KR20180063288A - 디지털 계수를 위한 흐름 시스템 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시료 내의 1종 이상의 분석물(analyte)과 같은 물질의 존재를 시험하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는, 개선된 단일 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay: sELISA) 시험뿐만 아니라 단일-효소 결합 분자 분석(single-enzyme linked molecular analysis: SELMA)을 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 적어도 하나의 개구부(유입구/배출구)를 갖는, 분석물을 디지털 계수하기 위한 흐름 시스템을 수반한다. 친수성 및 소수성 패치를 갖는 지지체는 좋기로는 친수성 특징부 상에 고정된 캡쳐 프로브를 품는다. 나노-내지-아토리터 액적은 친수성 특징부 상에 형성된다. 기체상(기체상 씰이라 함)은 액적의 증발을 방지하기/감소시키기 위하여 적용된다.
Description
본 발명은 시료 내의 1종 이상의 분석물(analyte)과 같은 물질의 존재를 시험하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는, 개선된 단일 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay: sELISA) 시험뿐만 아니라 단일-효소 결합 분자 분석(single-enzyme linked molecular analysis: SELMA)을 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다.
과학자들은 생물학적 및 화학적 시스템의 변화를 분석하기 위한 기술을 개발하고 있는데, 이러한 변화는 종종 두개 이상의 상태 사이의 전환과 관련이 있다. 예를 들어, Witters 등은 다양한 디지털 생물 및 화학 기술의 발전에 관해 논의한다 (Digital Biology and Chemistry, DOI: 10.1039/C4LC00248B, (Frontier) Lab on a Chip, 2014, 14, pp. 3225-3232). 이들 디지털 기술은 정성적인 측정으로 정량적인 정보를 얻을 수 있기 때문에, 견고성, 분석 설계, 및 단순성 측면에서 이점을 제공하므로, 효과가 상당히 좋을 수 있다. 그러나, 디지털 기술은 단일 분자를 분리하고 조작하는 일부 기술적 어려움 때문에 비교적 복잡할 수 있다. 예를 들어, 일부 기술은 펨토리터(femtoliter) 부피의 시료를 처리하기 위해 마이크론 크기의 마그네틱 비드(beads)를 사용한다. Rissin 등의 문헌 참조(Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations, DOI:10.1038/nbt.1641, Nature Biotechnology 2010, 28, pp. 595-599). 다른 기술은 심지어 더 작은 부피인 아토리터(attoliters)를 사용한다. 이들 아주 작은 부피는, 작은 부피의 유체 역학은 전형적인 실험실 온도 및 압력에서 거동을 나타내어 처리가 어려워지기 때문에 문제가 될 수 있다.
예를 들어, 대부분의 디지털 검출 기술은 분석물을 함유하는 액체의 마이크로-격실(compartment) 및 다양한 검출-프로브 및 캡쳐-프로브에 의존한다. 분석물 및 검출/캡쳐 프로브는 전형적으로 피코 내지 아토리터 부피의 마이크론 크기의 액적(droplet) 내로 운반되거나 존재한다.
따라서, 시료를 작은 부피로 분할하는 방식은 디지털 검출 처리의 가장 중요한 부분이다. 가장 쉽게 이용할 수 있는 장치 포맷은 시료가 그리로 이송될 수 있는 마이크로-격실 배열체(array)를 형성하는 고체 또는 고분자 기판에 의존한다. 이들 배열체는 주로 두가지 유형이 있다; (i) 마이크로-웰 배열체 및 (ii) 모세관 배열체. 마이크로-웰 배열체에서, 격실은 기판 내의 오목부(recess)에 의해 만들어지는 반면, 모세관 배열체에서 격실은 기판을 통해 완전히 뻗어나가서 관통 구멍(through hole)을 형성한다. 이러한 배열 유형 모두에 내재하는 주요 문제는 시료 및 보조 시약이 로드되는 방식이다. 마이크로-웰 배열체에서, 웰의 미세 치수 때문에 공기가 웰을 떠날 수 없으므로, 오목부는 액체 시료로 쉽게 채워지지 않을 수 있다. 이러한 예로서 Kim 등의 연구 문헌을 참조하라("Large-scale femtoliter droplet array for digital counting of single biomolecules" published in Lab on a Chip, (2012) vol. 12, pp. 4986-4991, DOI: 10.1039/c2lc40632b). 이러한 문제는 모세관 배열체에는 없는데, 그 이유는 각 격실이 2개의 개구부를 가지고 있어서 액체 시표가 상단 개구부로 첨가되면 공기가 하단 개구부로 빠져나갈 수 있기 때문이다. 그러나, 마이크로-웰 또는 모세관 격실 내에 보유된 액체를 다른 액체와 교환하는 경우, 분자의 느린 확산에 의해 야기되는 추가적인 문제가 발생한다. 마이크로-웰 및 모세관 모두는 첨가되는 액체 상의 흐름에 수직으로 위치하기 때문에, 양호한 혼합이 이루어지지 않으면 액체 교환은 벌크 액체로부터 모세관으로의 분자의 확산에 의해서만 일어날 수 있고, 반대의 경우도 마찬가지이다. 결과적으로, 적절한 액체 교환을 보장하기 위해 시간-지연(그 길이는 마이크로-웰/모세관의 크기 및 첨가되는 분자 종의 유형에 의존할 것임)이 적용되어야 할 것이다.
이러한 과제를 극복하기 위하여, 표면장력 배열체라고 하는 세번째 유형의 배열체가 개발되었다. 표면장력 배열체는 평면이고, 소수성 기판 내에(in) 또는 상에(onto) 패턴화된 친수성 특징부(features)로 구성된다. (예컨대, 수성상(aqueous phase)으로의 침지 및 배열체의 회수에 의해) 표면장력 배열체가 수성 시료와 접촉할 경우, 개별 액적은 친수성 특징부와 주변 기판 사이의 표면장력 차이에 의해 친수성 특징부 상에 형성될 수 있다. 액적이 평면 표면에 놓이기 때문에, 액체 시료가 배열체에 도입될 때 액체 로딩뿐만 아니라 액체 교환은 순간적으로(또는 확산-제한 이동보다 적어도 몇 자릿수 빠르게) 이루어질 수 있다. 마이크로-웰 배열체와 달리, 액체 및 친수성 특징부 아래에 공기가 포획될 수 없고, 배열체가 기판의 파인곳/오목부/캐비티에 의존하지 않기 때문에 액적과 벌크 액체 사이의 액체 혼합이 분자 확산으로 제한되지 않는다. 그러나, 세가지 유형의 마이크로-격실 포맷(마이크로-웰, 모세관 및 표면장력 배열체)은 수행될 디지털 계산을 허용하기 위해 충분한 시간 동안 많은 수의 액체 마이크로-액적을 보존하는 과제에 직면해 있다.
실험실의 전형적인 주변 온도 및 압력에서, 이들 마이크로액적(microdroplet)은 수초 내에 증발한다. 예로서, Birdi, K. S., Vu, D. T. 및 Winter, A.의 연구 문헌을 참조하라("A study of the evaporation rates of small water drops placed on a solid surface" published in The Journal of Physical Chemistry, 1989, vol. 93, pp. 3702-3703, DOI: 10.1021/j100346a065).
일단 증발하면, 마이크로액적 내에서 분자를 처리하는 능력이 사라지고, 디지털 기술이 수행될 수 없다.
따라서, 신속한 증발을 방지하고 관심 분자의 존재를 측정하기에 충분한 기간동안 마이크로액적을 유지시킬 필요가 있다.
이를 위해, 과학자들과 엔지니어들은 마이크로액적을 보유하고 있는 격실을 씰링(sealing)하는 특정 기술을 개발해왔다. 이들 씰은 마이크로액적이 주변 환경과 접촉하는 것을 방지하여 증발을 방지한다.
격실을 씰링하기 위한 기술로는 일반적으로 2가지 기술이 있다: 물리적 씰 및 화학적 씰. 격실이 기판 내에 마이크로-오목부 또는 마이크로-캐비티로 구조화되는 경우 물리적 씰이 사용된다. 격실을 물리적으로 씰링하기 위하여, 격실 상단에 기밀 뚜껑이 부착된다. 이러한 방식으로, 개별 격실의 내용물은 증발할 수 없으며, 인접한 격실와 내용물이 교환될 수 없는데, 그렇지 않으면 교차-오염이 발생할 것이다. 물리적 씰링의 단점은 일단 격실이 씰링되면 분석이 끝난다는 것인데, 이는 마이크로-격실의 무결성을 파괴하지 않고는 뚜껑을 쉽게 제거할 수 없기 때문이다. 더구나, 물리적 씰을 적용하기 위해서 격실은 마이크로-웰/-캐비티/-오목부로 구조화되어야 하는데, 이는 느린 분자 확산으로 인하여 초기 준비 단계 중에 격실에서 액체의 교환에 기술적 어려움을 가져온다.
화학적 씰의 한 유형은 격실을 오일(또는 비극성 액체) 상(phase)으로 덮는 것에 의존한다. 이러한 방식으로, 시료의 증발이 감소되는데, 이는 시료에서 물이 오일상(oil phase)으로 천천히 분배되기 때문이다. 화학적 씰의 장점은 계면 장력을 기반으로 하므로, 격실이 캐비티로 구조화될 필요가 없고, 표면 상에 놓인 액적으로 형성될 수 있다는 것이다. 이러한 특징부는 신속한 시약 교환을 가능하게 하는데, 시약 교환은 분자 확산에 한정되지 않고, 새로운 시약이 도입되는 유속으로 결정된다. 더구나, 물리적 씰과 달리, 화학적 씰은 시료로부터 오일상을 흡입함으로써 쉽게 제거될 수 있다. 그러나, 화학적 씰의 단점은 분석물 또는 기타 생체분자가 시료로부터 비극성-상으로 분배될 수 있어, (i) 시료 손실 및/또는 (ii) 액적간 오염을 유발할 수 있다는 것이다. 특히, 단백질과 같은 생체분자는, 주로 단백질 중의 소수성 아미노산이 소수성 계면에 노출되면 스스로 재배치될 수 있다는 사실 때문에, 비극성 액체에서 용해되기 쉽다. 분자가 물에서 비극성-상으로 분배되는 이러한 특성은 분배계수, 즉 오일-물 분배계수, 물-옥탄 분배계수 등으로 설명된다 (예컨대, Lien, E. J. and Ren, S. S. in Chapter 186 in Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Third Edition, 2006, ISBN: 9780849393990). 더구나, 심지어 물은 - 비록 느리긴 하지만 - 주변 오일상으로 분배되는 것으로 나타났다 (예컨대, 문헌 참조: Huebner, A. 등, Lab on a Chip, 2009, vol. 9, pp. 692-698, DOI: 10.1039/B813709A). 또한, 벌크 수성상이 벌크 오일상에 의해 변위될 때 또는 그 반대의 경우, 에멀젼 액적, 즉 마이크론 크기의 오일 중 물(water in oil) 포함 또는 그 반대의 액적이 생성될 위험이 있다. 에멀젼 액적은 표면을 오염시키고 및/또는 장치의 흐름(flow)-성능을 저하시킬 수 있기 때문에, 실험적인 방해가 될 수 있다. "초고감도의 핵산의 농축 및 검출"이라는 제목의 국제공개공보 WO2015061362 A1는 신속한 증발 속도를 나타내는 액적의 비씰링 표면장력 배열체를 제조하는 방법을 기술한다. "패터닝 장치"라는 제목의 국제공개공보 WO2013110146 A2는 액적의 표면장력 배열체를 제조하는 방법 및 화학적 씰 하에 생물검정(bioassays)을 위해 이를 사용하는 방법을 기술한다. "시료 부피의 배분 및 조작을 위한 장치 및 방법"이라는 제목의 국제공개공보 WO2013063230 A1는 디지털 계수(counting) 측정을 포함하는 생물검정을 위하여 화학적 씰링된 표면장력 배열체를 제조 및 사용하는 방법을 기술한다. "인공 지질막을 형성하기 위한 장치 및 방법"이라는 제목의 일본공개공보 JP2014021025A는 지질막으로 화학적으로 씰링된 표면장력 배열체를 제조하는 방법을 기술한다. "유체 시료 중의 분석 분자 또는 입자의 농도의 고감도 결정"이라는 제목의 국제공개공보 WO2010039180 A2는 시료를 물리적으로 씰링된 마이크로-웰 격실로 나눔으로써 분석물을 디지털 계수하는 방법을 기술한다. "시료 부피의 이산화 및 조작을 위한 방법 및 장치"라는 제목의 국제공개공보 WO2010019388 A2는 하나 이상의 비혼화성 액체로 구성된 화학적 씰을 적용함으로써 액체 시료를 캡쳐하고 나누기 위하여 사용될 수 있는 마이크로-웰 격실을 기술한다. "평평한 시료 상에서 분석물을 직접 정량화하기 위한 마이크로웰 배열체"라는 제목의 국제공개공보 WO2012022482 A1는 평평한 기판 상에 함유된 시료를 분석하기 위한 물리적으로 씰링된 마이크로-웰 격실의 사용을 기술한다. "단일 분자 배열체 상에서의 분자의 초고감도 검출"이라는 제목의 미국공개공보 US20100075407 A1는 물리적으로 씰링된 마이크로-웰 격실에서 수행되는 디지털 계수 측정을 기술한다. "디지털 측정을 수행하기 위한 방법 및 시스템"이라는 제목의 국제공개공보 WO2012100198 A2는 액적의 배열체를 제조 및 분석함으로써 수행되는 디지털 계수 측정을 기술한다. "다층 고밀도 마이크로웰"이라는 제목의 미국공개공보 US20130052649 A1는 생물검정을 위한 마이크로-웰 격실의 화학적으로 씰링된 배열체를 기술한다. "마이크로-부피의 액체 반응의 병렬 처리 장치 및 방법"이라는 제목의 국제공개공보 WO2001061054 A2는 생물검정을 수행하기 위한 화학적으로 씰링된 모세관 배열체의 사용을 기술한다. "시험 담체를 충전하는 방법 및 시험 담체"라는 제목의 국제공개공보 WO2014001459 A1는 생물검정을 수행하기 위한 모세관 배열체의 사용을 기술한다. "중합 효소 연쇄 반응을 위한 분석 어셈블리"라는 제목의 국제공개공보 WO1998047003 A1는 올리고 뉴클레오티드의 디지털 계수를 기술한다.
따라서, 분석될 물질을 함유하는 마이크로액적을 보유하는 격실을 씰링하기 위한 개선된 시스템 및 방법이 당업계에 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 첫 번째 측면에서, 소수성 기판 내에 또는 상에 친수성 특징부의 패턴을 갖는 지지체를 포함하는, 시료 중의 1종 이상의 구별되는 분석물을 디지털 계수하기 위한 흐름 시스템이 제공되되, 상기 소수성 기판은 적어도 하나의 개구부를 포함하는 흐름 격실 내에 매립되고(embedded), 상기 친수성 특징부는 복수의 나노 내지 아토리터 액적을 지지하도록 배치된다(configured).
본 발명의 추가적 일 측면에서, 평면의 소수성 기판(16) 내에 또는 상에 평면의 친수성 특징부(14)의 패턴을 갖는 지지체(12)를 포함하는, 시료 중의 1종 이상의 구별되는 분석물을 디지털 계수하기 위한 흐름 시스템(10)이 제공되되, 상기 소수성 기판(16)은 적어도 하나의 개구부(20)를 포함하는 흐름 격실(18) 내에 매립되고, 상기 친수성 특징부(14)는 복수의 나노 내지 아토리터 액적을 지지하도록 배치되고, 1종 이상의 구별되는 분석물에 대한 적어도 1종의 캡쳐 프로브(22)를 포함하고, 캡쳐 프로브(들)(22)는 친수성 특징부(14)에 부착된다.
본 발명의 두 번째 측면에서, 소수성 기판 내에 또는 상에 친수성 특징부의 패턴을 갖는 지지체를 포함하는, 시료 중의 1종 이상의 분석물을 계수하기 위한 흐름 시스템이 제공되되, 상기 소수성 기판은 적어도 하나의 개구부를 포함하는 흐름 격실 내에 매립되고, 상기 친수성 특징부는 각각이 최대 액적 부피를 갖는 복수의 나노 내지 아토리터 액적을 지지하도록 배치되고, 흐름 격실은 각각의 나노 내지 아토리터 액적의 증발을 감소시키는 기체상 씰(gas phase seal)을 지지하도록 배치된다.
본 발명의 추가적 일 측면에서, 소수성 기판(16) 내에 또는 상에 친수성 특징부(14)의 패턴을 갖는 지지체(12)를 포함하는, 시료 중의 1종 이상의 분석물을 계수하기 위한 흐름 시스템(10)이 제공되되, 상기 소수성 기판(16)은 적어도 하나의 개구부(20)를 포함하는 흐름 격실(19) 내에 매립되고, 상기 친수성 특징부(14)는 각각이 최대 액적 부피를 갖는 복수의 나노 내지 아토리터 액적을 지지하도록 배치되고, 흐름 격실(18)은 각각의 나노 내지 아토리터 액적의 증발을 감소시키는 기체상 씰을 지지하도록 배치되고, 여기서 흐름 격실(18)은 부피(V C )를 갖고, 부피(V C )는 모든 나노 내지 아토리터 액적의 합산(aggregate) 최대 액적 부피(V DA ) 보다 크고, 다음 식에 의해 계산된 V MAX 보다 작고:
여기서, ρ L 은 액체의 부피 밀도이고, R은 몰 기체 상수이고, T는 온도이고, RHI는 액체의 기체 성분의 초기 상대 증기 포화도이고, P 0 는 대응 기준 온도 T 0 에서의 액체의 기준 증기압이고, M W 는 액체의 몰 중량이고, ΔH VAP 는 액체의 증발 엔탈피이다.
본 발명의 네 번째 측면에서, 본 발명의 흐름 시스템을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가적 일 측면에서, 적어도 1종 이상의 구별되는 분석물을 디지털 계수하기 위한 본 발명의 흐름 시스템을 이용하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서, 적어도 1종 이상의 구별되는 분석물을 디지털 계수하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 기체상 씰 하의 복수의 나노 내지 아토리터 액적에 함유된 분석물을 계수하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서, 적어도 1종 이상의 구별되는 분석물을 디지털 계수하는데 있어서, 기체상 씰 하의 복수의 나노 내지 아토리터 액적의 용도가 제공된다.
여기서, 복수의 나노 내지 아토리터 액적을 지지하도록 배치된 친수성 특징부의 특징은 특히 친수성 특징부가 제2 친수성 특성을 갖는 물질에 둘러싸인 제1 친수성 특성을 갖는 물질의 패턴을 형성하는 것을 의미할 수 있고, 제1 특성은 제2 특성보다 더 친수성이고, 이는 접촉각이 제1 친수성 특성을 갖는 물질 위의 액적에 대하여 더 작음을 의미한다. 일례에서, 액적은 본질적으로 제1 친수성 특성을 갖는 물질에만 위치하므로, 제2 친수성 특성을 갖는 물질은 소수성인 것으로 간주된다.
증발을 감소시키는 기체상 씰을 지지하도록 배치된 흐름 격실의 특징은 액적들의 부피에 대한 흐름 격실의 부피를 지칭한다. 흐름 격실은 다음 식에 의해 설정된 경계 내에 있는 부피 V C 를 갖는다:
여기서, 상기 부피는 증발을 감소시키는 기체상 씰을 지지하도록 배치된 격실의 정의 내에 있는 것으로 간주된다.
증발을 감소시키는 기체상의 일례는 본질적으로, 상대 습도, 즉 100 pct. 부근의 습도 또는 적어도 90-100 pct. 범위, 예컨대 95-100 pct. 범위의 습도를 증가시킬 수 없는 이의 포화 온도 및 압력에서의 증기일 수 있다. "개구부(opening)"라는 용어는 시표가 소수성 기판 위의 친수성 특징부에 들어가는 입구를 의미한다. 개구는 외부로부터 격실 내로의 동일하거나 상이한 크기의 하나 이상의 유입구(inlets)에 의해 형성될 수 있다.
흐름 격실은 시료가 흐를 수 있고 소수성 기판 상에 친수성 특징부를 수용하는 격실이다. 흐름 격실은 하나 이상의 구별되는 챔버에 의해 형성될 수 있다. 둘 이상의 챔버로 정의될 경우, 챔버는 유체 연결 상태이다.
캡쳐 프로브는 특정 구성요소를 포획할 수 있는 형상이다. 캡쳐 프로브는 예를 들어 PNA 또는 DNA, 예를 들어 단일가닥(single-stranded) PNA 올리고를 기반으로 할 수 있다.
일 구현예에서, 친수성 특징부의 지지체는 흐름 격실 내의 중심에 위치한다. 일례에서, 친수성 특징부의 지지체는 흐름 격실 내에서, 친수성 특징부를 위한 지지체 둘레의 경계를 형성하는 소수성 물질에 의해 둘러싸인다.
본 발명의 전술한 목적 및 다른 목적 및 이점은 첨부된 도면을 참조하여 하기의 상세한 설명으로부터 보다 잘 이해될 것이다.
도 1은 복수의 마이크로액적(26)을 갖는 흐름 격실(18)의 일례를 도시한다. 이 스케치는 비례하여 그려지지 않았다.
도 2는 도 1의 흐름 격실(18)의 단부의 일례를 도시한다. 이 스케치는 비례하여 그려지지 않았다.
도 3은 기체 씰을 형성하는 증기 상을 갖는 흐름 격실(18)의 예시적인 표현이다. 이 스케치는 비례하여 그려지지 않았다.
도 4는 기체상 씰을 생성하기 위하여 흐름 격실로부터 유체를 이동시키는 과정의 예시적인 표현이다. 이는 유도 시스템이 가동할 때 얻은 명시야(brightfield) 현미경 사진에서 발췌한 것이다 (실시예 1-5 참조). 명시야 현미경 사진의 스케일 바는 20 ㎛이다.
도 5는 (i) 평면 형상, (ii) 소수성 기판(16) 내에 오목부로 형상화된 형상 및 (iii) 친수성 영역을 함유하는 오목부가 있는 소수성 기판의 돌출부를 포함하는 형상을 포함하는 친수성 특징부(14)의 예시적 표현이다. 이 스케치는 비례하여 그려지지 않았다.
도 6은 고체 지지체와 접촉하는 액적의 예를 도시한다. 이 예에서, 다음이 나타난다: (i) 기체 분위기에서 소수성 기판 상에 놓인 액적의 접촉각(γ), (ii) 원형의 평면 친수성 특징부의 반경(R D ), (iii) 원형의 평면 친수성 특징부 상에 놓인 액적의 접촉각(α) 및 (iv) 원형의 평면 친수성 특징부에 대한 최대 액적 부피의 기하학적 정의. 이 스케치는 비례하여 그려지지 않았다.
도 7은 소수성 기판에 의해 둘러싸인 평면 친수성 특징부의 패턴을 제조하기 위한 2가지 예시적인 포토리소그래피 기반의 과정을 도시한다. 도시된 단계는 다음을 포함한다:
A - 친수성 웨이퍼 기판을 제공
B2 - 감광성 박막 코팅의 증착; 또는 B1 - 웨이퍼의 균일한 표면 변형
C2 - 코팅의 UV 노출 및 현상; 또는
C1 - 감광성 박막 코팅의 증착, 이어서 C1' - 코팅의 UV 노출 및 현상
D2 - 웨이퍼의 소수성 표면 변형, 또는 D1 - 소수성 층의 선택적 에칭
E - 친수성 특징부의 평면 패턴(F)을 얻기 위하여 박막 코팅을 제거
도 8은 양성(positive) 신호를 나타내는 격실의 수를 분석함으로써, 시료로부터 분석물의 농도가 얻어지는 일반적인 디지털 계수 측정의 일례를 개략적으로 도시한다.
도 9는 평면 소수성 특징부에 기반한 SELMA 과정의 예시적 스케치를 제공한다. 단계 (A)에서 시료의 분석물은 단일 단계에서 친수성 특징부에 위치한 캡쳐 프로브에 결합된다. 단계 (B1)에서, 벌크 액체에 존재하는 캡쳐 프로브(캡쳐 프로브 부분 2)는 시료의 분석물에 결합됨으로써, 단계 (B2)에서 분석물/캡쳐 프로브 부분 2-복합체를 형성한다. 단계 (B3)는 B2에 후속하며, 분석물/캡쳐 프로브 부분 2-복합체가 고체 지지체에 존재하는 캡쳐 프로브(캡쳐 프로브 부분 1)에 결합하는 것을 보여준다. 캡쳐 프로브 부분 1 및 2는 서로 인식하므로, 고체 지지체 상에 캡쳐 프로브 부분 1/캡쳐 프로브 부분 2/분석물-복합체를 형성하여, 친수성 특징부 상에 분석물을 고정시킨다. 단계 (C)에서, 표지제(labelling agents)가 캡쳐 프로브/분석물-복합체에 첨가되어, 캡쳐 프로브/분석물/표지제-복합체를 형성한다. 단계 (D)에서, 캡쳐 프로브/분석물-복합체는 표지제의 제1 부분(표지제 부분 1)에 의해 표지된다. 단계 (E)에서, 캡쳐 프로브/분석물/표지제 부분 1-복합체는 표지제의 제2 부분(표지제 부분 2)에 의해 2차로 표지된다. 단계 (F)에서, 기능성 캡쳐 프로브/분석물/표지제-복합체가 형성되었다. 단계 (G)에서, 액적이 친수성 특징부 표면 상에 형성된다. 액적은 검출제(detection agents)를 함유하고 기체상 씰에 의해 증발로부터 보호된다. 단계 (H)에서, 검출제는 표지제의 처리에 의해 분자 리포터로 전환된다. 이 스케치는 비례하여 그려지지 않았다.
도 10은 예시적인 흐름 시스템의 스케치를 제공한다. 흐름 시스템은 5개의 기능성 요소들을 포함하는 직사각형 슬래브로 구성된다. 각 요소는 숫자로 표시되며 파선 사각형 내에 있다. 요소 1은 흡입을 제공하기 위하여 압력 소스에 연결된 액체 배출구(outlet)이다. 요소 2는 흐름 격실이다. 요소 3은 흐름 격실을 액체 로딩 패드(liquid loading pad)에 연결하는 액체 유입구이다. 요소 4는 액체 시약을 위한 용기 형태의 액체 로딩 패드이다. 요소 5는 소수성 기판에 의해 둘러싸인 친수성 특징부의 패턴을 나타내는 액적 영역이다. 액적 영역은 흐름 격실의 바닥 부분에 위치한다. 이 스케치는 비례하여 그려지지 않았다.
