KR20180104117A - Tlr7 작용제 결정형 a, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TLR7 작용제, 2-부톡시-7-(4-(피롤리딘-1-일메틸)-벤질)-5H-피롤로[3,2-d]피리미딘-4-아민 (화학식 I)의 결정형 A, 상기 결정형 A의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

TLR7 작용제 결정형 A, 이의 제조 방법 및 용도

본 발명은 의료 화학 분야에 관한 것이며, 특히 TLR7 작용제 (2-부톡시-7-(4-(피롤리딘-1-일메틸)벤질)-5H-피롤로[3,2-d]피리미딘-4-아민)의 결정형 (crystal form) A, 이의 제조 방법, 상기 결정형 A를 포함하는 결정성 조성물 (crystalline composition), 상기 결정형 A 또는 결정성 조성물을 포함하는 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

톨-유사 수용체 (Toll-like receptor)는 다양한 면역 세포에 의해 발현되며, 미생물 병원체에 의해 발현되는 병원체 관련 분자 패턴 (Pathogen Associated Molecular Pattern: PAMP) 또는 사멸한 세포에 의해 방출되는 손상 관련 분자 패턴 (damage Associated Molecular Pattern: DAMP)과 같은 고도로 보존된 구조적 모티프를 인식한다. PAMP 또는 DAMP는 톨-유사 수용체를 자극하여 전사 인자 (예: AP-1, NF-κB) 및 인터페론 조절자 (펄스 반응 함수 (pulse response function))의 활성화를 유도하는 신호 캐스캐이드 (signal cascade)를 유발한다. 이는, 인터페론, 전염증성 시토카인 (proinflammatory cytokine) 및 효과기 시토카인의 생성을 비롯한 다양한 세포 반응으로 이어지며, 이에 의해 면역 반응이 생성된다. 지금까지, 포유동물에서 13가지 종류의 톨-유사 수용체가 발견되었다. 톨-유사 수용체 1, 2, 4, 5 및 6은 주로 세포의 표면에 발현되나, 톨-유사 수용체 3, 7, 8 및 9는 엔도솜 내에 발현된다. 상이한 톨-유사 수용체는 상이한 병원체로부터 유래된 리간드를 인식한다. 톨-유사 수용체 7 (TLR7)은 주로 플라즈마사이토이드 수지상 세포 (plasmaeytoid endritic cell: pDC)에 의해 발현되고, 리간드를 통해 인식되어 인터페론 α (IFN-α)의 분비를 유도한다. 톨-유사 수용체 7 (TLR7) 및 톨-유사 수용체 8 (TLR8)은 고도로 상동성이므로, 대부분의 경우 TLR7의 리간드는 또한 TLR8의 리간드이다. TLR8 자극은 주로 종양 괴사 인자 α (TNF-α) 및 화학유인물질 (chemoattractant)과 같은 시토카인의 생성을 유도한다. 인터페론 α는 만성 B형 간염 또는 C형 간염을 치료하기 위한 의약 중 하나인 반면, TNF-α는 전염증성 시토카인이며, 이의 과다 분비는 심각한 부작용을 유발할 것이다.

수개의 TLR7 작용제, 예컨대, 이미퀴모드 (imiquimod)(British Journal of Dermatology 2003; 149 (Suppl. 66): 5-8), 레시퀴모드 (resiquimod)(Antiviral Research 64 (2004) 79-83), GS-9620 (Gastroenterology (2013), 144(7), 1508-1517)가 보고되었다. 그럼에도 불구하고, 더 우수한 선택성, 활성 및 안전성을 갖는 신규 TLR7 작용제를 갖는 것이 바람직하다.

중국 특허 출원 제201410405136.0호는 이의 전문이 본원에 원용되며, 하나의 소분자, 즉, 하기의 구조식을 갖는 2-부톡시-7-(4-(피롤리딘-1-일메틸)벤질)-5H-피롤로[3,2-d]피리미딘-4-아민을 개시한다:

.

하나의 양태에서, 화학식 I의 화합물의 결정형 A가 제공된다:

상기 결정형 A는 2θ=5.5°±0.2°, 10.1°±0.2°, 13.8°±0.2°, 19.7°±0.2°, 23.7°±0.2°, 24.1°±0.2°에서 회절 피크를 갖는 X-선 분말 회전 (X-ray powder diffraction: XRPD) 패턴으로 특성화된다.

또 다른 양태에서, 하기의 단계를 포함하는, 화학식 I의 화합물의 결정형 A의 제조 방법이 제공된다:

1) 화학식 I의 화합물을 결정화 용매 (crystallizing solvent) 중에 용해시키는 단계로서, 바람직하게는 가열되어 용해를 촉진시키는 것인, 단계; 및

2) 결정화를 위하여 냉각시키고 여과하고 세척하고 건조시켜 상기 결정형 A를 수득하는 단계.

또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 결정형 A 또는 이의 결정성 조성물을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 약학적 조성물은 임의로 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 매체 (medium)를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서, 톨-유사 수용체 7 (TLR7) 관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 이의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명에 따른 결정형 A 또는 이의 결정성 조성물 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 질환은 바이러스 감염이다.

추가의 양태에서, 톨-유사 수용체 7 (TLR7) 관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조를 위한, 본 발명에 따른 결정형 A 또는 이의 결정성 조성물 또는 약학적 조성물의 용도가 제공된다. 바람직하게는, 상기 질환은 바이러스 감염이다.

또 다른 추가의 양태에서, 톨-유사 수용체 7 (TLR7) 관련 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명에 따른 결정형 A 또는 이의 결정성 조성물 또는 약학적 조성물이 제공된다. 바람직하게는, 상기 질환은 바이러스 감염이다.

본 발명의 하나의 실시형태에서, 바이러스 감염은 간염 바이러스 감염, 특히 B형 간염 또는 C형 간염 바이러스 감염이다.

도 1: 화학식 I의 화합물의 결정형 A의 XRPD 패턴.
도 2: 화학식 I의 화합물의 결정형 A의 단위 격자 다이어그램 (Unit cell diagram).
도 3: 화학식 I의 화합물의 결정형 A의 DSC 패턴.

일반적 정의 및 용어

달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 및 어구는 하기의 의미를 갖는다. 구체적인 용어 또는 어구는 구체적으로 정의되지 않는 경우 불명확하거나 막연한 것으로 간주되어서는 안된다. 이는 일반적인 의미에 따라 이해되어야 한다. 본원에 사용된 상품명은 상응하는 생성물 또는 활성 성분을 지칭한다.

달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 비율 (백분율 포함) 또는 부분은 본원에서 중량을 기준으로하여 계산된다.

