KR20180091218A

KR20180091218A - 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 결합된 나노복합체를 포함하는 유전자 전달체

Info

Publication number: KR20180091218A
Application number: KR1020170016096A
Authority: KR
Inventors: 김진회; 최윤정
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2017-02-06
Filing date: 2017-02-06
Publication date: 2018-08-16

Abstract

본 발명은 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 결합된 나노복합체를 포함하는 유전자 전달체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 결합된 나노복합체는 in vivo및 in vitro 상에서 세포 독성이 없고, 클라트린(clathrin) 및 카베올래(caveolae) 매개의 엔도시토시스를 통한 세포 흡수 및 유전자 전달 효율이 현저하므로 고효율의 유전자 전달체로서 유용하게 사용할 수 있다. 특히, 상기 유전자를 줄기세포로 전달하여 줄기세포 치료에도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 결합된 나노복합체를 포함하는 유전자 전달체{Gene delivery comprising nanocomplex having polyethylenimine and gold nanoparticle}

본 발명은 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 결합된 나노복합체를 포함하는 유전자 전달체에 관한 것이다.

줄기세포 치료는 질환의 진행으로 기능이 저하되었거나 상실된 병변 조직의 세포 회복 및 재생을 통해 조직의 기능회복을 유도하는 치료법을 말한다. 줄기세포는 뛰어난 재생력과 주변 조직으로의 정상적인 분화가 가능한 만능세포이며 배아로부터 분리 배양하는 배아줄기세포 (embryonic stem cell, ESC)와 성체줄기세포 (adult stem cell)로 크게 나눌 수 있다.

성체줄기세포는 ESC와는 달리 성체의 각 조직으로부터 안전한 방법으로 분리 배양할 수 있다. ESC의 경우 윤리적인 문제와 비정상적인 분화와 성장으로 체내 이식 후 기형종 (teratoma)이라는 종양의 생성에 따른 위험성이 따른다. 그러나 성체줄기세포의 경우 윤리적인 문제가 없을 뿐만 아니라 ESC보다 제한적인 분화능이 오히려 생체 이식 후 종양 형성과 같은 부작용이 따르지 않는 장점이 있다.

성체 줄기세포 중 골수와 제대혈로부터 분리 배양하는 줄기세포가 환자치료를 위한 연구에 가장 널리 사용되고 있으나 이식 후 줄기세포의 생존율 및 생착율의 급감으로 인해 줄기세포 치료효과 또한 제한적인 문제점이 대두되고 있다.

줄기세포의 생존율과 생착율을 향상시키기 위하여 관련 유전자의 도입을 통한 개선이 줄기세포 치료효과를 개선시키는 것으로 보고되고 있다. 예를 들어, 줄기세포에 유전자를 도입시키는데 있어 레트로바이러스나 아데노바이러스와 같은 바이러스성 벡터가 이용되어 왔고, 또한 아데노바이러스를 유전자 벡터로 사용하는 종래의 기술을 개량한 바이러스인 헬퍼-의존성 아데노바이러스 벡터를 사용하여 유전자 일부를 제거하고 분화의 유도에 관련하는 변형 유전자를 삽입시켜 ES 세포는 물론 iPS 세포에서도 거의 100%에 가까운 확률로 유전자가 도입된 것을 확인한 바 있다.

하지만 상기와 같은 바이러스성 벡터는 유전자 전달효율이 매우 뛰어난 반면 체내 적용 시 면역반응, 암 유발가능성, 그리고 염증 등 심각한 부작용의 위험이 따른다. 따라서 줄기세포의 유전자전달 후 임상 적용을 위해서는 새로운 안전한 비바이러스성 유전자 전달체의 개발이 필요한 실정이다.