도 11은 증발과 흐름 통로-/액적-/배열체-기하학 사이의 이론적 상관관계의 일례를 도시한다.
(A) 액적 반경 2.5 ㎛, 환산 계수(scaling factor) N = 4 및 φ = 2을 갖는 배열체에 대한 식 17의 플롯. 온도가 높을수록, 및 흐름 통로 높이가 100 ㎛에서 1500 ㎛로 커질 때 증발률이 증가할 것이다. (B) 35℃에서 최대 허용 증발률(θ MAX )의 함수로서 최대 높이(h MAX ) 및 다양한 배열체/액적 기하학에 대한 식 19의 플롯. (C) 높이 100 ㎛, 환산 계수 φ = 2을 나타내고 35℃의 온도에 고정된 흐름 통로에 대한 식 17의 플롯. 인접한 액적 사이의 간격이 클수록(N-값이 클수록) 증발률이 커지고, 액적 크기가 클수록 증발이 감소한다.
도 12는 기체상 씰 하의 증발 저항성 마이크로액적의 일례 및 다양한 흐름 통로 기하학 및 온도에 대한 액적 안정성을 도시한다. 명시야 현미경 사진은 높이 (A) 2000 ㎛, (B) 800 ㎛ 및 (C) 150 ㎛를 나타내는 흐름 통로에서 형성된 액적을 보여준다. 배열체 파라미터는 A-C에서 동일하였는데, 즉 액적 반경 R D = 2.5 ㎛, 초과 배열체 길이 비율(excess-to-array length ratio) φ = 1, 및 배열 피치(array pitch) N = 4 이었다. 3가지 배열체를 동일한 방식으로 제조하였다: 수용액을 주입하고 흐름 통로로부터 회수하였고, 온도는 25℃로 조정하였다. 30분의 평형시간 후, 현미경 사진을 얻었고, 온도를 35℃로 올렸다. 30분의 평형 후에 현미경 사진을 다시 얻었다. 45℃에 대하여 과정을 반복하였다. 패널 A에서 액적은 25℃에서만 명확하게 구별할 수 있다. 더 높은 온도에서는 액적이 증발된다. 패널 B에서, 액적은 25℃ 및 35℃에서 구별할 수 있으나, 액적 직경은 증발로 인하여 줄어들은 것으로 나타났다. 45℃에서 배열체는 증발 및 수증기의 재응축으로 인하여 크게 무너졌는데, 이는 현미경 사진을 얻었을 시점에 흐름 통로/배열체가 열 평형에 도달하지 않았음을 나타낸다. 패널 C에서, 액적은 모든 온도에서 명확하게 구별가능하고, 액적 직경은 대체로 변하지 않은 것으로 나타난다. 스케일 바는 20 ㎛이다.
도 13은 예시적인 흐름 통로(28) 및 흐름 통로 내에 매립된 예시적 마이크로-액적 배열체(30)를 정의하는 파라미터의 예시적 스케치를 제공한다. 이 스케치는 비례하여 그려지지 않았다.
도 14는 1 pM DNA 표적을 함유하는 보정 시료에 대한 대응하는 명시야(i) 및 형광(ii) 현미경 사진의 쌍을 제공한다. 형광 신호는 실시예 4에 기술된 바와 같이 동정되었고, 흰색 원으로 표시되었다. 형광 신호의 위치는 명시야 현미경 사진에 적용되고 검은색 원으로 표시된다. 형광 신호의 위치는 액적의 위치에 대응한다는 것이 명백하다. 스케일 바는 10 ㎛이다.
도 15는 다음 농도의 DNA 표적을 함유하는 시료로부터 대표적인 3개의 형광 현미경 사진을 제공한다; (A) 100 aM, (B) 1 fM 및 (C) 10 fM. 형광 액적의 수를 각 시료에 대하여 계수하였고, 배열체 상에 존재하는 액적의 총 수에 대하여 표준화하여, 형광 액적의 백분율, 즉 양성(positive) 분율을 제공하였다. 양성 분율은 100 aM DNA 표적, 1 fM DNA 표적, 10 fM DNA 표적 뿐만 아니라 DNA를 함유하지 않는 대조군(control) 시료(D)에 대하여 플롯팅되었다. 막대 차트의 값은 각 시료의 5회 검출 실험에서 수집한 평균값을 나타낸다. 오류 막대(error bars)는 동일하게 수행된 5회의 실험에서 양성 분율(positive fraction)의 표준편차를 나타낸다.
도 16은 실시예 5에 개략된 바와 같이 100 aM 표적 DNA를 함유하는 시료의 형광 현미경 사진 시리즈를 제공한다. 이들 중 첫번째 현미경 사진 (i)은 첫번째 탐지 단계 후 얻은 것이고, 두번째 현미경 사진 (ii)는 두번째 탐지 단계 후 동일한 위치에서 얻은 것이고, 세번째 현미경 사진 (iii)은 세번째 탐지 단계 후 동일한 위치에서 얻은 것이다.
도 17은 친수성 특징부(14)의 패턴을 나타내는 지지체(12)를 포함하는, 시료 내의 1종 이상의 분석물을 디지털 계수하기 위한 예시적 흐름 시스템(10)의 단면도이다. 패턴은 소수성 기판(16) 내에 매립되거나, 그 위에 놓이거나, 또는 그것에 의해 둘러싸이고, 개구부(20)를 갖는 흐름 격실(18) 내에 매립된다. 각각의 친수성 특징부는 표면에 부착된 캡쳐 프로브(22)를 갖는다. 지지체는 2개의 영역(24)으로 나누어지고, 각 영역은 특정 유형의 캡쳐 프로브를 제시한다. 이 스케치는 비례하여 그려지지 않았다.
도 2는 도 1의 흐름 격실(18)의 단부의 일례를 도시한다. 이 스케치는 비례하여 그려지지 않았다.
도 3은 기체 씰을 형성하는 증기 상을 갖는 흐름 격실(18)의 예시적인 표현이다. 이 스케치는 비례하여 그려지지 않았다.
도 4는 기체상 씰을 생성하기 위하여 흐름 격실로부터 유체를 이동시키는 과정의 예시적인 표현이다. 이는 유도 시스템이 가동할 때 얻은 명시야(brightfield) 현미경 사진에서 발췌한 것이다 (실시예 1-5 참조). 명시야 현미경 사진의 스케일 바는 20 ㎛이다.
도 5는 (i) 평면 형상, (ii) 소수성 기판(16) 내에 오목부로 형상화된 형상 및 (iii) 친수성 영역을 함유하는 오목부가 있는 소수성 기판의 돌출부를 포함하는 형상을 포함하는 친수성 특징부(14)의 예시적 표현이다. 이 스케치는 비례하여 그려지지 않았다.
도 6은 고체 지지체와 접촉하는 액적의 예를 도시한다. 이 예에서, 다음이 나타난다: (i) 기체 분위기에서 소수성 기판 상에 놓인 액적의 접촉각(γ), (ii) 원형의 평면 친수성 특징부의 반경(R D ), (iii) 원형의 평면 친수성 특징부 상에 놓인 액적의 접촉각(α) 및 (iv) 원형의 평면 친수성 특징부에 대한 최대 액적 부피의 기하학적 정의. 이 스케치는 비례하여 그려지지 않았다.
도 7은 소수성 기판에 의해 둘러싸인 평면 친수성 특징부의 패턴을 제조하기 위한 2가지 예시적인 포토리소그래피 기반의 과정을 도시한다. 도시된 단계는 다음을 포함한다:
A - 친수성 웨이퍼 기판을 제공
B2 - 감광성 박막 코팅의 증착; 또는 B1 - 웨이퍼의 균일한 표면 변형
C2 - 코팅의 UV 노출 및 현상; 또는
C1 - 감광성 박막 코팅의 증착, 이어서 C1' - 코팅의 UV 노출 및 현상
D2 - 웨이퍼의 소수성 표면 변형, 또는 D1 - 소수성 층의 선택적 에칭
E - 친수성 특징부의 평면 패턴(F)을 얻기 위하여 박막 코팅을 제거
도 8은 양성(positive) 신호를 나타내는 격실의 수를 분석함으로써, 시료로부터 분석물의 농도가 얻어지는 일반적인 디지털 계수 측정의 일례를 개략적으로 도시한다.
도 9는 평면 소수성 특징부에 기반한 SELMA 과정의 예시적 스케치를 제공한다. 단계 (A)에서 시료의 분석물은 단일 단계에서 친수성 특징부에 위치한 캡쳐 프로브에 결합된다. 단계 (B1)에서, 벌크 액체에 존재하는 캡쳐 프로브(캡쳐 프로브 부분 2)는 시료의 분석물에 결합됨으로써, 단계 (B2)에서 분석물/캡쳐 프로브 부분 2-복합체를 형성한다. 단계 (B3)는 B2에 후속하며, 분석물/캡쳐 프로브 부분 2-복합체가 고체 지지체에 존재하는 캡쳐 프로브(캡쳐 프로브 부분 1)에 결합하는 것을 보여준다. 캡쳐 프로브 부분 1 및 2는 서로 인식하므로, 고체 지지체 상에 캡쳐 프로브 부분 1/캡쳐 프로브 부분 2/분석물-복합체를 형성하여, 친수성 특징부 상에 분석물을 고정시킨다. 단계 (C)에서, 표지제(labelling agents)가 캡쳐 프로브/분석물-복합체에 첨가되어, 캡쳐 프로브/분석물/표지제-복합체를 형성한다. 단계 (D)에서, 캡쳐 프로브/분석물-복합체는 표지제의 제1 부분(표지제 부분 1)에 의해 표지된다. 단계 (E)에서, 캡쳐 프로브/분석물/표지제 부분 1-복합체는 표지제의 제2 부분(표지제 부분 2)에 의해 2차로 표지된다. 단계 (F)에서, 기능성 캡쳐 프로브/분석물/표지제-복합체가 형성되었다. 단계 (G)에서, 액적이 친수성 특징부 표면 상에 형성된다. 액적은 검출제(detection agents)를 함유하고 기체상 씰에 의해 증발로부터 보호된다. 단계 (H)에서, 검출제는 표지제의 처리에 의해 분자 리포터로 전환된다. 이 스케치는 비례하여 그려지지 않았다.
도 10은 예시적인 흐름 시스템의 스케치를 제공한다. 흐름 시스템은 5개의 기능성 요소들을 포함하는 직사각형 슬래브로 구성된다. 각 요소는 숫자로 표시되며 파선 사각형 내에 있다. 요소 1은 흡입을 제공하기 위하여 압력 소스에 연결된 액체 배출구(outlet)이다. 요소 2는 흐름 격실이다. 요소 3은 흐름 격실을 액체 로딩 패드(liquid loading pad)에 연결하는 액체 유입구이다. 요소 4는 액체 시약을 위한 용기 형태의 액체 로딩 패드이다. 요소 5는 소수성 기판에 의해 둘러싸인 친수성 특징부의 패턴을 나타내는 액적 영역이다. 액적 영역은 흐름 격실의 바닥 부분에 위치한다. 이 스케치는 비례하여 그려지지 않았다.
도 11은 증발과 흐름 통로-/액적-/배열체-기하학 사이의 이론적 상관관계의 일례를 도시한다.
(A) 액적 반경 2.5 ㎛, 환산 계수(scaling factor) N = 4 및 φ = 2을 갖는 배열체에 대한 식 17의 플롯. 온도가 높을수록, 및 흐름 통로 높이가 100 ㎛에서 1500 ㎛로 커질 때 증발률이 증가할 것이다. (B) 35℃에서 최대 허용 증발률(θ MAX )의 함수로서 최대 높이(h MAX ) 및 다양한 배열체/액적 기하학에 대한 식 19의 플롯. (C) 높이 100 ㎛, 환산 계수 φ = 2을 나타내고 35℃의 온도에 고정된 흐름 통로에 대한 식 17의 플롯. 인접한 액적 사이의 간격이 클수록(N-값이 클수록) 증발률이 커지고, 액적 크기가 클수록 증발이 감소한다.
도 12는 기체상 씰 하의 증발 저항성 마이크로액적의 일례 및 다양한 흐름 통로 기하학 및 온도에 대한 액적 안정성을 도시한다. 명시야 현미경 사진은 높이 (A) 2000 ㎛, (B) 800 ㎛ 및 (C) 150 ㎛를 나타내는 흐름 통로에서 형성된 액적을 보여준다. 배열체 파라미터는 A-C에서 동일하였는데, 즉 액적 반경 R D = 2.5 ㎛, 초과 배열체 길이 비율(excess-to-array length ratio) φ = 1, 및 배열 피치(array pitch) N = 4 이었다. 3가지 배열체를 동일한 방식으로 제조하였다: 수용액을 주입하고 흐름 통로로부터 회수하였고, 온도는 25℃로 조정하였다. 30분의 평형시간 후, 현미경 사진을 얻었고, 온도를 35℃로 올렸다. 30분의 평형 후에 현미경 사진을 다시 얻었다. 45℃에 대하여 과정을 반복하였다. 패널 A에서 액적은 25℃에서만 명확하게 구별할 수 있다. 더 높은 온도에서는 액적이 증발된다. 패널 B에서, 액적은 25℃ 및 35℃에서 구별할 수 있으나, 액적 직경은 증발로 인하여 줄어들은 것으로 나타났다. 45℃에서 배열체는 증발 및 수증기의 재응축으로 인하여 크게 무너졌는데, 이는 현미경 사진을 얻었을 시점에 흐름 통로/배열체가 열 평형에 도달하지 않았음을 나타낸다. 패널 C에서, 액적은 모든 온도에서 명확하게 구별가능하고, 액적 직경은 대체로 변하지 않은 것으로 나타난다. 스케일 바는 20 ㎛이다.
도 13은 예시적인 흐름 통로(28) 및 흐름 통로 내에 매립된 예시적 마이크로-액적 배열체(30)를 정의하는 파라미터의 예시적 스케치를 제공한다. 이 스케치는 비례하여 그려지지 않았다.
도 14는 1 pM DNA 표적을 함유하는 보정 시료에 대한 대응하는 명시야(i) 및 형광(ii) 현미경 사진의 쌍을 제공한다. 형광 신호는 실시예 4에 기술된 바와 같이 동정되었고, 흰색 원으로 표시되었다. 형광 신호의 위치는 명시야 현미경 사진에 적용되고 검은색 원으로 표시된다. 형광 신호의 위치는 액적의 위치에 대응한다는 것이 명백하다. 스케일 바는 10 ㎛이다.
도 15는 다음 농도의 DNA 표적을 함유하는 시료로부터 대표적인 3개의 형광 현미경 사진을 제공한다; (A) 100 aM, (B) 1 fM 및 (C) 10 fM. 형광 액적의 수를 각 시료에 대하여 계수하였고, 배열체 상에 존재하는 액적의 총 수에 대하여 표준화하여, 형광 액적의 백분율, 즉 양성(positive) 분율을 제공하였다. 양성 분율은 100 aM DNA 표적, 1 fM DNA 표적, 10 fM DNA 표적 뿐만 아니라 DNA를 함유하지 않는 대조군(control) 시료(D)에 대하여 플롯팅되었다. 막대 차트의 값은 각 시료의 5회 검출 실험에서 수집한 평균값을 나타낸다. 오류 막대(error bars)는 동일하게 수행된 5회의 실험에서 양성 분율(positive fraction)의 표준편차를 나타낸다.
도 16은 실시예 5에 개략된 바와 같이 100 aM 표적 DNA를 함유하는 시료의 형광 현미경 사진 시리즈를 제공한다. 이들 중 첫번째 현미경 사진 (i)은 첫번째 탐지 단계 후 얻은 것이고, 두번째 현미경 사진 (ii)는 두번째 탐지 단계 후 동일한 위치에서 얻은 것이고, 세번째 현미경 사진 (iii)은 세번째 탐지 단계 후 동일한 위치에서 얻은 것이다.
도 17은 친수성 특징부(14)의 패턴을 나타내는 지지체(12)를 포함하는, 시료 내의 1종 이상의 분석물을 디지털 계수하기 위한 예시적 흐름 시스템(10)의 단면도이다. 패턴은 소수성 기판(16) 내에 매립되거나, 그 위에 놓이거나, 또는 그것에 의해 둘러싸이고, 개구부(20)를 갖는 흐름 격실(18) 내에 매립된다. 각각의 친수성 특징부는 표면에 부착된 캡쳐 프로브(22)를 갖는다. 지지체는 2개의 영역(24)으로 나누어지고, 각 영역은 특정 유형의 캡쳐 프로브를 제시한다. 이 스케치는 비례하여 그려지지 않았다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 시스템 및 방법은 마이크로액적을 위한 개선된 씰을 제공하고, 그 결과 기체상 씰을 제공한다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 시스템 및 방법은 복수의 액적을 지지하기 위한 표면을 갖는 통로 형태의 흐름 격실을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같이, 통로 형태의 흐름 격실은 마이크로액적을 지지하는 표면에 연장되는 표면을 갖고, 통로 유형의 흐름 격실이 흐름 격실의 양측에 하나씩 2개의 개구부를 갖도록 벽을 포함한다. 일 구현예에서, 통로는 각 개구부가 사각형(square)이 되도록 사각형의 단면을 갖는 직사각형이다. 다른 구현예에서, 흐름 격실은 원통형이고 각 개구부는 원형이다. 이들 구현예 모두에서, 마이크로액적은, 예를 들어 배열체 내에서, 서로 이격되고, 흐름 격실 내의 중심에 위치한다. 일 구현예에서, 중심에 위치한 마이크로액적은 각 개구부로부터 길이(L E ) 만큼 이격되어 있다. 일 구현예에서, 흐름 격실의 높이(h)는 마이크로액적 내에 함유된 유체의 합산 부피, 흐름 격실을 접촉하는 주변 환경의 온도 및 압력 및 길이(L E )에 부분적으로 기반하여 선택된다. 일 구현예에서, 높이(h)는 마이크로액적이 증발되는 속도를 감소시키는 흐름 격실 내 증기압을 생성하도록 선택된다. 이론에 구애됨 없이, 마이크로액적이 증발하면, 증발에 의한 증기는 기체상 씰을 생성하고, 이는 마이크로액적이 일반적으로 주변 환경에 노출될 경우 경험하게 되는 속도에 비해, 증발이 일어나는 속도를 감소시킨다. 일 실시에서, 수용액에 있어서, 물의 특정 분율이 기체상으로 증발될 것임이 이해된다. 그러나, 증발의 정도는 (i) 정확한 흐름 통로의 깊이 및 기하학적 구조, (ii) 정확한 액적 부피 및 (iii) 정확한 마이크로액적 배열체 기하학적 구조를 선택함으로써 예측되거나 합리적으로 제어될 수 있다. 파라미터를 옳게 선택하면, 마이크로액적은 흐름 통로 내의 증기압에 의해, 따라서 높은 습도에 의해 증발하지 않을 것이다. 이는 액체상으로 흐름 격실을 덮는 대신, 화학적 씰과 유사한 기체상 씰을 제공하여, 마이크로액적은 가스상, 예컨대 공기 내에 유지된다. 액체상과 비교할 때 기체상의 장점은 많은 커다란 생체분자(단백질, DNA, 지질 등)는 끓는점이 물에 비해 상당히 높기 때문에 공기로 분배되지 않는다는 것이다. 화학적 씰과 달리, 가스상 씰은 오일상을 제거할 필요 없이 시약을 배열체에 쉽게 도입하도록 허용한다.
흐름 격실이 마이크로액적을 표면장력에 의해 평면 기판 상에 놓여 제자리에 고정하고 흐름 통로에 통합시키는 구현예에 있어서, 기체상 씰은 배열체를 액체와 접촉하게 한 후 액체를 회수함으로써 만들어질 수 있다. 액체 회수시, 배열체는 마이크로액적을 보유할 것이고, 흐름 통로는 예를 들어 공기로 채워질 것이므로, 기체상 씰이 만들어진다. 따라서, 본원에 기술된 시스템 및 방법은, 다른 것들 중에서도, 흐름 통로 내에 매립된 표면장력 기반의 마이크로액적 배열체를 제공하며, 여기서 흐름 통로의 기하학적 구조는 증발을 특정 분율 미만으로, 예를 들어 5% 미만으로 감소시키도록, 배열체의 기하학적 구조와 일치시킨다(match).
정의
본 발명의 맥락에서, "디지털 계수(digital counting)"라 함은 시료의 특정 성분을 제한 농도로 격실에 분할함으로써 격실의 수가 특정 시료 성분의 수보다 크도록 하는 분석을 지칭한다. 이러한 방식으로, 각 격실이 비어 있는지(값 0) 또는 로딩되어 있는지(값 1)에 따라 2진의(binary)/디지털 값이 지정될 수 있다. 이와 관련하여, 로딩됨이라 함은 격실이 적어도 하나의 특정 시료 성분을 함유하는 것을 의미하는 반면, 비어 있음이라 함은 격실에 특정 시료 성분이 전혀 함유되지 않음을 의미한다. 디지털 계수는 로딩된 및 비어있는 격실의 수가, 특정 시료 성분 자체로부터 또는 특성 시료 성분의 존재와 커플링된 보조 검출 시약으로부터 생성되는 특정 신호를 기반으로 평가될 때 수행된다.
본 발명의 맥락에서, "디지털 계수 측정"이라 함은 앞서 정의한 바와 같은 디지털 계수를 의미하지만, 디지털 계수 결과를 수학적 처리 또는 보정하는 것, 예컨대 전체 격실에 존재하는 특정 시료 성분의 절대 개수를 추론하는 것을 더 포함한다. 이는 다음을 포함할 수 있다: (i) 로딩된 격실이 동일한 시료 성분의 1, 2, 또는 3개 등의 복제(copies)를 함유할 수 있다는 사실을 설명하는 것, 또는 (ii) 로딩된 격실이 신호 생성 과정에서 불완성으로 인하여 비어있음 및 그 반대로 잘못 분류될 수 있다는 사실을 설명하는 것. 디지털 계수 측정의 예로는 디지털 중합효소 연쇄반응(dPCR), 단일 효소면역측정법(sELISA) 또는 디지털 단일 효소면역측정법(dELISA)을 들 수 있다. 디지털 계수 측정 과정의 개요가 도 8에 나타나 있다.
I본 발명의 맥락에서, "SELMA"라는 용어는 단일 효소 단일-효소 결합 분자 분석(single-enzyme linked molecular analysis)의 약어로 사용되며, 디지털 계수 측정의 특정 유형이다. SELMA에서 디지털 계수 측정은, 액적 격실이 패턴으로 조직되고 특정 시료 성분이 격실 내에서 고정/포획되는 흐름 시스템에서 수행된다. 이러한 방식으로, 시료 성분은 손실 없이 여러 반응 단계를 거칠 수 있는데, 각 반응 단계는 침지 및 흐름 시스템으로부터 용액 또는 시약의 회수로 구성된다. 예시적인 SELMA-과정의 개요는 도 9에 제공된다.
본 발명의 맥락에서, "친수성 특징부"라 함은 다른 물질 특성들의 집합을 갖는 고체 기판에 의해 둘러싸인 또는 지지된 제1 물질 특성들의 집합을 갖는 구조체를 의미한다. 구조체 및 고체 기판의 물질 특성은 고체 기판 보다 습윤성이 있도록 조정되어야 한다. 다시 말해, 구조체를 구성하는 물질은 고체 기판에 비해 물과의 접촉각이 더 작아야 한다. 구조체는 화학적 및/또는 물리적 수단에 의해 정의될 수 있다. 가능한 구조체의 비제한적 집합은 다음을 포함한다: (i) 주변 기판 보다 더 친수성 물질로 구성된 폐쇄된 평면 영역 및 (ii) 주변 기판에 형성된 오목부, 돌출부 또는 이들의 조합으로서, 여기서 하나 이상의 측면은 주변 기판 보다 친수성 물질로 구성된다. 예시적인 친수성 특징부의 개요가 도 5에 제공된다. SELMA와 관련하여, 친수성 특징부는 예를 들어, 분석물 포획을 위한 구별되는 화학적 기능을 제공하고, 신호 생성 및 검출을 위한 액적의 패턴을 제공함으로써, 디지털 계수 측정에 적절한 반응 격실을 제시하도록 조작될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "평면 친수성 특징부"라 함은 소수성 기판이 평면이고, 소수성 기판 내에 매립된 친수성 특징부가 평면인 설계를 의미한다. 평탄성의 이상적인 경우는 도 5에 그려져 있지만, 실제 응용에 있어서 평탄성은 표면 거칠기와 관련하여 정의되어야 한다. 예를 들어, 소수성 기판 및 친수성 특징부는 서로 상이한 물질로 형성될 수 있기 때문에, 소수성 영역과 친수성 영역 사이에 높이의 미세한 차이가 있을 수 있다. 일 구현예에서, 평면으로 간주되는 친수성 특징부에 대한 적절한 기준은 소수성 영역과 친수성 영역 사이에 높이 차이( Δh)(대안적으로, 표면 거칠기)가 특유의 특징부 크기와 비교하여 무시해도 될 정도이어야 한다. 반경 R D 를 갖는 원형 친수성 특징부의 경우, 기준은 R D >> Δh일 수 있다. 일 구현예에서, Δh-값이 20 nm을 나타내는 특징부는 평면인 것으로 간주된다.
본 발명의 맥락에서, "접촉각"이라는 용어는 액체/증기/고체 계면에서 측정된 특유의 각도를 지칭한다. 기체상 내에서 액적이 고체 표면에 도포되는 경우, 접촉각은 액체/증기 계면이 고체 표면과 만나는 선 상의 한 점에서 액체를 통해 측정된다. 이 각은 문헌에서 정의된 바와 같이, 고체 표면과 액체 계면의 접선 사이에서 측정된다 (W.C. Bigelow, D.L. Pickett and W.A.J. Zisman in "Oleophobic monolayers I: Films adsorbed from solution in non-polar liquids" published in Journal of Colloid Science, vol. 1, pp. 513-538 (1946), DOI: 10.1016/0095-8522(46)90059-1). 예시적인 접촉각의 개요는 도 6에 제공된다.
본 발명의 맥락에서, "RH"라는 용어는 액체의 기체 성분의 상대 증기 포화도"를 의미하는데, 이는 "상대 습도"라는 용어의 일반화이다. 상대 습도는 물의 부분 증기압(P W ) 대 대기 중 포화 압력( P SAT ) 사이의 비율, 즉 RH = P W / P SAT 로 정의된다. 포화 압력은 액체 물과의 열 평형에서 수증기에 의해 가해지는 분압으로 정의된다. RH-값은 물 이외의 다른 액체를 포함하는 것으로 일반화될 수 있다. 이 경우, RH는 여전히 P W / P SAT 와 동일하지만, P W 는 주어진 액체의 기체 성분에 의해 가해지는 분압으로 이해되어야 하고, P SAT 는 주어진 액체와의 열 평형 상태에서 기체 성분에 의해 가해지는 분압으로 이해되어야 한다. 분압은 기체상이 여러 개의 기체 종으로 구성된 경우를 지칭한다. 따라서, RH는 대응하는 기체상의 증기 포화 수준의 지표로 간주될 수 있다. 이는 RH = 0인 경우, 기체상이 액체의 다른 기체 성분을 함유하지 않는 것이고, RH = 1인 경우, 기체상은 액체의 기체 성분의 최대 가능 함량을 차지한 것이다.
