KR20180114225A - (2s,4r)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 결정 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

일 양상에서, 본 발명은, 네프릴리신 저해 활성을 갖는, 하기 구조의 결정형 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다:

(I').
다른 양상에서, 본 발명은 이 결정형을 포함하는 약학적 조성물; 그 결정형 및 그것의 가용성 형태 (I)를 사용하는 방법; 및 가용성 (I) 및 결정형 (I')을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

(2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 결정 및 그 용도

[관련 출원에 대한 상호 참조]

본 출원은, 출원일이 각각 2016년 3월 8일 및 2016년 6월 6일인 U.S. 가출원 번호 62/305,393 및 62/346,336의 우선권을 주장하고, 이들 개시는 전체가 참조로 본 명세서에 통합되어 있다.

[기술 분야]

본 발명은, 네프릴리신-저해 활성을 갖는 신규 결정형에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 화합물을 포함하는 약학적 조성물, 화합물을 제조하는 방법, 및 고혈압, 심부전, 및 신장 질환과 같은 질병을 치료하기 위해 화합물을 이용하는 방법에 관한 것이다.

네프릴리신 (Neprilysin) (중성 엔도펩티다제, EC 3.4.24.11) (NEP)은 뇌, 신장, 폐, 위장관, 심장, 및 말초 맥관 구조를 포함한, 많은 기관 및 조직에서 발견되는 내피 멤브레인 결합된 Zn^{2 +} 메탈로펩티다제 (metallopeptidase)이다. NEP는 다수의 내인성 펩티드, 예컨대 엔케팔린 (enkephalin), 순환하는 브라디키닌 (circulating bradykinin), 안지오텐신 펩티드, 및 나트륨성이뇨 펩티드 (natriuretic peptides)를 분해 및 불활성화시키고, 나트륨성이뇨 펩티드는 혈관 확장 및 나트륨배설항진 (natriuresis)/이뇨, 뿐만아니라 심장 비대 (cardiac hypertrophy) 및 심실 섬유증 (ventricular fibrosis)의 억제를 포함한, 여러 효과들을 갖는다. 그러므로, NEP는 혈압 항상성 및 심혈관 건강에서 중요한 역할을 한다.

NEP 저해제, 예를 들어 티오르판 (thiorphan), 칸독사트릴 (candoxatril), 및 칸독사트릴라트 (candoxatrilat)는 강력한 치료제로서 연구되어 왔다. NEP와 안지오텐신-I 전환 효소 (angiotensin-I converting enzyme: ACE) 둘다를 저해하는 화합물들이 또한 알려져 있고, 이들은 오마파트릴라트 (omapatrilat), 겜파트릴라트 (gempatrilat), 및 삼파트릴라트 (sampatrilat)를 포함한다. 바소펩티다제 저해제로서 지칭되는, 이러한 종류의 화합물이 Robl et al. (1999) Exp. Opin. Ther. Patents 9(12): 1665-1677에 기술되어 있다.

수많은 NEP 저해제가 Fleury et al에 대한 U.S. 특허 번호. 9,126,956에 기술되어 있다. 이러한 화합물 중 많은 것이 하나 이상의 바람직한 특성을 갖는다. 그러나, 치료제로서 NEP 저해제 화합물을 효과적으로 사용하기 위해서, 용이하게 제조될 수 있고, 또한 허용가능한 화학적 및 물리적 안정성을 갖는 고체-상 형태를 갖는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 비교적 고온에서 열적으로 안정하여 물질의 가공 및 저장을 용이하게 하는 물리적 형태, 및 용해, 생체이용성 및 흡수를 증가시켜 바람직한 약물 전달 특성을 허용하는 작은 결정 크기를 갖는 것이 바람직할 것이다. 결정 고체는 일반적으로 제조된 제품의 순도 및 안정성을 향상시키기 위해, 비결정형보다 바람직하다. 그러나, 유기 화합물의 결정형의 형성은 매우 예측하기 어렵다. 유기 화합물의 형태가 결정성이 될 지를 예측하기 위한 신뢰할 수 있는 방법은 존재하지 않는다. 더욱이, 결정형이 약학적 작용제로서 사용하기에 바람직한 물리적 특성을 갖는 지를 예측하는 방법은 존재하지 않는다. 따라서, 비교적 높은 용융점 및 작은 결정 크기를 갖는 안정한 결정형의 요구가 존재한다.

본 발명은 네프릴리신 (NEP) 효소 저해 활성을 갖는 것으로 밝혀진 화합물 I의 신규 결정형을 제공한다. 따라서, 이 화합물은 고혈압, 폐고혈압, 심부전 및 신장 질환과 같은 상태를 치료하기 위한 치료제로서 유용하고 이점이 있을 것으로 기대된다. 화합물 I의 구조는 하기와 같다:

(I).

본 발명의 일 양상은 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산의 유리산 결정형 (화합물 I')에 관한 것이다. 일 구체예에서, 화합물 I'은 무수성이거나, 비흡습성(non-hygroscopic)이거나 또는 이 둘 모두 이다. 화합물 I'은 또한 결정형 I'라고 부를 수도 있다.

본 발명의 다른 양상은 하나 이상의 약학적 허용가능한 담체 및 화합물 I' 을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 선택적으로, AT₁ 수용체 길항제, 안지오텐신-전환 효소 저해제 (angiotensin-converting enzyme inhibitor), 포스포디에스테라제 (phosphodiesterase; PDE) 저해제, 레닌 저해제 (renin inhibitor), 이뇨제 (diuretic), 또는 이들의 조합들을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 치료제를 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물 I'은 NEP 효소 저해 활성을 가지며, 그러므로 상기 NEP 효소를 저해하거나 또는 그 펩티드 기질의 수준을 증가시킴으로써 치료되는 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 치료제로서 유용할 것으로 기대된다. 그러므로, 본 발명의 일 양상은, 화합물 I'의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 NEP 효소를 저해함으로써 치료되는 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양상은, 화합물 I'의 치료적 유효량을 대상 (subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 고혈압, 폐 고혈압, 심부전, 또는 신장 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 양상은, 화합물 I'의 NEP 효소-저해량을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상에서 NEP 효소를 저해하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양상은 화합물 I 및 이의 결정형인, 화합물 I'을 제조하는데 유용한 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양상은 약제의 제조, 특히 고혈압, 심부전 또는 신장 질환을 치료하기에 유용한 약제의 제조를 위한, 화합물 I 또는 그 결정형인, 화합물 I'의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양상은 개체에서 NEP 효소를 저해하기 위한 화합물 I 또는 화합물 I'의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양상 및 구체예가 본 명세서에 개시된다.

일 양상에서, 본 발명은 결정 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산　(I')에 관한 것이다.

본 발명의 화합물 I'은 2개의 키랄 중심을 포함하므로, 그러한 구조의 화합물이 다양한 입체이성질체 형태로 존재할 수 있다. 구체적으로, 탄소 원자가 특정 ( R,R ), ( S,S ), ( S,R ), 또는 ( R,S ) 배향 (configuration)을 가질 수 있거나, 또는 상기 배향을 갖는 입체이성질체 형태가 풍부하다. 개시되고 명명된 바와 같이 화합물 I'은 (2S,4R) 배향이다. 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면, 본 발명의 조성물 전체의 유용성이 다른 이성질체의 존재에 의해 제거되지 않는다면, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 조성물 중에 소량의 다른 입체이성질체가 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 적합한 키랄 고정상 또는 지지체를 사용하는 키랄 크로마토그래피, 또는 입체이성질체를 부분입체이성질체로 화학적으로 전환시키고, 그 부분입체이성질체를 크로마토그래피 또는 재결정과 같은 종래의 수단으로 분리시킨 후, 원래 입체이성질체를 재생시키는 것을 포함하는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 수많은 방법에 의해서 개별적인 입체이성질체를 수득할 수 있다.

본 발명의 화합물 I'은 네프릴리신 (NEP) 저해 활성을 포함하는바, 즉 효소-촉매 작용을 저해할 수 있다. 화합물의 NEP 활성을 저해하는 능력의 일 측정법은 저해상수 (inhibition constant) (pK_i)이다. 상기 pK_i 값은 해리상수 (K_i)의 기저 10에 대한 음의 로그값(-log₁₀)이고, 이는 통상적으로 몰 단위 (molar units)으로 보고된다. 본 발명의 화합물은 NEP의 pK_i ≥ 9.0을 갖는다. 화합물 (I')의 다른 특성 및 유용성이 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있는, 그 중에서도 U.S. 특허번호 9,126,956에 개시되어 있는 인 비트로 (in vitro) 및 인 비보 (in vivo) 분석법을 사용하여 입증될 수 있다.

화합물 I' 뿐만 아니라 그 합성에 사용되는 화합물은 또한, 동위원소-표지된 화합물 (isotopically-labeled compounds), 즉 화합물 중 하나 이상의 원자가 자연에서 우세하게 발견되는 원자량과 다른 원자량을 갖는 원자로 풍부해진 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명에 기술된 화합물로 혼입될 수 있는 동위원소의 예로는, 예를 들면, ²H, ³H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸O, ¹⁷O, ³⁵S, ³⁶Cl, 및 ¹⁸F를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특히, 예를 들면, 조직 분포 연구 (tissue distribution studies)에서 사용될 수 있는 트리튬 (tritium) 또는 탄소-14가 풍부한 화합물 I'; 예를 들면 더 큰 대사 안정성을 갖는 화합물을 유발하는 특히 대사부위에서 중수소가 풍부한 화합물 I'; 예를 들면, 양전자 방출 단층촬영 (Positron Emission Topography: PET) 연구에서 사용될 수 있는, ¹¹C, ¹⁸F, ¹⁵O 및 ¹³N과 같은 양전자 방출 동위원소 (positron emitting isotope)가 풍부한 화합물 I'이 유리하다.

화학 구조는 본 명세서에서 ChemDraw 소프트웨어 (Perkin Elmer, Inc., Cambridge, MA)에서 구현된 바와 같이 IUPAC 협약에 따라 명명되었다.

정의

본 발명의 화합물, 조성물, 방법 및 공정을 기재하는 경우, 달리 표시되지 않는 한 하기의 용어는 하기 의미를 갖는다. 또한, 본 명세서에서 사용된, 단수 형태 "하나의(a, an)" 및 "그(the)"는, 사용되는 문맥이 명백히 다르게 지시하지 않는 한, 상응하는 복수 형태를 포함한다. 용어 "포함하는(comprising, including)", 및 "갖는 (having)"은 포괄적인 것으로 의도되고, 기재된 요소들 외에 추가적인 요소들이 존재할 수 있다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용된, 성분의 양, 분자량과 같은 특성, 반응 조건 등을 표현하는 모든 숫자는 달리 표시되지 않으면, 모든 경우에 용어 "약(about)"에 의해 수식되는 것으로 이해된다. 따라서, 본 명세서에 기재된 숫자는 본 발명에 의해 수득하고자 하는 원하는 특성에 따라 변할 수 있는 근사값(approximation)이다. 적어도, 및 본 발명의 범위에 대한 균등론의 적용을 제한하기 위한 시도는 아니나, 각 숫자는 적어도 기재된 유효 숫자를 고려하여 통상적인 올림 기법을 적용하여 해석되어야 한다.

용어 "약(about)" 또는 "대략적으로(approximately)"은 화합물 I'의 열적 행동의 맥락으로 사용되는 경우, ± 1-3 ℃로 정의된다. 용어 "근사치(approximate)"는 소변에서 배설되는 화합물 I'의 % 용량의 맥락으로 사용되는 경우, 전형적으로 95 % 신뢰 구간의 표준 편차 또는 절반 폭의 약 두 배인 오차 범위로 정의된다. 본 개시의 다른 영역에서 용어 "근사치(approximate)"는 표준 편차 또는 데이터 값 세트의 편차 또는 분산의 양을 나타내기 위해 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "제어된-방출(controlled-release)" 은 지속된-방출(sustained-release) 및 광범위한-방출(extended-release)과 동의어이고, 개체에서 장시간에 걸쳐 전달되는 약물의 양과 관련된다. 일반적으로, 제어된-방출 정제 및 캡슐은 약 8-, 12-, 16-, 및 24-시간의 기간 동안 상기 개체로 활성물(active)을 방출한다. 반면, 용어 "즉시-방출(immediate-release)"은 전형적으로 약 30 분 미만의 적은 시간 내에 개체로 활성물을 방출하는 것을 의미한다. 용어 "지연된-방출(delayed-release)"은 일정 시간 후에 약학적 용량을 방출하는 정제 및 캡슐에 관한 것이다. 이러한 투여 형태는 일반적으로 위장에서의 방출은 예방하고 장관에서의 방출을 허용하기 위해 장용 코팅된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 문구 "화학식의(of the formula)" 또는 "화학식을 갖는(having the formula)" 또는 "구조를 갖는(having the structure)"은 제한하려는 의도가 아니고 용어 "포함하는(comprising)"이 일반적으로 사용되는 것과 동일한 방식으로 사용된다. 예를 들어, 하나의 구조가 도시되어 있는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 모든 입체이성질체 및 호변이성질체 형태가 포함되는 것으로 이해된다.

일반적으로, 약학적 고체를 기술함에 있어서, 용어 "비-용매화된(non-solvated)"는 "용매가 없는(without solvent)"을 의미한다. 따라서, 본 발명의 결정형이 "비-용매화된" 것으로서 기술되는 경우, 상기 결정 입자는 본질적으로 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 분자만을 함유함을 의미한다; 상기 형태는 다른 격자-포함 용매 분자의 상당한 양을 함유하지 않거나, 다른 의미로, 용매가 상기 결정 격자에 현저하게 혼입되지 않는다. 용어 "비-용매화된"은, 물이 용매인경우, 용어 "비-수화된(non-hydrated)"과 동의어이다. 용어 "무수물(anhydrous)"은 결정이 물, 특히 결정화의 물이 무시 가능한 정도로 함유하거나 없는 것을 의미한다. 무시 가능한 양의 물은 물이 측정될 수 있는 검출 한계를 의미한다. 예를 들어, 이 출원에서 칼 피셔(Karl Fischer)에 의한 물 함량 (% w/w)을 측정하는 것은 0.20% w/w의 정량 한계(limit of quantification; LOQ)를 가질 수 있다. 따라서, 화합물 I'에서 발견되는 물의 양은 <LOQ 또는 <0.20% w/w로서 보고될 것이다. 또한, 흡습성 물질은 흡착 또는 흡착을 통해 주위로부터 쉽게 물을 끌어당기는 물질이다. 용어 "비-흡습성(non-hygroscopic)"은 결정 표면에 수분을 흡착하거나 결정 격자로 물을 흡수하는 경향이 거의 없거나 없는 결정을 설명하는데 사용된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "용융점 (melting point)"은 고체-액체 상 변화(solid-to-liquid phase change)에 해당하는 열전이에 대해, 시차 주사 열량측정에 의해 최대 흡열 열 흐름(endothermic heat flow)이 관찰되는 온도를 의미한다.

용어 "약학적으로 허용가능한 (pharmaceutically acceptable)"은 본 발명에서 사용될 때, 생물학적으로나 또는 달리 허용될 수 없는 것이 아닌 물질을 의미한다. 예를 들면, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체 (pharmaceutically acceptable carrier)"는 허용될 수 없는 생물학적 효과를 야기하거나 조성물 중 다른 성분들과 허용될 수 없는 방식으로 상호작용하지 않으면서, 조성물에 포함되고 환자에게 투여될 수 있는 물질을 의미한다. 이와 같은 약학적으로 허용가능한 물질들은 일반적으로 독성학적 및 제조 시험의 요구되는 기준을 충족시키고, 미국 식품 의약국(U.S. Food and Drug Administration)에 의해 적합한 비활성 성분으로 확인된 물질 들을 포함한다.

용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 포유동물과 같은, 환자로의 투여를 위해 허용가능한 염기 또는 산으로부터 제조된 염 (예를 들면, 정해진 투여 용법(dosage regime)에 있어서 허용가능한 포유동물 안전성을 갖는 염)을 의미한다. 그러나, 본 발명에 포함되는 염은, 환자 투여를 목적으로 하지 않는 중간체 화합물의 염과 같이, 약학적으로 허용가능한 염일 것이 요구되지 않는 것으로 이해된다. 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용가능한 무기 또는 유기 염기, 및 약학적으로 허용가능한 무기 또는 유기산으로부터 유래할 수 있다. 또한, 화합물이 아민, 피리딘 또는 이미다졸과 같은 염기성 모이어티(moiety) 및 카르복시산 또는 테트라졸과 같은 산성 모이어티를 모두 포함하는 경우, 양쪽성 이온(zwitterion)이 형성될 수 있고, 이는 본 명세서에서 사용되는 용어 "염(salt)"의 범위에 포함된다. 약학적으로 허용가능한 무기 염기로부터 유래한 염은 암모늄염, 칼슘염, 구리염, 제2철(ferric)염, 제1철(ferrous)염, 리튬염, 마그네슘염, 제2망간(manganic)염, 제1망간(manganous)염, 칼륨염, 나트륨염 및 아연염 등을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 유기 염기로부터 유래한 염은, 아르기닌, 베타인(betaine), 카페인, 콜린, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 디에틸아민, 2-디에틸아미노에탄올, 2-디메틸아미노에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-에틸모르폴린, N-에틸피페리딘, 글루카민, 글루코사민, 히스티딘, 히드라바민, 이소프로필아민, 리신, 메틸글루카민, 모르폴린, 피페라진, 피페라딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 퓨린, 테오브로민, 트리에틸아민, 트리메틸아민, 트리프로필아민, 트로메타민 등과 같은, 치환된 아민, 고리형(cyclic) 아민, 천연(naturallyoccuring) 아민 등을 포함하는, 1차, 2차 및 3차 아민의 염을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 무기산으로부터 유래한 염은 붕산, 탄산, 할로겐화수소산 (브롬화수소산, 염화수소산, 플루오르화수소산 또는 요오드화수소산), 질산, 인산, 술팜산및 황산의 염을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 유기산으로부터 유래한 염은 지방족 히드록실산(예를 들어, 시트르산, 글루콘산, 글리콜산, 락트산, 락토바이오산, 말레산 및 타르타르산), 지방족 모노카르복실산(예를 들어, 아세트산, 부티르산, 포름산, 프로피온산 및 트리플루오로아세트산), 아미노산(예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산), 방향족 카르복실산(예를 들어, 벤조산, p-클로로벤조산, 디페닐아세트산, 겐티신산, 히푸르산, 및 트리페닐아세트산), 방향족 히드록실산(예를 들어, o-히드록시 벤조산, p-히드록시벤조산, 1-히드록시-나프탈렌-2-카르복실산 및 3-히드록시나프탈렌-2-카르복실산), 아스코르브산, 디카르복실산(예를 들어, 푸마르산, 말레산, 옥살산 및 숙신산), 글루코론산, 만델산, 뮤산, 니코틴산, 오로트산, 파모산, 판토텐산, 술폰산(예를 들어, 벤젠술폰산, 캄포술폰산, 에디실산, 에탄술폰산, 이세티온산, 메탄술폰산, 나프탈렌술폰산, 나프탈렌-1,5-디술폰산, 나프탈렌-2,6-디술폰산 및 p-톨루엔술폰산), 지나포익산(xinafoic acid) 등의 염을 포함한다.

용어 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은 치료를 필요로 하는 환자에게 투여된 경우 치료를 달성하기에 충분한 양, 즉 원하는 치료 효과를 얻는데 필요한 약물의 양을 의미한다. 예를 들면, 고혈압을 치료하기 위한 치료적 유효량은 예를 들면, 고혈압의 증상을 경감, 억제, 제거 또는 예방하거나, 또는 고혈압의 근본적인 원인을 치료하는데 필요한 화합물의 양이다. 일 구체예에서, 치료적 유효량은 혈압을 저하시키는데 필요한 약물의 양 또는 정상 혈압을 유지하는데 필요한 약물의 양이다. 한편, 용어 "유효량 (effective amount)"은 원하는 결과를 얻기에 충분한 양을 의미하며, 상기 결과는 반드시 치료적 결과일 필요는 없다. 예를 들어, NEP 효소를 포함하는 시스템을 연구하는 경우, "유효량"은 상기 효소를 억제하는데 필요한 양일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "치료(treating, treatment)"는 포유동물 (특히, 사람)과 같은 환자에서 질병 또는 (고혈압과 같은) 질환(medical condition)을 치료하는 것을 의미하며, 하기 중 하나 이상을 포함한다: (a) 질병 또는 의학적 상태의 발생 방지, 즉 질병 또는 의학적 상태의 재발 방지 또는 질병 또는 의학적 상태에 걸리기 쉬운(pre-disposed) 환자의 예방적 치료(prophylactic treatment); (b) 질병 또는 의학적 상태의 개선(ameliorating), 즉 환자에서 질병 또는 의학적 상태를 제거하거나 퇴행(regression)을 야기하는 것; (c) 질병 또는 의학적 상태의 억제(suppressing), 즉 환자에서 질병 또는 의학적 상태의 진행을 둔화시키거나 저지하는것; 또는 (d) 환자에서 질병 또는 의학적 상태의 증상 완화. 예를 들면, 용어 "고혈압의 치료(treating hypertension)"는 고혈압의 발병 예방, 고혈압의 개선, 고혈압의 억제, 및 고혈압 증상의 완화 (예를 들면, 혈압을 낮추는 것)를 포함한다. 용어 "개체(subject)" 또는 "환자(patient)"는 치료 또는 질병 예방을 필요로 하거나, 질병 예방 목적 또는 특정한 질병 또는 의학적 상태의 치료 목적으로 현재 치료받고 있는, 사람과 같은 포유동물뿐만 아니라 본 발명의 화합물이 평가되거나 또는 분석(assay)에 사용되는 시험 대상(test subject), 예를 들면 동물 모델을 포함하는 것으로 의도된다.

본 명세서에서 사용되는 다른 모든 용어들은 이들이 적용되는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 일반적인 의미를 갖는 것으로 의도된다.

일반적 합성 과정

본 발명의 화합물 I의 결정형은 하기에 기술된 바와 같은 쉽게 입수 가능한 출발 물질 및 실시예로 합성될 수 있다. 전형적이거나 선호되는 공정 조건 (즉, 반응 온도, 결정화 온도, 시간, 반응 몰비, 용매, 압력 등)이 주어지면, 달리 언급되지 않는 한 다른 공정 조건이 또한 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 일부 예에서, 반응 또는 결정화는 실온에서 수행되고 실제 온도 측정은 이루어지지 않는다. 실온은 일반적으로 실험실 환경에서의 주위 온도와 관련된 범위 내에 있는 온도를 의미하고, 전형적으로 약 20℃ 내지 약 25℃와 같은, 약 15℃ 내지 30℃ 범위일 것으로 이해된다. 다른 예에서, 반응 또는 결정화는 실온에서 수행되고, 상기 온도는 실제 측정되고 기록된다.

본 발명의 방법에서 기술된 임의의 몰비는 당업계 기술자가 사용 가능한 다양한 방법에 의해서 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 그러한 몰비는 ¹H NMR에 의해서 쉽게 결정될 수 있다. 대안적으로, 원소 분석 및 HPLC 방법이 몰비를 결정하는데 사용될 수 있다.

일 구체예에서, 화합물 I은 (a) 벤질 (2S,4R)-4-아미노-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-2-메틸펜타노에이트 히드로클로리드를 3-((4-메톡시벤질)옥시)이속사졸-5-카르복실산과 용매에서 대략 1:1 몰비로 커플링하여 벤질 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-((4-메톡시벤질)옥시)이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜타노에이트를 수득하는 단계; 및 (b) 벤질 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-((4-메톡시벤질)옥시)이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜타노에이트를 탈보호화하여 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 (I)을 형성하는 단계에 의해서 제조될 수 있다.

일 구체예에서, 단계 (a)는 커플링제 및 염기를, 커플링제: 염기: 벤질 (2S,4R)-4-아미노-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-2-메틸펜타노에이트 히드로클로리드: 3-((4-메톡시벤질)옥시)이속사졸-5-카르복실산 약 1:3:1:1의 몰비로 더 포함한다. 펩티드 커플링제의 대표적인 예는, O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU), O-(벤조트리아졸-1-일)- N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)- N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플로오로보레이트 (TATU), O-(6-클로로벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HCTU), 및 O-[(에톡시카르보닐)시아노메틸렌아미노]-N,N,N',N'-테트라 메틸우로늄 테트라플로오로보레이트 (TOTU)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 구체예에서, 상기 펩티드 커플링제는 HATU, HBTU 및 HCTU, 가장 바람직하게는 HCTU이다. 상기 반응에서 사용될 수 있는 염기의 예는 DIPEA이다.

다른 구체예에서, 탈보호화 단계 (b)는 팔라듐 촉매, 예를 들어 탄소(5% 또는 10% w/w)상 팔라듐, 및 수소 가스로 수행된다. 추가 구체예에서, 하기의 단계가 단계 (b) 후에 수행될 수 있다. 상기 팔라듐 촉매를 제거한 후, 과산화수소와 같은 산화제를 첨가한다. 그런 다음, 그 반응물을 1 시간 이상 또는 바람직하게는 2 시간 동안 약 20℃ 내지 30℃의 실온에서 교반할 수 있다. 이 단계 이후 증류하고 1회 이상 세척하고, 선택적으로 화합물 I 의 단리 전 냉동 및 숙성(aging)할 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명은 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 (I')의 결정형에 관한 것이다. 다른 구체예에서, 상기 결정형은 무수성이거나, 비-흡습성이거나 또는 둘 모두 이다.

결정형 I'의 제조는 일반적으로, 예를 들어 선택적으로 물을 포함하는, 아세톤, 아세토니트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 에틸 케톤, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 이소부탄올, 디클로로메탄, 메틸 t-부틸 에테르, 시클로펜틸 메틸 에테르, 헥산 등, 및 이들의 혼합물들을 포함하나 이에 한정되지 않는 적절한 비활성 희석제 중에서 수행한다. 비활성 희석제의 혼합물 (또한, 용매 시스템이라 함)은 아세톤과 물, 아세토니트릴과 물, 에탄올 및 에틸 아세테이트, 에틸아세테이트 및 헥산, 및 저급 알콜 (C_1-6 알킬-OH)과 물, 예를 들면 메탄올 및 물, 및 이소프로판올 및 물을 포함한다. 특히 적절한 용매 시스템은 에틸 아세테이트 및 물을 포함한다. 결정화의 완료 시에, 침전, 여과, 농축, 원심분리, 진공 건조 등과 같은 임의의 종래 수단에 의해 상기 반응 혼합물로부터 결정 화합물을 분리할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 결정형 I'은 (a) 용매와 함께 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 (화합물 I)을 포함하고, 선택적으로 메탈 스캐벤저를 함유하는 용액을, 높은 온도에서 형성하는 단계; (b) 약 -20℃ 내지 5 ℃의 온도로 상기 용매를 냉각시키는 단계; 및 (c) 상기 생성된 고체를 단리하여 결정형 I'을 수득하는 단계에 의해서 제조될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 공정은 상기 용액을 -20도 내지 5도의 온도에서 교반 (stirring)하거나 회교반 (agitating)하는 단계를 더 포함한다.

단계 (a)는 일반적으로 극성 용매 중에 실온에서 수행된다. 상기 극성 용매는 양성자성 또는 비양성자성일 수 있고, 예를 들어, 에틸 아세테이트 및 물, 에틸 아세테이트, 또는 에탄올을 포함한다. 단계 (a)에서 상기 높은 온도는 전형적으로 약 60　^oC 내지 95　^oC 및 바람직하게는 70　^oC 내지 85　^oC, 70　^oC 내지 80　^oC, 또는 75　^oC 내지 85　^oC이다. 상기 단리하는 단계 (c)는 여과하는 단계, 하나 이상의 용매로 세척하는 단계, 공기 중 또는 진공 하에 건조하는 단계, 또는 이들 단계의 조합들을 포함한다. 만약 화합물 I' 또는 결정형　I'이 진공 하에 건조되는 경우, 이는, 25　^oC 내지 70　^oC, 바람직하게는 30　^oC 내지 60　^oC, 30　^oC 내지 50　^oC, 40　^oC 내지 60　^oC, 또는 40　^oC 내지 50　^oC의 온도에서 수행할 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 방법은 온도를 약 60　^oC 내지 95　^oC로 올리기 전에 0　^oC 내지 30　^oC의 온도에서 약 5 분 이상 상기 혼합물을 교반하는 단계를 더 포함한다. 대안적으로, 교반하는 단계는 1 분 이상 25 ^oC 내지 35 ^oC의 온도에서 수행할 수 있다.

