KR20180112777A - 향상된 다능성 세포 및 미세혈관 조직 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 향상된 생물활성을 갖는 조성물 및 질환 또는 조직 부상 및 질환 병태와 관련된 통증의 치료에서의 사용 방법을 제공된다.

Description

향상된 다능성 세포 및 미세혈관 조직 및 이의 사용 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 미국 특허법(35 U.S.C. § 119(e)) 하에 2016년 3월 2일자로 출원된 미국 출원 제62/302,669호에 대한 우선권을 주장하며, 이 기초출원은 그의 전문이 참고로 포함된다.

줄기 세포 분야는 수십년 동안 빠르게 진보하였다. ED 토마스(ED Thomas)는 1950년대에 환자에게 골수로부터의 조혈 줄기 세포를 이식하였다. 프리덴슈타인(Friedenstein)은 골수 내에 간충직 줄기 세포(MSC)가 있다는 것을 처음으로 발견하였다. 그는 서양 문헌에서 출판하기 전 수년 동안 상기 주제에 관해 연구하였다(Friedenstein AJ, et al., Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Exp Hematol . 1976 Sep; 4(5):267-74). 카플란(Caplan)은 플라스틱 상에서의 선택적 흡착 및 선택적 조건 하의 후속적 배양에 의해 골수 및 뼈막으로부터의 간충직 줄기 세포의 상대적으로 순수한 집단을 얻을 수 있다는 것을 나타내었다(AI Caplan et al., Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 1991 Sep; 9(5):641-50). 1990년대 동안, 다수의 상이한 그룹은 줄기 또는 전구체 세포가 매우 다양한 조직, 예컨대, 피부, 장, 모공, 근육, 간, 뇌, 태반 및 치아로부터 유사한 방식으로 단리될 수 있다는 것을 나타내었다. 유안-디 할보르센(Yuan-Di Halvorsen)은 지방 조직이 다중 표현형으로 배양되고 분화될 수 있는 세포를 함유한다는 것을 처음으로 나타내었다(WO/2001/062901). 대부분의 문헌은 줄기 세포를 동정하고 특성규명하는 것에 그리고 그들의 분화를 다양한 세포 유형으로 제어하는 것에 중점을 둔다.

다수의 회사에 의한 30년의 작업에도 불구하고, MSC를 이용한 상업적 제품은 미국식품의약국(Food and Drug Administration: FDA) 요건을 통과할 수 없었다. 줄기 세포를 이용한 상업적 제품은 있었지만, 그들은 배양되지 않았다. 신선한 골수를 이용하는 제품은 1980년대 이래로 시판되었다(예를 들어, 콜라그라프트(Collagraft)(등록상표) 및 셀렉트(Cellect)(상표명)). DR 페테르손(DR Peterson)은 지방 및 다른 미세혈과 조직으로부터의 신선한 세포가 정형외과적 조직을 재생하기 위해 사용될 수 있다는 것을 처음을 나타내었다(미국 특허 제 6,200,606호). 다른 이들은 그 이후로 이들 세포가 심장, 누공, 상처, 신장, 만성 허혈, 연골 결함 및 다수의 다른 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다는 것을 나타내었다. 역사적으로, 이들 세포는 항상 자가 또는 전신 환경에서 사용되었다.

오시리스 쎄라퓨틱스 인코포레이티드(Osiris Therapeutics, Inc.)는 20년 전에 MSC의 배양이 그들의 면역원성을 변화시킨다는 것을 나타내었다. 배양 공정은 세포가 그들의 표면 마커를 변화시키는 것을 유도한다. 이들 세포가 다른 동물에게 이식될 때, 그들은 보통 즉시 거부되지 않으며, 사실, 숙주의 면역계가 거부를 방지하도록 조절하는 것으로 나타난다. 거부를 방지하는 그들의 능력에도 불구하고, MSC는 숙주의 신체 내에서 빠르게 제거된다. 종종 1% 미만의 거부된 세포가 이식 후 3일에 발견된다. 엄청난 양의 작업에도 불구하고, 세포가 사멸하는 이유 또는 그들이 유리한 결과를 생성하는 방법에 대한 증거 또는 심지어 합의는 여전히 없다.

따라서, 다능성 세포 제제의 활성을 향상시키고, 이러한 향상된 세포 제제를 이용하는 방법에 대한 당업계의 필요가 있다.

최근의 진보는 줄기 세포, 다능성 세포, 및 단리된 미세혈관 조직을 이용하기 위한 새로운 접근을 야기하였다. 연구 및 임상적 사용은 이들 세포 및 조직이 건조되고, 심지어 여전히 치료적 가치를 유지하면서 종국적으로 멸균될 수 있다는 것을 나타내었다. 더 나아가, 제제는 동종이계 또는 심지어 이종발생성 대상체에서 사용될 수 있다. 조성물의 일부 추가적인 이점은: (1) 감소된 면역 반응 및 감소된 거부 가능성; (2) 항-염증 활성; (3) 혈관화 활성; (4) 멸균; (5) 즉시 사용을 위한 형태로 장기간 동안 실온 저장의 편리함을 포함한다. 가공된 또는 동결건조된 미세혈관 조직을 제조 및 이용하는 방법은 미국 특허 제9,044,430호, 미국 특허 공개 제2015/0231183호, 및 미국 특허 공개 제2016/0015859호에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 개시내용은 향상된 생물활성을 갖는 다능성 세포를 포함하는 조성물, 및 다수의 상이한 질환 및 병태를 치료하거나 또는 예방함에 있어서 그들의 제조 및 사용 방법을 제공한다.

본 발명의 실시형태는 단리된 다능성 세포, 가공된 미세혈관 조직, 상기 세포 또는 조직으로부터 얻은 또는 유래된 세포막을 포함하되, 세포, 조직 또는 막은 혈관화 또는 항-염증 활성을 가진다. 본 발명의 실시형태는 전형적으로 세포 또는 단백질의 효능을 감소시키지만, 놀랍게도 세포 또는 조직의 생물활성을 향상시키는 치료에 노출된 조성물을 포함한다. 상기 치료는 방사선, 실온에서의 저장, 저산소, 전자기장에 대한 노출, 초음파 교반, 유체 전단력, pH 충격, 삼투압 충격, 열 충격, 장기간 저온 저장, 및 반응성 산소종에 대한 노출을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 건조 또는 동결건조된다. 관련된 실시형태에서, 상기 조성물(멸균, 건조 또는 동결건조된 조성물을 포함)은 측정 가능한 생물활성을 보유한다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 부형제를 포함한다.

몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 이식 가능한 스캐폴드 또는 매트릭스를 추가로 포함하는데, 이는, 예를 들어, 뼈-유래 이식물, 스캐폴드, 다공성 재흡수성 중합체, 하이드로겔, 조직 생성물을 포함하는 퍼티(putty), 또는 봉합일 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포, 조직 또는 세포막은 상기 이식 가능한 스캐폴드 또는 매트릭스의 뼈, 힘줄, 또는 진피 접합면 상에 존재한다.

특정 실시형태에서, 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다. 그러나, 직접 투여(조직면에 대해 또는 직접 주사 중 하나에 의해), 동맥내 투여, 전신 투여 등을 포함하는 다른 투여 경로가 사용될 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 세포 또는 조직은 포유류 공여자, 선택적으로 인간으로부터 얻어진다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 줄기 세포 또는 전구체 세포를 포함한다.

본 발명은 가공된 미세혈관 조직을 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하되, 상기 조성물은 향상된 생물활성을 가지고, 상기 방법은 공여자 포유류로부터 얻은 미세혈관 조직 샘플을 분리시켜 분리된 미세혈관 조직을 포함하는 조성물을 생성하는 단계; 분리된 미세혈관 조직을 포함하는 조성물로부터 한 가지 이상의 조직 성분을 제거하는 단계; 선택적으로 멸균 전에 또는 후에 상기 조성물을 건조 또는 동결건조시키는 단계; 및 선택적 건조 또는 동결건조 전에 또는 후에 처리하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 처리 후에 증가된 효력을 가진다. 특정 실시형태에서, 세포 또는 조성물은 배양되지 않는다. 특정 실시형태에서, 처리 단계는 방사선에 대한 노출, 열, 삼투압 충격, pH 충격, 초음파 교반, 여과, 밀도 구배 분리, 저산소, 반응성 산소종, 및/또는 전자기장을 포함한다. 특정 실시형태에서, 분리 또는 제거하는 단계는 초음파 교반, 여과, 또는 밀도 구배의 사용을 포함한다. 특정 실시형태에서, 미세혈관 조직은 지방-유래 조직이며, 상기 초음파 교반, 여과 또는 밀도 구배의 사용은 조성물로부터 지방세포를 제거한다.

다른 관련된 실시형태에서, 본 발명은 포유류에게 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 방법에 따라 제조된 조성물을 제공하는 단계를 포함하는 포유류에서 부상 또는 질환을 치료하고/하거나 상처 치유를 촉진시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 국소로 적용된다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 포유류에게 수술에 의해 이식된다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 상기 포유류에서 부상 또는 질환 부위 내에서 또는 이에 인접하여 이식되거나 또는 주사된다. 관련된 실시형태에서, 상기 조성물은 포유류에게 정맥내로 제공된다.

특정 실시형태에서, 치료될 질환 또는 병태는 조직 또는 기관 질환이다. 조직은 임의의, 예컨대 상피, 결합조직, 근육, 지방, 또는 신경 조직일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 기관은 임의의, 예컨대 소화, 호흡, 배설, 내분비, 순환, 감각, 생식 및 신경 기관일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 이들은 위, 간, 소장, 대장, 직장, 항문, 폐, 코, 기관지, 신장, 방광, 요도, 뇌하수체, 부신, 갑상선, 췌장, 부갑상선, 전립선, 심장, 혈관, 비장, 피부, 혀, 눈, 귀, 자궁, 고환, 음경, 난소, 유선, 뇌 및 척수를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 질환 또는 병태는 탈모, 활액낭염, 구개열, 골수염 또는 말초신경병증이다. 다른 실시형태에서, 질환 또는 병태는 관절 과운동성/엘러스-단로스 증후군, 복합부위 통증 증후군(CRPS), 근막통증 증후군, 약화된 치아 임플란트, 페이로니병, 크론병, 자가면역간염, 간질성 방광염, 또는 경화 태선이다.