본 발명의 맥락에서, "RHI" 라는 용어는 "액체의 기체 성분의 초기 상대 증기 포화도"를 의미한다. "액체의 기체 성분의 초기 상대 증기 포화도"가 적용되면, 이는 변화가 곧 일어나려는 상황을 나타내므로, 아직 열 평형이 이루어지지 않았음을 나타낸다. 예를 들어, 특유의 포화 압력 P SAT 를 갖는 액체 1이, 액체 1의 기체 성분의 분압이 P1인 폐쇄된 환경에 놓이면, 그리고 P1<PSAT 이면, 액체는 증발할 것이다. 따라서, 액체의 기체 성분의 초기 상대 증기 포화도는 어떤 변화기 일어나기 전에 계산되므로, RHI = P 1 / P SAT 이다. 그러나, 일단 액체 1의 증발이 시작되면, RH-값은 RHI-값으로부터, (i) RH = 1, 즉 기체 상이 포화되거나, (ii) 모든 액체가 증발할 때까지, 점진적으로 증가할 것이다.
본 발명의 맥락에서, "최대 액적 부피"라 함은 최적의 조건 하에 준비되는 경우 단일 친수성 특징부가 지지할 수 있는 가장 큰 액체 부피를 의미한다. 액적으로부터 액체의 증발과 관련하여, 증발된 액체의 부피 분율은 최대 액적 부피에 대하여 계산된다. 평면 원형 친수성 특징부의 예시적인 최대 액적 부피의 개요는 도 6에 제공된다.
본 발명의 맥락에서, "합산(aggregate) 최대 액적 부피"라는 용어는 복수의 액적을 함유하는 패턴의 최대 액적 부피를 모두 더함으로써 얻어지는 부피의 합을 지칭한다. 패턴으로부터 액체의 증발과 관련하여, 증발된 액체의 부피 분율은 합산 최대 액적 부피에 대하여 계산된다.
본 발명의 맥락에서, "시료"라는 용어는 생물학적 또는 화학적 물질의 집합을 지칭하며, 이는 실험실 처리를 거쳤을 수도 있고 아닐 수도 있다. 시료는 액체 또는 고체 형태일 수 있으며, 디지털 계수를 위한 입력의 역할을 하는 특정 성분을 함유할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "분석물"이라는 용어는 디지털 계수 측정에 활용될 수 있는 특정 시료 성분을 의미한다. 분석물은 생물학적 또는 분자적 성질을 갖고, (i) 잔여 시료 물질로부터 분리되고 및/또는 (ii) 디지털 계수 과정 중에 구별되게 조작될 것이다.
본 발명의 맥락에서, "캡쳐 프로브"라는 용어는 예컨대 분석물을 반응 격실에 보유 및/또는 한정하기 위하여, 분석물의 특정 영역을 인식하고 그에 결합할 수 있는 분자적 성질의 화학적 또는 생물학적 제제이다.
본 발명의 맥락에서, "표지제"라는 용어는 분석물의 특정 영역을 인식하고 그에 결합할 수 있는 분자적 성질의 화학적 또는 생물학적 제제이다. 표지제의 결합 영역은 캡쳐 프로브의 결합 영역과 다르므로, 디지털 계수 측정 중에, 캡쳐 프로브/분석물/표지제-복합체가 만들어질 수 있다. 또한, 하나 이상의 분석물-결합 양상(analyte-binding modality)과는 달리, 표지제는 하나 이상의 검출-양상(detection modality)을 포함한다. 또한, 표지제라는 용어는 하나 이상의 제제를 지칭할 수 있는데, 이들이 함께 조합될 경우, 분석물-결합 양상 및 검출 양상을 제공한다.
본 발명의 맥락에서, "검출 양상(detection modality)"이라는 용어는 검출기에 의해 검출가능한 신호의 생성을 매개(mediate)할 수 있는 생화학적, 화학적, 생물학적 또는 물리적 모이어티를 지칭한다. 신호는 사실상 광학적, 전기적 또는 자기적일 수 있다. 또한, 검출 양상은 신호 생성을 달성하기 위하여 검출제에 의존할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "검출제(detection agent)"라는 용어는 통상적으로 분자적 성질의 화합물로서, 호환가능한(compatible) 검출 양상에 의해 접촉될 경우 화학적 또는 물리적 상태를 변화시킬 수 있는 화합물을 지칭한다. 검출제의 상태 변화는 기록되어 적절한 검출기에 의해 신호로 변환될 수 있다. 또한, 상태 변화를 겪은 검출제는 리포터 분자 또는 분자 리포터로 지칭될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "검출가능한 농도" 또는 "최소 검출가능한 농도"는 적절한 검출기에 의해 검출가능한, 반응 격실에 한정된 분자 리포터의 가장 낮은 농도를 지칭한다. 농도를 검출가능하도록 하기 위하여, 분자 리포터로부터 생성된 신호는 검출기의 노이즈(noise) 수준의 신호를 초과하여야 한다. 일반적으로, 분자 리포터의 농도가 높을수록 검출기에 의해 기록되는 것과 같은 대응하는 높은 신호를 생성하는 경향이 있다.
본 발명의 특정
구현예들
본 발명은 소수성 기판 내에 또는 상에 친수성 특징부의 패턴을 갖는 지지체를 포함하는, 시료 중의 1종 이상의 구별되는 분석물을 디지털 계수하기 위한 흐름 시스템을 개시하며, 상기 소수성 기판은 적어도 하나의 개구부를 포함하는 흐름 격실 내에 매립되고, 상기 친수성 특징부는 복수의 나노 내지 아토리터 액적을 지지하도록 배치된다. 일 구현예에서, 흐름 격실은 각각의 나노 내지 아토리터 액적의 증발을 감소시키는 기체상 씰을 지지하도록 배치된다. 일 구현예에서, 기체상 씰은 각각의 나노 내지 아토리터 액적의 증발을 최대 액적 부피의 50 퍼센트 미만으로 감소시킨다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 흐름 시스템은 소수성 기판 내에 또는 상에 친수성 특징부의 패턴을 제공하는 액적 영역을 포함하여, 증발 저항성 기체상 씰링된 나노 내지 아토리터 액적의 형성을 가능하게 한다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 흐름 시스템은 액적 영역을 오버레이하는 하나 이상의 흐름 격실, 예컨대 흐름 통로를 포함하여, 액체가 친수성/소수성 패턴에 접촉가능하게 한다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 흐름 시스템은 흐름 격실 및 액적 영역에 액체 및 시약을 공급하기 위한 액체 로딩 패드를 포함한다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 흐름 시스템은 흐름 격실을 액체 로딩 패드에 연결시키는 액체 유입구를 포함한다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 흐름 시스템은, 흡입을 제공하는 압력 소스에 흐름 격실을 연결시키는 액체 배출구를 포함함으로써, 흐름 격실을 통하여 액체 작동(liquid actuation)을 매개한다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 흐름 시스템은 단일 분자 디지털 계수 장치로서 기능하기 위한 적어도 5개의 구별되는 요소들을 포함한다 (도 10 참조).
이들은 다음과 같다:
ㆍ 증발 저항성 기체상 씰링된 나노 내지 아토리터 액적의 형성을 가능하게 하는, 소수성 기판에 의해 둘러싸인 친수성 특징부의 패턴을 제공하는 액적 영역
ㆍ 액체가 친수성/소수성 패턴에 접촉할 수 있게 하는, 액적 영역을 오버레이하는 하나 이상의 흐름 격실.
ㆍ 흐름 격실에 액체 및 시약을 공급하기 위한 액체 로딩 패드
ㆍ 흐름 격실을 액체 로딩 패드에 연결시키는 액체 유입구
ㆍ 흡입을 제공함으로써 흐름 격실을 통해 액체 작동을 매개하기 위한, 압력 소스에 흐름 격실을 연결시키는 액체 배출구.
전술한 5개의 특징은 액체가 유입구로부터 배출구로의 압력 강하에 의해 흐름 격실을 통과하는 예시적 흐름 시스템을 정의한다. 흡입을 적용하는 대신에, 로딩 패드 내의 액체 시약은 흐름 통로를 통해 밀려날 수 있다. 이는 로딩 패드가 일측이 압력 소스에 연결되고 다른 측이 액체 유입구에 연결될 것을 요구할 것이다. 이 경우, 액체 배출구는 압력 소스에 연결될 필요가 없다. 액체 흐름을 작동시키는 대안적 수단은 압력 소스가 필요없는 중력에 의한 것, 또는 흐름 통로 내에 전극이 매립되어야 하는 유전 영동(dielectrophoretic) 작동에 의한 것일 수 있다. 본원에 개시된 일 구현예에서, 액체 작동은 흡입 구동이다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 유사한 기능적 흐름 시스템이 다수의 상이한 접근법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 비제한적으로 다음이 포함된다:
1. 컴퓨터 수치 제어(computer numeric controlled: CNC) 밀링, 사출 성형, 핫 엠보싱 또는 3D 인쇄를 사용하여 고체 기판 내에 흐름 격실을 제조함.
2. CNC 밀링, 사출 성형, 핫 엠보싱 또는 3D 인쇄와 호환되는 모든 고체 기판의 적용함.
3. 하나 이상의 구성 요소로부터 흐름 시스템을 제조한 후, 원하는 기하학적 구조 또는 기능을 달성하도록 구성 요소들을 결합시킴. 결합 기술은 압력감지 접착 필름, 액체 접착제의 스프레이 코팅, 열 접착, 초음파 용접 또는 레이저 용접을 포함한다. 결합 대신에 개별 구성 요소는 기계적으로, 전자기계적으로 또는 자기적으로 클램핑되어 최종 조립체를 제조할 수 있다. 마이크로유체 응용에 활용되는 결합 및 제조 방법의 개요에 대하여 다음 문헌 참조(Temiz, Y., Lovchik, R., Kaigala, G. V. and Delamarche, E. in "Lab-on-a-chip devices: How to close and plug the lab" published in Microelectronics Engineering, vol. 132, pp. 156-175 (2015) (DOI: 10.1016/j.mee.2014.10.013).
본원에 개시된 바와 같이, 기판 상의 친수성 특징부는 각각 최대 액적 부피를 갖는 복수의 나노 내지 아토리터 액적을 지지하도록 배치된다. 친수성 표면은 최대 액적 부피를 갖는 액적을 보유할 수 있는 것이면 어떤 유형도 가능하다. 즉, 최대 부피의 액적이 친수성 특징부 상에 남아있는 한, 친수성 특징부는 그러한 액적을 지지하도록 배치된 것이다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 액적 영역은 소수성 매질로 둘러싸인 친수성 특징부의 패턴으로 구성된다. 이 구현예에서, 친수성 특징부의 기하학적 구조, 액체의 물리적/화학적 특성 및 소수성 기판은 단일 특징부가 보유할 수 있는 최대 액적 부피를 결정하여, 액체가 주변 소수성 매질을 접촉하지 않도록 한다. 실험적으로 최대 액적 부피를 결정하는 한 가지 방법은 초기에 건조된 친수성 특징부 상에 증가된 양의 액체를 도포(deposit)하는 것이다. 액체 도포는 자동화된 마이크로-디스펜서의 도움으로, 또는 마이크로 크기의 특징부의 경우에는 압전-작동 마이크로-매니퓰레이터의 도움으로 수행할 수 있지만, 증발이 일어날 수 없도록 습윤 챔버 내에서 수행되어야 한다. 또한, 현미경의 도움으로, 도포된 액적의 종적(footprint)을 측정할 수 있다. 결과적으로, 측정된 종적이 친수성 특징부에 의해 정의된 둘레(perimeter)를 넘어가면, 최대 액적 부피에 도달하고 초과한 상태이다.
실험적 접근과 별개로, 최대 액적 부피는 간단한 이론적 모델로부터 추정될 수도 있다. 이 경우, 친수성 특징부는 반경 R D 를 갖는 원형이고, 액체는 소수성 매질을 접촉할 때 접촉각 γ를 나타내며, 액적은 평면 상에 놓인다고 가정한다 (도 5-6 참조). 또한, 액적은, 중력이 액적의 형태에 크게 영향을 미치지 않도록 충분히 작다고 가정한다. 액체가 친수성 특징부 상에 도포되면, 액체는 둘레로 퍼져서 접촉각 α를 형성할 것이다. 접촉각 α는 각도로 정의되고, 액적 표면에 대한 접선은 둘레에서 평면 친수성 표면과 함께 형성된다. 액적의 부피가 증가할수록, α도 증가하지만, 특정 지점까지만이다. α가 γ를 초과하면, 액적이 소수성 매질에 퍼져서 친수성 둘레를 지나치는 것이 훨씬 더 유리해질 것이다. 결과적으로, 최대 액적 부피에서 α가 γ와 같고, 부피(V D )는 다음과 같이 캡이 있는(capped) 구(sphere)의 기하학적 설명으로부터 얻어질 수 있다:
γ-값이 90°에 충분히 가깝다면, 식 1은 액적을 반구형 캡으로 가정하여 V D -값을 
으로 나타냄으로써 더 단순화시킬 수 있다. 이와 달리, 친구성 특징부가 반경 R D 및 깊이 d를 갖는 원형 캐비티 형태일 경우, 최대 부피는 캐비티 부피 
을 식 1에 더함으로써 구한다.
일 구현예에서, 친수성 특징부는 나노 내지 아토리터 액적을 지지하도록 배치되고, 액체는 소수성 기판 상의 접촉각이 90도 이상 150도 이하이다. 일 구현예에서, 친수성 특징부는 0.1 ㎛ 이상 100 ㎛ 이하의 반경(R D )을 갖는 나노 내지 아토리터 액적을 지지하도록 배치된다.
소수성 매질로 둘러싸인 친수성 특징부의 배열체를 제조하기 위하여 여러 가지 접근법이 이용될 수 있지만, 가장 쉽게 적용할 수 있는 것은 포토리소그래피를 수반한다. 포토리소그래피는 마이크론 크기의 화학적 및/또는 물리적 구조체를 정밀하게 제조할 수 있고, 감광성 박막을 갖는 평평한 웨이퍼 기판의 코팅에 의존한다. 후속 단계에서, 박막은 의도된 패턴을 제공하는 포토마스크를 통한 고강도 자외선에의 노출에 의해 선택적으로 제거된다. 예시적인 제조 과정의 개요가 도 7에 제공된다. 그러나, UV 포토리소그래피의 광학 해상도로 인해, 0.1 ㎛ 미만의 특징부를 정밀하게 제조하는 것은 기술적으로 어렵다. 패턴화된 친수성 특징부가 평면의 원형이고, R D -값이 0.1 ㎛인 경우, 식 1에 따르면, 대응하는 최대 액적 부피는 90°의 γ-값에 대해 V D = 2.9 아토리터이고, 150°의 γ-값에 대해 V D = 33.1 아토리터이다.
0.1 ㎛까지 낮은 R D- 값을 나타내는 친수성 특징부는 고밀도 배열체를 허용하는데, 이는 단일 분자 디지털 계수와 관련하여, (i) 확장된 동적 범위 및 (ii) 더 신속한 검출 시간으로 변환된다.
확장된 동적 범위는, 디지털 계수에 있어, 측정에 존재하는 많은 수의 액적 격실이 신호의 선형성을 결정한다는 사실 때문이다. 모든 액적 격실이 신호를 생성할 때까지, 즉 배열체가 포화되면, 신호는 선형인 것으로 간주된다. 예를 들어, 0.1 ㎛의 R D -값 및 0.4 ㎛의 특징부 사이(inter-feature) 간격을 갖는 10 mm x 10 mm의 일반적인 직사각형 배열체는 6억2천5백만 액적을 수용하므로, 약 8 자릿수에 걸친 선형 동적 범위를 나타낸다.
더 신속한 검출 시간은, 디지털 계수에 있어, 분자 리포터가 보통 효소 또는 효소적으로 커플링된 시스템에 의해 생성된다는 사실 때문이다. 이 구현예에서, 단일 효소는 비-형광/비-화학발광/비-비색 분자를 형광/발광/흡광 분자(분자 리포터)로 반복적으로 전환시킴으로써 신호를 생성한다. 리포터 분자의 최소 검출 농도는 액적 부피에 의존하며; 효소 회전율이 일정하다고 가정할 때, 상기 부피가 작을수록 상기 농도에 더 빨리 도달한다.
한편, 나노리터 범위에서 큰 부피를 나타내는 액적(예를 들어, R D -값이 100 ㎛인 원형 평면 친수성 특징부는 90°의 γ-값에 대해 2.1 나노리터의 최대 부피를 갖고, 150°의 γ-값에 대해 33.1 나노리터의 최대 부피를 갖는다)은 다음 상황에서 유리하다: (i) 큰 동적 범위가 필요하지 않을 경우, 예를 들어, 분석물 농도가 너무 낮아 배열체를 포화시키지 못할 것으로 예상되는 경우, 또는 (ii) 서브-나노리터 액적을 이미징 센서에 의해 분석할 수 없는 경우.
대안적으로, 나노리터 부피의 액적은 측정 전에, 큰 생물학적 개체, 예컨대 세포, 세포 단편, 바이러스 입자, 소포, 세포기관 등을 배열 및 조직하는데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 친수성 기판은 유리, 친수성 폴리머 또는 금속 산화물 화합물이다.
친수성 기판의 주요 요구사항은 액체가 그 위에서 소수성 기판에서 보다 작은 접촉각을 형성해야 한다는 것이다. 또한, 기판은 좋기로는 마이크로 제조법, 예컨대 포토리소그래피, 소프트 리소그래피 또는 마이크로임프린팅에 적합해야 한다. 이산화규소 및 이의 순수한 및 도핑된 변이체는 포토리소그래피를 위한 잘 특성화된 기판의 역할을 할 뿐만 아니라 다수의 화학적 및 생화학적 표면 기능화 프로토콜이 가능하므로, 목적에 적절한 선택이다. 예를 들어, 시판되는 광범위한 실란 화합물이 있는데(예컨대, Gelest Inc.에서 출판된 "실란 커플링제, 버전 3.0" 참조), 이는 이산화규소 표면의 직접적인 유도체화에 사용될 수 있다. 실란처리(silanization)는 이산화규소와 같이 표면에 실라놀기를 나타내는 물질에 가장 효율적이지만, 다른 많은 물질이 이 과정에 적합할 수 있다. 이들은 비제한적으로, 알루미늄, 알루미노-실리케이트, 규소, 구리, 주석, 탈크, 무기산화물(예컨대, 산화 제1철, 산화티타늄, 산화크롬), 강철, 철, 니켈 및 아연을 포함한다.
기판의 실란 유도체화시, 새로운 화학적 기능성이 물질에 도입되므로, 액체는 기능화(functionalization) 이후 기판 상에서 변화된 접촉각을 나타낼 수 있다. 이러한 이유로, 유리와 같은 초기 친수성 기판은 친수성 실란 모이어티, 예컨대 플루오로카본 실란에 의해 기능화됨으로써 소수성으로 될 수 있다. 대안적으로, 초기에 약간 친수성인 기판은 고도로 친수성인 실란 모이어티, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜) 실란에 의해 기능화됨으로써 더욱더 친수성으로 될 수 있다. 이는 당업자에게 잘 알려져 있으므로, 이 문헌에서 언급된 액체/고체 접촉각은 초기 기판 물질의 표면 개질 이후에 얻어진 액체/고체 접촉각만을 의미한다.
무기 기판의 실란-유도체화는 새로운 화학적 기능성을 기판에 도입하는 많은 방법들 중 오직 하나에 해당한다. 다른 접근법은 예컨대 자기 조립 단일층을 생성하기 위해, 금 기판에 모노티올화 화합물을 흡착하는 것을 포함한다. 플라스틱과 같은 소프트 유기 기판에 적절한 또 다른 접근법은 플라즈마 중합으로서, 원하는 화학 중합체의 박막은 대응하는 모노머의 플라즈마로부터 플라스틱 표면 상에 증착된다.
친수성 특징부의 배치(configuration)는 다음 중 적어도 하나에 관한 것일 수 있다:
ㆍ 친수성 특징부를 구성하는 물질의 친수성;
ㆍ 소수성 기판을 구성하는 물질의 소수성;
ㆍ 특징부의 면적; 및
ㆍ 특징부의 두께
일 구현예에서, 최대 액적 부피는 식 1에 의해 계산된 바와 같은 V D 이다. 따라서, 친수성 특징부는 이 부피의 액적이 각각의 친수성 특징부에 보유될 수 있도록 제공될 수 있다.
최대 액적 부피로부터 개별 친수성 특징부의 특정 배치를 얻는 방법의 예로서 다음 단계들이 수행될 수 있다:
1. 먼저, 적용하기에 적절한 액적 부피를 선택한다. 액적 부피에 관한 전술한 내용 참조.
2. 다음으로, 본 발명에 적용되는 액체에 대하여 고체/액체 접촉각 γ을 얻는다.
3. 다음으로, 친수성 특징부의 원하는 기하학적 형태, 즉, 원형, 사각형, 육각형 등을 결정한다. 형태는 패턴을 생성하기 위하여 적용되는 제조 방법에 의존하기 쉽다.
4. 단계 3의 특정 형태의 둘레 길이와 대응 최대 액적 부피 사이의 관계를 계산한다. 원형의 경우, 관계는 식 1로 주어진다. 다른 기하학적 형태에 있어서, 관계는 식 1의 유도에 대해 설명한 바와 비슷한 방식으로 유도되어야 할 것이다.
5. 단계 4의 관계로부터, 선택된 액적 부피에 대응하는 둘레 길이를 얻는다. 원형의 경우, R D 에 대하여 식 1을 풀면 충분하다.
추가적 일 구현예에서, 친수성 특징부의 패턴이 존재하는 흐름 격실의 배치는 마이크론 크기의 액적의 증발을 감소시키기 위한 기능적 기체상 씰을 제공하기 위하여 결정될 필요가 있다. 예를 들어, 아로리터 수성 액적이 대기 조건에서 기판 상에 도포되면, 높은 표면/부피 비율로 인하여 수초만에 증발할 것이다. 결과적으로, 액적 함량이 측정될 필요가 있는 응용에서, 액적은 오랜 기간 동안 안정해야 하므로, 증발이 크게 감소되거나 완전히 방지되어야 한다.
본원에 개시된 추가적 일 구현예에서, 친수성 특징부의 패턴을 수용하는 흐름 격실이 있으며, 친수성 특징부는 전술한 특정 최대 부피의 액적을 지지하도록 배치되고, 흐름 격실은 부피 V C 및 친수성 패턴이 품은 액적의 최대 도달가능한 합산 부피 V DA 로 표시된다. 패턴이 동일한 최대 액적 부피(V D )를 나타내는 다수의 액적(N D )을 수용하는 경우, V DA = V D ㆍ N D 이다. 패턴이 다양한 크기의 액적을 수용하는 경우, 대응 V DA -값은 다음과 같이 주어진다:
여기서, V D,i 는 i번째 액적의 최대 부피이다. 결과적으로, 액체의 대응 몰 양(n DA )은 다음과 같다:
여기서, M W 는 액체의 몰 중량이고, ρ L 은 액체의 밀도이다. 모든 액적이 완전히 증발되는 경우, 증발된 증기가 이상 기체로 거동한다고 가정하면, 얻어진 증기는 흐름 격실 내에 다음과 같이 주어진 대응 증기압(P VAP )을 생성할 것이다:
여기서, R은 몰 기체 상수이고, T는 온도이다. 그러나, 완전한 액적 증발은 V C >> V DA 일 경우에만 가능한데, 이는 이 경우, 완전한 액적 증발에 의해 생성되는 증기의 양은 흐름 격실의 초기 증기압을 크게 변화시키지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 흐름 격실 부피가 V DA ,에 근접할 경우, 포화 증기압(P SAT )이 성립될 때까지 액적 증기는 흐름 격실 내 압력을 증가시킬 것이다.
일단 P SAT 에 도달하면, 추가 증발이 불가능하다. P SAT -값, 즉 열역학적 평형 상태에서 액체의 기체-성분에 의해 가해지는 증기압은 Clausius-Clapeyron 식에 의해 다음과 같이 주어진다:
여기서, ΔH VAP 는 액체의 증발 엔탈피이고, P 0 는 대응 기준 온도 T 0 에서 액체의 기준 증기압이다. 결과적으로, 증발할 수 있는 액체의 최대 허용 몰 양(n VAP )은 다음과 같은 이상 기체 방정식으로부터 얻을 수 있다:
n VAP ≥ n DA 인 경우, 완전한 액적 증발이 일어난다. 최대 흐름 격실 부피(V MAX ), 즉 액적이 완전히 증발하지 않는 최대 가능 흐름 격실 부피에 대한 표현은 다음과 같이 얻을 수 있다:
결과적으로, 기능적이고 장기간 안정한 액적 패턴을 수용할 수 있는 흐름 격실은 V C < V MAX 이 되도록 배치되어야 한다.
식 7에서의 표현은 평형 상태를 나타낸다. 평형에 이르는 경로는 다양하지만 다음과 같이 설명될 수 있다; (i) 친수성 특징부의 패턴이 액체와 접촉하여 액체의 패턴을 형성하고, 각각의 액적은 초기에 최대 가능 부피를 나타낸다, (ii) 흐름 격실 내에 포화 압력이 성립될 때까지 액체는 액적으로부터 증발될 것이다, (iii) 증발로 인해 이제 감소된 부피를 갖는 액적은 안정하게 남아있다.
중요하게, 패턴은 기능적 기체상 씰을 생성하기 위한 적절한 방식으로 액체와 접촉할 필요가 있다. 예를 들어, 패턴을 가로질러 액체 플러그를 작동시킴으로써, 액체 마이크로 액적을 친수성 특징부에 도포한다. 일단 액체 플러그가 배열체 상에 모든 특징부를 접촉하면, 폐쇄 환경을 제공하기 위하여 액체 유입구 및 배출구를 막는다. 이는 다양한 방법으로, 예를 들어 (i) 액체 유입구 및 배출구에 밸브를 설치함으로써, 또는 (ii) 제1 액체 플러그 다음에 제2 액체 플러그가 뒤따르도록 액체 흐름을 동기화(synchronizing)시켜서, 제1 액체 플러그가 액체 배출구를 향해 작동한 후 정지하고, 제2 액체 플러그가 액체 유입구를 향해 작동하여, 유입구 및 배출구를 액체로 막음으로써, 달성될 수 있다. 이러한 방식으로 액적으로부터 증발된 액체는 흐름 격실 내에 포화 압력을 성립하므로, 증발 저항성이 생길 것이다. 이는 실시예 1 및 2에서 예시된다.