숫자 변수와 함께 사용되는 경우, 용어 "대략" 또는 "약"은 일반적으로 실험 오차 (예: 평균 95% 신뢰 구간 내) 또는 지정된 값의 ± 10% 이내 또는 이보다 넓은 범위 내의 변수 값 및 모든 값들을 지칭한다.

표현 "포함하다" 또는 이의 동의어 "함유하다", "포함하며" 또는 "갖는다" 등은 개방형이며, 다른 미기재된 요소, 단계 또는 성분을 배제하지 않는다. 표현 "~로 이루어진"은 임의의 미기재된 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 표현 "실질적으로 이루어진"은 청구된 주제의 기본적이고 새로운 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 임의의 요소, 단계 또는 성분과 함께, 소정의 범위 내의 구체화된 요소, 단계 또는 성분을 지칭한다. 표현 "포함하다"는 표현 "~로 실질적으로 이루어진" 및 "~로 이루어진"을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

용어 "임의적" 또는 "임의로"는 이후에 기재된 이벤트가 발생할 수 있거나 발생하지 않을 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 용어는 이벤트가 일어날 수 있거나 일어나지 않을 수 있는 경우를 포함한다.

용어 "약학적 조성물"은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 성분 (예를 들어, 제한 없이, 담체 및/또는 부형제)과 임의로 배합된, 활성 성분을 지칭한다. 활성 성분은, 화학식 I의 화합물 또는 이의 염, 본 발명에 따른 결정형 또는 본 발명에 따른 결정성 조성물로 예시된다.

용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 유의한 자극이 없고, 활성 화합물의 생물 작용 및 특성을 손상시키지 않는, 이들의 담체를 지칭한다. "약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분과 함께 투여되며 이의 투여에 도움이 되는, 불활성 물질을 지칭하며, 인간 또는 동물 (예: 가축류)에 사용시 중국 국가 식품약품 감독관리국 (State Food and Drug Administration)에 의해 승인된 하기의 물질 중 임의의 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 활강제 (glidant), 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 착향료, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 붕해제 (disintegrant), 현탁화제 (suspending agent), 안정제, 등장성제 (isotonic agent), 용매 또는 유화제. 담체의 비-제한적인 예는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당 및 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성유 및 폴리에틸렌 글리콜 등을 포함한다. 담체에 관한 다른 정보는 문헌 [The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2005)]에서 찾아볼 수 있으며, 이의 성분은 본원에 참고로 원용된다. 용어 "부형제"는 일반적으로 효과적인 약학적 조성물을 제형화하는데 사용되는 담체, 희석제 및/또는 매체를 지칭한다.

용어 "투여" 또는 "투여하는" 등은 화합물 또는 조성물의 목적하는 생물학적 작용 부위로의 전달을 가능하게 하는 방법을 지칭한다. 이러한 방법은 경구, 비경구 (정맥내, 피하, 복막내, 근육내, 혈관내 주사 또는 주입 포함), 국소, 직장 투여등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

약학적 또는 약리적 활성제에 있어서, 용어 "유효량"은, 독성이 아니면서 목적하는 효과를 달성하기에 충분한 의약 또는 작용제 (agent)의 양을 지칭한다. 본원에서 경구 제형에 관하여, 조성물 내 활성 물질에 대한 "유효량"은, 조성물 내 또 다른 활성 물질과 함께 목적하는 효과를 달성하도록 요구되는 양을 지칭한다. 유효량은 개별적으로 결정될 수 있으며, 수용자 뿐만 아니라 특정 활성 물질의 재령 (age) 및 일반적 조건에 따라 다를 수 있다. 특정한 경우 유효량은 통상적인 시험을 통해 당업자에 의해 결정될 수 있다.

용어 "활성 성분", "치료제", "활성 물질" 또는 "활성제"는 표적 장애, 질환 또는 병증을 효과적으로 치료 또는 예방하는데 유용한 화학적 엔티티 (chemical entity)를 지칭한다. 본원에서 이러한 용어는, 예를 들어, 화학식 I의 화합물 또는 이의 염, 본 발명에 따른 결정형 또는 본 발명에 따른 결정성 조성물을 지칭할 수 있다.

X-선 분말 회절 (XRPD 또는 XRD) 스펙트럼에서, 결정성 화합물로부터 수득된 회절 패턴은 일반적으로 특정 결정형에 대해 특성적이며, 여기서, (특히 낮은 각에서의) 밴드 (band)의 상대적 강도는 결정화 조건, 입자 직경 및 다른 측정 조건의 차이로 인한 우세한 배향 효과 (orientation effect)에 따라 다양할 수 있다. 따라서, 회절 피크의 상대적 강도는 소정의 결정형에 대해 특성적이지 않다. 결정형이 당업계에 공지된 것과 동일한지의 여부를 측정하는 경우, 피크의 상대적 강도 보다는, 피크의 상대적 위치를 주목하는 것이 보다 중요하다. 또한, 임의의 소정의 결정형에 대한 피크 위치에 다소 오차 (error)가 존재할 수 있으며, 이는 또한 결정학 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 피크의 위치는, 샘플 분석 동안에 온도, 샘플 이동 또는 장치 교정 (instrument calibration)에서의 변화로 인하여 이동될 수 있으며; 2θ 값의 측정 오차는 때때로 약 ±0.2°, 전형적으로 약 ±0.1°일 수 있다. 따라서, 결정 구조를 측정하는 경우, 이러한 오차가 고려되어야 한다. 만일 본 발명에 따른 결정형이 도면에 도시된 바와 같이 실질적으로 기재되는 경우, 용어 "실질적으로"는 또한 회절 피크에서의 이러한 차이를 포함하는 것으로 의도된다.

XRPD 패턴에서, 피크 위치는 일반적으로 각 2θ 또는 결정면 (crystal surface) 거리 d로 표현되며, d와 θ 사이의 단순 변환 (simple conversion)은 d=λ/2sinθ이며, 여기서, d는 결정면 거리를 나타내고, λ는 입사 X-선 (incident X-ray)의 파장을 나타내고, θ는 회절각 (diffraction angle)이다. 동일한 화합물의 동일한 결정형에 있어서, XRPD 패턴의 피크 위치는 전체적으로 유사하며, 상대적 강도 오차는 클 수 있다. 또한, 혼합물의 식별에 있어서, 일부 회절 라인 (diffraction line)은 함량 감소와 같은 요인으로 인해 소실될 수 있으며, 따라서, 이는 고순도 샘플에서 관찰된 전체 밴드에 의존할 필요는 없고, 심지어 1개 밴드는 소정의 결정에 대해 특성적일 수 있다는 것을 유념해야 한다.

본 발명에서, X-선 분말 회절 패턴을 하기와 같이 측정한다: 장치 Bruker D8 ADVANCE X-선 회절계; 방법: 표적: Cu: K-Alpha; 파장 λ=1.54179Å; 전압: 40 kV; 전류: 40 mA; 스캐닝 범위: 4~40°; 샘플 회전 속도: 15 rpm; 스캐닝 속도: 10°/min.

