원 결정기를 지칭하고, 이는 항체 또는 T 세포 수용체에 의해 인식되는 항원의 특이적 부분이다.
본 발명의 항원은 이에 제한되지 않으나, 폴리펩티드 또는 단백질, 비단백질 분자 및 이들의 단편을 모두 포함하는 의미이다. 바람직하게 본 발명의 항원은 폴리펩티드 또는 단백질 및 이의 단편을 의미한다.
본원 발명의 항원은 당업자에게 공지된 면역원성 물질일 수 있고, 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 박테리아 항원 또는 에피토프, 진균 항원 또는 에피토프, 식물 항원 또는 에피토프, 사상균 항원 또는 에피토프, 바이러스 항원 또는 에피토프, 종양(암) 세포 항원 또는 에피토프, 독소 항원 또는 에피토프, 화학적 항원 또는 에피토프 및 자가 항원 또는 에피토프를 포함한다.
본원 발명의 항원은 바람직하게 종양-연관 항원일 수 있다. 상기 종양-연관 항원은 당업자에게 알려진 종양(또는 암) 연관 항원이라면 그 종류가 제한되지 않으나, 예를 들어 유방암 항원, 난소암 항원, 전립선암 항원, 자궁경부암 항원, 췌장암 항원, 폐암 항원, 방광암 항원, 결장암 항원, 고환암 항원, 교모세포종 암 항원, B 세포 악성 종양과 관련된 항원, 다발성 골수종과 관련된 항원, 비-호지킨 림프종과 관련된 항원, 만성 림프구성 백혈병과 관련된 항원 또는 대장암 항원을 포함한다.
더욱 구체적으로 상기 종양-연관 항원은 A33; ADAM-9; ALCAM; B1; BAGE; 베타-카테닌; CA125; 카르복시펩티다아제 M; CD5; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD28; CD32B; CD36; CD40; CD45; CD46; CD56; CD79a; CD79b; CD103; CD154; CDK4; CEA; CTLA4; 사이토케라틴 8; EGF-R; 에프린 수용체; ErbB1; ErbB3; ErbB4; GAGE-1; GAGE-2; GD2; GD3; GM2; gplOO; HER-2/neu; 인간 파필로마바이러스-E6; 인간 파필로마바이러스-E7; 인테그린 알파-V-베타-6; JAM-3; KID3; KID31; KSA(17-1A); LUCA-2; MAGE-1; MAGE-3; MART; MUC-1; MUM-1; N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제; 온코스타틴 M(온코스타틴 수용체 베타); p15; PIPA; PSA; PSMA; RAAG1O; ROR1;SART; sTn; TES7; TNF-α 수용체; TNF-β 수용체; TNF-γ 수용체; 트랜스페린 수용체; VEGF 수용체, GA733 또는 PAP(prostatic acid phosphatase, 전립선 산성 인산가수분해효소)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항원은 바람직하게 대장암 세포 표면 특이 단백질인 GA733 또는 전립선 산성 인산가수분해효소(PAP)일 수 있다.
상기 GA733은 상피세포 부착분자(EpCAM: Epithelial Cell Adhesion Molecule; 또는 17-1A 항원, KSA, EGP40, GA733-2, ks 1-4 및 esa로도 불린다)이다. EpCAM은 간단한 상피세포(epithelial cell) 및 이로부터 유도된 종양세포(tumorous cell)에 의해 발현된 표면 당단백질(surface glycoprotein)이다. EpCAM 분자는 건강한 조직으로부터의 세포 표면에 보이지만, 그 발현은 악성조직에서 상향조절된다. EpCAM은 배향되고 매우 정렬된 형태로 상피세포에 고착하는 기능을 한다(Litvinov, J Cell Biol. 1997, 139, 1337-1348). 본 발명의 상기 GA733은 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드일 수 있다.
상기 PAP는 산성 조건하에서 인산 모노에스텔을 가수분해하는 효소의 하나로서, 전립선 상피 세포에서 생산되며, 전립선 조직에 가장 많이 함유된 당단백이다. 본 발명의 상기 PAP는 바람직하게 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩타이드일 수 있다.
상기 (ii)에서 표적 결합 도메인(target binding domain, TBD)은 적어도 하나 이상의 항체 Fc 단편유래 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인을 포함하며, 항원-제시세포(antigen-presenting cell, APC)와 결합할 수 있는 부분을 지칭한다.
본 발명에서 용어 '항체'는 '면역글로불린(immunoglobulin, 이하, "Ig"로 표기)'과 혼용하여 사용되며, 항원에 선택적으로 작용하여 생체 면역에 관여하는 단백질의 총칭이다. 항체는 경쇄 및 중쇄의 2개 쌍으로 이루어진다. 이러한 항체의 경쇄 및 중쇄는 여러 도메인으로 이루어진 폴리펩티드이다. 전체 항체(whole antibody)에서, 각각의 중쇄는 중쇄 가변 부위(VH) 및 중쇄 불변 부위를 포함한다. 중쇄 불변 부위는 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3(항체 부류 IgA, IgD 및 IgG) 및 임의로 중쇄 불변 도메인 CH4(항체 부류 IgE 및 IgM)를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인(VL) 및 경쇄 불변 도메인(CL)을 포함한다. 가변 도메인 VH 및 VL은 보다 보존된, 골격 부위(FR)라 불리는 부위 내에 산재된 상보성 결정 부위(CDR)라 불리는 과가변성 부위로 보다 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로, 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 배열된 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 구성되어 있다(Janeway, C.A., Jr. 등 (2001). Immunobiology., 5th ed., Garland Publishing; and Woof, J., Burton, D., Nat Rev Immunol 4 (2004) 89-99). 중쇄 및 경쇄의 2개의 쌍(HC/LC)은 동일한 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서 상기 전체 항체는 2가, 단일특이성 항체이다.
그리스 문자 α, δ, ε, γ, 및 μ로 표시된 5가지 유형의 포유류 항체 중쇄가 존재한다(Janeway, C.A.,Jr., 등, (2001). Immunobiology., 5th ed., Garland Publishing). 존재하는 중쇄의 유형이 항체의 부류를 정의한다; 이러한 사슬은 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 항체에서 발견된다(Rhoades R.A., Pflanzer RG(2002). Human Physiology, 4th ed., Thomson Learning). 구별되는 중쇄는 크기 및 조성이 상이하다; α 및 γ는 대략 450개의 아미노산을 함유하는 한편, μ 및 ε는 대략 550개의 아미노산을 갖는다. 각각의 중쇄는 불변 부위와 가변 부위인 2개의 부위를 갖는다. 불변 부위는 동일한 동형의 모든 항체에서 일치하나, 상이한 동형의 항체에서 상이하다. 중쇄 γ, α 및 δ는 3개의 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3 (일렬로)으로 구성된 불변 도메인, 및 유연성을 더하기 위한 힌지 부위를 갖고 (Woof, J., Burton, D., Nat Rev Immunol 4 (2004) 89-99); 중쇄 μ 및 ε는 4개의 불변 도메인 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 구성된 불변 부위를 갖는다(Janeway, C.A., Jr.,등, (2001). Immunobiology., 5th ed., Garland Publishing). 중쇄의 가변 부위는 상이한 B 세포에 의해 생성되는 항체에서는 상이하나, 단일 B 세포 또는 B 세포 클론에 의해 생성되는 모든 항체에 대해서는 동일하다. 각각의 중쇄의 가변 부위는 대략 110개의 아미노산 길이이고, 단일 항체 도메인으로 구성된다. 포유류에는 람다(λ) 및 카파(κ)로 불리는 오직 2가지 종류의 경쇄가 존재한다. 경쇄는 1개의 불변 도메인 CL 및 1개의 가변 도메인 VL의 2개의 연속 도메인을 갖는다. 경쇄의 대략적인 길이는 211 내지 217개의 아미노산이다다.
본원 발명의 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, IgG를 항체의 대표적인 기본 구조하여 설명하는 것으로 이해된다.
본 발명의 Fc 단편은 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래된것 일 수 있으며, 바람직하게 IgG 유래의 Fc 단편일 수 있다. 상기 IgG는 다시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 나뉠 수 있으며, 본 발명의 Fc 단편은 가장 바람직하게 IgG1 유래의 Fc 단편일 수 있다.
본 발명에서 용어 'Fc 단편'은 면역글로불린(Ig) 분자를 파파인으로 분해시킬 때 얻어지는 분절로, 경쇄의 가변영역(VL)과 불변 영역(CL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 중쇄 불변영역 1(CH1)이 제거된 영역이다. 즉, 상기 Fc 단편은 두 개의 CH2-CH3 도메인 사슬의 이량체(dimer of two CH2-CH3 chain)를 의미하는 것으로 상기 두 사슬은 이황화결합에 의해 이량체 구조를 형성한다. 또한, 상기 Fc 단편은 중쇄 불변영역에 경첩영역(hinge region) 펩타이드의 전체 또는 일부를 포함할 수 있다. 또한, 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄 불변영역 1(CL1)의 일부 또는 전체를 포함하는 확장된 Fc 단편일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 단편일 수도 있다.