추가의 다른 구체예에서, 상기 혼합물을 추가로 정치시키고 상등의 비-수성상을 온도를 올리기 전에 단리한다. 대안적으로 상기 온도를 올리기 전에, 상기 혼합물을 여과하고, 씻어내고, 부피를 감소시킨다.

또 다른 구체예에서, 상기 방법의 단계 (b)에서의 온도는 독립적으로 -15 ^oC 내지 -5 ^oC 또는, 대안적으로 독립적으로 -5 ^oC 내지 5 ^oC이다.

결정 특성

분말 X-선 회절 (PXRD) 분석 분야에서 잘 알려진 바와 같이, PXRD 패턴의 상대 피크 높이는 시료 준비 및 장비 기하학과 관련된 여러 요소에 따라 달라지지만, 피크 위치는 실험 세부 사항에 상대적으로 민감하지 않다. PXRD, 시차 주사 열량계 (DSC), 열 중량 분석 (TGA) 및 동적 수분 수착 (DMS) 평가 (수분 수착-탈착 분석으로도 알려짐)가 본 명세서에서 개시된 바와 같이 수행되었다.

일 양상에서, 본 발명은 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 (I')의 결정형과 관련되고 피크 위치가 도 1에 도시된 것과 실질적으로 일치하는 PXRD 패턴이 특징을 특징으로 한다.

면적에서 1% 초과의 상대적 세기를 갖는 피크를 하기의 표에 나열하였다. 이 패턴은 2θ에서 5-35°범위에서 날카로운 회절 피크를 나타낸다. 상기 회절 패턴에서 이러한 피크 및 다른 피크는 이 형태를 동정하는데 사용될 수 있다.

*2θ 값은 값±0.20으로서 보고된다.

따라서, 일 구체예에서, 결정형 I'은 6.51±0.20, 11.62±0.20, 13.05±0.20, 15.07±0.20, 및 23.28±0.20의 2θ 값에서 회절 피크를 포함하는 PXRD 패턴을 특징으로 한다.

다른 구체예에서, 상기 결정형 I'은 6.51±0.20, 11.62±0.20, 13.05±0.20, 15.07±0.20, 17.12±0.20, 23.28±0.20, 및 26.19±0.20 의 2θ 값에서 회절 피크를 포함하는 PXRD 패턴을 특징으로 한다.

다른 구체예에서, 상기 결정형 I'은 6.51±0.20, 11.62±0.20, 13.05±0.20, 15.07±0.20, 15.72±0.20, 17.12±0.20, 20.79±0.20, 21.10±0.20, 23.28±0.20, 24.48±0.20, 25.81±0.20, 및 26.19±0.20으로부터 선택된 2θ 값에서 하나 이상의 부가적인 회절 피크를 갖는 것을 더 특징으로 하고; 또 다른 구체예에서, 상기 결정 화합물은 세 개 이상의 그러한 부가적인 회절 피크를 갖는 것을 더 특징으로 한다.

일 구체예에서, 결정형 I'은 도 2에 개시된 것과 실질적으로 일치하는 DSC 서모그램(thermogram) 또는 시차 주사 열량측정 트레이스를 특징으로 한다. 상기 결정형 I'은 약 214　^oC 내지 약 218　^oC의 온도에서 최대 흡열 열 흐름을 나타내는 분당 10 ℃의 가열 속도로 기록되는 시차 주사 열량측정 트레이스를 특징으로 한다. 상기 DSC 서모그램 또는 시차 주사 열량측정 트레이스는 약 216.1　℃에서 피크, 214.2　℃에서 개시점, 및 107.2　J/g에 상응하는 흡열 하의 면적을 갖는 용융 흡열을 설명한다. 상기 화합물의 분해(decomposition)는 용융과 일치하고, 용융 엔탈피에 대한 107.2　J/g의 기여는 확립되지 않았다.

일 구체예에서, 결정형 I'은 도 3의 TGA 프로필을 특징으로 한다. 상기 프로필은 약 240 ℃까지 질량 손실을 보이지 않고; 상기 결정 화합물은 대략 242 ℃의 개시점에서 발생하는 상당한 중량 손실에 의해 보여지는 바와 같이, 용융 후 분해된다. 상기 분해 온도까지 질량의 추가 손실은 없고, 이는 물과 같은 흡착된 분자의 결여를 나타낸다.

일 구체예에서, 결정형 I'은 도 4의 DMS 등온선을 특징으로 한다. 이 형태는 비-흡습성 고체이다. 관찰된 전체 수분 수득율은 5-90% 상대 습도에 노출될 때, 0.02 중량% 이하이다. 2 번의 연속적인 수착-탈착(sorption-desorption) 주기 내에, 유의적인 히스테리시스 (hysteresis)는 발견되지 않았다. 수착-탈착 주기 후 수득된 고체는 출발 물질과 동일한 PXRD 패턴을 보였는데, 이는 이 실험 후의 형태에서의 변화가 없음을 나타낸다. 이러한 데이터는 결정형 I'이 물이 존재 하에서 수화된 형태로 전환하지 않음을 나타낸다. 상기 결정형 I'은 비-흡습성을 유지하여, 무수성이거나, 비흡습성이거나 또는 둘 모두인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 결정형 I'은 도 5의 PLM 이미지를 특징으로 할 수 있는데, 도 5는 상기 결정형이 결정, 복굴절(birefringent), 플레이트-유사 입자인 것임을 나타낸다.

유용성

대상에서 약물 거동의 인 비트로-대-인 비보 외삽 (extrapolation)이 계속해서 개선되고 있다 (예컨대, Chiba et al., AAPS J., 2009 June; 11(2): 262-276 참조). 본 발명에서, 인 비트로 인간 네프릴리신 저해제 활성이 화합물 I 및 결정형 I'의 네프릴리신 저해 활성을 결정하기 위해서 분석되었다. pKi ≥ 9.0의 역치가 충족되었다. 그러나, 대상에서 화합물 I 및 결정형 I'의 거동을 더 정확하게 예측하기 위해서 부가적인 인 비보 실험이 더 수행되었다.

인 비보 거동에 관해, 신장 기능이 손상된 대상에 대해, 시험된 모든 종에서의 낮은 혈장 클리어런스, 높은 경구 생체이용률, 시클릭 일인산구아노신(cGMP) 반응의 바람직한 강화작용(potentiation) 및 낮은 신장 클리어런스과 같은 필수적인 치료 효과를 얻기 위해 충분한 양의 약물이 혈장에 전달되는지 여부를 평가하는데 유용한 몇 가지 특성이 있다.

본 발명에 있어서, 화합물 I, 즉, 화합물 I'의 경구 생체이용률을 결정하기 위해서, 랫트, 개 및 원숭이 종에서 경구 및 정맥내 약물동태학적 (pharmacokinetic) 연구가 수행되었다 (분석법 1). 이 분석은 또한, 이러한 화합물에 대한 혈장 클리어런스를 결정하기 위해 사용되었다; 낮은 클리어런스는 상기 화합물이 순환에 잔존할 것이라 기대되는 기간, 즉 수반되는 개별적인 제거(elimination) 과정에 대한 규명 없이 인 비보 안정성 및 저항성을 예측할 수 있을 것이라 기대된다.

화합물 I로 수득된 네프릴리신 저해 수준을 결정하기 위해 약동학적/약력학적 연구를 인간에서 수행하였다 (분석 3). 상기 분석에서, 시클릭 일인산구아노신 (cGMP)의 수준을 측정하였다. cGMP는 나트륨이뇨 펩티드 수용체 결합의 하류 효과자 분자여서, 나트륨이뇨 펩티드 활성의 효과적인 인 비보 바이오 마커로서 역할한다. cGMP의 수준이 동물에 네프릴리신 저해제를 투여한 경우, 위약 대조군에 비해 증가한다. 본 발명의 일 구체예는, 화합물 I 또는 결정형 I'의 치료적 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 고혈압, 심부전, 또는 신장 질환을 갖는 개체의 동맥 나트륨이뇨 펩티드 (atrial natriuretic peptide; ANP) 또는 cGMP 기저 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. ANP 및 cGMP의 수준은 개체의 소변 또는 혈장 또는 이 둘 모두에서 측정된다. 다른 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'의 치료적 효과량을 투여한 경우, ANP 또는 cGMP의 수준은, 개체에서 24 시간 동안 적어도 ≥ 1.1-배, ≥ 1.2-배, ≥ 1.3-배, ≥ 1.4-배, ≥ 1.5-배, ≥ 2-배, ≥ 3-배, ≥ 4-배, 또는 ≥ 5-배 증가한다. 다른 양상에서, 본 발명은 인간의 혈장에서 시클릭 일인산구아노신의 양을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 일 양상의 결정 유리산 형을 인간에 투여하는 단계를 포함하고, 본 발명은 인간의 혈압을 감소시키는 것과 관련된 것으로서, 상기 방법은 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산의 결정 유리산 형의 혈압을 감소시키는 양으로 인간에 투여하는 단계를 포함한다.

개체에서 그 수용성 형태인 화합물 I으로 용해된 결정형 I'은 NEP 효소를 저해하므로, NEP 저해에 대한 의학적 상태의 치료 및/또는 예방에 유용할 수 있을 것으로 기대된다. 그러므로, 이는, NEP 효소를 저해하거나 또는 그 펩티드 기질의 수준을 증가시킴으로써 치료되는 질환 또는 장애를 갖는 환자에게 화합물 I 또는 결정형 I'의 치료적 유효량을 투여함으로써 치료할 수 있을 것으로 기대된다. 예를 들면, NEP를 저해시킴으로써, 화합물 I 또는 결정형 I' 이 NEP에 의해 대사된 내인성 펩티드, 가령 나트륨이뇨성 펩티드, 봄베신 (bombesin), 브라디키닌, 칼시토닌, 엔도텔린 (endothelin), 엔케팔린 (enkephalin), 뉴로텐신 (neurotensin), 물질 (substance) P, 및 혈관활성 장내 펩티드 (vasoactive intestinal peptide)의 생물학적 효과를 강화시킬 것으로 기대된다. 그러므로, 상기 화합물이 예를 들어 신장계, 중추 신경계, 생식계, 및 위장 관계에서 기타 생리적인 작용을 가질 것으로 기대된다.

약물이 일반적으로 배설 (excretion) 및 생체전환 (biotransformation)으로 분류되는 다양한 제거 공정에 의해 개체 신체로부터 제거된다. 배설은 담즙 (간), 땀, 타액, 우유 (젖 분비를 통한) 또는 기타 체액을 포함하는 배설의 다른 경로와, 신장 (신)에 의해 방광에서 소변으로 손상되지 않은 비-휘발성 약물을 제거하는 것과 관련된다. 알콜 및 기체성 마취제와 같은 휘발성 약물이 폐를 통해 내쉬는 공기로 배출된다. 반면에, 생체전환 또는 약물 대사는 약물이 신체에서 대사산물로 화학적으로 전환되는 것과 관련이 있고, 일반적으로 효소 과정이다. 예외적으로, 약물이 비-효소적으로, 예컨대 에스테르 가수분해로 화학적으로 변화된다. 약물의 생체전환에 관여하는 효소는 주로 간에 위치한다. 신장, 폐, 소장 및 피부와 같은 다른 조직에도 대사 효소를 포함한다.

개체에서 제거 경로, 예컨대 경시적으로 투여된 약물의 소변으로의 배설을 통한 신장 클리어런스 (renal clearance)을 조사하기 위해 약동학적 연구가 사용될 수 있다. 랫트, 개 및 원숭이 종뿐 아니라 인간에서 화합물 I의 신장 배설이 제거 경로로서 신장 배설을 평가하기 위해 수행되었다 (분석 2 및 4). 상기 제거 경로는 신장 기능이 손상되고, 신장 배설에 의해 최소한으로 제거되는 치료를 필요로 하는 개체에게 중요하다. 일 구체예에서, 상기 개체에서의 화합물 I 또는 결정형 I'은 신장 배설은 24시간에 걸쳐서 상기 투여된 용량의 대략 ≤15%, ≤10%, ≤5%, ≤3%, ≤2%, ≤1% 또는 ≤0.5% 이다.

하기 분석법 부분에 개시된 바와 같이, 다수의 동물 종에서 혈장 클리어런스, 경구 생체이용률, 및 신장 배설의 인 비보 결정이 이루어졌다.　 화합물 I 또는 결정형 I'은 질병 치료에서 특별한 유용성을 유발할 것으로 기대되는 인간 네프릴리신의 높은 저해 활성, 높은 경구 생체이용률, 낮은 혈장 클리어런스, cGMP의 증가된 상승 작용(potentiation) 및 낮은 신장 배설을 나타내었다.

심혈관 질환

나트륨이뇨 펩티드 및 브라디키닌과 같은 혈관활성 펩티드의 효과를 강화함으로써, 화합물 I 및 결정형 I' 은 혈관 질환 같은 의학적 상태를 치료 및/또는 예방하는데 유용성을 발견할 것으로 기대된다. 예를 들어, Roques et al. (1993) Pharmacol. Rev. 45:87-146 및 Dempsey et al. (2009) Amer. J. of Pathology 174(3):782-796을 참조한다. 특정 관심대상의 심혈관 질환은 고혈압 및 심부전을 포함한다. 고혈압은 예로서 하기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 본태성(essential) 고혈압 또는 특발성(idiopathic) 고혈압으로도 지칭되는, 원발성 (primary) 고혈압; 속발성(secondary) 고혈압; 신장 질환을 수반하는 고혈압; 신장 질환을 수반하거나 수반하지 않는 중증 고혈압; 폐 동맥성 고혈압을 포함한, 폐 고혈압; 및 내성(resistant) 고혈압. 심부전은 예로서 하기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 울혈성 심부전(congestive heart failure); 급성 심부전; 만성 심부전; 예를 들어 감소된 좌심실 박출율(left ventricular ejection fraction)을 갖거나 (또한 수축성 심부전으로도 지칭됨) 또는 보존된 좌심실 박출율을 갖는 (또한 확장기 심부전으로도 지칭됨) 만성 심부전; 및 급성 또는 만성의 보상부전성(decompensated) 심부전. 따라서, 본 발명의 구체예는 환자에게 화합물 I 또는 결정형 I'의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 고혈압, 구체적으로 원발성 고혈압, 폐동맥성 고혈압, 만성 혈전색전성 폐고혈압 (CTEPH), 또는 신장동맥협착를 동반한 고혈압을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.

원발성 고혈압의 치료에 대해, 치료적 유효량은 전형적으로 환자의 혈압을 낮추기에 충분한 양이다. 일 양상에서, 본 발명은 인간의 혈압을 감소시키는 것과 관련되고, 상기 방법은 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산의 결정 유리산 형의 혈압을-감소시키는 양을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다. 이는 경증 내지 중증도의 고혈압 및 중증(severe) 고혈압을 둘다 포함할 것이다. 고혈압을 치료하기 위해 사용되는 경우, 화합물 I 또는 결정형 I'은 기타 치료제, 예를 들어, 알도스테론 길항제, 알도스테론 신타제(synthase) 저해제, 안지오텐신-전환 효소 저해제 및 이중-작용 안지오텐신-전환 효소/네프릴리신 저해제, 안지오텐신-전환 효소 2 (ACE2) 활성제 및 촉진제, 안지오텐신-II 백신, 항-당뇨제, 항-지질제, 항-혈전제, AT1 수용체 길항제 및 이중-작용 AT1 수용체 길항제/네프릴리신 저해제, β1-아드레날린성 수용체 길항제, 이중-작용 β-아드레날린성 수용체 길항제/α1-수용체 길항제, 칼슘 채널 차단제, 이뇨제, 엔도텔린 수용체 길항제, 엔도텔린 전환 효소 저해제, 네프릴리신 저해제, 나트륨이뇨 펩티드 및 그의 유사체, 나트륨이뇨 펩티드 제거(clearance) 수용체 길항제, 일산화 질소 공여체, 비-스테로이드성 항염증제, 포스포디에스테라제 저해제(구체적으로 PDE-V 저해제), 프로스타글란딘 수용체 효능제, 레닌 저해제, 가용성 구아닐레이트 시클라제(cyclase) 촉진제 및 활성제, 및 이들의 조합과 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 일 특정 구체예에서, 본 발명의 상기 화합물은 AT1 수용체 길항제, 칼슘 채널 차단제, 이뇨제, 또는 그의 조합과 조합되고, 원발성 고혈압을 치료하는데 사용된다. 본 발명의 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 상기 화합물은 AT1 수용체 길항제와 조합되고, 신장 질환을 수반하는 고혈압을 치료하는데 사용된다. 내성 고혈압을 치료하기 위해 사용되는 경우, 상기 화합물은 알도스테론 신타제 저해제와 같은 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다.

폐동맥성 고혈압의 치료의 경우, 치료적 유효량은 보통 폐 혈관 저항성을 낮추기에 충분한 양이다. 치료의 다른 목표는 환자의 운동 능력을 향상시키는 것이다. 예를 들어, 임상 환경(clinical setting)에서, 상기 치료적 유효량은 6 분의 시간 동안(대략 20-40 미터의 거리를 커버함) 편안하게 걸을 수 있는 환자의 능력을 향상시키는 양이 될 수 있다. 폐동맥성 고혈압을 치료하는데 사용하는 경우, 화합물 I 또는 결정형 I' 은 기타 치료제, 예를 들어 α-아드레날린성 수용체 길항제, β1-아드레날린성 수용체 길항제, β2-아드레날린성 수용체 효능제, 안지오텐신-전환 효소 저해제, 항응고제(anticoagulant), 칼슘 채널 차단제, 이뇨제, 엔도텔린 수용체 길항제, PDE-V 저해제, 프로스타글란딘 유사체, 선택적 세로토닌 재흡수(reuptake) 저해제, 및 이들의 조합과 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 일 특정 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I' 은 PDE-V 저해제 또는 선택적 세로토닌 재흡수 저해제와 조합되고 폐동맥성 고혈압을 치료하는데 사용된다.

만성 혈전색전성 폐고혈압의 치료의 경우, 치료적으로 유효량은 전형적으로 폐 색전증이 개체에 형성되었는지 여부와 관계 없이 폐의 혈압을 감소시키기에 충분한 양이다.

추가적으로, 신장동맥협착를 동반한 고혈압의 치료를 위해, 치료적 유효량은 전형적으로 혈압을 낮추기에 충분한 양이다. 신동맥 협착증을 갖는 개체에 대해서, 상기 동맥은 관상동맥질환으로 인해 좁아져있다. 이는 결국 신장에 도달하는 혈액을 감소시켜, 이를 혈압감소로서 해석하고, 결과적으로 혈압을 증가시키는 호르몬의 방출 신홀ㄹ 보낸다. 시간에 따라 이는 신부전을 유발할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는 환자에게 화합물 I 또는 결정형 I'의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 심부전, 구체적으로 울혈성 심부전 (수축성 및 확장기 울혈성 심부전을 모두 포함함)을 치료하는 방법에 관한 것이다. 통상적으로, 치료적 유효량은 혈압을 낮추거나 및/또는 신장 기능을 향상시키기에 충분한 양이다. 임상 현장에서, 치료적 유효량은 심장의 혈류 동태(cardiac hemodynamics), 예를 들어 쐐기압(wedge pressure), 우심방압(right atrial pressure), 충압(filling pressure), 및 혈관 저항을 향상시키기에 충분한 양일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 화합물은 정맥내 투여 제형으로 투여된다. 심부전을 치료하기 위해 사용되는 경우, 상기 화합물 I 또는 결정형 I' 은 기타 치료제, 예를 들어, 아데노신 수용체 길항제, 최종 당화 산물 분해제(advanced glycation end product breaker), 알도스테론 길항제, AT1 수용체 길항제, β1-아드레날린성 수용체 길항제, 이중-작용 β-아드레날린성 수용체 길항제/α1-수용체 길항제, 키마제(chymase) 저해제, 디곡신(digoxin), 이뇨제, 엔도텔린 전환 효소 (ECE) 저해제, 엔도텔린 수용체 길항제, 나트륨이뇨 펩티드 및 그의 유사체, 나트륨이뇨 펩티드 제거 수용체 길항제, 일산화 질소 공여체, 프로스타글란딘 유사체, PDE-V 저해제, 가용성 구아닐레이트 시클라제 활성제 및 촉진제, 및 바소프레신 수용체 길항제와 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 일 특정 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 알도스테론 길항제, β1-아드레날린성 수용체 길항제, AT1 수용체 길항제, 또는 이뇨제와 조합되고, 울혈성 심부전을 치료하는데 사용된다.

설사

NEP 저해제로서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 내인성 엔케팔린 (endogenous enkephalin)의 분해를 저해할 것으로 기대되고, 따라서 이러한 화합물은 또한 감염성 및 분비성/수성 (watery) 설사를 포함한, 설사의 치료에 대한 유용성을 발견할 수 있다. 예를 들어, Baumer et al. (1992) Gut 33:753-758; Farthing (2006) Digestive Diseases 24:47-58; 및 Marcais-Collado (1987) Eur. J. Pharmacol. 144(2):125-132를 참조한다. 설사를 치료하는데 사용되는 경우, 화합물 I 또는 결정형 I'은 하나 이상의 추가적인 지사제와 조합될 수 있다.

신장 질환

나트륨이뇨 펩티드 및 브라디키닌과 같은 혈관활성 펩티드의 효과를 강화시킴으로써, 화합물 I 또는 결정형 I'은 신장 기능을 증강하고 (Chen et al. (1999) Circulation 100:2443-2448; Lipkin et al. (1997) Kidney Int. 52:792-801; 및 Dussaule et al. (1993) Clin. Sci. 84:31-39 참조), 신장-손상된 개체에서 신장 질환을 치료 및/또는 예방하는데 유용성을 찾을 것으로 기대된다. 특히 관심대상인 신장 질환은 당뇨병성 신장병, 만성 신장 질환, 단백뇨 (proteinuria), 및 특히 급성 신손상 (acute kidney injury) (예를 들어, 심혈관 수술, 화학요법, 또는 의료 영상에서 조영제 (contrast dye)의 사용에 의해 야기됨) 또는 급성 신부전 (acute renal failure)을 포함한다 (Sharkovska et al. (2011) Clin. Lab. 57:507-515 및 Newaz et al. (2010) Renal Failure 32:384-390 참조). 구체적으로 흥미 있는 다른 신장 질환은 신증후군, 국소 분절 사구체경화증(focal segmental glomerulosclerosis; FSGS) 및 다낭성 신장 질환 (PKD)을 포함한다.

만성 신장 질환 (chronic kidney disease: CKD)이 있는 신장-손상된 개체는 National Kidney Foundation Kidney Disease Outcomes Quality Initiative (NKF KDOQI) 지침에 따라 분류될 수 있다. 만성 신장 질환이 확립되면, 즉 ≥3개월 동안 신장 손상 또는 사구체 여과율 (glomerular filtration rate: GFR) <60 mL/분/1.73 m²인 경우, 질병 단계는 KDOQI CKD 분류에 따라 할당될 수 있다. 여기에는 단계 1 (정상 또는 증가된 GFR을 갖는 신장 손상): GFR ≥90; 단계 2 (경미하게 감소된 GFR을 갖는 신장 손상): GFR 60-89; 단계 3 (중등 감소된 GFR): GFR 30-59; 단계 4 (중증 감소된 GFR): GFR 15-29; 및 단계 5 (신부전): GFR <15 (또는 투석)가 포함된다. GFR은 mL/분/1.73m² 단위로 정의된다.

일 구체예는 화합물 I 또는 결정형 I'의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 신장 손상된 개체를 치료하는 방법을 포함한다. 이 방법은 고혈압 또는 심부전으로 신장-손상된 개체를 치료하는 단계를 더 포함한다. 신장 질환을 치료하기 위해 사용되는 경우, 화합물 I 또는 결정형 I' 이 안지오텐신-전환 효소 저해제, AT₁ 수용체 길항제, 및 이뇨제와 같은 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다.

다른 구체예는 60 mL/분/1.73m² 내지 15 mL/분/1.73m² 의 추정 사구체 여과율 (estimated glomular filtration rate: eGFR)을 갖는 만성 신장 질환을 갖는 신장-손상된 개체를 치료하는 방법을 포함하고, 이는 화합물 I 또는 결정형 I'의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예는 추정 사구체 여과율 (eGFR) ≥90 mL/분/1.73m²(단계 1) 또는 eGFR <15 mL/분/1.73m²(단계 5)인 만성 신장 질환을 갖는 신장-손상된 개체를 치료하는 방법을 포함하고, 이는 화합물 I 또는 결정형 I'의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해서, 중증 신장 질환은 eGFR <30 mL/분/1.73m²로 분류될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 단계 1, 단계 2, 단계 3, 단계 4, 단계 5 또는 하나 이상의 상기 단계를 포함하는 eGFR 범위들로 분류되는 만성 신장 질환을 갖는 신장-손상된 대상을 화합물 I 또는 결정형 I' 으로 치료하는 방법이 포함된다.

예방 요법(Preventative Therapy)

나트륨이뇨 펩티드의 효과를 강화함으로써, 화합물 1 은 또한 나트륨이뇨 펩티드의 비대방지 (antihypertrophic) 및 항섬유성(antifibrotic) 효과에 기인한, 예방 요법 (Potter et al. (2009) Handbook of Experimental Pharmacology 191:341-366 참조), 예를 들어 심근 경색 후 심장 기능저하의 진행 예방, 혈관성형술(angioplasty) 후 동맥 재협착(arterial restenosis) 예방, 혈관 수술 후 혈관 벽의 비후(thickening) 예방, 동맥경화증 예방 및 당뇨성 혈관병증 예방에 유용할 것으로 기대된다.

녹내장

나트륨이뇨 펩티드의 효과를 강화시킴으로써, 화합물 I 또는 결정형 I'은 녹내장을 치료하는데 유용할 것으로 기대된다. 예를 들어, Diestelhorst et al. (1989) International Ophthalmology 12:99-101을 참조한다. 녹내장을 치료하기 위해 사용되는 경우, 화합물 1은 하나 이상의 추가적인 녹내장 치료제와 조합될 수 있다.

통증 완화

NEP 저해제로서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 내인성 엔케팔린의 분해를 저해할 것으로 기대되고, 따라서 이러한 화합물은 또한 진통제로서의 유용성을 확인할 수 있다. 예를 들어, Roques et al. (1980) Nature 288:286-288 및 Thanawala et al. (2008) Current Drug Targets 9:887-894를 참조한다. 통증을 치료하기 위해 사용되는 경우, 화합물 I 또는 결정형 I'은 하나 이상의 항통증 약물, 예를 들어 아미노펩티다제 N 또는 디펩티딜 펩티다제 III 저해제, 비-스테로이드성 항염증제, 모노아민 재흡수 저해제, 근육 이완제, NMDA 수용체 길항제, 오피오이드 수용체 효능제, 5-HT1D 세로토닌 수용체 효능제, 및 트리시클릭 항우울제와 조합될 수 있다.

기타 유용성

NEP 억제 특성으로 인해, 화합물 I 또는 결정형 I'은 또한 기침약 (antitussive agent)으로서 유용할 것으로 기대되고, 뿐만 아니라 간 경변과 연관된 문맥성 (portal) 고혈압 (Sansoe et al. (2005) J. Hepatol. 43:791-798 참조), 암 (Vesely (2005) J. Investigative Med. 53:360-365 참조), 우울증 (Noble et al. (2007) Exp. Opin. Ther. Targets 11:145-159 참조), 월경 이상, 조기 분만(preterm labor), 자간전증(pre-eclampsia), 자궁내막증(endometriosis), 생식 장애(예를 들어, 남성 및 여성의 불임, 다낭성 난소 증후군, 착상 실패), 및 남성 발기부전 및 여성 성적 흥분 장애를 포함한 남성 및 여성의 성기능 장애(sexual dysfunction)의 치료에서 유용성을 확인할 수 있다. 보다 구체적으로, 화합물 I 또는 결정형 I'은, 종종 여성 환자의 성적 표현에 있어 만족감을 찾기 어렵거나 불가능하다고 정의되는 여성의 성기능 장애를 치료하는데 유용할 것으로 기대된다 (Pryde et al. (2006) J. Med . Chem . 49:4409-4424 참조). 설명되지만 제안되지 않은 방식으로, 이는 성욕 감퇴 장애(hypoactive sexual desire disorder), 성적 흥분 장애(sexual arousal disorder), 오르가즘 장애 및 성기 통증 장애를 포함하는 다양한 여성 성기능 장애를 포함한다. 그러한 장애, 특히 여성 성기능 장애를 치료하는데 사용되는 경우, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 하기의 제제와 결합될 수 있다: PDE-V 저해제, 도파민 작용제, 에스트로겐 수용체 작용제 및/또는 길항제, 안드로겐, 및 에스트로겐. NEP 억제 특성으로 인해, 화합물 I 또는 결정형 I'은 또한 항염증 특성을 가질 것으로 기대되고, 특히 스타틴 (statins)과 조합하여 사용될 경우, 그러한 유용성을 가질 것으로 기대된다.