종래 비바이러스성 유전자 벡터를 이용한 기술로서, 대한민국 등록특허 제10-0486878호 "혈관내피세포 특이적 발현 벡터"에는 내피세포 특이적 프로모터를 포함하여 목적 단백질을 내피세포에서 특이적으로 발현하는 벡터로서 내피세포 특이적 비바이러스성 발현 벡터가 개시되어 있고, 대한민국 특허출원 제10-2007-0113499호 "ＤＫＫ1을 포함하는 혈관신생을 억제시키는 방법"에 동물 세포에서 발현될 수 있는 플라스미드를 포함하는 비바이러스성 벡터가 개시되어 있다.

줄기세포 확립과 관련하여 비바이러스성 벡터를 이용한 기술로서, 대한민국 특허출원 제10-2008-0058406호 "비바이러스성 형질전환방법을 이용한 유도 다능성 줄기세포의 확립 방법 및 그 용도"에 유도 다능성 관련 유전자벡터 및 조합된 벡터를 이용하여 유도 다능성 관련 유전자를 폴리머로 코팅된 마그네틱 산화철로 제조된 나노입자를 통해 줄기세포에 도입시키는 방법이 개시되어 있다.

본 발명자들은 유전자 전달 효율이 우수한 유전자 전달체를 제조하기 위해 연구를 거듭한 결과, 폴리에틸렌이민과 금 나노입자가 결합된 나노 복합체가 세포 독성이 적고, 줄기세포에서 유전자 전달 효율이 현저함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 결합된 나노복합체를 포함하는 유전자 전달체를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 결합된 나노복합체를 포함하는 유전자 전달체를 제공하며, 상기 나노복합체는 가지형 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 결합된 형태 또는 선형 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 공유결합된 형태이다.

본 발명에 따른 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 결합된 나노복합체는 세포 독성이 적고, 클라트린(clathrin) 매개의 엔도시토시스를 통한 세포 흡수 및 유전자 전달 효율이 현저하여 고효율의 비바이러스성 유전자 전달체로서 사용될 수 있으며, 특히, 상기 유전자를 줄기세포로 전달하여 줄기세포 치료에도 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 제조된 AuPEINPs의 크기 및 구조를 확인하기 위하여 TEM(transmission electron microscopy) 분석(a) 및 UV-Vis 분광법(b)을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에서 제조된 AuMUAPEINPs의 크기 및 구조를 확인하기 위하여 TEM(transmission electron microscopy) 분석(a) 및 UV-Vis 분광법(b)을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에서 제조된 AuPEINPs 및 AuMUAPEINPs의 표면상의 PEI 및 MUAPEI의 양을 확인하기 위하여 열중량분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에서 제조된 AuPEINPs(a) 및 AuMUAPEINPs(b)의 유전자 플라스미드 결합력을 확인하기 위하여 아가로스겔 지연 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에서 제조된 AuPEINPs(a) 및 AuMUAPEINPs(b)의 유전자 전달 효율을 확인하기 위하여 발광효소 분석(luciferase assay)을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에서 제조된 AuPEINPs-pGL3 및 AuMUAPEINPs-pGL3 나노복합체로 형질주입된 hMSC 세포에 처리한 후 형광표지 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 상기 도 6의 결과를 수치화하여 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명에서 제조된 AuPEINPs-pGL3 및 AuMUAPEINPs-pGL3 나노복합체로 형질주입된 hMSC 세포의 GFP 및 C/EBPB 단백질의 발현을 웨스턴블롯팅을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명에서 제조된 AuPEINPs-pGL3 및 AuMUAPEINPs-pGL3 나노복합체로 형질주입된 hMSC 세포의 세포 생존률을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명에서 제조된 AuPEINPs-pGL3 및 AuMUAPEINPs-pGL3 나노복합체로 형질주입된 hMSC 세포의 지방세포로의 분화 정도를 Oil Red O 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명에서 제조된 AuPEINPs-pGL3 및 AuMUAPEINPs-pGL3 나노복합체로 형질주입된 hMSC 세포에서 C/EBPβ와 C/EBPβ에 의해 발현이 촉진되는 PPARg2와 분화된 지방세포에서 발현하는 AP2 유전자의 발현을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 hMSC 세포 내로 유입되는 AuPEINPs-pGL3 및 AuMUAPEINPs-pGL3 나노복합체를 전자투과현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 hMSC 세포 내로 유입되는 AuPEINPs-pGL3 및 AuMUAPEINPs-pGL3 나노복합체의 양(a)과 유입 효율(b)을 수치화하여 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 AuPEINPs-pGL3 및 AuMUAPEINPs-pGL3 나노복합체의 세포 흡수 기전을 확인하기 위하여 엔도시토시스 저해제 처리 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 AuPEINPs-pGL3 및 AuMUAPEINPs-pGL3 나노복합체의 세포 흡수 기전을 도식화하여 나타낸 도이다.