또한, 식 7 및 아래 논의에서, 흐름 시스템이 준비되는 기체상은 친수성 특징부가 액체와 접촉하기 전에는 증발된 액체(즉, 액체의 기체 성분)를 함유하지 않았다고 가정하였다. 그러나, 이것은 항상 그렇지는 않다. 예를 들어, 액체가 물이고 기체상이 대기일 경우, 공기는 초기에 특정 분율의 수증기를 함유할 수 있다. 대기의 경우, 상대 습도(RH)는 포화 압력에 대한 수증기 압력, 즉 RH = P W / P SAT 을 제공하며, 여기서 P W 는 대기 중 수증기의 분압이다. 대기의 초기 상대 수증기 포화도(RHI)가 0이면, 공기는 수증기 함량을 갖지 않을 것이므로, 식 7이 적용될 수 있다. 한편, RHI > 0이면, 포화 압력을 성립하기 위해서 액적의 증발이 더 적게 필요하므로, 식 7은 수정이 필요하다. 따라서, 식 6을 참조한다.
이는 V MAX 에 대한 다음 해법으로 변환된다:
현재의 맥락에서, RHI는 가능한 한 일반적으로, 즉, 물뿐만 아니라 다른 액체와도 관련하여 이해되어야 한다 (상기 정의 항목 참조). 이 경우, RHI의 보다 일반적인 정의는 RHI = P L / P SAT 이고, 여기서 P L 은 적용된 액체의 기체 성분의 초기 증기압이다. P L -값은 액적 배열체의 형성 전에 흐름 시스템이 사용되는 기체상을 의미한다. 기체상 씰은 흐름 격실 내부가 포화 압력에 도달하면 만들어진다. 따라서, 흐름 격실 내에 국부적으로 RH-값이 초기값으로부터 완전한 포화 및 기능적 기체상 씰을 나타내는 1로 상승할 것이다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 흐름 격실은 전체 액체 나노 내지 아토리터 액적의 합산 최대 액적 부피(V DA ) 보다 크고, 식 9에서 계산되는 바와 같은 V MAX 보다 작은 부피(V C )를 갖는다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 소수성 기판 내에 또는 상에 친수성 특징부의 패턴을 포함하는, 분석물을 디지털 계수하기 위한 흐름 시스템의 최적의 배치를 얻기 위하여, (i) 개별 친수성 특징부의 배치, (ii) 특징부 패턴의 배치, 및 (iii) 패턴이 존재하는 격실의 배치를 고려할 필요가 있다. 집합적으로, 이들 3개의 구조는 흐름 시스템에 기체상 씰을 통해 마이크로액적의 증발 저항성 패턴을 유지할 수 있는 능력을 제공한다. 개별 친수성 특징부의 배치는 위에 개략되어 있다. 흐름 시스템 배치를 결정하는 예시적인 그 다음 단계들은 아래와 같다:
1) 적용에 필요한 액적의 총 개수를 결정한다. 위에서 논의한 바와 같이, 액적의 총 개수는 측정의 동적 범위를 결정하므로, 분석물의 예상 농도 범위와 일치하여야 한다.
2) 패턴에 대한 V DA -값은 이제 식 2로부터 계산될 수 있으므로, 흐름 격실 부피, 즉 V C -값에 대한 하한을 제공한다.
3) 적용된 액체의 공칭(nominal) 몰 중량(M W ) 및 부피 밀도(ρ L )뿐만 아니라, 측정이 일어날 온도(T) 및 RHI-값을를 결정한다. 식 9를 이용하여 흐름 격실 부피에 대한 V MAX -값을 계산하기 위하여, 기준 온도, 압력 및 증발의 엔탈피에 대한 적절한 값의 집합을 적용한다. 예를 들어, 물에 대하여, T 0 = 373 K에서 P 0 = 1.0 atm이고, 이는 40.7 kJ/mol의 ΔH VAP -값을 나타낸다.
4) 친수성 특징부 패턴의 특정 배열, 예컨대 정사각형 격자 배열체, 육각형 격자 배열체, 직사각형 격자 배열체, 마름모 격자 배열체 등을 결정한다. 바람직한 배열체 기하학적 구조는 일반적으로 제조방법에 의해 결정될 것이다. 총 액적 수를 수용하기 위하여 배열체의 길이 및 폭을 결정한다.
5) 흐름 격실 기하학적 구조, 예컨대 직사각형 통로, 원형 통로, 반원형 통로 등을 결정한다. 바람직한 배열체 기하학적 구조는 일반적으로 제조방법에 의해 결정될 것이다.
6) 총 부피가 V MAX 보다 작도록 흐름 격실 기하학적 구조를 조정한다. 이러한 일례는 실시예 2에 제공된다. 간단하게 말해서, 직사각형 통로의 경우, 총 부피는 통로의 폭 x 길이 x 높이로 주어진다. 통로의 폭 및 길이는 예를 들어 배열체와 일치할 수 있으므로, 높이 변수가 남는다. 따라서, 높이는 V MAX 보다 작은 총 부피를 제공하도록 선택될 수 있다.
본원에 개시된 추가적 일 구현예에서, 친수성 특징부가 반경(R D )을 갖는 원형이고, 단일 친수성 원형이 지지할 수 있는 최대 액적 부피(V D )가 식 1에서 제공되는, 흐름 시스템이 있다.
일 구현예에서, 각각의 나노 내지 아토리터 액적의 증발은 각각의 나노 내지 아토리터 액적의 최대 액적 부피의 50 퍼센트 미만, 40 퍼센트 미만, 30 퍼센트 미만, 20 퍼센트 미만, 10 퍼센트 미만, 5 퍼센트 미만, 1 퍼센트 미만이다.
흐름 시스템의 주어진 일 배치, 즉 특정된 V C - 및 V DA -값의 집합에 있어서, 대응 증발률 θ VAP 이 계산될 수 있다. 증발률은 기체상으로 증발된 액적 부피 분율, 즉 θ VAP = n VAP / n DA 로 정의된다. 식 3 및 식 8을 이 표현에 삽입하면 다음을 얻는다:
1 보다 큰 값의 θ VAP 를 가정하면, 전체 액적 배열체는 너무 큰 흐름 격실 부피, 배열체 상의 너무 적은 액적, 너무 높은 온도, 너무 작은 친수성 특징부 등으로 인해 증발된 것이다. 한편, θ VAP 가 1 보다 작으면, 비록 부피 감소를 나타내기는 하지만, 온전한 액적이 친수성 특징부에 남아있을 수 있으므로 기체상 씰은 기능적이라고 간주된다. 원칙적으로, 증발에 대항하여 액적을 씰링할 수 있다고 당업자에게 공지된 모든 기체가 사용될 수 있다. 기체상 씰의 예로는 대기, 질소, 아르곤 또는 헬륨 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다. 일 구현예에서, 기체상 씰은 대기, 질소, 아르곤 또는 헬륨에 의해 제공된다. 추가적 일 구현예에서, 기체상 씰은 대기에 의해 제공된다.
디지털 계수 측정은 단일 분석물 분자를 직접 검출하고 계수하여, 시료 중의 농도를 결정할 수 있다. 디지털 계수 측정은 디지털 중합효소 연쇄반응(dPCR), 디지털 효소면역측정법(dELISA) 및 이들의 변형에 적용된다. dPCR의 경우, 단일 뉴클레오티드 분석물은 반응 격실에 분리되고 중합효소-보조 뉴클레오티드 증폭 및 앰플리콘의 형광 표지를 거친다. dELISA의 경우, 단일 단백질/펩티드 분석물이 마이크로-콜로이드 입자의 표면에 포획되고, 효소-접합된(enzyme-conjugated) 항체로 표지되고, 현미경 반응 격실에 분리되고, 검출 시약이 공급된다. 검출 시약은 효소에 의해 처리될 때 반응 격실의 현미경 부피로 인해 신속하게 검출 농도에 도달하여, 광신호(예컨대, 형광, 화학발광, 흡광)를 생성한다. 디지털 계수 측정의 원리는 도 8에 개략되어 있다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 흐름 시스템을 사용하여, 주어진 분석물의 디지털 계수 측정을 수행하기 위하여, 적어도 다음 3개의 일반적 단계가 필요하다; (1) 분석물 포획, (2) 분석물 표지 및 (3) 분석물 계수 (예를 들어, 도 9의 스케치 참조). 단계 1에서, 시료로부터 분석물은 친수성 특징부에 특이적으로 포획된다. 단계 2에서, 포획된 분석물은 적절한 제제, 예컨대 효소-접합에 의해 특이적으로 표지된다. 단계 3에서, 액체가 검출제를 함유하도록, 마이크로액적의 배열체가 형성된다. 표지제가 효소인 경우, 검출제는 효소에 대한 형광-/발색-/화학발광 기질일 수 있다. 상기 기질의 처리시, 검출가능한 광신호가 초기에 표지제 및 검출 시약을 모두 품고 있는 액적에 생성된다. 다음으로, 신호를 생성하는 액적은 배열체의 광학 이미징에 의해 계수될 수 있다.
일 구현예에서, 흐름 시스템은 1종 이상의 구별되는 분석물에 대한 1종 이상의 캡쳐 프로브를 포함하고, 캡쳐 프로브(들)는 친수성 특징부에 부착된다. 추가적 일 구현예에서, 다른 유형의 캡쳐 프로브가 영역에 배열된다.
dPCR 및 마이크로-콜로이드 보조 dELISA 보다 나은 본 발명의 장점은 분석물이 포획되어 친수성 특징부 상에 특이적으로 조직될 수 있다는 것이다. 이러한 장점들은 (i) 여러 종의 상이한 분석물을 측정할 경우, (ii) 반복 측정을 원할 경우에 인정된다.
상기 첫 번째 경우에, 1종의 분석물에 특이적인 캡쳐 프로브가 제1 영역에 국한되고, 다른 1종의 분석물에 특이적인 캡쳐 프로브가 제2 영역에 국한되는 등, 상이한 캡쳐 프로브들이 흐름 격실 내에서 상이한 영역에 위치할 수 있다. 이는 수백개의 표적 분석물이 단일 측정에서 검출될 수 있는, DNA- 및 단백질-마이크로분석 연구 분야에서 잘 알려진 전략이다. 예컨대, Weinrich, D. 등의 연구를 참조하라("Applications of Protein Biochips in Biomedical and Biotechnological Research" published in Angewandte Chemie International Edition (2009), vol. 48, pp. 7744-7751. DOI: 10.1002/anie.200901480).
상기 두 번째 경우, 표지제 및 검출제를 제거하고 이들을 흐름 시스템에 재도입함으로써 디지털 계수의 반복이 가능하다. 포획된 분석물이 친수성 특징부 상에 고정되어 남아 있기 때문에 예컨대 신호-대-노이즈 비율을 개선하기 위하여 디지털 계수 측정을 반복할 수 있다(실시예 5 참조). 이는 dPCR 또는 dELISA의 경우에는 불가능한데, 분석물도 함께 제거하지 않고는 표지제 및 검출제를 제거할 수 없기 때문이다.
일 구현예에서, 1종 이상의 분석물에 대한 1종 이상의 캡쳐 프로브는 링커 모이어티에 의해 친수성 특징부에 부착된다. 링커 분자는 대부분의 경우 친수성 특징부의 단단한 무기 표면을 소프트 유기 캡쳐 프로부에 연결시키는 역할을 한다. 따라서, 링커 분자는 캡쳐 프로브를 표면에 연결시키기 위하여 이중의(dual) 화학 기능성을 함유할 수 있다. 링커 분자는 유연성이 있고, 불활성이며 친수성인 폴리(에틸렌-글리콜) 중합체로 선택될 수 있다. 또한, 이들은 선형 알칸 사슬로 선택될 수도 있다. 폴리(에틸렌 글리콜) 링커는 상이한 크기/길이로 제조될 수 있으므로, 표면과 캡쳐 프로브 사이에 분리가 커질 수 있는 반면, 알칸 사슬은 일반적으로 더 짧다. 다른 링커 분자는 비제한적으로 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 링커 분자 상에 존재하는 화학적 기능성은 반응성 화학 작용기, 예컨대 알데히드, 알킨, 아민, 아지드, 비오틴, Boc/Fmoc-보호된 아민, 카르복시산, 에폭시드, 히드라지드, 히드록실, 말레이미드, N-히드록시숙신이미드, 티올, 비닐술폰 및 그 변이체의 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 2종 이상의 캡쳐 프로브가 친수성 특징부에 부착되고, 상이한 유형의 캡쳐 프로브가 영역들에 배열된다. 일 구현예에서, 캡쳐 프로브는 다음 프로브 군으로부터 선택된다: 올리고뉴클레오티드, 단백질, 펩티드 또는 이들의 합성 변이체.
캡쳐 프로브가 올리고뉴클레오티드인 경우, 프로브는 캡쳐 프로브와 상보적인 서열을 나타내는 다른 올리고뉴클레오티드를 포획할 능력이 있을 수 있다. 가닥-침투 특성을 나타내는 합성 올리고뉴클레오티드 변이체, 예컨대 잠금 핵산(locked nucleic acids: LNA) 또는 펩티드 핵산(PNA)은 단일 또는 이중 가닥의 DNA를 포획하는데 활용될 수 있다. 압타머도 단백질 또는 펩티드의 포획을 가능하게 하는 캡쳐 프로브로 활용될 수 있다. 또한, 항체 또는 항체 단편은 단백질, 펩티드 또는 소분자의 특정 포획을 매개하기 위해 캡쳐 프로브로 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 친수성 특징부의 패턴을 갖는 소수성 지지체는 평면이다. 추가적 일 구현예에서, 친수성 특징부의 패턴은 친수성 특징부가 배열체로 배열되어 있는 적어도 하나의 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 친수성 특징부는 2차 평면 배열체로 조직되고, 특징부는 반경(R D )을 갖는 원형으로 형상화되고, 배열체는 인접한 특징부들 사이의 피치(pitch)(δ)를 갖고, 여기서 δ는 적어도 3R D 이고, 배열체는 흐름 방향을 따라 길이(L AX )로 연장되고, 배열체는 흐름 방향의 수직으로 길이(L AY )로 연장되고, 통로는 흐름 방향을 따라 길이(L CX )로 연장되고, 여기서 L CX 는 L AX 보다 크거나 같고, 통로는 흐름 방향의 수직으로 길이(L CY )로 연장되고, 여기서 L CY 는 L AY 보다 크거나 같고, 통로는 2R D 이상이고 h MAX 이하인 높이(h)를 갖고, h MAX 는 다음 식으로부터 계산된다:
여기서, θ MAX 는 액적의 최대 허용 증발 부피 분율이고, V D (R D , γ)는 식 1에 따른 최대 액적 부피이다. 식 11에 도달하기 위해 증발률(θ VAP )을 격실 부피(V C ) 및 총 최대 액적 배열체 부피(V DA )의 함수로 나타내는 식 10을 고려할 필요가 있다. 전술한 기하학적 구조를 나타내는 흐름 격실에 있어서, 흐름 격실 부피는 V C = hL CX L CY 이고, 최대 총 액적 배열체 부피는 V DA = V D (R D , γ)L AX L AY δ -2 이다. 기체상 씰을 제공하기 위하여 흐름 격실의 기능적 배치를 만드는 한가지 접근법은 액적의 최대 허용 증발 부피 분율을 적절한 값, 예컨대 θ MAX = 0.05으로 설정하는 것이다. 다음으로, 흐름 격실 높이를 유일한 매개변수로 두면, 최대 허용 높이(h MAX )는 V C = V MAX = h MAX L CX L CY , V DA 및 θ MAX 를 식 10에 삽입하여 얻을 수 있다. 일 구현예에서, 친수성 특징부의 패턴은 적어도 2개의 영역을 포함하고, 하나의 영역의 배열체는 나머지 영역의 배열체와 다르다.
친수성 특징부가 다양한 크기의 액적을 지지하도록 배치된 경우, 식 11에서 h MAX 의 계산은 패턴 상의 최소 액적 부피에 대응하는 V D -값을 사용하여 수행되어야 한다. 이러한 방식으로, 배열체 상의 최소 및 최대 액적은 θ MAX -값에 의해 규정된 것보다 많이 증발하지 않고 안정하게 남이 있을 수 있다.
일 구현예에서, 친수성 특징부의 지지체는 흐름 격실 내의 중심에 위치한다.
친수성 특징부를 포함하는 배열체의 흐름 격실 내의 중심 위치가 일반적으로 선호되지만, 배열체의 정확한 위치는 이전 계산의 결과에 영향을 미치지 않는다. 이는 계산이, 흐름 격실 내에서 열역학적 평형, 즉 친수성 특징부에 의해 지지되는 액적으로부터의 증발 속도가 흐름 격실 내의 증기의 액적으로의 응축 속도과 동일한 평형이 이루어진다는 가정을 기반으로 하기 때문이다. 그러나, 중심에 위치하는 배열체는 격실 내의 증기의 수송 동력 때문에 중심 아닌 곳에(decentrally) 위치하는 배열체에 비해 더 신속하게 평형에 도달할 수 있다.
일 구현예에서, 친수성 특징부의 수는 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 적어도 10,000,000 이다.
일 구현예에서, 소수성 층은 기판에 공유적으로 그라프트된 분자 단일층이다. 일 구현예에서, 소수성 층은 금속 기판 상에 화학흡착된 분자 단일층이다.
일 구현예에서, 흐름 격실은 통로 형태이고, 흐름 격실의 대향 단부의 2개의 개구부 사이에서 흐름 방향을 형성한다. 일 구현예에서, 흐름 격실 및 개구부는 흐름 방향에 수직인 단면이 직사각형 형태를 갖는다. 일 구현예에서, 흐름 격실은 직사각형 형태이고, 개구부는 흐름 방향에 수직인 단면이 원형이다.
본원에 개시된 일 측면에서, 흐름 시스템을 제조하는 방법이 있다.
본 발명의 전반적인 이해를 제공하기 위하여, 효소의 sELISA 분석을 허용하는, 마이크로액적의 배열체를 지지하는 시스템을 포함하는 예시적인 특정 구현예가 이제 기술될 것이다. 그러나, 당업자는 본원에 기술딘 시스템 및 방법이 다른 적절한 응용을 위해 조정되고 수정될 수 있으며, 이러한 다른 추가 및 수정은 본 발명의 범위를 벗어나지 않는다는 것을 이해할 것이다.
도 1은 감소된 증발률을 갖는, 복수의 마이크로액적을 지지하기 위한 시스템의 일 구현예를 도시한다. 구체적으로, 도 1은 직사각형 흐름 격실이 복수의 마이크로액적을 수용하는 시스템(18)을 도시한다. 마이크로액적은 흐름 격실 바닥 표면에 놓인다. 흐름 격실의 각 단부는 주변 환경에 개방되어 있다.
도 2는 흐름 격실의 단부의 단변도이다. 도 2는 이 구현예에서 단부가 높이 h (수직 화살표로 도시됨)의 사각형임을 도시한다. 도 1로 돌아와서, 마이크로액적의 배열체의 각 단부는 흐름 격실 단부로부터 거리 L E (양방향 화살표로 도시됨)를 이격되는 것으로 도시한다.
도 1의 흐름 격실은 마이크로액적의 배열체를 지지하는 흐름 통로이다. 마이크로액적은 공지된 기술을 이용하여 흐름 통로 내로 삽입될 수 있다. 도시된 흐름 통로의 치수는 도 1로부터 일반적으로 이해될 수 있고, 통로의 높이 h, 마이크로액적의 배열체로 덮이는 흐름 통로의 길이인 L A , 및 유입구 및 배출구로부터 마이크로배열체를 분리하는 (및 마이크로액적 배열체의 어떤 부분도 지지하지 않는) 통로의 길이인 L E 으로 특징지어진다. 흐름 통로의 길이 및 높이 및 형태가 주어지면, 흐름 통로의 부피를 계산할 수 있다. 이러한 계산의 세부사항은 실시예 2에 기술되어 있다.
각각의 액적은 본질적으로 반구형이고 그렇게 모델링할 수 있다. 반구형 액적은 반경을 가질 것이다. 액적은 본질적으로 표준 피치로 이격되어 있다. 점(dot)은 선형 배열체, 사각형 배열체, 또는 다른 적절한 배열체일 수 있다. 물론, 마이크로액적의 배열체 내에 함유된 액체의 총 합산 부피를 액적의 반경 및 액적의 수의 함수로 추정하는 것은 가능하다. 이러한 계산의 세부사항은 실시예 2에 기술되어 있다.
흐름 통로의 기하학적 구조가 알려지면, 사용가능한 부피가 계산될 수 있다. 부피 및 평형 수증기압(P W )은 Clausius-Clapeyron 식에 의해 명시된 바와 같이 증발될 물의 양을 결정한다. 이러한 계산의 세부사항은 실시예 2에 기술되어 있다. 증기압은 액적으로부터 증발된 물에 의해 생성되기 때문에, 흐름 통로에서 가습하고 공기를 포화시킨다. 결과적으로, 합산 액적 부피의 작은 부분만으로 평형 증기압을 성립하는데 충분하다면, 남아 있는 물 부피는 액적으로서 표면에 보존될 것이다. 이러한 방식으로, 가습된 공기는 도 3에 도시한 바와 같이 기체상 씰을 제공한다 (마이크로액적을 둘러싸면서 채워진 점선으로 표시됨).
특정 부피의 용액에 대하여 예를 들어 특정 높이 h를 선택하면, 도 11B에 나타낸 바와 같이, 증발된 물의 양이 약 5%로 유지될 수 있다.
기체상 씰이 만들어지는 과정은 도 4의 현미경 사진에 나타나 있다. 여기에는 물의 플러그가 흐름 통로의 일 단부로부터 나머지 단부로 작동되어 명확한 마이크론 크기의 수성 액적을 남긴다. 물러가는(receding) 물가(water front)는 현미경 사진 좌측에서 볼 수 있으며, 액적의 배열체는 물가의 우측에서 볼 수 있다. 흑색 화살표는 액체가 작동되는 방향을 나타낸다.
적용
여기에 기술된 본 발명은 많은 가능한 응용예들을 갖는데, 이들은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어 Witters 등의 문헌 참조(Digital Biology and Chemistry DOI: 10.1039/C4LC00248B, (Frontier) Lab on a Chip, 2014, 14, pp. 3225-3232). 여기에는 우리가 단일-효소 결합 분자 분석(SELMA)이라고 칭하는 분석 유형이 포함된다. SELMA-기반의 분석은 단일 펩티드, 단백질 및/또는 올리고뉴클레오티드 분자의 조작 및 검출에 의존한다.
일 측면에서, 본원에 개시된 흐름 시스템은 적어도 1종의 구별되는 분석물을 디지털 계수하는 방법에서 사용될 수 있다.
SELMA 기반 측정은 분석물이 기체상 씰링된 액적 내부에 고정된 후, 분석물이 하나 이상의 단계에서 효소-접합된 제제로 표지를 거치게 되는 디지털 계수 분석이다. 액적의 나노 내지 아토리터 부피로 인하여, 단일 효소는 검출제의 연속적인 효소적 전환에 의해 수초 내지 수분 내에 검출가능한 광신호를 생성할 수 있다. 도 9에 예시적인 SELMA 기반 측정의 개요가 제공되고, 실시예 4에 SELMA의 실험적 증명이 기술된다.
본원에 개시된 일 측면에서, 1종 이상의 구별되는 분석물을 디지털 계수하는 방법이 제공되며, 이 방법은 기체상 씰 하에서 복수의 나노 내지 아토리터 액적에 함유된 분석물 종을 계수하는 것을 포함한다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 기체상 씰은 흐름 격실 내에 마이크로액적의 증발을 감소시킬 수 있는 증기압을 성립시킨다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 디지털 계수는 흐름 시스템에서 수행되고, 이 흐름 시스템은 소수성 기판 내에 또는 상에 친수성 특징부의 패턴을 갖는 지지체를 포함하고, 소수성 기판은 적어도 하나의 개구부를 포함하는 흐름 격실 내에 매립되고, 친수성 특징부는 복수의 나노 내지 아토리터 액적을 지지하도록 배치된다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 친수성 특징부는 반경(R D )을 갖는 원형이고, 단일 친수성 원이 지지할 수 있는 최대 액적 부피(V D )는 다음과 같다:
여기서, γ는 소수성 기판 상의 액체 접촉각이다. 본원에 개시된 일 구현예에서, 기체상 씰은 각각의 나노 내지 아토리터 액적의 증발을 최대 액적 부피의 50 퍼센트 미만으로 감소시킨다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 본원에 기술된 흐름 시스템은 본원에 개시된 방법에서 사용된다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 상기 방법은 (i) 소수성 기판 내의 또는 상의 친수성 특징부의 패턴을 적어도 1종의 분석물을 함유하는 시료와 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 상기 방법은 (ii) 적어도 1종의 분석물을 친수성 특징부 상에 포획하는 단계를 더 포함한다.
다수의 분석물 종(types)은 앞서 상세하게 기술된 바와 같이, (생)화학 기능화를 거친 친수성 특징부 상에 포획될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 기반 분석물, 예컨대 RNA, mRNA, 바이러스 RNA, DNA, 바이러스 DNA, 박테리아 DNA, DNA/RNA-복합체 또는 단백질/DNA/RNA-복합체를 특이적으로 포획하기 위해서는, 분석물과 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내는 올리고뉴클레오티드 기반 캡쳐 프로브를 적용할 필요가 있을 수 있다. 단백질- 또는 펩티드-기반 분석물 또는 이의 복합체를 특이적으로 포획하기 위하여, 분석물의 3차원 구조, 즉, 항원/항체 결합을 특이적으로 인식하는 항체- 또는 압타머-기반 캡쳐 프로브를 적용할 필요가 있을 수 있다. 동일한 방식으로, 전체 생물학적 개체 또는 거대분자 어셈블리, 예컨대 세포, 박테리아, 바이러스, 바이러스유사 입자, 나노입자 또는 세포 단편을 포함하는 분석물은 분석물에 의해 나타난 항원을 특이적으로 표적화하는 항체를 사용하여 포획될 수 있다. 대안적으로, 전술한 분석물 종은 캡쳐 프로브의 도움없이 포획될 수 있으나, 대신에 오직 하나의 분석물이 액적 내에 존재할 수 있도록, 마이크로액적의 크기(즉, V D -값)를 분석물의 크기에 일치시킴으로써 가능하다.