결정이 이의 결정 구조 또는 결정 용융시의 변화로 인해, 열을 흡수하거나 방출할 경우의 전이 온도를 측정하기 위하여, 시차 주사 열량측정법 (Differential scanning calorimetry: DSC)이 사용된다. 열 전이 온도 및 융점 (metling point)의 오차는, 연속 분석에서 동일한 화합물의 동일한 결정형에 대해 전형적으로 약 5 ℃, 일반적으로 약 3 ℃ 내이다. 화합물이 소정의 DSC 피크 또는 융점을 갖는 것으로 기재되는 경우, 이는 DSC 피크 또는 융점 ±5 ℃를 의미한다. 상이한 결정형을 식별하기 위하여 DSC에 의한 보조적 방법이 제공된다. 상이한 결정형은 이들의 상이한 전이 온도 특성에 따라 식별될 수 있다. 혼합물의 DSC 피크 또는 융점이 넓은 범위에 걸쳐 다양할 수 있다는 것이 주목된다. 또한, 융점은, 물질의 용융 동안의 분해에 기인한 온도 상승 속도와 관련된다.

본원에서 시차 주사 열량측정법 (DSC)은 하기의 방법에 따라 측정된다: 장치: TA Q2000 시차 주사 열량계; 방법: 샘플 (~1 mg)을 DSC 알루미늄 팬 (pan)에 위치시킴, 방법: 25 ℃~300 ℃, 가열 속도 10 ℃/min.

또한, 본 발명에 따른 결정형은 셀 파라미터 (cell parameter)에 의해 특성화될 수 있다. 이러한 파라미터는 단결정 X-선 결정학적 분석 (crystallographic analysis)으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 셀 파라미터의 상세한 정보를 문헌 [Chapter 3 of Stout & Jensen, X-Ray structure Determination: A Practical Guide, MacMillian Co., New York, N.Y. (1968)]에서 찾을 수 있다.

본원에서 셀 파라미터는 하기의 방법으로 측정된다: 회절계: Rigaku MicroMax-007HF; 파장: 1.54178Å; 온도: 296K.

용어 "결정성 조성물"은, 본 발명에 따른 결정형 A를 포함하는, 고체 형태를 지칭한다. 결정성 조성물에 함유된 결정형 A의 양은 50% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상일 수 있다. 본 발명에 따른 결정형 외에도, 결정성 조성물은 또한 임의로 다른 결정형 또는 무정형 (amorphous form)의 화학식 I의 화합물 또는 이의 염 또는 이러한 물질 외의 불순물을 포함할 수 있다. 결정성 조성물 내 성분 함량의 합은 100% 이어야 한다는 것을 당업자는 이해하여야 한다.

결정형 A

화학식 I의 화합물의 결정형 A가 제공되며, 이는 X-선 분말 회절 (XRPD) 패턴에서 2θ=5.5°, 10.1°, 13.8°, 19.7°, 23.7°, 24.1°±0.2°에서 회절 피크를 갖는다.

구체적인 실시형태에서, 결정형 A는 X-선 분말 회절 (XRPD) 패턴에서 2θ=5.5°, 10.1°, 13.8°, 16.4°, 19.7°, 23.7°, 24.1°, 27.9°±0.2°에서 회절 피크를 갖는다.

보다 구체적인 실시형태에서, 결정형 A는 X-선 분말 회절 (XRPD) 패턴에서 2θ=5.5°, 10.1°, 13.8°, 16.4°, 17.9°, 19.0°, 19.7°, 20.3°, 21.8°, 22.1°, 23.7°, 24.1°, 25.5°, 27.9°, 32.9°, 34.0°±0.2°에서 회절 피크를 갖는다.

특정 실시형태에서, 화학식 I의 화합물의 결정형 A의 회절 피크는 하기와 같이 특성화된다:

하나의 실시형태에서, 화학식 I의 화합물의 결정형 A의 X-선 분말 회절 패턴은 실질적으로 도 1에 도시된다.

또 다른 실시형태에서, 화학식 I의 화합물의 결정형 A는 하기의 셀 파라미터를 갖는다 (도 2에 도시됨):

a = 16.560 (3) Å

b = 10.426 (2) Å

c = 12.203 (2) Å

α= 90°

β=98.54(3)°

γ=90°

공간 군: P21/c

Z=4.

또한, 결정형 A는 DSC에 의해 199 ℃의 초기 온도 및 200.4 ℃의 피크 온도 (peak temperature)로 특성화될 수 있다.

하나의 실시형태에서, 화학식 I의 화합물의 결정형 A의 DSC 패턴은 도 3에 도시된다.

제조 방법

또한, 용매로부터 화학식 I의 화합물의 결정형 A를 침전시키는 단계를 포함하는, 화학식 I의 화합물의 결정형 A의 제조 방법이 제공된다.

하나의 실시형태에서, 제조 방법은 하기의 단계를 포함한다:

1) 결정화 용매 중에 화학식 I의 화합물을 용해시키는 단계로서, 바람직하게는 가열되어 용해를 촉진시키는 것인, 단계; 및

2) 결정화를 위하여 냉각시키고 여과하고 세척하고 건조시켜 상기 결정형 A를 수득하는 단계.

단계 1)에서, 상기 결정화 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올, 3차 부탄올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 물 및 이의 혼합 용매로 이루어진 그룹 중에서 선택되며; 바람직하게는 에탄올이다.

단계 1)에서, 화학식 I의 화합물의 1g 당 첨가된 결정화 용매의 양은 2 내지 10 mL, 바람직하게는 4 내지 8 mL, 보다 바람직하게는 5 내지 7 mL이다.

단계 1)에서, 가열이 사용되어 화학식 I의 화합물 및 결정화 용매의 균질계 (homogeneous system)를 형성시킨다. 상기 가열 온도는 40 ℃ 내지 90 ℃, 바람직하게는 50 ℃ 내지 80 ℃, 보다 바람직하게는 70 ℃ 내지 80 ℃일 수 있다.

화학식 I의 화합물의 결정형 A를 포함하는 결정성 조성물이 또한 제공된다. 하나의 실시형태에서, 결정성 조성물의 중량을 기준으로, 결정형 A의 함량은 50% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 및 가장 바람직하게는 95% 이상이다. 결정형 A 외에도, 결정성 조성물은 또한 다른 결정형 또는 무정형의 화학식 I의 화합물 또는 이의 염, 또는 이러한 물질 외의 불순물을 포함할 수 있다.

약학적 조성물 및 투여

화학식 I의 화합물의 결정형 A 또는 이의 결정성 조성물을 유효량으로 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 더욱이, 약학적 조성물은 또한 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 매체를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.