최근 연구는 NEP가 인슐린-결핍성 당뇨병 및 식이 유도성 비만에서 신경 기능을 조절하는데 역할을 담당한다는 것을 제시한다. Coppey et al. (2011) Neuropharmacology 60:259-266. 그러므로, 그 NEP 억제 특성으로 인해, 화합물 I 또는 결정형 I'은 또한 당뇨병 또는 식이 유도성 비만에 의해 야기된 신경 손상으로부터의 보호를 제공하는데 유용할 것으로 기대된다.

투여량 당 투여되는 화합물 I 또는 결정형 I'의 양 또는 1일 당 투여되는 총량은 미리 결정되어 있거나, 또는 환자 상태의 성질 및 중증도, 치료될 상태, 환자의 연령, 체중 및 전반적 건강, 활성제 또는 활성 대사산물에 대한 환자의 내약성 (tolerance), 투여 경로, 투여되는 화합물 및 제2 작용제의 활성, 효능, 약동학적 및 독성학적 프로파일과 같은 약리학적 고려 사항을 포함한, 다수의 인자들을 고려하여 개별 환자에 따라 결정될 수 있다. 질환 또는 (고혈압과 같은) 의학적 상태를 앓는 환자의 치료는 미리 결정된 투여량 또는 치료하는 의사에 의해 결정된 투여량으로 시작할 수 있고, 상기 질환 또는 의학적 상태의 증상을 예방, 개선, 억제 또는 완화하는데 필요한 기간 동안 지속할 것이다. 이러한 치료를 받는 환자들은 보통, 치료요법의 유효성을 결정하기 위해 일상적인 기준에서 모니터링될 것이다. 예를 들어, 고혈압을 치료함에 있어서, 혈압 측정이 치료의 유효성을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 본 명세서에서 기재되는 다른 질병 및 상태에 대한 유사한 지표들은 치료하는 의사에게 잘 알려져 있고 용이하게 이용가능하다. 의사에 의한 지속적인 모니터링은 화합물 I 또는 결정형 I'의 최적의 양이 임의의 주어진 시간에 투여되도록 보장할 것이고, 또한 치료 지속기간(duration)의 결정을 용이하게 할 것이다. 이것은 2차 작용제가 또한 투여되는 경우 이들의 선택, 투여량, 및 치료의 지속기간도 조정을 요구할 수 있으므로, 특히 중요한 값이다. 이러한 방식으로, 치료 계획(regimen) 및 투약 스케줄은, 원하는 효과를 나타내는 최소량의 활성제 또는 활성 대사산물이 투여되고, 또한 투여가 상기 질병 또는 의학적 상태를 성공적으로 치료하는데 필요한 기간 동안에만 지속될 수 있도록, 치료 과정 전체에 걸쳐서 조정될 수 있다.

화합물 I 은 또한 화합물 I 의 결정형, 예를 들면 결정형 I'의 제조에 유용한 중간체로서 유용성을 발견하였다.

연구 수단

화합물 I 또는 결정형 I'은 NEP 효소 저해 활성을 갖기 때문에, 이는 또한 NEP 효소를 갖는 생물학적 시스템 또는 시료를 조사하거나 연구하기 위한, 예를 들어, NEP 효소 또는 그의 펩티드 기질이 역할하는 질환을 연구하기 위한 연구 수단으로서 유용하다. NEP 효소를 갖는 임의의 적절한 생물학적 시스템 또는 시료는 인 비트로 또는 인 비보에서 수행될 수 있는 이러한 연구에서 채용될 수 있다. 이러한 연구에 적합한 대표적인 생물학적 시스템 또는 시료는 세포, 세포 추출물, 원형질막, 조직 시료, 적출된 기관, 포유동물 (예를 들어 마우스, 래트, 기니피그, 토끼, 개, 돼지, 사람 등) 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않고, 특히 관심대상은 포유동물이다. 본 발명의 일 특정 구체예에서, 포유동물에서 NEP 효소 활성은 화합물 I 또는 결정형 I'의 NEP-저해량을 투여함으로써 저해된다.

연구 수단으로서 사용되는 경우, NEP 효소를 포함하는 생물학적 시스템 또는 시료는 통상적으로 화합물 I 또는 결정형 I'의 NEP 효소-저해량과 접촉된다. 생물학적 시스템 또는 시료가 화합물에 노출된 후, NEP 효소의 억제 효과는 결합 분석법에서 수용체 결합을 측정하거나 기능 분석법에서 리간드-매개 변화를 측정하는 것과 같이, 통상적인 방법 및 장비를 사용하여 결정된다. 노출은 세포 또는 조직을 상기 화합물과 접촉시키는 것 및 상기 화합물을 포유동물에 투여하는 것, 예를 들어 복강(i.p.), 경구(p.o.), 정맥(i.v.), 피하(s.c.) 또는 흡입(inhaled) 투여 등을 포함한다. 이 결정 단계는 반응의 측정 (정량 분석)을 포함할 수 있거나, 또는 관찰(정성 분석)을 수반할 수 있다. 반응을 측정하는 단계는 예를 들어, 효소 활성 분석법과 같은 통상적인 방법 및 설비를 이용하여 화합물의 생물학적 시스템 또는 시료에 대한 효과를 결정하는 단계, 및 기능적 분석법에서 효소 기질 또는 생성물 매개 변화를 측정하는 것을 수반한다. 분석 결과는 활성 수준뿐만 아니라 원하는 결과를 달성하기 위해 필요한 화합물의 양, 즉, NEP 효소-억제량을 결정하는데 이용될 수 있다. 통상적으로, 상기 결정 단계는 NEP 효소를 저해하는 효과를 결정하는 단계를 수반할 것이다.

추가적으로, 화합물 I 또는 결정형 I'은 다른 화합물을 평가하기 위한 연구 수단으로서 사용될 수 있고, 따라서 예를 들어, NEP-저해 활성을 갖는 새로운 화합물을 발견하기 위한 스크리닝 분석법에도 또한 유용하다. 이 방식에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 시험 화합물 및 화합물 I 또는 결정형 I'로 수득된 결과의 비교는, 있다면, 대략 동등하거나 또는 우월한 활성을 갖는 시험 화합물을 동정하는 것을 가능하게 하는 분석법에서 표준으로서 이용된다. 예를 들어, 시험 화합물 또는 시험 화합물들의 그룹의 pKi 데이터는 화합물 I 또는 결정형 I'에 대한 pKi 데이터를 비교하여, 바람직한 특성을 갖는 시험 화합물이 있다면, 본 발명의 상기 화합물과 동등하거나 우월한 pKi 값을 갖는 시험 화합물을 동정한다. 본 발명의 상기 양상은, 별도의 구체예로서, 관심대상인 시험 화합물을 동정하기 위한 비교 데이터의 생성 (적절한 분석법을 이용함) 및 피검 데이터의 분석 둘다를 포함한다. 따라서, 시험 화합물은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해, 생물학적 분석법에서 평가될 수 있다: (a) 시험 화합물을 가지고 생물학적 분석법을 수행하여 제1 분석값을 제공하는 단계; (b) 화합물 I 또는 결정형 I'로 생물학적 분석을 수행하여 제2 분석값을 제공하는 단계로서; 상기 단계 (a)는 상기 단계 (b) 전, 후 또는 그와 동시에 수행되는 것인 단계; 및 (c) 상기 단계 (a)의 제1 분석값을 상기 단계 (b)의 제2 분석값과 비교하는 단계. 예시적인 생물학적 분석법은 NEP 효소 저해 분석법을 포함한다.

또한, 본 발명의 또다른 양상은 NEP 효소를 포함하는 생물학적 시스템 또는 시료를 연구하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다: (a) 생물학적 시스템 또는 시료를 화합물 (I) 또는 결정형 (I')과 접촉시키는 단계; 및 (b) 생물학적 시스템 또는 시료에 상기 화합물에 의해 야기된 효과를 결정하는 단계.

약학적 조성물 및 제제

화합물 I 또는 결정형 I'는 전형적으로 약학적 조성물 또는 제제의 형태로 환자에게 투여된다. 이러한 약학적 조성물은 경구, 직장, 질, 코, 흡입, 국소(경피를 포함), 눈, 및 비경구 투여 경로를 포함하는 임의의 허용가능한 투여 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 추가적으로, 화합물 I 또는 결정형 I'은 예를 들면, 하루에 복수회의 투여(예를 들면, 매일 2회, 3회, 또는 4회 투여), 하루에 1회 투여 또는 1주에 1회 투여로, 경구로 투여될 수 있다. 특정 투여 방식을 위해 적절한 화합물 I 또는 결정형 I'의 임의의 형태 (즉, 유리 상태의 염기, 유리 상태의 산, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 등)는 본 명세서에서 논의되는 약학적 조성물에서 사용될 수 있음은 이해될 것이다.

따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 및 화합물 1을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 조성물은 필요하다면, 다른 치료제 및/또는 제제화제(formulating agent)를 함유할 수 있다. 조성물을 논의할 때, "화합물 I 또는 결정형 I'은 또한 담체와 같은 제제의 다른 성분과 본 발명의 화합물을 구분하기 위하여 "활성제"로서 언급될 수 있다. 따라서, 용어 "활성제(active agent)"는 화합물 I 또는 결정형 I' 뿐만 아니라 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 전형적으로 화합물 I 또는 결정형 I'의 치료적 유효량을 포함한다. 그러나, 당해 분야의 당업자는 약학적 조성물은 벌크 조성물에서와 같이 치료적 유효량보다 많이, 또는 치료적 유효량보다 적게, 즉 치료적 유효량을 이루기 위해 복수회의 투여를 위해 계획된 개개의 단위 투여(unit dose)로 치료적 유효량보다 적게 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 통상적으로, 조성물은 제제 그 자체, 투여 경로, 투여 빈도수, 및 기타 등등에 의존하여, 실제 함량을 갖는 활성제를 약 0.01-99 wt % 함유할 것이다. 일 구체예에서, 경구 투여 제형에 적절한 조성물은 예를 들면, 약 10-99 wt %, 또는 약 55-99 wt %의 활성제를 포함할 수 있다.

임의의 통상적인 담체 또는 부형제가 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있다. 특정한 담체 또는 부형제, 또는 담체와 부형제의 배합에 대한 선택은 특정한 환자를 치료하는데 사용될 투여 방식 또는 의학적 상태의 유형 또는 질병 상태에 의존할 것이다. 이와 관련하여, 특정한 투여 방식을 위한 적절한 조성물의 제조법은 약제학 분야에 있는 당업자들의 범위 내에 있다. 추가적으로, 이러한 조성물에 사용되는 담체 또는 부형제는 상업적으로 입수가능하다. 예를 들면, 통상적인 제제 방법은 Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 20^th Edition, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000); and H. C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7^th Edition, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999)에서 기술되어 있다.

약학적으로 허용가능한 담체로 사용될 수 있는 물질의 대표적인 예는 하기의 담체를 포함하지만, 이들에 제한되는 것이 아니다: 락토오스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당류; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; 미세결정형 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스, 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 유도체; 분말형 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 탈크; 코코아 버터 및 좌제용 왁스와 같은 부형제; 땅콩 오일, 면실유, 홍화씨유, 참기름, 올리브 기름, 옥수수 기름 및 콩기름과 같은 기름; 프로필렌글리콜과 같은 글리콜; 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; 아가; 마그네슘 히드록시드와 알루미늄 히드록시드와 같은 완충제; 알긴산; 발열 물질이 없는 물(pyrogen-free water); 등장성 식염수; 링거 용액; 에틸 알코올; 포스페이트 완충 용액; 클로로플루오로탄소 및 히드로플루오로탄소와 같은 압축된 추진체 기체; 및 약학적 조성물에서 사용되는 다른 무독성의 양립 가능한 물질.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 마그네슘 스테아레이트이다. 예를 들어, 상기 약학적 조성물은 화합물 I 또는 결정형 I' 대 마그네슘 스테아레이트의 약 3:1 내지 약 10:1의 비로 화합물 I 또는 결정형 I' 및 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 화합물 I 또는 결정형 I' 대 마그네슘 스테아레이트의 다른 비율은 1:1, 5:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1 및 50:1을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I' 대 마그네슘 스테아레이트의 양은 중량%로서 표현될 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물은 99 wt%의 화합물 I 또는 결정형 I' 및 1 wt%의 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I' 대 마그네슘 스테아레이트의 중량비는 각각 85:15 내지 99:1이다. 바람직한 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I' 대 마그네슘 스테아레이트의 중량비는 95:5 내지 99:1, 바람직하게는 99:1이다.

약학적 조성물은 통상적으로는 약학적으로 허용가능한 담체 및 하나 이상의 선택적인 성분을 활성제와 완전히 및 직접적으로 혼합하거나 또는 블렌딩함으로써 제조된다. 그 결과로 얻은 균일하게 블렌딩된 혼합물은 통상적인 방법과 장비를 사용하여 형태로 만들어지거나 또는 정제, 캡슐, 환약, 카니스터, 카트리지, 분배기 및 그 등가물 안에 충진될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 경구 투여를 위해 적절하다. 경구 투여를 위한 적절한 조성물은 캡슐, 정제, 환약, 로젠지(lozenge), 교갑(cachet), 당의정(dragee), 분말, 과립; 수성 또는 비-수성 액체에서의 용액 또는 현탁액; 수중유 (oil-in-water) 또는 유중수형(water-in-oil) 액체 에멀젼; 엘릭시르 또는 시럽; 및 그 등가물의 제형으로 될 수 있고; 각각은 활성제의 예정된 함량을 포함한다.

조성물이 고체형 투여 제형(캡슐, 정제, 환약 및 그 등가물)으로 경구 투여를 목적으로 할 때, 조성물은 통상적으로는 활성제, 및 소듐 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트와 같은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 것이다. 고체형 투여 제형은 또한 전분, 미세결정형 셀룰로오스, 락토오스, 수크로스, 글루코스, 만니톨, 및/또는 규산과 같은 충진제(filler) 또는 증량제(extender); 카르복시메틸셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로스 및/또는 아카시아와 같은 결합제; 글리세롤과 같은 습윤제; 아가-아가, 탄산 칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 임의의 실리케이트, 및/또는 탄산 나트륨과 같은 붕해제; 파라핀과 같은 용해 지연제; 4차 암모늄 화합물과 같은 흡수 가속화제; 세틸 알코올 및/또는 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 보습제; 카올린 및/또는 벤토나이트 클레이와 같은 흡수제; 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체형 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 술페이트, 및/또는 이들의 혼합물과 같은 윤활제; 색소제; 및 완충제를 포함할 수 있다. 본 발명의 목적에 대해, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 상기 기술된 바와 같은 담체, 충진제 또는 증량체, 보습제, 용해 지연제, 흡윤제, 흡수제, 윤활제, 색소제 및 완충화제와 같은 모든 용어를 포함한다

방출제, 보습제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 향료, 방부제 및 항산화제가 또한 약학적 조성물에 존재할 수 있다. 정제, 캡슐, 환약 및 그 등가물을 위한 예를 든 코팅제는 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트, 메타크릴산-메타크릴산 에스테르 공중합체, 셀룰로오스 아세테이트 트리멜러테이트(trimellitate), 카르복시메틸 에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스 아세테이트 숙시네이트, 및 그 등가물과 같은 장용성 코팅(enteric coating)을 위해 사용되는 코팅제를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 항산화제의 예는 하기를 포함한다: 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산 나트륨, 메타비술페이트(metabisulfate) 나트륨, 아황산 나트륨 및 그 등가물과 같은 수-가용성 항산화제; 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 히드록시 아니솔, 부틸화된 히드록시톨루엔, 레시친, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤, 및 그 등가물과 같은 오일-가용성 항산화제; 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산, 소르비톨, 타르타르산, 인산, 및 그 등가물과 같은 금속-킬레이트제.

조성물은 또한 예를 들면, 다양한 비율로 된 히드록시프로필 메틸셀룰로오스를 사용하거나 또는 다른 중합체 기제, 리포좀 및/또는 미소구(microsphere)를 사용하여, 활성제의 서 방출 또는 제어 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다. 게다가, 본 발명의 약학적 조성물은 유탁제(opacifying agent)를 포함할 수 있고, 위장관의 임의의 부분에서만, 또는 우선적으로, 선택적으로는 지연된 방식으로 활성제를 방출하도록 제제화될 수 있다. 사용될 수 있는 내장 조성물(embedding composition)의 예는 중합체 기질과 왁스를 포함한다. 활성제는 또한 선택적으로는 상기 기술된 부형제 중 하나 이상과 함께, 마이크로-캡슐화된 제형 안에 있을 수 있다.

본 발명의 일 구체예는 캡슐, 정제, 액체 또는 현탁액으로 화합물 I 또는 결정형 I'을 포함하는 경구 제형을 포함한다. 본 발명의 다른 구체예는, 개체에서 화합물 I 또는 결정형 I'의 방출이 즉각적이거나, 제어되거나, 지연된 방출인 경구 제형에 관한 것이다. 캡슐이 경구 제형으로 사용되는 경우, 다른 구체예는 젤라틴, 폴리사카리드 또는 합성 폴리머로 구성된 캡슐을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 캡슐은 히드록시프로필 메틸셀룰로오스를 포함한다.

본 발명에 따른 적절한 캡슐 물질이 젤라틴, 셀룰로스 유도체, 스타치, 스타치 유도체, 키토산 및 합성 플라스틱으로부터 선택된다. 젤라틴이 캡슐 물질로 사용되는 경우, 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 글리세롤, 소르비톨, 폴리프로필렌글리콜, PEO-PPO 블록 코폴리머 및 기타 폴리알콜 및 폴리에테르로부터 선택된 다른 첨가제와 혼합하여 사용될 수 있다. 셀룰로스 유도체가 캡슐 물질로 사용되는 경우, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시메틸셀룰로스 및 히드록시에틸셀룰로스가 바람직한 폴리머이다. 합성 플라스틱이 캡슐 물질로 사용되는 경우, 폴리에틸렌, 폴리카르보네이트, 폴리에스테르, 폴리프로필렌 및 폴리에틸렌 테레프탈레이트가 바람직한 물질이다. 특히 바람직한 것은 폴리에틸렌, 폴리카르보네이트 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트이다.

적절한 경구투여용 액체 투여 제형은 예시로서, 약학적 허용 가능한 에멀전, 마이크로에멀전, 용액, 현탁액, 시럽제, 및 엘릭서제를 포함한다. 액체 투여 제형은 보통 활성제, 및 불활성 희석제, 예를 들어 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들어 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (예를 들어, 면실유, 땅콩 기름, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라히드로푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 그의 혼합물을 포함한다. 현탁액은 현탁화제, 예를 들어 에톡시화된 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미정질 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸트, 및 그의 혼합물을 함유할 수 있다.

경구 투여를 목적으로 하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 단위 투여 제형으로 패키징(package)될 수 있다. 용어 "단위 투여 제형(unit dosage form)"은 환자에게 투여하기에 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고, 즉, 각 단위는 단독으로, 또는 하나 이상의 추가적인 단위와 조합되어 원하는 치료 효과를 발생시키도록 계산된 미리 정해진 양의 활성제를 함유한다. 예를 들어, 이러한 단위 제형은 캡슐, 정제, 환제 등일 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 흡입 투여에 적합하고, 보통 에어로졸 또는 분말의 형태일 것이다. 이러한 조성물은 일반적으로 잘 알려진 전달 장치, 예를 들어 네뷸라이저(nebulizer), 건조 분말, 또는 정량식 흡입기(metered-dose inhaler)를 사용하여 투여된다. 네뷸라이저 장치는 조성물이 환자의 호흡 기도 내로 운반되는 미스트(mist)로서 분사되도록 하는, 고속의 기류를 생성한다. 예시적인 네뷸라이저 제형은 담체에 용해되어 용액을 형성하거나, 또는 미분화(micronized)되고 담체와 조합되어 호흡가능한 크기의 미분화 입자의 현탁액을 형성하는 활성제를 포함한다. 건조 분말 흡입기는 활성제를, 흡입 동안 환자의 기류 중에 분산되는 자유-유동성 (free-flowing) 분말로서 투여한다. 예시적 건조 분말 제형은 부형제, 예를 들어 락토스, 전분, 만니톨, 덱스트로스, 폴리락트산, 폴리락티드-글리콜리드 공중합체(polylactide-co-glycolide), 및 이들의 조합과 건조-블렌딩된(dry-blended) 활성제를 포함한다. 정량식 흡입기는 압축된 추진제 가스를 사용하여 활성제의 측정된 양을 배출한다. 예시적인 정량식 제형은 액화된 추진제, 예를 들어 클로로플루오로카본 또는 히드로플루오로알칸 중 활성제의 용액 또는 현탁액을 포함한다. 이러한 제형의 선택적 성분은 공-용매, 예를 들어 에탄올 또는 펜탄, 및 계면활성제, 예를 들어 소르비탄 트리올레에이트, 올레산, 레시틴, 글리세린 및 소듐 라우릴 술페이트를 포함한다. 이러한 조성물은 보통 활성제, 에탄올 (존재하는 경우), 및 계면활성제 (존재하는 경우)를 함유한 적절한 용기에 냉각되거나 가압된 히드로플루오로알칸을 첨가함으로써 제조된다. 현탁액을 제조하기 위해, 활성제는 미분화되고 그 후 추진제와 함께 조합한다. 대안적으로, 현탁액 제형은 활성제의 미분화된 입자 상에 계면활성제 코팅을 분무건조함으로써 제조될 수 있다. 상기 제형은 그 후 에어로솔 캐니스터 내에 적재되어, 흡입기의 일부분을 형성한다.

화합물 I 또는 결정형 I' 및 이의 조성물은 또한 비경구적으로, 예를 들어, 피하, 정맥내, 근육내, 또는 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다. 이러한 투여를 위해, 활성제는 멸균 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로 제공된다. 그러한 제형을 제조하기 위한 예시적 용매는 물, 염수, 전해물질, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 저분자량 알콜, 오일, 아미노산, 젤라틴, 슈거, 에틸 올레에이트와 같은 지방산 에스테르 등을 포함한다. 비경구 제형은 또한 하나 이상의 항산화제, 가용화제, 안정화제, 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 계면 활성제, 추가적인 안정화제 또는 pH 조절제 (산, 염기 또는 완충제) 및 항산화제는 특히, 제형에 안정성를 제공하는데, 예를 들어, 화합물 내에 존재할 수 있는 에스테르 및 아미드 연결 (linkage)의 가수분해를 최소화하거나 회피하는데 유용하다. 이 제형들은 멸균 주사용 매질, 살균제, 여과, 방사선조사 또는 열을 사용하여 무균 상태로 만들 수 있다.

대표적인 생리학적-허용가능한 수성 담체는, 예로서, 주사용 멸균수 (Sterile Water for Injection), USP; 덱스트로스 주사 (Dextrose Injection), USP (예컨대, 2.5, 5.0, 10, 20% 덱스트로스, 5%의 덱스트로스 주사 (D5/W) 포함); 덱스트로스 및 소듐 클로리드 주사, USP (예컨대, 2.5 내지 10%의 덱스트로스 범위 및 0.12 (19 mEq 나트륨) 내지 0.9% (154 mEq 나트륨) 범위의 나트륨 클로리드); 만니톨 주사, USP, (예컨대, 5, 10, 15, 20 및 25%의 만니톨); 링거 주사 (Ringer's Injection), USP (예컨대, 리터 당 147 mEq 나트륨, 4 mEq 포타슘, 4.5 mEq 칼슘 및 156 mEq 클로리드); 락테이트 링거 주사 (Lactated Ringer's Injection), USP (예컨대, 리터 당 2.7 mEq 칼슘, 4 mEq 포타슘, 130 mEq 나트륨, 및 28 mEq 락테이트); 나트륨 클로리드 주사, USP (예컨대, 0.9% 소듐 클로리드) 등을 포함한다.

환자에게 투여되는 경우, 상기 화합물 I 또는 결정형 I'은 통상적으로 화합물 I 또는 결정형 I'의 mg 당 약 0.5 mL 내지 약 10 mL, 가령 mg 당 약 0.6내지 약 8 mL의 수성 담체로 희석될 것이다.

일 특정 구체예에서, 비경구 제형은 약학적 허용가능한 담체로서 수성 시클로덱스트린 용액을 포함한다. 적절한 시클로덱스트린은 아밀라아제, β-시클로덱스트린 또는 시클로헵타아밀로오스에서와 같은 연결에 의해 1,4위치에서 연결된, 6개 이상의 α-D-글루코피라노스 단위를 갖는 시클릭 분자를 포함한다. 예시되는 시클로덱스트린은 시클로덱스트린 유도체, 예를 들어 히드록시프로필, 및 술포부틸 에테르 시클로덱스트린, 예를 들어 히드록시프로필-β-시클로덱스트린 및 술포부틸 에테르 β-시클로덱스트린을 포함한다. 이러한 제형을 위한 예시되는 완충제는 카르복실산-기반 완충제, 예를 들어 시트레이트, 락테이트 및 말레에이트 완충 용액을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 정맥내 투여 제형은 완충 용액 중 화합물 I 또는 결정형 I'을 포함한다.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I' 또는 그 약학적 조성물은 동결건조된 분말이다. 전형적으로, 상기 동결건조된 분말은 멸균되고, 밀폐-밀봉된 바이알 (hermetically-sealed vial) 또는 앰플 (ampoule) 또는 유사한 용기에 포장된다.

화합물 I 또는 결정형 I'은 공지된 경피 전달 시스템 및 부형제를 사용하여 경피적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 화합물 I 또는 결정형 I'은 투과 촉진제, 예를 들어 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 모노라우레이트, 아자시클로알칸-2-온 등과 혼합되고, 패치(patch) 또는 유사한 전달 시스템에 혼입될 수 있다. 겔화제, 유화제 및 완충제를 포함한 추가적 부형제는, 바람직하다면, 이러한 경피용 조성물에 사용될 수 있다.

제2 작용제(Agents)

화합물 I 또는 결정형 I'은 화합물 I 또는 결정형 I'은 질환의 단독 치료제(sole treatment)로서 유용할 수 있고, 또는 원하는 치료 효과를 얻기 위해 하나 이상의 추가적인 치료제와 조합될 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 화합물 I 또는 결정형 I'과 조합-투여되는 다른 약물을 함유한다. 예를 들어, 상기 조성물은 하나 이상의 약물("제2 작용제(들)"로도 지칭됨)을 더 포함할 수 있다. 이러한 치료제는 당업계에서 잘 알려져 있고, 아데노신 수용체 길항제, α-아드레날린성 수용체 길항제, β1-아드레날린성 수용체 길항제, β2-아드레날린성 수용체 효능제, 이중-작용 β-아드레날린성 수용체 길항제/α1-수용체 길항제, 최종 당화 산물 분해제(advanced glycation end product breaker), 알도스테론 길항제, 알도스테론 신타제 저해제, 아미노펩티다제 N 저해제, 안드로겐, 안지오텐신-전환 효소 저해제 및 이중-작용 안지오텐신-전환 효소/네프릴리신 저해제, 안지오텐신-전환 효소 2 활성제 및 촉진제, 안지오텐신-II 백신, 항응고제, 항-당뇨제, 지사제, 항-녹내장제(anti-glaucoma agent), 항-지질제, 항통증제(antinociceptive agent), 항-혈전제, AT₁ 수용체 길항제 및 이중-작용 AT₁ 수용체 길항제/네프릴리신 저해제 및 다기능성 안지오텐신 수용체 차단제(blocker), 브라디키닌 수용체 길항제, 칼슘 채널 차단제, 키마제 저해제, 디곡신, 이뇨제, 도파민 효능제, 엔도텔린 전환 효소 저해제, 엔도텔린 수용체 길항제, HMG-CoA 리덕타제 (reductase) 저해제, 에스트로겐, 에스트로겐 수용체 효능제 및/또는 길항제, 모노아민 재흡수 저해제, 근육 이완제, 나트륨이뇨 펩티드 및 그의 유사체, 나트륨이뇨 펩티드 제거 수용체 길항제, 네프릴리신 저해제, 산화 질소 공여체, 비-스테로이드성 항염증제, N-메틸 d-아스파르테이트 수용체 길항제, 오피오이드 수용체 효능제, 포스포디에스테라제 저해제 (예를 들어, PDE5 및 PDE9), 프로스타글란딘 유사체, 프로스타글란딘 수용체 효능제, 레닌 저해제, 선택적 세로토닌 재흡수 저해제, 나트륨 채널 차단제, 가용성 구아닐레이트 시클라제 촉진제 및 활성화제, 트리시클릭 항우울제, 바소프레신 수용체 길항제, 및 이들의 조합. 이러한 작용제의 구체적인 예가 본 명세서에 상술된다.

