KR20180053751A - 소르타아제 접합 루프를 포함하는 재조합 면역글로불린 중쇄 및 이의 접합체 - Google Patents

소르타아제 접합 루프를 포함하는 재조합 면역글로불린 중쇄 및 이의 접합체 Download PDF

Info

Publication number
KR20180053751A
KR20180053751A KR1020187011806A KR20187011806A KR20180053751A KR 20180053751 A KR20180053751 A KR 20180053751A KR 1020187011806 A KR1020187011806 A KR 1020187011806A KR 20187011806 A KR20187011806 A KR 20187011806A KR 20180053751 A KR20180053751 A KR 20180053751A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
heavy chain
amino acid
sorbitase
immunoglobulin heavy
sequence
Prior art date
Application number
KR1020187011806A
Other languages
English (en)
Inventor
알프레트 엥겔
파벨 쿠발레츠
알폰스 니히틀
토비아스 욀슐레겔
라이너 슐레히트
Original Assignee
에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에프. 호프만-라 로슈 아게 filed Critical 에프. 호프만-라 로슈 아게
Publication of KR20180053751A publication Critical patent/KR20180053751A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1075—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of amino acids or peptide residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C12Y304/2207—Sortase A (3.4.22.70)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 VH 도메인, CH1 도메인, 중간 경첩 영역의 가장 C-말단에 있는 시스테인에 이르기까지의 경첩 영역, 소르타아제 접합 루프, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 재조합 면역글로불린 중쇄로서, 상기 소르타아제 접합 루프는 a) 중간 경첩 영역의 가장 C-말단에 있는 시스테인과, 면역글로불린 중쇄 CH2 도메인의 N-말단에 있는 VFX1FPP(SEQ ID NO: 2로서, X1은 L 또는 I임) 공통 서열 사이에 위치하는 적어도 16개의 아미노산으로 이루어지고, b) 아미노산 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1)(여기서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)로 이루어지는 소르타아제 인지 모티브를 포함하고, c) b)의 서열에 대한 N-말단에 적어도 2개의 아미노산을 포함하고, d) b)의 서열에 대한 C-말단에 적어도 6개의 아미노산을 포함하고, e) b)의 서열에 대한 C-말단 및 N-말단 아미노산은 시스테인이 아닌, 재조합 면역글로불린 중쇄와, 이의 소르타아제 효소를 기반으로 한 부위 지정 접합에 있어서의 용도에 관한 것이다.

Description

소르타아제 접합 루프를 포함하는 재조합 면역글로불린 중쇄 및 이의 접합체
본 발명은 소르타아제 접합 루프를 포함하는 재조합 면역글로불린 중쇄, 소르타아제 효소를 사용하여 이러한 재조합 면역글로불린 중쇄를 접합 및/또는 표지화하기 위한 방법, 및 상기 방법을 통하여 수득된 접합체 및/또는 표지화된 생성물에 관한 것이다.
본 발명의 배경
단백질의 부위 특이적 변형은, 특히 진단적 또는 치료적 적용을 위하여 사용되는 항체로의 도전해볼 만한 과제이다. 경제적이며, 산업적 규모로 적용 가능한, 부위 특이적 폴리펩티드 변형을 위한 신뢰할 수 있는 방법은 매우 중요하다.
초기의 단백질 작용화 방법은, 단백질과 과량의 티올- 또는 아민-반응성 시약, 예컨대 말레이미드 또는 N-하이드록시숙신이미딜 에스테르 각각의 반응에 의한, 시스테인 잔기 또는 리신 잔기 중 어느 하나의 반응성을 이용하였다. 이러한 잔기는 풍부하게 존재하고, 널리 분포되어 있으며, 적당한 커플링 화학(coupling chemistry)의 효용성으로 인해 변형이 용이하다.
그러나, 예를 들어 "리신-표지화" 전략은, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 표지화하는데 사용될 때, 하기와 같은 몇몇 단점, 즉 a) 종종 항원 결합 활성의 유의한 감소가 초래된다는 점 (리신이 항원 결합 부위 내 또는 이에 인접하여 존재함); b) 심지어 화학량론적으로 동일하게 1:1로 단일 표지화된 접합체가, 폴리펩티드 내부의 리신 중 상이한 것들을 통해 부착된 표지를 포함하는 혼합물로 이루어진다는 점; 및 c) 요망되는 1:1 생성물의 수율이 다소 낮다는 점을 가진다.
부위 특이적 단백질 표지화를 위한 최근의 접근법 중 가장 중요한 하나는, 효소 반응을 통하여 단백질 내 특이적인 부위에 생물 직교 작용기(bioorthogonal fuctionality)를 통합하는 것이다. "단백질의 효소 표지화"에 대한 최근의 보고서에 대해서는 문헌 [M. Rashidian et al., Bioconjugate Chemistry 24(2013) 1277-1294]을 참조한다. 이 보고서에 포함된, 부위 특이적 접합에 사용되는 효소는 포르밀글리신 생성 효소, 시알릴 전달효소, 포스포판테테이닐 전달효소, O-GlcNAc 번역 후 변형, 소르태깅(sortagging), 트랜스글루타미나아제, 파네실 전달효소, 바이오틴 리가아제, 리포산 리가아제 및 N-미리스토일 전달효소를 포함한다.