본 발명에 따른 화합물은 순수한 형태 또는 적절한 약학적 조성물 형태로 투여되며, 이는 유사한 용도의 작용제의 임의의 허용가능한 투여 방식으로 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 염을 적합한 약학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 제조될 수 있으며, 예를 들어, 이는 고체, 반-고체, 액체 또는 기체 제형, 예컨대, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 과립제, 연고, 에멀젼, 현탁액, 용액, 좌제, 주사제, 흡입제, 겔, 미소 구체 (microsphere) 또는 에어로졸 등으로 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 종래의 혼합, 용해, 과립화, 당의정 코팅 (dragee coating), 빻기 (levigation), 에멀젼화, 동결-건조등과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적 조성물의 투여를 위한 전형적인 경로 (route)는, 경구, 직장, 점막내 (transmucosal), 장관 투여 또는 국소, 경피, 흡입, 비경구, 설하, 질내, 비강내, 안구내, 복강내, 근육내, 피하, 정맥내 투여를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

바람직한 실시형태에서, 약학적 조성물은 경구 투여 형태이다. 경구 투여에 있어서, 활성 화합물을 당업계에 잘 공지된 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 매체와 혼합하여 약학적 조성물을 제조할 수 있다. 담체, 부형제 및 매체를 사용하여 본 발명에 따른 화합물을 환자에게 경구 투여하기에 유용한 정제, 알약, 구내정 (troche), 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 슬러리, 현탁액으로 제조할 수 있다.

고체 경구 조성물은 종래의 혼합, 충전 또는 압축 방법, 예를 들어, 하기의 방법으로 제조될 수 있다: 활성 화합물을 고체 부형제와 혼합함, 생성된 혼합물을 임의로 분쇄 (milling)함, 필요한 경우 다른 적절한 애주번트 (adjuvant)를 첨가함, 및 이어서, 상기 혼합물을 과립으로 가공하여 정제 또는 당의정의 코어 (core)를 수득함. 적절한 부형제로는, 충전제, 예컨대, 락토오스, 슈크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 비롯한 당; 셀룰로오스 제제, 예컨대, 미정질 셀룰로오스, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분; 및 다른 물질, 예컨대, 실리카 겔, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨 및/또는 폴리비닐피롤리돈; 붕해제 (disintegrant), 예컨대, 카르복시메틸 전분 나트륨, 크로스카르멜로스 나트륨 (croscarmellose sodium), 가교결합된 폴리비닐피롤리돈, 한천 또는 알긴산을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 염, 예컨대, 나트륨 알기네이트가 또한 사용될 수 있다. 당의정의 코어는 일반적으로 약학적 관행에 잘-공지된 방법으로 임의로 코팅, 예컨대, 장용 코팅 (enteric coating) 될 수 있다.

유익한 효과

본 발명에 따른 화학식 I의 화합물의 결정형 A는 고 순도, 고 결정화도 및 우수한 안정성의 이점을 가진다. 반면, 본 발명에 따른 결정형 A의 제조 방법은 간단하며, 용매는 저렴하고 용이하게 수득할 수 있고, 결정형 조건은 엄격하지 않으며, 상기 방법은 산업적 생산에 적합하다.

본 발명의 기술적 해결책이 하기 단락 [1] 내지 [20]에 따라 예시된다:

[1] X-선 분말 회절 패턴에서 2θ=5.5°±0.2°, 10.1°±0.2°, 13.8°±0.2°, 19.7°±0.2°, 23.7°±0.2°, 24.1°±0.2°에서 회절 피크를 갖는 것을 특징으로하는, 화학식 I의 화합물의 결정형 A:

.

[2] X-선 분말 회절 패턴에서 2θ=5.5°±0.2°, 10.1°±0.2°, 13.8°±0.2°, 16.4°±0.2°, 19.7°±0.2°, 23.7°±0.2°, 24.1°±0.2°, 27.9°±0.2°에서 회절 피크를 갖는 것을 특징으로하는, 단락 [1]에 따른 화학식 I의 화합물의 결정형 A.

[3] X-선 분말 회절 패턴에서 2θ=5.5°±0.2°, 10.1°±0.2°, 13.8°±0.2°, 16.4°±0.2°, 17.9°±0.2°, 19.0°±0.2°, 19.7°±0.2°, 20.3°±0.2°, 21.8°±0.2°, 22.1°±0.2°, 23.7°±0.2°, 24.1°±0.2°, 25.5°±0.2°, 27.9°±0.2°, 32.9°±0.2°, 34.0°±0.2°에서 회절 피크를 갖는 것을 특징으로하는, 단락 [2]에 따른 화학식 I의 화합물의 결정형 A.

[4] 도 1에 실질적으로 도시된 X-선 분말 회절 패턴을 갖는 것을 특징으로하는, 단락 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 따른 결정형 A.

[5] 하기의 셀 파라미터를 갖는 것을 특징으로하는, 단락 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 따른 결정형 A:

a = 16.560 (3) Å

b = 10.426 (2) Å

c = 12.203 (2) Å

α= 90°

β = 98.54(3)°

γ = 90°

공간 군:P21/c

Z = 4.

[6] DSC에 의해 특징지어지는 경우, 초기 온도가 199.0 ℃±5 ℃이고 피크 온도가 200.4 ℃±5 ℃인 것을 특징으로하는, 단락 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 따른 결정형 A.

[7] 하기의 단계를 포함하는, 단락 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 결정형 A의 제조 방법:

1) 결정화 용매에 화학식 I의 화합물을 용해시키는 단계로서, 바람직하게는 가열되어 용해를 촉진시키는 것인, 단계; 및

2) 결정화를 위하여 냉각시키고 여과하고 세척하고 건조시켜 상기 결정형 A를 수득하는 단계.

[8] 단계 1)에서의 결정화 용매가 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올, 3차 부탄올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 물 및 이의 혼합 용매로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로하는, 단락 [7]에 따른 제조 방법.

[9] 상기 결정화 용매가 에탄올인 것을 특징으로하는, 단락 [8]에 따른 제조 방법.

[10] 단계 1)에서, 화학식 I의 1 g 당 첨가된 결정화 용매의 양이 2 내지 10 mL인 것을 특징으로하는, 단락 [7] 내지 [9] 중 어느 하나에 따른 제조 방법.

[11] 화학식 I의 화합물의 1 g 당 첨가된 결정화 용매의 양이 4 내지 8 mL인 것을 특징으로하는, 단락 [10]에 따른 제조 방법.

[12] 화학식 I의 화합물의 1 g 당 첨가된 결정화 용매의 양이 5 내지 7 mL인 것을 특징으로하는, 단락 [11]에 따른 제조 방법.