본 발명은 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 결합된 나노복합체를 포함하는 유전자 전달체를 제공한다.

상기 폴리에틸렌이민은 [-CH₂CH₂NH-]n의 식으로 표시되는 선상 고분자 화합물로서 사슬 중의 각 이미노기는 염화벤조일, 페닐이소티오시아네이트에 대하여 일반 아민과 동일하게 반응한다.

상기 금 나노입자는 금의 입자 크기가 나노미터 단위인 것으로 약 1^-9m 사이즈의 입자를 의미한다. 금 나노입자는 완전한 구 모양이 아니라 불규칙한 모양으로 되어있으며 각각의 모양과 크기에 따라 상태가 다르고 색깔이 다르므로 에너지 갭(gap)을 추측할 수 있다. 크기가 클수록 짧은 파장의 색을 낸다.

본 발명의 나노복합체는 가지형 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 결합된 형태; 또는 선형 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 공유결합된 형태;일 수 있다.

상기 가지형 폴리에틸렌이민은 20 내지 30 kDa일 수 있으며, 바람직하게는 25 kDa일 수 있다.

상기 나노복합체는 5 내지 9 nm의 크기일 수 있다.

본 발명에 있어서 유전자 전달체는 벡터(vector)라고도 하며, 유전자치료 과정에서 환자의 질병세포에 유전자를 전달하여 주는 것을 의미하고, 유전자 치료를 위하여 세포 안에 결손된 유전자를 정상 유전자로 치환하거나, 새 유전자를 집어넣거나, 과잉 또는 과소 작용하는 유전자의 기능을 조절하는데 이용될 수 있는 것을 모두 의미한다.

상기 유전자 전달체는 바람직하게는 비바이러스성 유전자 전달체이다.

상기 유전자 전달체에 결합될 수 있는 치료 유전자의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 바람직하게는 C/EBPβ(CCAAT/enhancer-binding proteinβ) 유전자일 수 있다.

상기 C/EBPβ는 인체의 저항력을 촉진하는 면역 관련 단백질로서, 지방세포의 분화초기에 발현되어 줄기세포가 지방세포로 분화하는데 관여하는 핵심 전사인자이다.

상기 유전자는 본 발명의 목적에 따라원하는 표적에 전달되어 원하는 치료 효과를 발휘할 수 있는 어떠한 형태도 포함될 수 있으며, 예를 들어 gDNA, cDNA, pDNA, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, shRNA, miRNA, DNA-RNA 혼성체 (hybrid), 리보자임 등을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 pDNA일 수 있다.

상기 유전자는 상기 나노복합체와 결합할 수 있으며, 이는 폴리플렉스(polyplex)라고 표현할 수 있다. 상기 나노복합체는 폴리에틸렌이민로서, 유전자와 결합이 잘 이루어지므로, 혈액 환경의 변화 등에 있어서 결합이 깨어지지 않아 목적하는 부위에 유전자를 효과적으로 전달할 수 있다.

본 발명의 나노복합체는 상기 유전자를 줄기세포 내로 전달할 수 있으며, 상기 나노복합체 용액을 줄기세포에 처리함으로써 세포 내로 전달할 수 있다.

