KR20180057278A - Lactobacillus sakei 2-6-4 and its use - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 상기 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주는 인삼을 유일한 영양원으로 하는 고체배지에서 배양되어, Rh2 또는 Rg3을 생산할 수 있는 신규 미생물에 관한 것이다.The present invention relates to a strain 2-6-4 of Lactobacillus saccharomyces. More particularly, the strain 2-6-4 of Lactobacillus saccharum is cultured in a solid medium having ginseng as a sole nutrient source to produce Rh2 or Rg3 Lt; / RTI >
인삼은 식물 분류학상으로 오갈피나무과(Araliaceae)의 인삼속(Panax)에 속하는 다년생 음지성 초본식물로서 오래전부터 한방에서 중요한 약재로 사용되어져 왔다. 인삼을 그대로 사용하거나 건조하여 이용하고 있으며, 또한, 인삼을 증숙시켜 홍삼을 제조하여 사용되기도 한다. 인삼을 증숙하여 홍삼을 제조하게 되면, 삼의 약리작용이 변화되어 삼에는 없던 성분이 생기거나, 기존에 존재하던 성분들의 함량이 증가한다고 보고된 바 있다.Ginseng is a perennial herbaceous herbaceous plant belonging to Panax ginseng (Araliaceae) in plant taxonomy and has long been used as an important medicinal herb in oriental medicine. Ginseng is used as it is or dried, and red ginseng is also used by making ginseng by steaming. It has been reported that when red ginseng is prepared by boiling ginseng, the pharmacological action of ginseng is changed and the content of the components that existed in the ginseng is increased or the content of the components that existed in the ginseng is increased.
그리고 최근 (사)한국인삼제품협회의 효능 검사결과에 의하면 대표적인 항암 성분이자 혈압강하, 뇌신경세포 보호작용, 항혈전작용, 항산화작용 등의 효능을 가진 사포닌 성분 중 진세노사이드(Ginsenosides) Rg3 등 10여 개 항목에서 흑삼이 홍삼에 비해 월등하게 더 함유되어 있고, 이는 인삼보다는 홍삼이, 홍삼보다는 흑삼이 사포닌 약리작용에 있어 효과가 큰 것을 의미한다.Recently, according to the results of the efficacy test of Korea Ginseng Products Association, Ginsenosides Rg3, which is a typical anti-cancer component and saponin component having blood pressure lowering effect, neuronal cell protection function, antithrombogenic effect, In addition, black ginseng is much more effective than red ginseng in red ginseng, which means that red ginseng rather than ginseng has a greater effect on saponin pharmacological action than red ginseng.
상기와 같이 홍삼보다 더 인삼을 여러 번 증숙하고 건조하는 과정을 거쳐서 인삼보다 활성성분이 뛰어난 흑삼을 제조하는 것에 큰 관심을 두고 있는 실정이다. 그러나 현재까지 알려진 흑삼의 제조방법은 그 제조과정이 복잡하며 시간이 오래 걸리고 제조과정에서 실패하는 경우가 많아져서 고가의 가격으로 산업화되어 일상생활에 이용되기 어려움이 있다.As described above, the ginseng is more than the red ginseng, and the ginseng is more active than the ginseng. However, the production method of black ginseng, known to date, is complicated in manufacturing process, takes a long time, and fails in the manufacturing process, so that it is industrialized at a high price and difficult to be used in everyday life.
일예로 한국등록특허 제0543862호에는 9번 증숙시키고 10회 건조시켜 활성성분의 함량이 뛰어난 흑삼 및 흑삼 농축액이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0496418호에는 10증 10포법에 의한 흑미삼의 제조방법이 개시되어 있으나, 여전히 제조과정이 복잡하며 시간이 오래 걸린다는 단점이 존재한다.For example, Korean Patent No. 0543862 discloses a black and ginseng concentrate with 9 active ingredients and 10 dryings, which are excellent in the content of active ingredients. Korean Patent No. 0496418 discloses a method for producing black rice flour However, there is a disadvantage that the manufacturing process is complicated and takes a long time.
상술한 문제점을 해결하기 위하여 증숙과 건조 횟수를 획기적으로 줄이면서도 진세노사이드 함량이 증진된 흑홍삼의 제조방법이 최근 개발되었으나, 획기적으로 줄였다고는 하지만 아직까지 탄산칼슘 수용액을 이용하여 숙성시키는 과정이 존재하며, 질소가스를 충진하여 증숙하는 단계 및 건조하는 단계를 거쳐야 하고, 고압의 장비를 이용해야한다는 점에서 여전히 문제가 존재한다.In order to solve the above-mentioned problems, a method for producing black ginseng having improved ginsenoside content while remarkably reducing the number of steaming and drying times has recently been developed. However, although it has been dramatically reduced, it is still a process of aging using an aqueous solution of calcium carbonate There is still a problem in that it is necessary to fill the nitrogen gas to be diluted and dried, and to use high-pressure equipment.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 인삼을 유일한 영양원으로 하는 고체배지에서 배양되어, Rh2 또는 Rg3를 생산할 수 있는 신규 미생물을 확보하고 이를 이용하여 효율적이고, 친환경적인 발효 공정만으로 대사형 진세노이드를 고함량으로 생산할 수 있는 방법을 개발하는 것이 요구된다.In order to solve these problems, a new microorganism capable of producing Rh2 or Rg3 is cultured in a solid medium having ginseng as a sole nutrient source, and a high content of metabolic type ginsenoside is produced using an efficient and environmentally friendly fermentation process It is required to develop a method that can be used.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 고체 배지에서도 우수한 활성을 갖는 신규한 미생물 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주를 제공하는 것이다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above problems, and it is an object of the present invention to provide a novel microorganism Lactobacillus saccharum 2-6-4 strain having excellent activity even in a solid medium.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 2-6-4 균주 또는 이의 배양물을 함유하는 Rh2 또는 Rg3 강화 인삼분말 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a starter composition for the production of Rh2 or Rg3-fortified ginseng powder containing the strain Lactobacillus sakei 2-6-4 or a culture thereof.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 인삼분말을 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 2-6-4 균주로 고체발효시킨 Rh2 또는 Rg3 강화 인삼분말을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 수탁번호 KCCM11861P로 기탁된 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주(Lactobacillus sakei 2-6-4)를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides Lactobacillus saccharum 2-6-4 strain (Lactobacillus sakei 2-6-4) deposited with Accession No. KCCM11861P.
상기 균주는 인삼 함유 고체배지에서 생육되는 것을 특징으로 한다.The strain is characterized in that it is grown in a solid medium containing ginseng.
상기 인삼분말 함유 배지는 전체 고체배지의 총 중량을 기준으로 인삼분말을 10 내지 40 중량% 포함하는 것을 특징으로 한다.The ginseng powder-containing medium comprises 10 to 40% by weight of ginseng powder based on the total weight of the whole solid medium.
상기 균주는 인삼을 유일한 영양원으로 함유한 고체배지에서 생육하는 것을 특징으로 한다.The strain is characterized in that it grows in a solid medium containing ginseng as a sole nutritional source.
상기 균주는 인삼분말 함유 고체배지로부터 Rh2 또는 Rg3을 생산하는 것을 특징으로 한다.The strain is characterized by producing Rh2 or Rg3 from solid medium containing ginseng powder.
상기 균주의 최적 생육조건은 (a) 발효온도 25-37 ℃, (b) pH 4.1-4.5, (c) 배양시간 24-48 시간인 것을 특징으로 한다.The optimum growth conditions of the strain are (a) fermentation temperature of 25-37 ° C, (b) pH 4.1-4.5, and (c) culturing time of 24-48 hours.
또한, 본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 2-6-4 균주 또는 이의 배양물을 함유하는 Rh2 또는 Rg3 강화 인삼분말 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.The present invention also provides a starter composition for the production of Rh2 or Rg3-fortified ginseng powder containing a strain Lactobacillus sakei 2-6-4 or a culture thereof.
또한, 본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 인삼분말을 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 2-6-4 균주로 고체발효시킨 Rh2 또는 Rg3 강화 인삼분말을 제공한다.The present invention also provides Rh2 or Rg3-fortified ginseng powder obtained by solid-fermenting ginseng powder with the strain 2-6-4 of Lactobacillus sakei .
본 발명에 따르면, 수탁번호 KCCM11861P로 기탁된 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주는 대사형 진세노사이드 Rh2, Rg3를 효율적으로 생산할 수 있다.According to the present invention, the lactobacillus saccharose 2-6-4 strain deposited with accession number KCCM11861P can efficiently produce the metabolic ginsenosides Rh2 and Rg3.