또한, 캡쳐 프로브는 포획을 매개하기 위하여 보조(helper) 프로브를 보충할 수 있는데, 보조 프로브는 먼저 분석물에 특이적으로 결합한 다음, 표면 상의 캡쳐 프로브에 특이적으로 결합하므로, 테터(tether)로서 작용한다. 예를 들어, 도 9의 스케치를 참조하라.
또한, 전술한 분석물의 모든 유형은, 가교제의 말단이 분석물에 결합되고 다른 하나의 말단이 표면에 결합되도록 하는 이종기능(heterobifunctional) 화학 가교제의 사용에 의해 비특이적으로 친수성 특징부에 포획될 수 있다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 상기 방법은 (iii) 검출될 분석물 종에 특이적인 표지제를 사용하여 적어도 1종의 포획된 분석물을 표지하는 단계를 더 포함한다.
표지제는 분석물의 특이적 표지를 매개하기 위하여 캡쳐 프로브와 동일한 방식으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 분석물이 올리고뉴클레오티드이면, 캡쳐 프로브 및 표지제는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 합성 변이체일 수 있다. 이 경우, 캡쳐 프로브는 분석물 상의 하나의 특정 서열을 인식할 수 있고, 표지제는 다른 특정 서열을 인식할 수 있다. 표지제는 분석물의 특이적 인식을 위한 하나의 모듈 및 분석물의 후속 검출을 위한 또다른 모듈을 함유할 수 있다. 적어도 3가지 유형의 표지제가 이러한 기준을 충족한다; 효소-접합된 올리고뉴클레오티드, 효소-접합된 단백질/펩티드 또는 효소-접합된 압타머. 분석물-인식 모듈은 각각 올리고뉴클레오티드, 단백질/펩티드 또는 압타머에 의해 제공되는 반면, 검출 모듈은 효소에 의해 제공된다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 상기 방법은 (iv) 검출제를 패턴을 가로질러 흐르게 하고 패턴으로부터 회수하여 개별 액적을 나노 내지 아토리터 액적의 형태로 생성하는 단계를 더 포함한다.
검출 시약을 함유하는 수성 마이크로액적의 형성으로, 표지제 및 검출제 모두가 존재하는 액적 서브집합 내에 신호-생성을 촉발시키는 것이 가능하다. 검출제가 효소를 포함하는 경우, 적절한 검출 시약은 효소 처리에 반응하는 광신호를 생성할 수 있는 모든 호환가능한 효소 기질일 것이다. 예를 들어, 효소가 페록시다아제(peroxidases)의 유형에 속하는 경우, 적절한 검출제로는 ABTS (2,2'-아지노비스[3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산]-디암모늄염), OPD (o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드), TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘), 뿐만 아니라 다음의 상표명의 제품을 들 수 있다: Quantablu, QuantaRed, Amplex UltraRed 또는 SuperSignal ELISA pico/femto. 효소가 포스파타아제(phosphatases)의 유형에 속할 경우, 적절한 검출제로는 PNPP (p-니트로페닐 포스페이트), 4-MUP (4- 메틸움벨리페릴 포스페이트), BCIP/NBT (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트/니트로 블루 테트라졸륨), 뿐만 아니라 다음의 상표명의 제품을 들 수 있다: CSPD, CPD Star or Dynalight. 효소가 갈락토시다아제(galactosidase)의 유형에 속할 경우, 적절한 검출제로는 FDG (플루오레세인 디-β-D-갈락토피라노시드), DDAO 갈락토시드 (9H-(1,3-디클로로-9,9-디메틸아크리딘-2-온-7-일) β-D-갈락토피라노시드), MUG (4-메틸움벨리페릴 β-D-갈락토피라노시드), ONPG (o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드), 레조루핀 β-D-갈락토피라노시드 , X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β-D-갈락토피라노시드), 뿐만 아니라 다음의 상표명의 제품을 들 수 있다: Galacton-Star 또는 Bluo-Gal. 또한, ELISA-호환가능한 효소/기질 쌍이 적용될 수 있다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 상기 방법은 (v) 표지제 및 검출제 모두를 수용하는 액적의 수를 계수하는 단계를 더 포함한다.
광신호를 나타내는 액적의 계수는 광학 현미경과 같은 이미징 장치의 도움으로 가장 편리하게 수행할 수 있다. 현미경을 사용하여, 개별 액적을 이미지화하고, 그들의 신호 수준을 현미경 사진의 상대적인 강도 단위로부터 평가할 수 있다. 신호가 사실상 화학발광 또는 형과발광일 경우, 획득되는 현미경 사진은 형광 필터세트를 사용하여 기록할 수 있다. 또한, 실시예 4에 나타낸 바와 같이, 형광 현미경 사진은, 예컨대 액적의 위치 및 외관을 확인하고 그것을 형광 신호의 위치와 상관시키기 위해, 동일한 위치에서 획득된 명시야 현미경 사진을 보충할 수 있다.
신호가 사실상 비색계(colorimetric)인 경우, 획득된 현미경 사진은 예컨대 개별 액적의 흡광도, 반사율 또는 투과율을 평가하기 위하여, 명시야 현미경 이미징에 의해 기록될 수 있다.
단일 현미경의 시야가 담을 수 없을 정도로 액적 배열체가 넓은 면적을 덮는 경우, 전체 배열체를 나타내는 더 큰 현미경 사진을 재구성하기 위하여 여러 개의 현미경 사진이 여러 위치에서 기록될 수 있다. 이미징 재구성(예를 들어, 현미경 사진 스티칭)을 안내하기 위하여, 쉽게 인식될 수 있는 마이크로 패턴이 배열체에 도입될 수 있다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 상기 방법은 단계 (iii), (iv) 및 (v)를 1회 이상 반복하는 것을 더 포함한다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 상기 방법은 제1 표지제를 사용하는 대신 검출될 제2 분석물 종에 특이적인 제2 표지제를 사용하여, 단계 (iii), (iv) 및 (v)를 반복하는 것을 더 포함한다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 상기 방법은 단계 (iii), (iv) 및 (v)를 반복하기 전에 이전 단계에 존재하는 표지제를 비활성화시키는 단계를 더 포함한다.
표지 단계, 검출 시약 첨가 단계 및 신호-양성 액적의 계수 단계들을 반복할 수 있는 능력은 SELMA 측정의 고유의 특성으로 적어도 2가지 장점이 있다:
먼저, 이전 측정으로부터 표지제 및 검출제의 제거한 후 이들을 재도입함으로써, 신호-대-노이즈 비율이 증가할 수 있다. 이는 표지제가 어떤 분석물도 존재하지 않는 가운데 친수성 특징부 표면에 비특이적으로 결합할 수 있기 때문이다. 따라서, 비특이적으로 결합된 표지제는 계수 측정에서 백그라운드 노이즈(background noise)를 포함할 수 있으므로, 잠재적으로 낮은 신호-대-노이즈 비율을 유도할 수 있다. 그러나, 비특이적 결합은 배열체 상의 무작위 위치에서 일어나는 반면, 분석물에의 특이적 결합은 분석물이 존재하는 배열체 특징부 상에서만 일어나므로, 두 결합 모드는 반복된 측정에 의해서 구별될 수 있다. 반복 측정에서, 비특이적 결합을 나타내는 액적은 비특이적 결합이 측정이 반복될 때마다 양성 신호를 제공하지 않을 수 있는 반면, 특이적 결합을 나타내는 액적은 매번 양성 신호를 제공할 수 있다. 이러한 방식으로, 백그라운드 노이즈가 현저하게 감소할 수 있으므로, 측정 감도가 커질 수 있다.
둘째로, 이전 측정으로부터 제1 분석물 종에 특이적인 표지제 및 검출제를 제거한 후 다른 분석물 종에 특이적인 표지제 및 검출제를 도입함으로써, 높은 다중처리(multiplexing) 용량을 제공할 수 있다. 이 경우, 측정이 반복될 때마다 새로운 분석물 종의 집합이 계수된다. 예를 들어, 배열체가 10가지 상이한 분석물 종에 특이적인 캡쳐 프로브로 기능화되면, 10회 측정을 반복- 매회마다 새로운 표지제 및 검출제를 도입-함으로써, 10가지 분석물 모두가 정량화될 수 있다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 표지제는 표면-결합된 분석물로부터 분리되어 비활성화되고 흐름 시스템의 플러싱(flushing)에 의해 제거된다.
당업자에게 알려진 바와 같이, 분자 프로브를 비활성화시키는 수많은 접근법이 존재한다. SELMA 측정의 경우, 가장 편리한 접근법은 캡쳐 프로브에 결합된 분석물을 유지하면서 분석물로부터 표지제를 방출하는 것에 의존한다. 표지제를 일단 분리하면, 헹굼 용액으로 흐름 통로를 플러싱함으로써 제거된다. 검출제는 배열체 표면에 결합시키기 위한 것이 아니기 때문에 보다 쉽게 제거되므로, 분리 단계가 필요하지 않다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 표지제는 효소적 절단에 의해 분리된다.
캡쳐 프로브, 분석물 및 표지제가 올리고뉴클레오티드인 경우, 엑소뉴클레아제(exonuclease) 처리에 의해 표지제를 특이적으로 제거할 수 있다. 엑소뉴클레아제는 분석물과 표지제 간의 상보적 서열과 같은 이중가닥(double-stranded) DNA를 분해하는 효소이다. 캡쳐 프로브를 엑소뉴클레아제 처리(예를 들어, 캡쳐 프로브로서 펩티드 핵산, 잠금 핵산 또는 화학적으로 개질된 단일가닥 DNA를 선택함으로써)로 비활성시킴으로써, 분석물과 표지제 사이의 결합만이 파괴될 수 있다.
일 구현예에서, 표지제는 화학적 절단 또는 탈착(desorption)에 의해, 예를 들어 pH, 이온 강도, 변성 염(denaturing salt) 또는 세제를 첨가 또는 조정함으로써 분리된다.
일 구현예에서, 표지제는 흐름 시스템의 온도를 높임으로써 분리된다.
일 구현예에서, 표지제는 화학적 또는 물리적 상태를 변화시킴으로써 비활성화된다.
분석물 및 표지제가 모두 올리고뉴클레오티드이고 염기쌍 서열 상보성에 의해서 서로 결합되는 일 구현예에서, 용액의 pH 또는 이온 강도를 변화시킴으로써 표지제를 특이적으로 제거할 수 있다. 예를 들어, pH가 상승하면 DNA의 이중가닥 구조는 핵 염기의 탈양자화로 인해 파괴된다. 또한, 이중 DNA(duplex DNA)의 분리는 용액의 이온 강도를 감소시켜 DNA 주골격 상의 하전된 인산기들 사이의 정전기적 반발력을 향상시킴으로써 달성될 수도 있다. 더욱이, 온도를 이중 DNA의 용융 전이온도 보다 높이면 분석물로부터 표지제의 분리를 유도할 수 있다.
분석물 및 표지제가 단백질 또는 펩티드 기반인 일 구현예에서, 표지제는 세제, 변성 염을 사용하여 3차 구조를 파괴/변성시킴으로써 또는 온도를 높임으로써 분리될 수 있다.
일 구현예에서, 표지제는 효소를 포함하고, 표지제는 활성 부위의 화학적 또는 생화학적 변형에 의해 효소의 상태를 변화시킴으로써 비활성화될 수 있다.
효소는 추가적 효소 처리가 불가능하도록 활성 부위를 파괴함으로써 비활성화될 수 있다. 예를 들어, 효소가 페록시다아제 효소의 유형에 속하는 경우, 활성 부위는 페놀 용액에 노출되면 비가역적으로 파괴된다. 예를 들어, 문헌을 참조하라(Mao, L., Luo, S., Huang, Q. and Lu, J. in "Horseradish peroxidase inactivation: Heme destruction and influence of polyethylene glycol" published in Scientific Reports, vol. 3, article number 3126 (2013), DOI: 10.1038/srep03126). 또한, 효소가 포스파타아제 효소의 유형에 속하는 경우, 활성 부위는 아연- 및 마그네슘-이온 복합체가 기능할 것을 요구한다. 결과적으로, 캘레이트제, 예컨대 EDTA(에틸렌-디아민-테트라아세트산)를 사용하여 이들 이온을 제거함으로써, 효소의 비가역적인 비활성화, 즉 효소 활성의 종결을 유도할 수 있다. 예를 들어, 문헌을 참조하라(Ackermann, B. P. and Ahlers, J. in "Kinetics of alkaline phosphatase from pig kidney. Influence of complexing agents on stability and activity" published in Biochemical Journal, vol. 153, pp. 151-157 (1976), DOI: 10.1042/bj1530151).
일 구현예에서, 표지제는 효소를 포함하고 효소의 상태는 효소의 3차원 구조의 화학적 또는 물리적 파괴에 의해 변화된다.
예를 들어, 효소의 구조는 용액의 온도를 높임으로써, pH를 높이거나 낮춤으로써, 이온 강도를 높이거나 낮춤으로써, 세제를 첨가함으로써, 또는 효소를 공유적으로(covalently) 변형시키는 화학적 가교제를 사용함으로써 변화될 수 있다.
일 구현예에서, 표지제는 효소 및 특정 분석물 인식 모이어티를 포함하고, 분석물 인식 모이어티는 다음 분자들로 이루어진 군으로부터 선택된다: 올리고뉴클레오티드, 단백질, 펩티드, 압타머, 항체, 이들의 복합체 또는 이들의 합성 변이체.
일 구현예에서, 액체 중에 1종 이상의 분석물을 함유하는 시료를 완전 침지에 의해 친수성 특징부를 함유하는 기판과 접촉시킨다.
일 구현예에서, 상기 방법은 액체를 제거하고 기판을 세척하는 것을 더 포함한다.
일 구현예에서, 표지는 분석물에 대한 표지제를 함유하는 용액을 완전 침지를 통해 포획된 분석물과 접촉시킴으로써 수행된다.
일 구현예에서, 상기 방법은 잔류 표지제를 함유하는 용액을 제거하고 기판을 세척하는 것을 더 포함한다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 친수성 특징부의 패턴을 수용하는 기판은 흐름 격실 내에 위치하므로, 유입구로부터 배출구로의 액체 플러그의 압력-구동 작동에 의해 액체 접촉이 가능하다. 상이한 시약(표지제, 검출제, 비활성화제, 헹굼 용액)을 함유하는 상이한 용액은 액체 로딩 패드 내로 로딩되고, 흐름 격실 내로 작동될 수 있다. 액체 접촉 모드는 (i) 흐름-통과 접촉(flow-through contact) 또는 (ii) 주입-정지-회수 접촉(infuse-stop-withdraw contact)으로 분류될 수 있다. 흐름-통과 접촉 모드에서, 액체 플러그는 플러그의 전체 부피가 통과할 때까지 흐름 격실을 가로질러 작동된다. 주입-정지-회수 접촉 모드에서, 액체 플러그는 흐름 격실의 전체 부피를 채우고 난 다음 정지할 때까지 작동된다. 일정한 대기 기간 후에, 플러그는 흐름 통로로부터 액체 배출구로 작동된다.
흐름-통과 접촉 모드는 전형적으로 시약이 과량인 반응 단계에 적합하다. 이러한 단계의 지속 시간은 유속(부피/시간) 및 액체 플러그의 부피에 의해 결정될 수 있고, 필요한 공정 시간을 달성하기 위해 조정될 수 있다. 헹굼 단계, 표지 단계, 비활성화 단계 및 검출 단계와 같은 단계들은 전형적으로 흐름-통과 접촉 모드에서 수행될 수 있다.
주입-정지-회수 접촉 모드는 보다 긴 배양시간을 요구하는, 시약들이 낮은 농도로 존재하는 단계들에 적합할 수 있다. 예를 들어, 분석물을 낮은 농도로 함유하는 시료가 친수성 특징부의 표면 상의 캡쳐 프로브에 결합하게 되는 포획 단계. 포획 단계의 경우, 시료로부터 모든 분석물의 완전한 포획을 보장하기 위하여 단계의 지속 시간을 연장하는 것이 유리할 수 있다. 즉, 분석물이 흐름 격실의 상단에서 하단으로 확산되도록 하는 충분한 배양 시간뿐만 아니라, 표면에서 성공적인 포획을 보장하도록 하는 충분한 시간을 갖는 것이 유리할 수 있다. 주입-정지-회수 접촉 모드는 용액 내 친수성 패턴의 완전한 침지와 동등하다.
일 구현예에서, 분석물은 다음 분석물 군으로부터 선택된다: 단일가닥 올리코뉴클레오티드, 이중가닥 올리코뉴클레오티드 복합체, 단백질, 단백질/올리코뉴클레오티드 복합체, 단백질/지질 복합체, 펩티드, 엑소좀, 바이러스 입자, 바이러스 유사 입자, 나노입자, 세포 단편 또는 세포.
일 구현예에서, 시료는 다음 시료 군으로부터 선택된다: 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 뇌척수액, 눈물 또는 조직.
일 구현예에서, 시료는 다음 시료 군의 실험실 처리 시료로부터 선택된다: 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 뇌척수액, 눈물 또는 조직.
시료 유형에 따라, 상이한 유형의 분석물 종이 존재하고, 측정을 위해 분석물을 준비하기 위하여 상이한 실험실 프로토콜이 필요할 수 있다. 예를 들어, 시료가 혈액 시료이면, 응고를 방지하기 위해 항응고제(예컨대, 에틸렌-디아민-테트라-아세트산(EDTA), 시트레이트 또는 옥살레이트)로 혈액을 처리해야 할 수 있다. 혈액 시료의 실험실 처리의 다른 예로는 혈액을 시료로부터 세포를 제거하기 위하여 원심분리 또는 여과하는 것일 수 있다. 혈액 시료의 실험실 처리의 또다른 예로는 혈액을 희석하거나 활성 성분을 첨가하여 관심있는 특정 바이오마커의 추출을 용이하게 하는 것일 수 있다. 예를 들어, DNA 분석물은 고체상 가역적 고정화를 통해 액체 시료로부터 정제될 수 있는데, 여기서 혈액은 군집제(crowding agents) 및 카르복시산으로 코팅된 상자성(paramagnetic) 마이크로입자와 혼합된다. 이들 반응 조건은 마이크로입자의 표면으로의 DNA의 선택적 흡착을 선호할 수 있고, 마이크로입자는 자기장의 인가에 의해 추출될 수 있다. 다른 적용의 경우, 희석된 또는 다르게 처리된 시료는 (i) 전기영동 단계 또는 (ii) 투석 단계를 거쳐, 분자의 전하, 크기 및 분자량을 바탕으로 시료로부터 분자를 선택하는 것이 유리할 수 있다.
일 구현예에서, 포획 후, 1종 이상의 포획된 분석물은 캡쳐 프로브에 공유적으로 가교되거나 커플링된다.
분석물과 캡쳐 프로브 사이에 공유 결합을 만드는 것은, 표면에 분석물을 본질적으로 비가역적으로 고정시키기 때문에 유리할 수 있다. 이와 같이, 분석물과 표지제 사이의 결합은 비공유이므로 보다 약하기 때문에, 표지제의 분리는 보다 쉽게 달성될 수 있다. 예를 들어, 캡쳐 프로브 및 분석물이 모두 올리고뉴클레오티드이고, 상보적 염기쌍에 의해 서로 결합되고, 하나 이상의 공유 결합을 통해 서로 결합될 경우, 및 표지제가 올리고뉴클레오티드이고 상보적 염기쌍에 의해서만 분석물에 결합된 경우, 표지제는, 복합체를 알칼리성 pH에 처리함으로써, 분석물로부터 쉽게 해리될 수 있다. 알칼리성 pH는 분석물/표지제 사이의 약한 염기쌍 결합에 미치는 것과 동일한 정도로 캡쳐 프로브/분석물 사이의 강한 공유 결합에 영향을 미치지 않을 것이다.
다른 예로서, 캡쳐 프로브가 항체이고 분석물이 단백질 또는 펩티드이고 이들 사이에 공유 결합이 성립되었다고 생각해보라. 표지제가 항체 기반이고, 항체/항원 상호작용을 통해 분석물에 결합될 경우, 표지제는 세제를 첨가하거나 변성제를 첨가함으로써 쉽게 제거될 수 있지만, 캡쳐 프로브와 분석물 사이에는 공유 결합이 여전히 존재한다.
일 구현예에서, 캡쳐 프로브는 올리고뉴클레오티드 또는 합성 올리고뉴클레오티드이고, 분석물은 캡쳐 프로브 서열에 염기쌍을 통해 캡쳐 프로브에 결합된 올리고뉴클레오티드이고, 여기서 공유적 가교는 사슬간 가교제(interstrand crosslinking agent), 예컨대 백금 착물, 마이토마이신 C, 질소 머스터드, 소랄렌 또는 알데히드를 사용하여 수행된다. 상기한 바와 같은 사슬간 가교제는 이중(duplex) DNA, 이중 DNA/RNA 또는 핵산 염기를 함유하는 이들의 변이체 내의 대향 가닥 상의 핵산 염기 사이에 공유 결합을 형성할 수 있다. 사슬간 공유 결합은 비공유의 사슬간 염기쌍 결합과 비교하여 향상된 안정성을 제공하므로, 캡쳐 프로브에 대한, 결과적으로 친수성 특징부에 대한 분석물의 실질적으로 비가역적인 고정을 제공한다.
일 구현예에서, 캡쳐 프로브는 단백질, 펩티드 또는 이들의 합성 변이체이고, 분석물은 단백질, 펩티드 또는 단백질 또는 펩티드를 함유하는 복합체이며, 분석물은 분석물의 특정 영역의 구조적 인식에 의해 캡쳐 프로브에 결합되고, 여기서 공유적 가교는 화학적 고정제(chemical fixation agent), 예컨대 포름알데히드, 글루타알데히드, 사산화오스뮴 또는 우라닐 아세테이트를 사용하여 수행된다. 전술한 바와 같은 화학적 고정제는 아미노산을 가교할 수 있으므로, 분석물과 캡쳐 프로브 사이의 접착 영역에 공유 결합을 제공할 수 있다. 이는 캡쳐 프로브에, 결과적으로 친수성 특징부에, 분석물의 실질적으로 비가역적인 고정을 유도할 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 흐름 시스템의 일 구현예에서, 기체상은 대기에 의해 제공되고, 및/또는 캡쳐 프로브는 단일가닥 DNA 올리고, 단일가닥 잠금 핵산 올리고 또는 단일가닥 펩티드 핵산 올리고의 군으로부터 선택되고, 및/또는 상이한 유형의 캡쳐 프로브가 영역 내에 배열되고, 및/또는 분석물은 처리된 혈액 시료로부터 추출된 단일가닥 DNA이고, 및/또는 표지제는 검출 양상 및 인식 모이어티를 포함하고, 및/또는 검출 양상은 효소이고 및/또는 인식 모이어티는 단일가닥 DNA 올리고, 단일가닥 잠금 핵산 올리고 또는 단일가닥 펩티드 핵산 올리고의 군으로부터 선택된다.
본원에 기술된 방법 및 흐름 시스템의 다른 일 구현예에서, 기체상은 대기에 의해 제공되고, 캡쳐 프로브는 단일가닥 DNA 올리고, 단일가닥 잠금 핵산 올리고 또는 단일가닥 펩티드 핵산 올리고이고, 상이한 유형의 캡쳐 프로브가 영역 내에 배열되고, 분석물은 처리된 혈액 시료로부터 추출된 단일가닥 DNA이고, 표지제는 검출 양상 및 인식 모이어티를 포함하고, 검출 양상은 효소이고 인식 모이어티는 단일가닥 DNA 올리고, 단일가닥 잠금 핵산 올리고 또는 단일가닥 펩티드 핵산 올리고의 군으로부터 선택된다.
이하, 응용의 몇가지 비제한적인 예를 기술한다.
단일 효소면역측정법(sELISA), 여기서 단백질 또는 펩티드 분석물은 표면-결합된 항체-프로브에 의해 포획된 다음, 단일 효소-접합된 검출 프로브에 의해 표지되고 검출된다.
단일 올리고뉴클레오티드 하이브리드화 분석, 여기서 올리코뉴클레오티드 분석물은 표면-결합된 상보성 올리고뉴크레오티드-프로브에 의해 포획된 다음, 단일 효소-접합된 검출 프로브에 의해 표지되고 검출된다.
다른 유형의 응용은 세포, 세포 단편/기관, 박테리아, 바이러스 캡시드 등과 같은 단일 생물학적 개체의 조작 및 정량을 다룬다. 이들의 경우, 분석은 표면-결합된 캡쳐 프로브를 사용하여 전술한 생물학적 개체를 고정한 다음, 특이적 검출 프로브를 적용하여 그들의 수 및 유형을 정량화한다. 대안적으로, 생물학적 개체가 포획된 후, 이들은 파열될 수 있으며, 단백질, 펩티드, 지질 또는 올리고뉴클레오티드의 내용물은 다른 표면-결합된 캡쳐 프로브의 집합에 의해 포획된 다음, 표지되고 단일 효소-접합된 검출 프로브에 의해 검출될 수 있다.
또한, 본 발명은 디지털 중합효소 연쇄반응(dPCR) 또는 이의 변형을 수행하기에 적절할 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, dPCR 분석은 단일 액적 내에 증폭 시약 및 검출 프로브 뿐만 아니라 표적 서열을 함유함으로써 특정 올리고뉴클레오티드를 검출한다. PCR이 일어나면, 표적 서열은 증폭되어 검출 프로브에 의해 검출가능하게 된다. 본 발명의 다른 일 구현예에서, 표적 올리고뉴클레오티드는 표면-결합된 프로브에 의해 먼저 특이적으로 포획된 다음, 증폭 시약 및 검출 프로브가 개별 액적에 공급되어 PCR 및 검출 반응이 일어나는 것을 허용한다.
당업자는 일상적인 실험을 통하여, 본원에 기술된 구현예 및 실시예와의 많은 동등물을 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 본원에 개시된 구현예들에 한정되지 않으며, 아래 특허 청구범위로부터 이해되어야 할 것이며, 이는 법률에 허용되는 만큼 넓게 해석되어야 한다.
본 발명의 추가적 특정 구현예
적어도 하나의 개수부를 갖는 통로 내에 마이크로액적을 배치하는 단계, 마이크로액적의 증발을 감소시킬 수 있는, 통로 내에 증기압을 성립시키는 값으로 통로 부피를 설정하는 단계를 포함하는, 피코리터 이하 부피의 마이크로액적을 기판 상의 제 위치에 액체상으로 보유하기 위한 방법.