[13] 단계 1)에서, 가열이 사용되어 화학식 I의 화합물 및 결정화 용매의 균질계를 형성시키는 것을 특징으로하는, 단락 [7] 내지 [12] 중 어느 하나에 따른 제조 방법.

[14] 단계 1)에서, 상기 가열 온도가 40 ℃ 내지 90 ℃ 일 수 있는 것을 특징으로하는, 단락 [7] 내지 [13] 중 어느 하나에 따른 제조 방법.

[15] 단계 1)에서, 가열 온도가 50 ℃ 내지 80 ℃ 일 수 있는 것을 특징으로하는, 단락 [14]에 따른 제조 방법.

[16] 단계 1)에서, 가열 온도가 70 ℃ 내지 80 ℃ 일 수 있는 것을 특징으로하는, 단락 [15]에 따른 제조 방법.

[17] 결정성 조성물의 중량을 기준으로, 단락 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 화학식 I의 화합물의 결정형 A가 50% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 95% 이상인 것을 특징으로하는, 결정성 조성물.

[18] 단락 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 결정형 A 또는 단락 [17]에 따른 결정성 조성물을 유효량으로 포함하는, 약학적 조성물.

[19] 톨-유사 수용체 7 (TLR7) 관련 질환 치료용 의약의 제조를 위한, 단락 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 화학식 I의 화합물의 결정형 A 또는 단락 [17]에 따른 결정성 조성물 또는 단락 [18]에 따른 약학적 조성물의 용도.

[20] 상기 질환이 바이러스 감염, 특히 간염 바이러스 감염, 예컨대, B형 간염 또는 C형 간염 바이러스 감염인 것을 특징으로하는, 단락 [19]에 따른 용도.

실시예

하기의 약어가 본원에 사용된다: SEM-Cl: 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸 클로라이드; SEM: 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸; DIPEA: 디이소프로필에틸아민; TFA: 트리플루오로아세트산; DMF: N,N-디메틸포름아미드; n-BuOH: n-부탄올; NH₃·H₂O: 암모니아수 (aqueous ammonia); Na: 나트륨; XRPD: X-선 분말 회절; DSC: 시차열 분석 (differential thermal analysis).

본원에서 사용된 용매는 상업적으로 구매가능하며, 추가의 정제 없이 사용될 수 있다. 제조예에서의 합성 반응은 일반적으로 불활성 질소 대기 하에 무수 용매 중에서 수행된다. 양성자 자기공명 (proton magnetic resonance) 데이터를 Bruker Avance III 400 (400 MHz) 분광계에 기록하고, 화학적 이동을 테트라메틸실란 저 필드 (low field)에서 (ppm)으로 나타냈다. Agilent 1200 plus 6110 (&1956A)에서 질량 분광분석을 수행한다. LC/MS 또는 Shimadzu MS는 DAD: SPD-M20A(LC) 및 Shimadzu Micromass 2020 검출기를 포함한다 질량 분광계는 양성 또는 음성 모드에서 작동되는 전자분무 이온화 (ESI)가 장착된다.

제조예 1:

2-부톡시-7-(4-(피롤리딘-1-일메틸)벤질)-5H-피롤로[3,2-d]피리미딘-4-아민의 제조

화학식 III:

2,4-디클로로-5-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5H-피롤로[3,2-d]피리미딘

화학식 II의 화합물 (2,4-디클로로-5H-피롤로[3,2-d]피리미딘) (4.00 kg, 21.28 mol)을 DMF (20.00 L) 중에 용해시키고, DIPEA (2.58 kg, 20.00 mol)를 실온에서 (25 ℃) 부분적으로 첨가하고, 이어서, 30분 동안 교반하였다. 반응 액체를 얼음 조 (ice bath)를 이용하여 0 ℃로 냉각시키고, 이어서 SEM-Cl (4.00 kg, 24.00 mol)를 초당 1 내지 2 방울의 적하 속도 (dropping rate)로 5시간 동안 서서히 적가하였다. 첨가 후, 반응 액체를 0 ℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응을 HPLC로 모니터링하였다. 완료 후, 반응 액체를 퀀칭하고 (quenched), 70 L의 물로 희석하고, 이어서 에틸 아세테이트 (15 LХ3)로 추출하였다. 배합된 유기 상을 1 M 수성 염산 (5 LХ2) 및 포화 염수 (7 LХ2)로 계속해서 세척하고, 용매를 감압하에 증류로 제거하여 화학식 III의 화합물을 수득하였다 (6.40 kg, 20.11 mol, 수율 94.50 %).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 8.24 - 8.35 (m, 1 H), 6.70 - 6.85 (m, 1 H), 5.77 (s, 2 H), 3.45 - 3.57 (m, 2 H), 0.74 - 0.86 (m, 2 H), 0.00 (s, 9 H).

화학식 IV:

2-클로로-5-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5H-피롤로[3,2-d]피리미딘-4-아민

10 L 클레이브 (clave)에서, 화학식 III의 화합물 (1.60 kg, 5.03 mol)을 이소프로판올 (1.60 L) 중에 용해시켰다. 암모니아수 (4 L)를 실온 (25 ℃)에서 1 부분 (one portion)으로 첨가하고, 반응 혼합물을 95 ℃에서 7시간 동안 교반하였다. 반응을 HPLC로 모니터링하였다. 완료 후, 반응 액체를 실온으로 냉각시키고, 뷰흐너 깔때기 (Buchner funnel)로 여과하여 진한 갈색 고체를 수득하였다. 고체를 연속하여 에틸 아세테이트/n-헵탄 (1/1, 5 LХ2) 및 에틸 아세테이트 (4 L)로 슬러리화하여 (slurried) 화학식 IV의 화합물을 갈색 고체로서 수득하였다 (1.25 kg, 4.18 mol, 수율 83.1 %).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 7.61 - 7.77 (m, 1 H), 6.97 - 7.19 (m, 2 H), 6.28 - 6.38 (m, 1 H), 5.54 - 5.67 (m, 2 H), 3.43 - 3.53 (m, 2 H), 0.76 - 0.91 (m, 2 H), 0.07 (s, 9 H).