소르타아제 A(SrtA)는 박테리아 세포벽에 단백질을 공유 부착시키는 막 결합 효소이다. SrtA 기질 상 특이적 소르타아제 인지 모티브는 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)이다. 소르타아제 효소는 트레오닌 잔기(T)와 X2(G 또는 A) 사이를 절단한다. (소르타아제 기질이라 지칭되기도 하는) 소르타아제 친핵체 상 결찰 모티브, 즉 박테리아 세포벽 상 기질에 부착되게 되는, 펩티도글리칸의 폴리펩티드 부분은 자연적으로 펜타글리신 모티브이다. 펩티도글리칸의 N-말단 상 트리글리신 모티브, 그리고 심지어 디글리신 모티브는 SrtA 반응을 지지하기에 충분함이 확인되었다(Clancy, K.W., et al., Peptide Science 94 (2010) 385-396). 이 반응은 올리고글리신 유래 아민 친핵체의 공격으로 분해되는 티오에스테르 아실-효소 중간체를 통해 진행되고, 이로 인하여 펩티도글리칸은 단백질 기질에 공유 연결되며, 그 결과 SrtA가 재생성된다.
현대 생화학 실험실에서, SrtA는, 예를 들어 화학 합성된 펩티드를 재조합 발현된 단백질에 공유 접합하는데 사용될 수 있다.
WO 2010/087994에는, SrtA-매개 결찰을 위한 방법 및 이의 용도가 보고되어 있다. IgG 유사 이중 특이적 항체에 대한 재조합적 접근법은 Marvin, J.S.외 다수에 의해 보고되었다(Acta Pharmacol. Sinica 26 (2005) 649-658). Levary, D.A.외 다수(PLoS one, 6 (2011) e18342.1-e18342.6)는, 소르타아제 A에 의하여 촉매화되는 단백질-단백질 융합을 보여주었다. WO 2013/003555에는, 단백질 결찰에 대한 클릭 화학(click chemistry) 운영을 확립하기 위한 소르타아제의 용도가 보고되어 있다.
항-상피 성장 인자 수용체 항체의 단일 사슬 형태로의 조작과, 소르타아제 A 매개 단백질 결찰에 의한 표지화는 Madej, M.P.외 다수에 의해 보고되었다(Biotechnol. Bioeng. 109 (2012) 1461-1470). Ta, H.T.외 다수는, 심혈관 질환에 있어서 세포 귀환과 표적 분자 영상화에 대한 보편적 접근법으로서 효소적 단일 사슬 항체 태깅을 보고하였다(Cir. Res. 109 (2011) 365-373). Popp, M.외 다수는, 펩티드 결합의 형성 및 파괴(소르타아제를 사용하는 단백질 조작)를 보고하였다(Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 50 (2011) 5024-5032).
N-말단 막 고정 모티브(예컨대 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) SrtA의 60번 내지 206번 아미노산 잔기)가 결실된 절단형 SrtA는, 단백질 표지화, 공유적 단백질 고정, 그리고 신규 작용기의 단백질로의 통합을 위해 사용되었다(Ton-That, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 12424-12429; Ilangovan, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 6056-6061).
부위 특이적 표지화가 절실히 요망되는, 폴리펩티드의 가장 중요한 부류 중 하나는 면역글로불린 또는 항체이다. 비록 전체 항체(보통은 IgG, IgA 또는 IgM)가 대부분의 적용에 이상적이긴 하지만, 특정 절차의 성능은 항체 단편, 예컨대 Fab, Fab' 및 F(ab')2를 사용하여 향상된다.
주요 관심 항체 단편은 항원 결합 단편이다. 몇몇 유형의 항원 결합 단편이 사용 가능하지만, 이 단편은 각각 적어도, 항체 결합 부위가 보존되도록 (보통 이황화물 결합에 의해) 서로 상합되는, 항원 결합에 필요한 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 영역의 부분(각각 VH 및 VL)을 함유한다.
항체 단편화는 보통, 예컨대 면역글로불린 단백질 구조의 특정 부분을 소화 또는 절단하는 프로테아제를 사용하고, 필요하다면 F(ab')2 단편의 경첩 영역에 있는 이황화물 결합을 파괴하는 환원제를 사용하여 달성된다. 효소적 단편화는 다소 힘든 작업으로서, 단백질의 효소 매개 소화의 최적화가 요구되고, 이를 합당하게 효율적으로 만들기 위해 충분한(예컨대 10 ㎎ 이상) 항체의 공급을 필요로 하고, 종종 정교한 정제 단계를 추가로 수반한다. 시간과 비용이 많이 소요되는 항체의 단편화는 보통 관심 항체가 다량으로 사용 가능하고, 구체적 적용이 이를 요구할 때에만 수행된다.
항체 단편은 예를 들어, 예컨대 상기 언급된 수율 및 재현 가능성에 관한 단점을 모두 가지고 있는 최신식 절차를 사용하여 화학 표지화될 수 있다.
예컨대 효소에 의해 촉진되는 부위 지정 접합이 최근 들어 높은 관심을 받고 있다.
(적어도 논문상) 소르타아제 태깅은 항체 단편을 생성함과 동시에, 이러한 단편을 "태깅"함에 있어 효과를 볼 수 있었다. 이론상으로 항체는, 예컨대 유전자 조작된 재조합 항체의 Fc 영역에 소르타아제 태그를 통합시킬 수 있어야 하고, 이 소르타아제 태그를 동시 절단 및 접합에 이용할 수 있어야 한다. 그러므로 이론상, 그리고 소르타아제 태그의 위치에 따라서, 예컨대 F(ab) 또는 F(ab')2 단편의 접합체를 각각 수득하는 것이 가능하여야 한다.
그러나 하이브리도마에 의해 생산된 마우스 모노클로날 항체에서와 같이, 또 다른 원산 항체(native antibody)로 소르타아제 태깅이 시도되었을 때(즉 인지 서열 LPETG만이 삽입되었을 때), 해당 접근법은 전혀 효과를 볼 수 없었거나, 또는 그 수율은 낮았거나/실망스러웠다.