또한 상기 항체 Fc 단편은, 상기 키메릭 항원을 포함하는 분자 또는 조성물이 투여될 숙주(대상체)와 동일한 종으로부터 유래되거나 또는 숙주에 대해 이종형인 항체 Fc 단편 일 수 있다. 예를 들어 숙주가 인간인 경우, 상기 항체 Fc 단편은 인간 항체로 부터 유래된 것일 수 있고, 이종형 항체 Fc 단편에 대해서는 비인간 포유류 동물, 예를 들어 소, 염소, 돼지, 마우스, 토끼, 햄스터, 랫트, 기니피그 또는 마우스 유래 항체 Fc 단편일 수 있다.
본 발명의 상기 '항체 Fc 단편'은, 당업자에게 알려진 항체 Fc 단편 펩타이드라면 그 종류 및 아미노산 서열이 제한되지 않으며, 예를 들어 서열번호 5로 표시되는 폴리펩티드일 수 있고(인간 IgG1의 Fc 단편 서열), 또한 상기 서열에 경첩영역(hinge region)이 부가된 서열번호 7로 표시되는 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명의 용어 '항원제시세포'는 항원을 내재화하고, 항원을 프로세싱하며, 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 부류 I 또는 II 분자 맥락에서 항원성 에피토프를 림프구에 제시함으로써 주로 기능하는 항원-유도성 사건의 보조 세포를 지칭한다. APC와 항원 간의 상호 작용은 면역 유도에 있어 필수적 단계인데, 이는 이로써 림프구가 항원성 분자와 접촉하고 이를 인식하여 활성화될 수 있기 때문이다. 예시적 APC에는 대식 세포, 단구, 랑게르한스(Langerhans) 세포, 서로 맞물려 있는 수지상세포, 소포성 수지상세포, 및 B 세포가 포함된다.
본 발명의 상기 '표적 결합성 도메인(TBD)'은 적어도 하나 이상의 항체 Fc 단편 유래 CH2 및 CH3 도메인을 포함하므로, APC 상의 Fc 수용체와 결합할 수 있다. 항체 Fc 단편은 Fc receptor binding site를 가지며, 상기 Fc receptor binding site에서 APC 상의 Fc 수용체(FcγR 등)와 결합한다.
상기 면역 반응 도메인(IRD)과 표적 결합성 도메인(TBD)은 유전적 융합 수단에 의해 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 따라서 본 발명의 상기 키메릭 항원은 IRD를 TBD에 연결시켜 주는 연결성 분자의 사용을 포함한다. 예시되는 링커 분자에는 루이신 지퍼, 및 바이오틴/아비딘이 포함된다. 예를 들어, 상기 키메릭 항원에 사용될 수 있는 기타 링커는 펩티드 서열이다. 이러한 펩티드 링커는 일반적으로, 길이가 약 2 내지 약 40개 아미노산(예를 들어, 약 4 내지 10개 아미노산)이다. 예시되는 펩티드 링커에는 아미노산 서열 'SRPQGGGS'이 포함된다. 기타 링커는 당해 분야에 공지되어 있고, 일반적으로 이들이 연결시키는 영역들 간의 가요성을 고려하여 글리신 및/또는 알라닌이 풍부하다.
본 발명의 키메릭 항원은 단량체성이거나(즉, 이들은 IRD 및 TBD를 포함하는 단일 단위를 함유한다) 또는 이량체성 일 수 있다. 상기 이량체성 키메라 항원에 대해서는 US 8,465,745; US 8,029,803 및 대한민국 등록특허 10-1054851 을 참고로 할 수 있다.
상기 (iii)에서 IgM 또는 IgA 유래 테일피스(tailpiece)를 포함하는 다량체화 도메인(polymerization domain, PD)은 적어도 하나 이상의 IgM 유래 테일피스 서열 또는 IgA 유래 테일피스 서열을을 포함하며, 테일피스에 존재하는 시스테인 잔기(cystein) 사이에 이황화 결합(disulfied bond)을 형성하여 다량체화 또는 고분자화를 유도하는 부분을 지칭한다.
상기 IgM 유래 테일피스 서열은 IgM C-말단에서 유래되는 것으로서 다량체화를 유도할 수 있는 것으로 당업계에 알려진 서열이라면 그 서열 구성이 특별히 제한되지 않으며, 일례로 서열번호 9로 표시되는 펩타이드 일 수 있다.
상기 IgA 유래 테일피스 서열은 IgA C-말단에서 유래되는 것으로서 다량체화를 유도할 수 있는 것으로 당업계에 알려진 서열이라면 그 서열 구성이 특별히 제한되지 않으며, 일례로 서열번호 11로 표시되는 펩타이드 일 수 있다.
본 발명의 상기 키메릭 항원은 바람직하게 N-말단 방향에서 C-말단 방향으로 (i) 항원성 단백질을 포함하는 면역 반응 도메인(immune response domain, IRD); (ii) 항체 경첩 영역(hinge region), CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 표적 결합 도메인(target binding domain, TBD); 및 IgM 또는 IgA 유래 테일피스(tailpiece)를 포함하는 다량체화 도메인(polymerization domain, PD)이 순차적으로 펩티드 결합(peptide linkage)에 의해 연결된 이량체 단백질인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 (a) 단계에서는 식물특이적 다량체화를 유도하는 본 발명 특유의 방식으로 항원 단백질을 발현시키기 위하여, 전술한 키메릭 항원은 소포체 저장 유도서열(또는 소포체 잔류 신호 펩타이드, ER retention signal peptide)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 소포체 저장 유도서열은 당업자에게 공지된 식물 소포체 저장 유도서열이라면 그 종류가 제한되지 않으며, WO 2009158716 및 하기의 문헌 등을 참조로 할 수 있다; Pagny et al., Signals and mechanisms for protein retention in the endoplasmic reticulum, Journal of Experimental Botany, Vol. 50, No. 331, pp. 157-64, February 1999.
본 발명의 상기 소포체 저장 유도서열은 바람직하게 KDEL(서열번호 13), HDEL(서열번호 14) 및 상기 서열에 1 내지 5개의 아미노산이 부가된 것일 수 있으며(예를 들어 서열번호 15의 SEKDEL, 서열번호 16의 KHDEL, 서열번호 17의 KEEL, 서열번호 18의 SEHDEL 등등), 가장 바람직하게 서열번호 11로 표시되는 KDEL 일 수 있다.
상기 소포체 저장 유도서열을 코딩하는 뉴클레오타이드를 특정 유전자(본 발명에서는 키메릭 항원 발현 유전자) 내에 삽입함으로서, 최종산물의 아미노산 서열 말단에 KDEL 등의 소포체 저장 유도서열이 노출될 수 있도록 한다. 이것은 생산된 단백질이 식물 세포 외부로 분비되지 않고 형질전환된 세포 내의 소포체에 존재할 수 있도록 유도한다. 상기 특정 유전자가 도입된 숙주 세포 속에서 생산되는 단백질은 KDEL 등의 서열에 의하여 소포체 내에 저장되고 식물체 내에서 이루어질 수 있는 번역 후 과정(post-translational modification)을 거친다. 이는 세포 내 항체단백질의 발현량 증가와 이종간 면역 반응의 중요한 역할을 하는 이종간 당구조 차이에 따른 문제점을 해결하는데에 중요한 역할을 한다.
상기 소포체 저장 유도서열(KDEL)의 삽입부위는 키메릭 항원의 면역원성 또는 항체 결합 능력에 영향을 주지 않는 한 그 부위가 제한되지 않는다. 상기 소포체 저장 유도서열의 삽입부위는 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 항체 Fc 단편을 포함하는 표적 결합 도메인의 C-말단 부위일 수 있다.
본 발명에서는 소포체 저장 유도서열과 IgM 테일피스 또는 IgA 테일피스 서열의 특이적 조합에 의하여 식물특이적 다량체화를 유도하는 것을 그 특징으로 한다. 본 발명에서 용어‘식물특이적 다량체화’란 식물세포에만 특이적으로 존재하는 특정 메커니즘을 통하여 단백질이 고분자화 되는 것을 의미한다. 본 발명에서는 상기 서열의 특이적 조합을 통해 식물 특이적 다량체화를 유도한 결과, 전술한 키메릭 항원이 다량 발현될 뿐만 아니라 상기 키메릭 항원의 테일피스에서 이황화 결합에 의하여 고분자화되어 존재하는 비율의 현저한 증가를 유도한다. 기존에 IgM 테일피스 또는 IgA 테일피스를 이용하여 항체 또는 이의 단편을 다량체화한 기존 연구들이 많았으나, 소포체 저장 유도서열과의 특이적 조합을 통하여 식물에서 이러한 다량체 수득률이 현저히 높아지고, 이렇게 생산된 다량체가 상당한 고(高)면역원성을 나타낸다는 사실은 본원 발명에서 최초로 공개하는 것으로서, 기존 연구들과도 대비된다.