화학식 V:

2-부톡시-5-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5H-피롤로[3,2-d]피리미딘-4-아민

질소 하에 금속 나트륨 (525.05 g, 22.84 mol)을 부분으로 n-BuOH (17.0 L)에 서서히 첨가하였다. 첨가 후, 시스템의 온도를 60 ℃로 올리고, 금속 나트륨이 완전히 용해될 때까지 상기 온도에서 지속적으로 교반을 수행하였다. 이어서, 시스템을 25 ℃로 냉각시키고, 화학식 IV의 화합물 (1.95 kg, 6.53 mol)을 부분으로 첨가하였다. 교반하면서 균질하게 혼합한 후, 반응 혼합물을 90 ℃에서 8시간 동안 지속적으로 교반하였다. 반응을 HPLC로 모니터링하였다. 완료 후, 반응 혼합물이 자발적으로 25 ℃로 냉각되고, 이를 30 L의 포화 수성 염화암모늄에 천천히 부었다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (15 LХ3)로 추출하고, 배합된 유기 상을 포화 염수 (20 LХ2)로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시키고 여과하였다. 감압하에 용매를 증류하여 제거한 후, 잔사를 n-헵탄 (4 L) 중에서 슬러리화하고, 고체를 여과로 분리하고, 이어서, 에틸 아세테이트 (5 L) 중에서 슬러리화하여 황화학식 V의 화합물을 백색 고체로서 수득하였다 (1.53 kg, 4.55 mol, 69.7%).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 7.49 - 7.54 (m, 1 H), 6.54 - 6.62 (m, 2 H) , 6.15 - 6.20 (m, 1 H) , 5.54 (s, 2 H) , 4.10 - 4.22 (m, 2 H) , 3.42 - 3.55 (m, 2 H) , 1.58 - 1.73 (m, 2 H) , 1.35 - 1.47 (m, 2 H) , 0.90 - 0.96 (m, 3 H) , 0.83 - 0.89 (m, 2 H) , 0.05 (s, 9 H).

화학식 VI: 2-부톡시-5H-피롤로[3,2-d]피리미딘-4-아민

화학식 V의 화합물 (1.10 kg, 3.27 mol)을 TFA (5.50 L) 중에 용해시키고, 반응 액체를 25 ℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응을 HPLC로 모니터링하였다. 완료 후, TFA를 감압하에 증류로 제거하고, 잔사를 메탄올 (1.2 L) 및 얼음물 (1.2 L) 중에 용해시켰다. 시스템의 pH를 일정한 교반하에 농축된 암모니아수로 12로 조정하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반하고, 지속적으로 용액으로부터 침전물을 침전시켰다. 여과 후, 백색 고체의 여과 케이크 (filter cake)를 15% 암모니아수 (1.2 LХ3) 및 에틸 아세테이트 (4 L)로 계속하여 슬러리화하여, 화학식 VI의 화합물 (550.00 g, 2.67 mol, 81.7%)을 백색 고체로서 수득하였다.

¹H NMR (400 MHz, 메탄올-d ₄) δ 7.37 (d, J=2.89 Hz, 1 H), 6.29 (d, J=3.01 Hz, 1 H), 4.27 (t, J=6.53 Hz, 2 H), 1.75 (d, J=7.91 Hz, 2 H), 1.44 - 1.61 (m, 2 H), 1.00 (t, J=7.40 Hz, 3 H).

화학식 VII:

4-((4-아미노-2-부톡시-5H-피롤로[3,2-d]피리미딘-7-일)-히드록시메틸)벤즈알데히드

3-구 플라스크에 테레프탈알데히드 (terephthalaldehyde)(790.64 mg, 5.82 mmol) 및 이소프로판올 (10 mL)을 첨가하고, 2-부톡시-5H-피롤로[3,2-d]피리미딘-4-아민 (1.00 g, 4.85 mmol)을 교반하면서 첨가하고, 시스템을 0 ℃로 냉각시키고, 또 다른 10분 동안 교반하였다. 정제수 (10 mL) 및 탄산칼륨 (804.17 mg, 5.82 mmol)을 첨가하고, LCMS로 모니터링 하여 원료가 고갈될 때까지, 25 ℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 고체가 침전되었다. 여과 후, 생성된 고체를 20 mL의 정제수 및 30 mL (에틸 아세테이트/n-헵탄=1/20)으로 계속적으로 슬러리화하고, 여과하고, 건조시켜 화학식 VII의 화합물을 황색 고체로서 수득하였다 (1.50 g, 4.41 mmol, 수율 90.9%).

¹H NMR (400 MHz, 메탄올-d ₄ ) δ 9.94 (s, 1 H), 7.86 (d, J = 8.16 Hz, 2 H), 7.72 (d, J = 8.16 Hz, 2 H), 7.12 - 7.17 (m, 1 H), 6.19 (s, 1 H), 4.28 (t, J=6.53 Hz, 2 H), 1.68 - 1.77 (m, 2 H), 1.44 - 1.54 (m, 2 H), 0.97 (t, J=7.34 Hz, 3 H).

화학식 VIII:

(4-아미노-2-부톡시-5H-피롤로[3,2-d]피리미딘-7-일)(4-(피롤리딘-1-일메틸)페닐) 메탄올

화학식 VII의 화합물 (450.0 g, 1.32 mol) 및 이소프로판올 (4.5 L)을 30 L 클레이브에 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 이어서, 빙초산 (119.0 g, 1.98 mol)을 첨가하고, 교반하면서 시스템의 온도를 0 내지 10 ℃로 낮췄다. 10 ℃ 이하의 온도에서 피롤리딘 (112.4 g, 1.58 mol)을 적가하였다. 첨가 후, 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드 (420.0 g, 1.98 mol)를 부분으로 첨가하고, 액체 크로마토그래피로 모니터링하는 경우, 원료가 고갈될 때까지 10 내지 20 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 5 L의 정제수를 첨가하고, 용액의 온도를 -10 ℃로 낮추고, 12 L의 15% 암모니아수를 용액에 첨가하고, 첨가 동안 0 ℃ 이하로 용액의 온도를 유지하였다. 교반하에 고체를 침전시켰다. 여과를 수행하고, 생성된 여과 케이크를 2 L의 물 및 2 LХ2 에틸 아세테이트로 슬러리화하였다. 여과를 수행하고, 감압하 40 ℃에서 12시간 동안 건조를 수행하여, 화학식 VIII의 화합물을 황색 고체로서 수득하였다 (465.0 g, 1.18 mol, 수율 89.4%, 수분 0.9%).

¹H NMR (400 MHz, 메탄올-d ₄ ) δ 7.46 (d, J=7.91 Hz, 1 H), 7.29 (d, J = 8.03 Hz, 1 H), 7.09 (s, 1 H), 6.12 (s, 1 H), 4.29 (t, J = 6.53 Hz, 2 H), 3.60 (s, 2 H), 2.52 (br. s., 4 H), 1.66 - 1.83 (m, 6 H), 1.49 (d, J = 7.53 Hz, 2 H), 0.98 (t, J = 7.40 Hz, 3 H).