상기 줄기세포는 바람직하게는 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSC)일 수 있으며, 상기 유전자가 전달되어 줄기세포가 지방세포로 분화되는 것을 촉진할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

준비예 1. 재료의 준비

염화 금(III) 삼수화물, 가지형 폴리에틸렌이민(25 kDa), 수소화 붕소나트륨(sodium borohydride), 11-머캅토운데칸산(11-mercaptoundecanoic acid), N-히드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide) 및 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, 페니실린-스트렙토마이신 용액, 트립신-EDTA 용액 및 α-MEM은 Life Technologies(GIBCO, Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였으며, 리포펙타민(Lipofectamine 2000) 및 LysoTracker Green DND-L7526은 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. 플라스미드 DNA, pGL3-컨트롤 및 Lucassay 키트는 Promega Corp(Madison, WI, USA)에서 구입하였고, BCA(bicinchoninic acid) 단백질 분석 시스템은 Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)에서 구입하였으며, 면역블롯팅을 위한 항체로서 EGFP(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), C/EBPβ(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA), 베타 액틴(Abcam, Cambridge, MA, USA)를 사용하였다.

준비예 2. 세포의 배양

인간 와튼제대교질(Wharton's jelly)에서 유래 된 간엽 줄기 세포(hMSCs)는 방콕의 줄기세포 회사로부터 구입하였다. MSCs는 습식 대기(5 % CO₂, 37 ℃)에서 10 % 소태아혈청(FBS)과 100 U/ML 페니실린-스트렙토마이신이 공급된 α-MEM(α-modification minimum essential medium)와 함께 배양하였다. 세포 배양 배지는 3 일마다 교환하였으며, 모든 실험은 5회 배양 후의 세포로 수행하였다.

실시예 1. 금 나노입자 및 폴리에틸렌이민이 결합된 나노복합체의 제조

1-1. pEGFP -C/ EBPβ 플라스미드의 제조

인간 대장암 세포인 HCT116(Korean Cell Line Bank로부터 입수)의 게놈 DNA를 주형으로하고, 5'-ctcgagatatgcaacgcctggtggcctgggac-3' 및 5'-ggatccctagcagtggccggaggaggcgag-3'의 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 인간 C/EBPβ의 코딩 영역을 증폭하였다. ~1000 bp 증폭 단편은 T Easy 벡터(Promega, USA)에 클로닝한 후, pEGFP-C1 벡터(Clontech Lab., USA)의 XhoI / BamHI 부위에 서브 클로닝하였다. 이 서열은 디데옥시 서열화 반응(Macrogen, South Korea)을 통해 확인 하였다.

1-2. 시아닌 3( Cyanine 3)-표지된 DNA의 제조

시아닌 3(Cy3)-표지된 876 bp DNA 단편(퓨로 마이신 내성 유전자의 부분 서열)은 5'Cy3-표지된 프라이머(Macrogen, Korea)를 사용한 PCR에 의해 제조하였다. 이때, GTTTGCGTATTGGGCGCTC, TTAGTCGGGGCTCACTCCTACAG 및 pGL4.82 플라스미드(Promega, USA)를 주형으로 사용하고, 필요한 경우, PCR 반응 동안 dCTP 대신 Cy3으로 표지된 dCTP (PerkinElmer, USA)를 사용하여 고도로 표지된 단편을 얻었고, 생성된 PCR 단편을 1.0 % 아가로스겔 전기영동으로 정제하였다.

1-3. 가지형 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자 결합체의 제조( AuPEINPs )

폴리에틸렌 이민(PEI)의 존재하에 수소화 붕소 나트륨 환원법을 사용하여 가지형 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자 결합체(AuPEINP)를 합성하였다. 먼저, 1.4 mM HAuCl4·3H₂O 25 mL와 1 % PEI 1 mL를 혼합하고 실온에서 30분 동안 격렬하게 30분 동안 교반한 후 1 mL의 10 mM NaBH₄ 용액을 첨가하고 밤새 교반하였다. NaBH₄ 용액을 첨가시 HAuCl₄·3H₂O 및 PEI 용액의 황색이 붉은색으로 변하여 금 나노 입자가 형성되었음을 확인하였다. 생성된 AuPEINPs는 과량의 PEI를 제거하기 위해 50 kDa MW 컷오프 멤브레인 필터(2회 반복)를 사용한 원심 분리 여과를 통해 정제하였다.