본 발명의 상기 (a) 단계의 키메릭 항원은 일례로 서열번호 19로 표시되는 GA-Fc αtpK 키메릭 항원, 서열번호 21로 표시되는 GA-Fc μtpK 키메릭 항원, 서열번호 23로 표시되는 PAP-Fc αtpK 키메릭 항원, 또는 서열번호 25로 표시되는 PAP-Fc μtpK 키메릭 항원이 바람직할 수 있다.
상기 용어 '형질전환(transformation)'은 외래성 폴리뉴클레오티드가 도입됨에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 세포 내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 유지되거나 통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자 모두 포함한다.
상기 용어 '도입'은 유전자 또는 유전자군을 인위적으로 표적하는 세포에 삽입하여 그 유전자군을 발현시키거나 또는 그 세포의 게놈(genome)에 다른 유전자(군)을 부가하는 조작을 의미한다. 이러한 유전자의 도입은 박테리오파아지에 의한 형질도입(세균), 토양세균인 Agrobacterium spp.을 매개로 한 간접적인 방법, 유전자 총(genegun), 전기자극(electroporation), 현미주입법(microinjection) 등에 의한 방법으로 수행될 수 있으며, 이 외에도 표적 세포 및 삽입 유전자의 특징에 따라 당업자가 공지된 유전자 도입 기술을 선택적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 (a) 단계에서 형질전환이란, 전술한 키메릭 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 식물 세포에 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 (a) 단계 '키메릭 항원을 발현하는 형질전환 식물체 제조'는 공지의 식물세포 형질전환 방법에 의해 수행될 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 원하는 유전자(키메릭 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티들)를 벡터(vertor)에 삽입하여 재조합 벡터를 제작(또는 작제)하고, 상기 재조합 벡터를 Agrobacterium 속의 균주에 형질전환시킨 다음, 상기 균주를 식물 세포에 감염시키는 방법일 수 있다.
상기 벡터는 일반적으로 시그날 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하는 것으로 바람직하게 발현 벡터이다. 상기 발현벡터(expression vector)는 선택된 폴리뉴클레오티드가 발현할 수 있는 벡터의 한 형태이다. 하나의 폴리뉴클레오티드 시퀀스는, 조절 시퀀스가 상기 폴리뉴클레오티드 시퀀스의 발현(예를 들어, 수준, 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 경우, 상기 조절 시퀀스(regulatory sequence)에 "작동가능하게 연결"된다. 상기 조절 시퀀스는 그것이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현(예를 들어, 수준, 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 서열이다. 상기 조절 시퀀스는, 예를 들어, 조절된 핵산에 직접적으로 또는 하나 또는 그 이상의 다른 분자들(예를 들어, 상기 조절 시퀀스 및/또는 상기 핵산에 결합하는 폴리펩티드들)의 작용을 통하여 그의 영향이 미치도록 할 수 있다. 상기 조절 시퀀스에는 프로모터(promoters), 인핸서(enhancers) 및 다른 발현 조절 요소들이 포함된다.
상기의 당 분야에 공지된 분자생물학적 기법인 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 다음 문헌에 기재되어있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1989; by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY,1984; and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience , 1987).
안정한 형질전환 후, 이어 형질전환된 식물을 번식시킨다. 상기 번식은 식물의 개체수를 증가시키는 것을 의미한다. 상기 식물의 번식은 재생 식물의 특성과 모(母) 유전자 이식 식물이 발현하는 특성이 동일하게 유지되는 방법이면 제한되지 않으나, 바람직하게 미세증식일 수 있다. 상기 미세증식은 선택된 모 식물 또는 재배종으로부터 잘라낸 단일 조직 샘플로부터 제 2 세대 식물을 성장시키는 방법이다. 이 방법에 의해 바람직한 조직을 가지며 목적하는 단백질을 발현하는 식물의 대량 재생산이 가능하다. 새로 생성된 식물은 최초 식물과 유전학적으로 동일하고 최초 식물의 특징 모두를 가진다. 미세증식은 단기간에 우수 식물 재료의 대량 생산을 가능케 하고, 최초 유전자이식 또는 형질전환 식물의 특징을 보존하면서 선택된 작물을 신속하게 증식 가능케 한다. 식물 클로닝 방법의 이점으로 식물 증식의 신속성 및 생성된 식물의 우수성 및 균일성이 포함된다.
상기 식물은 '식물'은 외래 유전자가 도입될 수 있는 식물이면 제한되지 않으나, 예를 들어 단자엽 식물인 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마 및 생강이 있다. 쌍자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 애기 장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 버즈풋 트레포일, 감자, 개구리밥, 들깨, 비둘기콩 및 완두일 수 있다. 바람직하게는 마늘, 브로콜리, 담배, 애기장대, 배추, 양배추, 양파, 파, 애호박, 무, 당근. 오이가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 담배(Nicotiana tabacum)일 수 있다. 담배는 단백질 함량도 높으면서, 손쉬운 재배방법과 많은 생체량을 얻을 수 있다는 장점이 있다.
(b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 제작된 형질전환 식물체로부터 단백질 성분, 특히 거대분자구조를 지니는 면역원성 다량체 항원 단백질을 수득한다.
상기 (b) 단계에서 '식물체로부터 단백질을 수득'하는 것은 공지의 식물 세포 유래 단백질 수득 방법에 의하여 행해질 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 교배 식물을 파쇄 및 분쇄하여 추출 버퍼(buffer, 완충용액)에 균질화하는 방법일 수 있다. 상기 추출 버퍼는 공지의 식물 단백질 추출 버퍼에 의한 것일 수 있고, 이에 제한되지 않으나 예를 들어 인산완충식염수(Phosphate buffered saline; PBS)일 수 있고, 또는 트리스-HCl pH 8, 디티오트레이톨(DTT), 프로테아제 억제제(예를 들어 애프로티닌(aprotinin), 펩스태틴(pepstatin), 루펩틴(leupeptine), 페닐메틸설포닐 플로오라이드(phenyl methyl sulphonyl fluoride) 및 [(N-(N-(L-3-트랜스-카복시옥시레인(carboxyoxirane)-2-카보닐)-L루실)-애그맨틴(agmantine)]등을 포함하는 조성물일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 상기 (a) 단계로부터 제작된 형질전환 식물체로부터 단백질 성분의 수득 시기는 바람직하게 식물의 전엽기 내지 성숙기 시기일 수 있다. 이러한 특정 시기의 채취를 통하여 본 발명의 면역원성 다량체 항원 단백질을 더 고효율로 대량생산이 가능하며, 효과가 뛰어난 목적 단백질(면역원성 다량체 항원 단백질)의 수득이 가능하다.
상기 수득시기는 담배 식물의 꽃이 피는 성체 시기이며, 바람직하게는 대략 14주일 수 있다.
본 발명에서는 상기 (b) 단계 이후에 단백질 정제 과정(c 단계)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 '단백질 정제'는 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시킬 수 있다(Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. AcademicPress. Inc., San Diego, CA(1990)). 상기 단백질 정제 과정에 의해 본원 발명의 면역원성 복합 단백질(즉, 거대 4차 구조 항원-항체 복합체)만을 고농도로 수득할 수 있다.
본 발명은 전술한 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된, 면역원성 다량체 항원 단백질을 제공한다. 본 발명의 면역원성 다량체 항원 단백질은 거대분자구조를 지니는 것이 그 특징으로 한다.
본 발명의 면역원성 다량체 항원 단백질 분자는 바람직하게 직경 10nm 내지 100nm 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 30nm 내지 90nm 크기를 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 면역원성 다량체 항원 단백질은 거대 4차원 분자구조를 지님으로써 면역 반응 증폭(boosting) 효과가 뛰어나다. 특히 기존에 문제가 되어오던 면역보조제(adjuvant)의 사용 없이도, 숙주 동물에서 항체 생성 능력이 뛰어나다. 특히 기존에 David N. A. Mekhaiel et al., (2011)’등에서와 같이 동물세포 등에서 Ag를 결합한 Fc-융합체를 고분자화하였을 때 FcγR과의 결합력이 떨어져 오히려 이의 단량체들보다 면역원성(immunogenicity)이 떨어지는 문제점이 현저하게 개선되어 뛰어난 면역증강효과를 나타낸다.
따라서 본 발명은 상기 면역원성 다량체 항원 단백질을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 '백신' 또는 '백신 조성물'은 면역응답(immuno response)을 자극하는 조성물을 의미하는 것으로, 면역원성 조성물과 동일한 의미로서 본 명세서에서 혼용되어 사용된다. 상기 백신은 예방 백신과 치료 백신을 모두 포함한다. 예방 백신은 개체가 항원에 노출될 때 더 큰 면역 반응을 내재하게 하기 위해, 항원을 포함하는 물질에 노출되기 전에 면역 반응을 유도하고, 따라서 항원을 운반하는 물질 또는 세포에 저항하는 능력을 증가시키는 것을 의미한다. 치료 백신은 백신의 항원과 관련된 질환을 이미 가지고 있는 개체에 투여하는 방식으로 사용되는 것으로 상기 치료 백신은 항원을 운반하는 질환 또는 세포와 싸우기 위한 증가된 능력을 제공하여 항원에 대한 개체의 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 단독으로 투여하거나, 대상 질환을 예방 및 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명의 상기 백신 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 상기 면역원성 복합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하며, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
상기 "담체(carrier)"라 함은 세포 또는 조직 내로 화합물의 부가를 용이하게 하는 물질을 의미한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한 본 발명의 면역원성 복합 단백질을 포함하는 백신 조성물은 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하여 면역화하는 데 사용할 수 있다.