특정 구체예는 화합물 I 또는 결정형 I', 및 AT₁ 수용체 길항제, 안지오텐신-전환 효소 저해제, 포스포디에스테라제 (PDE) 저해제, 레닌 저해제, 이뇨제, 또는 그 조합, 및 선택적으로 하나 이상의 약학적 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.

따라서, 본 발명의 또 다른 양상에서, 약학적 조성물은 화합물 I 또는 결정형 I', 제2 활성제, 및 약학적 허용가능한 담체를 포함한다. 제3, 제4 등의 활성제가 또한 상기 조성물에 포함될 수 있다. 조합 요법에서, 투여되는 화합물 I 또는 결정형 I'의 양 및 제2 작용제의 양은 단일 요법(monotherapy)에서 통상적으로 투여되는 양보다 적을 수 있다.

화합물 I 또는 결정형 I'은 제2 활성제와 물리적으로 혼합되어 작용제 둘다 함유하는 조성물을 형성하거나; 또는 각각의 작용제가 동시에 또는 개별적 시간에 환자에게 투여되는 별개의 분리된 조성물 중에 존재할 수 있다. 예를 들어, 화합물 I 또는 결정형 I'은 통상적인 공정 및 장비를 사용하여 제2 활성제와 조합되어, 화합물 I 또는 결정형 I' 및 제2 활성제를 포함하는, 활성제들의 조합을 형성할 수 있다. 추가적으로, 상기 활성제는 약학적 허용가능한 담체와 조합되어 화합물 I 또는 결정형 I', 제2 활성제 및 약학적 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 형성할 수 있다. 본 구체예에서, 상기 조성물의 구성성분은 보통 혼합 또는 블렌딩되어 물리적 혼합물을 생성한다. 상기 물리적 혼합물은 그 후 본 명세서에서 개시된 임의의 경로를 이용하여 치료적 유효량으로 투여된다.

대안적으로, 상기 활성제는 환자에게 투여되기 전에, 분리된 별개의 상태를 유지할 수 있다. 본 구체예에서, 상기 작용제는 투여 전에 물리적으로 함께 혼합되지 않으나, 분리된 조성물로서 동시에 또는 별개의 시간에 투여된다. 이러한 조성물은 별개로 패키징되거나 또는 키트 내에 함께 패키징될 수 있다. 별개의 시간에 투여 는 경우, 제2 작용제는 보통 화합물 I 또는 결정형 I'의 투여 후 24시간 내, 본 발명의 화합물 투여와 동시 시점부터 투여후 약 24시간 경과 시점까지의 임의의 시점에 투여될 것이다. 이것은 순차적 투여로도 지칭된다. 따라서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 각각의 활성제에 대해 1정씩, 2정의 정제를 사용하여 또다른 활성제와 동시에 또는 순차적으로 경구 투여될 수 있고, 여기서 순차적이란 화합물 I 또는 결정형 I'의 투여 직후, 또는 미리 정해진 시간 경과 후 (예를 들어, 1시간 후 또는 3시간 후)에 투여되는 것을 의미할 수 있다. 화합물 I 또는 결정형 I'의 투여 후 24시간 이후에 제2 작용제가 투여될 수 있다는 것도 또한 고려된다. 대안적으로, 상기 조합은 서로 다른 투여 경로로 투여될 수 있으며, 즉, 하나는 경구 및 다른 하나는 흡입으로 투여될 수 있다.

일 구체예에서, 키트는 화합물 I 또는 결정형 I'을 포함하는 제1 투여 제형, 및 본 명세서에 제시된 제2 작용제들 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 추가적인 투여 제형을 본 발명의 방법을 수행하기에 충분한 양으로 포함한다. 제1 투여 제형 및 제2 (또는 제3 등) 투여 제형은 함께, 환자의 질환 또는 의학적 상태의 치료 또는 예방을 위한 활성제들의 치료적 유효량을 포함한다.

제2 작용제(들)는 포함되는 경우, 치료적 유효량으로 존재하여, 일반적으로 본 발명의 화합물 I 또는 결정형 I'과 조합-투여되었을 경우, 치료적으로 유익한 효과를 나타내는 양으로 투여될 수 있게 한다. 상기 제2 작용제는 약학적 허용가능한 염, 용매화합물, 선택적으로는 순수한 입체이성질체 등의 형태일 수 있다. 상기 제2 작용제는 또한, 프로드러그, 예를 들어, 에스테르화된 카르복실산 기를 갖는 화합물의 형태일 수 있다. 따라서, 본 명세서에 열거된 제2 작용제는 모든 이러한 형태들을 포함하는 것으로 의도되고, 상업적으로 이용가능하거나 또는 통상의 방법 및 시약을 사용하여 제조될 수 있다.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 아데노신 수용체 길항제와 조합하여 투여되며, 그 예는 낙시필린(naxifylline), 롤로필린(rolofylline), SLV-320, 테오필린(theophylline), 및 토나포필린(tonapofylline)을 포함한다.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 α-아드레날린성 수용체 길항제와 조합되어 투여되며, 그 예는 독사조신(doxazosin), 프라조신(prazosin), 탐술로신(tamsulosin), 및 테라조신(terazosin)을 포함한다.

화합물 I 또는 결정형 I'은 또한 β1-아드레날린성 수용체 길항제 ("β1-차단제")와 조합되어 투여되며, 그 예는 아세부톨롤 (acebutolol), 알프레놀롤(alprenolol), 아모술라롤(amosulalol), 아로티놀롤(arotinolol), 아테놀롤 (atenolol), 베푸놀롤(befunolol), 베탁솔롤(betaxolol), 베반톨롤(bevantolol), 비소프롤롤(bisoprolol), 보핀돌롤(bopindolol), 부신돌롤(bucindolol), 부쿠몰롤(bucumolol), 부페톨롤(bufetolol), 부푸랄롤 (bufuralol), 부니트롤롤(bunitrolol), 부프라놀롤(bupranolol), 부브리딘(bubridine), 부토필롤롤(butofilolol), 카라졸롤(carazolol), 카르테올롤(carteolol), 카르베딜롤(carvedilol), 셀리프롤롤 (celiprolol), 세타몰롤(cetamolol), 클로라놀롤(cloranolol), 딜레발롤(dilevalol), 에파놀롤(epanolol), 에스몰롤(esmolol), 인데놀롤(indenolol), 라베톨롤(labetolol), 레보부놀롤(levobunolol), 메핀돌롤 (mepindolol), 메티프라놀롤(metipranolol), 메토프롤롤 숙시네이트 및 메토프롤롤 타르트레이트와 같은 메토프롤롤(metoprolol), 모프롤롤(moprolol), 나돌롤(nadolol), 나독솔롤(nadoxolol), 네비발롤(nebivalol), 니프라딜롤(nipradilol), 옥스프레놀롤(oxprenolol), 펜부톨롤(penbutolol), 페르부톨롤(perbutolol), 핀돌롤(pindolol), 프락톨롤(practolol), 프로네탈롤(pronethalol), 프로프라놀롤(propranolol), 소탈롤(sotalol), 수피날롤(sufinalol), 탈린돌(talindol), 테르타톨롤(tertatolol), 틸리솔롤(tilisolol), 티몰롤(timolol), 톨리프롤롤(toliprolol), 지베놀롤(xibenolol), 및 이들의 조합을 포함한다. 일 특정 구체예에서, β1-길항제는 아테놀롤, 비소프롤롤, 메토프롤롤, 프로프라놀롤, 소탈롤, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 통상적으로, β1-차단제는 투여량당 약 2-900 mg를 제공하기에 충분한 양으로 투여될 것이다.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 β2-아드레날린성 수용체 효능제와 조합하여 투여되고, 그 예는 알부테롤 (albuterol), 비톨테롤(bitolterol), 페노테롤(fenoterol), 포르모테롤(formoterol), 인다카테롤 (indacaterol), 이소에타린(isoetharine), 레발부테롤(levalbuterol), 메타프로테레놀(metaproterenol), 피르부테롤(pirbuterol), 살부타몰(salbutamol), 살메파몰(salmefamol), 살메테롤(salmeterol), 테르부탈린 (terbutaline), 빌란테롤(vilanterol) 등을 포함한다. 보통, 상기 β2-아드레날린성 수용체 효능제는 투여량 당 0.05-500 ㎍를 제공하기에 충분한 양으로 투여될 것이다.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 최종 당화 산물(AGE) 분해제와 조합하여 투여되고, 그 예는 알라게브라움 (alagebrium)(또는 ALT-711) 및 TRC4149를 포함한다.

다른 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 알도스테론 길항제와 조합되어 투여되며, 그 예는 에플레레논(eplerenone), 스피로노락톤(spironolactone), 및 이들의 조합을 포함한다. 통상적으로, 알도스테론 길항제는 1일 당 약 5-300 mg을제공하기에 충분한 양으로 투여될 것이다.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 아미노텝티다제 N 또는 디펩티딜 펩티다제 III 저해제와 조합하여 투여되고, 그 예는 베스타틴(bestatin) 및 PC18 (2-아미노-4-메틸술포닐 부탄 티올, 메티오닌 티올)을 포함한다.

화합물 I 또는 결정형 I'은 또한 안지오텐신-전환 효소(ACE) 저해제와 조합하여 투여될 수 있고, 그 예는 아쿠프릴 (accupril), 알라세프릴(alacepril), 베나제프릴(benazepril), 베나제프릴라트(benazeprilat), 카프토프릴(captopril), 세라나프릴(ceranapril), 실라자프릴(cilazapril), 델라프릴(delapril), 에날라프릴(enalapril), 에날라프릴라트(enalaprilat), 포시노프릴(fosinopril), 포시노프릴라트(fosinoprilat), 이미다프릴 (imidapril), 리시노프릴(lisinopril), 모엑시프릴(moexipril), 모노프릴(monopril), 모벨토프릴 (moveltopril), 펜토프릴(pentopril), 페린도프릴(perindopril), 퀴나프릴(quinapril), 퀴나프릴라트(quinaprilat), 라미프릴(ramipril), 라미프릴라트(ramiprilat), 사랄라신 아세테이트(saralasin acetate), 스피라프릴(spirapril), 테모카프릴(temocapril), 트란돌라프릴(trandolapril), 조페노프릴(zofenopril), 및 이들의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 ACE 저해제는 베나제프릴, 카프토프릴, 에날라프릴, 리시노프릴, 라미프릴 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 전형적으로, 상기 ACE 저해제는 1일 약 1-150 mg을 제공하기에 충분한 양으로 투여될 것이다.

또 다른 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 이중-작용 안지오텐신-전환 효소/네프릴리신(ACE/NEP) 저해제와 조합하여 투여되고, 그 예는 하기를 포함한다: AVE-0848 ((4S,7S,12bR)-7-[3-메틸-2(S)-술파닐부티르아미도]-6-옥소-1,2,3,4,6,7,8,12b-옥타히드로피리도[2,1-a][2]-벤자제핀-4-카르복실산); AVE-7688 (일레파트릴) 및 그 모(parent) 화합물; BMS-182657 (2-[2-옥소-3(S)-[3-페닐-2(S)-술파닐프로피온아미도]-2,3,4,5-테트라히드로-1H-1-벤자제핀-1-일]아세트산); CGS-35601 (N-[1-[4-메틸-2(S)-술파닐펜탄아미도]시클로펜틸카르보닐]-L-트립토판); 파시도트릴(fasidotril); 파시도트릴레이트(fasidotrilate); 에날라프릴라트(enalaprilat); ER-32935 ((3R,6S,9aR)-6-[3(S)-메틸-2(S)-술파닐펜탄아미도]-5-옥소퍼히드로티아졸로[3,2-a]아제핀-3-카르복실산); 젬파트릴라트(gempatrilat); MDL-101264 ((4S,7S,12bR)-7-[2(S)-(2-모르폴리노아세틸티오)-3-페닐프로피온아미도]-6-옥소-1,2,3,4,6,7,8,12b-옥타히드로피리도[2,1-a][2]벤자제핀-4-카르복실산); MDL-101287 ([4S-[4α,7α(R*),12bβ]-7-[2-(카르복시메틸)-3-페닐프로피온아미도]-6-옥소-1,2,3,4,6,7,8,12b-옥타히드로피리도[2,1-a][2]벤자제핀-4-카르복실산); 오마파트릴라트(omapatrilat); RB-105 (N-[2(S)-(머캅토메틸)-3(R)-페닐부틸]-L-알라닌); 삼파트릴라트; SA-898 ((2R,4R)-N-[2-(2-히드록시페닐)-3-(3-머캅토프로피오닐)티아졸리딘-4-일카르보닐]-L-페닐알라닌); Sch-50690 (N-[1(S)-카르복시-2-[N2-(메탄술포닐)-L-리실아미노]에틸]-L-발릴-L-티로신); 및 이들의 조합이 또한 포함될 수 있다. 일 특정 구체예에서, 상기 ACE/NEP 저해제는 다음으로부터 선택된다: AVE-7688, 에날라프릴라트, 파시도트릴, 파시도트릴레이트, 오마파트릴라트, 삼파트릴라트, 및 이들의 조합.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 안지오텐신-전환 효소 2 (ACE2) 활성화제 또는 촉진제와 조합하여 투여된다.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 안지오텐신-II 백신과 조합하여 투여되고, 그 예는 ATR12181 및 CYT006-AngQb를 포함한다.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 항응고제와 조합하여 투여되는데, 그 예는 다음을 포함한다: 쿠마린(coumarin), 예를 들어 와파린(warfarin); 헤파린(heparin); 및 직접적 트롬빈 저해제(direct thrombin inhibitor), 예를 들어 아르가트로반(argatroban), 비발리루딘(bivalirudin), 다비가트란(dabigatran) 및 레피루딘(lepirudin).

또 다른 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 항-당뇨제와 조합하여 투여되고, 그 예는 주사용 약물(injectable drug)과 경구 효과적인 약물(orally effective drug) 및 이들의 조합을 포함한다. 주사용 약물의 예는 인슐린 및 인슐린 유도체를 포함한다. 경구 효과적인 약물의 예는 하기를 포함한다: 비구아니드(biguanides), 예를 들어 메트포르민(metformin); 글루카곤 길항제; α-글루코시다제 저해제, 예를 들어 아카르보스(acarbose) 및 미글리톨 (miglitol); 디펩티딜 텝티다제 IV 저해제 (DPP-IV 저해제), 예를 들어 알로글립틴(alogliptin), 데나글립틴(denagliptin), 리나글립틴(linagliptin), 삭사글립틴(saxagliptin), 시타글립틴(sitagliptin), 및 빌다글립틴(vildagliptin); 메글리티니드(meglitinide), 예를 들어 레파글리니드(repaglinide); 옥사디아졸리디네디온 (oxadiazolidinedione); 술포닐우레아, 예를 들어 클로르프로파미드(chlorpropamide), 글리메피리드 (glimepiride), 글리피지드(glipizide), 글리부리드(glyburide), 및 톨라자미드(tolazamide); 티아졸리디네디온(thiazolidinedione), 예를 들어, 피오글리타존(pioglitazone) 및 로지글리타존(rosiglitazone); 및 이들의 조합.

다른 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 지사 치료(antidiarrheal treatment)와 조합하여 투여된다. 대표적인 치료 옵션은 경구용 재수화 용액(oral rehydration solution: ORS), 로페르아미드(loperamide), 디페녹실레이트(diphenoxylate), 및 비스무트 서브살리실레이트(bismuth subsalicylate)를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 항녹내장제와 조합하여 투여되고, 그 예는 하기를 포함한다: α-아드레날린성 효능제, 예를 들어 브리모니딘(brimonidine); β1-아드레날린성 수용체 길항제; 국소 β1-차단제, 예를 들어 베탁솔롤(betaxolol), 레보부놀롤(levobunolol), 및 티몰롤(timolol); 탄산 탈수효소(carbonic anhydrase) 저해제, 예를 들어 아세타졸아미드(acetazolamide), 브린졸아미드(brinzolamide), 또는 도르졸아미드(dorzolamide); 콜린성(cholinergic) 효능제, 예를 들어 세비멜린(cevimeline) 및 DMXB-아나바세인(DMXBanabaseine); 에피네프린(epinephrine) 화합물; 축동제(miotics), 예를 들어 필로카르핀(pilocarpine); 및 프로스타글란딘 유사체.

또 다른 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 항-지질제와 조합하여 투여되고, 그 예는 하기를 포함한다: 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질 저해제(CETP), 예를 들어 아나세트라핍(anacetrapib), 달세트라핍(dalcetrapib), 및 토르세트라핍(torcetrapib); 스타틴(statins), 예를 들어 아토르바스타틴(atorvastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 로바스타틴(lovastatin), 프라바스타틴(pravastatin), 로수바스타틴(rosuvastatin) 및 심바스타틴(simvastatin); 및 이들의 조합.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 항-혈전제와 조합하여 투여되고, 그 예는 하기를 포함한다: 아스피린; 항혈소판제 (anti-platelet agent), 예를 들어 클로피도그렐(clopidogrel), 프라수그렐(prasugrel), 및 티클로피딘(ticlopidine); 헤파린, 및 이들의 조합.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 안지오텐신 II 타입 1 수용체 차단제 (ARB)로도 알려진, AT1 수용체 길항제와 조합하여 투여된다. 대표적인 ARB는 아비테사르탄(abitesartan), 아질사르탄(azilsartan)(예, 아질사르탄 메독소밀), 벤질로사르탄(benzyllosartan), 칸데사르탄(candesartan), 칸데사르탄 실렉세틸(candesartan cilexetil), 엘리사르탄(elisartan), 엠부사르탄(embusartan), 에놀타소사르탄(enoltasosartan), 에프로사르탄 (eprosartan), EXP3174, 폰사르탄(fonsartan), 포라사르탄(forasartan), 글리실로사르탄(glycyllosartan), 이르베사르탄(irbesartan), 이소테올린(isoteoline), 로사르탄(losartan), 메독시밀(medoximil), 밀파사르탄(milfasartan), 올메사르탄(olmesartan)(예, 올메사르탄 메독소밀), 오포미사르탄(opomisartan), 프라토사르탄(pratosartan), 리피사르탄(ripisartan), 사프리사르탄(saprisartan), 사랄라신(saralasin), 사르메신(sarmesin), TAK-591, 타소사르탄(tasosartan), 텔미사르탄(telmisartan), 발사르탄(valsartan), 졸라사르탄(zolasartan) 및 이들의 조합을 포함한다. 일 특정 구체예에서, 상기 ARB는 아질사르탄 메독소밀, 칸데사르탄 실렉세틸, 에프로사르탄, 이르베사르탄, 로사르탄, 올메사르탄 메독소밀, 사프리사르탄, 타소사르탄, 텔미사르탄, 발사르탄 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 예시적 염 및/또는 프로드러그는 칸덴사르탄 실렉세틸, 에프로사르탄 메실레이트, 로사르탄 포타슘 염, 및 올메사르탄 메독소밀을 포함한다. 통상적으로, ARB는 투여량 당 약 4-600 mg을 제공하기에 충분한 양으로 투여될 것이며, 예시적 1일 투여량은 1일 20-320 mg 범위이다.

화합물 I 또는 결정형 I'은 또한 AT1 수용체 길항제/네프릴리신 저해제 (ARB/NEP) 저해제와 같은, 이중-작용제와 조합하여 투여될 수 있고, 그 예는 화합물, 4'-{2-에톡시-4-에틸-5-[((S)-2-머캅토-4-메틸펜타노일아미노)-메틸]이미다졸-1-일메틸}-3'-플루오로비페닐-2-카르복실산과 같은, Allegretti 등의, 미국특허 제7,879,896호 및 제8,013,005호에 기재된 화합물을 포함한다.

화합물 I 또는 결정형 I'은 또한 Kurtz & Klein (2009) Hypertension Research 32:826-834에 기재된 바와 같이, 다기능성 안지오텐신 수용체 차단제와 조합하여 투여될 수 있다.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 브라디키닌 수용체 길항제, 예를 들어, 이카티반트(icatibant)(HOE-140)와 조합하여 투여된다. 이 조합 치료요법은 혈관부종(angioedema) 또는 상승된 브라디키닌 수준의 기타 원치 않는 결과를 예방하는 장점을 제공할 것으로 기대된다.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 칼슘 채널 차단제와 조합되어 투여되고, 그 예는 암로디핀(amlodipine), 아니파밀(anipamil), 아라니핀(aranipine), 바르니디핀(barnidipine), 벤시클란(bencyclane), 베니디핀(benidipine), 베프리딜(bepridil), 클렌티아젬(clentiazem), 실니디핀(cilnidipine), 신나리진(cinnarizine), 딜티아젬(diltiazem), 에포니디핀(efonidipine), 엘고디핀(elgodipine), 에타페논(etafenone), 펠로디핀(felodipine), 펜딜린(fendiline), 플루나리진(flunarizine), 갈로파밀(gallopamil), 이스라디핀(isradipine), 라시디핀 (lacidipine), 레르카니디핀(lercanidipine), 리도플라진(lidoflazine), 로메리진(lomerizine), 마니디핀(manidipine), 미베프라딜(mibefradil), 니카르디핀(nicardipine), 니페디핀(nifedipine), 니굴디핀(niguldipine), 닐루디핀(niludipine), 닐바디핀(nilvadipine), 니모디핀(nimodipine), 니솔디핀 (nisoldipine), 니트렌디핀(nitrendipine), 니발디핀(nivaldipine), 페르헥실린(perhexiline), 프레닐라민 (prenylamine), 리오시딘(ryosidine), 세모티아딜(semotiadil), 테로딜린(terodiline), 티아파밀(tiapamil), 베라파밀(verapamil), 및 이들의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 칼슘 채널 차단제는 암로디핀, 베프리딜, 딜티아젬, 펠로디핀, 이스라디핀, 라시디핀, 니카르디핀, 니페디핀, 니굴디핀, 닐루디핀, 니모디핀, 니솔디핀, 리오시딘, 베라파밀, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 통상적으로, 상기 칼슘 채널 차단제는 1회 투여시 약 2-500 mg를 제공하기에 충분한 양으로 투여될 것이다.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 TPC-806 및 2-(5-포르밀아미노-6-옥소-2-페닐-[0150] 1,6-디히드로피리미딘-1-일)-N-[{3,4-디옥소-1-페닐-7-(2-피리딜옥시)}-2-헵틸]아세트아미드 (NK3201)와 같은, 키마제 저해제와 조합되어 투여된다.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 이뇨제와 조합하여 투여되고, 그 예는 하기를 포함한다: 아세타졸아미드(acetazolamide) 및 디클로르펜아미드(dichlorphenamide)와 같은 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase) 저해제; 아세타졸아미드(acetazolamide), 암부시드(ambuside), 아조세르니드(azosernide), 부메타니드 (bumetanide), 부타졸아미드(butazolamide), 클로르아미노펜아미드(chloraminophenamide), 클로펜아미드(clofenamide), 클로파미드(clopamide), 클로렉솔론(clorexolone), 디술파미드(disulfamide), 에톡솔아미드(ethoxolamide), 퓨로세미드(furosemide), 메프루시드(mefruside), 메타졸아미드(methazolamide), 피레타니드(piretanide), 토르세미드(torsemide), 트리파미드(tripamide), 및 지파미드(xipamide)와 같은 술폰아미드 유도체, 및 에타크린산(ethacrynic acid) 및 티에닐산(tienilic acid), 인다크리논(indacrinione) 및 퀸카르베이트(quincarbate)와 같은 기타 페녹시아세트산 화합물을 포함한, 루프 이뇨제(loop diuretic); 만니톨과 같은, 삼투성 이뇨제(osmotic diuretic); 스피로노락톤(spironolactone)과 같은 알도스테론 길항제, 및 아밀로리드(amiloride) 및 트리암테렌(triamterene)과 같은 Na+ 채널 저해제를 포함하는 칼륨-보존성 이뇨제(potassiumsparing diuretics); 알티아지드(althiazide), 벤드로플루메티아지드(bendroflumethiazide), 벤질히드로클로로티아지드(benzylhydrochlorothiazide), 벤즈티아지드(benzthiazide), 부티아지드(buthiazide), 클로르탈리돈(chlorthalidone), 클로로티아지드(chlorothiazide), 시클로펜티아지드(cyclopenthiazide), 시클로티아지드(cyclothiazide), 에피티아지드(epithiazide), 에티아지드(ethiazide), 펜퀴존(fenquizone), 플루메티아지드(flumethiazide), 히드로클로로티아지드(hydrochlorothiazide), 히드로플루메티아지드(hydroflumethiazide), 인다파미드(indapamide), 메틸클로티아지드(methylclothiazide), 메티크레인(meticrane), 메톨라존 (metolazone), 파라플루티지드(paraflutizide), 폴리티아지드(polythiazide), 퀴네타존(quinethazone), 테클로티아지드(teclothiazide), 및 트리클로로메티아지드(trichloromethiazide)와 같은 티아지드 및 티아지드-유사 이뇨제; 및 이들의 조합. 특정 구체예에서, 상기 이뇨제는 아밀로리드, 부메타니드, 클로로티아지드, 클로르탈리돈, 디클로르펜아미드, 에타크린산, 퓨로세미드, 히드로클로로티아지드, 히드로플루메티아지드, 인다파미드, 메틸클로티아지드, 메톨라존, 토르세미드, 트리암테렌, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 상기 이뇨제는 1일 당 약 5 내지 50 mg, 보다 일반적으로 1일당 6 내지 25 mg을 제공하기에 충분한 양으로 투여될 것이며, 통상적인 투여량은 1일당 6.25 mg, 12.5 mg 또는 25 mg이다.

화합물 I 또는 결정형 I'은 또한 엔도텔린 전환 효소 저해제(ECE)와 조합되어 투여될 수 있으며, 그의 예는 포스포라미돈(phosphoramidon), CGS 26303, 및 이들의 조합을 포함한다.

특정 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 엔도텔린 수용체 길항제와 조합하여 투여되고, 그 예는 다음을 포함한다: 엔도텔린 A 수용체에 영향을 미치는 선택적인 엔도텔린 수용체 길항제, 예를 들어 아보센탄(avosentan), 암브리센탄(ambrisentan), 아트라센탄(atrasentan), BQ-123, 클라조센탄(clazosentan), 다루센탄(darusentan), 시탁센탄(sitaxentan), 및 지보텐탄(zibotentan); 및 엔도텔린 A 및 B 수용체 모두에 영향을 미치는 이중 엔도텔린 수용체 길항제, 예를 들어 보센탄(bosentan), 마시텐탄(macitentan), 및 테조센탄(tezosentan).

또 다른 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 스타틴(statin)으로도 알려진, 하나 이상의 HMG-CoA 리덕타제 저해제와 조합하여 투여된다. 대표적인 스타틴은 아토르바스타틴(atorvastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 로바스타틴(lovastatin), 피타바스타틴(pitavastatin), 프라바스타틴(pravastatin), 로수바스타틴(rosuvastatin) 및 심바스타틴(simvastatin)을 포함한다.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 모노아민 재흡수 저해제와 조합하여 투여되는데, 그 예는 노르에피네프린 재흡수 저해제, 예를 들어 아토모세틴(atomoxetine), 부프로프리온(buproprion) 및 부프로프리온 대사산물 히드록시부프로프리온, 마프로틸린(maprotiline), 레복세틴(reboxetine), 및 빌록사진(viloxazine); 선택적인 세로토닌 재흡수 저해제(SSRI), 예를 들어 시탈로프람(citalopram) 및 시탈로프람 대사산물 데스메틸시탈로프람 (desmethylcitalopram), 다폭세틴(dapoxetine), 에스시탈로프람(escitalopram)(예, 에스시탈로프람 옥살레이트), 플루옥세틴(fluoxetine) 및 플루옥세틴 데스메틸 대사산물 노르플루옥세틴(norfluoxetine), 플루복사민(fluvoxamine)(예, 풀루복사민 말레에이트), 파록세틴(paroxetine), 세르트랄린(sertraline) 및 세르트랄린 대사산물 데메틸세르트랄린; 이중 세로토닌-노르에피네프린 재흡수 저해제(SNRI), 예를 들어 비시파딘(bicifadine), 둘록세틴(duloxetine), 밀나시프란(milnacipran), 네파조돈(nefazodone), 및 벤라팍신(venlafaxine); 및 이들의 조합을 포함한다.