1-4. 선형 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자 공유결합체의 제조( AuMUAPEINPs )

아미드 결합 형성에 의해 11-머캅토운데칸산-폴리에틸렌 이민 접합체(MUAPEI)를 제조하였다. 먼저, 11-머캅토운데칸산 1 mmol 및 N- 히드록시 숙신이 미드 1 mmol을 실온에서 디메틸 포름아미드 10 mL에 용해시키고, 10 mmol의 디시 클로헥실카르보디이미드를 디메틸 포름아미드를 교반하며 첨가하였다. 몇 시간 후 반응 혼합물로부터 디시클로헥실우레아가 침전되고, 반응 혼합물은 총 12 시간 동안 교반시킨 후, 에틸 아세테이트로 희석시키고, 침전된 디시 클로 헥실 우레아를 여과하여 제거하였다. 이를 브라인으로 세척하고, 에틸아세테이트 층을 무수 Na₂SO₄상에서 건조시켰다. 에틸 아세테이트를 증발시켜 제거하고 수득된 고체를 클로로포름에 용해시켰으며, 다시 여과하여 잔류하는 디시클로헥실우레아를 제거하였다. 그 후 여액을 포화 탄산칼륨 및 브라인으로 3회 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시킨 후, 1-[(11-설파닐운데카노일)옥시] 피롤리딘-2,5-디온(1-[(11-sulfanylundecanoyl)oxy] pyrrolidine-2,5-dione)을 수득하였으며, 그 구조를 질량 분석을 통해 확인하였다.

그 후, 0.04 mmol의 PEI를 10 mL의 테트라 하이드로 퓨란에 용해시키고, 10 mL의 테트라 하이드로 퓨란에 용해된 0.2 mmol의 1-[(11-설파닐운데카노일)옥시] 피롤리딘-2,5-디온에 교반하며 적가하였다. 순간적으로 MUAPEI의 백색 침전물이 형성되었고 12시간 동안 상기 용액을 교반하였다.

원심 분리 후 상기 생성된 고체생성물을 수득하고, THF(tetrahydrofuran)로 세척하여 과량의 반응물을 제거하였다. 용매를 증발시킨 후, 고체 생성물을 25 mL의 물에 재현탁시키고, 0.2 μm 멤브레인 필터를 통해 여과하였다. 여액에 1.4 mM HAuCl₄·3H₂O를 녹이고 실온에서 30분 동안 격렬하게 교반한 후, 1 mL의 10 mM NaBH₄ 용액을 첨가하고 밤새 교반하였다. NaBH₄ 용액을 첨가시 혼합 용액의 황색이 핑크색으로 변하여 금 나노 입자가 형성되었음을 확인하였다. 생성된 AuMUAPEINPs는 과량의 MUAPEI를 제거하기 위해 50 kDa MW 컷오프 멤브레인 필터(2회 반복)를 사용한 원심 분리 여과를 통해 정제하였다.

실시예 2. 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 결합된 나노복합체의 특성 확인

2-1. 가지형 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자 결합체의 구조 및 크기 확인(AuPEINPs)

상기 실시예 1-3에서 합성된 AuPEINPs를 300-kV의 가속 전압에서 JEM-1200EX 현미경을 사용하는 투과 전자 현미경(TEM)과 Optizen POP(Mecasys, South Korea) 기기를 이용하는 UV-Vis 분광법을 수행하여 그 구조 및 크기를 분석하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, AuPEINPs는 약 9-10nm의 입자가 주를 이루는 것을 확인하였다.

2-2. 선형 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자 공유결합체의 구조 및 크기 확인(AuMUAPEINPs)

상기 실시예 1-4에서 합성된 AuMUAPEINPs를 300-kV의 가속 전압에서 JEM-1200EX 현미경을 사용하는 투과 전자 현미경(TEM)과 Optizen POP(Mecasys, South Korea) 기기를 이용하는 UV-Vis 분광법을 수행하여 그 구조 및 크기를 분석하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, AuMUAPEINPs는 약 4-6nm의 입자가 주를 이루는 것을 확인하였다.