특히, 본 발명은 다음의 구현예들에 관한 것이다:
구현예 1. 소수성 기판 내에 또는 상에 친수성 특징부의 패턴을 갖는 지지체를 포함하는, 시료 중의 1종 이상의 분석물을 디지털 계수하기 위한 흐름 시스템으로서, 상기 소수성 기판은 적어도 하나의 개구부를 포함하는 흐름 격실 내에 매립되고, 상기 친수성 특징부는 복수의 나노 내지 아토리터 액적을 지지하도록 배치되고, 각각의 액적은 최대 액적 부피를 갖고, 흐름 격실은 각각의 나노 내지 아토리터 액적의 증발을 감소시키는 기체상 씰을 지지하도록 배치된다.
구현예 2. 구현예 1에 따른 흐름 시스템으로서, 흐름 격실(18)은 부피(V C )를 갖고, 부피(V C )는 모든 나노 내지 아토리터 액적의 합산(aggregate) 최대 액적 부피(V DA ) 보다 크고, 다음 식에 의해 계산된 V MAX 보다 작고:
여기서, ρ L 은 액체의 부피 밀도이고, R은 몰 기체 상수이고, T는 온도이고, RHI는 액체의 기체 성분의 초기 상대 증기 포화도이고, P 0 는 대응 기준 온도 T 0 에서의 액체의 기준 증기압이고, M W 는 액체의 몰 중량이고, ΔH VAP 는 액체의 증발 엔탈피이다.
구현예 3. 구현예 1-2 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 친수성 특징부는 반경(R D )을 갖는 원형이고, 단일 친수성 원이 지지할 수 있는 최대 액적 부피(V D )는 다음과 같고:
여기서, γ는 소수성 기판 상의 액체 접촉각이다.
구현예 4. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 각각의 나노 내지 아토리터 액적의 증발은 최대 액적 부피의 50 퍼센트 미만, 40 퍼센트 미만, 좋기로는 30 퍼센트 미만, 좋기로는 20 퍼센트 미만, 좋기로는 10 퍼센트 미만, 좋기로는 5 퍼센트 미만, 좋기로는 1 퍼센트 미만이다.
구현예 5. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 기체상 씰은 대기, 질소, 아르곤 및/또는 헬륨으로 구성된다.
구현예 6. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 기체상 씰은 대기로 구성된다.
구현예 7. 소수성 기판 내에 또는 상에 친수성 특징부의 패턴을 갖는 지지체를 포함하는, 시료 중의 1종 이상의 분석물을 디지털 계수하기 위한 흐름 시스템으로서, 상기 소수성 기판은 적어도 하나의 개구부를 포함하는 흐름 격실 내에 매립되고, 상기 친수성 특징부는 복수의 나노 내지 아토리터 액적을 지지하도록 배치된다.
구현예 8. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 상기 시스템은 흐름 시스템은 액적 영역을 오버레이하는 하나 이상의 흐름 격실을 포함하여, 액체가 친수성/소수성 패턴에 접촉가능하게 한다.
구현예 9. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 상기 시스템은 흐름 시스템에 액체 및 시약을 공급하기 위한 하나 이상의 액체 로딩 패드를 포함한다.
구현예 10. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 상기 시스템은 흐름 격실(들)을 액체 로딩 패드(들)에 연결시키는 액체 유입구를 포함한다.
구현예 11. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 액체는 유입구로부터 배출구로의 압력 강하에 의해 흐름 통로를 가로질러 작동된다(actuated).
구현예 12. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 흡입을 제공하는 압력 소스에 흐름 통로를 연결시키는 액체 배출구를 포함함으로써, 흐름 통로를 통하여 액체 작동을 매개한다.
구현예 13. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 기체상 씰은 대기, 질소, 아르곤 및/또는 헬륨으로 구성된다.
구현예 14. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 기체상 씰은 대기로 구성된다.
구현예 15. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 상기 시스템은 1종 이상의 구별되는 분석물에 대한 적어도 1종의 캡쳐 프로브를 포함하고, 캡쳐 프로브(들)은 친수성 특징부에 부착된다.
구현예 16. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 상이한 유형의 캡쳐 프로브(들)가 영역에 배열된다.
구현예 17. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 지지체는 평면이다.
구현예 18. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 친수성 특징부(들)는 평면이다.
구현예 19. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 친수성 특징부의 패턴은 친수성 특징부가 배열체로 배열되어 있는 적어도 하나의 영역을 포함한다.
구현예 20. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 친수성 특징부는 2차 평면 배열체로 조직되고, 특징부는 반경(R D )을 갖는 원형으로 형상화되고, 배열체는 인접한 특징부들 사이의 피치(pitch)(δ)를 갖고, 여기서 δ는 적어도 3R D 이고, 배열체는 흐름 방향을 따라 길이(L AX )로 연장되고, 배열체는 흐름 방향의 수직으로 길이(L AY )로 연장되고, 통로는 흐름 방향을 따라 길이(L CX )로 연장되고, 여기서 L CX 는 L AX 보다 크거나 같고, 통로는 흐름 방향의 수직으로 길이(L CY )로 연장되고, 여기서 L CY 는 L AY 보다 크거나 같고, 통로는 2R D 이상이고 h MAX 이하인 높이(h)를 갖고, h MAX 는 다음 식으로부터 계산된다:
여기서, γ는 소수성 물질에 대한 액체 접촉각이고, θ MAX 는 액적의 최대 허용 증발 부피 분율이고, ρ L 은 액체의 부피 밀도이고, R은 몰 기체 상수이고, T는 온도이고, RHI는 액체의 기체 성분의 초기 상대 증기 포화도이고, P 0 는 대응 기준 온도 T 0 에서의 액체의 기준 증기압이고, M W 는 액체의 몰 중량이고, ΔH VAP 는 액체의 증발 엔탈피이다.
구현예 21. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 친수성 특징부의 패턴은 적어도 2개의 영역을 포함하고, 하나의 영역의 배열체는 나머지 영역의 배열체와 다르다.
구현예 22. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 친수성 특징부를 지지하는 영역은 흐름 격실 내의 중심에 위치한다.
구현예 23. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 친수성 특징부의 수는 적어도 1,000, 좋기로는 적어도 10,000, 좋기로는 적어도 100,000, 좋기로는 적어도 1,000,000, 좋기로는 적어도 10,000,000 이다.
구현예 24. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 흐름 격실은 통로 형태이고, 흐름 격실의 대향 단부의 2개의 개구부 사이에서 흐름 방향을 형성한다.
구현예 25. 구현예 13에 따른 흐름 시스템으로서, 흐름 격실 및 개구부는 흐름 방향에 수직인 단면이 직사각형 형태를 갖는다.
구현예 26. 구현예 13에 따른 흐름 시스템으로서, 흐름 격실은 직사각형 형태이고, 개구부는 흐름 방향에 수직인 단면이 원형이다.
구현예 27. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 친수성 특징부는 나노 내지 아토리터 액적을 지지하도록 배치되고, 액체는 소수성 기판 상의 접촉각이 90도 이상 150도 이하이다.
구현예 28. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 친수성 특징부는 0.1 ㎛ 이상 100 ㎛ 이하의 반경을 갖는 나노 내지 아토리터 액적을 지지하도록 배치된다.
구현예 29. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 친수성 기판은 유리, 친수성 폴리머 또는 금속 산화물 화합물이다.
구현예 30. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 소수성 층은 기판에 공유적으로 그라프트된 분자 단일층이다.
구현예 31. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 소수성 층은 금속 기판 상에 화학흡착된 분자 단일층이다.
구현예 32. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 포획 후, 1종 이상의 포획된 분석물은 캡쳐 프로브에 공유적으로 가교되거나 커플링된다.
구현예 33. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 캡쳐 프로브는 올리고뉴클레오티드 또는 합성 올리고뉴클레오티드이고, 분석물은 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 분자 복합체이고, 분석물은 캡쳐 프로브 서열에 상보적 서열을 통해 캡쳐 프로브에 결합되고, 공유적 가교는 사슬간 가교제, 예컨대 백금 착물, 마이토마이신 C, 질소 머스터드, 소랄렌 또는 알데히드를 사용하여 수행된다.
구현예 34. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 캡쳐 프로브는 단백질, 펩티드 또는 이들의 합성 변이체이고, 분석물은 단백질, 펩티드 또는 단백질 또는 펩티드를 함유하는 복합체이며, 분석물은 분석물의 특정 영역의 구조적 인식에 의해 캡쳐 프로브에 결합되고, 여기서 공유적 가교는 화학적 고정제, 예컨대 포름알데히드, 글루타알데히드, 사산화오스뮴 또는 우라닐 아세테이트를 사용하여 수행된다.
구현예 35. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 디지털 계수는 디지털 계수 측정이다.
구현예 36. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 단일-효소 결합 분자 분석(SELMA), 디지털 중합효소 연쇄반응(dPCR), 단일 효소면역측정법(sELISA) 또는 디지털 단일 효소면역측정법(dELISA)이다.
구현예 37. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 흐름 시스템의 제조방법.
구현예 38. 적어도 1종 이상의 구별되는 분석물을 디지털 계수하기 위한, 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 흐름 시스템의 제조방법.
구현예 39. 적어도 1종 이상의 구별되는 분석물을 디지털 계수하는 방법으로서, 상기 방법은 기체상 씰 하의 복수의 나노 내지 아토리터 액적에 함유된 분석물을 계수하는 것을 포함한다.
구현예 40. 구현예 39에 따른 방법으로서, 기체상 씰은 마이크로액적의 증발을 감소시킬 수 있는, 흐름 시스템 내 증기압을 성립시킨다.
구현예 41. 구현예 39-40 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 디지털 계수는 흐름 시스템에서 수행되고, 상기 시스템은 소수성 기판 내에 또는 상에 친수성 특징부의 패턴을 갖는 지지체를 포함하고, 상기 소수성 기판은 적어도 하나의 개구부를 포함하는 흐름 격실 내에 매립되고, 상기 친수성 특징부는 복수의 나노 내지 아토리터 액적을 지지하도록 배치된다.
구현예 42. 구현예 39-41 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 친수성 특징부는 반경(R D )을 갖는 원형이고, 단일 친수성 원이 지지할 수 있는 최대 액적 부피(V D )는 다음과 같고:
여기서, γ는 소수성 기판 상의 액체 접촉각이다.
구현예 43. 구현예 39-42 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 기체상 씰은 각각의 나노 내지 아토리터 액적의 증발을 최대 액적 부피의 50 퍼센트 미만으로 감소시킨다.
구현예 44. 구현예 39-43 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 흐름 시스템은 구현예 1-36 중 어느 하나에 정의된 바와 같다.
구현예 45. 구현예 39-44 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 방법은 (i) 소수성 기판 내의 또는 상의 친수성 특징부의 패턴을 1종 이상의 분석물을 함유하는 시료와 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
구현예 46. 구현예 39-45 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 방법은 (ii) 적어도 1종의 분석물을 친수성 특징부 상에 포획하는 단계를 포함한다.
구현예 47. 구현예 39-46 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 방법은 (iii) 검출될 분석물 종에 특이적인 표지제를 사용하여 적어도 1종의 포획된 분석물을 표지하는 단계를 포함한다.
구현예 48. 구현예 39-47 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 방법은 (iv) 검출제를 패턴을 가로질러 흐르게 하고 패턴으로부터 회수하여 개별 액적을 나노 내지 아토리터 액적의 형태로 생성하는 단계를 포함한다.
구현예 49. 구현예 39-48 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 방법은 (v) 표지제 및 검출제 모두를 수용하는 액적의 수를 계수하는 단계를 포함한다.
구현예 50. 구현예 39-49 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 방법은 단계 (iii), (iv) 및 (v)를 1회 이상 반복하는 것을 포함한다.
구현예 51. 구현예 39-50 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 방법은 제1 표지제를 사용하는 대신 검출될 제2 분석물 종에 특이적인 제2 표지제를 사용하여, 단계 (iii), (iv) 및 (v)를 반복하는 것을 포함한다.
구현예 52. 구현예 39-51 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 방법은 단계 (iii), (iv) 및 (v)를 반복하기 전에 이전 단계에 존재하는 표지제를 비활성화시키는 단계를 포함한다.
구현예 53. 구현예 39-52 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 표지제는 표면-결합된 분석물로부터 분리되어 비활성화되고 흐름 시스템의 플러싱에 의해 제거된다.
구현예 54. 구현예 39-53 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 표지제는 효소적 절단에 의해 분리된다.
구현예 55. 구현예 39-54 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 표지제는 pH의 조정, 이온 강도의 조정, 변성 염의 첨가 또는 세제의 첨가에 의해, 화학적 절단 또는 탈착함으로써 분리된다.
구현예 56. 구현예 39-55 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 표지제는 흐름 시스템의 온도를 높임으로써 분리된다.
구현예 57. 구현예 39-56 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 표지제는 화학적 또는 물리적 상태를 변화시킴으로써 비활성화된다.
구현예 58. 구현예 39-57 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 표지제는 효소를 포함하고, 효소의 상태는 활성 부위의 화학적 또는 생화학적 변형에 의해 변화된다.
구현예 59. 구현예 39-58 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 표지제는 효소를 포함하고, 효소의 상태는 효소의 3차원 구조의 화학적 또는 물리적 파괴에 의해 변화된다.
구현예 60. 구현예 39-59 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 표지제는 효소 및 특정 분석물 인식 모이어티를 포함하고, 분석물 인식 모이어티는 다음 분자들로 이루어진 군으로부터 선택된다: 올리고뉴클레오티드, 단백질, 펩티드, 압타머, 항체, 이들의 복합체 또는 이들의 합성 변이체.
구현예 61. 구현예 39-60 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 1종 이상의 구별되는 분석물에 대한 1종 이상의 캡쳐 프로브는 친수성 특징부에 부착된다.
구현예 62. 구현예 39-61 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 1종 이상의 구별되는 분석물에 대한 1종 이상의 캡쳐 프로브는 링커 모이어티에 의하여 친수성 특징부에 부착되고, 링커 모이어티는 다음 분자들의 군으로부터 선택된다: 폴리(에틸렌 글리콜), 선형 또는 분지형 알칸, 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 합성 변이체.
구현예 63. 구현예 39-62 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 방법은 친수성 특징부에 부착된 2종 이상의 캡쳐 프로브를 포함하고, 상이한 유형의 캡쳐 프로브들이 영역들에 배열된다.
구현예 64. 구현예 39-63 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 캡쳐 프로브는 다음 프로브 군으로부터 선택된다: 올리고뉴클레오티드, 단백질, 펩티드 또는 이들의 합성 변이체.
구현예 65. 구현예 39-64 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 액체 중에 1종 이상의 분석물을 함유하는 시료를 완전 침지에 의해 친수성 특징부를 함유하는 기판과 접촉시킨다.
구현예 66. 구현예 39-65 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 방법은 액체를 제거하고 기판을 세척하는 것을 포함한다.
구현예 67. 구현예 39-66 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 표지는 분석물에 대한 표지제를 함유하는 용액을 완전 침지를 통해 포획된 분석물과 접촉시킴으로써 수행된다.
구현예 68. 구현예 39-67 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 방법은 잔류 프로브를 함유하는 용액을 제거하고 기판을 세척하는 것을 포함한다.
구현예 69. 구현예 39-68 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 액체는 유입구로부터 배출구로의 압력 강하에 의해 흐름 통로를 가로질러 작동된다.
구현예 70. 구현예 39-69 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 분석물은 다음 분석물 군으로부터 선택된다: 단일가닥 올리코뉴클레오티드, 이중가닥 올리코뉴클레오티드 복합체, 단백질, 단백질/올리코뉴클레오티드 복합체, 단백질/지질 복합체, 펩티드, 엑소좀, 바이러스 입자, 바이러스 유사 입자, 나노입자, 세포 단편 또는 세포.
구현예 71. 구현예 39-70 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 시료는 다음 시료 군으로부터 선택된다: 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 뇌척수액, 눈물 또는 조직.
구현예 72. 구현예 39-71 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 시료는 다음 시료 군의 실험실 처리 시료로부터 선택된다: 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 뇌척수액, 눈물 또는 조직, 예컨대 처리된 혈액 시료.
구현예 73. 구현예 39-72 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 포획 후, 1종 이상의 포획된 분석물은 캡쳐 프로브에 공유적으로 가교되거나 커플링된다.
구현예 74. 구현예 39-73 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 캡쳐 프로브는 올리고뉴클레오티드 또는 합성 올리고뉴클레오티드이고, 분석물은 캡쳐 프로브 서열에 상보적 서열을 통해 캡쳐 프로브에 결합되고, 공유적 가교는 사슬간 가교제, 예컨대 백금 착물, 마이토마이신 C, 질소 머스터드, 소랄렌 또는 알데히드를 사용하여 수행된다.
구현예 75. 구현예 39-74 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 캡쳐 프로브는 단백질, 펩티드 또는 이들의 합성 변이체이고, 분석물은 단백질, 펩티드 또는 단백질 또는 펩티드를 함유하는 복합체이며, 분석물은 분석물의 특정 영역의 구조적 인식에 의해 캡쳐 프로브에 결합되고, 여기서 공유적 가교는 화학적 고정제, 예컨대 포름알데히드, 글루타알데히드, 사산화오스뮴 또는 우라닐 아세테이트를 사용하여 수행된다.
구현예 76. 구현예 39-75 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 디지털 계수는 디지털 계수 측정이다.
구현예 77. 구현예 39-76 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 단일-효소 결합 분자 분석(SELMA), 디지털 중합효소 연쇄반응(dPCR), 단일 효소면역측정법(sELISA) 또는 디지털 단일 효소면역측정법(dELISA)이다.
구현예 78. 구현예 1-38 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템으로서, 기체상은 대기에 의해 제공되고, 및/또는 캡쳐 프로브는 단일가닥 DNA 올리고, 단일가닥 잠금 핵산 올리고 또는 단일가닥 펩티드 핵산 올리고의 군으로부터 선택되고, 및/또는 상이한 유형의 캡쳐 프로브가 영역 내에 배열되고, 및/또는 분석물은 처리된 혈액 시료로부터 추출된 단일가닥 DNA이고, 및/또는 표지제는 검출 양상 및 인식 모이어티를 포함하고, 및/또는 검출 양상은 효소이고 및/또는 인식 모이어티는 단일가닥 DNA 올리고, 단일가닥 잠금 핵산 올리고 또는 단일가닥 펩티드 핵산 올리고의 군으로부터 선택된다.
구현예 79. 구현예 39-77 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 기체상은 대기에 의해 제공되고, 및/또는 캡쳐 프로브는 단일가닥 DNA 올리고, 단일가닥 잠금 핵산 올리고 또는 단일가닥 펩티드 핵산 올리고의 군으로부터 선택되고, 및/또는 상이한 유형의 캡쳐 프로브가 영역 내에 배열되고, 및/또는 분석물은 처리된 혈액 시료로부터 추출된 단일가닥 DNA이고, 및/또는 표지제는 검출 양상 및 인식 모이어티를 포함하고, 및/또는 검출 양상은 효소이고 및/또는 인식 모이어티는 단일가닥 DNA 올리고, 단일가닥 잠금 핵산 올리고 또는 단일가닥 펩티드 핵산 올리고의 군으로부터 선택된다.
구현예 80. 적어도 1종 이상의 구별되는 분석물을 디지털 계수하는데 사용되는, 기체상 씰 하의 복수의 나노 내지 아토리터 액적의 용도.
구현예 81. 구현예 80에 따른 용도로서, 이는 구현예 39-77 및 79 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수행된다.
구현예 82. 구현예 80-81 중 어느 하나에 따른 용도로서, 이는 구현예 1-38 및 78 중 어느 하나에 따른 흐름 시스템에서 수행된다.
이하, 몇가지 비제한적인 실시예가 기술된다:
실시예 1: 펨토리터 수성 마이크로액적 배열체의 형성 및 보존
안정한 마이크로액적을 형성하기 위하여, 평면 소수성 영역 상에 매립된 친수성 원형 특징부의 규칙적인 사각형 배열체를 인산완충 수용액과 접촉시켰다. 용액의 10 ㎕의 플러그가 배열체 표면을 가로질러 작동되어, 도 4의 현미경 사진에 나타낸 바와 같이 친수성 특징부 상에 마이크로액적을 남겼다.
흐름 시스템은 액체를 안내하기 위한 직사각형 통로의 양단에 있는 2개의 개구부에 의해 정의되었다. 통로의 폭은 3 mm이고, 길이는 16 mm이며, 높이는 150 ㎛이었다. 배열체는 통로의 중심에 위치하고, 2.9 mm의 폭, 14 mm의 길이를 갖고, 총 406,000개의 친수성 특징부로 구성되었다. 친수성 원의 직경은 5 ㎛이고, 원 간의 간격은 10 ㎛이었다. 소수성 표면 상의 수용액의 접촉각은 대략 110도이고, 실험은 주변 온도 21℃에서 수행되었다. 액적 부피의 최대 3%가 증발하도록 허용되었고, 이는 식 11에 따라 건조 공기(RHI = 0)의 경우 대략 680 ㎛의 통로 최대 높이를 암시한다. 흐름 격실의 높이가 단지 150 ㎛이므로 최대 높이 미만이기 때문에, 기체상 씰은 기능적이었고 마이크로액적을 손상 없이 지킬 수 있었다.
통로 유입구에 연결된 로딩 패드로 10-㎕ 부피를 넣음으로써 배열체를 벌크 수용액과 접촉시켰다. 다음으로, 통로 배출구에서 음압을 가하여, 10-㎕ 액체 플러그를 5 ㎕/min의 유속으로 통로를 가로지르도록 작동시켰다. 벌크 액체의 물러가는(receding) 모서리가 통로 배출구에 도달하면, 압력이 종결되고 새로운 액체 플러그가 로딩 패드에 위치한다. 기능성 가스상 씰에 의해, 친수성 특징부 상단에 형성된 액적은 상당한 증발을 겪지 않으면서 1시간 넘게 안정하게 남아있었다. 도 12C 참조.
실시예 2: 흐름 통로-, 액적- 및 배열체-기하학적 구조를 최적화함으로써, 증발-저항성의 수성 마이크로액적 배열체를 만드는 방법
화학적으로 패턴화된 고체 기판이 매립된 흐름 통로를 고려하자. 화학적 패턴은 배열체로 조직된 원형의 친수성 영역으로 구성된다. 친수성 배열체는 연속적인 소수성 영역에 의해 둘러싸인다. 이러한 방식으로, 수용액이 주입된 후 흐름 통로로부터 회수되면, 실시예 1에서 묘사한 바와 같이 액적의 배열체는 친수성 특징부 상단에 형성된다.
흐름 통로의 크기는 도 13에 정의되어 있고, 통로의 높이 h, 배열체에 의해 덮인 흐름 통로의 길이 l A , 및 유입구/배출구로 이어지는 통로의 초과 부분으로서 배열체를 수용하지 않는 길이 l E 로 특징 지어진다. 배열을 정의하는 파라미터는 고체 기판 상의 친수성 특징부의 반경으로 정의되는 액적 반경 R D , 및 인접한 액적들 사이의 중심간 거리인 δ이다. 이하, 사각형 패턴으로 조직된 배열체를 가정할 것이지만, 다른 배열체 패턴에 대한 솔루션들이 아래에 나타낸 바와 같은 원칙을 이용하여 유도될 수 있다.
먼저, 흐름 통로에 존재하는 물의 총 몰량을 계산할 것이다. 이는 액적 부피(V D )를 계산하고 존재하는 액적의 총 수로 곱함으로써 이루어진다. 액적은 구(sphere) 부피의 절반을 나타내는 반구로 표시될 수 있다고 가정한다. 배열체 및 흐름 통로가 y-방향을 따라 동일하기 때문에, 단일 라인의 액적으로 구성된 (스케치된 것과 같이) 1차원 배열체 및 액적간 간격 δ의 폭을 갖는 유사(pseudo) 1차원 흐름 통로를 고려하면 된다. 1차원 배열체에 있는 액적의 총 수(N D )는 다음과 같다:
모든 액적의 총 몰량(n TOT )은 이제 다음과 같이 평가될 수 있다:
여기서, m w 는 모든 액적의 총 질량이고, M W 는 물의 몰 중량(18.016 g/mol)이고, ρ w 는 물의 밀도(1000 g/l)이다. 주어진 온도에서 증발하게 될 물의 양을 계산하기 위하여, Clausius-Clapeyron 식을 활용하여 물의 평형 증기압(P W )을 계산하여야 한다:
여기서, P 0 는 기준 온도 T 0 에서 기준 평형 증기압이고, T는 반응 온도이고, R은 기체 상수(8.31 Jㆍmol-1ㆍK- 1)이고, ΔH VAP (40.65 kJㆍmol- 1)는 물의 증발 후 엔탈피 변화이다. T 0 및 P 0 에 대한 적절한 값은 각각 293 K의 온도에서 2.34 kPa이다. V F 의 부피를 갖는 폐쇄된 흐름 통로의 경우, 물의 증기압은 수증기로서 공기 중으로 전달될 수 있는 물의 양을 나타낸다. 평형에서 물의 몰량(n EVAP )은 이상 기체 법칙으로부터 다음과 같다:
증발된 물의 분율(θ W )은 이제 물의 총 몰량에 대한 증발된 물의 비율로 평가될 수 있다:
다음을 도입할 것이다: (i) 배열체를 특징짓는 기하학적 파라미터인 무차원(dimensionless) 환산 계수 
(즉, N-값이 클수록 배열체가 거의 채워지지 않음), 및 (ii) 흐름 통로 디자인을 특징짓는 기하학적 파라미터인 무차원 환산 계수 
(즉, 큰 φ-값은 배열체가 흐름 통로의 작은 일부만을 차지하는 것을 나타냄). 이 기호법을 사용하면, 식 16은 다음과 같이 재작성될 수 있다:
식 17은 원하는 최대 증발 분율(θ MAX )이 선택되면, 대응하는 최대 높이(h MAX )가 다음과 같이 평가될 수 있도록 재배열될 수 있다:
도 11에서, 식 17 및 식 18은 다양한 흐름 통로/액적/배열체의 기하학 및 온도에 대하여 플롯팅되어 있다. 또한, 도 12에서, 온도 및 흐름 통로 기하학의 함수로서 액적 안정성의 실험적 증명이 도시되어 있다. 액적 보존을 위해 최적화된 흐름 통로의 경우(도 12C), 액적 배열체는 온도 범위(여기에 증명된 바와 같이, 25-45℃)에서 및 1.5 시간의 오랜 기간 동안 안정하게 남아있다. 원칙적으로, 일단 열역학 평형이 수립되면, 액적 배열체는 무기한으로 안정될 것이다. 그러나 실제로는, 흐름 통로/배열체는 외부 환경으로부터 완전하게 씰링될 수 없으므로, 액적은 서서히 증발할 수 있다.