상기 ‘개체(subject)’는 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자일 수 있다.
상기 ‘면역화(immunization)’는 본 발명에 따른 면역원성 복합 단백질을 개체에 투여했을 때, 개체 내에서 상기 면역원성 복합 단백질에 대한 분비성, 체액성 및/또는 세포성 면역 반응이 유발되는 것으로, 이 같은 면역화를 통해 대상 질환에 대한 예방 또는 치료 효과가 나타나게 된다.
상기 대상 질환은 본 발명에 따른 면역원성 복합 단백질에 포함되는 항원, 즉 실질적인 면역 반응 도메인에 의해 결정되는 것으로서, 질병을 유발하는 항원이 알려져 있는 질환, 즉 질병 유발 항원을 본 발명의 면역원성 다량체 항원 단백질에 포함하여 예방이나 치료에 유용하게 사용될 수 있는 것이라면 어느 것이라도 적용가능하다. 그 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 종양(암) 질환, 자가면역질환, 대사성 질환, 퇴행성 질환, 바이러스성 또는 세균성 감염, 프리온 질환(prion disease), 운동신경질환(monor neuron disease, MND) 등일 수 있다.
상기 대상 질환은 구체적으로는 흑색종, 아데노칼시노마(adenocarsinoma), 폐암, 소세포성 폐암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암, 방광암, 결장암, 대장암, 고환암, B 세포 악성 종양, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 근육암, 췌장암, 뇌종양, 교모세포종암(astroblastoma), 교아세포종암(glioblastoma), 유방암, 척삭종, 알러지, 천식, 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS), 당뇨병, 류마티스성 관절염, 요실금, 골다공증, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 시뉴클레인(synuclein) 단백질 이상으로 발생하는 루이소체병(lewy body disorder, LBD), 파킨슨씨병(Parkinson's disease, PD), 다발성 신경계 위축(multiple system atrophy, MSA) 등의 신경퇴행성 질환, 후천성면역결핍증(AIDS), B형 또는 C형 간염바이러스로 유발되는 간염, 사람 유두종 바이러스(human papilloma virus, HPV)에 의한 감염과 이로 유발되는 종양, 폐렴 클라디미아(Chlamydia pneumonia)에 의한 감염, 대장균(Escherichia coli)에 의한 감염, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)가 유발하는 위궤양, 말라리아, 결핵, 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 등 칸디다에 의한 감염, 탄저병(anthrax), 패혈증(sepsis), 변형 크루이츠펠트-야콥병(variant Creutzfeldt-Jakob disease, vCJD), 진저병(scrapie), 근위축성 측삭경화증(amyotropic lateral sclerosis, ALS) 등 일 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 상기 백신 조성물의 대상 질환은 종양 질환일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 대장암 또는 전립선암일 수 있다.
상기 ‘유효량’은 본 발명의 상기 백신 조성물의 대상 질환에 대한 예방이나 치료 효과를 나타내는 양으로, 투여된 개체에서 본 발명의 면역원성 복합 단백질에 대한 분비성, 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하기에 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 단백질의 총 유효량은 단일 투여량(single does)으로 개체에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 또한 투여 목적에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수도 있다. 상기 유효 용량은 대상 질환의 유형 및 중증도, 투여 경로 및 투여 횟수뿐만 아니라 투여가 필요한 개체의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 각 개체에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 해당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 투여 목적에 따라 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 또한 본 발명에 따른 단백질을 투여한 후 면역 세포의 활성을 결정해주는 검정 방법(assay) 또는 널리 알려진 생체내 검정을 사용하여 요법의 효능을 모니터링함으로써 결정할 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명에 따른 상기 백신 조성물의 투여 경로는 전술한 바와 같다. 본 발명의 면역원성 복합 단백질은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 투여될 수 있다. 상기 담체, 부형제 또는 희석제는 전술한 바와 같다.
본 발명에 따른 상기 백신 조성물은 단독으로 투여하거나, 대상 질환을 예방 및 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명의 상기 면역원성 다량체 항원 단백질의 생산을 위해서는 (a) 단계에서 제작되는 식물체가 반드시 필요한 것으로서, 따라서 본 발명은 항원성 단백질을 포함하는 면역 반응 도메인(immune response domain), 항체 Fc 단편(Fc antibody fragment)을 포함하는 표적 결합 도메인(target binding domain), 및 IgM 또는 IgA 유래 테일피스(tailpiece)를 포함하는 키메릭 항원(chimeric antigen)을 발현하도록 작제된 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 면역원성 다량체 항원 단백질을 생산하는 형질전환 식물의 제조방법과, 이 방법으로 제조된 식물체(면역원성 다량체 항원 단백질을 생산하는 식물체)를 제공한다. 상기 형질전환 식물의 제조방법은 상기 (a) 단계에서 기술한 바를 참조로 하여 이해된다.
본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법을 통해 안전하고 경제적으로 목적 단백질을 대량 생산할 수 있으며, 이에 의해 제조된 면역원성 다당체 항원 단백질은 거대 4차원 구조를 지님으로서 면역 반응 증폭(boosting) 효과가 뛰어나서, 면역보조제(adjuvant)의 사용 없이도, 숙주 동물에서 항체 생성 능력이 뛰어나다.
도 1A는 대장암 항원 단백질인 GA733(GA로 표시)과 IgG Fc region이 융합된 Fc-융합체 단백질에 IgA c-말단 유래 tailpiece(αtp)를 추가하여[종합하여‘GA-Fc αtp’로 표시], 이를 발현하도록 제작한 식물발현 벡터 및 이에 의해 생산되는 단백질의 당구조를 나타낸다.
도 1B는 대장암 항원 단백질인 GA733(GA로 표시)과 IgG Fc region이 융합된 Fc-융합체 단백질에 IgA c-말단 유래 tailpiece(αtp) 및 ER retention signal peptide인 KDEL(K로 표시)을 추가하여[종합하여‘GA-Fc αtpK’로 표시], 이를 발현하도록 제작한 식물발현 벡터 및 이에 의해 생산되는 단백질의 당구조를 나타낸다.
도 1C는 대장암 항원 단백질인 GA733(GA로 표시)과 IgG Fc region이 융합된 Fc-융합체 단백질에 IgM c-말단 유래 tailpiece(μtp)를 추가하여[종합하여‘GA-Fc μtp’로 표시], 이를 발현하도록 제작한 식물발현 벡터 및 이에 의해 생산되는 단백질의 당구조를 나타낸다.
도 1D는 대장암 항원 단백질인 GA733(GA로 표시)과 IgG Fc region이 융합된 Fc-융합체 단백질에 IgM c-말단 유래 tailpiece(μtp) 및 ER retention signal peptide인 KDEL(K로 표시)을 추가하여[종합하여‘GA-Fc μtpK’로 표시], 이를 발현하도록 제작한 식물발현 벡터 및 이에 의해 생산되는 단백질의 당구조를 나타낸다.
도 2A는 전립선암 항원 단백질인 PAP와 IgG Fc region이 융합된 Fc-융합체 단백질에 IgA c-말단 유래 tailpiece(αtp)를 추가하여[종합하여‘PAP-Fc αtp’로 표시], 이를 발현하도록 제작한 식물발현 벡터 및 이에 의해 생산되는 단백질의 당구조를 나타낸다.
도 2B는 전립선암 항원 단백질인 PAP와 IgG Fc region이 융합된 Fc-융합체 단백질에 IgA c-말단 유래 tailpiece(αtp) 및 ER retention signal peptide인 KDEL(K로 표시)을 추가하여[종합하여‘PAP-Fc αtpK’로 표시], 이를 발현하도록 제작한 식물발현 벡터 및 이에 의해 생산되는 단백질의 당구조를 나타낸다.
도 2C는 전립선암 항원 단백질인 PAP와 IgG Fc region이 융합된 Fc-융합체 단백질에 IgM c-말단 유래 tailpiece(μtp)를 추가하여[종합하여‘PAP-Fc μtp’로 표시], 이를 발현하도록 제작한 식물발현 벡터 및 이에 의해 생산되는 단백질의 당구조를 나타낸다.
도 2D는 전립선암 항원 단백질인 PAP와 IgG Fc region이 융합된 Fc-융합체 단백질에 IgM c-말단 유래 tailpiece(μtp) 및 ER retention signal peptide인 KDEL(K로 표시)을 추가하여[종합하여‘PAP-Fc μtpK’로 표시], 이를 발현하도록 제작한 식물발현 벡터 및 이에 의해 생산되는 단백질의 당구조를 나타낸다.