다른 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 근육 이완제와 조합하여 투여되고, 그 예는 하기를 포함한다: 카리소프로돌(carisoprodol), 클로르족사존(chlorzoxazone), 시클로벤자프린(cyclobenzaprine), 디플루니살(diflunisal), 메탁살론(metaxalone), 메토카르바몰(methocarbamol), 및 이들의 조합.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 나트륨이뇨 펩티드 또는 유사체와 조합하여 투여되고, 그 예는 하기를 포함한다: 카르페리티드(carperitide), CD-NP (Nile Therapeutics), CU-NP, 네시리티드(nesiritide), PL-3994 (Palatin Technologies, Inc.), 울라리티드(ularitide), 센데리티드(cenderitide), 및 Ogawa et al (2004) J. Biol. Chem. 279:28625-31에 기재된 화합물. 이 화합물들은 나트륨이뇨 펩티드 수용체-A (NPR-A) 효능제로도 지칭된다. 다른 구체예에서, 화합물 (I) 또는 결정형 (I')은 SC-46542, cANF (4-23), 및 AP-811 (Veale (2000) Bioorg Med Chem Lett 10:1949-52)과 같은 나트륨이뇨 펩티드 제거 수용체 (NPR-C) 길항제와 조합하여 투여된다. 예를 들어, AP-811은 NEP 저해제, 티오르판(thiorphan)(Wegner (1995) Clin. Exper. Hypert. 17:861-876)과 조합될 경우, 상승작용을 보였다.

다른 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 네프릴리신(NEP) 저해제와 조합하여 투여되고, 그 예는 다음을 포함한다: AHU-377; 칸독사트릴(candoxatril); 칸독사트릴라트(candoxatrilat); 덱세카도트릴(dexecadotril) ((+)-N-[2(R)-(아세틸티오메틸)-3-페닐프로피오닐]글리신 벤질 에스테르); CGS-24128 (3-[3-(비페닐-4-일)-2-(포스포노메틸아미노)프로피온아미도]프로피온산); CGS-24592 ((S)-3-[3-(비페닐-4-일)-2-(포스포노메틸아미노)프로피온아미도]프로피온산); CGS-25155 (N-[9(R)-(아세틸티오메틸)-10-옥소-1-아자시클로데칸-2(S)-일카르보닐]-4(R)-히드록시-L-프롤린 벤질 에스테르); Hepworth et al. (Pfizer Inc.)에 의한 WO 2006/027680에 기재된 3-(1-카르바모일시클로헥실)프로피온산 유도체; JMV-390-1 (2(R)-벤질-3-(N-히드록시카르바모일)프로피오닐-L-이소류실-L-루신); 에카도트릴(ecadotril); 포스포르아미돈(phosphoramidon); 레트로티오르판(retrothiorphan); RU-42827 (2-(머캅토메틸)-N-(4-피리디닐)벤젠프로피온아미드); RU-44004(N-(4-모르폴리닐)-3-페닐-2-(술파닐메틸)프로피온아미드); SCH-32615 ((S)-N-[N-(1-카르복시-2-페닐에틸)-L-페닐알라닐]-β-알라닌) 및 그 프로드러그 SCH-34826((S)-N-[N-[1-[[(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)메톡시]카르보닐]-2-페닐에틸]-L-페닐알라닐]-β-알라닌); 시알오르핀(sialorphin); SCH-42495 (N-[2(S)-(아세틸술파닐메틸)-3-(2-메틸페닐)프로피오닐]-L-메티오닌 에틸 에스테르); 스핀오르핀(spinorphin); SQ-28132 (N-[2-(머캅토메틸)-1-옥소-3-페닐프로필]루신); SQ-28603 (N-[2-(머캅토메틸)-1-옥소-3-페닐프로필]-β-알라닌); SQ-29072 (7-[[2-(머캅토메틸)-1-옥소-3-페닐프로필]아미노]헵탄산); 티오르판 및 그 프로드러그 라세카도트릴(racecadotril); UK-69578 (시스-4-[[[1-[2-카르복시-3-(2-메톡시에톡시)프로필]시클로펜틸]카르보닐]아미노] 시클로헥산카르복실산); UK-447,841 (2-{1-[3-(4-클로로페닐)프로필카르바모일]-시클로펜틸메틸}-4-메톡시부티르산); UK-505,749 ((R)-2-메틸-3-{1-[3-(2-메틸벤조티아졸-6-일)프로필카르바모일]시클로펜틸}프로피온산); 5-비페닐-4-일-4-(3-카르복시프로피오닐아미노)-2-메틸펜탄산 및 5-비페닐-4-일-4-(3-카르복시프로피오닐아미노)-2-메틸펜탄산 에틸 에스테르 (WO 2007/056546); Khder et al. (Novartis AG)에 의한 WO　2007/106708에 기재된 다글루트릴(daglutril) [(3S,2'R)-3-{1-[2'-(에톡시카르보닐)-4'-페닐부틸]-시클로펜탄-1-카르보닐아미노}-2,3,4,5-테트라히드로-2-옥소-1H-1-벤자제핀-1-아세트산]; 및 이들의 조합. 특정 구체예에서, 상기 NEP 저해제는 AHU-377, 칸독사트릴, 칸독사트릴라트, GGS-24128, 포스포라미돈, SCH-32615, SCH-34826, SQ-28603, 티오르판, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 상기 NEP 저해제는 다글루트릴(daglutril) 또는 CGS-26303 ([N-[2-(비페닐-4-일)-1(S)-(1H-테트라졸-5-일)에틸]아미노]메틸포스폰산)과 같은 화합물이고, 이는 또한 엔도텔린 전환 효소 (ECE) 및 NEP 둘다의 저해제로서 활성을 갖는다. 다른 이중 활성 ECE/NEP 화합물도 사용될 수 있다. NEP 저해제는 1일 약 20-800 mg를 제공하기에 충분한 양으로 투여될 것이고, 통상적인 일 투여량은 1일 50-700 mg, 더욱 일반적으로는 1일 100-600 또는 100-300 mg의 범위에 있다.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 산화질소 공여체와 조합하여 투여되고, 그 예는 니코란딜(nicorandil); 유기 질산염(organic nitrate), 예를 들어 펜타에리트리톨 테트라니트레이트(pentaerythritol tetranitrate); 및 시드노니민(sydnonimines), 예를 들어 린시도민(linsidomine) 및 몰시도민(molsidomine)을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 비스테로이드성 항염증제(NSAID)와 조합하여 투여되고, 그 예는 하기를 포함한다: 아세메타신(acemetacin), 아세틸 살리실산, 알클로페낙(alclofenac), 알미노프로펜(alminoprofen), 암페낙(amfenac), 아미프릴로오스(amiprilose), 아록시프린(aloxiprin), 아니롤락(anirolac), 아파존(apazone), 아자프로파존(azapropazone), 베노릴레이트(benorilate), 베녹사프로펜(benoxaprofen), 베즈피페릴론(bezpiperylon), 브로페라몰(broperamole), 부클록산(bucloxic acid), 카르프로펜(carprofen), 클리다낙(clidanac), 디클로페낙(diclofenac), 디플루니살(diflunisal), 디프탈론(diftalone), 에놀리캄(enolicam), 에토돌락(etodolac), 에토리콕시브(etoricoxib), 펜부펜(fenbufen), 펜클로페낙(fenclofenac), 펜클로진산(fenclozic acid), 페노프로펜(fenoprofen), 펜티아작(fentiazac), 페프라존(feprazone), 플루페남산(flufenamic acid), 플루페니살(flufenisal), 플루프로펜(fluprofen), 플루르비프로펜(flurbiprofen), 푸로페낙(furofenac), 이부페낙(ibufenac), 이부프로펜(ibuprofen), 인도메타신(indomethacin), 인도프로펜(indoprofen), 이속세팍(isoxepac), 이속시캄(isoxicam), 케토프로펜(ketoprofen), 케토롤락(ketorolac), 로페미졸(lofemizole), 로르녹시캄(lornoxicam), 메클로페나메이트(meclofenamate), 메클로페남산(meclofenamic acid), 메페남산(mefenamic acid), 멜록시캄(meloxicam), 메살아민(mesalamine), 미로프로펜(miroprofen), 모페부타존(mofebutazone), 나부메톤(nabumetone), 나프록센(naproxen), 니플룸산(niflumic acid), 옥사프로진(oxaprozin), 옥스피낙(oxpinac), 옥시펜부타존(oxyphenbutazone), 페닐부타존(phenylbutazone), 피록시캄(piroxicam), 피르프로펜(pirprofen), 프라노프로펜(pranoprofen), 살살레이트(salsalate), 수독시캄(sudoxicam), 술파살라진(sulfasalazine), 술린닥(sulindac), 수프로펜(suprofen), 테녹시캄(tenoxicam), 티오피낙(tiopinac), 티아프로펜산(tiaprofenic acid), 티옥사프로펜(tioxaprofen), 톨페남산(tolfenamic acid), 톨메틴(tolmetin), 트리플루미데이트(triflumidate), 지도메타신(zidometacin), 조메피락(zomepirac), 및 이들의 조합. 특정 구체예에서, 상기 NSAID는 에토돌락, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 멜록시캄, 나프록센, 옥사프로진, 피록시캄, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 N-메틸 d-아스파르테이트 (NMDA) 수용체 길항제와 조합하여 투여되고, 그 예는 아만타딘(amantadine), 덱스트로메토르판(dextromethorphan), 덱스트로프로폭시펜(dextropropoxyphene), 케타민(ketamine), 케토베미돈(ketobemidone), 메만틴(memantine), 메타돈(methadone) 등을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 오피오이드 수용체 효능제(오피오이드 진통제로도 지칭됨)와 조합하여 투여된다. 대표적인 오피오이드 수용체 효능제는 하기를 포함한다: 부프레노르핀(buprenorphine), 부토르파놀 (butorphanol), 코데인(codeine), 디히드로코데인(dihydrocodeine), 펜타닐(fentanyl), 히드로코돈(hydrocodone), 히드로모르폰(hydromorphone), 레발로르판(levallorphan), 레보르파놀(levorphanol), 메페리딘(meperidine), 메타돈(methadone), 모르핀(morphine), 날부핀(nalbuphine), 날메펜(nalmefene), 날로르핀(nalorphine), 날록손(naloxone), 날트렉손(naltrexone), 날로르핀(nalorphine), 옥시코돈(oxycodone), 옥시모르폰(oxymorphone), 펜타조신(pentazocine), 프로폭시펜(propoxyphene), 트라마돌(tramadol), 및 이들의 조합. 특정 구체예에서, 상기 오피오이드 수용체 효능제는 코데인, 디히드로코데인, 히드로코돈, 히드로모르폰, 모르핀, 옥시코돈, 옥시모르폰, 트라마돌, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.

일 특정 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 포스포디에스테라제 (PDE) 저해제, 특히 PDE-V 저해제와 조합하여 투여된다. 대표적인 PDE-V 저해제는 아바나필(avanafil), 로데나필(lodenafil), 미로데나필(mirodenafil), 실데나필(sildenafil)(Revatio®), 타달라필(tadalafil)(Adcirca®), 바르데나필(vardenafil)(Levitra®), 및 우데나필(udenafil)을 포함한다.

다른 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 프로스타글란딘 유사체(프로스타노이드(prostanoid) 또는 프로스타시클린(prostacyclin) 유사체로도 지칭됨)와 조합하여 투여된다. 대표적인 프로스타글란딘 유사체는 베라프로스트(beraprost) 나트륨, 비마토프로스트(bimatoprost), 에포프로스테놀(epoprostenol), 일로프로스트(iloprost), 라타노프로스트(latanoprost), 타플루프로스트(tafluprost), 트라보프로스트(travoprost), 및 트레프로스티닐(treprostinil)을 포함하고, 비마토프로스트(bimatoprost), 라타노프로스트(latanoprost), 및 타플루프로스트(tafluprost)가 특히 관심대상이다.

또 다른 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 프로스타글란딘 수용체 효능제와 조합되어 투여되며, 그의 예는 비마토프로스트(bimatoprost), 라타노프로스트(latanoprost), 트라보프로스트(travoprost) 등을 포함한다.

화합물 I 또는 결정형 I'은 또한 레닌 저해제(renin inhibitor)와 조합되어 투여될 수 있으며, 그의 예는 알리스키렌(aliskiren), 에날키렌(enalkiren), 레미키렌(remikiren), 및 이들의 조합을 포함한다.

다른 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 선택적인 세로토닌 재흡수 저해제 (SSRI)와 조합하여 투여되고, 그 예는 다음을 포함한다: 시탈로프람(citalopram) 및 시탈로프람 대사산물 데스메틸시탈로프람(desmethylcitalopram), 다폭세틴(dapoxetine), 에스시탈로프람(escitalopram)(예, 에스시탈로프람 옥살레이트), 플루옥세틴(fluoxetine) 및 플루옥세틴 데스메틸 대사산물 노르플루옥세틴(norfluoxetine), 플루복사민(fluvoxamine)(예, 플루복사민 말레에이트), 파록세틴(paroxetine), 세르트랄린(sertraline) 및 세르트랄린 대사산물 데메틸세르트랄린(demethylsertraline), 및 이들의 조합.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 5-HT1D 세로토닌 수용체 효능제와 조합하여 투여되고, 그 예는 알모트립탄(almotriptan), 아비트립탄(avitriptan), 엘레트립탄(eletriptan), 프로바트립탄(frovatriptan), 나라트립탄(naratriptan), 리자트립탄(rizatriptan), 수마트립탄(sumatriptan), 및 졸미트립탄(zolmitriptan)과 같은 트립탄(triptan)을 포함한다.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 나트륨 채널 차단제와 조합하여 투여되고, 그 예는 카르바마제핀(carbamazepine), 포스페니토인(fosphenytoin), 라모트리그닌(lamotrignine), 리도카인(lidocaine), 멕실레틴(mexiletine), 옥카르바제핀(oxcarbazepine), 페니토인(phenytoin), 및 이들의 조합을 포함한다.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 가용성 구아닐레이트 시클라제 자극제 또는 활성화제와 조합하여 투여되며, 그 예는 아타시구아트(ataciguat), 리오시구아트(riociguat), 및 이들의 조합을 포함한다.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 트리시클릭 항우울제 (TCA)와 조합하여 투여되고, 그 예는 아미트립틸린(amitriptyline), 아미트립틸리녹시드(amitriptylinoxide), 부트립틸린(butriptyline), 클로미프라민(clomipramine), 데멕십틸린(demexiptiline), 데시프라민(desipramine), 디벤제핀(dibenzepin), 디메타크린(dimetacrine), 도술레핀(dosulepin), 독세핀(doxepin), 이미프라민(imipramine), 이미프라미녹시드(imipraminoxide), 로페프라민(lofepramine), 멜리트라센(melitracen), 메타프라민(metapramine), 니트록사제핀(nitroxazephine), 노르트립틸린(nortriptyline), 녹십틸린(noxiptiline), 피포페진(pipofezine), 프로피제핀(propizepine), 프로트립틸린(protriptyline), 퀴누프라민(quinupramine), 및 이들의 조합을 포함한다.

일 구체예에서, 화합물 I 또는 결정형 I'은 바소프레신 수용체 길항제와 조합하여 투여되고, 그 예는 코니밥탄(conivaptan) 및 톨밥탄(tolvaptan)을 포함한다.

또한, 조합된 제2 치료제가 본 발명의 화합물을 포함한 추가적인 조합 치료에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 이뇨제 및 ARB, 또는 칼슘 채널 차단제 및 ARB, 또는 이뇨제 및 ACE 저해제, 또는 칼슘 채널 차단제 및 스타틴(statin)과 조합될 수 있다. 구체적인 예는, 상표명 Vaseretic®으로 시판된, ACE 저해제 에날라프릴(말레에이트 염 형태)과 이뇨제 히드로클로로티아지드의 조합, 또는 칼슘 채널 차단제 암로디핀 (베실레이트 염 형태)과 ARB 올메사르탄 (메독소밀 프로드러그 형태)의 조합, 또는 칼슘 채널 차단제와 스타틴의 조합을 포함하고, 모두 화합물 (1)과 함께 사용될 수 있다. α2-아드레날린성 수용체 효능제 및 바소프레신 수용체 길항제와 같은 다른 치료제들도 조합 요법에 도움이 될 수 있다. 예시적인 α2-아드레날린성 수용체 효능제는 클로니딘(clonidine), 덱스메데토미딘(dexmedetomidine), 및 구안파신(guanfacine)을 포함한다.

본 발명의 다양한 양상이 수반된 도면을 참조하여 개시된다.
도 1은 결정 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 (I')의 분말 X-선 회절 (powder X-ray diffraction; PXRD) 패턴을 나타낸다.
도 2는 결정형 (I')의 시차 주사 열량측정 (differential scanning calorimetry; DSC) 서모그램 (thermogram)을 나타낸다.
도 3은 결정형 (I')의 열 중량 분석 (thermal gravimetric analysis; TGA) 프로필을 보여준다.
도 4는 결정형 (I')의 동적 흡습 (dynamic moisture sorption; DMS) 등온곡선(isotherm)을 나타낸다.
도 5는 결정형 (I')의 편광 현미경(polarized light microscope; PLM) 이미지이다.
도 6은 24-시간 동안 50 mg, 100　mg, 200 mg, 400 mg 및 600 mg의 무 투여 또는 단일 투여를 받은 건강한 개체에서의 평균 혈장 cGMP (nM)의 기준치로부터의 변화를 나타낸다.
도 7은 단일 용량 상승 시험(single ascending dose study) 에서 생성된 데이터에 대한 기저 대비 용량(mg)으로부터의 cGMP에서 n-배 변화를 설명한다.
도 8은 단일 용량 상승 시험에서 생성된 데이터에 대한 화합물 I (ng/mL)의 농도 대비 시간 (hr)이다.
도 9는 건강한 개체에서 사쿠비트릴 대비 화합물 I 의 % 신장 제거를 보여준다.
도 10은 24-시간 동안 10 mg, 50　mg, 100 mg, 및 200 mg 의 무 투여 또는 단일 투여를 받은 건강한 성인 및 노인 피검자에서 14 일 째의 평균 혈장 cGMP (nM)의 기준치로부터의 변화를 보여준다.

하기 제형들은 본 발명의 대표적인 약학적 조성물을 예시한다.

예시적 경구 투여용 경질 젤라틴 캡슐

본 발명의 화합물 (50 g), 440 g의 분무 건조된 락토오스 및 10 g의 마그네슘 스테아레이트를 완전히 혼합한다. 그 다음, 결과의 조성물을 경질 젤라틴 캡슐(hard gelatin capsule) 내에 적재한다 (캡슐당 500 mg의 조성물). 대안적으로, 화합물 I 또는 결정형 I'(20 mg)을 전분 (89 mg), 미정질(microcrystalline) 셀룰로오스 (89 mg) 및 마그네슘 스테아레이트 (2 mg)와 완전히 혼합한다. 그 후, 혼합물을 제45호 메쉬 U.S. 체(No. 45 mesh U.S. sieve)를 통해 통과시키고, 경질 젤라틴 캡슐 내에 적재한다 (캡슐 당 200 mg의 조성물).

대안적으로, 화합물 I 또는 결정형 I'(30 g), 제2 작용제(20 g), 440 g의 분무 건조된 락토오스 및 10 g의 마그네슘 스테아레이트를 완전히 혼합하고, 전술된 바와 같이 가공된다.

예시적 경구 투여용 젤라틴 캡슐 제형

화합물 I 또는 결정형 I' (100 mg)을 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 (polyoxyethylene sorbitan monooleate) (50 mg) 및 전분 분말 (250 mg)과 완전히 혼합한다. 혼합물을 그 후 젤라틴 캡슐 내에 적재한다 (캡슐 당 400 mg의 조성물). 대안적으로, 화합물 (1) (70 mg) 및 제2 작용제 (30 mg)를 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(50 mg) 및 전분 파우더(250 mg)와 완전히 혼합하고, 결과로 얻은 혼합물을 젤라틴 캡슐 내에 적재한다(캡슐 당 조성물 400 mg).

대안적으로, 화합물 I 또는 결정형 I' (40 mg)을 미정질 셀룰로오스 (Avicel PH 103; 259.2 mg) 및 마그네슘 스테아레이트 (0.8 mg)와 완전히 혼합한다. 혼합물을 그 후 젤라틴 캡슐 (크기 #1, 백색, 불투명) 내에 적재한다 (캡슐 당 300 mg의 조성물).

예시적 경구 투여용 히드록시프로필 메틸셀룰로스 ( HPMC ) 캡슐

화합물 I 또는 결정형 I' (50 mg 또는 100 mg)이 HPMC 캡슐로 직접 적재된다.

예시적 경구 투여용 정제 제형

화합물 I 또는 결정형 I' (10 mg), 전분 (45 mg), 및 미정질 셀룰로오스 (35 mg)을 No.20 메쉬 U.S. 체를 통과시키고 완전히 혼합한다. 생성된 과립을 50-60℃에서 건조하고 No.16 메쉬 U.S. 체로 통과시킨다. 폴리비닐피롤리돈 용액 (멸균수 중 10 % 용액으로서 4 mg)을 소듐 카르복시메틸 전분 (4.5 mg), 마그네슘 스테아레이트 (0.5 mg), 및 탈크 (1 mg)와 혼합하고, 이 혼합물을 그 후 No.16 메쉬 U.S. 체를 통해 통과시킨다. 소듐 카르복시메틸 전분, 마그네슘 스테아레이트 및 탈크를 그 후 상기 과립에 첨가한다. 혼합 후에, 혼합물을 타정기(tablet machine)에서 압축하여 100 mg 중량의 정제를 제조한다.

대안적으로, 화합물 I 또는 결정형 I' (250 mg)을 미정질 셀룰로오스 (400 mg), 건식 실리콘 디옥시드 (silicon dioxide fumed) (10 mg) 및 스테아르산 (5 mg)과 완전히 혼합한다. 혼합물을 그 후 압축하여 정제를 생성한다 (정제 당 665 mg의 조성물).

대안적으로, 화합물 I 또는 결정형 I' (400 mg)을 옥수수전분 (50 mg), 크로스카르멜로오스 나트륨 (25 mg), 락토오스 (120 mg), 및 마그네슘 스테아레이트 (5 mg)와 완전히 혼합한다. 혼합물을 그 후 압축하여 단일선(single-scored) 정제를 생성한다 (정제 당 600 mg의 조성물).

대안적으로, 화합물 I 또는 결정형 I' (100 mg)을 젤라틴 수용액 (20 mg)과 함께, 옥수수전분(100 mg)과 완전히 혼합한다. 혼합물을 건조시키고, 고운 분말로 분쇄한다. 미정질 셀룰로스 (50 mg) 및 마그네슘 스테아레이트 (5　mg)를 그 후 젤라틴 제형과 혼합하고, 과립화하고, 결과로 얻은 혼합물을 압축하여 정제를 형성한다 (정제 당 100 mg의 본 발명의 화합물).

예시적 경구 투여용 현탁 제형

하기 구성성분들을 혼합하여, 현탁액 10 mL 당 화합물 I 또는 결정형 I' 100 mg을 함유하는 현탁제를 형성시킨다:

성분 양

화합물 I 또는 결정형 I’ 1.0 g

푸마르산 0.5 g

염화 나트륨 2.0 g

메틸 파라벤 0.15 g

프로필 파라벤 0.05 g

과립당(granulated sugar) 25.5 g

소르비톨 (70% 용액) 12.85 g

Veegum®K (마그네슘 알루미늄 실리케이트) 1.0 g

향료(flavoring) 0.035 mL

착색제(coloring) 0.5 mg

증류수(distilled water) 100 mL로 적량

예시적 경구 투여용 액상 제형

적절한 액상 제형은 시트레이트, 락테이트 및 말레에이트 완충 용액과 같은, 카르복실산계 완충제를 포함하는 제형이다. 예를 들어, (DMSO와 사전-혼합될 수 있는) 화합물 I 또는 결정 I'을 100 mM 암모늄 시트레이트 완충제와 혼합하고 pH는 pH 5로 적정하거나, 또는 100 mM 시트르산 용액과 혼합하고 pH는 pH 2로 적정할 수 있다. 이러한 용액은 또한 시클로덱스트린과 같은 가용화 부형제(solubilizing excipient)를 포함할 수 있고, 예를 들어, 상기 용액은 10 중량%의 히드록시프로필-β-시클로덱스트린을 포함할 수 있다.

기타 적절한 제형은 시클로덱스트린을 포함하거나 포함하지 않는, 5% NaHCO₃ 용액을 포함한다.

예시적 주사 투여용 비경구 IV 제형

화합물 I 또는 결정형 I' (0.2 g)을 0.4 M 소듐 아세테이트 완충 용액 (2.0 mL)과 혼합한다. 결과의 용액의 pH를, 필요한 경우, 0.5 N 염산 수용액 또는 0.5 N 수산화나트륨 수용액을 사용하여 pH 4로 조정한 다음, 충분한 양의 주사용수(water for injection)를 첨가하여 총 부피 20 mL를 만든다. 그 다음, 상기 혼합물을 멸균 필터 (0.22 마이크론)를 통하여 여과시켜, 주사에 의한 투여에 적합한 멸균 용액을 제조한다.

하기 제형은 본 발명의 대표적인 약학적 조성물을 예시한다.

제형 예 A

주사용 용액을 제조하는데 적합한 동결된 용액이 하기와 같이 제조된다:

성분 양

활성 화합물 I 또는 I' 10 내지 1000 mg

부형제 (예컨대, 덱스트로스) 0 내지 50 g

주사 용액용 물 10 내지 100 mL

대표적인 절차: 상기 부형제가 존재하는 경우 약 80%의 주사용 수에 용해되고, 상기 활성 화합물 I 또는 I'이 첨가되고, 용해된다. pH를 1M의 소듐 히드록시드로 3 내지 4.5로 조정하고, 그 후 상기 부피를 주사용수로 최종 부피의 95%로 조정하였다. 상기 pH를 확인하고, 필요하다면 조정하고, 상기 부피를 주사용수로 최종 부피로 조정하였다. 상기 제형이 그 후 0.22 미크론 필터를 통해 멸균 여과되고, 무균 조건하에 멸균 바이알에 넣었다. 상기 바이알에 캡을 씌우고, 표지하고, 동결 보관하였다.

제형 예 B

주사용 용액을 제조하는데 적합한 동결건조된 분말 또는 결정 고체가 하기와 같이 제조된다:

성분 양

활성 화합물 I 또는 I' 10 내지 1000 mg

부형제 (예컨대, 만니톨 및/또는 수크로스) 0 내지 50 g

완충제 (예컨대, 시트레이트) 0 내지 500 mg

주사용수 10 내지 100 mL

대표적인 절차: 상기 부형제 및/또는 완충제가 존재하는 경우 약 60%의 주사용수에 용해된다. 상기 활성 화합물 I 또는 I'이 첨가되고, 용해되고, pH를 1M의 소듐 히드록시드로 3 내지 4.5로 조정하고, 상기 부피를 주사용수로 최종 부피의 95%로 조정하였다. 상기 pH를 확인하고, 필요하다면 조정하고, 상기 부피를 주사용수로 최종 부피로 조정하였다. 상기 제형이 그 후 0.22 미크론 필터를 통해 멸균 여과되고, 무균 조건하에 멸균 바이알에 넣었다. 상기 제형이 그 후 적절한 동결건조 사이클을 사용하여 동결-건조된다. 상기 바이알에 (선택적으로 부분 진공 또는 건조 질소 하에) 캡을 씌우고, 표지하고, 냉장 하에 보관하였다.

제형 예 C

환자에게 정맥내 투여를 위한 주사 용액이 상기 제형 예 B로부터 하기와 같이 제조된다: .