특정 실시형태에서, 상기 부상은 연조직에 존재한다. 특정 실시형태에서, 상기 부상은 힘줄, 인대, 피부, 뼈, 연골, 추간판, 또는 미세혈관 조직에 존재한다. 특정 실시형태에서, 부상 또는 질환은 허혈 부상, 재관류 부상, 미세혈관 부상 또는 염증이다. 특정 실시형태에서, 질환은 힘줄증이다. 특정 실시형태에서, 질환은 관절염, 예컨대, 골관절염 또는 류마티스 관절염이다. 다른 실시형태에서, 질환은 족저근막염이다. 또 다른 실시형태에서, 질환은 측두하악 관절 장애이다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 흉터를 치료하거나 또는 예방하기 위한 조성물의 투여를 포함한다.

도 1은 HUVEC 이동에 의해 측정된 바와 같은 가공된 미세혈관 조직의 생물활성에 대한 방사선 효과를 도시한 도면.
도 2는 세포 계수에 대한 방사선 조사 효과를 도시한 도면.
도 3은 HUVEC 이동에 의해 측정된 바와 같은 가공된 미세혈관 조직의 생물활성에 대한 저장 시간의 효과를 도시한 도면.
도 4는 HUVEC 이동에 의해 측정하여 가공된 미세혈관 조직의 생물활성에 대한 저장 온도의 효과를 도시한 도면.
도 5는 국소 선형 물질내 슬개골 힘줄 파열의 주사전 시상면을 도시한 도면.
도 6은 동일한 슬개골 힘줄 파열의 주사후 28일에 시상면을 도시한 도면.
도 7은 발바닥 상의 거대 당뇨병성 족부 궤양의 이미지를 도시한 도면.
도 8은 mVASC의 처리 1주 후에 동일한 궤양을 도시한 도면.
도 9는 세포 증식 분석에서 효소 처리된 미세혈관 조직에 비교한 미세혈관 조직의 필름 활성을 도시한 도면.

달리 표시되지 않는 한, 본 개시내용의 실행은 당업계의 기술 범위 내인 분자 생물학, 의학, 수술, 포유류 생리학, 단백질 정제, 단백질 조작, 세포 생물학 및 조직 조작 분야에서 통상적으로 사용되는 통상적인 기법을 수반한다. 이러한 기법은 당업자에게 공지되어 있으며, 수많은 표준 교재 및 참고 작업에 기재되어 있다. 본 명세서에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 논문 및 간행물(상기 및 하기 참조)은 본 명세서에 명확하게 참고로 포함된다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분양의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 포함된 용어를 포함하는 다양한 과학 사전은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 이용 가능하다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동일한 임의의 방법 및 물질은 개시내용의 실행 또는 시험에서의 용도를 발견하지만, 일부 바람직한 방법 및 물질이 기재되어 있다. 따라서, 바로 이하에 정의되는 용어는 전체로서 본 명세서를 참고로 하여 더 완전하게 기재된다. 본 개시내용은 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 시약이지만, 이들로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 하는데, 그들이 당업자에 의해 사용되는 내용에 따라서 변할 수 있기 때문이다.

정의

본 명세서에 사용되는 바와 같은, 단수 형태는 문맥에서 달리 분명하게 나타나지 않는 한, 복수의 언급을 포함한다.

수치적 범위는 범위를 정하는 숫자를 포함한다. 본 명세서 전체적으로 제공된 모든 최대 수치적 제한은, 이러한 더 낮은 수치적 제한이 본 명세서에서 명확하게 기재된다면, 모든 더 낮은 수치적 제한을 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서 전체적으로 제공된 모든 최소 수치적 제한은, 이러한 더 높은 수치적 제한이 본 명세서에서 명확하게 기재된다면, 모든 더 높은 수치적 제한을 포함할 수 있다. 본 명세서 전체적으로 주어진 모든 수치적 범위는, 이러한 더 좁은 수치적 범위가 본 명세서에서 모두 명확하게 기재되는 것과 같이, 이러한 더 넓은 수치적 범위 내에 속하는 모든 더 좁은 수치적 범위를 포함할 것이다.

본 명세서에 제공된 표제는 전체로서 본 명세서에 대한 참조일 수 있는 본 발명의 다양한 양상 또는 실시형태의 제한이 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "발명" 또는 "본 발명"은 비제한적 용어이며, 특정 발명의 임의의 단일 실시형태를 언급하는 것으로 의도되지는 않지만, 본 명세서 및 청구범위에 기재된 바와 같은 모든 가능한 실시형태를 포함한다.

"약"은 기준의 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1%만큼 변하는 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다. 용어 "약"과 함께 사용되는 수치적 값에 대해 논의한 임의의 실시형태에서, 용어 약이 생략될 수 있다는 것이 구체적으로 상정된다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 발명의 목적을 위해, 다음의 용어를 이하에 정의한다.

본 명세서 전체적으로 "일 실시형태" 또는 "실시형태"는 실시형태와 관련하여 기재된 특정 특성, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체적으로 다양한 곳에서 어구 "일 실시형태" 또는 "실시형태"의 출현은 모두 동일한 실시형태에 관한 것이 아니다. 더 나아가, 특정 특성, 구조 또는 특징은 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "기능" 및 "기능성" 등은 생물학적, 효소적 또는 치료적 기능을 지칭한다.

"증가된" 또는 "향상된" 양은 전형적으로 "통계학적으로 유의한" 양이며, 본 명세서에 기재된 양 또는 수준의 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50배 이상(예를 들어, 100, 500, 1000배)(그 사이의 그리고 1 초과의 모든 정수 및 소수점, 예를 들어, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 등)인 증가를 포함할 수 있다.

"줄어든" 또는 "감소된" 또는 "더 적은" 양은 전형적으로 "통계학적으로 유의한" 양이며, 본 명세서에 기재된 양 또는 수준의 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50배 이상(예를 들어, 100, 500, 1000배)(그 사이의 그리고 1 초과의 모든 정수 및 소수점, 예를 들어, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등을 포함)인 감소를 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 용어 "다능성 세포"는 2 이상의 상이한 전문화된 세포 유형으로 분화되는 능력을 유지하는 배양 또는 비배양 세포를 지칭한다. 상기 세포는 살아있는 배양 세포 또는 불멸 세포일 수 있다. 대안적으로, 상기 세포는 1차 세포일 수 있다. 또 다른 양상에서, 상기 세포는 멸균 또는 보존될 수 있다. 다능성 세포는 줄기 세포 및 전구체 세포를 포함한다. 다능성 세포의 예는, 간충직 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 내피 전구체 세포, 지방-유래 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 태반 줄기 세포, 및 탯줄 줄기 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 기재된 방법에 따른 다음의 멸균 또는 보존 후에, 다능성 세포는 성장 또는 분화하는 그의 능력을 상실할 수 있다는 것이 이해된다.

용어 "미세혈관 조직"은 소동맥, 모세혈관, 작은 정맥 및 신체 내의 거의 임의의 조직 또는 기관으로부터 단리된 관련된 세포 및 세포외 기질 성분으로 구성된 조직을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "가공된 미세혈관 조직"은 영양분을 공급하는 인접 조직으로부터 단리되고, 이어서, 예를 들어, 냉동-건조 또는 분무 건조 기법을 이용하여 건조된 미세혈관 조직을 지칭한다. 본 명세서에 제공된 가공된 미세혈관 조직은 미세혈관 조직(예를 들어, 지방, 힘줄 또는 근육 조직)의 분리(예를 들어, 효소 분해에 의함)로부터 생성된 줄기 및/또는 전구체 세포의 혼합물을 포함하는 최소로 가공되고, 배양되지 않은 미세혈관 조직이다. 가공된 미세혈관 조직은 추가적인 분자(예를 들어, 전체 또는 단편화된 세포외 기질 분자, 성장 인자 또는 세포 표면 분자)를 포함할 수 있다.

가공된 미세혈관 조직 및 다능성 세포 조성물은 항-염증 활성, 혈관화 활성, 유사분열촉진 활성, 및 연조직 및 경조직 치유(예를 들어, 수선 또는 재생) 활성을 포함하는 다양한 생물학적 특성을 가진다.

용어 "로부터 얻어진"은 샘플, 예를 들어, 세포 또는 조직이, 예를 들어, 특정 공급원, 예컨대 목적으로 하는 유기체 또는 목적으로 하는 유기체 내의 특정 조직으로부터 유래된 경우를 지칭한다. 다능성 세포 및 미세혈관 조직의 인기있는 공급원은 지방 조직, 골수, 혈관, 뼈, 근육, 양막, 태반, 피부, 장 및 폐를 포함한다.

예를 들어, 미세혈관 조직 또는 다능성 세포에 대해 본 명세서에서 사용되는 용어 "단리된"은 그의 천연 환경으로부터 제거된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 미세혈관 조직은, 그것이 그의 천연 환경에서 공동존재하는 물질의 일부 또는 모두로부터 분리된다면 단리된다. 단리 정도는 천연 조직 이상으로 적어도 50%만큼 미세혈관 요소의 농도를 증가시켜야 한다. 마찬가지로, 단리된 다능성 세포는 천연 조직에서의 그들의 농도의 적어도 2배 이상으로 농축되어야 한다.

세포의 50% 미만이 트립판 블루를 제외하고, 아직 본래 세포의 적어도 1%가 여전히 위상차 광현미경 하에 세포로서 여전히 살아있을 수 있는 조성물의 부분이라면, 세포는 생존 가능하지 않은 것으로 여겨질 수 있다.

용어 "생물활성"은 살아있는 물질에 대해 유리한 효과를 발휘하는 조성물의 능력을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "향상된 생물활성"은 감소된 면역 반응, 항-염증 활성, 혈관화 활성, 상처 치유, 질환 관련 통증 경감, 또는 이들의 조합을 지칭한다. 생물활성은 세포 이동 또는 증식 분석, 특정 세포 단백질의 발현, 통증의 보고된 감소, 의학적 영상화, 증가된 수의 모세혈관 및/또는 개선된 상처 치유에 의해 측정될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "항-염증"은 염증 또는 염증 또는 종창을 감소시키는 물질의 특성을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "혈관화"는 혈관형성을 촉진시키는 물질의 특성, 새로운 혈관이 이미 존재하는 혈관 또는 혈관형성으로부터 형성되는 생리학적 과정, 새로운 혈관 형성 과정을 지칭한다. 이는 성장 및 발생에서 뿐만 아니라 상처 치유에서 정상적 그리고 생명 관련 과정이다.