그러나, 동시 절단 및 부위 특이적 폴리펩티드 접합을 통하여 F(ab) 또는 F(ab')2와 같이 가장 유관한 항체 단편 각각의 소르타아제 매개 "태깅"을 경제적 및 산업상 적용 가능한 규모로 가능하게 하는 것에 대한 요구가 매우 절실할 것이다.
놀랍게도 소르타아제는, 이하 본원에 개시된 바와 같은 특성을 가지는 재조합 항체 중쇄의 소르타아제 매개 절단이 이루어질 때 (예컨대 항체-단편 표지화에 있어서) 항체-단편의 접합에 사용될 수 있음이 파악되었다.
본 발명의 개요
특정한 소르타아제 접합 루프가 면역글로불린 중쇄의 CH2 도메인과, 중간 경첩 영역의 가장 C-말단에 있는 시스테인 사이에 재조합 방법으로 도입되는 경우, 재조합 항체의 소르타아제 매개 절단 및 결찰이 가능하다는 것이 파악되었다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 VH 도메인, CH1 도메인, 중간 경첩 영역의 가장 C-말단에 있는 시스테인에 이르기까지의 경첩 영역, 소르타아제 접합 루프, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 재조합 면역글로불린 중쇄로서, 여기서 소르타아제 접합 루프는 a) 중간 경첩 영역의 가장 C-말단에 있는 시스테인과, 면역글로불린 중쇄 CH2 도메인의 N-말단에서의 VFX1FPP(SEQ ID NO: 2로서, X1은 L 또는 I임) 공통 서열 사이에 위치하는 적어도 16개의 아미노산으로 이루어지고, b) 아미노산 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1)(여기서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)로 이루어지는 소르타아제 인지 모티브를 포함하고, b)의 서열에 대한 N-말단에 적어도 2개의 아미노산을 포함하고, b)의 서열에 대한 C-말단에 적어도 6개의 아미노산을 포함하며, b)의 서열에 대한 C-말단 및 N-말단 아미노산은 시스테인이 아닌, 재조합 면역글로불린 중쇄를 개시하고 있다.
하기 본원에 개시된 바와 같은 적어도 2개의 재조합 면역글로불린 중쇄를 포함하는 항체가 추가로 개시되어 있다. 하나의 구현예에서, 이들 항체는 IgG 부류의 것이며, 하기 본원에 개시된 바와 같은 2개의 재조합 면역글로불린 중쇄를 가진다.
본원에 보고된 바와 같은 하나의 양태는, 재조합 면역글로불린 중쇄의 소르타아제 절단 단편과 소르타아제 친핵체 간의 접합체를 제조하기 위한 방법으로서, i) 본 발명에 개시된 바와 같은 재조합 면역글로불린 중쇄를 적어도 하나, 예컨대 2개 포함하는 IgG 부류 항체, ii) 소르타아제 친핵체를 포함하는 화합물, 및 iii) 소르타아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 인큐베이션하고, 그로써 재조합 항체 중쇄를 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있으며, X2는 G 또는 A임) 내부의 트레오닌 뒤에서 절단하고, 소르타아제 친핵체의 N-말단을 상기 트레오닌에 접합하는 단계를 포함하는 방법이다.
하나의 구현예에서, 본 출원은 본원에 개시된 바와 같은 방법에 따라서 제조된 접합체, 예컨대 VH 도메인, CH1 도메인, 중간 경첩 영역의 마지막 시스테인에 이르기까지의 경첩 영역, 중간 경첩 영역의 가장 C-말단에 있는 시스테인과 서열 LPXT(SEQ ID NO: 3으로서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 사이의 2개 이상의 아미노산, 및 적어도 2개의 글리신 잔기를 포함하는 재조합 면역글로불린 중쇄 단편을 포함하는 접합체에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명
I. 정의
본 발명의 설명과 청구범위에 있어서, 면역글로불린 중쇄 Fc 영역 내 잔기의 번호화는 Kabat의 EU 인덱스 번호화를 따른다[본원에 명백히 참조로 인용되어 있는 문헌(Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242) 참조].
"위치"라는 용어는, 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 아미노산 잔기의 자리를 지칭한다. 위치는 순서대로 번호화될 수 있거나, 또는 정립된 방식, 예를 들어 항체 번호화에 관한 Kabat의 EU 인덱스에 따라서 번호화될 수 있다.
"전장 항체"라는 용어는, 원산 항체(native antibody)와 실질적으로 동일한 구조 및 아미노산 서열을 가지는 항체를 지칭한다.
"전장 항체 중쇄"란 용어는, 항체 가변 도메인, 제1 불변 도메인(= CH1 도메인), 항체 중쇄 경첩 영역, 제2 불변 도메인(= CH2 도메인), 그리고 제3 불변 도메인(= CH3 도메인)을 N-말단 → C-말단 방향으로 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
"전장 항체 경쇄"란 용어는, 항체 가변 도메인과 불변 도메인을 N-말단 → C-말단 방향으로 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
"경첩 영역"이란 용어는, 야생형 항체 중쇄에서 CH1 도메인과 CH2 도메인을 연결하는 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분으로서, 예를 들어 인간 IgG1의 경우 EU 번호 체계에 따르면 약 216번 위치 내지 약 238번 위치(http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html)이거나, 또는 Kabat 번호화에 따르면 약 226번 위치 내지 약 243번 위치인 부분을 지칭한다. Kabat에 따른 226번 위치는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역의 99번 위치에 대응한다. 다른 IgG 하위 부류의 경첩 영역은 인간 IgG1 하위 부류 서열의 경첩 영역 시스테인 잔기와 정렬됨으로써 결정될 수 있다.