락토바실러스 속에 속하는 유산균은 일반적으로 고체발효가 어려우며, 균일하지 않은 분해활성을 지니는 문제가 있으나, 특이적으로 본 발명에 따른 균주는 유산균이면서 고체발효에서 매우 효과적인 Rh2 또는 Rg3 생산 활성을 가지면서, 다른 영양원 없이 오로지 인삼분말을 유일한 영양원으로 함에도 불구하고 대사형 진세노사이드 Rh2 또는 Rg3를 효과적으로 생산하므로, 종래 찌고 말리고 숙성하는 등의 과정을 거치지 않고도 고농도의 Rh2 또는 Rg3을 포함하는 대사형 진세노사이드 함유 인삼을 제조할 수 있다.Lactobacillus belonging to the genus Lactobacillus generally has difficulty in solid fermentation and has an uneven decomposition activity. Specifically, the strain according to the present invention has activity of producing Rh2 or Rg3 which is highly effective in lactic acid bacteria and solid fermentation, Although the ginseng powder is the only nutrient source without a nutritional source, it produces the metabolic ginsenosides Rh2 or Rg3 effectively. Therefore, it is possible to produce the metabolic ginsenosides containing high concentrations of Rh2 or Rg3 without the conventional processes such as drying, Ginseng can be produced.
또한, 이를 대사형 진세노사이드 함유 인삼의 제조과정에 적용하면 발효하는 간단한 단계만으로 효과적으로 인삼분말을 함유하는 고체배지로부터 Rh2 또는 Rg3를 생산할 수 있으므로, 과량의 물과 별도의 영양분 및 액체 혼합을 위한 배양기 둥의 장치 추가를 생략할 수 있다.In addition, if it is applied to the production process of ginseng containing metabolic ginsenosides, Rh2 or Rg3 can be effectively produced from a solid medium containing ginseng powder only by a simple step of fermentation. Therefore, Addition of a device in the incubator can be omitted.
도 1은 본 발명에 따른 미생물 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주를 다양한 농도의 인삼분말 함유 고체배지에서 배양한 배양액을 촬영한 사진이다.
도 2는 실험예 2의 과정으로부터 측정된, 인삼분말 함유 고체배지의 농도에 따른 총 6 종의 균주의 생균수를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실험예 4에서의 결과를 나타낸 도면으로, 구체적으로 10% MRS를 포함한 2 °Brix 인삼농축액에서 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주의 온도에 따른 생장곡선이다.
도 4는 실험예 5에서의 결과를 나타낸 도면으로, 구체적으로 20% 인삼분말 함유 고체배지에서 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주의 시간에 따른 생장곡선이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a photograph of a culture solution obtained by culturing a strain of microorganism Lactobacillus saccharum 2-6-4 according to the present invention in a solid medium containing ginseng powder at various concentrations. FIG.
FIG. 2 is a graph showing the number of viable cells of six strains according to the concentration of ginseng powder-containing solid medium measured from the procedure of Experimental Example 2. FIG.
FIG. 3 is a graph showing the results of Experimental Example 4. Specifically, FIG. 3 shows growth curves of Lactobacillus saccharum 2-6-4 strain at 2 ° Brix ginseng concentrate containing 10% MRS according to temperature.
FIG. 4 is a graph showing the results of Experimental Example 5. Specifically, FIG. 4 shows the growth curve of the strain 2-6-4 of Lactobacillus saccharum over time in a solid medium containing 20% ginseng powder.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
Hereinafter, various aspects and various embodiments of the present invention will be described in more detail.
본 발명은 수탁번호 KCCM11861P로 기탁된 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 2-6-4 균주를 제공한다.The present invention provides a strain 2-6-4 of Lactobacillus sakei deposited with Accession No. KCCM11861P.
김치로부터 순수 분리된 락토바실러스 사케이 1, 2, 5와 공시 균주 LY-011, 된장으로부터 순수 분리된 락토바실러스 사케이 3, 4를 사용하여, 총 6 개의 균주 중 고체배지에서 대사형 진세노사이드 Rh2 또는 Rg3를 가장 우수하게 생산할 수 있는 균주인 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주를 선발하였다.Lactobacillus saccharides 1, 2 and 5 isolated from Kimchi and Lactobacillus saccharose 3 and 4 purely isolated from doenjang were used to isolate the metabolic ginsenosides Lactobacillus saccharide strain 2-6-4, which can produce
락토바실러스 사케이 2-6-4 균주는 인삼분말을 유일한 영양원으로 함유한 인삼분말 함유 고체배지에서 배양 속도가 빠르고, 배양과정에서 대사형 진세노사이드 Rh2 또는 Rg3를 가장 고농도로 생산하였기 때문에 최종적으로 선발되었다.The strain 2-6-4 of Lactobacillus saccharum was found to have a fast growth rate in the solid medium containing ginseng powder containing ginseng powder as the only nutrient source and to produce metabolic ginsenosides Rh2 or Rg3 at the highest concentration during the cultivation, Was selected.
선발된 상기 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주로부터 16S rRNA를 추출하여 염기서열을 분석한 결과, 이는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)에 속하는 것으로 확인되었다. 이와 같이 획득한 균주를 한국 미생물 보존센터(KCCM)에 기탁하였으며, KCCM 11861P의 기탁번호를 부여받았다.The 16S rRNA was extracted from the selected Lactobacillus saccharum 2-6-4 strain and analyzed for its base sequence, and it was confirmed that it belonged to Lactobacillus sakei . The strain thus obtained was deposited with the Korean Center for Microbiological Conservation (KCCM) and given the deposit number KCCM 11861P.
본 발명에 따른 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 2-6-4 균주는 된장으로부터 유래되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The strain 2-6-4 of Lactobacillus sakei according to the present invention is preferably but not limited to be derived from doenjang.
본 발명의 균주는 인삼분말 함유 고체배지에서 생육되는 것을 특징으로 하고, 상기 인삼분말 함유 배지는 인삼분말 외에 다른 영양원을 더 포함할 수 있으나, 고농도의 대사형 진세노사이드(Rh2, Rg3)를 얻기 위해서는 인삼분말을 유일한 영양원으로 함유한 고체배지에서 배양되는 것이 가장 바람직하다.The strain of the present invention is characterized in that it is grown in a solid medium containing ginseng powder. The ginseng powder-containing medium may further include a nutrient source in addition to the ginseng powder. However, the present invention is not limited to obtaining a high concentration of metabolic ginsenoside (Rh2, Rg3) It is most preferable to cultivate in a solid medium containing ginseng powder as a sole nutrient source.
즉, 본 발명에 따른 균주는 인삼분말을 유일한 영양원으로 함유한 고체배지에서 배양되어, 대사형 진세노사이드인 Rh2 또는 Rg3를 보다 고농도로 생산하는 효과가 있는 것을 특징으로 한다.That is, the strain according to the present invention is characterized in that the strain is cultured in a solid medium containing ginseng powder as a sole nutritional source, and produces Rh2 or Rg3, which is a metabolic type ginsenoside, at a higher concentration.
일반적으로 인삼은 사포닌 3~6% 함질소화합물 12~15%, 지용성 성분 1~2%, 탄수화물계 50~60% 및 기타 4~6% 정도로 구성되어 있으며, 특히 상기 구성성분 중에서 가장 중요한 것은 생리활성물질인 사포닌이다. 사포닌 즉, 진세노사이드(ginsenoside)는 분자구조에 따라 크게 파낙사디올계(Panaxadiol: PD)와 파낙사트리올계(Panaxatriol: PT) 및 올레아난계(Oleanane)로 나눌 수 있고, 최근까지 총 33 종이 발견되었다.In general, ginseng consists of about 3 ~ 6% of saponin, about 12 ~ 15% of nitrogen compound, about 1 ~ 2% for fat - soluble component, about 50 ~ 60% for carbohydrate and about 4 ~ 6% Saponin which is an active substance. Saponins, namely ginsenosides, can be divided into three major groups depending on their molecular structure: Panaxadiol (PD), Panaxatriol (PT) and Oleanane, The paper was found.
이중에서 파낙사디올계 진세노사이드인 Rh2, Rg3는 일반 인삼에는 거의 존재하지 않고, 증숙과정이나, 산 및 효소 등의 추가 가수분해공정을 통해 Rb1로부터 새롭게 생성되는 화합물로 그 구조는 각각 하기 화학식 1과 화학식 2로 표시된다. Among them, the pyrazyldiol-based ginsenosides Rh2 and Rg3 are rarely present in common ginseng, and are newly produced from Rb1 through a steaming process or an additional hydrolysis process such as an acid and an enzyme, 1 and formula (2).