도 3은 재조합 식물발현 벡터로 형질전환시킨 식물에 대장암 백신 단백질 4종(GA-Fc αtp, GA-Fc αtpK, GA-Fc μtp, GA-Fc μtpK) 및 전립선 백신 단백질 4종(PAP-Fc αtp, PAP-Fc αtpK, PAP-Fc μtp, PAP-Fc μtpK)의 유전자가 삽입된 것을 PCR 방법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 재조합 식물발현 벡터로 형질전환시킨 식물에서 대장암 백신 단백질 4종(GA-Fc αtp, GA-Fc αtpK, GA-Fc μtp, GA-Fc μtpK) 및 전립선 백신 단백질 4종(PAP-Fc αtp, PAP-Fc αtpK, PAP-Fc μtp, PAP-Fc μtpK)의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 재조합 식물발현 벡터로 형질전환시킨 식물에서 대장암 백신 단백질 4종(GA-Fc αtp, GA-Fc αtpK, GA-Fc μtp, GA-Fc μtpK) 및 전립선 백신 단백질 4종(PAP-Fc αtp, PAP-Fc αtpK, PAP-Fc μtp, PAP-Fc μtpK)을 정제하여 SDS-PAGE 방법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 대장암 백신 단백질 4종(GA-Fc αtp, GA-Fc αtpK, GA-Fc μtp, GA-Fc μtpK) 및 전립선 백신 단백질 4종(PAP-Fc αtp, PAP-Fc αtpK, PAP-Fc μtp, PAP-Fc μtpK)을 SEC-HPLC(Size exclusion chromatography-High-performance liquid chromatography)를 이용하여 크기에 의한 분리 및 상태를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 1B는 대장암 항원 단백질인 GA733(GA로 표시)과 IgG Fc region이 융합된 Fc-융합체 단백질에 IgA c-말단 유래 tailpiece(αtp) 및 ER retention signal peptide인 KDEL(K로 표시)을 추가하여[종합하여‘GA-Fc αtpK’로 표시], 이를 발현하도록 제작한 식물발현 벡터 및 이에 의해 생산되는 단백질의 당구조를 나타낸다.
도 1C는 대장암 항원 단백질인 GA733(GA로 표시)과 IgG Fc region이 융합된 Fc-융합체 단백질에 IgM c-말단 유래 tailpiece(μtp)를 추가하여[종합하여‘GA-Fc μtp’로 표시], 이를 발현하도록 제작한 식물발현 벡터 및 이에 의해 생산되는 단백질의 당구조를 나타낸다.
도 1D는 대장암 항원 단백질인 GA733(GA로 표시)과 IgG Fc region이 융합된 Fc-융합체 단백질에 IgM c-말단 유래 tailpiece(μtp) 및 ER retention signal peptide인 KDEL(K로 표시)을 추가하여[종합하여‘GA-Fc μtpK’로 표시], 이를 발현하도록 제작한 식물발현 벡터 및 이에 의해 생산되는 단백질의 당구조를 나타낸다.
도 2A는 전립선암 항원 단백질인 PAP와 IgG Fc region이 융합된 Fc-융합체 단백질에 IgA c-말단 유래 tailpiece(αtp)를 추가하여[종합하여‘PAP-Fc αtp’로 표시], 이를 발현하도록 제작한 식물발현 벡터 및 이에 의해 생산되는 단백질의 당구조를 나타낸다.
도 2B는 전립선암 항원 단백질인 PAP와 IgG Fc region이 융합된 Fc-융합체 단백질에 IgA c-말단 유래 tailpiece(αtp) 및 ER retention signal peptide인 KDEL(K로 표시)을 추가하여[종합하여‘PAP-Fc αtpK’로 표시], 이를 발현하도록 제작한 식물발현 벡터 및 이에 의해 생산되는 단백질의 당구조를 나타낸다.
도 2C는 전립선암 항원 단백질인 PAP와 IgG Fc region이 융합된 Fc-융합체 단백질에 IgM c-말단 유래 tailpiece(μtp)를 추가하여[종합하여‘PAP-Fc μtp’로 표시], 이를 발현하도록 제작한 식물발현 벡터 및 이에 의해 생산되는 단백질의 당구조를 나타낸다.
도 2D는 전립선암 항원 단백질인 PAP와 IgG Fc region이 융합된 Fc-융합체 단백질에 IgM c-말단 유래 tailpiece(μtp) 및 ER retention signal peptide인 KDEL(K로 표시)을 추가하여[종합하여‘PAP-Fc μtpK’로 표시], 이를 발현하도록 제작한 식물발현 벡터 및 이에 의해 생산되는 단백질의 당구조를 나타낸다.
도 3은 재조합 식물발현 벡터로 형질전환시킨 식물에 대장암 백신 단백질 4종(GA-Fc αtp, GA-Fc αtpK, GA-Fc μtp, GA-Fc μtpK) 및 전립선 백신 단백질 4종(PAP-Fc αtp, PAP-Fc αtpK, PAP-Fc μtp, PAP-Fc μtpK)의 유전자가 삽입된 것을 PCR 방법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 재조합 식물발현 벡터로 형질전환시킨 식물에서 대장암 백신 단백질 4종(GA-Fc αtp, GA-Fc αtpK, GA-Fc μtp, GA-Fc μtpK) 및 전립선 백신 단백질 4종(PAP-Fc αtp, PAP-Fc αtpK, PAP-Fc μtp, PAP-Fc μtpK)의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 재조합 식물발현 벡터로 형질전환시킨 식물에서 대장암 백신 단백질 4종(GA-Fc αtp, GA-Fc αtpK, GA-Fc μtp, GA-Fc μtpK) 및 전립선 백신 단백질 4종(PAP-Fc αtp, PAP-Fc αtpK, PAP-Fc μtp, PAP-Fc μtpK)을 정제하여 SDS-PAGE 방법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 대장암 백신 단백질 4종(GA-Fc αtp, GA-Fc αtpK, GA-Fc μtp, GA-Fc μtpK) 및 전립선 백신 단백질 4종(PAP-Fc αtp, PAP-Fc αtpK, PAP-Fc μtp, PAP-Fc μtpK)을 SEC-HPLC(Size exclusion chromatography-High-performance liquid chromatography)를 이용하여 크기에 의한 분리 및 상태를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
거대분자구조 다량체 단백질을 생산하는 식물체의 제조
대장암 세포 표면 특이 단백질 GA733(서열번호 1)과 human IgG1 Fc 영역(서열번호 7)이 융합된 Fc-융합체를 구축하고, 구축한 Fc-융합체의 c-말단에 IgA와 IgM 항체의 존재하는 tailpiece [αtp (IgA tailpiece, 서열번호 11)와 μtp (IgM tailpiece, 서열번호 9)]를 추가하여 이를 발현하도록 하는 식물발현벡터 구축하였다. 이를 pBI121 바이너리 벡터(binary vector)에 삽입하여 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터(CaMV 35S promoter)와 작동가능하게 연결하여 식물발현벡터를 제작하였다.
또한 ER retention signal peptide인 KDEL 추가하여 도 1과 같이 4가지 형태(GA-Fc αtp, GA-Fc αtpK, GA-Fc μtp 그리고 GA-Fc μtpK)의 거대분자 융합 백신 단백질 발현 시스템을 확립하였다.
마찬가지로 전립선 암 항원인 PAP 단백질(prostatic acid phosphatase, 서열번호 3) 및 human IgG1 Fc 영역(서열번호 7)이 융합된 Fc-융합체를 구축하였다, 구축한 Fc-융합체의 c-말단에 IgA와 IgM 항체의 존재하는 tailpiece [αtp (IgA tailpiece, 서열번호 11)와 μtp (IgM tailpiece, 서열번호 9)]를 추가하여 식물발현벡터 구축하였다. 또한 ER retention signal peptide인 KDEL 추가하여 도 2와 같이 4가지 형태(PAP-Fc αtp, PAP-Fc αtpK, PAP-Fc μtp 그리고 PAP-Fc μtpK)의 거대분자 융합 백신 단백질 발현 시스템을 확립하였다.
상기 구축된 각각의 식물 발현 벡터들을 Agrobacterium을 이용하여 담배 (Nicotiana tabacum) 식물 잎에서 캘러스 (callus) 유도한다. 생성된 캘러스에서 형질전환 식물체를 확보하고, Kanamycin 항생제가 함유된 식물배지를 이용하여 in vitro에서 형질전환 식물체를 선별하였다.
<실시예 2>
거대분자구조 면역원성 유전자 확인
상기 <실시예 1>에서 선별된 식물체의 잎으로부터 추출물을 제조하고, PCR 방법을 이용하여 전술한 8종의 단백질의 유전자 발현을 확인하였다.