"약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제"는 인간 또는 가축 동물에서의 사용에 허용 가능한 것으로 미국 식품의약국에 의해 승인되었거나 또는 승인될 임의의 보조제, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향미 향상제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정제, 등장제, 용매 또는 유화제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

"약제학적 조성물"은 본 발명의 조성물의 제형 및 포유류, 예를 들어, 인간에 대한 치료제의 전달을 위해 당업계에서 일반적으로 허용되는 배지를 지칭한다. 이러한 배지는 임의의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 그에 대한 부형제를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 달리 분명하게 표시되지 않는 한, "의학적 치료" 및 유사한 단어, 예컨대 "치료되는", "치료하는" 등은 유리한 또는 목적으로 하는 결과(임상 결과를 포함)를 얻기 위한 접근을 나타낸다. 치료는 부상, 질환 또는 병태의 증상 감소 또는 개선, 또는 부상, 질환 또는 병태 진행의 지연을 수반할 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물의 투여는, 일부 실시형태에서, 이러한 증상 중 하나 이상을 치료할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 달리 명확하게 나타나지 않는 한, "예방" 및 유사한 단어, 예컨대 "예방되는", "예방하는" 등은 부상, 질환 또는 병태의 개시 또는 재발 가능성을 예방하거나, 저해하거나 또는 감소시키는 접근을 나타낸다. 이는 또한 부상, 질환 또는 병태 중 하나 이상의 발생 또는 재발 가능성을 예방하거나, 저해하거나 또는 감소시키는 것 또는 선택적으로 부상, 질환 또는 병태의 개시 또는 발생을 지연시키기 위한 접근 또는 부상 질환 또는 병태 중 하나 이상의 증상의 발생 또는 재발의 지연을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "예방" 및 유사한 단어는 또한 부상, 질환 또는 병태의 강도, 효과, 증상 및/또는 부담을 감소시키는 것을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "유효량" 또는 "치료적 유효량"의 조성물은 목적으로 하는 생물학적 효과, 예컨대 유리한 임상 결과를 달성하는 데 충분한 양이다.

용어 "자가 전달(autologous transfer)", "자가 이식" 등은 조직 공여자가 또한 조직으로부터 생성된 조성물의 수용자인 치료를 지칭한다.

용어 "동종이계 전달", "동종이계 이식" 등은 조직 공여자가 조직으로부터 생성된 조성물 수용자와 동일한 종이지만, 동일한 개체는 아닌 치료를 지칭한다.

용어 "이종발생성 전달", "이종발생성 이식" 등은 조직 공여자가 조직으로부터 생성된 조성물의 수용자와 상이한 종인 치료를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "과정 치료" 또는 "치료에 대한 노출"은 세포 또는 단백질, 예컨대 방사선, 열 충격, 장기간 실온 이상에서의 저장, 장기간 저온 저장, 초음파 교반, 유체 전단력, 저산소증에 대한 노출, 반응성 산소종, 전자기장, 및 이들의 조합에 해로운 것으로 예상되는 병태를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "최소 역치" 또는 "최소 역치 용량"은 한 번에 투여될 양을 지칭한다. 본 명세서에서, 이는 특정 치료에 대한 주어진 양의 노출을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 최소 역치는 킬로그래이 단위로서 주어진 양의 방사선을 지칭할 수 있다. 상기 용어는 특정 치료에 기반하여 치료 노출에 따라서 적절한 단위, 예를 들어, 온도, 시간, pH, 힘의 단위 또는 이들의 조합을 가진다는 것이 이해된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "킬로그레이"는 국제 단위 시스템에서의 이온화 방사선량의 파생 단위이다. 그레이 또는 "Gy"는 1킬로그램의 물질 당 1줄(J)의 방사선 에너지의 흡수로서 정의된다. 이는 흡수된 용량, 특정 에너지 및 커마(kerma)(단위 질량 당 방출된 운동 에너지에 대한 두문자어)의 측정으로서 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "최대 한계"는 세포가 더 이상 세포로서 시각화될 수 없고, 위상차 광현미경에 의해 계수화될 수 없도록 세포 완전성(integrity)의 약 90% 또는 약 99%의 상실을 야기하는 용량 또는 노출이다. 완전성은 세포 완전성을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는, "연조직"은 일반적으로 신체 전체적으로 발견되는 외골격 구조를 지칭하며, 연골 조직, 반월상 조직, 인대 조직, 힘줄 조직, 추간 추간판 조직, 치주 조직, 피부 조직, 혈관 조직, 근육 조직, 근막 조직, 골막 조직, 안구 조직, 심막 조직, 폐 조직, 활액 조직, 신경 조직, 뇌 조직, 신장 조직, 골수, 비뇨 생식기 조직, 장 조직, 간 조직, 췌장 조직, 비장 조직, 지방 조직, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 연조직 부상은 신체 전체적으로 일어날 수 있는 임의의 연조직, 예컨대, 근육, 인대, 힘줄, 피부, 섬유 조직, 지방, 활액막, 신경, 혈관 및 근막에 대한 손상 또는 부상을 포함한다.

다능성 세포

본 명세서에 제공된 다능성 세포 조성물은 몇몇 실시형태에서, 미세혈관 조직(예를 들어, 지방, 골수, 또는 근육 조직)의 해리로부터(예를 들어, 효소 분해에 의해) 생성된 줄기 및/또는 전구체 세포의 혼합물을 포함할 수 있는 최소로 가공된, 비배양 세포 또는 비배양 미세혈관 조직(또는 이들의 성분)을 포함한다. 가공된 다능성 세포 조성물은 추가적인 분자(예를 들어, 전체 또는 단편화된 세포외 기질 분자 또는 성장 인자)를 포함할 수 있다. 추가로, 가공된 다능성 세포 조성물은 다능성 세포의 단편 또는 막을 포함할 수 있다. 다능성 세포는 정제 또는 배양될 수 있다. 그들은 부분적으로 분화된 세포, 1차 세포 또는 세포주일 수 있다.

본 발명의 실시형태는 향상된 생물활성을 초래하는 치료에 노출된 단리된 다능성 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 다능성 세포는 세포가 증식 또는 분화하는 능력을 감소시키거나 또는 제거하는 치료에 노출되었다. 치료는 방사선에 대한 노출, 실온 이상에서의 저장, 열 충격, 저산소, 전자기장에 대한 노출, 초음파 교반, 유체 전단력, pH 충격, 삼투압 충격, 장기간 저온 저장, 및 반응성 산소종에 대한 노출을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 치료는 전형적으로 세포의 생존도 또는 단백질의 효력을 감소시키지만, 세포 제제의 생물활성을 놀랍게 향상시킨다. 치료는 종종 세포를 사멸시키지만, 가속화된 속도로 미세소포, 성장인자 등을 방출하는 그들의 능력을 향상시킬 수 있거나 또는 단순히 저해 요소를 파괴할 수 있다. 향상된 생물활성은 혈관화, 상처 치유, 세포 증식, 세포 이동을 촉진시키고, 그리고 염증을 감소시키는 능력 또는 이들을 조합을 포함한다.

본 발명은 다능성 세포를 단리시키는 단계 및 상기 세포를 향상된 생물활성을 초래하는 방사선, 열, 또는 전단력과 같은 치료에 노출시키는 단계를 포함하는, 향상된 생물활성을 갖는 다능성 세포의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 다능성 세포를 단독으로 또는 1종 이상의 추가적인 세포 유형 및/또는 다른 성분과 조합하여 포함하는 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.

특정 실시형태에서, 추가적인 세포 유형은 섬유아세포, 여포 외모근초 세포를 포함하는 케라틴세포, 내피 세포, 주피세포, 적혈구, 단핵구, 혈장 세포를 포함하는 림프구, 호중구, 혈소판, 비만 세포, 지방세포, 근육 세포, 평활근 세포, 간세포, 신경 및 신경아교 세포, 골세포 및 조골세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 기질, 상피 또는 혈액-유래 세포이다.

특정 실시형태에서, 추가적인 조직 성분은 세포외 기질의 성분이다. 세포외 기질은 다양한 구성성분, 예컨대 단백질, 당단백질, 프로테오글리칸, 복합 탄수화물 및 기타 분자를 포함한다. 세포외 기질은 다양한 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 트롬보스폰딘, 테나신(cytoactin), 엔탁틴(니도겐), 오스테오넥틴(SPARC), 안코린 CII, 콘드로넥틴, 연결 단백질, 오스테오칼신, 뼈 시알로단백질, 오스테오폰틴, 에피넥틴, 하이알루로넥틴, 아밀로이드 P 성분, 피브릴린, 메로신, s-라미닌, 운둘린, 에필리그린, 칼리닌, 피브린, 피브리노겐 및 HSP를 포함하는 임의의 다수의 상이한 단백질을 포함할 수 있다.

관련된 실시형태에서, 추가적인 조직 성분은 성장 인자, 혈관화제, 항-염증제, 사이토카인, 또는 분화제를 포함한다. 예를 들어, 성장 인자 또는 혈관화제는 염기성 섬유아세포 성장 인자, 다른 섬유아세포 성장인자, 뼈 형성 단백질, 간세포 성장 인자, 케라틴세포 성장 인자, 과립구 대식세포 집락 자극 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 베타1 및/또는 베타3, 및 혈관 내피 세포 성장 인자로부터 선택될 수 있다. 사용될 수 있는 추가적인 성장인자 및 성장인자의 부류 또는 패밀리는 당업자에게 공지된 임의의 것을 포함한다.