[화학식 1] Rh2[Chemical Formula 1]
[화학식 2] Rg3[Formula 2] Rg3
Rh2 또는 Rg3는 항암, 암 치료, 항암제 독성 감소, 면역증진 및 혈전병 예방 등에 특히 효능이 우수하여, 이들 성분을 강화하기 위한 다양한 기술이 개발되었으나, 여전히 액체배양이나 유기용매 또는 고온 고압의 추출법으로 한정되어 있다. 이러한 방법들은 제법상 공정이 번거롭고 비용이 다소 많이 소요될 뿐만 아니라, 관리가 어려운 등 다양한 공정상의 비경제적 단점이 존재했다.Rh2 or Rg3 has been particularly effective for anticancer, cancer treatment, reduction of anticancer drug toxicity, immunity enhancement and prevention of thrombosis, and various techniques for strengthening these components have been developed. However, It is limited. These methods are not only costly and cumbersome in process, but also have various economical disadvantages such as difficult management.
본 발명의 균주는 단순히 인삼분말을 유일한 영양원으로 함유하고 있는 고체배지에서 생육시키는 과정만으로, 상기 인삼분말 함유 고체배지로부터 Rh2 또는 Rg3을 얻을 수 있다는 장점을 갖는다.The strain of the present invention has an advantage that Rh2 or Rg3 can be obtained from the ginseng powder-containing solid medium only by growing the strain in a solid medium containing ginseng powder as a sole nutritional source.
즉, 종래 다양한 기술들과 달리, 본 발명에 따른 균주는 액체배양이 아닌 고체발효만으로 충분한 Rh2 또는 Rg3를 생산할 수 있기 때문에, 제법상 공정이 단순하고 별도의 공정 및 장치가 필요하지 않으며, 인삼분말 자체를 영양원으로 사용하기 때문에 원료를 가공하거나 추출 또는 건조하는 등 별도의 단계가 요구되지 않으므로, 비용이 상당히 절감될 수 있다.That is, unlike the conventional techniques, the strain according to the present invention can produce sufficient Rh2 or Rg3 by solid fermentation alone, not in liquid culture. Therefore, the process is simple and requires no separate process or apparatus, Since it uses itself as a nutrient source, no additional steps are required, such as processing, extraction or drying of the raw material, so that the cost can be significantly reduced.
상기 균주를 배양하는 인삼분말 함유 고체배지는 특별히 이에 한정되지 않으나, 바람직하게 전체 고체배지의 총 중량을 기준으로 인삼분말을 10 내지 40 중량% 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 15 내지 35 중량%, 더욱 바람직하게는 전체 고체배지의 총 중량을 기준으로 인삼분말을 20 내지 30 중량% 포함하는 것일 수 있다. 만약 상기 전체 고체배지의 총 중량을 기준으로 인삼분말이 10 중량% 미만 포함되는 경우 생산성이 저하되는 문제가 있고, 40 중량%를 초과할 경우 균일성이 저하되고 수분이 골고루 전해지지 못해 생산성이 저하되는 문제가 있다.The solid medium containing the ginseng powder for culturing the strain may be 10-40 wt%, preferably 15-35 wt% of ginseng powder based on the total weight of the total solid medium, , More preferably from 20 to 30 wt% of the ginseng powder, based on the total weight of the total solid medium. If the ginseng powder is contained in an amount of less than 10% by weight based on the total weight of the whole solid medium, the productivity tends to deteriorate. If it exceeds 40% by weight, the uniformity may be lowered, There is a problem.
하지만 상기 인삼분말 함유 고체배지에 있어서, 상기 고체배지 총 중량을 기준으로 인삼분말을 20 내지 30 중량%를 함유하는 것이 Rh2 또는 Rg3의 생산성이 가장 우수하면서 생육활성이 가장 활발하여 균일하게 Rg2 또는 Rg3가 생산되기 때문에 가장 바람직하다.However, in the solid medium containing the ginseng powder, it is preferred that those containing 20 to 30% by weight of ginseng powder based on the total solid weight of the solid medium have the highest productivity of Rh2 or Rg3 and the most active growth activity and uniformly Rg2 or Rg3 Is most preferable.
상기 균주의 최적 생육조건은 (a) 발효온도 25-37 ℃, (b) pH 4.1-4.5, (c) 배양시간 24-48 시간인 것인데, 특별히 이에 한정되지 않으나, 발효온도가 실온의 범위에 있고, pH 역시 약한 산성조건이라는 점에서 생육조건이 까다롭지 않기 때문에 배양하는 기술이 단순하므로 비용을 절감할 수 있다.The optimum growth conditions of the strain are (a) a fermentation temperature of 25-37 ° C, (b) a pH of 4.1-4.5, and (c) a cultivation time of 24-48 hours. Although the fermentation temperature is in a range of room temperature And the pH is also in a weakly acidic condition, so that the cultivation conditions are not complicated, and thus the cost can be reduced because the cultivation technique is simple.
게다가 후술하는 실험예에서 확인한 바와 같이, 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주는 고체발효 후, 24 내지 48 시간 만에 인삼분말로부터 진세노사이드 Rh2를 약 0.013 mg/g(인삼발효물의 건조중량 기준), Rg3를 0.177 mg/g(인삼발효물의 건조중량 기준)를 생산하였음을 확인하였다. 이는 백삼 제품에 포함되어 있다고 알려진 Rg3 0.003 mg/g, Rh2 0 mg/g보다 약 59배의 Rg3와 약 100배의 Rh2를 생산하는 효과를 갖는다.Furthermore, as has been confirmed in the experimental examples to be described later, the strain Lactobacillus saccharum 2-6-4 according to the present invention produced about 0.013 mg / g of ginsenoside Rh2 from ginseng powder within 24 to 48 hours after solid fermentation (Dry weight of fermented product) and 0.177 mg / g of Rg3 (based on dry weight of ginseng fermented product). It has an effect of producing Rg3 of 0.003 mg / g, which is known to be contained in white ginseng products, and Rg3 of about 59 times and Rh_2 of about 100 times that of Rh2 of 0 mg / g.
다시말해 상기 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주는 고체발효를 통해 고농도의 Rh2 또는 Rg3를 생산할 수 있고, 이는 후술하는 실험예를 통해 확인할 수 있다.In other words, the strain Lactobacillus saccharum 2-6-4 can produce Rh2 or Rg3 at a high concentration through solid fermentation, which can be confirmed by the following experimental examples.
따라서, 상기 균주는 고형의 인삼분말만을 포함하는 고체배지에 적용하여, 고체발효인데도 불구하고 인삼분말로부터 Rh2 또는 Rg3을 고농도로 효과적으로 생산할 수 있다.Therefore, the above strain can be applied to a solid medium containing only solid ginseng powder to produce Rh2 or Rg3 at a high concentration from the ginseng powder in spite of solid fermentation.
상기 고체배지는 탄소원, 유기산, 무기원소 등을 첨가하지 않고 오로지 인삼분말만을 유일한 영양원으로 한 것으로, 이를 통해 제조원가를 현저히 절감할 수 있으며, 균주의 생육 및 Rh2 또는 Rg3의 생산을 촉진시킬 수 있다.The solid medium does not contain a carbon source, an organic acid, an inorganic element, or the like but only a ginseng powder as a sole nutritional source. Thus, the production cost can be remarkably reduced and the production of the strain and the production of Rh2 or Rg3 can be promoted.
상기 균주는 높은 Rh2 또는 Rg3 생산량을 가지며, 고체발효에서 후수한 생장성을 가져, 이를 인삼분말 함유 고체배지에 적용하는 경우 생리활성물질인 진세노사이드 Rh2 또는 Rg3를 고농도로 함유한 우수한 인삼분말 가공제품 또는 발효된 인삼의 분말을 획득할 수 있다.The strain has a high Rh2 or Rg3 production yield, and has a growth characteristic after solid fermentation, and when applied to a solid medium containing ginseng powder, excellent ginseng powder containing high concentration of ginsenoside Rh2 or Rg3 Product or powder of fermented ginseng can be obtained.