2-3. 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자 결합체의 열중량분석 ( TGA )

상기 실시예 1-3 및 1-4에서 합성된 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 결합된 나노복합체의 표면상의 PEI 및 MUAPEI의 양을 확인하기 위하여, 유동 질소 대기 하에서 10 ℃/분의 가열 속도로 열중량분석기(SDT Q600 시스템)를 이용하여 열중량분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

이때, 온도 범위는 27 내지 800℃이고, PEI와 MUAPEI의 그래프팅 밀도는 nm²=(f×Na×d×ρ)/((1-f)×M×6) 당 분자 수를 사용하여 계산하였으며, 여기서 ρ는 구형의 밀도, f는 TGA에 의해 결정된 유기리간드의 중량 분율이고, Na는 아보가드로 상수이고, d는 나노 입자 코어의 직경이고, M은 폴리머 리간드의 분자량이다.

도 3에 나타낸 바와 같이, AuPEAP의 경우, 약 52.5 %의 PEI가 0.42 분자/nm²의 그래프트 밀도로 나노 입자 표면에 부착되었으며, AuMUAPEI의 경우 약 70.2 %의 MUAPEI가 1.62 분자/nm²의 그래프트 밀도로 나노 입자 표면에 부착된 것을 확인하였다. MUAPEI가 리간드 부착의 더 높은 밀도를 나타낸다는 것은 티올 그룹의 존재로 인한 금과의 강한 공유 결합과, 리간드 부착이 가능한 금 나노 입자의 큰 표면적(평균 직경 9 nm)에 기인한 것으로 추정된다.

반면, PEI는 질소에 전자쌍을 사용하여 약한 비공유 상호 작용을 통해 금 표면뿐만 아니라 리간드 부착이 가능한 금 나노입자(평균 직경 5 nm)의 더 작은 표면 영역과 결합할 수 있다.

실험예 1. 나노복합체와 DNA의 결합력 확인

상기 실시예 1에서 제조된 pEGFP-C/EBPβ 플라스미드와 상기 실시예 1-3 또는 1-4에서 합성된 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 결합된 나노복합체의 결합력을 확인하기 위하여 아가로스겔 지연 분석(agarose gel retardation assay)을 수행하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, AuPEINPs와 유전자 플라스미드 결합력(a)은 약 0.58X10¹¹, AuMUAPEINPs와 유전자 플라스미드 결합력(b)은 약 0.18X10¹¹에서 1μg의 DNA와 강하게 결합한다는 것을 확인하였다.

실험예 2. 나노복합체의 유전자 전달 효율 확인

상기 실시예 1-3 또는 1-4에서 합성된 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 결합된 나노복합체의 유전자 전달 효율을 확인하기 위하여 발광효소 분석(luciferase assay)을 수행하였다. 먼저, 인간중간엽줄기세포(human mesenchymal stem cell, hMSC)(5×10⁴ cells/well)를 24-웰에 접종하고 37 ℃의 5 % CO₂ 배양기에서 밤새 배양하였다. 형질주입 실험은 세포가 60-70 %의 confluence에 도달하고 각 웰당 1㎍의 pGL3가 사용되었을 때 수행되었다. 형질주입 전 배지를 FBS 및 항생제가 없는 새로운 α-MEM 400 μL와 교환하였다. 이어서, 상기 세포에 상기 나노입자-pGL3 복합체 용액(AuPEINP-pGL3 또는 AuMUAPEINP-pGL3), 리포펙타민(Lipofectamine)-pGL3, 또는 PEI-pGL3 복합체 용액을 각각 100 μL 첨가하고, 5 % CO₂의 존재하에 37 ℃의 습식 배양기에서 6시간 동안 배양하고, 배지를 10 % FBS 및 항생제를 함유하는 새로운 배지로 교체하여 48시간 동안 배양하였다. 루시페라제 활성은 제조사(Promega)의 프로토콜에 따른 루시페라제 분석을 수행하여 측정하였다. 유전자 전달 효율은 각각의 시료로부터 총 단백질 1 g 당 상대적인 빛 단위(RLU/g)로 표현하였으며, 그 결과를 도 5a 및 도 5b에 나타내었다.