미세혈관 조직

본 명세서에 기재된 가공된 미세혈관 조직은 미세혈관 조직을 분리시킴으로써 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 미세혈관 조직은 1종 이상의 효소를 이용하여 효소적으로 분해된다. 적합한 효소는 조직 분리에 기여하는 것, 예컨대 콜라게나제 및 중성 프로테아제, 예컨대 서몰리신 또는 BP 프로테아제를 포함한다. 효소 분해 공정은 조직 분리를 증가시키거나 또는 감소시키도록 조절될 수 있다. 예를 들어, 더 완전한 분리가 요망된다면, 1종 초과의 효소가 포함될 수 있거나 또는 분해 시간이 증가될 수 있다. 세포 생존도가 유지될 필요는 없지만, 일부 실시형태에서, 일부 세포 용해가 효소 분해 동안 일어난다고 해도 부착 및 신호전달 분자를 포함하는 막을 보존하기 위해 세포막이 일반적으로 무부상으로 남아있을 것이 일반적으로 요망된다. 따라서, 리파제와 같은 효소의 사용은 본 발명의 일 실시형태에 따라 이러한 공정에서 유용하지 않을 수도 있다. 이러한 시나리오에서, 콜라게나제 또는 중성 프로테아제가 이용될 수 있다.

대안적으로, 미세혈관 조직은 효소의 사용 없이 분리될 수 있다. 오히려, 미세혈관 조직은 킬레이터, 초음파 교반 또는 기계적 세포 분리의 사용을 포함하는 물리적 또는 화학적 수단을 이용하여 분리될 수 있다. 기계적 세포 분리는 부드러운 피펫팅, 수동 스크레이핑, 나일론 메쉬, 기계적 붕괴 등을 포함할 수 있다.

공여자 미세혈관 조직의 조달 및 후속적 처리는 미생물(예를 들어, 박테리아, 진균 또는 바이러스) 오염을 방지하기 위한 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 공여자는 가공 전에 미생물 유기체(예를 들어, HIV, HPV, EBV, TB 등)의 사전결정된 목록에 대해 선별될 수 있다. 선별은 공지된 기법을 이용하여, 예컨대 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 미생물 핵산의 존재를 검출하거나 또는 ELISA에 의해 특정 미생물과 관련된 분자 존재를 검출함으로써 행해질 수 있다. 미생물 오염된 미세혈관 조직은 본 발명의 일부 실시형태에 따라 사용으로부터 제외될 수 있다. 추가로, 미세혈관 조직은 살균 또는 멸균 기법을 이용하여 생성될 수 있거나, 또는 종국적으로 멸균될 수 있다.

조직 해리 후에, 미세혈관 조직은 원치않는 세포 또는 분자, 예컨대 적혈구, 지질 또는 지방세포를 제거하기 위해 추가로 처리될 수 있다. 추가적인 처리는 미세혈관 조직의 공급원 및 그의 의도된 용도에 의존할 것이다. 예를 들어, 미세혈관 조직 공급원이 지방 조직이라면, 분리된 미세혈관 조직은 미세혈관 조직의 나머지로부터 지질, 지방세포, 및 일부 전-지방세포를 분리하기 위해 상대적으로 낮은 힘에서 원심분리될 수 있다. 다른 실시형태에서, 공지된 근육 세포 단리 프로토콜, 예컨대 밀도 구배 원심분리의 사용은 근육 세포를 제거하기 위해 그리고 미세혈관 관련 세포 및 조직을 농축시키기 위해 효소 분해 후에 근육 조직을 추가로 처리하는 데 사용될 수 있다.

일단 미세혈관 조직이 제조된다면, 가공된 미세혈관 조직을 생성하기 위해 건조시킴으로써, 예를 들어, 냉동-건조 또는 분무-건조 기법을 이용하여 보존될 수 있다. 당(예를 들어, 트레할로스, 만니톨, 수크로스), 폴리알코올(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜), 알데하이드, 단백질(예를 들어, 알부민), 아미노산(예를 들어, 글리신), 계면활성제(예를 들어, Tween 20), DMSO, 및/또는 과망간산염을 포함하는 임의의 적절한 부형제가 미세혈관 조직을 보존할 때 사용될 수 있다.

냉동 건조는 전형적으로 4단계를 수반한다: 전처리, 냉동, 1차 건조, 및 2차 건조. 전처리는 농도 조절 또는 1종 이상의 부형제의 첨가를 포함할 수 있다. 전처리 후에, 미세혈관 조직은 냉동된다. 냉동 단계는 전형적으로 세포 구조를 보존하기 위해 주의깊에 제어된 방식(예를 들어, 약 -0.5℃/분 내지 약 -50℃/분의 냉각 속도에서)으로 행해지지만, 그러나 세포 생존도는 보존될 필요가 없다. 일부 실시형태에서, 미세혈관 조직은 분당 약 -10℃의 냉각 속도에서 냉동된다. 냉각 속도는 특정 미세혈관 조직 및 사용되는 부형제에 기반하여 조절될 수 있다. 미세혈관 조직은 그것이 냉동 건조에 적합한 온도에 도달될 때까지 기계적 냉장을 이용하고/하거나 드라이아이스 또는 액체 질소에 미세혈관 조직을 함유하는 용기를 노출시키는 것을 포함하는 임의의 적절한 수단을 이용하여 냉동될 수 있다.

추가적으로, 생존도는 조직 부상에서 사용하기 위한 가공된 미세혈관 조직의 적합성에 필요하지 않기 때문에, 보존 공정 및 저장은 생존도를 유지하기 위해 조절될 필요가 없다. 가공 전에 제공된 미세혈관 조직에서 살아있는 세포의 백분율은 100%까지일 수 있다. 가공 후에, 이는 50% 미만, 예를 들어, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 가공 미세혈관 조직은 가공 또는 동결보존 후에 측정 가능한 살아있는 세포를 함유하지 않는다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 미세혈관 조직은 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된다.

생산 처리 방법

조직의 멸균은 전형적으로 단백질 및 세포에 대한 큰 손상을 야기한다. 상기 단백질은 종종 변성되고, DNA는 절단되고/되거나 교차 연결되고, 세포는 사멸된다.

부상을 최소화하기 위해, 이러한 생성물은 생체부담을 감소시키기 위해 매우 주의깊게 가공된다. 이어서, 그들은 14 내지 15kGy만큼 낮게 방사선 노출에 의해 멸균될 수 있다. 놀랍게도, 본 명세서에 기재된 다능성 세포 조성물은, 약 1kGy 내지 약 40kGy 방사선에 노출될 때 생물활성에 의해 측정하여 개선된 효력을 가진다. 일부 실시형태에서, 다능성 세포 조성물은 1kGy 미만, 예를 들어 0.65kGy에 노출된다. 다른 실시형태에서, 다능성 세포 조성물은 2kGy에 노출된다. 또 다른 실시형태에서, 다능성 세포 조성물은 약 14kGy에 노출된다. 방사선 노출이 2배로 될 때 효력이 증가될 수 있고, 노출이 거의 3배일 때 추가로 증가된다(실시예 2에 나타낸 바와 같음). 방사선은 이하의 실시예에 설명하는 바와 같이 전자빔("E-빔") 내지 적외선의 파장 범위에 대한 노출에 의해 달성될 수 있다.

전형적으로 세포 또는 단백질의 효력을 감소시키는 가공에 의한 향상된 생물활성의 놀라운 현상은 다양한 상황 하에서 알 수 있다. 본 발명의 조성물은 장기간의 시간 동안 저장될 때 또는 승온에 노출될 때 향상된 생물활성을 나타낸다. 저산소 조건, 반응성 산소종, 전자기장, 초음파 교반, 유체 전단력, 비-생리적 pH 또는 긴장성에 대해 조성물을 노출시키는 것은 또한 개선된 효력을 야기한다. 상기 조성물은 다능성 세포, 가공된 미세혈관 조직 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다능성 세포는 1차 조직 또는 세포주로부터의 정제된, 배양된 세포, 비배양 세포, 및 부분적으로 분화된 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다능성 세포는 멸균 및 건조될 수 있다.

저장 조건의 예는 장기간 실온에서의 저장을 포함한다. 장기간은 약 6개월, 1년 미만, 약 1년, 약 2년 또는 3년 이상일 수 있다. 실온은 약 25℃이다. 저장 조건은 냉각 온도, 예컨대 0℃, -20℃, 또는 -80℃, 또는 46℃까지의 승온에서 저장될 수 있다.

저산소 조건의 예는, 예를 들어 3% 미만의 산소를 포함한다. 저산소 조건은 CO₂ 인큐베이터에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 저산소 조건은 "3-기체" 인큐베이터에서 생성될 수 있다. 그러나, 산소 수준을 감소시키기 위해 2가지 기체만이(이산화탄소(보통으로서) 및 질소) 공급된다. 일반적으로 산소는 1% 미만으로 저하될 수 있다.

산소를 함유하는 화학적으로 반응성인 분자인 반응성 산소종에 대한 노출의 예는 과산화물,　초과산화물,　하이드록실 라디칼, 과산화아세트산, 및　일중항 산소를 포함한다.

전자기장 노출의 예는 마이크로파 에너지를 포함한다.

음파처리는 다양한 목적을 위해 샘플에서 입자를 교반시키도록 음 에너지(sound energy)를 적용하는 작용이다. 초음파처리로서 알려진 과정을 야기하는 초음파 주파수(>20㎑)가 보통 사용된다. 생물학적 적용에서, 음파처리는 생물학적 물질을 방해하거나 또는 비활성화시키는 데 충분할 수 있다. 예를 들어, 음파처리는 종종 세포막을 붕괴시키기 위해 그리고 세포 내용물을 방출시키기 위해 사용된다. 이 공정은 초음파천공법으로 불린다. 음파처리는 또한 DNA의 분자를 단편화하기 위해 사용되며, 이때 짧은 음파처리 기간이 실시된 DNA는 더 작은 단편으로 전단된다.

전단응력은 물질 단면적에 따른 응력 공면의 성분으로서 정의된다. 전단응력은 힘 벡터 성분으로부터 단면적에 평행하게 생긴다.　다른 한편으로, 정상 응력은 그것이 작용하는 물질 단면적에 직각인 힘 벡터 성분으로부터 생긴다. 전단 응력은 혈관 항상성, 혈관 리모델링의 조절, 심장병 발생 및 죽종형성의 근본적 결정요인이다. 유체 전단력은 층상 또는 난류에 대한 노출에 의해 실험 상황에서 모방될 수 있다. 생성물을 전단하는 편리한 방법은 격렬한 혼합 또는 작은 오리피스를 통한 강제구동(forcing)을 포함한다.