경첩 영역은 보통 아미노산 서열이 동일한 2개의 폴리펩티드로 이루어지는 이량체이다. 경첩 영역은 일반적으로 약 25개의 아미노산 잔기를 포함하며, 가요성이어서 항원 결합 영역이 독립적으로 움직일 수 있게 한다. 경첩 영역은 3개의 도메인, 즉 상부(upper) 경첩 도메인, 중간(middle) 경첩 도메인 및 하부(lower) 경첩 도메인으로 세분될 수 있다[예를 들어 문헌(Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083) 참조].
Fc 영역의 "상부 경첩 영역"이란 용어는, 예를 들어 인간 IgG1에 있어서, 중간 경첩 영역에 대해 N-말단에 있는 아미노산 잔기, 즉 EU 번호화에 따른 Fc 영역의 216번 내지 225번 잔기의 확장부(stretch)를 지칭한다.
"중간 경첩 영역"이란 용어는, 예를 들어 인간 IgG1에 있어서(즉 EU 번호화에 따른 Fc 영역의 226번 내지 230번 잔기), 가교 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 잔기의 확장부를 지칭하며, 프롤린과 시스테인이 풍부하고, 상부 경첩 영역과 하부 경첩 영역의 사이에 위치하고 있다.
Fc 영역의 "하부 경첩 영역"이란 용어는, 예를 들어 인간 IgG1에 있어서, 중간 경첩 영역에 대한 바로 C-말단의 아미노산 잔기, 즉 EU 번호화에 따른 Fc 영역의 231번 내지 238번 잔기의 확장부를 지칭한다.
"야생형 Fc 영역"이란 용어는, 자연에서 발견되는 통상의 알로타입(allotype)/이소알로타입(isoallotype)의 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 지칭한다. 야생형 인간 Fc 영역은 원산 인간 IgG1 Fc 영역(A 비-알로타입 및 A 알로타입), 원산 인간 IgG2 Fc 영역, 원산 인간 IgG3 Fc 영역 및 원산 인간 IgG4 Fc 영역뿐만 아니라, 이들의 자연 발생 변이체를 포함한다.
"변경"이란 용어는, 예를 들어 재조합 항체의 모 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이, 부가 또는 결실을 지칭한다.
"아미노산 돌연변이"란 용어는, 모 아미노산 서열 내 아미노산 서열에서의 변형을 지칭한다. 예시적 변형은 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다.
"특정 위치에서의 아미노산 돌연변이"란 용어는, 지정된 잔기의 치환 또는 결실, 또는 지정된 잔기에 인접한 적어도 하나의 아미노산 잔기의 삽입을 지칭한다. "지정된 잔기에 인접한 삽입"이란 용어는, 지정된 잔기로부터 1개 내지 2개 잔기 이내에서의 삽입을 지칭한다. 삽입은 지정된 잔기에 대해 N-말단 또는 C-말단일 수 있다.
"아미노산 치환"이란 용어는, 사전결정된 모 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산 잔기가, 상이한 "대체" 아미노산 잔기로 대체되는 것을 지칭한다. 대체 잔기 또는 잔기들은 "자연 발생 아미노산 잔기(즉 유전자 암호에 의해 암호화됨)"일 수 있으며, 알라닌(Ala); 아르기닌(Arg); 아스파라긴(Asn); 아스파르트산(Asp); 시스테인(Cys); 글루타민(Gln); 글루탐산(Glu); 글리신(Gly); 히스티딘(His); 이소루신(Ile): 루신(Leu); 리신(Lys); 메티오닌(Met); 페닐알라닌(Phe); 프롤린(Pro); 세린(Ser); 트레오닌(Thr); 트립토판(Trp); 티로신(Tyr); 및 발린(Val)으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 하나의 구현예에서, 아미노산 치환은 자연 발생 아미노산으로의 대체이다. 하나의 구현예에서, 대체 잔기는 시스테인이 아니다.
하나 이상의 비 자연 발생 아미노산 잔기로의 치환은 또한 본원의 아미노산 치환에 관한 정의에 포함된다. "비 자연 발생 아미노산 잔기"란, 상기 나열된 자연 발생 아미노산 잔기 이외의 잔기로서, 폴리펩티드 사슬 중 인접 아미노산 잔기(들)에 공유 결합할 수 있는 잔기를 지칭한다. 비 자연 발생 아미노산 잔기의 예로서는 노르루신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린, α-아미노이소부티르산(Aib) 및 기타 아미노산 잔기 유사체, 예컨대 문헌(Ellman, et al., Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336)에 기술된 것들을 포함한다. 이러한 비 자연 발생 아미노산 잔기를 제조하기 위하여 Noren외 다수의 절차(Science 244 (1989) 182) 및/또는 Ellman외 다수의 절차(상동)가 사용될 수 있다. 요약하면, 이들 절차는 억제 tRNA를 비 자연 발생 아미노산 잔기로 화학 활성화한 다음, RNA의 시험관 내 전사 및 번역을 진행시키는 것을 포함한다.
"아미노산 삽입"이란 용어는, 하나 이상의 부가 아미노산 잔기(들)를 사전결정된 모 아미노산 서열에 통합하는 것을 지칭한다. 본 발명에 의한 "삽입 아미노산 서열"은 보통 적어도 5개의 아미노산으로 이루어질 것이다. 삽입된 아미노산 잔기(들)는 상기 정의된 바와 같이 자연 발생의 것일 수 있거나, 비 자연 발생의 것일 수 있다. 하나의 구현예에서, 삽입된 아미노산 잔기는 자연 발생 아미노산 잔기이다. 하나의 구현예에서, 삽입된 아미노산 잔기는 자연 발생 아미노산 잔기이지만, 시스테인은 아니다. 하나의 구현예에서, 삽입된 아미노산 잔기는 자연 발생 아미노산 잔기이지만, 시스테인도 아니고 프롤린도 아니다.