상기 인삼분말은 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 분말일 수 있고, 상기 분말은 백삼, 수삼, 직삼, 곡삼, 반곡삼, 생건삼, 미삼 등을 분쇄기를 이용하여 분쇄함으로써 제조한 것을 사용할 수 있다. 상기에서 인삼의 분말화 정도는 특별히 한정되지 않으며, 상기 균주가 인삼의 조직 또는 섬유소 내에 효율적으로 침투할 수 있을 정도이면 충분하다. 바람직하게 인삼의 분말화 정도는 입자 크기가 30~150 메쉬 정도가 되도록 할 수 있다.The ginseng powder is not particularly limited, but may be powder. The powder may be prepared by grinding white ginseng, fresh ginseng, direct ginseng, ginseng, bangkoku, raw ginseng, and ginseng using a pulverizer. The degree of powdering of ginseng is not particularly limited, and it is sufficient that the strain can efficiently penetrate into the tissue or fibrin of ginseng. Preferably, the degree of powdering of ginseng is about 30 to 150 mesh.
상기 인삼은 인삼의 뿌리, 잎 및 줄기 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용한 것일 수 있다.
The ginseng may be one using at least one selected from roots, leaves and stem of ginseng.
따라서, 본 발명의 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 2-6-4 균주는 인간 및 동물의 건강증진을 위한 용도, 즉 항암 등 다양한 효과를 갖는 인삼의 생리활성물질인 Rh2 또는 Rg3를 강화한 인삼분말을 제조할 수 있는 스타터(starter) 조성물 또는 식품 첨가용 조성물로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 본 발명의 락토바실러스 사케이의 생균, 건조균 또는 배양물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 배양물은 고체배지에서 배양한 배양물 자체, 상기 배양물을 여과 또는 건조 또는 희석한 가공 배양물 등을 포함한다. 조성물 내 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주의 함량은 조성물 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있다.Therefore, the strain 2-6-4 of Lactobacillus sakei according to the present invention is useful as a ginseng powder having enhanced effects of Rh2 or Rg3, which is a physiologically active substance of ginseng having various effects such as anti-cancer, A starter composition or a food additive composition capable of producing a starch composition. The composition may contain live bacteria, dried germs or cultures of Lactobacillus sacae according to the present invention as an active ingredient, and may further contain excipients or carriers. The culture includes a culture itself cultured in a solid medium, a processed culture obtained by filtering or drying or diluting the culture, and the like. The content of Lactobacillus saccharum 2-6-4 in the composition may vary depending on the composition use and formulation.
상기 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주 또는 이의 배양물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제(tablet), 트로키(troche), 캡슐(caps㎕e), 엘릭실(elixir), 시럽(syrup), 산제(powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(gran㎕e) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다. 상기 담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다. 투여방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.The compositions can be prepared and administered in a variety of formulations and methods. For example, a strain of Lactobacillus saccharae 2-6-4 or a culture thereof is mixed with a carrier and a flavoring commonly used in the pharmaceutical field to prepare tablets, troche, capsules, May be manufactured and administered in the form of elixir, syrup, powder, suspension or granule, and the like. Examples of the carrier include binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents and the like. The administration method may be oral, parenteral or application, but is preferably orally administered. The dose may be appropriately selected depending on the degree of absorption, inactivation rate and excretion rate of the active ingredient in the body, age, sex, condition, etc. of the subject.
본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주 또는 이의 배양물은 김치, 음료, 이유식, 유제품 등의 식품에 대한 식품첨가제로 사용될 수 있다. 아울러, 본 발명의 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주는 Rh2 또는 Rg3 강화 인삼분말의 제조를 위한 스타터(starter)로 사용될 수 있다. 본 발명의 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주를 이용한 Rh2 또는 Rg3 강화 인삼분말은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있는데 구제척으로 인삼분말을 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 2-6-4 균주로 고체발효시킨 것일 수 있다.The strain Lactobacillus saccharum 2-6-4 according to the present invention or a culture thereof can be used as a food additive for foods such as kimchi, beverages, baby foods, and dairy products. In addition, the Lactobacillus saccharum strain 2-6-4 of the present invention can be used as a starter for the production of Rh2 or Rg3-fortified ginseng powder. The Rh2 or Rg3-fortified ginseng powder using the Lactobacillus saccharide 2-6-4 strain of the present invention can be prepared according to a conventional method known in the art, and the ginseng powder is added to the Lactobacillus sakei ) It may be a solid fermented with strain 2-6-4.
본 명세서 내에서 '강화'란 기존 인삼과 비교하여, 2 배 바람직하게는 10 배 더욱 바람직하게는 20 배 더더욱 바람직하게는 100 배의 Rh2 성분을 포함하거나, 1.5 배 바람직하게는 2.0 배 더욱 바람직하게는 2.5 배의 Rg 2 성분이 포함되어 있는 것을 의미한다.
In the context of the present invention, the term "fortification" as used herein refers to a composition comprising 2 times, preferably 10 times, more preferably 20 times, more preferably 100 times Rh2 component, 1.5 times, preferably 2.0 times, Means that
구체적으로 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주 또는 이의 배양물은 Rh2 또는 Rg3 함유 인삼의 제조에 사용될 수 있다. 바람직하게 인삼분말 함유 고체배지에 상기 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주를 접종하여 발효시키는 Rh2 또는 Rg3 함유 발효인삼의 제조방법에 관한 것이다.Specifically, the strain Lactobacillus saccharum 2-6-4 or a culture thereof can be used for the production of Rh2 or Rg3-containing ginseng. The present invention relates to a method for producing fermented ginseng containing Rh2 or Rg3, which is preferably fermented by inoculating the lactobacillus saccharide strain 2-6-4 into a solid medium containing ginseng powder.
상기 고체배지에 균주를 접종하는 고체발효는 낮은 수분 활력에 의해 오염균의 생장이 제한되므로 액상발효처럼 심각한 오염을 유발하지 않으며, 액상발효와 고체발효 방법으로 수행하는 경우, 기질 친화성이 높은 고체발효에서 Rh2 또는 Rg3 생산성이 높게 나타난다. 또한 고체발효 방법으로 생산된 대사형 진세노사이드 Rh2 또는 Rg3는 별도의 공정이 필요하지 않아 안정성이 높고, 고체발효에서는 균주가 대사억제를 낮은 수준으로 제어받아 더 많은 양의 대사형 진세노사이드 Rh2 또는 Rg3를 얻을 수 있게된다. 나아가 가공 중 폐수가 거의 발생하지 않고, 발효 잔여물들은 수분함량이 낮아 별도의 건조 및 가공 단계없이 발효된 인삼 제품으로 활용이 가능하며, 고체발효에 이용되는 배지는 액상발효에 사용되는 인공합성배지에 비해 상대적으로 단순하고 가격이 저렴하다. 한편 고체발효에서 요구되는 생산 설비는 액상발효에서 요구되는 생산설비에 비해 경제적이고, 고체발효 방법은 액상발효 방법에 비해 통기(aeration)나 온도를 조절하는데 사용되는 에너지도 비교적 낮게 요구된다.Solid fermentation in which a strain is inoculated into the solid medium does not cause serious contamination as in liquid fermentation because the growth of contaminants is limited due to low water activity. In case of performing liquid fermentation and solid fermentation, Rh2 or Rg3 productivity is high in fermentation. In addition, the metabolic type ginsenoside Rh2 or Rg3 produced by the solid fermentation method does not require a separate process, so that the stability is high. In the case of solid fermentation, the strain has a low level of metabolic inhibition and a higher amount of the metabolic ginsenoside Rh2 Or Rg3. Furthermore, since the wastewater is hardly generated during processing and the fermentation residues are low in water content, it can be used as a ginseng product fermented without additional drying and processing steps. The medium used for solid fermentation is an artificial synthetic medium used for liquid fermentation Relatively simple and relatively inexpensive. On the other hand, the production facilities required for solid fermentation are economical compared to the production facilities required for liquid fermentation, and the solid fermentation methods require relatively low energy to be used for controlling aeration and temperature as compared with liquid fermentation methods.