비-생리적 pH의 예는 7.0 미만 또는 7.8 초과의 pH를 포함한다. 이는 약 0 내지 약 7.0 및 약 7.8 내지 약 14의 범위를 포함한다. 이는 해당 한계 내의 범위, 예를 들어 약 0 내지 약 1, 약 0 내지 약 2, 약 0 내지 약 3, 약 0 내지 약 4, 약 0 내지 약 5, 약 0 내지 약 6, 약 0 내지 약 7, 약 7.8 내지 약 8, 약 7.8 내지 약 9, 약 7.8 내지 약 10, 약 7.8 내지 약 11, 약 7.8 내지 약 12, 약 7.8 내지 약 13, 및 약 7.8 내지 약 14를 포함한다.

생물활성

특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 한 가지 이상의 생물학적 활성을 가진다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 조성물은 항-염증, 혈관화 활성, 또는 이들의 조합을 가진다. 조성물은 내피 세포의 이동 또는 증식을 유발할 수 있다. 특정 관련된 실시형태에서, 조성물은 혈관 형성 또는 조직 치유를 촉진시킨다. 이들 효과의 조합은 몇몇 실시형태에서 달성된다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 항-염증 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물에 노출되거나 또는 접촉된 부상된 또는 병에 걸린 조직(예를 들어, 염증 반응을 겪고 있는 부상 또는 병에 걸린 조직)은 부상된 또는 병에 걸린 조직이 유사하게 처리되지만, 본 발명의 조성물에 노출 또는 접촉되지 않을 때에 비해 감소된 염증을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물에 노출되거나 또는 접촉되는 조직 내 염증의 양은 부상 또는 병에 걸린 조직이 본 발명의 조성물에 노출 또는 접촉되지 않을 때 염증의 양에 비해 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%만큼 감소된다. 염증은, 예를 들어, 조직학적으로 관찰될 때, 영향받은 조직에서 관찰된 림프구의 수를 포함하는 당업계에서 이용 가능한 수단에 의해 측정될 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 통증으로서 또는 시각적으로 측정될 수 있는 항-염증 활성을 가진다. 시각적으로, 그것은 홍반 및/또는 종창에 의해 측정될 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 혈관화 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물에 노출 또는 접촉되는 부상 또는 병에 걸린 조직(예를 들어, 염증 반응을 겪고 있는 부상 또는 병에 걸린 조직)은 부상 또는 병에 걸린 조직이 유사하게 처리되지만, 본 발명의 조성물에 노출 또는 접촉되지 않을 때에 비해 증가된 혈관형성을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물에 노출 또는 접촉되는 조직 내 혈관형성의 양은 부상 또는 병에 걸린 조직이 본 발명의 조성물에 노출 또는 접촉되지 않을 때의 혈관형성의 양에 비해 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 300%, 적어도 약 400%, 또는 적어도 약 500%만큼 증가된다. 혈관형성은, 예를 들어, 뒷다리 허혈 모델을 포함하는 당업계에서 이용 가능한 수단에 의해 측정될 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 생체내 또는 시험관내 분석에서 측정될 수 있는 혈관화 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물의 존재 하에 시험관내 혈관활성 분석에서 측정된 활성의 양은 본 발명의 조성물의 부재 하에서 또는 대조군 조성물의 존재 하에서 동일한 분석에서 측정된 활성의 양보다 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 300%, 적어도 약 400%, 또는 적어도 약 500% 더 크다. 특정 실시형태에서, 생체내 분석은 매트리겔 분석이다. 특정 실시형태에서, 시험관내 분석은 본 명세서에 기재된 내피 세포 이동이다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 부상 또는 병에 걸린 조직의 치유를 촉진시키며, 즉, 이는 조직 치유 활성을 가진다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, 조성물의 "조직 치유 활성"은 유사하게 처리된 유사 조직에 비해 조성물에 노출되었지만, 조성물에 대한 노출이 없는 부상 또는 병에 걸린 조직(예를 들어, 경조직 또는 연조직)의 개선된 치유(예를 들어, 수선 또는 재생)를 촉진시키는 조성물의 능력이다. 개선된 치유는 임의의 적절한 수단, 예컨대 치유를 완료하는 시간, 생성된 새로운 조직의 양, 얻어진 치유 조직의 강도 또는 얻어진 치유 조직의 작용성을 이용하여 측정된다.

멸균 또는 바이러스-비활성화된 동종이계 및 이종발생성 다능성 세포 및 가공된 미세혈관 조직 조성물은 자가 줄기 세포를 갖는 새로운 연조직을 생성하는 것의 어려움, 동종이계 및 이종발생성 줄기 세포가 거부될 수 있다는 인식, 및 멸균 또는 바이러스-비활성 세포가 감소된 생존도를 가지고, 따라서 감소된 생물학적 또는 치료적 활성을 가진다는 이전의 믿음 때문에 인대 및 힘줄과 같은 연조직의 수선을 용이하게 하기 위해 이전에 사용되지 않았다. 그러나, 본 명세서에 기재된 공정 및 조성물은 자가 줄기 세포 또는 세포 생존도에 반드시 의존하지는 않는다. 오히려, 제공된 공정은 줄기 세포, 또는 전구체 세포, 또는 이러한 세포와 심지어 생물활성을 향상시키기 위해 가공후 처리에 노출된 다른 세포 유형 및 이러한 세포와 관련된 분자(예를 들어, 사이토카인, 성장인자, 화학주성 분자 등)의 혼합물을 함유하는 조성물을 생성하기 위해 사용된다. 이러한 처리는 방사선 조사, 실온 저장, 냉각 온도, 저산소 조건, 반응성 산소종, 전자기장, 초음파 교반, 유체 전단력, 비-생리적 pH 또는 긴장성을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 가공 처리는 건조 또는 멸균화 전에 수행된다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 살아있는 세포와 살아있지 않은 세포의 혼합물을 함유한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 생물활성을 향상시키기 위해 개시된 공정 중 하나 이상에 노출된 분화 또는 조작된 치료 세포를 함유한다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물 중에 존재하는 세포의 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 3% 미만, 또는 약 1% 미만은 살아있다. 몇몇 실시형태에서, 실질적으로 모든 세포는 살아있지 않다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "살아있는"은 그의 보통의 의미로 제공될 것이고, 또한, 예를 들어 본 명세서에 기재되는 바와 같이 가공되지 않는다면, 적절한 조건, 예를 들어, 동일한 세포 또는 세포 유형이 증식하는 것으로 예상되는 조건 하에 배양될 때 증식할 수 있는 세포를 지칭한다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물 중에 존재하는 약 2% 미만 또는 약 1% 미만의 세포가 살아있다. 특정 실시형태에서, 조성물 중에 존재하는 세포 중에는 살아있는 것이 없거나 또는 실질적으로 없다.

따라서, 용어 "살아있지 않은"은 세포가, 예를 들어, 본 명세서에 기재되는 바와 같이 가공되지 않는다면, 적절한 조건, 예를 들어, 동일한 세포가 증식하는 것으로 예상되는 조건 하에 배양될 때 세포가 증식할 수 없다는 것을 의미한다. 실시예 2 내지 5는 본 발명의 특정 양상의 가공된 미세혈관 조직의 예시적인 생물활성을 나타낸다. 시험한 생성 후 가공 처리는 방사선 조사(실시예 2), 실온에서 저장(실시예 3), 저장 온도(실시예 4) 및 저산소(실시예 5)를 포함한다.

사용 방법

특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 질환 병태를 치료하기 위해 사용된다.

본 발명의 방법에 따라 치료되거나 또는 예방될 수 있는 조직 부상, 질환 및 병태는 혈관, 피부, 또는 근골격 조직에 대한 부상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 근골격 병태는, 예를 들어, 관절염, 힘줄증, 인대 파열, 뼈 골절, 골수염, 구개열, 근막통증 증후군, 관절 과운동성/엘러스-단로스 증후군, 복합부위 통증 증후군(CRPS) 및 약화된 치아 임플란트를 포함한다. 연조직 병태는, 예를 들어, 피부의 병태(예를 들어, 경화 태선, 흉터 제거, 흉터 조직, 예컨대, 페이로니병에서, 또는 외상성 상처의 치료, 중증의 화상, 피부 궤양[예를 들어, 욕창(압박) 궤양, 정맥 궤양, 및 당뇨병성 궤양], 수술 상처, 예컨대 피부암의 절개와 관련된 것), 및 습진; 혈관 병태(예를 들어, 혈관 질환, 예컨대 말초동맥질환 및 정맥 질환; 혈관 부상; 부적절한 혈관 발생; 무혈성 괴사); 성대 또는 치주 조직에 영향을 미치는 병태; 미용적 병태(예를 들어, 증량제를 포함하는 수선, 증대 또는 미화를 수반하는 것, 지방 이식, 모발 성장, 유방 재구성 및 진피 찰과상 후 치유); 근육 부상; 근육 질환(예를 들어, 선천성 근육병증; 중증 근무력증; 염증, 신경성, 및 근원성 근육 질환; 및 근육 영양 실조, 예컨대 뒤센형 근육 이상증, 베커 근육 이상증, 근긴장 이상증, 팔다리이음-근육 이상증, 얼굴어깨팔 근육 이상증, 선천성 근육 영양 실조, 안구인두근 근육 이상증, 원위 근육 이상증, 및 에머리-드라이푸스 근육 이상증); 말초신경병증과 같은 병태; 및 기관 및/또는 근막(예를 들어, 방광, 장, 골반저)의 병태, 예컨대 간질성 방광염을 포함한다. 상당히 통상적인 연조직 부상의 일 예는 골반저에 대한 손상이다. 이는 출생 동안 또는 이의 합병증으로부터 생길 수 있는 잠재적으로 심각한 의학적 병태인데, 이는 방광의 탈장인 방광질 근막, 예컨대 방광류에 대한 손상을 야기할 수 있다. 유사한 의학적 병태는 직장탈출(직장의 탈장), 탈장(직장질 또는 방광질 주머니를 통한 장의 돌출부), 및 창자방광탈출증(방광과 장이 둘 다 돌출된 이중 헤르니아(double hernia))을 포함한다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 연조직 부상을 치료 또는 예방하기 위해 사용된다.