"아미노산 결실"이란 용어는, 아미노산 서열 중 사전결정된 위치에서의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되는 것을 지칭한다.
본 출원 내에서 아미노산 변경이 언급될 때마다, 이는 정교한 아미노산 변경이며, 무작위의 아미노산 변형이 아니다.
II. 재조합 방법
VH 도메인, CH1 도메인, 중간 경첩 영역의 가장 C-말단에 있는 시스테인에 이르기까지의 경첩 영역, 소르타아제(sortase) 접합 루프, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며, 소르타아제 접합 루프가 a) 중간 경첩 영역의 가장 C-말단에 있는 시스테인과, 면역글로불린 중쇄 CH2 도메인의 N-말단에서의 VFX1FPP(SEQ ID NO: 2로서, X1은 L 또는 I임) 공통 서열 사이에 위치하는 적어도 16개의 아미노산으로 이루어지고, b) 아미노산 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1)(여기서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)로 이루어지는 소르타아제 인지 모티브를 포함하고, c) b)의 서열에 대한 N-말단에 적어도 2개의 아미노산을 포함하고, d) b)의 서열에 대한 C-말단에 적어도 6개의 아미노산을 포함하고, e) b)의 서열에 대한 C-말단 및 N-말단 아미노산이 시스테인이 아닌, 재조합 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 발현 벡터는 최신식 절차에 따라서 제조될 수 있다[예를 들어 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) 참조].
본원에 개시된 바와 같은 재조합 면역글로불린 중쇄를 제조하기 위해 시험관 내 번역을 이용할 수 있지만, 통상적으로 세포 발현 계가 사용될 것이다. 폴리펩티드 암호화 벡터를 클로닝 또는 발현/분비시키는데 적합한 숙주 세포는 본원에 기술된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 예를 들어 폴리펩티드는 박테리아 내에서, 구체적으로는 글리코실화가 필요하지 않을 때 생산될 수 있다[예를 들어 대장균(E. coli) 내에서의 항체 단편 발현에 대해 기술하고 있는 문헌(Charlton, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 245-254 (B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ), US 5,648,237, US 5,789,199 및 US 5,840,523 참조]. 폴리펩티드는 발현 후 가용성 분획 중 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있거나, 불용성 분획, 소위 봉입체(inclusion body)로부터 단리될 수 있으며, 이는 가용화되고 생체 활성 형태로 재폴딩(folding)될 수 있다. 그 다음, 폴리펩티드는 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물에 추가로, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어, 부분적으로나 전체적으로 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드 생산을 초래하는, 진균 및 효모 균주를 비롯한, 사상 진균 또는 효모가 폴리펩티드 암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다[예컨대 문헌(Gerngross, Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414, and Li, et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215) 참조].
글리코실화된 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포도 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로서는 식물 세포와 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질 감염을 위해 곤충 세포와 연계하여 사용될 수 있는 바큘로바이러스 균주 다수가 동정되었다.
식물 세포 배양액도 또한 숙주로 사용될 수 있다[예를 들어 US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 및 US 6,417,429(유전자 이식 식물 내에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIES™ 기술에 관하여 기술) 참조].
척추동물 세포도 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들어 현탁액 중에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 또 다른 예로서는, COS-7 세포주(SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포); HEK293 세포주(인간 배아 신장); BHK 세포주(새끼 햄스터 신장); TM4 마우스 세르톨리 세포주(예를 들어 문헌(Mather, Biol. Reprod. 23 (1980) 243-251)에 기술된 바와 같은 TM4 세포); CV1 세포주(원숭이 신장 세포); VERO-76 세포주(아프리카 푸른 원숭이 신장 세포); HELA 세포주(인간 지궁경부암종 세포); MDCK 세포주(개 신장 세포); BRL-3A 세포주(버팔로 래트 간 세포); W138 세포주(인간 폐 세포); HepG2 세포주(인간 간 세포); MMT 060562 세포주(마우스 유방암 세포); TRI 세포주(예컨대 문헌(Mather, et al., Anal. N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68)에 기술됨); MRC5 세포주; 및 FS4 세포주가 있다. 기타 유용한 포유동물 숙주 세포주로서는 CHO 세포주(중국 햄스터 난소 세포), 예컨대 DHFR 음성 CHO 세포주(예를 들어 문헌(Urlaub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216) 참조), 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 세포주를 포함한다. 폴리펩티드 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주에 관한 보고는, 예를 들어 문헌(Yazaki, and Wu, Methods in Molecular Biology, Antibody Engineering 248 (2004) 255-268 (B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ)을 참조한다.
항체 중쇄와 항체 경쇄의 공동 발현은 본 발명에 따른 하나의 구현예를 나타낸다. 이러한 공동 발현이 사용되면, 중쇄와 경쇄 둘 다를 포함하는 항체, 예컨대 본 발명에 따른 재조합 중쇄 2개와 경쇄 2개로 이루어지는 IgG 부류 항체가 수득될 수 있다.
III. 본원에 보고된 바와 같은 재조합 항체 중쇄 및 이의 용도
본 발명에 따른 재조합 면역글로불린 중쇄는 소르타아제 접합 루프의 의도적인 삽입에 의해 특징지어진다.