구체적으로는 거대분자구조 대장암 백신 단백질 4종(GA-Fc αtp, GA-Fc αtpK, GA-Fc μtp, GA-Fc μtpK) 및 거대분자구조 전립선 백신 단백질 4종(PAP-Fc αtp, PAP-Fc αtpK, PAP-Fc μtp, PAP-Fc μtpK)을 발현하는 상기 형질전환 식물의 잎으로부터 genomic DNA를 DNeasy kit(Quiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 분리 정제하였다. 약 50~100g의 식물 잎을 채취하여 액체질소(liquid nitrogen)에 의해 동결시킨 후, 추출 과정을 통해 DNA를 획득하였다. ?득한 genomic DNA를 주형으로 하여 백신 후보 단백질 (GA733, PAP)의 프라이머(primer)와 tailpiece 프라이머(primer)를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR의 반응 조건은 94℃에서 30초, 65℃에서 20초, 72℃에서 30초이며, 이를 27회 반복하였다. 그 다음, 전기영동을 실시하여 유전자 삽입을 확인하였다.
그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 형질전환된 식물의 잎에 거대분자 대장암 백신 단백질 4종(GA-Fc αtp, GA-Fc αtpK, GA-Fc μtp, GA-Fc μtpK) 및 거대분자 전립선 백신 단백질 4종(PAP-Fc αtp, PAP-Fc αtpK, PAP-Fc μtp, PAP-Fc μtpK)의 유전자가 삽입되어진 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 3>
거대분자구조 면역원성 단백질 발현 확인
상기 <실시예 1>에서 선별된 식물체의 잎으로부터 추출물을 제조하고, western blot 방법으로 분석하여 전술한 8종의 단백질의 발현을 확인하였다.
구체적으로는 거대분자구조 대장암 백신 단백질 4종(GA-Fc αtp, GA-Fc αtpK, GA-Fc μtp, GA-Fc μtpK) 및 거대분자구조 전립선 백신 단백질 4종(PAP-Fc αtp, PAP-Fc αtpK, PAP-Fc μtp, PAP-Fc μtpK)을 발현하는 상기 형질전환 식물에서 각각 100 mg의 잎을 채취하여 300μl의 1x PBS(NcCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4)에 넣어준 후 파쇄하였다. 파쇄한 잎의 상층액을 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동을 하였고, 니크로섬유소막(nitrocellulose)에 transfer를 거친 후 5%의 스킴밀크(skim milk, Fluka, Buchs, Switzerland)를 이용하여 4℃에서 16시간 동안 blocking 하였다. 1차 항체(primary antibody)로 anti-EpCAM/TROP1(R&D system, Minneapolis, MN) 및 anti-PAP를 처리한 후, 2차 항체(Secondary antibody)로 anti-mouse IgG H+L(Bethyl, Montgomerty, TX)를 1:5,000 비율로 희석하여 처리하였다. 그 다음 1x PBS(Tween 0.1 %) 버퍼로 10분씩 3번 membrane washing한 후, Membrane에 있는 버퍼를 제거하였고, Supersignal chemiluminescence substrate(Thermo, Fisher Scientific, Roskilde, Rosilde, Denmark)을 처리하여 반응시킨 후 X-ray 필름에 감광하였다.
그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, 상기 형질전환된 식물의 잎에서 4종의 거대분자구조 대장암 백신 단백질(GA-Fc αtp, GA-Fc αtpK, GA-Fc μtp, GA-Fc μtpK) 및 4종의 거대분자구조 전립선 백신 단백질(PAP-Fc αtp, PAP-Fc αtpK, PAP-Fc μtp, PAP-Fc μtpK)이 발현되는 것을 확인하였고, 대장암 백신 단백질과 전립선 백신 단백질은 각각 약 68kDa, 78kDa의 크기를 갖는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 4>
거대분자구조 면역원성 단백질 정제
상기 <실시예 3>에서 확인한 식물체의 잎으로부터 발현되는 8종의 단백질을 SDS-PAGE 방법으로 정제하였다.
구체적으로는 4종의 거대분자구조 대장암 백신 단백질(GA-Fc αtp, GA-Fc αtpK, GA-Fc μtp, GA-Fc μtpK) 및 4종의 거대분자구조 전립선 백신 단백질 (PAP-Fc αtp, PAP-Fc αtpK, PAP-Fc μtp, PAP-Fc μtpK)을 발현하는 상기 형질전환 식물 잎에 추출 완충액 (37.5 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 15 mM EDTA, 75 mM 시트르산 나트륨, 및 0.2 % 티오황산나트륨)을 넣고 호모게나이즈를 실시하였다. 4℃에서 30분 동안 4,800×g로 원심분리한 후, 상등액을 Miracloth(Biosciences, La Jolla, CA, USA)로 여과하였고, 아세트산을 이용하여 pH를 5.1로 조정하였다. 그 다음 상층액을 30분 동안 10,200×g로 원심분리 하였고, 상층액을 수득하여 3M Tris-HCl를 첨가하여 pH를 중성으로 조정하였다. 그 다음 전체 가용성 단백질을 차가운 방에서 밤새 배양한 후, 황산암모늄으로 침전시킨 다음, 4℃에서 30분 동안 원심분리 하였다. 펠렛을 추출 버퍼의 초기 부피의 1/10로 재현탁한 후, 수득된 용액을 4℃에서 30분 동안 10,200×g로 원심분리 하였고, 그 다음 식물 추출물을 protein A(GE Healthcare, Sweden, NJ, USA) column에 flow하여 정제하였다. Nano-drop (Biotek, Highland, VT, USA)을 사용하여 단백질 농도를 측정하고 정제된 단백질로 SDS-PAGE를 실시하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
<
실시예
5>
거대분자구조 면역원성 단백질 특성 확인
상기 <실시예 4>에서 정제한 8종의 단백질을 SEC-HPLC (Size exclusion chromatography-High-performance liquid chromatography) 방법으로 특성을 분석하였다.
상기 정제한 4종의 거대분자구조 대장암 백신 단백질(GA-Fc αtp, GA-Fc αtpK, GA-Fc μtp, GA-Fc μtpK) 및 4종의 거대분자구조 전립선 백신 단백질 (PAP-Fc αtp, PAP-Fc αtpK, PAP-Fc μtp, PAP-Fc μtpK)로 SEC-HPLC를 실시하였다. 25℃에서 Agilnet Bio SEC-5 column을 사용하여 분석하였고, elution은 0.3 M sodium chloride를 포함하는 0.1 M sodium phosphate로 구성된 이동상(mobile phase)으로 pH 7.0 조건에서 실시하였으며, flow rate은 1 mL/min으로 실시하였다.
그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 8종의 거대분자구조 백신 단백질은 IgM(Immunogloblin M)과 비슷한 크기로 존재하는 것으로 나타났고, 같은 시간에 동일한 양상을 나타내는 것을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 거대분자구조 백신 단백질은 뛰어난 면역원성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 6>
면역원성 비교 및 백신 성능 평가
본 발명에서 상기 <실시예 1>과 같은 방법으로 식물 특이적 다량체화를 유도하여 제작한 거대분자구조 백신 단백질(면역원성 다량체 항원 단백질)에 대해서, 기존에 알려진 박테리아 또는 동물세포 등에서 제작된 다량체 Fc-융합체와 비교하여 면역원성을 비교 평가하였다.
그 결과 본 발명의 거대분자구조 백신 단백질은 뛰어난 면역원성 및 암 성장 억제효과를 보였으며, 특히 adjuvant 없이도 면역증폭 효과가 뛰어난 것을 확인하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 (a) 항원성 단백질을 포함하는 면역 반응 도메인(immune response domain), 항체 Fc 단편(Fc antibody fragment)을 포함하는 표적 결합 도메인(target binding domain), 및 IgM 또는 IgA 유래 테일피스(tailpiece)를 포함하는 다량체화 도메인(polymerization domain)을 포함하는 키메릭 항원(chimeric antigen)을 발현하는 형질전환 식물체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환 식물체로부터 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 면역원성 다량체 항원 단백질의 제조방법과 이를 위한 식물체에 대한 것이다.
본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법을 통해 안전하고 경제적으로 목적 단백질을 대량 생산할 수 있으며, 이에 의해 제조된 면역원성 다당체 항원 단백질은 거대 4차원 구조를 지님으로서 면역 반응 증폭(boosting) 효과가 뛰어나서, 면역보조제(adjuvant)의 사용 없이도, 숙주 동물에서 항체 생성 능력이 뛰어나므로 산업상 이용가능성이 높다.