제공된 향상된 조성물의 연조직 치유 활성이 유리할 수 있는 연조직 부상이 부상, 예컨대 힘줄 및/또는 인대 파열 및 허혈성사건으로부터 초래된 부상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 통상적인 연조직 부상은 염좌, 접지름, 타박상으로부터 초래된 부상, 또는 특정 연조직의 과용으로부터 초래될 수 있다. 연조직 부상은 개방과 폐쇄 연조직 부상을 둘 다 포함한다.

다양한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 원치않는 염증 또는 면역 반응과 관련된 질환을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 질환을 치료하거나 또는 예방하기 위해 사용된다. 이러한 질환의 예는 류마티스 관절염, 골관절염, 활액낭염, 및 자가면역질환 및 장애, 예컨대 크론병 및 자가면역 질환 및 장애, 예컨대 크론병 및 자가면역 간염을 포함한다. 추가로, 본 발명의 조성물은, 예를 들어 부상 부위에서 염증을 감소시키기 위해 그리고/또는 면역 반응, 예를 들어 부상에 의해 유도되는 면역 반응을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 조성물은 이식 거부 가능성 또는 중증도를 예방하거나 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 부상 또는 조직 부상 부위에서 혈관형성 또는 재혈관화를 촉진시키거나 또는 자극하기 위해 사용된다. 특정 실시형태에서, 상기 부상은 조직에 대한 허혈, 저산소 또는 재관류 부상과 관련되거나 또는 이를 초래한다. 본 발명에 따라 치료 또는 예방될 수 있는 허혈, 저산소 또는 재관류 부상과 관련되거나 또는 이를 초래하는 부상 또는 질환의 예는 뇌졸중, 심근경색, 급성 신장 부상, 및 실혈을 포함한다. 혈관형성 또는 재혈관화를 촉진하거나 또는 자극하기 위해 본 발명의 조성물로 치료될 수 있는 부상 또는 조직 손상의 추가적인 예는 이식 또는 사지 재부착을 포함한다.

본 발명의 조성물은 의학적 병태와 관련된 통증을 치료하기 위해 또는 완화시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 의학적 병태의 예는 족저근막염, 관절염 관절, 힘줄증, 요통, 파행, 근막통증 증후군, 및 측두하악 관절 통증을 포함한다.

본 발명의 조성물은 또한 말초 신경 손상, 발기부전, 다발성 경화증, 및 방사선 화상을 치료하기 위해 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, 그들은 조혈작용 및/또는 상처 치유를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 그들은 또한 당뇨병성 신장병증, 당뇨병성 망막병증 및 황반변성을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 정맥내 투여를 위해 제형화될 때, 급성 심근경색, 울혈성 심부전, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 폐 고혈압 폐기종 또는 만성 폐쇄성 폐질환을 치료하거나 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 호흡 문제는 또한 흡입에 적합한 본 발명의 분쇄 형태로 처리될 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독으로 또는 부상 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 한 가지 이상의 다른 치료제 또는 절차와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 손상된 조직에 대한 혈액 공급을 풍부하게 하기 위해 그리고/또는 조직 재생을 촉진시키기 위해, 본 발명의 조성물은 혈소판-풍부 혈장과 조합하여 사용될 수 있다. 1종 이상의 다른 치료제 또는 절차와 조합하여 사용될 때, 본 발명의 조성물은 다른 치료제 또는 절차 전에 의한 치료와 동시에, 중복되는 시간 기간 동안에, 또는 후속하여 제공되거나 또는 사용될 수 있다.

가공된 미세혈관 조직을 이용하는 추가적인 방법이 제공된다. 가공된 미세혈관 조직은 수선이 필요한 조직에 직접적으로 적용될 수 있거나, 또는 수선이 필요한 이러한 조직을 둘러싸는 조직에 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 건조된 가공 미세혈관 조직은 적합한 담체(예를 들어, 물 또는 식염수) 중에서 재구성되고, 수선이 필요한 조직에 직접적으로 적용된다. 마케인(Marcaine)과 같은 마취제를 함유하는 용액은 일부 환자에 의해 바람직하다는 것이 경험에 의해 나타났다. 국소 용도를 위해, 가공된 미세혈관 조직은 동결건조 케이크로서, 분말로서 적용될 수 있고, 피부 크림에 혼합되거나, 건조 필름 또는 용액으로서 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 재구성된 가공 미세혈관 조직은 조직에 적용되기 전에 스캐폴드, 예컨대 콜라겐 매트릭스, 피브린 응괴 또는 생체적합성 직물에 적용된다. 다른 실시형태에서, 가공된 미세혈관 조직은 물질, 예컨대 가요성 생체적합성 스캐폴드(예를 들어, 직물 또는 부직포 시트 또는 실), 생체적합성 마이크로비드 또는 입자, 또는 이식 가능한 의료 장치를 코팅하기 위해 사용된다. 분무 건조 가공된 미세혈관 조직은 코팅 전에 재구성을 필요로 하는 일 없이 마이크로비드 또는 입자를 포함하는 물질에 특히 적합한데, 코팅이 분무 건조 공정 동안 행해질 수 있기 때문이다.

가공된 미세혈관 조직은 환자에게 이식되기 전에 임의의 적합한 장치 또는 물질과 조합될 수 있다. 가공된 미세혈관 조직은 정형외과 이식물; 다공성, 가요성 이식 가능한 스캐폴드; 수술 이식물; 순수(pure water); 식염수; 마취제 용액; 다공성 코팅 이식물; 중합체 용액; 용매, 예컨대 DMSO, N-메틸피롤리돈(NMP) 및 알코올; 하이드로겔; 하이알루론산 또는 다른 글리코사미노글리칸 또는 프로테오글리칸; 콜라겐; 피브린; 트롬빈; 혈병; 혈소판; 혈소판 풍부 혈장; 탈회골기질; 자가 세포; 및/또는 뼈 또는 뼈 성분과 조합될 수 있다.

가공 또는 동결보존된 미세혈관 조직은 단독으로, 예를 들어, 바이알에서 또는 다른 생성물, 예컨대 가공 또는 동결보존된 미세혈관 조직과 조합에 적합한 것으로 열거된 것과 조합하여 패키징될 수 있다. 다른 물질과 함께 패키징될 때, 가공 또는 동결보존된 미세혈관 조직은 별개로 패키징되거나 또는 다른 물질과 함께 사전혼합되거나 또는 관련될 수 있다. 일부 실시형태에서, 가공된 미세혈관 조직은 생체적합 물질 상에서 코팅으로서 패키징된다.

동물에서 살아있지 않은 다능성 세포는 힘줄의 치유를 개선시킨다는 것이 이전에 나타났다(미국 특허 제9,044,430호). 향상된 본 발명의 조성물의 임상 용도는 다양한 힘줄증의 빠른 치유 및 놀라운 통증 경감을 나타내었다(실시예 7). 발의 장기간 무부하를 제외하고 뚜렷한 병인이 없고, 다른 효과적인 치료가 없는 발의 만성 통증성 병태인 족저근막염에서 통증 경감이 또한 관찰되었다(실시예 9). 관절염 관절에서, 본 발명의 가공된 미세혈관 조직의 주사는 MRI 또는 X-선에 의해 영상화된 연골의 명확한 치유 없이 확연하고, 지속 가능한 통증 경감을 제공하였다(실시예 6).

임상적 사용은 만성 상처(실시예 8), 흉터, 힘줄증 및 골관절염의 치료에서 예상치 못한 유익이 나타났다. 이러한 환자에서 주목되는 치유에 추가로 통증의 현저한 감소가 있다. 이 통증 감소는 또한 측두하악 관절 통증에 대해 치료된 환자에서 관찰되었다(실시예 10).

본 발명의 일부 실시형태는 살아있는 세포가 다수의 임상 용도에서 이점을 나타내지 않는 조성물을 포함한다. 통상적인 요법, 예컨대 고압실, 콜로이드 드레싱, 조직 이식, 및 미부하로 치료될 때 치유되지 않은 만성 상처는 본 발명의 향상된, 가공된 미세혈관 조직의 적용 1주 후에 치유된다. 본 발명의 가공된 미세혈관 조직의 동결건조 케이크는 상처에 직접적으로 적용되고, 분말화되며, 더 큰 상처 표면에 걸쳐 펼쳐지거나 또는 물 또는 다른 적절한 유체로 수화되고, 상처에서 피하로 그리고 상처 주위에 주사될 수 있다. 이어서, 상처는 전형적으로 전통적인 드레싱으로 뒤덮인다.

본 발명의 방법은 1, 2회 이상의 용량으로 조성물을 투여함으로써 실행될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 조성물은 일정 시간 기간에 걸쳐 단일 용량, 다회 용량 또는 반복된 용량으로서 투여된다.

실시예

실시예 1: 가공된 미세혈관 조직의 제조

지방 조직을 기관 공여자로부터 얻었다. 피하 지방을 복부, 대퇴부 및 둔부로부터 취한다. 적절한 배지, 예컨대 ZTM(상표명) 수송 배지(INCELL) 내로 오(5) 내지 십(10) 파운드의 지방을 채취하였다.

조직을 채취하고 나서, PBS로 세척함으로써 사멸일 내에 초기에 가공하고, 이어서, 37℃에서 40분 동안 CIzyme HA(비타사이트(Vitacyte)) + ZSolM(상표명)(INCELL) 중의 중성 프로테아제 효소 중에서 현탁시켰다.

분해 후에, 샘플을 PBS와 같은 적절한 완충제 중에서 린스하였다. 이 실험에서, ZSolF(상표명)를 사용하였고, 이어서, 샘플을 원심분리시키고 나서, 디캔팅하고, 이어서 ZSolF(상표명) 중에서 2회 이상 세척하였다. 세포를 1.5 x 10⁶개 세포/㎖로 EZ-CPZ(상표명)(INCELL) 동결보존제 용액 중에서 M3D(상표명)의 1:1 혼합물 중에 재현탁시키고, 1㎖ 분취액 중에서 동결건조시켰다.