대표적인 절차: 제형 예 B의 동결건조된 분말 (예컨대, 활성 화합물 I 또는 I'의 10 내지 1000 mg 포함)이 20 mL의 멸균수로 재구성되고, 결과의 용액이 100 mL의 인퓨젼 백 (infusion bag)에서 80 mL의 멸균 식염수로 더 희석되었다. 상기 희석된 용액이 그 후 30 내지 120분에 걸쳐서 환자에게 정맥내로 투여된다.

예시적 흡입 투여용 조성물

화합물 I 또는 I' (0.2 mg)을 미분화하고 락토오스(25 mg)와 블렌딩한다. 이 블렌딩된 혼합물을 그 다음 젤라틴 흡입 카트리지에 적재한다. 상기 카트리지의 내용물은, 예를 들어, 건조 분말 흡입기를 사용하여 투여된다.

대안적으로, 미분화된 화합물 I 또는 I' (10 g)을, 탈염수(demineralized water) (200 mL)에 레시틴(0.2 g)을 용해시켜 제조된 용액 중에 분산시킨다. 얻어진 현탁액을 분무 건조시키고, 미분화하여 약 1.5 ㎛ 미만의 평균 직경을 갖는 입자를 포함하는 미분화 조성물을 생성시킨다. 그 다음, 상기 미분화 조성물을, 흡입기로 투여되는 경우 투여당 본 발명의 화합물 약 10 ㎍ 내지 약 500 ㎍을 제공하기에 충분한 양으로, 가압된 1,1,1,2-테트라플루오로에탄을 함유하는 정량식 흡입 카트리지 내에 적재한다.

대안적으로, 화합물 I 또는 I' (25　mg)을 시트레이트 완충(citrate buffered) (pH 5) 등장성 염수(125 mL)에 용해시킨다. 수득된 혼합물을 교반하고, 화합물이 용해될 때까지 초음파 처리한다. 용액의 pH를 확인하고, 필요한 경우, 1 N NaOH 수용액을 서서히 첨가하여 pH 5로 조정한다. 상기 용액은 투여 당 화합물 I 또는 I'을 약 10 ㎍ 내지 약 500 ㎍을 제공하는 네뷸라이저 장치를 사용하여 투여된다.

실시예

하기 반응 과정식(Reaction Scheme)/제조예 및 실시예는 본 발명의 특정 구체예를 예시하기 위해 제공된다. 이 특정 구체예는, 그러나, 구체적으로 표시되지 않는 한, 어느 방식으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도하는 것은 아니다.

하기 약어들은 달리 표시되지 않는 한 하기 의미를 갖고, 본 명세서에 사용되고 정의되지 않은 다른 약어들은 그의 표준인, 일반적으로 받아들여지는 의미를 갖는다:

ACN = 아세토니트릴

CPME = 시클로펜틸 메틸 에테르

d = 일(s)

DCC = N,N '-디시클로헥실카르보디이미드

DCM = 디클로로메탄 또는 메틸렌 클로리드

DIPE = 디이소프로필 에테르

DIPEA = N,N-디이소프로필에틸아민

DMF = N,N-디메틸포름아미드

EDTA = 에틸렌디아민테트라아세트산

EtOH = 에탄올

EtOAc = 에틸 아세테이트

g = 그람(s)

h = 시간(s)

H₂ = 수소 가스

H₂O₂ = 과산화수소

HCTU = 2-(6-클로로-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-일)-1,1,3,3-

테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(V)

HATU = N,N,N ',N'-테트라메틸-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트

HCl = 염산

NaBH₄ = 소듐 보로히드리드

NaCl = 염화나트륨

NaHCO₃ = 탄산수소나트륨

Na₂CO₃ ⁼ 탄산나트륨

NaHMDS = 소듐 비스(트리메틸실릴)아미드 또는 소듐 헥사메틸디실라지드

NaOH = 수산화나트륨

Na₂SO₄ = 황산나트륨

NH₄Cl = 염화암모늄

NMM = n-메틸모르폴린

MeI = 메틸 이오디드

MeOH = 메탄올

min = 분(s)

MgSO₄ = 황산마그네슘

Pd(PPh₃)₄ = 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0)

Pd/C = 활성 탄소 상 팔라듐, 10% 로딩(loading)

PE = 석유 에테르

SiO₂ = 실리콘 디옥시드 또는 실리카

TFA = 트리플루오로아세트산

THF = 테트라히드로퓨란

달리 언급되지 않은 한, 모든 물질, 예를 들어 시약, 출발 물질 및 용매는 상업적 공급처 (예를 들어 Sigma-Aldrich, 및 Fluka Riedel-de HaeN 등)에서 구입하였고 추가적인 정제 없이 사용하였다.

반응은 달리 언급이 없는 한, 질소 대기 하에서 수행되었다. 반응의 진행은 얇은 막 크로마토그래피(thin layer chromatography: TLC), 분석적 고성능 액체 크로마토그래피(analytical high performance liquid chromatography: anal. HPLC), 및 질량 분광법으로 모니터링하였고, 자세한 사항은 특정 실시예에 기재된다. 대표적인 분석적 HPLC조건은 하기와 같다:

A. 분석적 HPLC 조건 - 방법 A

기기	Agilent 1260 HPLC
컬럼	Advance Material Technology HALO®; 150 x 4.60 mm; 2.7 미크론
컬럼 온도	30 ℃
유속	1.0 mL/분
주입 부피	5 μL
시료 제조	ACN:물 1:1에 용해
이동상	A = 물:ACN:TFA (98:2:0.1) B = 물:ACN:TFA (30:70:0.1)
검출기 파장	254 nm
구배	총 22 분시간 (분)/% B: 0/30, 15/100, 18/100, 20/30, 22/30

B. 분석적 HPLC 조건 - 방법 B

기기	Agilent 1260 HPLC
컬럼	Agilent Zorbax-Bonus RP-C18; 150 x 4.6 mm; 3.5　micron
컬럼 온도	40 ℃
유속	1.5 mL/분
주입 부피	5 μL
시료 제조	ACN:1 M HCl 1:1에 용해
이동상	A = 물:TFA (99.95:0.05) B = ACN:TFA (99.95:0.05)
검출기 파장	254 nm 및 214 nm
구배	총 26 분시간 (분)/% B: 0/5, 18/90, 22/90, 22.5/90, 26/5

반응은 예를 들면 각 제조예에 구체적으로 기재된 바와 같이 수행하였다; 흔히 반응 혼합물이 추출 및 기타 정제 방법 예를 들어, 온도-, 및 용매-의존성 결정화, 및 침전에 의해 정제하였다. 또한, 반응 혼합물을, 보통 Microsorb C18 및 Microsorb BDS 컬럼 패키징 및 통상적인 용리액을 이용한 분취 HPLC에 의해 통상적으로 정제하였다. 반응의 진행은 전형적으로 액체 크로마토그래피 질량 분광법(liquid chromatography mass spectrometry: LCMS)에 의해 측정하였다. 이성질체의 특징분석은 핵 오버하우저 효과 분광학(Nuclear Overhauser effect spectroscopy: NOE)으로 수행하였다. 반응 생성물의 특징분석은 질량 및 ¹H-NMR 분광법에 의해 일상적으로 수행하였다. NMR 측정을 위해, 시료를 중수소화 용매 (CD₃OD, CDCl₃, 또는 DMSO-d ₆)에 용해하고, ¹H-NMR 스펙트럼이 표준 관찰 조건 하에서 Varian Gemini 2000 기기 (400 MHz)로 획득하였다. 화합물의 질량 분석적 규명은 보통 Applied Biosystems (Foster City, CA) 모델 API 150 EX 기기 또는 Agilent (Palo Alto, CA) 모델 1200 LC/MSD 기기로 전자분무 이온화 방법(electrospray ionization method: ESMS)을 사용하여 실시하였다.

측정 기술

분말 X-선 회절

분말 X-선 회절 분석은 Bruker D8-Advance X-선 회절계를 사용하여 수행되었다. X-선 광원은 40kV의 출력 전압과 40mA의 전류를 갖는 Cu-Kα 방사선이었다. 상기 기기는 Bragg-Brentano 기하학으로 작동하고, Goebel Mirrors를 사용하여, 평행한 X-선 빔을 수득하였다. 상기 빔의 모든 발산은 광원에서 0.2°수직 발산 슬릿과, 광원 및 검출기에서 Soller 슬릿 (2.5°)에 의해 제한되었다. 측정을 위해, 소량의 분말 (5-25 mg)을 제로-배경 실리콘 시료-홀더 (zero-background silicon sample-holder)에 부드럽게 프레스하여 매끄러운 표면을 형성하고 X-선에 노출시켰다. 상기 시료가 2θ에서 2°내지 35°의 결합된 θ-2θ 모드로 0.02°의 스텝 크기 및 스텝당 0.3초의 스캔 속도로 스캔되었다. 데이터 수집이 Bruker DiffracSuite 소프트웨어로 제어되었고, Jade 소프트웨어 (버전 7.5.1)로 분석되었다. 상기 기기가, ±0.02° 2θ 각 내에서, 커런덤 표준 (corundum standard)으로 검정되었다.

데이터 수집에 사용된 Bragg-Brentano 기하학은 선호되는 배향이 있다는 것에 명심해야 한다. 이러한 조건 하에, 회절 피크의 상대 세기가 구형 입자의 이상적인 분포 또는 단일 결정 데이터로부터 시뮬레이트된 회절 패턴으로부터 얻어지는 진정한 상대 세기를 나타내지 않을 수 있다. 또한, 광범위한 선호 배향으로 인해 일부 회절 패턴에서 일부 피크가 보이지 않을 수도 있다.

시차 주사 열량계

DSC 측정은 Thermal Analyst 콘트롤러가 장착된 TA Instruments Model Q-100 모듈을 사용하여 수행되었다. TA Instruments Universal Analysis 소프트웨어를 사용하여 데이터가 수집 및 분석되었다. 시료가 커버된 알루미늄 팬으로 정확하게 칭량되었다. 5℃에서 5분간의 등온도 평형 기간 후에, 0℃에서 250℃까지 10℃/분의 선형 가열 램프를 사용하여 시료가 가열되었다.

열중량 분석

열중량 측정은 고해상도 능력을 갖춘 TA Instruments 모델 Q-500 모듈을 사용하여 수행되었다. TA Instruments Thermal Analyst 콘트롤러를 사용하여 데이터가 수집되고, TA Instruments Universal Analysis 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 칭량된 시료를 백금 팬에 놓고, 주위 온도에서 300 ℃까지 10 ℃/분의 가열 속도로 스캔되었다. 저울 및 노 챔버가 사용 중에 질소 흐름으로 퍼지되었다.

편광 현미경

편광 현미경 (PLM) 연구를 위해, 시료가 교차-편광 필터를 갖춘 광학 현미경 (Olympus BX51) 하에서 검사되었다. PaxIt 이미징 소프트웨어 (버전 6.4)에 의해 제어된 PaxCam 카메라로 이미지가 수집되었다. 침지 매질로서 경질 미네랄 오일을 갖는 유리 슬라이드상에 시료가 준비되었다. 입자의 크기에 따라, 4배, 10배 또는 20배의 대물 렌즈가 확대를 위해 사용되었다.

동적 수분 수착 평가

DMS 측정이 VTI 대기 미세저울, SGA-100 시스템 (VTI Corp., Hialeah, FL 33016)을 사용하여 수행되었다. 칭량된 시료가 사용되었고, 습도는 분석 시작시 가능한 최저 값 (상대 습도 0%에 가까움)이었다. DMS 분석은 5-90%의 전체 습도 범위에서 5% 상대 습도/단계의 스캔 속도로 구성되었다. DMS 실시는 25 ℃에서 등온으로 수행되었다.

합성 반응 반응식

본 발명에 채용된 (3S, 5R)-5-[[4-(5-클로로-2-플루오로페닐)페닐]메틸]-3-(히드록시메틸)-3-메틸피롤리딘-2-온 (A)은 실시예 1에 기술되고 반응식 A에 나타낸 바와 같은 과정을 이용하는 개시 물질 및 시약으로부터 제조될 수 있다:

반응식 A

반응식 A 에서 일반적인 반응 단계는 하기와 같다. 화합물 1의 아민기를, 저온에서 불활성 대기 하에 수성 염기와 함께 용매 중에 1을 용해시킨 후, 단리 전에 실온에서 용매 중의 아민 보호화제를 첨가하여 보호하였다. 1: 염기: 아민 보호화제를 대략 1:2:1의 몰 당량이 되도록 사용할 수 있다. 아민 보호화제와 1의 반응에 사용될 수 있는 용매는 아세토니트릴과 같은 극성 비양성자성 용매를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 염기로는 LiOH, NaOH, 및 KOH를 포함한 강염기 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 저온은 전형적으로 -10 ℃ 이하이다.

그 다음, 화합물 2를 비활성 대기 하에 양성 화합물(예: NaHCO₃ 수용액) 및 촉매 (예: Pd(PPh₃)₄)를 첨가하여 용매 중에 3과 커플링하였다. 이는 유도체 4를 생성시키고, 그런 다음 이를 비활성 대기 하에 비양성자성 용매 중에서 5와 친핵성 촉매와 함께 반응시켰다. 펩티드 커플링제를 추가로 사용하여 화합물 6을 형성시켰다. 그런 다음 화합물 6을 불활성 대기 하에 약산과 함께 용매 중에 두고 환원제를 저온(-5 ℃ 미만)에서 첨가하였다. 그 혼합물을 몇 시간 동안 교반한 다음, 염수로 ?칭(quenching)하였다. 그런 다음 화합물 7을 약염기의 용액으로 추출함으로써 단리하고 건조제로 건조시킨 후 진공 하에 농축하였다.

다음, 화합물 7을 MeI와 같은 메틸화제를 이용하여 약염기와 함께 비양성자성 용매 중에서 메틸화하였다. 형성된 고체를 단리하고 용매 중에 추가로 용해시킨 후 건조제로 건조시키고 진공 하에 농축하여 화합물 8을 수득하였다. 화합물 8을 에테르 용매 중에 산과 추가로 반응시켜 화합물 9를 수득하였고, 그런 다음 농축하고 추가 용매로 세척하여 화합물 9'를 수득하였다. 그런 다음 화합물 9'를 극성 비양성자성 용매 중에 불활성 기체하에 두고 저온(< -5 ℃)에서 10과 반응시켜 중간체 11을 수득하였다. 화합물 A는, 11을 유기 염기와 함께 반응 시킨 후 저온에서 10과 반응시키고 환원제로 환원시켜 형성시켰다.

본 발명에 이용된 (2S,4R)-벤질 4-아미노-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-2-메틸펜타노에이트 (B)는 실시예 2에 기재된 방법을 이용하여 반응식 B 에 나타낸 바와 같이, 상기 제조된 출발 물질(A) 및 시약으로부터 제조할 수 있다:

반응식 B

반응식 B 에서 일반적인 반응 단계는 하기와 같다. 먼저 화합물 A 를, 산을 함유하는 용매 중에 3,4-디히드로-2H-피란과 반응시키고 중화 및 단리하였다. 생성된 조혼합물을 에테르 용매 중에 두고 저온에서 교반하여 슬러리를 형성시켰다. 상기 슬러릴 추가로 씻어내고, 건조하고, 농축하여 점성이 있는 오일 12로 하였고, 그 후 표준 조건 하에 고리 질소를 디-tert-부틸 디카르보네이트로 보호하여 13을 형성시켰다. 13의 에테르기를 강산으로 추가로 절단하여 14에 나타낸 바와 같은 알코올기를 형성하였다. 그런 다음 화합물 14를, 불활성 대기 중에 헤테로시클릭 유기 리간드, 예를 들어 1,10-페난트롤린을 첨가한 후 금속 촉매, 예를 들어, 팔라듐 촉매를 첨가함으로써 에틸 비닐 에테르와 반응시켰다. 정제된 생성물 15의 알켄기를 예를 들어, H₂ 및 10% Pd/C를 사용하여 환원시켜 16을 수득하였다. 16의 피롤리돈의 고리 열림 (비누화)을 수성 염기로 수행한 후, 정제 및 단리하여 화합물 17을 수득하였다. 17의 카르복시레이트기를 예를 들어, 벤질 브로미드로 표준 조건 하에 추가로 보호하여 18을 형성하였다. 그런 다음, 18의 아민기를 탈보호화하여 화합물 B를 형성시켰다.

상기 논의한 바와 같이, 반응식 A 및 B에 대한 예시적인 반응 조건은 각각, 하기 실시예 1 및 2에서 기재한다.

실시예 1

(3S,5R)-5-[[4-(5-클로로-2-플루오로페닐)페닐]메틸]-3-(히드록시메틸)-3-메틸피롤리딘-2-온 (A)의 합성

단계 A-1:

아세토니트릴 중 (2R)-2-아미노-3-(4-브로모페닐)프로판산 (1) (3300 g, 13.52　mol)의 용액(46.2 L) 을 불활성 질소 대기로 퍼징하고 유지한 250 L 반응기 중에 두었다. NaOH (1081　g, 27.02 mol) 수용액 (46.2 L)을 -10 ℃에서 여러 배치(batch)로 첨가하였다. 이어서, ACN 중 디-tert-부틸 디카르보네이트 (2948 g, 13.51 mol) 용액 (6.6 L)을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 밤새 교반하고 진공 하에 추가로 농축하였다. 이 생성된 용액을 45 L의 물/얼음로 희석하고 상기 용액의 pH 값을 1N HCl로 pH 2로 조정하였다. 그런 다음 생성된 용액을 3x50　L의 DCM로 추출하고, 그 유기층을 합하였다. 생성된 혼합물을 1x50 L의 염수로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조시키고 진공 하에 농축하였다. 그 결과, (2R)-3-(4-브로모페닐)-2-[[(tert-부톡시)카르보닐] 아미노]프로판산 (2) 3720 g (80%)이 흰색 고체로서 생산되었다.

단계 A- 2:

디옥산 중 (2R)-3-(4-브로모페닐)-2-[[(tert-부톡시)카르보닐]아미노]프로판산 (2) (530 g, 1.54 mol) 용액 (9.54 L), (5-클로로-2-플루오로페닐) 보론산 (3) (348 g, 2.00 mol), 물 중 Na₂CO₃ (228 g, 2.15 mol) 용액 (1.06 L), 및 Pd(PPh₃)₄ (8.89 g, 7.69 mmol)를 불활성 질소 대기로 퍼징하고 유지한 20 L의 4-구 둥근-바닥 플라스크에 두었다. 그 생성된 용액을 오일 배쓰(oil bath)에서 2.5 시간 동안 가열하여 환류시킨 후 물/얼음 배쓰로 실온으로 냉각시켰다. 생성된 용액을 15 L 의 EtOAc으로 희석하고 1x5 L의 1N HCl 및 4x5 L의 염수로 세척하였다. 합한 유기 추출물을 무수 MgSO₄로 건조시키고 진공 하에 농축하였다. 잔류물을 2x1 L의 PE로 세척하였다. 그 결과, (2R)-2-[[(tert-부톡시)카르보닐]아미노]-3-[4-(5-클로로-2-플루오로페닐)페닐]프로판산 (4) 510 g (84%)이 갈색 오일으로서 생성되었다.

단계 A-3:

DCM 중 (2R)-2-[[(tert-부톡시)카르보닐]아미노]-3-[4-(5-클로로-2-플루오로페닐)페닐]프로판산 (4) (510 g, 1.29 mol) 용액 (5000 mL), 2,2-디메틸-1,3-디옥산-4,6-디온 (5) (205 g, 1.42 mol), 및 4-디메틸아미노피리딘 (237　g, 1.94 mol)을 불활성 질소 대기로 퍼징하고 유지한 10 L의 4-구 둥근-바닥 플라스크에 두었다. 이어서, DCM 중 DCC (294 g, 1.43 mol) 용액 (600 mL)를 -10 ℃에서 교반하면서 적가하였다. 생성된 용액을 실온에서 밤새 교반하고 고체를 여과하여 제거하였다. 여액을 1 N HCl (2 L) 및 염수 (3 L)로 세척하였다. 합한 유기 추출물을 무수 MgSO₄ 로 건조하고 고체를 여과하여 제거하였다. 여과물인 tert-부틸 N-[(2R)-3-[4-(5-클로로-2-플루오로페닐)페닐]-1-(2,2-디메틸-4,6-디옥소-1,3-디옥산-5-일)-1-옥소프로판-2-일]카르바메이트 (6)를 추가 정제 없이 곧바로 다음 단계에 사용하였다.

단계 A-4:

DCM (7 L) 중 tert-부틸 N-[(2R)-3-[4-(5-클로로-2-플루오로페닐)페닐]-1-(2,2-디메틸-4,6-디옥소-1,3-디옥산-5-일)-1-옥소프로판-2-일]카르바메이트 (6) 용액 및 AcOH (600 mL)를 불활성 질소 대기로 퍼징하고 유지한 20 L의 4-구 둥근-바닥 플라스크에 두었다. 이어서, NaBH₄ (88.8 g, 2.35 mol)를 -5℃에서 여러 배치로 첨가하였다. 생성된 용액을 -5 ℃에서 얼음/염 조 중에 3 시간 동안 교반한 후, 1L의 염수를 점적 방식으로 첨가함으로써 ?칭하였다. 생성된 용액을 2L의 염수로 희석하고 2x2 L의 물 및 1x1 L의 Na₂CO₃ 및 1x2 L의 염수로 세척하였다. 합한 유기 추출물을 무수 MgSO₄로 건조하고 진공 하에 농축하였다. 그 결과, tert-부틸 N-[(2S)-1-[4-(5-클로로-2-플루오로페닐)페닐]-3-(2,2-디메틸-4,6-디옥소-1,3-디옥산-5-일)프로판-2-일]카르바메이트 (7) 520 g (79%)이 황색 오일로서 생성되었다.

단계 A-5:

아세톤/DMF (1:1) 중 tert-부틸 N-[(2S)-1-[4-(5-클로로-2-플루오로페닐)페닐]-3-(2,2-디메틸-4,6-디옥소-1,3-디옥산-5-일)프로판-2-일]카르바메이트 (7) (520 g, 1.03 mol) 용액 (5.2 L), Na₂CO₃ (163 g, 1.54 mol), 및 MeI (219　g, 1.54 mol)를 불활성 질소 대기로 퍼징하고 유지한 10 L의 4-구 둥근-바닥 플라스크에 두었다. 생성된 용액을 실온에서 밤새 교반한 후, 15L의 물로 희석하였다. 1 시간 동안 교반한 후, 고체를 여과를 이용해 수집하였다. 잔여물을 5L의 DCM에 용해시켰다. 합한 유기 추출물을 무수 MgSO₄ 로 건조하고 진공 하에 농축하였다. 그 결과, tert-부틸 N-[(2R)-1-[4-(5-클로로-2-플루오로페닐)페닐]-3-(2,2,5-트리메틸-4,6-디옥소-1,3-디옥산-5-일)프로판-2-일]카르바메이트 (8) 520 g (97%)이 황색 고체로서 생성되었다.

단계 A-6 및 A-7:

CPME 중 tert-부틸 N-[(2R)-1-[4-(5-클로로-2-플루오로페닐)페닐]-3-(2,2,5-tri메틸-4,6-디옥소-1,3-디옥산-5-일)프로판-2-일]카르바메이트 (8) (520 g, 1.00 mol, 1.00 당량) 용액 (2.6 L)을 질소의 불활성 대기로 퍼징하고 유지된 10 L의 4-구 둥근-바닥 플라스크에 두었다. 이어서, HCl/CPME (4N) (2.6 L) 를 -5 ℃에서 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 생성된 혼합물을 진공 하에 절반의 부피로 농축하였다. 그 고체를 여과로 수집하고, EtOAc/DIPE (1:2)로 추가로 세척하였다. 그 결과, (3R,5R)-5-[[4-(5-클로로-2-플루오로페닐)페닐]메틸]-3-메틸-2-옥소피롤리딘-3-카르복실산 (9') 220 g (61%)이 황백색 고체로서 생성되었다.

단계 A-8 및 A-9:

THF 중 (3R,5R)-5-[[4-(5-클로로-2-플루오로페닐)페닐]메틸]-3-메틸-2-옥서피롤리딘-3-카르복실산 (9') (218 g, 602.55 mmol) 용액 (4 L), NMM (170 g, 1.68 mol)를 불활성 질소 대기로 퍼징하고 유지한 10 L의 4-구 둥근-바닥 플라스크에 두었다. 이어서, 2-메틸프로필 클로로포르메이트 (164.4 g, 1.20 mol)를 -5 ℃에서 교반하면서 적가하였다. 생성된 용액을 얼음/염 조 중에 -5 ℃에서 추가로 20 분간 교반하였다. 물 중 NaBH₄ (91.5 g, 2.42 mol) 용액을 -5 ℃에서 교반하면서 추가로 적가하고 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 그런 다음 상기 반응을 2.6 L의 1N HCl을 적가함으로써 ?칭하였다. 생성된 혼합물을 1 시간 동안 추가로 교반한 후, 진공 하에 농축하여 THF를 제거하였다. 그런 다음, 잔여 혼합물을 추가 1 시간 동안 교반한 후, 그 고체를 여과에 의해 수집하였다. 그 고체를 물로 세척하고 THF에 용해시키고, 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 진공 하에 농축하였다. 그 결과, (3S,5R)-5-[[4-(5-클로로-2-플루오로페닐)페닐]메틸]-3-(히드록시메틸)-3-메틸피롤리딘-2-온 (A) 170 g (81%)이 백색 고체로서 생성되었다.

실시예 2

(2S,4R)-벤질 4-아미노-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-2-메틸펜타노에이트 (B) 의 합성

단계 B- 1:

5000 mL 자켓식 둥근 바닥 플라스크에, (3S,5R)-5-((5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)메틸)-3-(히드록시메틸)-3-메틸피롤리딘-2-온 (A) (121.0 g, 348　mmol) 및 DCM (2420 mL)을 가하여 균질한 투명한 용액을 제공한 다음 교반하면서 0 ℃로 냉각히켰다. 3,4-디히드로-2H-피란 (71.0 mL, 783　mmol) 및 4-메틸벤젠술폰산 (20.97 g, 122 mmol)을 첨가하고 반응 혼합물을 18.5 ℃에서 밤새 교반하여 >98% 전환율을 달성하였다. 그런 다음, 그 반응물을 2420 mL의 농축된 NaHCO₃로 ?칭하고, 상을 천천히 분리하고, 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 용매를 제거하였다. 그런 다음, 그 조혼합물을 1 시간 동안 21 ℃에서 교반하면서 DIPE (1815 mL) 중에 둔 후, 5 시간 동안 0-5　℃에서 냉각 및 교반하여 백색 슬러리를 수득하였다. 상기 슬러리리를 여과하고 1X 부피의 차가운(0 ℃) DIPE로 씻어 내고, 여과하였다. 그 결과 얻어진 고체를 밤새 건조하여 113.8　g; 99.1% HPLC 순도를 수득하였다. 여액은 추가로 건조하여 24 g 중량의 걸쭉한 오일을 수득하였다. DIPE (96 mL)를 첨가하고 그 혼합물을 0-5 ℃에서 밤새 교반하여 (3S,5R)-5-((5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)메틸)-3-메틸-3-(((테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)피롤리딘-2-온 (12)을 수득하였다.