본 발명에 따른 소르타아제 접합 루프는 중간 경첩 영역의 가장 C-말단에 있는 시스테인과, 면역글로불린 중쇄 CH2 도메인의 N-말단 VFX1FPP(SEQ ID NO: 2로서, X1은 L 또는 I임) 공통 서열 사이에 위치하는 인공 아미노산 서열이다. 본 발명에 따른 소르타아제 접합 루프는, 부가적으로는 하기와 같은 본질적인 특징을 가진다: a) 적어도 16개의 아미노산으로 이루어지고, b) 아미노산 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1)(여기서 X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)로 이루어지는 소르타아제 인지 모티브를 포함하고, c) b)의 서열에 대한 N-말단에 적어도 2개의 아미노산을 포함하고, d) b)의 서열에 대한 C-말단에 적어도 6개의 아미노산을 포함하며, e) b)의 서열에 대한 C-말단 및 N-말단 아미노산은 시스테인이 아님.
표 1에 보인 바와 같이 다양한 면역글로불린 중쇄의 중간 경첩 영역은 적당한 서열 정렬을 통하여 용이하게 동정될 수 있다. 중간 경첩 영역 중 가장 C-말단에 있는 시스테인은 표 1에 굵은 글씨로 표시되어 있다. 표 1에는, 다양한 종으로부터의 면역글로불린 중쇄에 대한 공통 서열의 통상적인 서열 정렬이 제공되어 있다.
Figure pct00001
표 1에 보인 서열 부분은 하기와 같은 서열 식별자로서 각각 제공되어 있다: H-IgG1(SEQ ID NO: 4); H-IgG2(SEQ ID NO: 5); H-IgG4(SEQ ID NO: 6); M-IgG1(SEQ ID NO: 7); M-IgG2a(a)(SEQ ID NO: 8); M-IgG2a(b)(SEQ ID NO: 9); M-IgG2b(SEQ ID NO: 10); M-IgG3(SEQ ID NO: 11); Rb-IgG(SEQ ID NO: 12); 및 S-IgG(SEQ ID NO: 13).
특별한 경우는 상부/중간 경첩 영역이 동일 서열 복제물 3개와, 상동성이 매우 큰 추가 서열 1개를 포함하는 H-IgG3이다. CH1의 C-말단은 TKVDKRV(SEQ ID NO: 14)이고; 상부 경첩 및 중간 경첩은 ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRPC)3 (SEQ ID NO: 15)이며; CH2 도메인의 N-말단 아미노산을 가지는 하부 경첩은 APELLGGPSVFLF(SEQ ID NO: 16)이다.
항체의 경첩 영역은 CH1 도메인 내 가장 C-말단에 있는 β-시트(G-가닥)의 마지막 아미노산과, CH2 도메인 내 첫 번째 β-시트(A 가닥)의 첫 번째 아미노산 사이의 중쇄 서열 일부에 확장되어 있다.
상부 경첩 영역의 서열 (원산 또는 변형된 것) 은 본 발명을 실행함에 있어서 중요하지 않다.
중간 경첩 영역은 2개의 면역글로불린 중쇄 사이에 분자 간 시스테인 가교를 형성하는데 필요한 시스테인 잔기를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시물에 따른 재조합 면역글로불린 중쇄는 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)에 대한 C-말단에 적어도 7개의 아미노산을 포함하는 소르타아제 접합 루프를 가진다.
하나의 구현예에서, 본 개시물에 따른 재조합 면역글로불린 중쇄는, 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)에 대한 C-말단에 적어도 8개의 아미노산을 포함하는 소르타아제 접합 루프를 가진다.
하나의 구현예에서, 본 개시물에 따른 재조합 면역글로불린 중쇄는, 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)에 대한 C-말단에 적어도 9개의 아미노산을 포함하는 소르타아제 접합 루프를 가진다.
하나의 구현예에서, 본 개시물에 따른 재조합 면역글로불린 중쇄는, 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)에 대한 N-말단에 적어도 3개의 아미노산을 포함하는 소르타아제 접합 루프를 가진다.
하나의 구현예에서, 본 개시물에 따른 재조합 면역글로불린 중쇄는, 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)에 대한 N-말단에 적어도 4개의 아미노산을 포함하는 소르타아제 접합 루프를 가진다.
하나의 구현예에서, 본 개시물에 따른 재조합 면역글로불린 중쇄는, 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)에 대한 N-말단에 적어도 5개의 아미노산을 포함하는 소르타아제 접합 루프를 가진다.
하나의 구현예에서, 본 개시물에 따른 재조합 면역글로불린 중쇄는, 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)에 대한 N-말단에 적어도 6개의 아미노산을 포함하는 소르타아제 접합 루프를 가진다.
하나의 구현예에서, 본 개시물에 따른 재조합 면역글로불린 중쇄는, 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)에 대한 N-말단에 적어도 7개의 아미노산을 포함하는 소르타아제 접합 루프를 가진다.
하나의 구현예에서, 본 개시물에 따른 재조합 면역글로불린 중쇄는, 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)에 대한 N-말단에 적어도 8개의 아미노산을 포함하는 소르타아제 접합 루프를 가진다.
하나의 구현예에서, 본 개시물에 따른 재조합 면역글로불린 중쇄는, 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)에 대한 N-말단에 적어도 5개의 아미노산과, 상기 서열에 대한 C-말단에 적어도 9개의 아미노산을 포함하는 소르타아제 접합 루프를 가진다.
하나의 구현예에서, 본 개시물에 따른 재조합 면역글로불린 중쇄는, 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)에 대한 N-말단에 적어도 8개의 아미노산과, 상기 서열에 대한 C-말단에 적어도 9개의 아미노산을 포함하는 소르타아제 접합 루프를 가진다.
본 개시물에 따라서 최소 길이 16개 아미노산이 준수되는 한, 소르타아제 접합 루프의 전체 길이는 중요한 것으로 보이지 않는다. 그럼에도 불구하고, 하나의 구현예에서, 본 개시물에 따른 재조합 면역글로불린 중쇄 내 소르타아제 접합 루프의 길이는 최대 아미노산 50개이다. 추가의 구현예에서, 본 개시물에 따른 재조합 면역글로불린 중쇄 내 소르타아제 접합 루프의 길이는 최대 아미노산 45개, 40개, 35개 또는 30개이다.