화학식 I:

2-부톡시-7-(4-(피롤리딘-1-일메틸)벤질)-5H-피롤로[3,2-d]피리미딘-4-아민

20 L 클레이브에 화학식 VIII의 화합물 (440.0 g, 1.11mol) 및 디클로로메탄 (7.0 L)을 첨가하고, 교반하면서 시스템의 온도를 -15 ℃로 낮췄다. 트리에틸실란 (880 mL, 5.55 mol)을 적가하고, 트리플루오로아세트산 (880 mL)을 적가하고, 첨가 동안 온도를 -10 ℃ 이하로 유지하였다. 첨가 후, 반응을 0 ℃에서 2시간 동안 수행하고, 원료 포인트 (raw material point)가 사라질 때까지 액체 크로마토그래피로 모니터링하였다. 반응 완료 후, 반응 액체를 농축하여 건조시키고, 2.2 L의 에틸 아세테이트를 용액에 첨가하였다. 0 ℃ 이하로 온도를 낮추기 위하여 교반을 수행하였다. 이어서, 포화 탄산나트륨 용액을 첨가하여 용액의 pH를 9 내지 10로 조정하고, 이 동안 시스템 온도를 10 ℃ 이하로 유지시켰다. 여과를 수행하고, 생성된 여과 케이크를 2.2 L의 물로 슬러리화하였다. 여과를 수행하고, 감압하에 건조시켜, 화학식 I의 화합물의 트리플루오로아세테이트 550 g을 백색 고체로서 수득하였다.

백색 고체의 화학식 I의 화합물의 트리플루오로아세테이트 525 g을 1.6 L의 에탄올에 첨가하고, 교반하면서 시스템의 온도를 약 0 ℃로 낮췄다. 이어서, 2.2 L의 1 mol/L 수산화나트륨 용액을 첨가하였다. 여과를 수행하고, 생성된 여과 케이크를 2.5 L의 정제수로 슬러리화하였다. 여과를 수행하고, 감압하에 건조시켜 화학식 I의 화합물의 380.0 g을 고체로서 수득하였다.

¹H NMR (400 MHz, 메탄올-d ₄ ) δ 7.27 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.22 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.04 (s, 1H), 4.32 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.99 (s, 2H), 3.60 (s, 2H), 2.55 - 2.52 (m, 4H), 1.85 - 1.71 (m, 6H), 1.55-1.48 (m, 2H), 1.00 (t, J = 7.4 Hz, 3H).

실시예 1: 2-부톡시-7-(4-(피롤리딘-1-일메틸)벤질)-5H-피롤로[3,2-d]피리미딘-4-아민의 결정형 A의 제조

에탄올 (2.3 L)에 제조예 1에서 수득한 화학식 I의 화합물 (380 g)을 첨가하고, 혼합물을 가열 환류시키고 (heated reflux), 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 여과 후, 여액을 실온으로 냉각시키고, 결정화를 위하여 정치시켰다. 여과를 수행하고, 수득한 여과 케이크를 감압하에 건조시켜 310.0 g의 고체, 즉, 화학식 I의 화합물의 결정형 A를 수득하였다.

XRPD는 하기와 같이 측정하였다: 장치: Bruker D8 ADVANCE X-선 회절계; 방법: 표적: Cu: K-Alpha; 파장 λ=1.54179; 전압: 40 kV; 전류: 40 mA; 스캐닝 범위: 4~40 °; 샘플 회전 속도: 15 rpm; 스캐닝 속도: 10 °/min.

수득한 화합물 결정은 실질적으로 도 1에 도시된 바와 같은 회절 피크를 가졌다.

실시예 2: 고온 안정성 시험

화학식 I의 화합물의 결정형 A를 문헌 [Guidelines for the Stability Test of Pharmaceutical Ingredients and Pharmaceutical Preparations (Chinese Pharmacopoeia 2010 Appendix XIXC)]에 따라 안정성에 대하여 고온 조건 하에서 가속 시험 (accelerated test)으로 시험하였다.

실시예 1에서 제조된 결정형 A를 60 ℃에서 오픈-클린 컨테이너 (open-clean container)에 두었다. 샘플을 취하여 10일, 20일 및 30일에 각각 시험하였다. 결과를 0일에서의 초기 시험 결과와 비교하고, 결과를 표 1에 나타내었다.

샘플링 시간 (일수)	외형	함량 (%)	불순물 총 함량 (%)
0	백색 분말	99.8	0.92
10	담황색 분말	98.5	1.10
20	담황색 분말	98.1	1.18
30	담황색 분말	98.8	1.29

고온 안정성 시험에서, 화학식 I의 화합물의 결정형 A가 고온 조건에서 우수한 안정성을 갖는다는 것이 밝혀졌다.

실시예 3: 고습도 안정성 시험

화학식 I의 화합물의 결정형 A을 문헌 [Guidelines for 0Stability Test of Pharmaceutical Ingredients and Pharmaceutical Preparations (Chinese Pharmacopoeia 2010 Appendix XIXC)]에 따라 안정성에 대하여 고습도 조건 하에서 가속 시험으로 시험하였다.

실시예 1에서 제조된 결정형 A를 각각 40℃/75% 습도 (개방)의 조건하에 일정한 온도 및 습도 용기 (humidity vessel)에서 가속 시험을 수행하였다. 샘플을 취하여 각각 30일, 60일 및 90일에 시험하였다. 결과를 0일에서의 초기 시험 결과와 비교하교, 결과를 표 2에 나타내었다.

시험 조건	샘플링 시간 (일수)	외형	함량 (%)	불순물 총 함량 (%)
40℃/75% 습도 (개방)	0	백색 분말	100.2	0.92
	30	백색 분말	99.9	0.92
	60	백색 분말	99.9	0.65
	90	백색 분말	100.2	0.93

고습도 안정성 시험에서, 화학식 I의 화합물의 결정형 A가 고 습도 조건에서 우수한 안정성을 갖는다는 것이 밝혀졌다.

약학적 활성의 실시예

효능 실시예 1: 톨-유사 수용체 7 및 톨-유사 수용체 8 시험관내 수용체 결합 활성 스크린

시약:

HEK-블루 hTLR7 세포 및 HEK-블루 hTLR8 세포 (InvivoGen에서 구매 가능)

DMEM 배지

열 불활성화된 태아 소 혈청

항 마이코플라즈마 시약 Normocin^TM

블레오마이신

블라스티사이딘

사용된 GS-9620 및 R848의 구조식은 하기와 같으며, 여기서, GS-9620의 제조는 US20100143301에 기재된 공정을 참조할 수 있고; R848은 ABGENT (IMG-2208, 사양: 0.5 mg)로부터 상업적으로 이용가능하였다.

절차:

1. 96-웰 (well) 화합물 플레이트의 제조:

10 mmol/L의 농도로 시작하는 액체 워크 스테이션 (work station) POD를 사용하여 3배로 DMSO로 화합물을 구배 희석 (gradient diluting)하고, 10 포인트 희석하였다 (2번째 컬럼 내지 11번째 컬럼, 및 각 포인트를 중복시켰다). 12번째 컬럼에서, 1 μL의 5 mg/mL 양성 화합물 R848를 양성 대조군으로 첨가하고; 1번째 컬럼에서, 1 μL의 DMSO를 음성 대조군으로 첨가하였다. 각각의 웰은 1 μL의 DMSO를 함유하였다.