단계 B-2:

5000 mL 자켓식 둥근 바닥 플라스크에서, (3S,5R)-5-((5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)메틸)-3-메틸-3-(((테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)피롤리딘-2-온 (12) (113.8 g, 263 mmol) 및 THF (1707 mL)를 교반하에 첨가하여 투명하고 균질한 용액을 제공하고, 그 용액을 질소로 퍼징하고, -10 ℃에서 냉각하였다. THF 중 1M NaHMDS (290 mL, 290 mmol)를 0 ℃ 미만의 온도에서 적가하고, 반응 혼합물을 30 분간 교반하였다. 10 ℃ 미만의 온도에서 디-tert-부틸 디카르보네이트 (69.0 g, 316 mmol)를 그 부피의 3 배의 THF (207 mL) 중에 적가함으로써 용해하였다. 그 반응 혼합물을 20 ℃에서 밤새 교반하고, 20% 염화암모늄 용액 (2731 mL)으로 ?칭하였다. EtOAc (1821 mL)를 첨가하고 수성층(pH 9) 및 유기층으로 상을 분리하였다. 유기층을 염수(2731 mL)로 세척하고, 분리된 상을 다시 수성상(pH 7) 및 유기층으로 분리하고, 유기층을 Na₂SO₄로 건조시킨 후 여과하였다. 용매를 제거하여 걸쭉한 오일을 수득하였다. 추가로 밤새 건조하여, (3S,5R)-tert-부틸 5-((5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)메틸)-3-메틸-2-옥소-3-(((테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)피롤리딘-1-카르복실레이트(13)의 거품-함유 고체가 생산되었다 (146.5 g, 275 mmol, 105 % 수득률, 98.76% 순도)

단계 B-3:

(3S,5R)-tert-부틸 5-((5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)메틸)-3-메틸-2-옥소-3-(((테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)피롤리딘-1-카르복실레이트 (13) (146.5 g, 275 mmol) 및 MeOH (1465 mL)를 3000　mL 둥근-바닥 플라스크에 첨가하였다. 4-메틸벤젠술폰산, H₂O (3.93 g, 20.65 mmol)를 추가로 첨가하고 반응 혼합물을 16 시간 동안 0 ℃에서 교반하여 >97% 전환률을 달성하였다. 반응이 완결되면, EtOAc (2930 mL)를 첨가한 후, 30 ℃ 미만의 배쓰 온도로 증류하여 총 부피를 대략 293 mL로 감소시켰다. 농축된 용액에 EtOAc (2930 mL)를 다시 첨가하고, 대략 293　mL까지 증류하였다. EtOAc (2930 mL)를 첨가함으로써 최종 세척을 완료하고 1465 mL의 최종 볼륨으로 증류하여 모든 잔여 메탄올을 완전히 제거하였다. 잔류하는 산은 ≤ 21 ℃의 온도에서 30 분간 교반하면서 10% NaHCO₃ 을 함유하는 EtOAc (1465　mL)로 상기 최종 부피(1465　mL)를 세척하여 ?칭하였다. 그 층을 교반을 멈춤으로써 분리되도록 하였다 (수성 층 pH~7). 유기층을 1465　mL의 염수(brine)로 세척하여 분리되도록 하였다 (수성 층 pH=7). 그런 다음, 에틸 아세테이트층을 ~146.5 mL로 진공 건조시킨 후, 1465 mL 헥산을 운점 (cloud point)까지 천천히 첨가하였다. 그 용액을 1 시간 동안 가라앉힌 다음, 1465 mL 헥산을 첨가하였다. 그 혼합물을 0 ℃에서 밤새 교반하고, 고체를 여과하고 293 mL 헥산으로 세척하였다. 잔여 고체를 고 밤새 건조하여 98.4 g의 (3S,5R)-tert-부틸 5-((5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)메틸)-3-(히드록시메틸)-3-메틸-2-옥소피롤리딘-1-카르복실레이트 (14)을 수득하였다; 수율 80%; HPLC 순도 99.3%.

단계 B-4:

(3S,5R)-tert-부틸 5-((5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)메틸)-3-(히드록시메틸)-3-메틸-2-옥소피롤리딘-1-카르복실레이트 (14) (118.2g, 264 mmol) 및 DCM (591 mL)을 100 mL 둥근-바닥 플라스크에 첨가하여 무색 용액을 형성하였다. 에틸 비닐 에테르 (761 mL, 7916 mmol) 및 1,10-페난트롤린　(4.76 g, 26.4 mmol)을 용기에 첨가하고, N₂로 퍼징한 후, Pd(II)아세테이트(8.89 g, 39.6 mmol)를 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 20 시간 동안 실온에서 교반하여 ~81% 전환률을 달성하였다. 용매를 회전증발(rotoevaporation)에 의해서 제거하여 조생성물을 수득하고 이를 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 상기 컬럼은 100% 헥산으로 예비-컨디셔닝하였고 조 생성물(30 g/run)을 DCM에 용해시키고, 실리카겔 300 g이 패킹된 컬럼에 로딩하였다. 40% 에틸 아세테이트/헥산의 등용매 구배(isocratic gradient)를 이용하여 상기 화합물을 용리하여, 91.25 g의 정제된 (3S,5R)-tert-부틸 5-((5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)메틸)-3-메틸-2-옥소-3-((비닐옥시)메틸)피롤리딘-1-카르복실레이트 (15)를 수득하였다.

단계 B- 5:

(3S,5R)-tert-부틸 5-((5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)메틸)-3-메틸-2-옥소-3-((비닐옥시)메틸)피롤리딘-1-카르복실레이트 (15) (185 g, 390 mmol)을 THF (1900 mL)에 용해시키고, 아세트산 (11.17 mL)을 첨가하고 10 분 동안 N₂를 퍼징하였다. 그런 다음, 그 혼합물을 H₂로 버블링하고 10%　Pd/C (즉, 18.5 g)를 첨가하였다. 느린 H₂ (가스) 퍼지를 22 ℃에서 밤새 상기 반응이 HPLC로 측정된 바에 따라 완료될 때까지 계속하였다. 그 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하여 균질한 용액을 수득하였다. 그런 다음, 그 여액을 고 진공(high vacuum) 하에서 건조 상태로 펌핑하여 185 그람의 (3S,5R)-tert-부틸 5-((5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)메틸)-3-(에톡시메틸)-3-메틸-2-옥소피롤리딘-1-카르복실레이트 (16)를 얻었다; HPLC 89%; 수율 99%.

단계 B- 6:

(3S,5R)-tert-부틸 5-((5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)메틸)-3-(에톡시메틸)-3-메틸-2-옥소피롤리딘-1-카르복실레이트 (16) (185 g, 389 mmol) 및 ~1205 mL THF를 3000 mL 둥근-바닥 플라스크에 첨가하여 무색 용액을 얻었다. 대략 물 중 1M LiOH 1205 mL를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하여 비누화를 완료하였다. 대략 1205 mL EtOAc를 상기 밤새 반응 혼합물 (pH=13)에 첨가한 다음, 대략 1205 mL의 포화 수성 NH₄Cl로 세척하였다. 유기상에 생성물을 잔류시키면서, 상을 수상(pH=8) 및 유기상으로 분리시켰다. 그런 다음, 상기 유기층을 염수로 세척하고, 층을 다시 분리시키고, 유기층을 Na₂SO₄로 건조한 후 여과하고 진공 건조하여 리튬 (2S,4R)-4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-2-메틸펜타노에이트 (17)를 수득하였다 (213 g, 426 mmol, 94.6 % 수득률).

단계 B-7:

리튬 (2S,4R)-4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-2-메틸펜타노에이트 (17) (194.0 g, 393 mmol) 및 ~650　mL DMF를 2 L 둥근-바닥 플라스크에 첨가하여 무색 용액을 수득하였다. K₂CO₃ (81　g, 589 mmol)을 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 15 분 간 교반하였다. 그런 다음, 벤질 브로미드 (56.1 mL, 471 mmol)를 한 번에 첨가하고, 반응 혼합물을 밤새 대략 22 ℃에서 교반하였다. LCMS 또는 TLC로 측정한 결과, 20 시간 후 완전한 전환을 달성하였다. 대략 3900 mL의 NH₄Cl 및 대략 650 mL의 EtOAc를 첨가하고 15 분 간 교반하고, 상을 분리하였다. 유기층을 ~3900 mL의 염수로 세척하고 층을 다시 분리하고, 유기층을 황산나트륨으로 건조시킨 후 용매를 제거하였다. 조 생성물을 SiO₂ 0-25% EtOAc/헥산에서 정제하고, 합한 정제 분획으로 (2S,4R)-벤질 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-2-메틸펜타노에이트 (18)를 수득하였다 (190 g, 322 mmol, 82 % 수득률). C₃₃H₃₉ClFNO₅에 대한 MS m/z {M+H]⁺ 계산치, 584.118; 실측치 584.12.

단계 B-8:

(2S,4R)-벤질 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-2-메틸펜타노에이트 (18)를 3L 둥근-바닥 플라스크에 채워 첨가하였다 (190.0 g, 325 mmol). CPME 중 3M HCl (1084 mL, 3253 mmol)을 첨가하고 반응 혼합물을 50 시간 동안 실온에서 교반하여 >99% 전환율로 슬러리를 수득하였다. 대략 1084 mL의 신선한 CPME를 첨가하고 생성된 슬러리를 3 시간 동안 교반한 후 여과하였다. 고체를 ~250 mL의 차가운 (0 ℃) CPME로 헹구었다. 그런 다음, 그 고체를 N₂ 가스 하에 건조시켜 (2S,4R)-벤질 4-아미노-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-2-메틸펜타노에이트 (B), HCl으로서 백색 고체를 수득하였다. (150 g, 288 mmol, 89 % 수득률, 99.5% 순도). C₂₈H₃₁ClFNO₃ 에 대해서 계산치 MS m/z {M+H]⁺, 484.00; 실측치 520.46 (HCl 염).

실시예 3:

(2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 (화합물 I)

단계 1:

벤질 (2S,4R)-4-아미노-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-2-메틸펜타노에이트 히드로클로리드 (B) (2.95 kg, 5668 mmol)를, THF 중 HCTU (2.71 kg, 6551 mmol) 및 DIPEA (0.28 kg, 2180 mmol) (26.64 kg)를 이용하여 3-((4-메톡시벤질)옥시)이속사졸-5-카르복실산 (19) (1.48 kg, 5939 mmol) 과 커플링하였다. 그 혼합물을 <10 ^oC로 냉각시켰다. 그런 다음, DIPEA (2.24 kg, 17.332 mmol)를 10 ℃ 미만의 온도에서 상기 혼합물에 첨가하고 그 혼합물을 20　^oC ± 10 ^oC의 온도로 조정하고 완료될 때까지 1 시간 이상 교반하였다. EtOAc (26.55 kg)를 그 다음에 상기 혼합물에 첨가한 후, 30 ℃ 미만의 온도에서 USP 물 (29.5 kg)을 첨가하였다. 그런 다음, 그 혼합물을 20 ℃　±　10 ℃의 온도에서 30 분 이상 교반하고(agitate) 30 분 이상 정치시켰다. 하부 수층을 용기로 분할하였다. 5　w/w% NaHCO₃ 용액 (30.4 kg)을 30 ℃ 미만의 온도에서 상기 혼합물에 첨가하고, 20　℃　±　10　℃의 온도에서 30 분 이상 추가로 회교반하고, 30 분 이상 정치하였다. 그 하부 수층을 용기로 분할하였다. 상기 NaHCO₃ 단계를 2 회 이상 반복한 후 그 혼합물을 6-클로로-1-히드록시벤조트리아졸 함량에 대해 샘플링 하였다. 10 w/v% NaCl (31.6 kg) 용액을 30 ℃ 미만의 온도에서 이 혼합물에 첨가하고, 20　℃ ± 10 ℃의 온도에서 30 분 이상 회교반한 후, 30 분 이상 정치하였다. 그 하부 수층을 용기로 분할하였다. 배치 온도를 30 ℃ 미만으로 유지하면서 잔류하는 층을 약 9L로 증류하였다. 그런 다음, EtOAc (39.8 kg)를 그 혼합물에 첨가하고 진공 증류를 사용하여 배치 온도를 30 ℃ 미만으로 유지하면서 그 혼합물의 부피를 약 9L로 감소시켰다. EtOAc (10.3 kg)를 다시 그 혼합물에 첨가하고 상기 혼합물을 10 분 이상 교반하였다. 그런 다음, 제1 반응 용기에서의 혼합물을 인라인 필터를 통해 제2 반응 용기로 옮겼다. EtOAc (5.6 kg)를 상기 제1 반응 용기를 헹구는데 사용하고, 인라인 필터를 통해 제2 반응 용기로 옮겼다. 두 개의 반응 용기에서의 생성물인, 벤질 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-((4-메톡시벤질)옥시)이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜타노에이트 (20) (4.05kg; 5663 mmol)를 10 분 이상 혼합하고, 멸균된 Nalgene 용기로 배수시키고 추가 공정까지 0-10 ℃에서 저장하였다.

단계 2:

10% w/w Pd/C (0.42 kg)를 반응 용기 1에 벤질 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-((4-메톡시벤질)옥시)이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜타노에이트 (20) (4.05 kg; 5663　mmol)와 함께 채웠다. 그런 다음, 변성 에탄올 (27.5 kg)을 반응 용기 1에 첨가하고 그 성분을 5 분 이상 20-30 ℃에서 혼합하였다. NaOH를 함유한 세정기를 사용하여 상기 단계동안 발생된 HCl 가스를 처리하였다. 6M HCl (3.1 kg)을 < 30 ℃의 온도를 유지하면서 상기 반응물에 첨가하고 5 분 이상 혼합하였다. 진공을 가하고 동시에 질소를 공급하여 그 혼합물을 탈기시켰다. 그런 다음, 상기 반응물의 온도를 20-30 ^oC으로 조정하고, 상기 반응 용기를 배기시켰다. H₂ (5.0 초고 순도)를 반응이 완료될 때까지 상기 혼합물을 통해 버블링하였다. 수소 공급을 차단하고, 그 혼합물을 질소로 퍼징하고, 인라인 필터를 통해 제2 반응 용기로 옮겼다. 변성 에탄올 (6.5 kg)을 헹굼제로서 제1 반응 용기에 채우고 인라인 필터를 통해 제2 반응 용기로 옮겼다. 그런 다음, 제2 반응 용기의 혼합물을 진공을 사용하여 30℃ 미만의 온도를 유지하면서 약 41 L로 증류시켰다. 상기 온도를 20-30 ℃로 조정하고, 30% w/w H₂O₂ 용액 (0.36 kg)을 < 25 ℃의 온도를 유지하면서 상기 제2 반응 용기 중의 혼합물에 첨가하였다. 그 혼합물을 반응 완료까지 20-30 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. 상기 제2 용기 중의 혼합물을 30 ℃ 미만의 온도를 유지하면서 약 12 L까지 진공을 이용하여 증류하였다. 그런 다음, ACN (40.1 kg)을 그 혼합물에 첨가하고 상기 혼합물을 30 ℃ 미만의 온도를 유지하면서 약 12L까지 진공을 이용하여 증류시켰다 (이 단계를 반복함). 이어서, ACN (3.2 kg)을 다시 상기 제2 반응 용기 중의 혼합물에 첨가하고 1 시간 이상 40-50 ℃로 가열하였다. 그 혼합물을 1.5 시간 이상 동안 15-25 ℃로 냉각하고 추가의 2 시간 이상 동안 그 온도에서 유지한 후, 원심 분리로 여과하였다. 그런 다음, ACN (13.0 kg)을 제1 반응 용기에 첨가하고 원심 분리된 고체를 세척하는데 사용하였다. 그런 다음, 상기 원심 분리된 고체를 16 시간 이상 20-30　^oC에서 진공 하에 건조하여 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산을 수득하였다 (4,218　mmol; 2.13 kg; 수율 74.5%; 순도 97.5%).

실시예 4:

결정 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 (화합물 I')의 제조

단계 3:

화합물 I (2.0 kg; 3961 mmol), EtOAc (36.0 kg) 및 USP 물 (20 kg)을 반응 용기 A에 첨가하고, 그 생성된 혼합물을 20　± 10　^oC에서 30 분 이상 교반하였다. 그런 다음, 배치를 추가로 30 분 이상 정치하였다. 그 하부 수층을 분리하고 용기에 저장한 반면, 남은 비-수상을 인라인 필터를 통해 반응 용기 B로 옮겼다. 헹구기 위해 EtOAc (3.6 kg)를 반응 용기 A에 첨가하고 인라인 필터를 통해 반응 용기 B 중 혼합물로 옮겼다. 그런 다음, 반응 용기 B 중 혼합물을 진공 증류하여 감소된 부피 (6L)로 하였다. 추가량의 EtOAc (25.2 kg)를 반응 용기 A에 첨가하고 인라인 필터를 통해 반응 용기 B 중 혼합물로 옮겼다. 그런 다음, 반응 용기 B 중 혼합물을 75 ± 5 ℃의 온도로 가열하고, 고체가 용해될 때까지 5 분 이상 교반하였다. 그런 다음, 이 혼합물을 6 시간 이상 동안 -10 ± 5 ℃로 냉각시키고, 추가적으로 -10 ± 5 ℃에서 12 시간 이상 교반한 후, 필터 C 상에 여과하였다. 추가량의 EtOAc (5.4 kg)를 반응 용기 A에 채우고, 추가로 인라인 필터를 통해 반응 용기 B로 옮기고, -10 ± 10 ℃로 냉각하였다. 그런 다음, 이 용매를 상기 필터 C 상의 여액을 세척하는데 사용하였다. 그런 다음, 여액 및 세척물을 용기에 수집하였다. 상기 여액 또는 습윤 케이크를 16 시간 동안 40 ℃ ± 10 ℃에서 진공 하에 건조시킨 다음, 순도를 위해 샘플링하였다. 화합물 I'은 HPLC로 측정시 98.0 % 이상 순수했고, 기체 크로마토그래피로 측정했을 때 EtOAc가 ≤ 2.5 % w/w로 존재했다. 결정화 후 화합물 I'의 수율은 (1.05 kg; 2079 mmol; 수율 52.5 %; 순도 98.5 %)이었다.

실시예 5:

결정 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 (화합물 I')의 대안적 제조

화합물 I (4.9 kg; 9705 mmol), SiliaMetS^® Thiol (1.62 kg) 및 EtOH (200 proof, 54.9 kg)을 반응 용기 A에 첨가하고, 그 생성된 혼합물을 약 25 ℃ 내지 35℃의 온도에서 1 시간 이상 교반하였다. 그런 다음, 그 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, EtOH (200 proof, 7.8 kg)로 세척하고, 인라인 0.22 ㎛ 필터를 이용하여 반응 용기 B로 옮기고 EtOH (200 proof, 7.8 kg)로 헹궜다. 용기 B 중 혼합물을 약 40 ^oC 내지 60 ^oC의 온도에서 이의 원래 용적의 약 10 %까지 추가로 진공 증류 하였다. 상기 잔여 혼합물을 함유하는 용기를 >　50 ^oC로 조정한 후, 여과된 (0.22 ㎛) USP 정제된 물(49 kg)을 첨가하였다. 이어서, 그 혼합물을 생성물이 완전히 용해될 때까지 교반하면서 약 75 ^oC 내지 85 ^oC의 온도로 가열하였다. 그 혼합물을 4 시간 이상 동안 약 -5 ^oC 내지 5 ^oC의 온도로 냉각하고 동일 온도에서 추가로 16 시간 이상 동안 교반하였다. 그런 다음, 생성된 혼합물을 여과하고 EtOH (200 proof, 9.8 kg) 및 USP 물 (12.3 kg)의 예비-냉각된 혼합물로 세척하였다. 상기 예비-냉각된 용매 혼합물의 온도를 약 0 ^oC 내지 10 ^oC로 조정하였다. 남아있는 여액을 16 시간 이상 동안 약 40 ^oC 내지 60 ^oC의 온도에서 진공 하에 건조한 후, 용매 및 HPLC에 의한 순도를 위해 샘플링하였다. 결정화 후 화합물 I'의 수득률은 90% 였다 (4.6 kg; 9110　mmol; ≥ 97.0% 순도).

실시예 6:

결정 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 (I')의 안정성 연구

의약품 개발에서의 일 과제는 상당히 높은 용융점을 갖는 약물의 안정한 결정형을 발견하는 것과 관련이 있다. 본 발명의 하나의 과제는 화합물 I 의 유리산의 작은 결정을 상기 언급된 바람직한 물리적 특성을 갖도록 얻기가 어렵다는 것이다. 일단, 약 216　^oC에서 용융되는 작은 결정이 얻어지면, 화합물 I'의 가속 안정성 연구를 하기에 보고된 온도 및 % 상대 습도(RH)에서 수행하였다.

시간 (개월)	25 o C , 60% RH			40 o C , 75% RH a
	분석b	총 불순물/ 분해물 (% 영역)	물 함량 (% w/w)	분석b	총 불순물/ 분해물 (% 영역)	물 함량 (% w/w)
0	98.6	0.87	< LOQ(LOQ= 0.2%)	98.6	0.87	< LOQ (LOQ= 0.2%)
1	ntb	nt	nt	98.5	0.86	nt
3	98.5	0.86	nt	98.6	0.87	< LOQ(LOQ= 0.22%)
6	99.2	0.87	< LOQ(LOQ= 0.19%)	99.0	0.87	< LOQ (LOQ= 0.19%)
9	99.0	0.87	nt	nt	nt	nt
12	99.2	0.87	< LOQ(LOQ= 0.19%)	nt	nt	nt
18	99.1	0.87	nt	nt	nt	nt

RH = 상대 습도; nt = 시험 안됨; LOQ = 정량 한계

^a6 개월 간 측정하여 25 ^oC, 60 % 상대 습도에서 2 년과 동등한 것으로 일반적으로 인정되는 가속 저장 조건.

^b분석 = (질량 물질/총 질량)*100 = % (w/w).

이들 데이터는, 화합물 I' 이 25 ^oC, 60% RH에서 18 개월 이상 동안 한정하게 유지된다는 것을 입증하고, 40 ^oC, 75% RH의 가속 조건에 의해 측정되어 적어도 2 년동안 안정하게 유지된다는 것을 입증한다. 이들 데이터는 또한 정량화 가능한 양의 물이 12 개월 째에 검출되지 않음을 나타내므로, 상기 결정이 그 시간 동안 비-흡습성으로 남아 있음을 나타낸다. 게다가, 이들 데이터는 18 개월(25 ^oC, 60% RH) 또는 2년 (40 ^oC, 75% RH의 가속 조건) 동안 1% 미만의 총 불순물/분해물이 검출됨을 나타낸다.

분석법

분석 1: 랫트 , 개 및 원숭이에서의 IV/PO 약물동태학 연구

각각의 랫트, 개 도는 원숭이 PK 연구는 시험 화합물의 제형으로 시작하였다. 각각의 시험 화합물의 적당한 중량을 비히클 부피에 첨가하여 (예를 들어, H₂O 중 5% 탄산수소나트륨, 5% 덱스트로스), 각 화합물의 최종 농도가 투여되기에 적당하도록 하였다. 균질 현탁액이 경구 투여에 허용가능하지만, 정맥 투여 용액을, 투여하기 전에 멸균-여과 (0.2 ㎛)하여 어떠한 미립자도 투여되지 않도록 하였다.

랫트 연구에서, 미리 캐뉼러 삽입된 (pre-cannulated) 수컷 Sprague-Dawley 랫트 (경로 당 3 마리)를 Harran Laboratories 또는 Charles Rivers Laboratories 로부터 입수하였다. 랫트는 투여 용액을 시린지 및 급식 튜브 (gavage tube)를 이용하여 위로 전달된 경구 투여 또는 단일 정맥 (측면 꼬리 정맥을 통해서) 투여를 받았다. 최종 용량은 전형적으로 0.5 mg/kg이었다. 연속 혈액 샘플을, 투여 후 3 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간 및 24 시간에 경정맥(jugular vein)에 이식된 캐뉼라를 통해 수확하였다. 샘플링은 수동으로 또는 자동 혈액 샘플러를 사용하여 수행하였다. 샘플을 항응고제로서 EDTA를 함유한 미세관에 수집하고 냉장 원심 분리에 의해 혈장으로 처리하였다.

개 연구에서, Agilux Laboratories (Worcester, MA)에 수용되고, 9-14 kg의 체중을 갖는 수컷 새끼가 아닌(non-na

ve) 비글 개들 (경로 당 3 마리)은, 단일 경구 또는 정맥 투여를 받았다. 경구 투여는 시린지 및 급식 튜브를 사용하여 위에 전달된 후, 대략 10 mL의 물을 플러쉬(flush)하였다. 경구 투여는 2 mL/kg의 부피로 투여되었다. 정맥 투여는 소복제(sphenous) 정맥에 놓인 경피 카테터를 통해 투여한 후, 대략 3 mL의 식염수 플러쉬를 하였다. 정맥 투여는 0.5 mL/kg의 부피로 투여되었다. IV 또는 PO의 최종 용량은 0.1 mg/kg이었다. 연속 혈액 샘플을, 투여 후 3 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간 및 24 시간에 직접 정맥천자 (direct venipuncture)를 통해서 수확하였다. 모든 샘플은 항응고제로서 EDTA를 함유한 미세관에 수동으로 수집하고 냉장 원심 분리에 의해 혈장으로 처리하였다.

원숭이 PK 연구는 비히클 (예를 들어, 경구용 및 IV를 위해서 H₂O 중 5% 탄산수소나트륨, 5% 덱스트로스, pH 7.4, 및 IV를 위해서 0.22 μM PDVF 시린지를 통해서 여과)의 부피에 화합물 I의 적절한 질량으로, 최종 농도가 IV 및 PO 모두에 대해 1.0 mg/mL으로 투여되도록 수행하였다.

Xenometrics (Stilwell, KS)에 수용된 수컷 게잡이 원숭이 (cynomologus monkeys) (경로 당 3 마리)는 1 또는 2 mg/kg으로 IV 또는 PO 용량의 화합물 I 을 투여받았다. 화합물 I의 정맥 투여는 소복제 정맥에 내부유치(indwelling) 카테터를 통해 투여한 후, 대략 3 mL의 식염수 플러쉬를 하였다. 정맥 투여는 1 mL/kg의 부피로 투여되었다. 경구 용량은 시린지 및 급식 튜브를 사용하여 위에 전달된 후, 대략 10 mL의 물을 플러쉬(flush)하였다. 경구 용량은 2 mL/kg의 부피로 투여되었다. 혈액 샘플을 각각의 동물로부터 각 시점 (투여-전, 0.083 시간, 0.25 시간, 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간 및 24 시간)에서, 두부 (cephalic), 대퇴부 (femoral) 또는 소복제 정맥을 통해서 48 시간 동안 투여하였다. 모든 샘플을 K₂EDTA 튜브에 수집하고 얼음에 두었다. 샘플을 원심 분리 (3200 rpm, 10 분, 5 ℃)에 의해 혈장으로 가공하고, 2% 아세트산의 최종 농도로 산성화시켰다. 혈장의 분취량을 96-웰 플레이트 튜브에 옮기고, 생체 분석 전에 냉동 보관 (-70 ℃) 하였다.

화합물 I의 혈장 농도를 LC/MS/MS로 결정하였다. 혈장 연구 샘플을 볼텍싱하고 96-웰 플레이트에 두었다. 혈액 샘플을 내부 표준을 갖는 200 μL의 아세토니트릴로 추출하였다. 추출물을 2809 RPM에서 10 분간 원심분리하고 50 μL 상등액을 물 중 0.2% 포름산 200 μL과 혼합하였다. 시료 (10-15 μL)를 0.35 mL/분의 유속으로 ThermoFisher HyPURITY^TM (C18 50x2.1mm) 컬럼에 주입하였다. 이동상 A는 물:아세토니트릴:포름산 (95:5:0.1, v:v:v)으로 이루어지고, 이동상 B는 메탄올:아세토니트릴:포름산 (50:50:0.1, v:v:v) (개)으로 이루어졌다. 이동상 A는 물 중 0.2% 포름산으로 이루어지고, 이동상 B는 아세토니트릴 중 0.2% 포름산으로 이루어졌다. (랫트 및 원숭이). Phoenix WinNonlin Version 6.3 (Certara, Sunnyvale, CA)을 사용하고 치료 그룹당 3 마리의 동물로부터의 개별적인 혈장 농도 시간 프로파일을 사용하여　비-구획 분석 (non-compartmental analysis) (각각 IV 및 PO 투여에 대해 Model 201 및 Model 200)으로 화합물 I 의 약물동태학적 파라미터를 결정하였다.

혈장 클리어런스 (plasma clearance)는 연구의 정맥 암 (intravenous arm)으로부터 결정되었고, 이는 약물이 혈장에서 제거되는 속도를 나타낸다. 이는 혈장 농도-시간 곡선 하의 면적으로 투여량을 나눈 값과 동일하다. 혈장 클리어런스에 더하여, 경구 투여 약물이 경구 전달 후 효과적인 전신 수준에 도달하는 것 또한 필수적이다. 경구 생체 이용률은 정맥 투여 후 노출에 대한 경구 투여에 따른 혈장 노출의 측정치이다.

약물동태학적 데이터

연구	경로	AUClast a (μg*hr/mL) 평균	CLlast b (L/hr/kg)평균	경구 생체이용률 (%)c 평균
랫트 (0.5 mg/kg)	IV	0.39	1.22	-
	PO	0.13	3.01	33% ± 10.3%
개 (0.1 mg/kg)	IV	0.21	-	-
	PO	0.0349	2.83	16.5% ± 4.2%
원숭이 (IV:1 mg/kg PO: 2 mg/kg)	IV	2.29	0.38	-
	PO	1.91	1.31	41.8% ± 22.7%

^a AUC_last는 시간 0에서 최종 정량가능한 농도가 관찰되는 투여 후 시간까지, 선형 사다리꼴 방법 (linear trapezoidal method)에 의해 측정된, 혈장 농도 대 시간 곡선 하의 면적이다.