상기 고체 발효 단계에 이용되는 고체배지는 탄소원, 유기산, 무기원소 등을 첨가하지 않고 오로지 인삼분말 만을 유일한 영양원으로 한 것으로, 이를 통해 제조원가를 현저히 절감할 수 있으며, 균주의 생육 및 Rh2 또는 Rg3의 생산을 촉진시킬 수 있다.The solid medium to be used in the solid fermentation step is not added with carbon source, organic acid, inorganic element, etc., but only the ginseng powder is made the only nutrient source. Thus, the manufacturing cost can be remarkably reduced and the production of the strain and the production of Rh2 or Rg3 . ≪ / RTI >
상기 균주는 높은 Rh2 또는 Rg3 생산량을 가지며, 고체발효에서 후수한 생장성을 가져, 이를 인삼분말 함유 고체배지에 적용하는 경우 생리활성물질인 진세노사이드 Rh2 또는 Rg3를 고농도로 함유한 우수한 인삼분말 가공제품 또는 발효된 인삼분말을 획득할 수 있다.The strain has a high Rh2 or Rg3 production yield, and has a growth characteristic after solid fermentation, and when applied to a solid medium containing ginseng powder, excellent ginseng powder containing high concentration of ginsenoside Rh2 or Rg3 Product or a fermented ginseng powder can be obtained.
상기 인삼분말은 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 분말일 수 있고, 상기 분말은 백삼, 수삼, 직삼, 곡삼, 반곡삼, 생건삼, 미삼 등을 분쇄기를 이용하여 분쇄함으로써 제조한 것을 사용할 수 있다. 상기에서 인삼의 분말화 정도는 특별히 한정되지 않으며, 상기 균주가 인삼의 조직 또는 섬유소 내에 효율적으로 침투할 수 있을 정도이면 충분하다. 바람직하게 인삼의 분말화 정도는 평균 입자 크기가 1 내지 500 ㎛ 정도가 되도록 할 수 있다.The ginseng powder is not particularly limited, but may be powder. The powder may be prepared by grinding white ginseng, fresh ginseng, direct ginseng, ginseng, bangkoku, raw ginseng, and ginseng using a pulverizer. The degree of powdering of ginseng is not particularly limited, and it is sufficient that the strain can efficiently penetrate into the tissue or fibrin of ginseng. Preferably, the degree of powdering of ginseng can be such that the average particle size is about 1 to 500 mu m.
상기 인삼은 인삼의 뿌리, 잎 및 줄기 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용한 것일 수 있다.The ginseng may be one using at least one selected from roots, leaves and stem of ginseng.
한편 고체배지의 인삼분말 함유량을 기준으로 고체배지의 조성을 조성을 선정하고 각 배지에서 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주에 대한 발효특성 및 Rh2 또는 Rg3 생산성을 평가한 결과, 상기 고체발효 단계에 이용되는 배지에 포함되는 인삼분말은 전체 고체배지의 총 중량을 기준으로 10 내지 40 중량%일 수 있고, 바람직하게는 15 내지 35 중량%, 보다 바람직하게 가장 Rh2 또는 Rg3 생산성이 가장 우수하면서 생육활성이 가장 활발하여 균일하게 Rg2 또는 Rg3가 생산되도록 전체 고체배지의 총 중량을 기준으로 인삼분말이 20 내지 30 중량% 포함하는 것일 수 있다.On the other hand, the composition of the solid medium was selected on the basis of the content of ginseng powder in the solid medium, and the fermentation characteristics and Rh2 or Rg3 productivity of Lactobacillus saccharum strain 2-6-4 were evaluated in each medium. As a result, The ginseng powder contained in the culture medium may be 10-40 wt%, preferably 15-35 wt%, more preferably the most Rh2 or Rg3 productivity and has the highest growth activity The most active ginseng powder may contain 20 to 30 wt% of ginseng powder based on the total weight of the total solid medium so that Rg2 or Rg3 is uniformly produced.
상기 고체배지에 있어서, 전체 고체배지의 총 중량을 기준으로 약 5 중량% 이하까지는 보편적인 첨가수준이나, 본 발명에서는 고체발효의 경우 훨씬 더 많은 수준이 적절한 첨가수준인 것으로 나타났다.For the solid medium, up to about 5 wt.% Based on the total weight of the total solid medium was found to be a universal level of addition, but in the present invention much higher levels of solid fermentation were found to be adequate levels of addition.
보다 구체적으로 상기 고체배지는 상기 인삼분말을 물에 현탁하여 제조된 것일 수 있다.More specifically, the solid medium may be one prepared by suspending the ginseng powder in water.
상기 고체발효 단계는 25 내지 37 ℃의 온도에서 수행되는 것이 바람직하고, 최적 발효온도는 30 ℃인 것으로 확인되었다. 대량생산에서 고체 발효 온도가 25 ℃ 미만이거나 37 ℃ 이상일 경우, 균주의 생육활성이 저하되어 공정지연 등 부수적인 문제가 발생될 수 있다.The solid fermentation step is preferably carried out at a temperature of from 25 to 37 DEG C and the optimum fermentation temperature is found to be 30 DEG C. When the solid fermentation temperature is lower than 25 ° C or higher than 37 ° C in mass production, the growth activity of the strain may be lowered, resulting in problems such as a process delay.
고체발효 단계의 초기 종균 접종량은 105 내지 108 CFU/g인 것이 바람직하며, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 2-6-4 균주의 최적 종균접종 수준이 약 107 CFU/g에서 활성이 가장 높게 나타났다. 한편, 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주의 경우 최적발효 시간은 24 내지 48 시간에서 가장 높은 Rh2 또는 Rg3 생산성을 보였고, 오히려 상기 48 시간이 넘어가면 Rh2 또는 Rg3의 함량에 변화가 없으므로, 이 이상 발효하는 것은 비용효율적이지 못하다.The initial inoculum size of the solid fermentation step is preferably 10 5 to 10 8 CFU / g, and the optimal inoculum level of the strain 2-6-4 of Lactobacillus sakei is active at about 10 7 CFU / g Respectively. On the other hand, in the case of Lactobacillus saccharomyces 2-6-4, the optimum fermentation time showed the highest Rh2 or Rg3 productivity in 24 to 48 hours, and the Rh2 or Rg3 content did not change in 48 hours. Over fermentation is not cost effective.
상기 균주는 된장에서 분리된 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주로, 인체 무해하다. 된장에서 분리된 락토바실러스 속의 균주라고 해서 무조건적으로 Rh2 또는 Rg3을 고체발효를 통해 생산하지 못한다. 이는 본 발명의 후술하는 실험예의 선발과정에서 확인할 수 있다.The strain is Lactobacillus saccharum 2-6-4 isolated from miso, and is harmless to human body. A strain of Lactobacillus isolated from doenjang does not produce Rh2 or Rg3 through solid fermentation unconditionally. This can be confirmed in the selection process of the experimental example described later of the present invention.
즉 본 발명에서 선발한 상기 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주가 인삼분말의 고체발효에서 생육활성 뿐만 아니라 Rh2 또는 Rg3 생산성이 가장 우수하였으며, 이외의 다른 락토바실러스 사케이 균주들은 생장조차 제대로 이루어지지지 않음을 확인하였다.In other words, the Lactobacillus saccharide strain 2-6-4 selected in the present invention has the highest productivity of Rh2 or Rg3 as well as the growth activity in the solid fermentation of ginseng powder. Respectively.
상술한 과정을 통해 홍삼과 같이 인상의 특이적 생리활성물질을 향상시키고자 찌고 건조하는 번거로운 과정없이, 단순히 본 발명에 따른 균주를 인삼분말을 함유한 고체배지에 접종하여 발효시킴으로써, 대사형 진세노사이드 Rh2 또는 Rg3를 가장 효율적으로 생산할 수 있다.By the above-mentioned process, the strain according to the present invention is simply inoculated into a solid medium containing ginseng powder and fermented without any cumbersome process of improving and drying specific physiologically active substances of impression like red ginseng, The side Rh2 or Rg3 can be most efficiently produced.
다시 말해 별도의 가공과정 없이 백삼제품 또는 홍삼제품과 동일하거나 우수한 농도의 Rh2 또는 Rg3를 제조할 수 있다.
In other words, Rh2 or Rg3 can be produced at the same or superior concentration as white ginseng products or red ginseng products without any additional processing.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and the like, but the scope and content of the present invention can not be construed to be limited or limited by the following Examples. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit and scope of the present invention as set forth in the following claims. It is natural that it belongs to the claims.
<측정방법><Measurement method>
1) 생균수1) Number of living cells
생균수를 측정하고자 하는 배양액 또는 발효물을 10 배 희석한 후, MRS 평판배지에 도말하고, 30℃, 24시간 배양한 다음, 형성된 콜로니를 계수하여 생균수를 확인하였다.
The culture medium or the fermentation product to be measured for the viable cell count was diluted 10-fold, plated on an MRS plate culture medium, cultured at 30 DEG C for 24 hours, and colonies formed were counted to confirm viable cell count.