실시예 2: 방사선 조사의 효과

실시예 1에 기재한 바와 같이 제조한 조성물을 방사선 노출에 의해 멸균시키고, 이어서, 이동 분석에서 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC)를 이용하여 생물활성에 대해 시험하였다. HUVEC는 대수증식기까지 배양시킨 제1 계대 세포였고, 이어서, CM-DiI(인비트로젠(Invitrogen))를 이용하여 형광 표지시켰다. 상피 세포 성장 인자(EGF - 양성 대조군)로 보충하거나 또는 다양한 유형 및 방사선량으로 처리한 미세혈관 조직의 재수화 조성물로 보충한 세포 배양 배지(M3D(상표명) 및 EZ-CPZ(상표명) INCELL의 50:50 혼합물) 단독(음성 대조군)을 이용하여 트랜스웰 플레이트(Transwell plate)(써모피셔(ThermoFisher))를 제조하였다. 표지한 HUVEC 세포를 트랜스웰(Transwell) 플레이트의 상부 챔버에 놓고, 세포 배양 인큐베이터 내 37℃에서 48시간 동안 배양시켰다. 상부와 하부 챔버를 분리시키는 PET 막은 3㎛ 기공을 가진다. 48시간 후에, 상부 챔버를 제거하고 나서, 하부 챔버 내 형광 강도를 측정하였다.

실험 결과를 도 1에서 그래프로 나타낸다. 파장과 상관없이 방사선량이 증가함에 따라 생물활성이 증가되며, 심지어 양성 대조군을 초과하였다. 처리된 조성물의 분취액을 DAPI(핵 염색)로 염색하고 나서, 형광 현미경과 함께 혈구계수기 상에서 계수화하였다. 세포 계수(도 2)는 방사선 조사가 처리된 조성물 중의 세포 수에 대해 상당한 효과를 갖지 않았다는 것을 나타낸다.

실시예 3: 저장 시간의 효과

실시예 1에 기재한 바와 같이 제조하고, 이어서, 27kGy의 감마 방사선 조사로 멸균시킨 조성물을 실온에서 저장하고, 이어서, 다양한 시간에 HUVEC 이동 분석을 이용하여 분석하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 2년 동안 저장한 샘플은 놀랍게도 더 이른 시점에 비해 증가된 생물활성을 나타내었다.

실시예 4: 저장 온도의 효과

실시예 1에서와 같이 제조하고, 25kGy의 감마 방사선으로 멸균시킨 조성물을 가능한 운송 상황을 자극하기 위한 승온에 노출시켰다. 기준 샘플을 실온에서 유지하였다. 예상치 못하게, 과열된 샘플은 도 4에 나타낸 바와 같이 가장 높은 생물활성을 나타내었다.

별개로, 관련된 실험이긴 하지만, 방사선 조사하지 않은 샘플을 실온 이하에서 6개월 동안 저장하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 생물활성은 더 낮은 저장 온도에서 감소되었다.

6개월 저장한 방사선 조사하지 않은 샘플의 생물활성
저장 온도	상대적 이동
RT	40%
4℃	55%
-20℃	35%
-80℃	5%

실시예 5: 산소 효과

실시예 1에서의 가공 동안, 세포 조성물에 낮은 산소 수준을 실시한다. 특정 세포 단백질의 발현은 그 결과 향상되거나 또는 저해될 것이며, 이는 조성물의 작용에 영향을 미친다. 저산소는 혈관형성 및 혈관화를 촉진시키는 데 중요한 인자인 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 발현 유도와 관련된다. 따라서, 저산소에 대한 노출은 투여된 조성물 중에서 VEGF의 발현이 향상될 수 있는 수단으로서 사용될 수 있다.

실시예 6: 관절염 치료

57세 만성 농부는 10점 통증 규모로 8 내지 9 등급의 골관절염에 기인하는 만성 통증으로 고통 받고 있다. 통증은 그의 작업 및 여가 활동을 제한하였다. 실시예 2에서와 같이 제조한 가공된 미세혈관 조직의 바이알을 3㎖의 물로 수화시키고, 용액을 병에 걸린 무릎에 주사하였다. 5주 후속 방문 시, 통증은 0으로 가라앉았다. 대상체는 통증이 주사 1주 내에 사라졌고, 그가 농장에서의 완전한 활동을 다시 시작하였으며, 수년 내에 처음으로 자전거를 탔다는 것을 언급하였다.

대상체는 주사 전 그리고 4개월 후에 다시 자기 공명 영상을 촬영하였다. 영상에 대한 방사선 전문의의 보고를 다음과 같이 요약한다:

전처리: 타당한 소견은 하기를 포함한다, 1) 유출물: 소량 내지 보통의 슬개상 유출물; 2) 피하 연조직: 보통의 피하 지방 부종 및 장경인대 안쪽의 그리고 오금부위 지방체로 연장되는 유체; 3) 외측 측부 인대: 근위 힘줄증 및/또는 부분적 파열; 4) 슬개대퇴관절: 등급 I CP; 5) 안쪽 관절 구획: 대퇴골의 원위 외측과와 옆쪽 경골 고평부 둘 다의 70% 초과의 관절면이 관여된 거의 완전한 두께의 연골 상실, 잔여 연골의 작은 병소 궤양, 및 매우 최소의 인접한 반응성(경화성) 뼈 변화 및 연골밑 정동 없음; 6) 골수: 안쪽-뒤쪽 대퇴골 외측과에서 보통 크기의 골수 타박상 및 무릎뼈의 골수 타박상; 및 7) 피질: 골절없음.

4개월 후처리: 타당한 소견은 하기를 포함한다, 1) 유출물: 소량 - 분해성; 2) 피하 연조직: 최소 잔여량을 갖는 피하 지방 부종의 상당한 분해; 3) 외측 측부 인대: 급성 힘줄증의 해결; 4) 슬개대퇴관절: 등급 I CP, 변화 없음; 5) 의학적 관절 구획: 변화 없음; 6) 골수: 골수 타박상의 변화 없음; 및 7) 피질: 골절 없음.

실시예 7: 힘줄증의 치료

환자는 무게를 싣지 않고 스쿼트를 수행함으로써 유발된 우측 슬개골의 아래쪽 영역에 과거 3 내지 4개월 동안 최근의 중증의 그리고 진행성 통증을 갖는 40세 남성이었다. 그는 촉진에 의해 아래쪽 무릎뼈 상의 임의의 압력을 용인할 수 없었다.　0 내지 10의 통증 규모에 대해, 10은 가장 나쁜 통증이고, 그는 무게를 싣지 않은 스쿼트를 수행할 때 통증이 대략 8 내지 9이며, 이 영역 상에서 임의의 압력을 퍼팅할 때 약 9라고 언급하였다. 그는 매우 깊은 스쿼트를 수행하고, 이어서 약간 과다굽힘된 그의 무릎에 의해 서 있는 위치로 저킹(jerking)함으로써 통증이 야기된다고 언급하였다. 그는 만약에 통증이 있다고 해도 걷거나 또는 휴식하는 동안에는 경험하지 않는다. 도 5는 힘줄 파열을 나타내는 무릎의 전처리 MRI이다.

실시예 2에서와 같이 제조한 가공된 미세혈관 조직의 하나의(1) 바이알을 슬개골 힘줄에 주사하였고, 그리고 실시예 2에서와 같이 제조한 가공된 미세혈관 조직의 하나의(1) 바이알을 소둔근 내로 주사하였다.

주사 5주 후에, 환자는 확실한 촉진에 의해 슬개골 아래 영역에 대해 통증이 없었다. 그는 또한 임의의 통증 없이 무게를 싣지 않은 깊은 스쿼트를 수행할 수 있었다.

주사 6주 후에, 그는 임의의 통증이 없는 그들의 최대 무게보다 약 70% 더 적은 무게로 스쿼트를 수행하기 시작하였다. 도 6은 영향 받은 힘줄의 치유를 나타내는 치료 후 MRI이다.

실시예 8: 만성 상처의 치료

당뇨병 및 신부전이 있는 48세 여성을 거대 당뇨병성 족부 궤양에 대한 만성 상처에 의해 1년 동안 치료하였다. 상처는 상처 5㎝ x 3.5㎝ x 0.4㎝를 노출시키는 일부 영역에서 힘줄 아래쪽으로 절제를 시행하였고(도 7에 나타낸 바와 같음) 그리고 실시예 2에서와 같이 제조한 가공된 미세혈관 조직의 바이알을 동결건조 케이크를 납작하게 하고, 상처 표면을 가로질러 살포함으로써 적응 드레싱(Adaptic dressing)을 이용하여 국소로 적용하였다.

1주 후에, 대상체를 후속 조치를 위해 복귀시키고, 도 8에 나타낸 바와 같은 궤양의 광대한 치유를 나타내었다. 상처는 후속 몇 주 동안 완전하게 봉합되었다.

실시예 9: 족저근막염의 치료

대상체는 47세 여성이었다. 그녀는 족근관 이완 및 내측족저 근막 이완을 위해 그녀의 왼쪽 발에 대해 사전 수술을 받았다. 수술 후 십오(15)주에 환자는 중증의 통증으로 불평하였다(통증 등급이 10 중에서 8임). 그녀는 하기를 포함하는 표준 요법에 실패하였다: 코티손 주사, 비복근 후퇴뿐만 아니라 내측족저 근막이완, 및 외래환자 물리 치료.

치료: 치료 면적을 베타인으로 준비한 후에, 25g 바늘을 이용하는 족저 접근을 통해 왼쪽 뒤꿈치에 실시예 2에서와 같이 제조한 1cc의 가공된 미세혈관 조직을 주사(WFI에 의함)하였고, 가공된 미세혈관 조직을 종골결절 수준의 아래쪽으로 주사하고, 이어서, 대략 5㎜로 후퇴시켰다. 환자는 주사를 잘 용인하였다. 환자는 또한 CAM 부츠를 착용하였다.

가공된 미세혈관 조직 치료 후 일(1)주 후속 조치: 환자는 왼쪽 뒤꿈치에 대한 주사 이후로, 그녀가 더 이상 뒤꿈치 통증이 없으며 족저근막 유래의 10 통증 수준 중에서 0이라는 것을 언급하였다.