2. 배양물 플라스크 속의 세포를 수집하고, 세포 밀도를 250,000 세포/mL로 희석하였다.

3. 200 μL (50,000 개 세포/웰)의 세포 현탁액을 제조된 화합물 플레이트에 첨가하였고, 각각의 웰 중 DMSO의 최종 농도는 0.5% 였다.

4. 세포 및 화합물을 함유하는 배양물 플레이트를 CO₂ 항온처리기에서 24시간 동안 37 ℃, 5%CO₂에서 항온처리하였다.

5. 24시간 항온처리 후, 각각의 웰로부터 20 μL의 상청액을 96-웰 투명 분석 플레이트로 제거하였다. 분석 플레이트의 각각의 웰에 180 μL의 Quanti-Blue 시약을 첨가하고, 플레이트를 항온처리기에서 37 ℃, 5%CO₂에서 1시간 동안 항온처리하였다.

6. 1시간 후, 20 μL의 상청액 중 알칼리성 포스파타아제 성분을 Microplate Reader OD650를 사용하여 측정하였다.

7. 프리즘 소프트웨어 (Prism software)를 사용하여 각 화합물의 EC₅₀ 을 수득하였다.

결과를 표 3에 나타냈다:

화합물 명	TLR7 EC50 (nM)	TLR8 EC50 (nM)
GS-9620	517	7867
화학식 I의 화합물	160	11632

본 발명에 따른 화학식 I의 화합물은, 톨-유사 수용체 7에 대하여 대조군 (톨-유사 수용체 7 작용제 GS-9620) 보다 더 높은 시험관내 수용체 결합 활성을 나타냈으며, 톨-유사 수용체 8에 대하여 대조군 (톨-유사 수용체 7 작용제 GS-9620) 보다 더 낮은 시험관내 수용체 결합 활성을 나타냈다. 본 발명의 화합물은 상이한 수용체에 대하여 명확한 선택성 차이를 가지며, 이의 효과는 종래의 것보다 우수하다.

효능 실시예 2: 말초 혈액 단핵구 세포 시험 절차

본 실시예의 목적은 화학식 I의 화합물로 인간 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 자극한지 24시간 후의 시토카인의 발현 수준을 측정하는 것이다.

세포 상청액을 희석 없이 분석하고, IFN-α의 수준을 직접적으로 측정하였다. 화학식 I의 화합물을 시험 동안 먼저 20 mM DMSO 원액으로 제형화하고, 총 11회 희석 포인트 (diluting point)로 세포 배지를 사용하여 10배로 구배 희석하였다. 9개의 희석 포인트 (가장 높은 농도는 200 μmol/L 이었음)에서의 화합물을 각각의 웰 중 50 μL로 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 새로운 인간 말초 혈액 단핵구 세포를 450,000개의 세포를 함유하는 각각의 웰 중 150 μL로 접종하였다. 세포 배양물 플레이트를 37℃, 5%CO₂ 항온처리기에서 24시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 배양물 플레이트를 1200 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하고, 측정을 위하여 -20℃에 저장하였다. 유세포 분석기 상에 BD-Pharmingen의 Cytometric Bead Array (CBA)를 사용하여 시토카인의 측정을 수행하였다. 상기 측정 방법을 사용하여, 30 pg/mL의 IFN-α 생성물을 자극시키는 가장 낮은 약물 농도를 시토카인 자극 시험에서 MEC 값으로 지정하였다. 결과를 표 4에 나타냈다.

화합물 명	IFN-α MEC(nM)	TNF-α MEC (nM)
GS-9620	50	500
화학식 I의 화합물	5	500

대조군 (GS-9620)과 비교하여, 본 발명의 화학식 I의 화합물은 더 우수한 PBMC의 시험관내 IFN-α 유도 활성 및 필적하는 TNF-α 유도 활성을 나타냈다.

Claims (10)

1. 화학식 I의 화합물의 결정형 A로서:
   

   

   
   X-선 분말 회절 패턴에서 2θ=5.5°±0.2°, 10.1°±0.2°, 13.8°±0.2°, 19.7°±0.2°, 23.7°±0.2°, 24.1°±0.2°에서 회절 피크를 갖는 것을 특징으로하는, 결정형 A.
2. 제1항에 있어서,
   상기 결정형 A가 하기의 셀 파라미터를 갖는 것을 특징으로하는, 결정형 A:
   a = 16.560 (3) Å
   b = 10.426 (2) Å
   c = 12.203 (2) Å
   α = 90°
   β = 98.54(3)°
   γ = 90°
   공간 군 : P21/c
   Z = 4.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   DSC에 의해 특징지어지는 경우, 초기 온도가 199.0 ℃±5 ℃이고, 피크 온도가 200.4 ℃±5 ℃인 것을 특징으로하는, 결정형 A.
4. 하기의 단계를 포함하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화학식 I의 화합물의 결정형 A의 제조 방법:
   1) 결정화 용매 (crystallizing solvent) 중에 화학식 I의 화합물을 용해시키는 단계로서, 바람직하게는 가열되어 용해를 촉진시키는 것인, 단계; 및
   2) 결정화를 위하여 냉각시키고 여과하고 세척하고 건조시켜 상기 결정형 A를 수득하는 단계.
5. 제4항에 있어서,
   단계 1)에서 결정화 용매가 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올, 3차 부탄올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 물 및 이의 혼합 용매로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 바람직하게는 에탄올인 것을 특징으로하는 것인, 제조 방법.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
   단계 1)에서 상기 화학식 I의 화합물의 1 g당 첨가된 결정화 용매의 양이 2 내지 10mL, 바람직하게는 4 내지 8 mL, 보다 바람직하게는 5 내지 7 mL인 것을 특징으로하는, 제조 방법.
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   단계 1)에서 상기 가열 온도가 40 ℃ 내지 90 ℃, 바람직하게는 50 ℃ 내지 80 ℃, 보다 바람직하게는 70 ℃ 내지 80 ℃인 것을 특징으로하는, 제조 방법.
8. 결정성 조성물의 중량을 기준으로, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화학식 I의 화합물의 결정형 A가 50% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 및 가장 바람직하게는 95% 이상인 것을 특징으로하는, 결정성 조성물.
9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화학식 I의 화합물의 결정형 A 또는 제8항에 따른 결정성 조성물 또는 이의 배합물을 유효량으로 포함하는, 약학적 조성물.
10. 톨-유사 수용체 7 관련 질환, 바람직하게는, 바이러스 감염을 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화학식 I의 결정형 A 또는 제8항에 따른 결정성 조성물 또는 제9항에 따른 약학적 조성물의 용도.
    
    
    
    

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