2) 진세노사이드 함량(HPLC)2) ginsenoside content (HPLC)
진세노사이드 함량을 측정하고자 하는 배양액 또는 발효물을 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)(Jasco Co., Japan)를 수행하여 진세노사이드를 정량적으로 분석하였다.The ginsenosides were quantitatively analyzed by performing high performance liquid chromatography (HPLC) (Jasco Co., Japan) on the culture solution or the fermentation product to be assayed for ginsenoside content.
구체적으로 측정하고자 하는 배양액 또는 발효뮬을 수득하고, 이를 동결건조한 다음, 70% 메탄올로 추출하고, 다시 0.45 um 필터로 여과하여, 분석에 사용하였다. 사용된 Column은 GS520(7.5mm×300mmL, Showa Denko Co., Toyko, Japan) + GS320(8.0mm×300mmL, Showa Denko Co., Toyko, Japan)을 사용하였으며, 이동상으로는 0.2M NaCl를 용매를 사용하였으며, 시료 주입량은 20ul, 유속은 0.4 ml/min로 하였으며, refractive index detector(Jasco Co., Toyko, Japan)로 검출하였다.Specifically, a culture medium or a fermentation mule to be measured was obtained, lyophilized, extracted with 70% methanol, filtered again with a 0.45 μm filter, and used for analysis. The columns used were GS520 (7.5 mm x 300 mm L, Showa Denko Co., Toyko, Japan) + GS 320 (8.0 mm x 300 mm L, Showa Denko Co., Toyko, Japan) and 0.2 M NaCl The sample injection volume was 20 μl and the flow rate was 0.4 ml / min and detected with a refractive index detector (Jasco Co., Toyko, Japan).
검출된 피크를 표준 물질(reference compounds)의 머무름 시간(retension time)과 비교하여 확인하였다.
The detected peaks were confirmed by comparison with the retention time of reference compounds.
3) 다당 분석3) polysaccharide analysis
분자량 측정을 하기 위하여 표준물질과 100℃에서 2시간 열수 추출한 인삼분말 추출액 시료 20 mg을 0.2M NaCl 1ml에 녹인 후, 막여과지로 여과하여 HPLC(Jasco Co., Japan) 분석에 사용하였다. For the molecular weight determination, 20 mg of the standard substance and 20 mg of ginseng powder extract extracted with hot water at 100 ° C for 2 hours were dissolved in 1 ml of 0.2 M NaCl, and then filtered through membrane filter paper and used for HPLC (Jasco Co., Japan) analysis.
사용된 Column은 GS520(7.5mm×300mmL, Showa Denko Co., Toyko, Japan) + GS320(8.0mm×300mmL, Showa Denko Co., Toyko, Japan)을 사용하였으며, 이동상으로는 0.2M NaCl를 용매를 사용하였으며, 시료 주입량은 20ul, 유속은 0.4 ml/min로 하였으며, refractive index detector(Jasco Co., Toyko, Japan)로 검출하였다. 정제다당의 분자량은 Pullulan Standard는 Fluka 제품(molecular size; 10K, 48.8K, 366K)를 표준물질로 하여 얻어진 표준곡선과 비교하여 측정하였다.
The columns used were GS520 (7.5 mm x 300 mm L, Showa Denko Co., Toyko, Japan) + GS 320 (8.0 mm x 300 mm L, Showa Denko Co., Toyko, Japan) and 0.2 M NaCl The sample injection volume was 20 μl and the flow rate was 0.4 ml / min and detected with a refractive index detector (Jasco Co., Toyko, Japan). The molecular weight of the purified polysaccharide was measured in comparison with the standard curve obtained using the Fluka product (molecular size; 10K, 48.8K, 366K) as a standard.
실험예 1 : 6 종의 균주 선정Experimental Example 1: Selection of 6 strains
김치, 된장 등 전통발효식품을 멸균 생기 식염수에 현탁하여 상등액을 얻고, 이를 유산균 분멸 배지인 BL 한펀 배지에 도말하여 유산균 특이 콜로니를 형성한 균주를 선택하였다. 선택된 균주들을 순수분리하여, 멸균한 5% 인삼분말 함유 고체배지에 배양하였다. 배양액으로부터 주요 진세노사이드 대사물 변화를 측정하여, 가장 우수한 5 여종의 락토바실러스 속 등의 유산균을 최종 선택하였다.Traditional fermented foods such as kimchi and doenjang were suspended in sterilized fresh saline solution to obtain a supernatant, which was then plated on a BL Hanfan medium, a lactic acid bacterin cell culture medium, to select lactic acid bacteria - specific colonies. The selected strains were separated by pure separation and cultured in a sterile 5% ginseng powder-containing solid medium. The major ginsenoside metabolite changes were measured from the culture medium, and the best 5 kinds of lactobacillus such as Lactobacillus were finally selected.
비교를 위해 종래 대한민국 등록특허공보 제10-1240663호에 공지된 페디오코커스 펜토사시우스 LY-011의 공지 균주도 함께 실험에 사용하였다. 선택된 5 여종의 유산균과 공지 균주를 아래 표 1에 정리하였다.For comparison, a known strain of Pediococcus pentosaceus LY-011 known in Korean Patent Registration No. 10-1240663 was also used in the experiment. Five selected strains of lactic acid bacteria and known strains were listed in Table 1 below.
상기 인삼분말 함유 고체배지는 평균 입자 크기가 100 ㎛로 분쇄된 인삼분말 5 중량%와 물 95 중량%를 혼합하여 제조한 것이다.The ginseng powder-containing solid medium was prepared by mixing 5 wt% of ground ginseng powder having an average particle size of 100 mu m and 95 wt% of water.
번호Strain
number
실험예 2 : 1 종의 균주 선별(락토바실러스 사케이 2-6-4 균주)Experimental Example 2: Selection of one strain (Lactobacillus saccharum 2-6-4 strain)
실험예 1의 6종의 균주 중에서 고함량의 인삼분말 함유 고체배지에서 생육활성이 우수하면서, Rh2 또는 Rg3에 대한 생산능력이 가장 우수한 균주 1종을 선별하고자 하였다.
Among the six strains of Experimental Example 1, one strains having the highest production capacity for Rh2 or Rg3 and having excellent growth activity in a solid medium containing a high content of ginseng powder were selected.
1) 생육활성 측정1) Measurement of growth activity
먼저 각각의 균주를 20% 인삼분말 함유 고체배지에 접종하기 전에 미리 MRS(lactobacilli, leuconostoc and weisella strain) 배지에 전배양(pre-culture) 하루동안 수행하고, 이의 OD600 값을 측정하여 성장여부를 확인하였다.First, the growth whether performed for a pre-MRS (lactobacilli, leuconostoc and weisella strain) before incubation (pre-culture) to the medium before inoculation of each strain-containing solid medium of 20% ginseng powder day, measure its OD 600 value Respectively.
전 배양이 완료된 상기 각 균주 전배양액의 1%(약 김치 배지 g 중량당 107 CFU)를 다양한 농도의 인삼분말 함유 고체배지(평균 입자 크기 100 ㎛로 분쇄된 인삼분말 5, 10, 15, 20, 25 중량%와 나머지 중량의 물을 혼합하여 제조한 것)에 접종하고, 30 ℃에서 48 시간 배양하여, 다양한 농도의 인삼분말 함유 고체배지로부터 각 균주별 인삼발효물을 얻었다.1% (107 CFU per gram of medium of kimchi medium) of each of the pre-cultivated strains was mixed with various concentrations of ginseng powder-containing solid medium (
우선 생육활성을 확인하기 위하여 상기 과정을 통해 얻은 인삼발효물 1g 당 생균수를 측정하여 도 2에 나타내었다.First, in order to confirm the growth activity, the viable cell count per g of the ginseng fermented product obtained through the above procedure was measured and shown in Fig.
도 2에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주는 고농도의 인삼분말 함유 고체배지에서 생육활성이 가장 우수하다는 것을 확인하였다. 구체적으로 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주는 인삼분말이 10 중량% 이상 포함되어 있는 인삼분말 함유 배지에서부터 생육활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주는 인삼분말이 20 중량% 이상 포함되어 있는 인삼분말 함유 배지에서 가장 생육활성이 우수함을 확인하였다.
As shown in FIG. 2, the strain 2-6-4 of Lactobacillus saccharum was found to have the best growth activity in a solid medium containing ginseng powder at a high concentration. Specifically, the Lactobacillus saccharum strain 2-6-4 according to the present invention has increased growth activity from a ginseng powder-containing medium containing 10% by weight or more of ginseng powder. In particular, the strain Lactobacillus saccharum 2-6-4 according to the present invention showed the best growth activity in the ginseng powder-containing medium containing 20% by weight or more of ginseng powder.