실시예 10: 악관절(TMJ) 통증의 치료

사십오(45)세 여성은 좌측과 우측 관절구 둘 다에서 일정한 턱 통증이 있었다. 그녀는 통증을 10 중의 8 내지 9로 동일하게 등급화하였다. 25g 바늘을 이용하여 관절 열극 내에서 오른쪽 관절구에 대해 하부, 상부 및 측부에서 실시예 2에서 제조한 가공된 미세혈관 조직의 1cc 주사제(에피네프린 없이 마케인 0.25%로 재구성)를 제조하였다. 이어서, 반대쪽(좌측 관절구)을 셀레스톤(베타메타손)을 이용하여 오른쪽과 동일하게 정확하게 처리하였다.

치료 일(1)주 후에, 환자를 우측(가공된 미세혈관 조직 처리측)에 대해 통증 스코어 0으로 등급화하였다. 환자는 주사 다음날에 우측에 통증이 없다는 발언을 하였다. 그녀의 좌측은 통증 규모가 10 중의 4 내지 5였다.

좌측 관절구 내 스테로이드 주사 6주 후, 환자의 통증 수준은 10 중의 6 내지 7이었다. 남은 관절구를 가공한 미세혈관 조직으로 처리하였다.

실시예 11: 효소 사용이 없는 지방 조직으로부터의 미세혈관 조직의 제조

인간 시체 공여자로부터 체취한 20그램의 피하 지방을 각각 2개의 50㎖ 원심분리관에 첨가하였다. 5㎖의 행크스 염기성 염 용액을 원심분리관 A에 첨가하고 나서, 혼합하고, 이어서, 관을 37℃ 초음파 수욕에 두고, 35분 동안 초음파 에너지를 이용하여 교반시켰다. 거대 자기 교반 막대를 원심분리관 B에 떨어뜨리고, 관을 캡핑하고 나서, 교반 막대가 끝에서 끝까지 튀어서 지방 조직을 파쇄하고 지방세포를 용해시키도록 관을 5분 동안 격렬하게 진탕시켰다. 관에 행크스 BSS로 50㎖까지 채우고, 이어서, 7분 동안 300g에서 원심분리시켰다. 오일 및 완충제를 쏟아내고, 남아있는 조직 펠렛을 페트리 접시에 부어서 페트리 접시의 바닥에서 얇은 슬러리를 형성하였다. 이어서, 페트리 접시를 냉동시키고, 동결건조시켜서 미세혈관 조직의 얇은 가요성 필름을 생성하였다. 2.7kGy 감마 방사선을 이용하여 필름을 멸균시켰다.

세포증식 분석을 이용하여 미세혈관 조직의 필름 활성을 분석하고, 상기 기재한 바와 같이 효소적으로 제조한 미세혈관 조직과 비교하였다. 기저 세포 배지를 이용하여 필름 및 케이크를 재수화시키고, 이어서, 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC)를 함유하는 기저 배지 내로 연속 희석시켰다. 2일 후에, 형광 염료로 세포를 표지하고, 도 9에 나타낸 바와 같이 웰에서 형광 강도에 의해 상대적 수를 결정하였다. 필름은 둘 다 효소적으로 분해된 미세혈관 조직만큼 또는 이보다 더 양호한 활성을 나타내었다.

실시예 12: 독두병(탈모)의 치료

이십구(29)세의 남성이 2년 이상 동안 탈모 징후를 나타내었다. 주사를 위해 4cc의 멸균수 중에서 가공된 미세혈관 조직을 재구성하였다. 2" 직경 치료 면적의 중심에서 시작해서, 30g 바늘을 통해 0.1 내지 0.2cc 분취액을 다회 주사하였고, 이어서, 방사상으로 퍼졌다.

치료 이(2)개월 후에, 후속조치 방문을 위해 환자를 보았다. 치료하는 의사는 주사 부위에서 미세한 모발 성장을 주목하였다.

실시예 13: 점액낭염의 치료

59-세 여성이 NSAIDS에 의할 때조차도 수면, 가드닝(gardening), 보행 또는 달리기를 불편하게 만드는 5년 동안 지속된 그녀의 좌측 둔부에서의 통증으로 불평하였다. 신체 검사 및 X-선은 엉덩관절에서의 중등증 관절염을 나타내었지만, 대부분의 통증은 염증 점액낭과 관련되고, 봉공근을 따라서 방사상으로 퍼졌다. 통증 궤도를 따라서 염증이 생긴 점액낭 내 그리고 점액낭 하에 12개의 부위에서 초음파 유도 하에 주사한 4㎖ 마케인을 이용하여 미세혈관 조직을 재구성하였다. 환자는 다음 2일에 걸쳐 통증이 감소되었음을 보고하였는데, 한 번의 통증은 제3일의 찌릿한 통증이고, 다른 통증은 제13일의 찌릿한 통증이며(남용), 그 이후로 찌릿한 통증은 없었다. 5개월 후에, 그녀는 심지어 그녀의 둔부에 대해 더 이상 생각하지 않는 것으로 보고되었다.

Claims (24)

1. 다능성 세포를 포함하는 조성물로서, 상기 세포에 향상된 생물활성을 초래하는 한 가지 이상의 가공 처리가 실시된, 다능성 세포를 포함하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 처리는 방사선 조사, 저장, 저산소, 반응성 산소종, 전자기장, 초음파 교반, 유체 전단력, 비-생리적 pH, 비-생리적 긴장성, 열, 냉각, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 다능성 세포를 포함하는 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 처리는 약 0.65kGy의 최소 역치 용량을 갖는 방사선 조사인, 다능성 세포를 포함하는 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 최소 역치 용량은 2kGy인, 다능성 세포를 포함하는 조성물.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 방사선 조사는 적외선 내지 전자빔의 파장 범위에서의 노출에 의해 달성되는, 다능성 세포를 포함하는 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 세포는 최대 용량 한계를 갖는 방사선 조사에 의해 처리되되, 상기 최대 용량은 세포 완전성(integrity)의 99% 상실을 야기하는 용량인, 다능성 세포를 포함하는 조성물.
7. 제1항에 있어서, 생물활성은 세포 증식, 세포 이동, 항-염증, 혈관화, 조직 치유 및 통증 경감으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 매개변수로서 측정되는, 다능성 세포를 포함하는 조성물.
8. 제2항에 있어서, 상기 처리는 저장이고, 46℃에서 약 1일, 실온에서 약 2년 및 -20℃에서 2년 초과로 이루어진 군으로부터 선택되는, 다능성 세포를 포함하는 조성물.
9. 제1항에 있어서, 추가로 상기 세포는 증식하는 능력이 감소된, 다능성 세포를 포함하는 조성물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 건조되고 멸균된, 다능성 세포를 포함하는 조성물.
11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 살아있는 배양된 세포인, 다능성 세포를 포함하는 조성물.
12. 제1항에 있어서, 1회 이상의 가공 처리가 실시된 상기 다능성 세포는 동등한 용량의 살아있는 비처리 다능성 세포보다 더 큰 생물활성을 갖는, 다능성 세포를 포함하는 조성물.
13. 가공된 미세혈관 조직을 포함하는 조성물로서, 상기 조직에 향상된 생물활성을 초래하는 1회 이상의 가공 처리가 실시된, 다능성 세포를 포함하는 조성물.
14. 제13항에 있어서, 상기 처리는 방사선 조사, 저장, 저산소, 반응성 산소종, 전자기장, 초음파 교반, 유체 전단력, 비-생리적 pH, 비-생리적 긴장성, 열, 냉각, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 다능성 세포를 포함하는 조성물.
15. 제14항에 있어서, 상기 처리는 약 0.65kGy의 최소 역치 용량을 갖는 방사선 조사인, 다능성 세포를 포함하는 조성물.
16. 제14항에 있어서, 상기 처리는 46℃에서 약 1일, 실온에서 약 2년, 또는 -20℃에서 2년 초과 동안 저장되는, 다능성 세포를 포함하는 조성물.
17. 제14항에 있어서, 상기 처리는 열에 대한 노출인, 다능성 세포를 포함하는 조성물.
18. 포유류에서 손상 또는 질환을 치료하거나 또는 예방하는 방법으로서, 생존할 수 없는 다능성 세포 또는 가공된 미세혈관 조직을 포함하는 조성물의 투여를 포함하되, 상기 조성물에 생물활성을 향상시키는 한 가지 이상의 처리가 실시된, 손상 또는 질환을 치료하거나 또는 예방하는 방법.
19. 의학적 병태와 관련된 조직 통증을 완화시키는 방법으로서, 생존할 수 없는 다능성 세포 또는 가공된 미세혈관 조직을 포함하는 조성물의 투여를 포함하되, 상기 조성물에 생물활성을 향상시키는 한 가지 이상의 처리가 실시된, 의학적 병태와 관련된 조직 통증을 완화시키는 방법.
20. 상처 치유 방법으로서, 생존할 수 없는 다능성 세포 또는 가공된 미세혈관 조직을 포함하는 조성물의 투여를 포함하되, 상기 조성물에 생물활성을 향상시키는 한 가지 이상의 처리가 실시된, 상처 치유 방법.
21. 대상체에서 흉터를 예방하거나 또는 치료하는 방법으로서, 생존할 수 없는 다능성 세포 또는 가공된 미세혈관 조직을 포함하는 조성물의 투여를 포함하되, 상기 조성물에 생물활성을 향상시키는 한 가지 이상의 처리가 실시된, 흉터를 예방하거나 또는 치료하는 방법.
22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 한 가지 이상의 처리는 방사선, 열, 장기간 저장, 저산소, 전단, pH 충격, 삼투압 충격, 초음파, 전자기장, 및 반응성 산소종 노출로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
23. 제18항에 있어서, 상기 의학적 병태는 관절염, 족저근막염, 활액낭염, 측두하악 관절 통증, 골관절염, 탈모, 지방 이식, 구개열, 골수염, 말초신경병증, 만성 상처, 골절, 및 힘줄 또는 인대 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는, 손상 또는 질환을 치료하거나 또는 예방하는 방법.
24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 국소 분말, 국소 케이크, 국소 크림, 건조 필름 또는 주사제인, 방법.
    

Images