실시예 3: 흐름 시스템의 제조
흐름 시스템의 제조는 2개의 주요 단계로 진행된다; 한 단계는 UV 포토리소그래피 및 미세가공(microfabrication) 처리를 활용하여 패턴화된 친수성 특징부를 생성하는 반면, 두번째 단계는 적합한 기하학적 구조를 나타내는 친수성 패턴을 흐름 격실에 통합시키는 것을 다룬다. 이하, 2 단계를 더욱 상세하게 기술한다.
패턴화된 친수성 기판의 미세가공
본 발명의 이 구현예에서, 친수성 특징부는 석영(SiO2)으로 구성되었고, 소수성 영역은 퍼플루오로데실트리클로로실란(FDTS)으로 구성되었다. 제조 공정의 첫 단계에서, FDTS의 분자 단일층은 MVD 100 분자 기상 증착 시스템(Applied Microstructures Inc.)을 이용하여 분자 기상 증착에 의해 석영 웨이퍼 상에 증착되었다. FDTS는 석영 표면 상의 실라놀기에 공유적 부착을 일으켜 웨이퍼 표면 상에 소수성 단일층을 생성하였다.
다음으로, AZ5214E 포토레지스트(Microchemicals GmbH) 층을 스핀-코팅에 의해 FDTS-처리된 웨이퍼 상단에 증착시킨 다음, 90℃에서 웨이퍼를 소프트 베이크하여 과량의 용매를 증발시켰다. SUSS 마스크 얼라이너, 모델 MA6(SUSS MicroTec)을 사용하여 포토레지스트를 크롬 마스크를 통해 UV 조사에 노출시킨 후, AZ351B 현상액(Microchemicals GmbH)에서 웨이퍼를 현상하였다. 이러한 방식으로, 포토레지스트의 연결된 패턴이 웨이퍼 상에 잔류하여 원형의 구멍을 아래의 FDTS 단일층에 노출시켰다.
최종 처리 단계에서, FDTS 단일층을 선택적으로 제거하여 그 아래의 친수성 석영 표면을 노출하였다. 이는 모델 300 플라즈마 프로세서(TePla)를 이용하여 짧은 기간 동안 산소-플라즈마로 웨이퍼를 처리하여, FDTS 단일층을 제거하지만 더 두꺼운 포토레지스트 필름을 남겨둠으로써 달성되었다. 포토레지스트 필름을 제거하기 위하여 웨이퍼를 아세톤에서 10분 동안 초음파 처리하여 필름을 용해시킴으로써, 소수성 FDTS 분자 단일층에 의해 둘러싸인 친수성 석영 특징부의 패턴을 제공하였다.
흐름 통로에 미세가공된
배열체의
통합
통합 전에, 미세구조화된 웨이퍼를 흐름 격실 내로 맞추기 위해 직사각형 조각(25 mm x 12 mm)으로 절단하였다. 배열체가 추가 표면 기능화를 필요로 하는 경우, 아래 실시예 4-5에 기술한 바와 같이, 격실 통합 전에 기능화 프로토콜을 수행하였다.
폴리(메틸 메타크릴레이트((PMMA) 시트를 CNC 밀링하여 흐름 통로 및 액체 로딩 패드를 준비하였다. 흐름 통로는 폭이 1 mm, 길이가 8 mm, 높이가 100 ㎛, 벽 두께가 200 ㎛이었다. 흐름 통로는 액체 작동에 필요한 흡입을 제공하는 연동 펌프에 연결된 배출구에서 끝난다. 액체 로딩 패드는 대략 100 ㎕의 부피를 나타내었고, 유입구를 통해 흐름 통로에 연결되었다. 흐름 통로, 로딩 패드, 유입구 및 배출구는 단일의 8 mm 두께의 PMMA 슬래브(slab)를 깎아서 만들었으며, 이는 이후에 PMMP 흐름 구조체라고 칭할 것이다.
미세가공된 친수성 특징부의 배열체를 수용하는 직사각형 웨이퍼-조각(칩)을 PMMP 흐름 구조체에 부착하기 위하여, 공칭 두께가 142 ㎛인 양면 압력감지 접착 필름(ARcare 90106, Adhesives Research, Inc.) 조각을 CO2 레이저 장비를 절단하였다. 레이저-절단된 접착 필름의 기하학적 구조를 PMMP 흐름 구조체와 일치시켰으나, 약간 작게 하여 흐름 통로가 접착제에 둘러싸이지만 접촉하지는 않게 하였다. 다음으로, 접착제를 PMMA 바닥면에 부착시킨 후, 접착제의 상단에 배열체 칩을 위치시켰다. 어셈블리(PMMA 흐름 구조체, 접착제 및 배열체 칩)를 2개의 평평한 5 mm 두께의 PMMA 시트 사이에 샌드위치로 끼우고 본딩 프레스에 위치시켰다. 이 샌드위치를 6 kN의 압력 및 40℃에서 60초 동안 클램핑하였다. 이러한 방식으로, 접착제는 흐름 통로의 높의로 정의된 바와 같이 100 ㎛의 두께로 압축되었다. 얻어진 결합된 어셈블리는 기능적 흐름 시스템을 정의하였다.
실시예 4: 단일 DNA 분자의 디지털 계수
이 실시예는 통합된 액적 배열체 칩을 갖는 흐름 시스템의 사용에 의해 단일 생체 분자(이 경우, 단일가닥 DNA)가 어떻게 검출되고 디지털 계수될 수 있는지 보여준다. 흐름 시스템 어셈블리는 실시예 1-3에 기술된 방법에 따라 생산되고 가동되었으나, PMMA 흐름 구조체에 액적 배열체 칩을 통합시키기 전에 칩을 추가 표면 기능화 처리하여 단일가닥 표적 DNA의 특이적인 포획을 가능하게 하였다. 미세가공된 칩은 직경이 4 ㎛인 93,750개의 원형 친수성 특징부로 구성되었고, 특징부간 간격이 8 ㎛인 사각형 배열체로 배열되었다.
표면 기능화 프로토콜
액적 배열체 칩을 아세톤에서 10분 동안 초음파 처리한 후, 에탄올에서 10분 동안 초음파 처리하여 완전히 세척하였다. 칩을 질소 흐름 하에 건조시키고, 95% (v/v) 에탄올 중의 1% (v/v) 에폭시실란(Dynasylan GLYEO, Evonik Industries) 용액에 침지시켰다. 칩을 에폭시실란 용액에 30분 동안 배양시킨 후, 95% 에탄올로 3번 세척하고 질소 흐름 하에서 건조시키고, 110℃에서 30분 동안 경화시켰다.
다음으로, 실란화된 칩 상의 에폭시기를 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티 상에 존재하는 아민기와 반응시켰다. 폴리(에틸렌 글리콜)은 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)2000-아민(OH-PEG2000-NH2)(Jenkem Technology)과 카르복시산-폴리(에틸렌 글리콜)2000-아민(COOH-PEG2000-NH2)(Jenkem Technology)과의 혼합물로 구성되었다. 이 혼합물은 OH-PEG2000-NH2 대 COOH-PEG2000-NH2이 10:1 몰비를 갖고, 10 mM 인산완충 식염수(PBS)(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 M 암모늄설페이트, pH 7.4) 중의 공칭 총 농도가 100 g/l이었다. 칩을 이 혼합물로 40℃에서 20시간 동안 배양하였다. 이어서, 칩을 Milli-Q 물(Millipore Corp.)로 3번 세척하고 질소 흐름 하에서 건조시켰다.
최종 표면 변형 단계에서, 칩을 DNA 표적에 특이적인 캡쳐 프로브로 기능화시켰다. 캡쳐 프로브는 N-말단에 리신기를 갖는 14-머(mer) 펩티드 핵산(PNA)이었고, 이는 표면 그라프트된 COOH-PEG2000-NH2 상의 카르복시산기에 부착시키기 위하여 사용되었다. N-말단에서 C-말단까지의 PNA 프로브 서열은 K-O-ACA TAG TTG ACA CG-OO (SEQ ID NO: 1: ACA TAG TTG ACA CG) (Panagene)이었고, 여기서 K는 리신기를 나타내고, O는 에틸렌글리콜 링커를 나타내며, 문자 G, C, A 및 T는 DNA 핵산염기의 PNA 유사체를 나타낸다.
우선, 각 화합물에 대하여 25 g/l의 공칭 농도를 갖는 100 mM 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES) 완충액 중의 N-히드록시숙신이미드와 N-(3-디메틸아미노프로필)-N′-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드와의 1:1 몰비의 혼합물에 칩을 침지시킴으로써, PNA 프로브에 대한 반응을 위하여 칩의 표면을 준비하였다. 이 혼합물에서 4℃에서 30분 동안 칩을 배양시킨 후, 100 mM MES 완충액에서 간단히 플러싱하였다. 다음으로, 칩을 100 mM MES 완충액 중의 100 nM PNA 프로브 용액에 침지시키고, 주위 온도에서 30분 동안 배양시켰다. 이어서, 칩을 100 mM MES 완충액에서 간단히 플러싱한 후, 50 mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄에 10분 동안 침지시켰다. 칩을 Milli-Q 물로 3번 플러싱하고, 질소 흐름 하에서 건조시키고, 실시예 3에서 개략한 바와 같이 PMMA 흐름 구조체에 결합시킬 때까지 진공 데시케이터에 보관하였다.
검출 프로토콜
검출용 표적은 50-bp DNA 올리고(5'- TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTC AAC TAT GT-3' (SEQ ID NO: 2))이었다. DNA 올리고의 마지막 14개의 염기쌍은 PNA 캡쳐 프로브와 상보적인 반면, DNA 올리고의 처음 12개의 염기쌍은 DNA-기반 표지제에 상보적이었다. 표지제는 서양고추냉이 페록시다아제 효소에 접합된 하나 이상의 12-bp DNA 올리고로 구성되었다. 표지 DNA 올리고의 서열은 5'- GCC TAC GAC AGA -3'-TEG-비오틴 (SEQ ID NO: TEG-비오틴에 커플링된 3)이었으며, 여기서 TEG는 테트라(에틸렌 글리콜) 링커를 나타낸다.
표지제는 뉴트라비딘-서양고추냉이 페록시다아제(NAv-HRP) 접합체(Invitrogen, A2664)와 표지 올리고를 NAv-HRP 대 올리고의 1:3 몰비로 혼합시켜 제조하였다. NAv-HRP의 최종 농도는 100 nM이었고, 혼합물은 5X 시트르산 나트륨 식염수(saline sodium citrate: SSC) 버퍼(1.0 g/l의 소혈청 알부민(BSA), 0.5% (v/v)의 Triton X-100, pH 7.0) 중에서 제조하였다. 이 혼합물을 4℃에서 24시간 동안 배양하여 비오틴화 DNA 올리고가 NAv-HRP 상의 뉴트라비딘 모이어티에 부착될 수 있게 하였다. 얻어진 접합체는 NAv-HRP 당 평균 3개의 결합된 DNA 올리고를 나타내었고 이후 NAv-HRP-LO3로 약칭될 것이다.
다음 완충액이 검출 실험에 사용되었다:
부동화(passivation) 완충액: 5X SSC buffer, 0.5% (v/v) Triton X-100, 10 g/l BSA, pH 7.0.
표지 완충액: 5X SSC buffer, 0.5% (v/v) Triton X-100, 10 g/l BSA, pH 7.0.
세척 완충액 1: 10 mM PBS, 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.1% (v/v) Triton X-100, 50 g/l 20 kDa 몰 중량의 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG20000), pH 7.4.
세척 완충액 2: 10 mM PBS, 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 50 g/l PEG20000, pH 7.4.
검출 완충액: 10 mM PBS, 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 g/l PEG20000, 1.0 mM H2O2, pH 7.4.
검출 실험 직전에, 다양한 공칭 DNA 표적 농도(10 fM, 1 fM 및 100 aM) 및 DNA 표적을 함유하지 않은 대조군의 용액을 5X SSC 완충액(0.5% Triton X-100, pH 7.0)에서 제조하였다. 검출 실험을 수행하기 위하여, 흐름 시스템을 다음 방식으로 가동시켰다:
단계 1: 25 ㎕의 DNA 표적 용액을 흐름 통로를 통해 0.2 ㎕/min의 유속으로 작동시킨다.
단계 2: 10 ㎕ 부동화 완충액을 흐름 통로로 주입시킨다.
단계 3: 10분 동안 배양시키고, 흐름 통로 밖으로 용액을 작동시킨다.
단계 4: 표지 완충액 중의 10 ㎕의 50 pM NAv-HRP-LO3을 흐름 통로로 주입시킨다.
단계 5: 10분 동안 배양시키고, 흐름 통로 밖으로 용액을 작동시킨다.
단계 6: 100 ㎕의 세척 완충액 1을 10 ㎕/min의 유속으로 작동시킨다.
단계 7: 100 ㎕의 세척 완충액 2를 10 ㎕/min의 유속으로 작동시킨다.
단계 8: 검출 완충액 중의 3 ㎕의 200 ㎛ Ampliflu red(Sigma Aldrich, 90101-5MG-F) 용액을 5 ㎕/min의 유속으로 작동시킨다.
간단히 말해, 단계 1에서 상기 프로토콜은 DNA 표적이 표면-부착된 PNA 캡쳐 프로브에 결합할 수 있게 하였다. 다음으로, 단계 4-5에서 포획된 DNA 표적은 NAv-HRP-LO3 에 의해 표지되었다. 단계 6-7에서 과량의 표지제를 제거한 후, 단계 8에서 검출 시약 Ampliflu red를 함유하는 마이크로액적이 만들어졌다. Ampliflu red는 서양고추냉이 페록시다아제에 대한 형광 기질이며, 이는 효소 처리 과정에서 형광성 화합물인 레조루핀(여기 570 nm, 방출 585 nm)으로 전환된다. 결과적으로, 검출제를 수용하는 액적은 형광 신호를 생성하였고, 이는 형광 현미경을 사용하여 용이하게 검출되었다.
단계 8에 이어, 레조루핀으로부터 방출된 신호를 검출하기 위하여, 적절한 형광 필터-세트와 함께 555-nm LED 여기 소스를 사용하여 형광 현미경(Zeiss Axio Vert.A1) 하에 흐름 시스템을 검사하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 대응하는 명시야 및 형광 현미경 사진을 1.4 MP CCD 카메라(AxioCam MR3)로 기록하였다.
형광 액적의 수를 계수하기 위하여, 형광 현미경 사진을 이미지 분석 소프트웨어 ImageJ를 사용하여 정량화하였다. 간단히 말해, 특정 강도 임계값 아래의 픽셀 값을 0으로, 위의 픽셀 값을 1로 포맷팅함으로써, 그레이스케일 현미경 사진을 2진법 형식으로 전환하였다. 다음으로, 값 "1"의 연결된 픽셀 클러스터를 계수하였다. 4개의 픽셀 미만으로 구성된 클러스터는 노이즈로 버렸다. 전체 배열체에 대한 총 클러스터 수를 후속 데이터 분석을 위하여 기록하였다. 동일한 강도 임계값을 모든 검출 실험으로부터 얻은 모든 형광 현미경 사진에 적용하였다.
총 20회의 검출 실험으로부터 얻은 결과를 도 15에 나타내었다. 이 도면은 DNA 표적의 상이한 농도에 대하여 검출가능한 형광 신호를 나타내는, 배열체 상에 존재하는 액적의 백분율을 나타낸다. DNA 표적이 존재하지 않는 대조군 시료에서, 여전히 많은 액적들이 검출가능하였다. 이는 배열체 상에 비특이적으로 결합된(예를 들어, 물리 흡착 또는 화학 흡착) 표지제의 존재에 기인한 것 같다. 비특이적 결합(non-specific binding: NSB)은 일반적인 현상으로 단일 분자 계수와 같은 고감도 응용분야에서 더욱 두드러진다. 여기에 제시된 실험에서, NSB 표지제를 수용하는 액적의 분율은 0.280 +/- 0.097%이었다 (5회 실험에서 평균 +/- 표준편차). 한편, 표적 DNA를 함유하는 시료는 검출가능한 마이크로액적의 분율이 더 높다는 것을 발견하였고, 따라서 분자 표적의 미세한 양의 특이적 검출 및 정량화를 입증하였다. 그러나, 표적 DNA의 농도가 증가할 경우, 형광 액적의 수가 직접 비례 방식으로 증가하지 않았다. 이는 예를 들어 흐름 시스템의 나머지 표면의 비특이적 흡착에 의한 농도 의존적인 표적의 손실에 기인한 것이거나, 표면-결합된 DNA 표적의 불완전한 표지에 기인한 것일 수 있다.
실시예 5: 단일 DNA 분자의 반복 검출
이 실시예는 포획된 DNA 표적이 표지제의 어떻게 비활성화에 의해 반복적으로 검출될 수 있는지 보여준다. 흐름 시스템은 실시예 1-3에 따라 제조되고 가동되었고, 실시예 4에 제공된 표면 기능화 프로토콜에 따라 기능화되었다.
이하에 묘사하는 바와 같이, 포획된 표적의 반복 검출의 장점은 검출이 반복될 때마다 신호-대-노이즈 비율이 개선되어, 검출 한계가 개선된다는 것이다. 또한, 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형(single nucleotide polymorphism: SNPs)을 품고있는 DNA 표적과 SNPs가 없는 것을 빼고는 동일한 야생형 DAN 가닥 사이를 구별하는 특이성(specificity)을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 실시예 6.
본 실시예에서, 실시예 4에서 기술된 동일한 검출 프로토콜을 적용하였으나, 표지 및 검출 단계를 3번 반복하였다. 캡쳐 프로브는 PNA를 기반으로 하였고, 표지제는 DNA를 기반으로 하였기 때문에, 캡쳐 프로브/표적-복합체를 손상시키지 않으면서, T7 엑소뉴클레아제를 사용하여 표지제를 선택적으로 제거하여 표지제를 소화시킬 수 있었다. 또한, NSB 표지제로부터의 신호를 제거하기 위하여, 프로브의 효소 부분을 페놀 용액으로 비활성화시켰고, 이는 페록시다아제 효소의 활성 부위 구조를 선택적으로 변화시켜, 다음 검출 분석에서 신호의 생성을 방지하였다.
부동화 완충액, 표지 완충액, 세척 완충액 1, 세척 완충액 2 및 검출 완충액은 실시예 4에서 적용된 것과 동일하였다. 또한, 다음 2가지 시약을 적용하였다:
소화 완충액: 50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM 트리스-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 1 mM DTT, pH 7.9 중의 1500 units/ml의 T7 엑소뉴클레아제 (New England Biolabs, M0263L)
비활성화 완충액: 10 mM PBS, 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4 중의 5.0 mM 페놀, 1.0 mM H2O2
실험은 다음 방식으로 수행되어 동일한 포획된 DNA 표적의 3가지 구별되는 검출을 가능하게 하였다.
단계 1: 25 ㎕의 DNA 표적 용액을 흐름 통로를 통해 0.2 ㎕/min의 유속으로 작동시킨다.
단계 2: 10 ㎕ 부동화 완충액을 흐름 통로로 주입시킨다.
단계 3: 10분 동안 배양시키고, 흐름 통로 밖으로 용액을 작동시킨다.
단계 4: 표지 완충액 중의 10 ㎕의 50 pM NAv-HRP-LO3을 흐름 통로로 주입시킨다.
단계 5: 10분 동안 배양시키고, 흐름 통로 밖으로 용액을 작동시킨다.
단계 6: 100 ㎕의 세척 완충액 1을 흐름 통로를 통해 10 ㎕/min의 유속으로 작동시킨다.
단계 7: 100 ㎕의 세척 완충액 2를 흐름 통로를 통해 10 ㎕/min의 유속으로 작동시킨다.
단계 8: 검출 완충액 중의 3 ㎕의 200 ㎛ Ampliflu red(Sigma Aldrich, 90101-5MG-F) 용액을 5 ㎕/min의 유속으로 작동시킨다.
단계 9: 액적 배열체의 형광 및 명시야 현미경 사진을 기록한다.
단계 10: 10 ㎕의 소화 완충액을 흐름 통로로 주입시킨다.
단계 11: 10분 동안 배양시키고, 흐름 통로 밖으로 용액을 작동시킨다.
단계 12: 20 ㎕의 비활성화 완충액을 흐름 통로를 통해 5 ㎕/min의 유속으로 작동시킨다.
단계 13: 50 ㎕ 세척 완충액 1을 흐름 통로를 통해 10 ㎕/min의 유속으로 작동시킨다.
단계 14: 단계 4-13을 반복한다.
단계 15: 단계 4-9를 반복한다.
각각의 샘플에 대하여, 3개의 연속적인 형광 현미경 사진 시리즈를 기록하고 실시에 4에서 개략된 바와 같은 설정 및 절차를 통해 분석하였다. 시리즈 중 첫번째 현미경 사진은 첫번째 검출 단계에 대응하고, 시리즈 중 그 다음 현미경 사진은 두번째 검출 단계에 대응하는 식이다. 흐름 시스템 표면 상의, 명시야 현미경 사진에서 가시적인 특이적인 마킹(marking)를 이용하여, 형광 현미경 사진의 좌표가 검출 단계들 사이의 XY-위치의 변화에 대해 보정되었다. 이러한 방식으로, 상이한 검출 단계에 대한 개별 액적들의 XY-위치를 비교하는 것이 가능하였다. 다음으로, 검출 시리즈 중 각 현미경 사진에 대하여 형광 신호를 나타내는 액적의 XY-픽셀 위치를 기록하고, 시리즈 중 나머지 두 멤버와 비교하였다. 검출 단계들 사이에서 픽셀 차이가 4개 이하인 액적 위치는 "지속적인(persistent)" 액적, 즉 표지제 및 검출제를 첨가할 경우 반복적으로 신호를 생성하는 액적으로 간주하였다.
3회의 검출 단계의 결과는 100 aM DNA 표적을 함유하는 시료에 대하여 형광 현미경 사진의 시리즈를 나타내는 도 16에 도시하였다. 현미경 사진에서, 지속적인 액적은 원형으로 표지되었다. DNA 표적이 첨가되지 않은 대조군 시료의 경우, 3회의 모든 검출 단계에서 지속적인 액적을 확인할 수 없었다.
다음 표는 100 aM DNA 표적 시료와 대조군 시료 사이의 정량적인 비교를 보여준다. 이 표는 100 aM의 표적 DNA를 함유하는 5개의 동일하게 준비된 시료 및 표적 DNA를 함유하지 않는 5개의 동일하게 준비된 대조군 시료의 평균 결과를 요약한 것이다. 하기 표는 대조군 시료(첫번째 줄) 및 100 aM 표적 DNA 시료(두번째 줄)에 대하여 실시예 5에서 정의된 지속적인 액적의 평균 양성 분율(Avg.)을 제공한다. 표준 편차(St. dev.)는 5개 샘플의 표준 편차에 대응한다. 세번째 줄은 각 후속 탐지 단계에서 얻은 신호-대-노이즈(S/N) 비율을 제공한다. S/N-비율은 실험적으로 측정된 값으로 제공되고 괄호 안에 이론적 값이 보충된다. 실험값은 두번째 줄의 평균값을 첫번째 줄의 평균값으로 나누어 얻었다. 이론값은 100 aM 시료의 평균 값을 (i) 첫번째 검출 단계의 0.28%, (ii) 두번째 검출 단계의 7.84 ㆍ 10-4% (0.28% ㆍ 0.28%) 및 (iii) 세번째 검출 단계의 2.2 ㆍ 10-6% (0.28% ㆍ 0.28% ㆍ 0.28%)로 나누어 계산되었다.
대조군 시료의 지속적인 액적의 백분율은 검출 단계의 반복마다 감소하였고, 결과적으로 S/N 비율을 증가시켰다. 그 이유는 대조군 시료의 경우 NSB 표지제만이 형광 신호를 제공하기 때문이다. 이들은 무작위 방식으로 배열체에 결합되고, 이들의 신호가 후속 검출 단계들 사이에 비활성화기 때문에 동일한 액적이 후속 검출 단계에서 신호를 생성하는 일은 거의 없다. 예를 들어, NSB 표지제의 결합 패턴을 가정하면, NSB 표지제를 수용하는 액적의 분율은 각 검출 단계, 예컨대 도 15D에서 0.28%이고, 3회의 검출 단계 모두에서 지속적인 액적을 관찰할 확률은 2.2 ㆍ 10-6 % (0.28 % ㆍ 0.28 % ㆍ 0.28 %) 밖에 안된다. 따라서, 대조군 시료에서 지속적인 액적을 관찰할 가능성은 매우 낮다. 결과적으로, 이러한 특정한 실험 설정에서, NSB 표지제로부터 유래된 모든 노이즈를 배제할 수 있으므로, 적어도 3회의 연속적인 검출 단계에서 지속적인 액적은 - 매우 높은 확률로 - 기능적으로 조립된 캡쳐-프로브/DNA-표적/표지-프로브 복합체를 나타낸다.
실시예 6: 단일 염기쌍에 의해 표적과 서열이 다른 비표적 DNA의 1:10,000 (표적:비표적) 백그라운드에서 단일 DNA 분자의 검출을 위한 흐름 시스템 설정의 설명
본 실시예에서, 100 ㎕ 시료 용액에 존재하는 DNA 분석물의 디지털 검출을 수행할 수 있는 흐름 시스템은 아래 단계들에 따라 얻는다. 분석물(표적 DNA)은 대략 10 aM 농도로 존재할 것으로 예상되고, 다음 서열 세그먼트를 함유한다: 5'- TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTC A AC TAT -3' (SEQ ID NO: 4). 분석물 이외에, 시료는 또 다른 비표적 DNA 분자(야생형 DNA)를 대략 10,000배 높은 농도, 즉 100 fM로 함유할 것으로 예상되고, 다음 서열 세그먼트를 함유한다: 5'- TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTC C AC TAT -3' (SEQ ID NO: 5). 표적 및 야생형 DNA는 굵은 글씨와 밑줄친 부분에서만 서열이 다르다.