2) Rh2 또는 Rg3에 대한 생산능력 측정2) Measurement of production capacity for Rh2 or Rg3
다음으로 상기 실험예 2-1) 과정을 통해 얻은 인삼발효물로부터 총 진세노사이드, 진세노사이드 Rb1, Rh2, Rg3 농도(㎎/g)를 분석하여 하기 표에 정리하였다.Next, the concentrations of total ginsenosides, ginsenosides Rb1, Rh2 and Rg3 (mg / g) from the fermented ginseng obtained through the above Experimental Example 2-1) were analyzed and are summarized in the following table.
표 2는 5% 인삼분말 함유 고체배지로부터 얻은 각 균주의 인삼발효물에서 측정된 총 진세노사이드, 진세노사이드 Rb1, Rh2, Rg3 농도(㎎/g)를 나타낸 것이고,Table 2 shows the total concentrations of ginsenosides, ginsenosides Rb1, Rh2 and Rg3 (mg / g) measured in the ginseng fermentation products of each strain obtained from the solid medium containing 5% ginseng powder,
표 3은 10% 인삼분말 함유 고체배지로부터 얻은 각 균주의 인삼발효물에서 측정된 총 진세노사이드, 진세노사이드 Rb1, Rh2, Rg3 농도(㎎/g)를 나타낸 것이며,Table 3 shows the total concentrations of ginsenosides, ginsenosides Rb1, Rh2 and Rg3 (mg / g) measured in the ginseng fermentation products of each strain obtained from the solid medium containing 10% ginseng powder,
표 4는 15% 인삼분말 함유 고체배지로부터 얻은 각 균주의 인삼발효물에서 측정된 총 진세노사이드, 진세노사이드 Rb1, Rh2, Rg3 농도(㎎/g)를 나타낸 것이며,Table 4 shows the total concentrations of ginsenosides, ginsenosides Rb1, Rh2 and Rg3 (mg / g) measured in the ginseng fermentation product of each strain obtained from the solid medium containing 15% ginseng powder,
표 5는 20% 인삼분말 함유 고체배지로부터 얻은 각 균주의 인삼발효물에서 측정된 총 진세노사이드, 진세노사이드 Rb1, Rh2, Rg3 농도(㎎/g)를 나타낸 것이며,Table 5 shows the total concentrations of ginsenosides, ginsenosides Rb1, Rh2 and Rg3 (mg / g) measured in the ginseng fermentation product of each strain obtained from the solid medium containing 20% ginseng powder,
표 6은 25% 인삼분말 함유 고체배지로부터 얻은 각 균주의 인삼발효물에서 측정된 총 진세노사이드, 진세노사이드 Rb1, Rh2, Rg3 농도(㎎/g)를 나타낸 것이다.Table 6 shows the total concentrations of ginsenosides, ginsenosides Rb1, Rh2 and Rg3 (mg / g) measured in the ginseng fermentation products of each strain obtained from the solid medium containing 25% ginseng powder.
이때, 상기 총 진세노사이드, 진세노사이드 Rb1, Rh2, Rg3 농도(㎎/g)는 각각 HPLC로 분석하였고, 상기 농도는 인삼발효물을 건조한 고형분 g에 대한 측정된 총 진세노사이드, 진세노사이드 Rb1, Rh2, Rg3의 중량(㎎)을 나타낸 것이다. 상기 수치는 5회 반복 실험한 결과값의 평균을 기록한 것이다.The concentrations of the total ginsenosides, ginsenosides Rb1, Rh2, and Rg3 (mg / g) were analyzed by HPLC, respectively. The concentrations were calculated by dividing the ginseng fermented product by the total ginsenosides measured for the dry solid g, (Mg) of side Rb1, Rh2, and Rg3. The above values are obtained by recording an average of the results of five repeated experiments.
본 발명에서 대조군은 발효전 인삼분말 함유 고체배지를 의미한다.In the present invention, the control group means a solid medium containing ginseng powder before fermentation.
**총 진세노사이드는 Rg1, Re, Rf, Rg2+Rh1, Rb1, Rh1(R), Rc, Rb2, Rb3, Rf1, Rd, Rf2, Rg3(S,R), PPT(S,R), CK, Rh2 총 16종의 합이다.** Total ginsenosides are represented by Rg1, Re, Rf, Rg2 + Rh1, Rb1, Rh1 (R), Rc, Rb2, Rb3, Rf1, Rd, Rf2, Rg3 CK, and Rh2.
표 2 내지 6을 살펴본 결과, 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주가 고농도의 인삼분말 함유 고체배지에서 생육활성이 우수할 뿐만 아니라, Rh2 또는 Rg3의 생산능력도 우수함을 확인하였다.As a result of looking at Tables 2 to 6, it was confirmed that the strain Lactobacillus saccharum 2-6-4 has excellent growth activity in a solid medium containing ginseng powder at a high concentration, and also has excellent production capacity of Rh2 or Rg3.
나아가, 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주는 인삼분말이 고함량의 인삼분말 함유 고체배지에서부터 생육활성이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 그러나 Rh2 또는 Rg3의 생산성이 가장 우수하면서 생육활성이 가장 활발하여 균일하게 Rg2 또는 Rg3가 생산되는 것은 전체 고체배지의 총 중량을 기준으로 인삼분말이 20 내지 30 중량% 포함된 것을 사용하였을 때이다.Furthermore, the strain Lactobacillus saccharum 2-6-4 according to the present invention can confirm that the ginseng powder increases the growth activity from the solid medium containing a high content of ginseng powder. However, the productivity of Rh2 or Rg3 is the most excellent and the growth activity is most active, and Rg2 or Rg3 is uniformly produced when 20 to 30% by weight of ginseng powder is contained based on the total weight of the whole solid medium.
즉, 본 발명에서 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주를 최종 선택하였다.That is, the strain Lactobacillus saccharum 2-6-4 was finally selected in the present invention.
본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주는 고체발효 후, 인삼발효물을 건조한 고형분을 기준으로 진세노사이드 Rh2를 약 0.01~0.013 mg/g, Rg3를 0.096~0.177 mg/g를 생산하였음을 확인하였다. 이는 백삼 제품에 포함되어 있다고 알려진 Rg3 0.003 mg/g, Rh2 0.0 mg/g보다 약 59배의 Rg3와 약 100배의 Rh2를 생산하는 효과를 갖는 것이다. The strain Lactobacillus saccharum 2-6-4 according to the present invention contains about 0.01 to 0.013 mg / g of ginsenoside Rh2 and 0.096 to 0.177 mg / g of Rg3 on the basis of the solid content of dried ginseng fermented product after solid fermentation Production. It has an effect of producing Rg3 of about 0.003 mg / g, which is known to be contained in white ginseng products, and about 59 times of Rg3 and about 100 times of Rh2, than that of Rh2 of 0.0 mg / g.
또한, 상기 표 2 내지 6의 결과는 건조시킨 인삼발효물의 고형분을 기준으로 측정된 총 진세노사이드, 진세노사이드 Rb1, Rh2, Rg3를 나타낸 것으로 이를 고려하면 저농도의 인삼분말 함유 고체배지에서 배양한 경우에는 크게 차이가 나지 않았다. 허나 10 중량% 이상의 인삼분말을 함유한 고체배지부터는 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주에서 Rh2와 Rg3가 생성되기 시작하였음을 확인하였다.In addition, the results of Tables 2 to 6 show total ginsenosides, ginsenosides Rb1, Rh2, and Rg3 measured on the basis of the solid content of the dried ginseng fermented product. There was not much difference in case. However, from the solid medium containing 10% by weight or more of ginseng powder, it was confirmed that Rh2 and Rg3 were produced in Lactobacillus saccharum 2-6-4 strain.
또한 20 내지 25 중량%의 인삼분말을 함유하는 고체배지를 사용한 경우, 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 2-4-6 균주는 대사형 진세노사이드의 중간대사물질인 Rb1은 감소하고, 고함량의 Rh2와 Rg3를 생성하는 것을 확인하였다. 이와 달리 다른 균주들에서는 생육활성도 현저히 낮았고 Rh2는 전혀 생성되지 않았으며 Rg3도 초기 인삼분말 함유 배지에 존재하던 양에서 크게 증가하지 않음을 알 수 있었다.