추가의 구현예에서, 소르타아제 접합 루프의 전체 길이는 각각 적어도 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개 아미노산이다.
면역글로불린 중쇄는 보통 VH 도메인, CH1 도메인, 경첩 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 면역글로불린 중쇄는 소르타아제 접합 루프 이외에도 상기 본원에 정의된 바와 같은 변경을 추가로 포함할 수 있다. 이름이 명시하고 있는 바와 같이, 가변 서열은 관심 표적에 요망되는 결합 특이성이 주어지는 한 임의의 방식으로 변경될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 소르타아제 접합 루프를 포함하는 재조합 항체 중쇄는 상응하는 자연 발생 면역글로불린 중쇄와 적어도 90% 동일할 것이다(이때, 하부 경첩 영역과 소르타아제 접합 루프 각각은 이러한 동일성 평가에 사용되지 않음). 다시 말하면, GCG PileUp 프로그램을 사용하는, 그리고 가변 영역과, 한편으로는 소르타아제 접합 루프, 및 다른 한편으로는 하부 경첩 영역을 제외한 적당한 정렬 후의 재조합 면역글로불린 중쇄는, 상기 면역글로불린 중쇄에 대한 (상응) 공통 서열과 적어도 90% 동일하다. 다른 구현예에서, 재조합 면역글로불린 중쇄는, 대응하는 공통 서열과 비교하여, 그 동일성이 각각 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%일 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 재조합 면역글로불린 중쇄의 CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인 서열 각각은 상응하는 자연 발생 면역글로불린 중쇄와 적어도 90%까지 동일할 것이다. 다시 말하면, GCG PileUp 프로그램을 사용하는 적당한 정렬 후에는, 예를 들어 이처럼 변경된 재조합 마우스 IgG1 중쇄 CH1 도메인의 아미노산의 적어도 90%는, 마우스 IgG1 중쇄 CH1 도메인에 대한 공통 서열의 (상응) 아미노산과 동일하다. 다른 구현예에서, 변형된 CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인 각각은, 상응하는 공통 서열과 비교하여, 그 동일성이 각각 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%일 것이다.
상기 언급된 바와 같이, 항체 중쇄와 항체 경쇄의 공동 발현은 본 개시물에 따른 하나의 구현예를 나타낸다. 이러한 공동 발현이 특히 세포 발현 계와 연계되어 이용되면, 중쇄와 경쇄 둘 다를 포함하는 항체가 수득될 수 있다. (재조합) 면역글로불린 중쇄와 이에 상응하는 경쇄의 공동 발현은 원하는 항체의 형성과 높은 생성 수율 둘 다를 이끌어낸다.
예컨대 알파 면역글로불린(IgA), 감마 면역글로불린(IgG), 델타 면역글로불린(IgD), 엡실론 면역글로불린(IgE), 그리고 뮤 면역글로불린(IgM)이라 지칭되는 인간 항체의 다양한 이소타입이 존재한다. 하나의 구현예에서, 본 개시물은 본원에 개시된 바와 같은 적어도 2개의 재조합 면역글로불린 중쇄를 포함하는, (이들 이소타입 중 임의의 것, 또는 다른 종으로부터의 상응 이소타입, 또는 이들의 상응 하위 부류의) 항체에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, IgG 부류 항체가 기술되어 있고, 본원에 개시된 바와 같은 2개의 재조합 면역글로불린 중쇄를 가지는 IgG 부류 항체가 청구되고 있다.
명칭에 이미 제시되어 있듯이, 본 발명에 따른 소르타아제 접합 루프를 포함하는 재조합 항체 중쇄는 소르타아제 결찰 기반 방법에 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 개시물은 재조합 면역글로불린 중쇄의 소르타아제 절단 단편과 소르타아제 친핵체의 접합체를 생산하기 위한 방법에 관한 것으로서, 본 방법은 i) 각각이 소르타아제 접합 루프를 포함하는 적어도 2개의 재조합 면역글로불린 중쇄를 포함하는 항체로서, 여기서 소르타아제 접합 루프가 a) 중간 경첩 영역의 가장 C-말단에 있는 시스테인과, 면역글로불린 중쇄 CH2 도메인의 N-말단 VFX1FPP(SEQ ID NO: 2로서, X1은 L 또는 I임) 공통 서열 사이에 위치하는 적어도 16개의 아미노산으로 이루어지고, b) 아미노산 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1)(여기서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)로 이루어지는 소르타아제 인지 모티브를 포함하고, c) b)의 서열에 대한 N-말단에 적어도 2개의 아미노산을 포함하고, d) b)의 서열에 대한 C-말단에 적어도 6개의 아미노산을 포함하며, e) b)의 서열에 대한 C-말단 및 N-말단 아미노산은 시스테인이 아닌 항체, ii) 소르타아제 친핵체를 포함하는 화합물, 및 iii) 소르타아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 인큐베이션하고, 그로써 재조합 항체 중쇄를 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있으며, X2는 G 또는 A임) 내부의 트레오닌 뒤에서 절단하고, 소르타아제 친핵체의 N-말단을 상기 트레오닌에 접합하는 단계를 포함한다.
당업자가 용이하게 이해할 바와 같이, 이러한 인큐베이션은 원하는 결과, 즉 원하는 접합체를 달성하기에 적당한 완충 조건을 사용하여 수행될 것이다. 이러한 적당한 조건은 문헌에 널리 공지되어 있고, 표준적 소르타아제 결찰 완충액은, 예를 들어 MgCl2를 포함한다.