도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, AuPEINPs의 경우 리포펙타민이나 변형, 가공되지 않은 폴리에틸렌이민 단독체보다 3~4배의 유전자 발현을 나타냈으며, AuMUAPEINPs 또한 변형, 가공되지 않은 폴리에틸렌이민 단독체보다 2.5~3.3배의 유전자 발현을 나타냄을 확인하였다. 이는 일반적으로 쓰이는 상업적 상품인 리포펙타민보다 합성한 두 나노복합체가 유전자 전달에 더 효율적임을 의미한다.

또한, 형광 표지인자가 결합된 GFP-C/EBPβ를 사용하여 상기와 동일하게 유전자 전달 실험을 수행 및 형광표지 발현을 비교하고, 그 결과를 수치화하였으며, 그 효율을 각각 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 리포펙타민의 경우보다 두 나노복합체가 더 많은 형광표지 발현을 보이는 것을 확인하였다.

또한, GFP-C/EBPβ로 형질감염 48시간 후 GFP 및 C/EBPB 단백질의 발현을 웨스턴블롯팅을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 리포펙타민의 경우보다 두 나노복합체가 더 많은 단백질을 합성하는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 나노복합체를 통해 더 많은 유전자가 전달됨을 의미한다.

실험예 3. 나노복합체의 세포 독성 실험

상기 실험예 2에서 형질주입된 인간 중간엽줄기세포의 독성을 확인하기 위하여, hMSC 세포(5×10⁴ cell/well)를 96-웰 평평한 바닥 배양 플레이트에 접종하고, 37 ℃의 5 % CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하고, 사용된 배지를 FBS 및 항생제를 포함하지 않는 신선한 α-MEM으로 교체하였다. 48시간 후 상기 세포에 아무것도 처리하지 않은 대조군과 AuPEINPs, AuMUAPEINPs, 리포펙타민 및 미가공, 변이된 PEI 단독체를 처리하고 시간별로 48시간(a), 72시간(b), 90시간(c) 후 Cell Counting Kit-8(CCK-8, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 사용하여 세포 생존률을 측정하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, AuPEINPs 및 AuMUAPEINPs 나노복합체는 PEI 단독체보다 세포 독성이 적으며 AuMUAPEINPs의 경우 리포펙타민보다 세포 독성이 적은 것을 확인하였다.

실험예 4. 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화 확인

C/EBPβ는 지방세포의 분화초기에 발현되어 지방세포의 분화에 관여하는 핵심 전사인자이다. GEP-C/EBPβ 유전자를 연결한 AuPEINPs 및 AuMUAPEINPs를 인간 중간엽줄기세포에 처리하여 유전자를 도입한 후 지방세포로의 분화 정도를 Oil Red O 염색을 통하여 확인하고, 그 결과를 수치화하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

구체적으로, 아무것도 처리하지 않고 일반 배지에서 배양한 군(a)과 그와 동일하지만 지방세포 분화유도 배지에서 키운 군(b), 리포펙타민에 의해 유전자가 도입된 후 지방세포 분화유도 배지에서 배양된 군(c), 1.06X10¹¹,1.33X10¹¹의 입자로 유전자와 같이 처리된 AuPEINPs 군(d,e), 0.35X10¹¹,0.53X10¹¹의 입자로 유전자와 같이 처리된 AuMUAPEINPs 군(f,g)의 사진이며 염색 정도를 수치화하여 나타내었다(h).