Also, when a solid medium containing 20 to 25% by weight of ginseng powder was used, the Lactobacillus saccharum strain 2-4-6 according to the present invention showed a decrease in Rb1, an intermediate metabolite of metabolic ginsenosides, Of Rh2 and Rg3. In contrast, the growth activity was significantly lower in the other strains, Rh2 was not produced at all, and Rg3 was not significantly increased in the amount present in the initial ginseng powder-containing medium.
실험예 3: 균주의 동정Experimental Example 3: Identification of Strain
상기 실험예 2에서 최종 선택된 균주의 동정은 16S rDNA 유전자 염기서열분석을 이용하여 실시하였다.The identification of the strains finally selected in Experimental Example 2 was carried out using 16S rDNA gene sequencing.
균주의 동정은 ㈜마크로젠에 의뢰하여 진행하였으며, 16S rRNA 유전자의 염기서열과 ITS 영역을 분석하였다. 그 결과 상기 균주의 rRNA gene의 조사된 1884661 개의 염기서열을 분석한 결과, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 23K 표준 균주의 complete genome 염기서열과 99% 상동성을 가지고 있음을 확인하였다. 이를 통해 상기 균주는 락토바실러스 속의 사케이 종 균주로 동정되었다.The identification of the strain was carried out by asking Macrogen Co., Ltd., and the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene and the ITS region were analyzed. As a result, 1884661 nucleotide sequences of the rRNA gene of the strain were analyzed, and it was confirmed that it was 99% homologous with the complete genome sequence of Lactobacillus sakei 23K standard strain. Thus, the strain was identified as a strain of Saccharomyces cerevisiae in the genus Lactobacillus.
따라서 본 발명의 균주를 락토바실러스 사케이 2-6-4 로 명명하였고, 또한, 이 균주를 2016년 7월 8일에 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganism)에 기탁하였으며, 수탁번호는 KCCM 11861P로 부여받았다.
Therefore, the strain of the present invention was designated as Lactobacillus saccharum 2-6-4, and this strain was deposited with the Korean Culture Center of Microorganism on July 8, 2016. The accession number is KCCM 11861P.
실험예 4 : 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주의 최적 생장온도.Experimental Example 4: Optimum growth temperature of Lactobacillus saccharum 2-6-4 strain.
최종 선별된 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주를 25, 30, 37, 40℃에서 각각 배양하여 48시간 동안 흡광도 측정(600nm)을 통해 생장곡선을 얻고, 최적 생장온도를 확인하였다. 배양할 배지는 10% MRS를 포함한 2 °Brix 인삼농축액을 이용하였다.The final selected Lactobacillus casei strain 2-6-4 was cultured at 25, 30, 37, and 40 ℃, respectively, and the growth curve was obtained by absorbance measurement (600 nm) for 48 hours. The medium to be cultured was a 2 ° Brix ginseng concentrate containing 10% MRS.
도 3은 실험예 4에서의 결과를 나타낸 도면으로, 구체적으로 10% MRS를 포함한 2 °Brix 인삼농축액에서 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주의 온도에 따른 생장곡선이다.FIG. 3 is a graph showing the results of Experimental Example 4. Specifically, FIG. 3 shows growth curves of Lactobacillus saccharum 2-6-4 strain at 2 ° Brix ginseng concentrate containing 10% MRS according to temperature.
도 3에 나타난 바와 같이, 40 ℃ 이후부터 생장이 두드러지게 저하되고 있음을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주는 발효온도 25-37 ℃인 것이 바람직한 것을 알 수 있다.
As shown in Fig. 3, it was confirmed that the growth was remarkably lowered after 40 占 폚. Thus, it can be seen that the Lactobacillus saccharum 2-6-4 strain of the present invention is preferably fermented at a temperature of 25-37 ° C.
실험예 5 : 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주의 최적 발효시간Experimental Example 5: Optimum Fermentation Time of Lactobacillus saccharum 2-6-4
실험예 2에서 최종 선별된 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주를 다양한 발효시간으로 배양하여 생균수를 측정하여 생장곡선을 얻고, 이로부터 총 진세노이드 합과 Rb1, Rh2, Rg3(표 7)을 측정하여 최적 생장시간을 확인하였다. 배양할 배지는 20% 인삼분말 함유 고체배지를 이용하였다. 상기 인삼분말 함유 고체배지는 앞서 설명한 바와 같이 20 중량%의 인삼분말과 80 중량%의 물을 혼합한 것이다.The total ginsenosides and Rb1, Rh2, and Rg3 (Table 7) were obtained from the cultivated Lactobacillus saccharum 2-6-4 strain selected in Experimental Example 2 at various fermentation times, And the optimum growth time was confirmed. The medium to be cultured was a solid medium containing 20% ginseng powder. The ginseng powder-containing solid medium is a mixture of 20 wt% of ginseng powder and 80 wt% of water as described above.
*진세노사이드 합: Rg1, Re, Rf, Rg2+Rh1, Rb1, Rh1(R), Rc, Rb2, Rb3, Rf1, Rd, Rf2, Rg3(S,R), PPT(S,R), CK, Rh2 총 16종(S, R), PPT (S, R), CK (R), Rc, Rb2, Rc, Rb2, Rb3, Rf1, Rd, , 16 kinds of Rh2
도 4는 실험예 5에서의 결과를 나타낸 도면으로, 구체적으로 20% 인삼분말 고체배지에서 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주의 시간에 따른 생장곡선이다.4 shows the results of Experimental Example 5. Specifically, FIG. 4 shows the growth curve of the strain 2-6-4 of Lactobacillus saccharum over 20% ginseng powder solid medium with time.
도 4에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주는 접종 후, 지속적으로 증가하여 24 내지 48 시간까지 최고 수준을 유지하였고, 이후 72 시간부터 급격히 생균수 감소를 나타내었다.As shown in Fig. 4, the strain 2-6-4 of Lactobacillus saccharum was continuously increased after inoculation and remained at the highest level for 24 to 48 hours, and then rapidly decreased in viable cell count from 72 hours.
이를 통해 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주는 발효시간이 24 내지 72 시간이였고, 더욱 바람직하게는 24 내지 48 시간임을 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that the Lactobacillus saccharum strain 2-6-4 according to the present invention had a fermentation time of 24 to 72 hours, more preferably 24 to 48 hours.
다만, Rh2 또는 Rg3와 같은 대사형 진세노이드 함량은 48시간에서 최고 농도가 검출되었고, 이후 발효시간에 따라 유의적 차이를 나타내지 않았다. 따라서 모든 상황을 고려하였을 때, 72 시간 바람직하게는 48 시간 이상 발효하는 것은 비용효율적이지 못하다.
However, the concentration of metabolite ginsenosides such as Rh2 or Rg3 was highest at 48 hours, and did not show any significant difference depending on the fermentation time. Therefore, considering all circumstances, fermentation for 72 hours, preferably 48 hours or more, is not cost effective.
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)Name of depository: Korea Microorganism Conservation Center (overseas)
수탁번호 : KCCM11861PAccession number: KCCM11861P
수탁일자 : 20160708
Checked on: 20160708
Claims (8)
상기 균주는 인삼분말 함유 고체배지에서 생육되는 것을 특징으로 하는 균주.The method according to claim 1,
Wherein the strain is grown on a solid medium containing ginseng powder.
상기 인삼분말 함유 배지는 전체 고체배지의 총 중량을 기준으로 인삼분말을 10 내지 40 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 균주.The method according to claim 1,
Wherein the ginseng powder-containing medium comprises 10 to 40 wt% of ginseng powder based on the total weight of the total solid medium.
상기 균주는 인삼분말을 유일한 영양원으로 함유한 고체배지에서 생육하는 것을 특징으로 하는 균주.The method according to claim 1,
Wherein the strain is grown in a solid medium containing ginseng powder as a sole nutritional source.
상기 균주는 인삼분말 함유 고체배지로부터 Rh2 또는 Rg3을 생산하는 것을 특징으로 하는 균주.The method according to claim 1,
Wherein said strain produces Rh2 or Rg3 from solid medium containing ginseng powder.
상기 균주의 최적 생육조건은 (a) 발효온도 25-37 ℃, (b) pH 4.1-4.5, (c) 배양시간 24-48 시간인 것을 특징으로 하는 균주.The method according to claim 1,
The optimum growth conditions of the strain are (a) a fermentation temperature of 25-37 ° C, (b) a pH of 4.1-4.5, and (c) a culturing time of 24-48 hours.
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