캡쳐 프로브는 표적 및 야생성 DNA의 5'-말단에 상보적인 것으로 선택된 단일가닥 PNA 올리고이고, 이는 다음 서열을 함유하는 캡쳐 프로브를 사용함으로써 달성될 수 있다: 5'- GTG CCT ACG ACA GA -3' (SEQ ID NO: 6), 여기서 5' 및 3'은 각각 프로브의 N- 및 C-말단에 대응한다. IDT Oligo Analyzer 소프트웨어 (https://eu.idtdna.com/calc/analyzer)에 따르면, 캡쳐 프로브의 용융 온도는 적어도 46.8℃일 것으로 예상되므로, 표적 및 야생형 DNA 모두 100% 주위 온도, 즉 23℃에서 결합될 것이다. 결과적으로, 배열체는, 100 fM DNA를 함유하는 100 ㎕ 시료의 100% 결합에 대응하는 적어도 6 mio의 DNA 분자의 결합을 수용하도록 설계되어야 한다.
디지털 계수 측정을 수행하기 위하여, 포획된 표적 DNA는, 모두 형광 기질을 갖고 시판되는 서양고추냉이 페록시다아제, 알칼리성 포스파타아제 또는 베타-갈락토시다아제와 같은 효소에 접합된, 다음 서열 5-ATA GTT GAC AC-3' (SEQ ID NO: 7)을 함유하는 단일가닥 DNA 올리고로 구성된 표지제로 표지되어야 한다. 표지제는 3'-말단에서 DNA 표적의 서열과 정확히 일치한다. 최적의 결합 조건 하에 표적 DNA의 82.6%는 23℃의 온도에서 표지제에 결합할 것이다(IDT Oligo Analyzer). 그러나, 동일한 조건에서 야생형 DNA의 1%는, 표적과 야생형 사이의 높은 서열 유사성으로 인해 표지제에 결합할 것이다. 결과적으로, 디지털 계수 측정을 수행하기 위하여, 배열체는 적어도 120,000개의 친수성 특징부를 제시하여야 한다. 120,000개의 특징부의 양은 첫번째 표지 및 첫번째 검출 단계가 수행될 때, 대략 배열체 절반의 액적, 즉 6 mio. 야생형 DNA의 1% + 600의 표적 DNA의 82.6%가 형광 신호를 생성하도록 선택된다. 120,000개의 친수성 특징부를 수용하기 위하여, 특징부는 직경이 5 ㎛인 원형을 갖고, 가장 인접한 것과의 거리가 10 ㎛인 직사각형 배열로 위치하여야 한다. 식 1에 따르면, 개별 친수성 특징부는 V D = 52 펨토리터의 최대 부피를 갖는 수성 액적을 지지할 수 있다. 최대 액적 부피를 계산하기 위하여, 퍼플루오로데실트리클로로실란(FDTS) 지지체 상의 물의 접촉각에 대응하는 110°의 γ-값을 적용하였다. 결과적으로, 액적 배열체의 합산 부피는 V DA = 6.2 나노리터(120,000 x 52 펨토리터)이다. 최대 흐름 격실 부피는 식 9로부터 V MAX = 326 ㎕ 로 얻어진다.
최대 흐름 격실 부피를 계산하기 위하여, 다음 값들이 적용되었다: ρ L = 1000 kg/m3는 물의 부피 밀도, R = 8.31 J/(mol ㆍ K)은 몰 기체 상수, T = 296 K (23℃)는 온도, RHI = 0 는 건조 대기의 초기 상대 수증기 포화도, P 0 = 1226 Pa는 온도 T 0 = 283 K (10℃)에서 수증기의 증기 압력, M W = 18.016 ㆍ 10-3 kg/mol은 물의 몰 중량, ΔH VAP = 40.65 ㆍ 103 J/mol은 물의 증발 엔탈피이다. 상기 값들은 Lange's Handbook of Physical Chemistry (ISBN-13: 9780070163843) 및 Atkin's Physical Chemistry, Volume 1: Thermodynamics and Kinetics (ISBN-13: 9780716785675)에서 얻었다.
그러나, 액적이 (i) 이미징 검출 단계 중에 안정하게 남아있게 하고, (ii) 효소 반응을 위한 최적의 조건을 제공하기 위해서는, 액적 부피의 작은 분율에 대해서만 증발이 허용된다. 액적의 최대 허용 증발 부피 분율은 5%, 즉 θ MAX = 0.05로 설정되어, V C = 16.3 ㎕, 즉 V C = θ MAX ㆍ VMAX의 흐름 격실 부피를 유도한다.
흐름 격실의 최종 기하학적 설계는 10:1의 종횡비, L CX = 15 mm의 길이, L CY = 1.5 mm의 폭을 나타내는 격실을 위한 직사각형 통로 형태를 선택함으로써 얻어진다. 따라서, 통로의 높이는, 최대 액적 부피의 5% 이하가 증발되도록, h MAX = 724 ㎛ (h MAX = V C / (L CY ㆍ L CX )) 미만이어야 한다. 10:1의 종횡비는, 배열체가 L AX = 10.9 mm 및 L AY = 1.1 mm에 대응하는 1,091 x 110개의 원형 특징부를 나타내도록, 친수성 특징부의 배열체에 적용될 수 있다.
상기한 흐름 시스템에 있어서, DNA 표적은 실시예 5에 기술된 바와 같이, 표지 및 검출 단계를 3회 반복함으로써, 표적의 10,000배 많은 백그라운드에서 신뢰성 있게 검출될 수 있다. 이러한 방식으로, 평균 60,496개의 DNA 분자(6 mio.개의 야생형 DNA의 1% + 표적 DNA의 82.6%)는 첫번째 검출 단계에서 신호를 제공할 것으로 예상되고, 이는 60,000개의 야생형 DNA의 거짓-양성 검출 및 496개의 표적 DNA의 올바른 검출에 대응한다.
두번째 검출 단계에서, 평균 1,010개의 DNA 분자(60,000개의 야생형 DNA의 1% + 496개의 표적 DNA의 82.6%)가 지속적인 신호를 제공할 것으로 예상되고, 이는 600개의 야생형 DNA의 거짓-양성 검출 및 410개의 표적 DNA의 올바른 검출에 대응한다. 세번째 검출 단계에서, 평균 344개의 DNA 분자(600개의 야생형 DNA의 1% + 410개의 표적 DNA의 82.6%)가 지속적인 신호를 제공할 것으로 예상되고, 이는 6개의 야생형 DNA의 거짓-양성 검출 및 338개의 표적 DNA의 올바른 검출에 대응한다.
세번째 검출 단계에 있어, 올바른 검출의 수는 거짓-양성 탐지의 수를 56배 초과하는 것으로 예상되므로, 탁월한 정량 정확도를 제공한다. 그러나, 표지 및 검출 단계를 4회 반복하면, 거짓-양성 검출은 완전히 제거될 것으로 예상된다.
서열 목록
SEQ ID NO: 1: ACA TAG TTG ACA CG
SEQ ID NO: 2: 5'- TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTC AAC TAT GT-3'
SEQ ID NO. 3: 5'- GCC TAC GAC AGA -3'
SEQ ID NO: 4: 5'- TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTC AAC TAT -3'
SEQ ID NO: 5: 5'- TCT GTC GTA GGC ACA GAG CGG TCT TAC GGC CAG TCG CGT GTC CAC TAT -3'
SEQ ID NO: 6: 5'- GTG CCT ACG ACA GA -3'
SEQ ID NO: 7: 5'-ATA GTT GAC AC-3'
SEQUENCE LISTING
<110> Selma Diagnostics ApS
<120> FLOW SYSTEM AND METHODS FOR DIGITAL COUNTING
<130> 20794PCT00
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PNA analogue of DNA sequence
<400> 1
acatagttga cacg 14
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Model oligonucleotide
<400> 2
tctgtcgtag gcacagagcg gtcttacggc cagtcgcgtg tcaactatgt 50
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Biotin-labelled DNA oligonucleotide
<400> 3
gcctacgaca ga 12
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Model target DNA
<400> 4
tctgtcgtag gcacagagcg gtcttacggc cagtcgcgtg tcaactat 48
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Model non-target DNA
<400> 5
tctgtcgtag gcacagagcg gtcttacggc cagtcgcgtg tccactat 48
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PNA-modified capture probe
<400> 6
gtgcctacga caga 14
<210> 7
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single stranded DNA label
<400> 7
atagttgaca c 11
Claims (43)
- 시료 중의 1종 이상의 분석물을 계수하기 위한 흐름 시스템(10)으로서, 상기 흐름 시스템은 소수성 기판(16) 내에 또는 상에 친수성 특징부(14)의 패턴을 갖는 지지체(12)를 포함하고, 상기 소수성 기판(16)은 적어도 하나의 개구부(20)를 포함하는 흐름 격실(19) 내에 매립되고, 상기 친수성 특징부(14)는 각각이 최대 액적 부피를 갖는 복수의 나노 내지 아토리터 액적을 지지하도록 배치되고, 흐름 격실(18)은 각각의 나노 내지 아토리터 액적의 증발을 감소시키는 기체상 씰(gas phase seal)을 지지하도록 배치되고, 여기서 흐름 격실(18)은 부피(V C )를 갖고, 부피(V C )는 모든 나노 내지 아토리터 액적의 합산(aggregate) 최대 액적 부피(V DA ) 보다 크고, 다음 식에 의해 계산된 V MAX 보다 작고:
여기서, ρ L 은 액체의 부피 밀도이고, R은 몰 기체 상수이고, T는 온도이고, RHI는 액체의 기체 성분의 초기 상대 증기 포화도이고, P 0 는 대응 기준 온도 T 0 에서의 액체의 기준 증기압이고, M W 는 액체의 몰 중량이고, ΔH VAP 는 액체의 증발 엔탈피인 것인 흐름 시스템(10). - 제1항에 있어서, 상기 흐름 시스템은 1종 이상의 구별되는 분석물에 대한 적어도 1종의 캡쳐 프로브(22)를 포함하고, 캡쳐 프로브(들)(22)는 친수성 특징부(14)에 부착되는 것인 흐름 시스템(10).
- 평면의 소수성 기판(16) 내에 또는 상에 평면의 친수성 특징부(14)의 패턴을 갖는 지지체(12)를 포함하는, 시료 중의 1종 이상의 구별되는 분석물을 디지털 계수하기 위한 흐름 시스템(10)으로서, 상기 소수성 기판(16)은 적어도 하나의 개구부(20)를 포함하는 흐름 격실(18) 내에 매립되고, 상기 친수성 특징부(14)는 복수의 나노 내지 아토리터 액적을 지지하도록 배치되고, 1종 이상의 구별되는 분석물에 대한 적어도 1종의 캡쳐 프로브(22)를 포함하고, 캡쳐 프로브(들)(22)는 친수성 특징부(14)에 부착되는 것인 흐름 시스템(10).
- 제3항에 있어서, 흐름 격실(18)은 부피(V C )를 갖고, 부피(V C )는 모든 나노 내지 아토리터 액적의 합산 최대 액적 부피(V DA ) 보다 크고, 다음 식에 의해 계산된 V MAX 보다 작고:
여기서, ρ L 은 액체의 부피 밀도이고, R은 몰 기체 상수이고, T는 온도이고, RHI는 액체의 기체 성분의 초기 상대 증기 포화도이고, P 0 는 대응 기준 온도 T 0 에서의 액체의 기준 증기압이고, M W 는 액체의 몰 중량이고, ΔH VAP 는 액체의 증발 엔탈피인 것인 흐름 시스템(10). - 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 친수성 특징부(14)는 반경(R D )을 갖는 원형이고, 최대 액적 부피(V D )는 다음과 같고:
여기서, γ는 소수성 기판 상의 액체 접촉각인 것인 흐름 시스템(10). - 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 기체상은 대기에 의해 제공되는 것인 흐름 시스템(10).
- 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상이한 유형의 캡쳐 프로브(들)(22)가 영역들(24)에 배열되는 것인 흐름 시스템(10).
- 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 친수성 특징부(14)는 2차 평면 배열체로 조직되고, 특징부는 반경(R D )을 갖는 원형으로 형상화되고, 배열체는 인접한 특징부들 사이의 피치(pitch)(δ)를 갖고, 여기서 δ는 적어도 3R D 이고, 배열체는 흐름 방향을 따라 길이(L AX )로 연장되고, 배열체는 흐름 방향의 수직으로 길이(L AY )로 연장되고, 통로는 흐름 방향을 따라 길이(L CX )로 연장되고, 여기서 L CX 는 L AX 보다 크거나 같고, 통로는 흐름 방향의 수직으로 길이(L CY )로 연장되고, 여기서 L CY 는 L AY 보다 크거나 같고, 통로는 2R D 이상이고 h MAX 이하인 높이(h)를 갖고, h MAX 는 다음 식으로부터 계산되고:
여기서, γ는 소수성 물질에 대한 액체 접촉각이고, θ MAX 는 액적의 최대 허용 증발 부피 분율이고, ρ L 은 액체의 부피 밀도이고, R은 몰 기체 상수이고, T는 온도이고, RHI는 액체의 기체 성분의 초기 상대 증기 포화도이고, P 0 는 대응 기준 온도 T 0 에서의 액체의 기준 증기압이고, M W 는 액체의 몰 중량이고, ΔH VAP 는 액체의 증발 엔탈피인 것인 흐름 시스템(10). - 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 친수성 특징부(14)의 지지체(12)는 흐름 격실(18) 내의 중심에 위치하는 것인 흐름 시스템(10).
- 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 친수성 특징부(14)의 수는 적어도 1,000, 좋기로는 적어도 10,000, 좋기로는 적어도 100,000, 좋기로는 적어도 1,000,000, 좋기로는 적어도 10,000,000 인 것인 흐름 시스템(10).
- 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 캡쳐 프로브(들)(22)는 1종 이상의 포획된 분석물에 공유적으로 커플링될 수 있는 것인 흐름 시스템(10).
- 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 디지털 계수는 디지털 계수 측정인 것인 흐름 시스템(10).
- 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 정의된 흐름 시스템을 제조하는 방법.
- 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 정의된 흐름 시스템을 적어도 1종 이상의 구별되는 분석물을 디지털 계수하는데 이용하는 방법.
- 적어도 1종 이상의 구별되는 분석물을 디지털 계수하는데 이용하는 방법으로서, 상기 방법은 기체상 씰 하의 복수의 나노 내지 아토리터 액적에 함유된 1종 이상의 분석물을 계수하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 기체상 씰은 마이크로액적의 증발을 감소시킬 수 있는, 흐름 시스템 내 증기압을 성립시키는 것인 방법.
- 제15항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 기체상 씰은 각각의 나노 내지 아토리터 액적의 증발을 최대 액적 부피의 50 퍼센트 미만으로 감소시키는 것인 방법.
- 제15항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 흐름 시스템은 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에서 정의된 바와 같은 것인 방법.
- 제15항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 (i) 소수성 기판(16) 내의 또는 상의 친수성 특징부(14)의 패턴을 1종 이상의 분석물을 함유하는 시료와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제15항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 (ii) 1종 이상의 분석물을 친수성 특징부(14) 상에 포획하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제15항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 (iii) 검출될 분석물 종에 특이적인 표지제를 사용하여 포획된 분석물 종(들)을 표지하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제15항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 (iv) 검출제를 패턴을 가로질러 흐르게 하고 패턴으로부터 회수하여 개별 액적을 나노 내지 아토리터 액적의 형태로 생성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제15항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 (v) 표지제 및 검출제 모두를 수용하는 액적의 수를 계수하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제15항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (iii), (iv) 및 (v)를 1회 이상 반복하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제15항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 제1 표지제를 사용하는 대신 검출될 제2 분석물 종에 특이적인 제2 표지제를 사용하여, 단계 (iii), (iv) 및 (v)를 반복하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제15항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (iii), (iv) 및 (v)를 반복하기 전에 이전 단계에 존재하는 표지제를 비활성화시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제15항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표지제는 표면-결합된 분석물로부터 분리되어 비활성화되고 흐름 시스템의 플러싱에 의해 제거되는 것인 방법.
- 제15항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표지제는 효소 및 특정 분석물 인식 모이어티를 포함하고, 분석물 인식 모이어티는 다음 분자들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법: 올리고뉴클레오티드, 단백질, 펩티드, 압타머, 항체, 이들의 복합체 또는 이들의 합성 변이체.
- 제15항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1종 이상의 구별되는 분석물에 대한 1종 이상의 캡쳐 프로브(22)가 친수성 특징부(14)에 부착되는 것인 방법.
- 제15항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 친수성 특징부(14)에 부착된 2종 이상의 캡쳐 프로브(22)를 포함하고, 상이한 유형의 캡쳐 프로브(22)가 영역들(24)에 배열되는 것인 방법.
- 제15항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 캡쳐 프로브(22)는 다음 프로브 군으로부터 선택되는 것인 방법: 올리고뉴클레오티드, 단백질, 펩티드 또는 이들의 합성 변이체.
- 제15항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 액체 중에 1종 이상의 분석물을 함유하는 시료를 완전 침지에 의해 친수성 특징부(14)를 함유하는 기판과 접촉시키는 것인 방법.
- 제15항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표지는 분석물에 대한 표지제를 함유하는 용액을 완전 침지를 통해 포획된 분석물과 접촉시킴으로써 수행되는 것인 방법.
- 제15항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 분석물은 다음 분석물 군으로부터 선택되는 것인 방법: 단일가닥 올리코뉴클레오티드, 이중가닥 올리코뉴클레오티드 복합체, 단백질, 단백질/올리코뉴클레오티드 복합체, 단백질/지질 복합체, 펩티드, 엑소좀, 바이러스 입자, 바이러스 유사 입자, 나노입자, 세포 단편 또는 세포.
- 제15항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 시료는 다음 시료 군으로부터 선택되는 것인 방법: 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 뇌척수액, 눈물 또는 조직.
- 제15항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 시료는 다음 시료 군의 실험실 처리 시료로부터 선택되는 것인 방법: 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 뇌척수액, 눈물 또는 조직.
- 제15항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 포획 후, 1종 이상의 포획된 분석물은 캡쳐 프로브(들)(22)에 공유적으로 커플링되는 것인 방법.
- 제15항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 디지털 계수는 디지털 계수 측정인 것인 방법.
- 제15항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, 디지털 계수 측정은 단일-효소 결합 분자 분석(single-enzyme linked molecular analysis: SELMA), 디지털 중합효소 연쇄반응(digital polymerase chain reaction: dPCR), 단일 효소면역측정법(single enzyme-linked immunosorbent assay: sELISA) 또는 디지털 단일 효소면역측정법(digital single-enzyme linked immunosorbent assay: dELISA)인 것인 방법.
- 제15항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 있어서, 기체상은 대기에 의해 제공되고, 캡쳐 프로브는 단일가닥 DNA 올리고, 단일가닥 잠금 핵산 올리고 또는 단일가닥 펩티드 핵산 올리고의 군으로부터 선택되고, 상이한 유형의 캡쳐 프로브가 영역 내에 배열되고, 분석물은 처리된 혈액 시료로부터 추출된 단일가닥 DNA이고, 표지제는 검출 양상(detection modality) 및 인식 모이어티를 포함하고, 검출 양상은 효소이고 인식 모이어티는 단일가닥 DNA 올리고, 단일가닥 잠금 핵산 올리고 또는 단일가닥 펩티드 핵산 올리고의 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 적어도 1종 이상의 구별되는 분석물을 디지털 계수하는데 사용되는, 기체상 씰 하의 복수의 나노 내지 아토리터 액적의 용도.
- 제41항에 있어서, 제15항 내지 제40항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의해 수행되는 것인 용도.
- 제41항 내지 제42항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 기재된 흐름 시스템에서 수행되는 것인 용도.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US20210164971A1 (en) * | 2018-08-17 | 2021-06-03 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Droplet arrays for detection and quantification of analytes |
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| DE102019220017A1 (de) * | 2019-12-18 | 2021-06-24 | Robert Bosch Gesellschaft mit beschränkter Haftung | Aufnahmeeinheit zum Aufnehmen eines Fluids, Verfahren und Vorrichtung zum Herstellen einer Aufnahmeeinheit, Verfahren und Vorrichtung zum Betreiben einer Aufnahmeeinheit und Aufnahmeeinrichtung |
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Family Cites Families (63)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6849462B1 (en) * | 1991-11-22 | 2005-02-01 | Affymetrix, Inc. | Combinatorial strategies for polymer synthesis |
| US5384261A (en) | 1991-11-22 | 1995-01-24 | Affymax Technologies N.V. | Very large scale immobilized polymer synthesis using mechanically directed flow paths |
| US5412087A (en) | 1992-04-24 | 1995-05-02 | Affymax Technologies N.V. | Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces |
| EP0916396B1 (en) | 1991-11-22 | 2005-04-13 | Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) | Combinatorial strategies for polymer synthesis |
| US6143496A (en) | 1997-04-17 | 2000-11-07 | Cytonix Corporation | Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly |
| US7070921B2 (en) | 2000-04-28 | 2006-07-04 | Molecular Devices Corporation | Molecular modification assays |
| FR2783179B1 (fr) | 1998-09-16 | 2000-10-06 | Commissariat Energie Atomique | Dispositif d'analyse chimique ou biologique comprenant une pluralite de sites d'analyse sur un support, et son procede de fabrication |
| EP1053784A3 (en) | 1999-05-21 | 2001-05-23 | Bruker Daltonik GmbH | Processing samples in solutions having defined small contact area with support |
| JP2001059844A (ja) | 1999-08-23 | 2001-03-06 | Nitto Denko Corp | 免疫クロマトグラフィー用試験片 |
| AU2001238606A1 (en) | 2000-02-18 | 2001-08-27 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Apparatus and methods for parallel processing of micro-volume liquid reactions |
| US7153679B2 (en) * | 2000-07-26 | 2006-12-26 | Aventis Behring Gmbh | Marburg I mutant of factor VII activating protease (FSAP) as risk factor for arterial thrombosis |
| US20040018491A1 (en) | 2000-10-26 | 2004-01-29 | Kevin Gunderson | Detection of nucleic acid reactions on bead arrays |
| AU2003267583A1 (en) | 2002-09-19 | 2004-04-08 | The Chancellor, Master And Scholars Of The University Of Oxford | Molecular arrays and single molecule detection |
| US7329545B2 (en) * | 2002-09-24 | 2008-02-12 | Duke University | Methods for sampling a liquid flow |
| JP3727026B2 (ja) | 2003-04-10 | 2005-12-14 | 博行 野地 | 一分子酵素活性検出に用いられるマイクロチャンバと１０００ｆＬ以下の液滴を調製する方法 |
| FR2861609B1 (fr) | 2003-10-31 | 2006-02-03 | Commissariat Energie Atomique | Procede de repartition de gouttes d'un liquide d'interet sur une surface |
| US20080026379A1 (en) | 2006-07-31 | 2008-01-31 | Siddiqi Suhaib M | Nucleotide analogs |
| EP1901067A3 (en) | 2004-08-03 | 2009-05-13 | On-Chip Cellomics Consortium | Cellomics system |
| JP4423150B2 (ja) * | 2004-09-24 | 2010-03-03 | 有限責任中間法人 オンチップ・セロミクス・コンソーシアム | 液滴サイズの制御装置ならびに制御方法 |
| WO2006038647A1 (ja) | 2004-10-05 | 2006-04-13 | Asahi Kasei Pharma Corporation | 補酵素の安定化方法およびその組成物 |
| EP2272983A1 (en) | 2005-02-01 | 2011-01-12 | AB Advanced Genetic Analysis Corporation | Reagents, methods and libraries for bead-based sequencing |
| JP2007020526A (ja) | 2005-07-20 | 2007-02-01 | Japan Science & Technology Agency | 特異的結合を利用した標的分子の高感度検出法、そのキット |
| US20070238096A1 (en) | 2006-03-09 | 2007-10-11 | The Regents Of The University Of California | Hybrid energy transfer for nucleic acid detection |
| CN101535806A (zh) * | 2006-10-30 | 2009-09-16 | 皇家飞利浦电子股份有限公司 | 多孔生物测定衬底以及用于生产这种衬底的方法和设备 |
| GB0700189D0 (en) | 2007-01-05 | 2007-02-14 | Univ Leicester | Fluorescence labelling |
| CA2734029C (en) | 2007-08-30 | 2016-03-29 | The Trustees Of Tufts College | Methods for determining the concentration of an analyte in solution |
| JP2009068995A (ja) | 2007-09-13 | 2009-04-02 | Panasonic Corp | マイクロアレイ装置 |
| US8093063B2 (en) | 2007-11-29 | 2012-01-10 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Assay for detecting genetic abnormalities in genomic nucleic acids |
| DK2610351T3 (en) | 2007-12-05 | 2015-09-28 | Complete Genomics Inc | Base efficient provision of sequencing reactions |
| GB0804024D0 (en) | 2008-03-04 | 2008-04-09 | Mir Kalim U | Multiplex selection |
| US9180453B2 (en) | 2008-08-15 | 2015-11-10 | University Of Washington | Method and apparatus for the discretization and manipulation of sample volumes |
| US20100075862A1 (en) | 2008-09-23 | 2010-03-25 | Quanterix Corporation | High sensitivity determination of the concentration of analyte molecules or particles in a fluid sample |
| US8222047B2 (en) | 2008-09-23 | 2012-07-17 | Quanterix Corporation | Ultra-sensitive detection of molecules on single molecule arrays |
| KR101065078B1 (ko) * | 2008-11-05 | 2011-09-15 | 삼성전자주식회사 | 바이오칩용 기판 및 그 제조 방법 |
| JP2010210308A (ja) | 2009-03-09 | 2010-09-24 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | マイクロアレイ用基板およびマイクロアレイ |
| WO2010117470A2 (en) | 2009-04-10 | 2010-10-14 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Nanopore sequencing devices and methods |
| US8926904B2 (en) | 2009-05-12 | 2015-01-06 | Daniel Wai-Cheong So | Method and apparatus for the analysis and identification of molecules |
| EP2480689A4 (en) | 2009-09-24 | 2013-05-15 | Seegene Inc | DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCES USING CYCLIC EXONUCLEOLYTIC REACTIONS |
| WO2012135730A2 (en) | 2011-03-30 | 2012-10-04 | Verinata Health, Inc. | Method for verifying bioassay samples |
| CN105273991B (zh) | 2010-02-08 | 2019-05-10 | 吉尼亚科技公司 | 用于在纳米孔中操作分子的***和方法 |
| US8236574B2 (en) * | 2010-03-01 | 2012-08-07 | Quanterix Corporation | Ultra-sensitive detection of molecules or particles using beads or other capture objects |
| WO2012022482A1 (en) | 2010-08-20 | 2012-02-23 | Eth Zurich | Microwell arrays for direct quantification of analytes on a flat sample |
| CN101935703B (zh) | 2010-08-27 | 2012-10-10 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 肠出血性大肠杆菌o157:h7多色量子点快速检测试剂盒及其检测方法 |
| WO2012072822A1 (en) * | 2010-12-03 | 2012-06-07 | Mindseeds Laboratories Srl | Microanalysis of cellular function |
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