^b CL_last는 AUC_last로 나눈 용량

^c 경구 생체 이용률은 경구 투여 후 AUC_last를 정맥 투여 후, AUC_last 로 나눈 값으로 계산되며, 투여된 용량의 차이에 대해 정규화되고, 백분율로 표시된다.

상기 랫트 데이터는 화합물 I이 0.5 mg/kg의 용량에서 대략 33 %의 경구 생체이용률을 가짐을 보여준다. 고용량 (30-1000 mg/kg)에서 평균 생체이용률은 상기 마우스에서 49-79% 범위였다 (데이터는 나타내지 않음). 화합물 I 은 또한 랫트 종에서 아지르살탄과 함께 투여되었다 (데이터는 나타내지 않음). 상기 개 데이터는 화합물 I이 대략 17%의 제한된 경구 생체이용률을 가짐을 보여준다. 고용량 (100-300 mg/kg)에서 평균 생체이용률은 7-13% 범위였다 (데이터는 나타내지 않음). 상기 원숭이 데이터는 화합물 I이 대략 42%의 경구 생체이용률을 가짐을 보여준다. 고용량 (30 및 100 mg/kg)에서 세 개의 상이한 제형에 대한 평균 생체이용률은 마우스에서 55-83% 범위였다 (데이터는 나타내지 않음).

분석 2: 랫트, 개 및 원숭이 종에서 화합물 I의 신장 배설

환자에서 적절한 장기 약물 투여 및 정확한 정상-상태 약물 농도를 보장하기 위한 중요한 요소는 약물 클리어런스 (drug clearance)이다. 일반적으로 낮은 약물 클리어런스는 더 높은 약물 농도 및 더 큰 약물 효과를 유발한다. 화합물 I 의 신장 클리어런스를 이해하기 위해서, 단일 IV 투여 후 소변에서 회수된 투여된 용량의 백분율을 세 동물 종에서 평가하였다. 각각 수컷 Sprague Dawley 랫트, 수컷 비글 개 및 수컷 게잡이 원숭이 중에서 3 가지 개별 연구를 수행하였으며, 그 절차와 실험 결과는 하기한 바와 같다.

297 내지 316 g 및 294 내지 311 g 의 체중을 갖는 수컷 Sprague Dawley 랫트 (N = 6, 3 마리씩 두 그룹)에, 투약 카셋트의 일부로서 0.5 mg/kg (그룹 I) 및 3.0 mg/kg (그룹 II)의 IV 투여량의 화합물 I 을 투여하였다. 화합물 I 을 0.25 mg/mL 농도로 D5W (물 중 5% 덱스트로스, pH 7.8) 중의 5% NaHCO₃에 용해시켜 1.0 mg/mL의 최종 총 농도를 달성하여 0.5 mg/kg 정맥 내 투여량을 투여하였다. 게다가, 화합물 I 을 1.5 mg/mL 농도로 D5W (물 중 5% 덱스트로스, pH 7.4) 중의 5% NaHCO₃에 용해시켜 3 mg/kg 정맥내 투여량을 투여하였다. 두 제형 모두 정맥내 투여하기 전에 멸균 여과하였다. 랫트는 화합물 I 의 투여 전후에 이들의 전형적 식이 스케줄에 따라 음식에 접근하도록 하였다. 0.5 mg/kg의 화합물 I 을 투여한 코호트(cohort)에 대해, 소변을 드라이아이스 상에 수집하였다. 소변 수집 기간 24 시간 후, 소변 샘플을 해동하고, 용적을 기록하고, 샘플을 혼합한 후 생체 분석을 위해 분취량(~700 L)를 취하였다. 3.0 mg/kg의 화합물 I 을 투여한 코호트에 대해 상기와 같이 소변을 수집하였으나 빙초산을 상기 수집된 소변 분취량에 첨가하여 아세트산의 최종 농도가 2%가 되도록 하였다.

랫트 소변의 화합물 I 농도를 LC/MS/MS에 의해 측정하였다. 소변 샘플을 해동시키고 K₂EDTA 랫트 혈장 중에서 5 배 희석시켰다. 희석된 소변의 50μL 분취량을 96-웰 플레이트로 옮기고, 내부 표준을 함유하는 아세토니트릴로 추출하였다. 96-웰 플레이트를 2809　RPM에서 10 분간 원심 분리하고 상등액을 0.2% 포름산 수용액으로 5 배 희석하고, 새로운 96-웰 플레이트로 옮겼다. 상등액을 0.2% 포름산 수용액으로 희석하였다. 샘플(10 또는 20 μL 부피)을 0.30 또는 0.35 mL/분의 유속으로 Thermo Hypurity (C18 50x2.1 mm) 컬럼에 주입하였다. 이동상 A는 0.2% 포름산수용액으로 이루어지며, 이동상 B는 아세토니트릴 중 0.2% 포름산으로 구성된다. 화합물 I 분석 범위는 0.0125 내지 25 ㎍/mL(0.5 mg/kg 코호트) 및 0.0058 내지 25　μg/mL (3.0　mg/kg 코호트)였다.

체중이 9.00-11.1 kg 및 10.6-13.4 kg인 새끼가 아닌 수컷 비글 개 (N = 6, 3 마리 두 그룹)는 투약 카셋트의 일부로서 0.1 mg/kg (그룹 I) 및 1.0 mg/kg (그룹 II)로　IV　투여량의 화합물 I을 투여하였다. 0.1　mg/kg의 투여를 위해 0.2 mg/mL의 농도 또는 1 mg/kg의 정맥 내 투여량를 위해 2 mg/mL의 농도로 화합물 I을 PEG-200:에탄올:물 (40:10:50)에 용해시키고, 투여 전 멸균 여과하였다. 개들은 화합물 I 의 투여 전후에 이들의 전형적 식이 스케줄에 따라 음식에 접근하도록 하였다. 소변 샘플을 빙초산으로 미리 채운 미리 칭량된 용기에 젖은 얼음 또는 콜드 팩 (cold packs) 상에서 수집하였다. 샘플의 무게를 다시 측정하고, 필요한 경우 추가 빙초산을 최종 농도가 2 %가 되도록 첨가하였다. 생체 분석 전에 샘플을 냉동 보관하였다 (-80 ℃).

개 소변의 화합물 I 농도를 LC/MS/MS에 의해 측정하였다. 소변 연구 샘플 (K₂EDTA 비글 개 혈장, Biochemed, Winchester, VA에 희석)을 해동하고, 볼텍싱하고, 10 또는 25 μL 중 하나를 96-웰 플레이트에 두었다. 샘플은 내부 표준 크리신(chrysin) 또는 글리부리드 (Glyburide)를 갖는 6 배 더 큰 부피의 아세토니트릴 (60 또는 120 μL)로 추출하였다. 추출물을 3000 RPM에서 5 분간 원심 분리하고, ~70%의 상등액 (50 또는 100 ㎕)을 새로운 96-웰 플레이트로 옮기고, 동일한 용적의 물과 합하였다. 샘플을 0.8 또는 0.9 mL/분의 유속으로 Mac Mod Ace C18 (2.1x50 mm, 3 m) 또는 Waters Acquity UPLC BEH C18 (50 x 2.1mm, 1.7　μm) 컬럼 상에 주입하였다. 이동상 A는 95:5:0.1 (v:v:v) 물:아세토니트릴:포름산으로 이루어지고, 이동상 B는 50:50:0.1 (v:v:v) 메탄올:아세토니트릴:포름산으로 이루어졌다. 화합물 I 분석 범위는 0.0002 내지 1.00　㎍/mL이었다.

체중이 2.87-3.61 kg인 새끼가 아닌 수컷 게잡이 원숭이 (N = 3)는 1 mg/kg으로　IV　투여량의 화합물 I 을 투여하였다. 화합물 I 을 D5W 중 5% NaHCO₃에 용해시키고, 투여 전 0.22 M 폴리비닐 디플루오리드 (PVDF) 시린지 필터 (Millipore Millex-GV, SLGV033RB)를 통해 여과하였다. 제형을 투여 전 날 제조되었고, -70 ^oC에 밤새 보관하여 투여 전 해동하였다. 화합물 I 의 정맥 용량을 두부 정맥으로 유치 카테터를 통해 투여한 후, 대략 3 mL의 식염수 플러쉬를 하였다. 정맥 투여는 1 mL/kg의 부피로 투여되었다. 소변 샘플을 빙초산을 함유하는 튜브에 젖은 얼음 또는 콜드 팩 상에서 수집하여 임의의 잠재적인 글루쿠로니드 콘쥬게이트를 안정화시켰다. 총 소변 샘플 부피를 중량 분석적으로 산정하였고 분취액을 수득하고, 생체 분석 전 냉동 (-70 ℃)하였다.

원숭이 소변의 화합물 I 농도를 LC/MS/MS에 의해 측정하였다. 소변 샘플을 해동하고 K₂EDTA 원숭이 혈장 (Bioreclamation, Westbury, NY) 중에 5 배로 희석하였다. 샘플을 볼텍싱하고 50 μL를 96-웰 플레이트로 옮겼다. 샘플을 내부 표준을 갖는 200 μL의 아세토니트릴로 추출하였다. 추출물을 2809 RPM 으로 10 분간 원심 분리하고, 50 μL의 상등액을 0.2% 포름산 수용액 200 μL에 첨가하였다. 샘플 (10-15 μL)을 ThermoFisher HyPURITY^TM (C18 50x2.1mm) 컬럼 상에 0.35 mL/분의 유속으로 주입하였다. 이동상 A는 0.2% 포름산 수용액으로 구성되고, 이동상 B는 아세토니트릴 중 0.2% 포름산으로 구성된다. 화합물 I 분석 범위는 0.00125 내지 5 ㎍/mL이었다.

24 시간의 수집 기간 동안 배설되는 소변의 평균량과 소변으로 배설되는 투여량의 대략적 %를 하기의 표에 보고하였다.

종	IV 투여량 (mg/kg)	소변 배설 (소변으로 배설된 투여량의 대략적 %) 평균a (±SDb)
랫트	0.5	< 0.03 (NA)
랫트	3.0	< 0.02 (NA)
개	0.1	< 0.02 (NA)
개	1.0	< 0.001 (NA)
원숭이	1.0	0.670 (0.593)

^a3회 측정의 평균

^b표준 편차

랫트 중 화합물 I 의 신장 배설은 투여된 용량의 약 0.02% 미만 또는 0.03% 미만이었고, 개에서는 투여된 용량의 0.02% 미만 또는 0.001 % 미만이었으며, 원숭이에서는 투여된 용량의 대략 0.670% ± 0.593%였다. 이들 데이터는 화합물 I 이 시험된 3 가지 종에서 낮은 신장 배설을 갖는다는 것을 나타낸다.

분석 3: 1 상 단회 -상승 용량 연구

체내에서 전환되거나 용해되어 그의 가용성 형태인 화합물 I을 제공하는, 화합물 I' (형태 I)의 1 상의 단회 상승 용량 (single-ascending dose; SAD) 임상 시험을, 다양한 심혈관 및 신장 질환, 예를 들어, 만성 신장 질환, 당뇨성 신경병증, 급성 및 만성 신부전, 감소된 박출률(ejection fraction)을 갖는 심부전, 보존된 박출률을 갖는 심부전, 심근경색후 무증상 좌심실 기능이상 (post-MI asymptomatic LVD), 아급성 심부전 및 내성 및 격리된 수축기 고혈압의 치료를 위한 네프릴리신 저해를 평가하기 위해 수행하였다. 안정성 및 내약성, 약물동태학 (QD/BID 투여 및 비-신장 배설에 대한 지원), 약물역학 (표적 관여 바이오마커 cGMP 및 ANP에 대한 시험, 식이 효과, 및 절대 경구 생체이용률을 시험하였으며, 그 중에서도 특히, ¹⁴C 정맥 마이크로트레이서를 이용하여 신장 제거를 시험하였다.

1 상 연구는 4:1의 비율로 무작위로 배정된 건강한 남성과 여성 자원자에서 이중 맹검, 무작위 위약-대조 단일 상승 용량 연구였다. 이 연구는 50 mg, 100 mg, 200 mg, 400 mg 및 600의 단일 오름차순 용량을 투여한 코호트 (n = 10/ 8 활성 및 2 위약의 코호트)를 포함하는 상승 용량 부분에 대해 수주 동안 56 명의 건강한 지원자를 등록했다. 여섯 개 코호트 (n=6)에 i.v. 마이크로 트레이서, 및 10 ㎍ 및 100 ㎎의 경구 용량을 각각(respectively) 투여하였다. SAD 임상 시험 데이터는 부분적으로 화합물 I을 600mg까지 단회 투여한 후 내약성이 우수함을 입증하였다.

분석 3.1: 인간에서 NEP 활성 ( cGMP )

이 연구의 한 가지 목표는 투여한 후 인간에서 화합물 I 의 작용 기전/지속기간을 결정하는 것이었다. 이를 위해, 네프릴리신 표적 관여 바이오마커인 cGMP 수준을 화합물 I' 을 투여한 후 측정하여 화합물 I의 생물학적 효과의 증거를 제공하였다. 예를 들어, 투여 24 시간 후 혈장 cGMP 수준의 상승은 약물학적 효과의 지속된 시간을 나타내고, 약동학적 지속을 입증하는 혈장 클리어런스 값과 유사하다.

도 6은 시험한 용량 vs. 시간에서 기저치로부터 평균 혈장 cGMP (nM)의 변화를 도시한다. 이 데이터는 단회 투여 후 24 시간 동안 평균 혈장 cGMP의 지속적인 증가를 제공하고, 8 내지 24 시간 범위에서 최대 수준의 cGMP가 발생하고, 8-12 시간이 가장 높은 cGMP 수준을 나타냄을 보여준다. 또한, 상기 혈장 cGMP 투여량 반응은 투여량 범위 즉, ≥ 100 mg 투여량 수준의 하단 끝에서 최대 효과에 근접함을 입증한다 (도 7 참조).

분석 3.2 인간에서의 화합물 I' 의 PK 프로필, 경구 생체이용률 및 신장 배설

화합물 I 의 약물동태학적 프로필은 투여량-비례적이고 (도 8 참조) 화합물 I은 높은 경구 생체이용률 (약 80%)을 갖는 것으로 나타났다. SAD 임상 시험의 데이터는 또한 낮은 수준의 신장 제거를 제안했는데, 즉, 투여된 총 화합물 I' 용량의 1 % 미만이 정맥 마이크로트레이서 검사 기술에 의해 확인된 바와 같이 신장을 통해 제거된다.

흥미롭게도, PK 프로필 (예를 들어, 화합물 I의 C_max) 및 PD 프로필 (예컨대, cGMP_max)은 상이한 시간 윈도우 내에서 피크 값을 나타냈다. SAD 임상 실험 데이터는, 혈장과 소변 모두에서 24 시간에 걸쳐 혈장 cGMP 수준에서의 투여량-관련된 증가 및 cGMP의 지속적인 상승을 제시하고, 이는 1일 1회 투여를 위한 화합물 I 또는 화합물 I' 의 사용을 뒷받침한다.

분석 3.3: 표준 치료와의 차별화

현재, 발사르탄과 병용되는 사쿠비트릴은 만성 심부전 및 박출률이 감소를 갖는 환자에서 심혈관성 사망 및 심부전으로 인한 입원 위험을 감소시키는 것으로 나타났다. 사쿠비트릴 (네프릴리신 저해제)과 화합물 I 의 비교는 신장 제거 및 24 시간 표적 관여에서 중요한 차별화를 보여준다. 예를 들어, 사쿠비트릴은 신장 (60 % 신장 제거율)을 통해 주로 제거되지만, 화합물 I 은 그렇지 않다 (<1 % 신장 제거율) (도 9 참조). 이는 심장 질환이 있거나 없는 신장-질환이 있는 환자의 치료에 중요할 수 있다. 게다가, cGMP의 수준 (즉, 표적 관여)은 사쿠비트릴의 투여 24 시간 후 상승하지 않지만, 화합물 I'과 투여한 후에는 상승한다. 이는 화합물 I 또는 화합물 I'의 잠재적인 1일 1회 투여를 가능하게 하는데, 발사르탄과 함께 병용 시 사쿠비트릴에 대해서는 그렇지 않으며, 이것은 1 일 2 회 투약 요법이다.

분석 4: 1 상 다회 -상승 용량 연구

건강한 성인 및 노인 개체에서, 화합물 I' 의 다회 상승 경구 투여량에서 화합물 I 및 이의 대사체의 안전성, 내약성, 약물동태학, 화합물 I 의 약물역학, 식이 효과, 절대 경구 생체이용률 및 신장 제거율을 추가로 평가하기 위해, 화합물 I' (형태 I)의 1 상 다회-상승 용량 (multiple-ascending dose; MAD) 임상 시험을 수행하였다. 하기에 논의된 바와 같이, 보고된 데이터는 SAD 임상 시험으로부터 유래된 결과를 확인한다.

1 상 연구는 4:1 비율로 무작위로 배정된 건강한 남성 및 여성 자원자에게 이중 맹검, 무작위 위약-대조 다중 상승 투여량 연구였다. 이 연구는, 상승-투여량 부분에 대해 수 주 동안 50 명의 건강한 성인 (19-55 세)과 노인 (65-80 세) 자원자를 등록하였고, 이는 (1) 50mg, 100mg 및 200mg의 상승 투여량, (2) PK/PK를 위해 200mg과 병행하여 시험한 10mg의 투여량, 및 (3) 한 노인 코호트에 대해 100mg의 투여량을 투여한 코호트 (n = 10 / 8 활성 및 2 위약의 코호트)를 포함하였다. MAD 임상 시험 데이터는 부분적으로는 화합물 I이 14 일까지 수 회의 경구 투여 후 일반적으로 내약성이 우수하다는 것을 입증했다. 또한, 수 회의 투여 후에도 화합물 I의 신장 제거율은 무시할 만하였고, 예를 들어, 모든 개체에 대해 1 일째 및 14 일째에 <1 %가 관찰되었다.

분석 4.1: 인간에서의 NEP 활성 ( cGMP ) 및 표준 치료와의 차별화

MAD 임상 연구의 일부는 사람에게 투여한 후 화합물 I의 작용 기전/지속기간을 결정하는 것이었다. 이를 위해, 네프릴리신 표적 관여 바이오마커인 cGMP의 수준을 화합물 I'의 투약 후 측정하여 화합물 I의 생물학적 효과의 증거를 제공하였다. 예를 들어, 투약 24 시간 후 혈장 cGMP 수준의 상승은 약리학적 효과의 지속 기간을 입증하였고, 이는 혈장 클리어런스 값과 유사하여 약물동태학적 지속을 입증한다.

도 10은 시험된 투여량 vs. 시간에서 기저치로부터의 평균 혈장 cGMP (nM)의 변화를 도시한다. 이 데이터는 화합물 I이 24 시간 동안 평균 혈장 cGMP의 지속적인 증가를 제공함을 입증한다. 중요한 결과는 도 10에 나와 있다. 이 데이터는 임상 연구의 14 일째에, 화합물 I'의 1 일 1 회 투여량에 대해 24 시간까지 측정된 모든 투여뿐만 아니라 골(trough) (0 시간)에서의 모든 용량의 표적 관여가 있음을 보여준다. 이는 1일 2회 투여 용법으로 골에서 및 24 시간에서의 표적 관여가 거의 없는 표준 치료법(Gu 등, 411 페이지, J. Clin. Pharmacol., 2010, Vol.50, Issue 4, pp. 401-414)과 대조적이다.

본 발명은 특정 양상 또는 이의 구체예를 참조하여 기술되었지만, 당업자는 본 발명의 실제 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변경이 이루어 지거나 또는 등가물이 대체될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 적용가능한 특허법 및 규정에 의해 허용되는 한도 내에서, 본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각 문서가 본 명세서에 참고로서 개별적으로 통합된 것과 동일한 정도까지 그 전체가 참조로 본 명세서에 통합된다.

Claims (36)

1. (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 (I')의 결정 유리산 형으로서,
   상기 결정형은 6.51±0.20, 11.62±0.20, 13.05±0.20, 15.07±0.20, 및 23.28±0.20의 2θ 값에서 회절 피크를 포함하는 분말 X-선 회절 패턴을 특징으로 하는 것인 결정형.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 결정형은 6.51±0.20, 11.62±0.20, 13.05±0.20, 15.07±0.20, 17.12±0.20, 23.28±0.20, 및 26.19±0.20의 2θ 값에서 회절 피크를 포함하는 분말 X-선 회절 패턴을 특징으로 하는 것인 결정형.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 결정형은 6.51±0.20, 11.62±0.20, 13.05±0.20, 15.07±0.20, 15.72±0.20, 17.12±0.20, 20.79±0.20, 21.10±0.20, 23.28±0.20, 24.48±0.20, 25.81±0.20, 및 26.19±0.20으로부터 선택된 하나 이상의 2θ 값에서 부가적인 회절 피크를 갖는 것을 특징으로 하는 결정형.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 결정형은 분당 10 ℃의 가열 속도로 기록된 시차 주사 열량측정 트레이스 (differential scanning calorimetry trace)가 약 214　℃ 내지 약 218 ℃의 온도에서 최대 흡열 열 흐름 (endothermic heat flow)을 나타내는 것을 특징으로 하는 결정형.
5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 결정형 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate)인 것인 약학적 조성물.
7. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 결정형, 및 AT₁ 수용체 길항제, 포스포디에스터라아제(phosphodiesterase) 저해제, 레닌 (renin) 저해제, 가용성 구아닐레이트 시클라아제(guanylate cyclase) 저해제, 광물코르티코이드-수용체(mineralocorticoid-receptor) 길항제, 이뇨제, 또는 이들의 조합들을 포함하는 것인 약학적 조성물.
8. 청구항 7에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
9. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 결정형을 캡슐 (capsule), 정제 (tablet) 또는 현탁액 (suspension) 중에 포함하는 경구 제형.
10. 청구항 9에 있어서, 개체에서 상기 결정형의 방출은 즉시 (immediate), 조절된 (controlled) 또는 지연된 (delayed) 방출인 것인 경구 제형.
11. 청구항 9에 있어서, 상기 캡슐 물질은 젤라틴 (gelatin), 폴리사카리드 (polysaccharide), 키토산 (chitosan) 또는 합성 폴리머 (synthetic polymers)인 것인 경구 제형.
12. 청구항 9에 있어서, 상기 경질 캡슐은 젤라틴, 폴리사카리드, 또는 합성 폴리머를 포함하는 것인 경구 제형.
13. 청구항 12에 있어서, 상기 캡슐은 히드록시프로필 메틸셀룰로오스를 포함하는 것인 경구 제형.
14. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 치료에 사용하기 위한 것인 결정형.
15. 청구항 14에 있어서, 고혈압, 심부전, 또는 신장 질환을 치료하는데 사용하기 위한 것인 결정형.
16. 고혈압, 심부전, 또는 신장 질환을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
17. (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 (I) 또는 그 결정형 (I'), 예를 들어 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 화합물을 1일 1회 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 고혈압, 심부전, 또는 신장 질환을 치료하는 방법.
18. 청구항 17에 있어서, 상기 고혈압은 본태성(primary) 고혈압, 폐동맥성(pulmonary arterial) 고혈압, 만성 혈전색전성(thromboembolic) 폐고혈압, 또는 신장동맥협착(renal artery stenosis)을 동반한 고혈압인 것인 방법.
19. 청구항 17에 있어서, 상기 신장 질환은 당뇨성 신경병증, 만성 신장 질환, 단백뇨, 급성 신장 손상, 신증후군(nephrotic syndrome), 국소 분절 사구체경화증(focal segmental glomerulosclerosis) 또는 다낭성(polycystic) 신장 질환인 것인 방법.
20. 치료적 유효량의 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 (I) 또는 이의 결정형 (I'), 예를 들어 청구항 1 내지 4 중 어느 하나의 화합물을 1일 1회 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 신장 손상 환자(renally-impaired patient)의 고혈압, 심부전, 또는 신장 질환을 치료하는 방법.
21. 청구항 20에 있어서, 상기 신장 손상 환자는 60 mL/분/1.73　m² 내지 15 mL/분/1.73 m²의 추정 사구체 여과율(estimated glomerular filtration rate; eGFR)을 갖는 만성 신장 질환을 갖는 것인 방법.
22. ANP 또는 cGMP를 증가시키는 양의 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 (I) 또는 이의 결정형 (I'), 예를 들어 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 화합물을 1일 1회 사람에게 투여하는 것을 포함하는, 최소 24 시간 동안 사람의 심방 나트륨이뇨 펩티드 (atrial natriuretic peptide; ANP) 또는 시클릭 일인산구아노신(cyclic guanosine monophosphate; cGMP)의 수준을 증가시키는 방법.
23. 청구항 22에 있어서, 상기 ANP 및 cGMP의 수준은 인간의 소변 또는 혈장 또는 둘 모두에서 측정하는 것인 방법.
24. 청구항 17, 20 또는 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 (I) 또는 이의 결정형 (I'), 예를 들어, 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 화합물은 비경구적으로 투여되는 것인 방법.
25. (a) 벤질 (2S,4R)-4-아미노-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-2-메틸펜타노에이트 히드로클로리드를 3-((4-메톡시벤질)옥시)이속사졸-5-카르복실산과 용매 중에서 약 1:1 몰비로 커플링하여 벤질 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-((4-메톡시벤질)옥시)이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜타노에이트를 수득하는 단계; 및
    (b) 벤질 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-((4-메톡시벤질)옥시)이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜타노에이트를 탈보호화하여 (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 (I)을 형성하는 단계를 포함하는,
    (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 (I)의 제조방법.
26. 청구항 25에 있어서, 단계 (a)는 펩티드 커플링제 및 염기를, 커플링제: 염기: 벤질 (2S,4R)-4-아미노-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-2-메틸펜타노에이트 히드로클로리드: 3-((4-메톡시벤질)옥시)이속사졸-5-카르복실산 약 1:3:1:1의 몰비로 더 포함하는 것인 제조방법.
27. 청구항 26에 있어서, 상기 커플링제는 2-(6-클로로-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(V)이고, 상기 염기는 N,N-디이소프로필에틸아민인 것인 제조방법.
28. 청구항 25에 있어서, 상기 탈보호화 단계 (b)는 팔라듐 촉매 및 수소 가스로 수행되는 것인 제조방법.
29. (a) (2S,4R)-5-(5'-클로로-2'-플루오로-[1,1'-비페닐]-4-일)-2-(에톡시메틸)-4-(3-히드록시이속사졸-5-카르복사미도)-2-메틸펜탄산 및 용매를 포함하는 용액을, 선택적으로 금속 스캐벤저와 함께 높은 온도에서 형성시키는 단계;
    (b) 상기 용액을 약 -20 ℃ 내지 5 ℃의 온도로 냉각시키는 단계; 및
    (c) 그 결과 생성된 고체를 단리하여 결정형을 수득하는 단계를 포함하는, 청구항 1의 결정형의 제조방법.
30. 청구항 29에 있어서, 단계 (a)에서 상기 용매는 극성 용매인 것인 제조방법.
31. 청구항 30에 있어서, 상기 용매는 에틸 아세테이트 및 물의 혼합물, 에틸 아세테이트, 또는 에탄올인 것인 제조방법.
32. 청구항 29에 있어서, 단계 (a)에서 상기 온도는 약 60 ℃ 내지 95 ℃인 것인 제조방법.
33. 청구항 32에 있어서, 상기 온도는 약 70 ℃ 내지 85 ℃인 것인 제조방법.
34. 청구항 29에 있어서, 단계 (c)에서 상기 고체를 단리하는 단계는, 여과하는 단계, 하나 이상의 용매로 세척하는 단계, 공기 중 또는 진공 하에 건조하는 단계, 또는 이들 단계의 조합을 수반하는 것인 제조방법.
35. 청구항 34에 있어서, 상기 용매는 에틸 아세테이트 및 물, 에틸 아세테이트 또는 에탄올인 것인 제조방법.
36. 청구항 34에 있어서, 상기 진공 하에 건조하는 단계는 25 ℃ 내지 70 ℃의 온도에서 수행하는 것인 제조방법.

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