또한, 상기 C/EBPβ와 C/EBPβ에 의해 발현이 촉진되는 PPARg2와 분화된 지방세포에서 발현하는 AP2 유전자의 발현정도를 측정하였으며 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 모든 결과에서 AuPEINPs와 AuMUAPEINPs가 리포펙타민보다 높은 수치를 보이는 것을 확인하였다. 이는 리포펙타민보다 두 나노전달체의 유전자 전달 효율이 높으며 그에 따른 지방 분화 역시 높음을 의미한다.

실험예 5. 세포 내 나노복합체의 유입 여부 확인

세포 내 나노복합체의 유입 여부를 확인하기 위하여 인간 중간엽줄기세포에 미처리군(a), AuPEINPs 처리군(b), AuMUAPEINPs 처리군(c)의 세포를 전자투과현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.

또한, 세포 내 나노복합체의 양(a)과 유입 효율(b)을 수치화하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이, 세포 내 나노복합체가 유입되었음을 확인하였다.

실험예 6. 나노복합체의 세포 내 유입 경로 확인

상기 실시예 1-3 또는 1-4에서 합성된 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 결합된 나노 복합체의 세포 내 유입 경로를 확인하기 위하여, Cy3로 표지된 DNA(1 μg/well)를 AuPEINPs 및 AuMUAPEINPs와 각각 혼합하고, FBS 및 항생제가없는 DMEM 배지의 hMSC 세포에 첨가하였으며, 6시간 동안 배양하였다. 그 후 상기 세포를 24-well 배양 접시에 접종하고, 리포좀을 염색하는 LysoTracker Green으로 30분 동안 배양하여 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14에 나타낸 바와 같이, 유전자는 주로 엔도시토시스를 통해 유입이 된다는 것을 확인하였다.

또한, 상기 세포에 엔도시토시스 저해제인 clathrin-매개 endocytosis 저해제인 클로로프로마진(chlorpromazine, CPZ)(클라트린-매개 엔도시토시스 저해제), 메틸-β-시클로덱스트린(methyl-β-cyclodextrin, MBCD)(카베올래-매개 엔도시토시스 저해제), LY294002(미크로피노시토시스 저해제)를 처리하였으며, 그 결과를 도 15a에 나타내었다,

도 15a에 나타낸 바와 같이, 두 나노복합체 모두 CPZ가 처리된 그룹에서 낮은 형광을 띄는 것을 통해 CPZ 처리 그룹에서 나노복합체의 세포 내 유입이 저해됨을 확인하였고, 이는 CPZ가 저해하는 클라트린-매개 엔도시토시스가 주된 나노복합체 유입 경로임을 의미한다. 이를 도 15b에 도식화하여 나타내었다.

상기 결과와 같이, 본 발명의 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 결합된 나노복합체는 세포 독성이 적고, 클라트린(clathrin) 매개의 엔도시토시스를 통한 세포 흡수 및 유전자 전달 효율이 현저하여 고효율의 비바이러스성 유전자 전달체로서 사용될 수 있고, 특히, 상기 유전자를 줄기세포로 전달하여 줄기세포 치료에도 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

Claims

폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 결합된 나노복합체를 포함하는 유전자 전달체.
제1항에 있어서, 상기 나노복합체는 가지형 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 결합된 형태; 또는 선형 폴리에틸렌이민 및 금 나노입자가 공유결합된 형태;인 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
제2항에 있어서, 상기 가지형 폴리에틸렌이민은 25 kDa인 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
제1항에 있어서, 상기 나노복합체는 5 내지 9 nm의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
제1항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 비바이러스성 유전자 전달체인 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
제1항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 유전자와 결합하는 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
제6항에 있어서, 상기 유전자는 C/EBPβ 유전자인 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 유전자는 gDNA, cDNA, pDNA, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, shRNA, miRNA 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
제8항에 있어서, 상기 유전자는 pDNA인 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
제1항에 있어서, 상기 유전자는 줄기세포 내로 전달되는 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
제10항에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSC)인 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.
제10항에 있어서, 상기 유전자는 줄기세포가 지방세포로 분화되는 것을 촉진하는 것을 특징으로 하는, 유전자 전달체.