<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation
<120> Method for preparing polymerized antigen protein with high
immunogenicity and Plant for implementing the same
<130> NP17-0009P
<150> KR 10-2017-0046943
<151> 2017-04-11
<160> 26
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 249
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GA733
<400> 1
Thr Ala Thr Phe Ala Ala Ala Gln Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr
1 5 10 15
Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gln Cys Gln Cys
20 25 30
Thr Ser Val Gly Ala Gln Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala
35 40 45
Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg
50 55 60
Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gln Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp
65 70 75 80
Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gln Cys Asn Gly
85 90 95
Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp
100 105 110
Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile
115 120 125
Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys
130 135 140
Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gln Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gln Leu
145 150 155 160
Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr
165 170 175
Ile Asp Leu Val Gln Asn Ser Ser Gln Lys Thr Gln Asn Asp Val Asp
180 185 190
Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser
195 200 205
Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gln Leu
210 215 220
Asp Leu Asp Pro Gly Gln Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala
225 230 235 240
Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys
245
<210> 2
<211> 747
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GA733
<400> 2
acggcgactt ttgccgcagc tcaggaagaa tgtgtctgtg aaaactacaa gctggccgta 60
aactgctttg tgaataataa tcgtcaatgc cagtgtactt cagttggtgc acaaaatact 120
gtcatttgct caaagctggc tgccaaatgt ttggtgatga aggcagaaat gaatggctca 180
aaacttggga gaagagcaaa acctgaaggg gccctccaga acaatgatgg gctttatgat 240
cctgactgcg atgagagcgg gctctttaag gccaagcagt gcaacggcac ctccacgtgc 300
tggtgtgtga acactgctgg ggtcagaaga acagacaagg acactgaaat aacctgctct 360
gagcgagtga gaacctactg gatcatcatt gaactaaaac acaaagcaag agaaaaacct 420
tatgatagta aaagtttgcg gactgcactt cagaaggaga tcacaacgcg ttatcaactg 480
gatccaaaat ttatcacgag tattttgtat gagaataatg ttatcactat tgatctggtt 540
caaaattctt ctcaaaaaac tcagaatgat gtggacatag ctgatgtggc ttattatttt 600
gaaaaagatg ttaaaggtga atccttgttt cattctaaga aaatggacct gacagtaaat 660
ggggaacaac tggatctgga tcctggtcaa actttaattt attatgttga tgaaaaagca 720
cctgaattct caatgcaggg tctaaaa 747
<210> 3
<211> 384
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAP
<400> 3
Met Ala Thr Gln Arg Arg Ala Asn Pro Ser Ser Leu His Leu Ile Thr
1 5 10 15
Val Phe Ser Leu Leu Ala Ala Val Val Ser Ala Glu Val Asp Lys Glu
20 25 30
Leu Lys Phe Val Thr Leu Val Phe Arg His Gly Asp Arg Ser Pro Ile
35 40 45
Asp Thr Phe Pro Thr Asp Pro Ile Lys Glu Ser Ser Trp Pro Gln Gly
50 55 60
Phe Gly Gln Leu Thr Gln Leu Gly Met Glu Gln His Tyr Glu Leu Gly
65 70 75 80
Glu Tyr Ile Arg Lys Arg Tyr Arg Lys Phe Leu Asn Glu Ser Tyr Lys
85 90 95
His Glu Gln Val Thr Ile Arg Ser Thr Asp Val Asp Arg Thr Leu Met
100 105 110
Ser Ala Met Thr Asn Leu Ala Ala Leu Phe Pro Pro Glu Gly Val Ser
115 120 125
Ile Trp Asn Pro Ile Leu Leu Trp Gln Pro Ile Pro Val His Thr Val
130 135 140
Pro Leu Ser Glu Asp Gln Leu Leu Tyr Leu Pro Phe Arg Asn Cys Pro
145 150 155 160
Arg Phe Gln Glu Leu Glu Ser Glu Thr Leu Lys Ser Glu Glu Phe Gln
165 170 175
Lys Arg Leu His Pro Tyr Lys Asp Phe Ile Ala Thr Leu Gly Lys Leu
180 185 190
Ser Gly Leu His Gly Gln Asp Leu Phe Gly Ile Trp Ser Lys Val Tyr
195 200 205
Asp Pro Leu Tyr Cys Glu Ser Val His Asn Phe Thr Leu Pro Ser Trp
210 215 220
Ala Thr Glu Asp Thr Met Thr Lys Leu Arg Glu Leu Ser Glu Leu Ser
225 230 235 240
Leu Leu Ser Leu Tyr Gly Ile His Lys Gln Lys Glu Lys Ser Arg Leu
245 250 255
Gln Gly Gly Val Leu Val Asn Glu Ile Leu Asn His Met Lys Arg Ala
260 265 270
Thr Gln Ile Pro Ser Tyr Lys Lys Leu Ile Met Tyr Ser Ala His Asp
275 280 285
Thr Thr Val Ser Gly Leu Gln Met Ala Leu Asp Val Tyr Asn Gly Leu
290 295 300
Leu Pro Pro Tyr Ala Ser Cys His Leu Thr Glu Leu Tyr Phe Glu Lys
305 310 315 320
Gly Glu Tyr Phe Val Glu Met Tyr Tyr Arg Asn Glu Thr Gln His Glu
325 330 335
Pro Tyr Pro Leu Met Leu Pro Gly Cys Ser Pro Ser Cys Pro Leu Glu
340 345 350
Arg Phe Ala Glu Leu Val Gly Pro Val Ile Pro Gln Asp Trp Ser Thr
355 360 365
Glu Cys Met Thr Thr Asn Ser His Gln Gly Thr Glu Asp Ser Thr Asp
370 375 380
<210> 4
<211> 1158
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAP
<400> 4
atggctactc aacgaagggc aaaccctagc tctctccatc taattactgt attctctctg 60
ctagctgctg tcgtctccgc tgaggtcgac aaggagttga agtttgtgac tttggtgttt 120
cggcatggag accgaagtcc cattgacacc tttcccactg accccataaa ggaatcctca 180
tggccacaag gatttggcca actcacccag ctgggcatgg agcagcatta tgaacttgga 240
gagtatataa gaaagagata tagaaaattc ttgaatgagt cctataaaca tgaacaggtt 300
tatattcgaa gcacagacgt tgaccggact ttgatgagtg ctatgacaaa cctggcagcc 360
ctgtttcccc cagaaggtgt cagcatctgg aatcctatcc tactctggca gcccatcccg 420
gtgcacacag ttcctctttc tgaagatcag ttgctatacc tgcctttcag gaactgccct 480
cgttttcaag aacttgagag tgagactttg aaatcagagg aatttcagaa gaggctgcac 540
ccttataagg attttatagc taccttggga aaactttcag gattacatgg ccaggacctt 600
tttggaattt ggagtaaagt ctacgaccct ttatattgtg agagtgttca caatttcact 660
ttaccctcct gggccactga ggacaccatg actaagttga gagaattgtc agaattgtcc 720
ctcctgtccc tctatggtat tcacaagcag aaagagaaat ctaggctcca agggggtgtc 780
ctggtcaatg aaatcctcaa tcacatgaag agagcaactc agataccaag ctacaaaaaa 840
cttatcatgt attctgcgca tgacactact gtgagtggcc tacagatggc gctagatgtt 900
tacaacggac tccttcctcc ctatgcttct tgccacttga cggaattgta ctttgagaag 960
ggggagtact ttgtggagat gtactatcgg aatgagacgc agcacgagcc gtatcccctc 1020
atgctacctg gttgcagccc tagctgtcct ctggagaggt ttgctgagct ggttggccct 1080
gtgatccctc aagactggtc cacggagtgt atgaccacaa acagccatca aggtactgag 1140
gacagtacag atactagt 1158
<210> 5
<211> 192
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc fragment of IgG1
<400> 5
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
1 5 10 15
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
20 25 30
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
35 40 45
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
50 55 60
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
65 70 75 80
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
85 90 95
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
100 105 110
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
115 120 125
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
130 135 140
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
145 150 155 160
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
165 170 175
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
180 185 190
<210> 6
<211> 576
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc fragment of IgG1
<400> 6
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 60
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 120
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 180
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 240
accatctcga aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 300
cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 360
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccag agaacaacta caagaccacg 420
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 480
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctctgtga tgcatgaggc tctgcacaac 540
cactacacgc agaagagcct ctccctgtcc ccgggt 576
<210> 7
<211> 237
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc fragment of IgG1 containing hinge region
<400> 7
Ala Ala Ala Asp Leu Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
20 25 30
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
35 40 45
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
50 55 60
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
65 70 75 80
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
85 90 95
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
100 105 110
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
115 120 125
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
130 135 140
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
145 150 155 160
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
165 170 175
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
180 185 190
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
195 200 205
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
210 215 220
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230 235
<210> 8
<211> 711
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc fragment of IgG1 containing hinge region
<400> 8
gcggccgcag atctcgttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 60
ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 120
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 180
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 240
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 300
caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 360
gcccccatcg agaaaaccat ctcgaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 420
accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 480
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccagagaac 540
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag 600
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc tgtgatgcat 660
gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtccccggg t 711
<210> 9
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgM tailpiece
<400> 9
Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala
1 5 10 15
Gly Thr Cys Tyr
20
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgM tailpiece
<400> 10
ggtaaaccca ccctgtacaa cgtgtccctg gtcatgtccg acacagctgg cacctgctac 60
60
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgA tailpiece
<400> 11
Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Met Ala Glu Val Asp Gly
1 5 10 15
Thr Cys Tyr
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgA tailpiece
<400> 12
ggtaaaccca cccatgtaaa tgtgtctgtt gttatggctg aggttgatgg cacatgttac 60
60
<210> 13
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KDEL for ER retention signal
<400> 13
Lys Asp Glu Leu
1
<210> 14
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HDEL for ER retention signal
<400> 14
His Asp Glu Leu
1
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEKDEL for ER retention signal
<400> 15
Ser Glu Lys Asp Glu Leu
1 5
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KHDEL for ER retention signal
<400> 16
Lys His Asp Glu Leu
1 5
<210> 17
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KEEL for ER retention signal
<400> 17
Lys Glu Glu Leu
1
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEHDEL for ER retention signal
<400> 18
Ser Glu His Asp Glu Leu
1 5
<210> 19
<211> 514
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GA-Fc atpK
<400> 19
Met Thr Ala Thr Phe Ala Ala Ala Gln Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn
1 5 10 15
Tyr Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gln Cys Gln
20 25 30
Cys Thr Ser Val Gly Ala Gln Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala
35 40 45
Ala Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly
50 55 60
Arg Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gln Asn Asn Asp Gly Leu Tyr
65 70 75 80
Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gln Cys Asn
85 90 95
Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr
100 105 110
Asp Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp
115 120 125
Ile Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser
130 135 140
Lys Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gln Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gln
145 150 155 160
Leu Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile
165 170 175
Thr Ile Asp Leu Val Gln Asn Ser Ser Gln Lys Thr Gln Asn Asp Val
180 185 190
Asp Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu
195 200 205
Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gln
210 215 220
Leu Asp Leu Asp Pro Gly Gln Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys
225 230 235 240
Ala Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Arg Thr Ser Ala Ala Ala
245 250 255
Asp Leu Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
260 265 270
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
275 280 285
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
290 295 300
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
305 310 315 320
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
325 330 335
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
340 345 350
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
355 360 365
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
370 375 380
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
385 390 395 400
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
405 410 415
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
420 425 430
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
435 440 445
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
450 455 460
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
465 470 475 480
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Lys Pro Thr His Val
485 490 495
Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys Tyr Lys Asp
500 505 510
Glu Leu
<210> 20
<211> 1542
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GA-Fc atpK
<400> 20
atgacggcga cttttgccgc agctcaggaa gaatgtgtct gtgaaaacta caagctggcc 60
gtaaactgct ttgtgaataa taatcgtcaa tgccagtgta cttcagttgg tgcacaaaat 120
actgtcattt gctcaaagct ggctgccaaa tgtttggtga tgaaggcaga aatgaatggc 180
tcaaaacttg ggagaagagc aaaacctgaa ggggccctcc agaacaatga tgggctttat 240
gatcctgact gcgatgagag cgggctcttt aaggccaagc agtgcaacgg cacctccacg 300
tgctggtgtg tgaacactgc tggggtcaga agaacagaca aggacactga aataacctgc 360
tctgagcgag tgagaaccta ctggatcatc attgaactaa aacacaaagc aagagaaaaa 420
ccttatgata gtaaaagttt gcggactgca cttcagaagg agatcacaac gcgttatcaa 480
ctggatccaa aatttatcac gagtattttg tatgagaata atgttatcac tattgatctg 540
gttcaaaatt cttctcaaaa aactcagaat gatgtggaca tagctgatgt ggcttattat 600
tttgaaaaag atgttaaagg tgaatccttg tttcattcta agaaaatgga cctgacagta 660
aatggggaac aactggatct ggatcctggt caaactttaa tttattatgt tgatgaaaaa 720
gcacctgaat tctcaatgca gggtctaaaa cggactagtg cggccgcaga tctcgttgag 780
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 840
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 900
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 960
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 1020
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1080
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1140
tcgaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1200
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1260
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccagagaaca actacaagac cacgcctccc 1320
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1380
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GA-Fc utpK
<400> 21
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20 25 30
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35 40 45
Ala Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly
50 55 60
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Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
325 330 335
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Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
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Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
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<213> Artificial Sequence
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Met Ala Thr Gln Arg Arg Ala Asn Pro Ser Ser Leu His Leu Ile Thr
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Val Phe Ser Leu Leu Ala Ala Val Val Ser Ala Glu Val Asp Lys Glu
20 25 30
Leu Lys Phe Val Thr Leu Val Phe Arg His Gly Asp Arg Ser Pro Ile
35 40 45
Asp Thr Phe Pro Thr Asp Pro Ile Lys Glu Ser Ser Trp Pro Gln Gly
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Glu Tyr Ile Arg Lys Arg Tyr Arg Lys Phe Leu Asn Glu Ser Tyr Lys
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165 170 175
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180 185 190
Ser Gly Leu His Gly Gln Asp Leu Phe Gly Ile Trp Ser Lys Val Tyr
195 200 205
Asp Pro Leu Tyr Cys Glu Ser Val His Asn Phe Thr Leu Pro Ser Trp
210 215 220
Ala Thr Glu Asp Thr Met Thr Lys Leu Arg Glu Leu Ser Glu Leu Ser
225 230 235 240
Leu Leu Ser Leu Tyr Gly Ile His Lys Gln Lys Glu Lys Ser Arg Leu
245 250 255
Gln Gly Gly Val Leu Val Asn Glu Ile Leu Asn His Met Lys Arg Ala
260 265 270
Thr Gln Ile Pro Ser Tyr Lys Lys Leu Ile Met Tyr Ser Ala His Asp
275 280 285
Thr Thr Val Ser Gly Leu Gln Met Ala Leu Asp Val Tyr Asn Gly Leu
290 295 300
Leu Pro Pro Tyr Ala Ser Cys His Leu Thr Glu Leu Tyr Phe Glu Lys
305 310 315 320
Gly Glu Tyr Phe Val Glu Met Tyr Tyr Arg Asn Glu Thr Gln His Glu
325 330 335
Pro Tyr Pro Leu Met Leu Pro Gly Cys Ser Pro Ser Cys Pro Leu Glu
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355 360 365
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370 375 380
Ala Ala Ala Asp Leu Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
385 390 395 400
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
405 410 415
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
420 425 430
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
435 440 445
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450 455 460
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
465 470 475 480
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
485 490 495
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
565 570 575
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
580 585 590
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
595 600 605
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Lys Pro
610 615 620
Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys
625 630 635 640
Tyr Lys Asp Glu Leu
645
<210> 24
<211> 1941
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAP-Fc atpK
<400> 24
atggctactc aacgaagggc aaaccctagc tctctccatc taattactgt attctctctg 60
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAP-Fc utpK
<400> 25
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1 5 10 15
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20 25 30
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100 105 110
Ser Ala Met Thr Asn Leu Ala Ala Leu Phe Pro Pro Glu Gly Val Ser
115 120 125
Ile Trp Asn Pro Ile Leu Leu Trp Gln Pro Ile Pro Val His Thr Val
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Pro Leu Ser Glu Asp Gln Leu Leu Tyr Leu Pro Phe Arg Asn Cys Pro
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275 280 285
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Leu Pro Pro Tyr Ala Ser Cys His Leu Thr Glu Leu Tyr Phe Glu Lys
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Gly Glu Tyr Phe Val Glu Met Tyr Tyr Arg Asn Glu Thr Gln His Glu
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Pro Tyr Pro Leu Met Leu Pro Gly Cys Ser Pro Ser Cys Pro Leu Glu
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
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acctgctaca aagatgaact c 1941
Claims (11)
- (a) 항원성 단백질을 포함하는 면역 반응 도메인(immune response domain), 항체 Fc 단편(Fc antibody fragment)을 포함하는 표적 결합 도메인(target binding domain), 및 IgM 또는 IgA 유래 테일피스(tailpiece)를 포함하는 다량체화 도메인(polymerization domain)을 포함하는 키메릭 항원(chimeric antigen)을 발현하는 형질전환 식물체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 형질전환 식물체로부터 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 면역원성 다량체 항원 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 키메릭 항원은 소포체 저장 유도 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 표적 결합 도메인은 면역글로불린 경첩영역(hinge region), 중쇄 CH1 도메인 또는 링커를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 항원성 단백질은 대장암 항원 GA733 또는 전립선암 항원 PAP(prostatic acid phosphatase)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 항체 Fc 단편은 GA733 또는 PAP(prostatic acid phosphatase)에 특이적인 IgG의 경첩영역(hing region), CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 식물은 담배(Nicotiana tabacum)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항의 방법으로 제조된, 면역원성 다량체 항원 단백질.
- 제7항의 면역원성 다량체 항원 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 백신 조성물.
- 항원성 단백질을 포함하는 면역 반응 도메인(immune response domain), 항체 Fc 단편(Fc antibody fragment)을 포함하는 표적 결합 도메인(target binding domain), 및 IgM 또는 IgA 유래 테일피스(tailpiece)를 포함하는 키메릭 항원(chimeric antigen)을 발현하도록 작제된 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환 시키는 단계
를 포함하는 면역원성 다량체 항원 단백질을 생산하는 형질전환 식물의 제조방법.
- 제9항에 있어서, 상기 키메릭 항원은 소포체 저장 유도 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제9항의 방법으로 제조된, 면역원성 다량체 항원 단백질을 생산하는 식물체.
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