소르타아제 A(SrtA)는 단백질을 박테리아 세포벽에 공유 부착시키는 막 결합 효소이다. 특정 "소르타아제 인지 모티브" 또는 "소르타아제 모티브"는 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)이다. 하나의 구현예에서, 소르타아제 인지 모티브는 X2가 G인 LPX1TX2이다. 하나의 구현예에서, X1은 자연 발생 아미노산이다. 하나의 구현예에서, X1은 시스테인 잔기가 아니다. 하나의 구현예에서, X1은 자연 발생 아미노산이지만, 시스테인 잔기는 아니다.
다수의 그람 양성 박테리아는 바이러스 독성 인자를 비롯한 다양한 표면 단백질을 박테리아 세포벽(펩티도글리칸)에 공유 고정하는데 소르타아제를 이용한다. 소르타아제는 막 결합 효소이다. 야생형 스타필로코커스 아우레우스 소르타아제 A(SrtA)는 N-말단 막 확장 영역을 가지는, 206개 아미노산의 폴리펩티드이다. 첫 번째 단계에서, 소르타아제 A는 소르타아제 인지 모티브(LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임))를 함유하는 기질 단백질을 인지한다. 소르타아제 효소는 트레오닌(T)과 X2(G 또는 A) 사이를 절단한다. Thr 뒤 아미드 결합의 효소 절단은 활성 부위 Cys에 의한 것이다. 이 펩티드 절단 반응은 소르타아제 A-기질 티오에스테르 중간체를 생성한다. 두 번째 단계에서, 티오에스테르 아실-효소 중간체는 소르타아제 결찰 모티브를 포함하는 소르타아제 기질(소르타아제 친핵체) 내 아미노기의 친핵성 공격에 의해 분해된다. 자연에서, 소르타아제 기질 폴리펩티드는 에스.아우레우스 내 펩티도글리칸의 펜타글리신 단위에 상응하고, 친핵성 공격은 공유 연결된 세포벽 단백질과, 소르타아제 A의 재생성을 초래한다. 올리고글리신 친핵체의 부재 시, 아실 효소 중간체가 물 분자에 의해 가수분해될 수 있다.
"소르타아제 친핵체"는, "소르타아제 결찰 모티브" 또는 간단히 말하면 "결찰 모티브" 및 "관심 태그" 또는 간단히 말하면 "태그" 를 포함한다. 소르타아제 친핵체는 N-말단에 올리고글리신을 가지고, 그의 결찰 모티브로서 적어도 2개의 글리신 잔기로 이루어진다. 다시 말하면, 소르타아제 결찰 모티브는 적어도 2개의 연속 글리신 잔기로 이루어진다.
하나의 구현예에서, 본 출원에 따른 방법은 화학식 (Gly)n-태그(여기서, n은 적어도 2임)를 가지는 관심 태그를 포함하는 소르타아제 친핵체를 사용하여 실행된다. 소르타아제 결찰 모티브 (Gly)n은 더 길 수 있으며, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 글리신 잔기로 이루어질 수 있다(즉 "(Gly)n-태그"의 "n"은 3, 4, 5 또는 6임). 추가의 구현예에서, 본 출원에 따른 방법은 화학식 (Gly)n-태그(여기서, n은 각각 3, 4, 5 또는 6임)를 가지는 관심 태그를 포함하는 소르타아제 친핵체를 사용하여 실행된다.
자연에서, 펩티도글리칸 상 소르타아제 결찰 모티브는 펜타글리신 모티브이다. N-말단 상 트리글리신 모티브, 심지어 디글리신 모티브는 SrtA 반응을 뒷받침하기에 충분하다고 나타난다(Clancy, K.W., et al., Peptide Science 94 (2010) 385-396). 반응은, 펩티도글리칸을 단백질 기질에 공유 연결시키고 SrtA를 재생성하면서, 아민 친핵체의 공격에 의해 올리고글리신으로부터 분해되는 티오에스테르 아실-효소 중간체를 통해 진행된다. SrtA는, 예컨대 결찰 모티브를 포함하는 기질을 함유하는 펩티드 또는 화학 합성 펩티드를, 소르타아제 인지 모티브를 포함하는 재조합 발현된 단백질에 공유 접합하는데 사용될 수 있다.
소르타아제 매개 결찰/접합은 다양한 단백질 조작 및 생체 접합용으로 적용되기 시작하였다. 이 기술은 천연 및 합성 작용기를 LPX1TX2-태깅된 재조합 또는 화학 합성 폴리펩티드에 도입시킬 수 있다. 예로서는 올리고글리신 유도체화 중합체(예컨대 PEG), 형광단, 비타민(예컨대 바이오틴 및 엽산염), 지질, 탄수화물, 핵산, 합성 펩티드 및 단백질(예컨대 GFP)의 공유 부착을 포함한다(예를 들어 문헌(Tsukiji, S. and Nagamune, T., ChemBioChem 10 (2009) 787-798; Popp, M.W.L. and Ploegh, H.L., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50 (2011) 5024-5032) 참조).
하나의 구현예에서, 시험관 내 효소 접합을 위해서는 막 확장 영역이 결실된 가용성 절단형 소르타아제 A(SrtA; 스타필로코커스 아우레우스 SrtA의 60번 내지 206번 아미노산 잔기)가 사용된다(SEQ ID NO: 17; 또한 문헌(Ton-That, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 12424-12429; Ilangovan, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 6056-6061) 참조).
소르타아제 친핵체에 포함된 "관심 태그" 또는 간단히 말하면 "태그"는 결합 쌍의 파트너, 작용기, 치료제(약물), 세포독성 제제(예컨대 독소, 예를 들어 독소루비신 또는 백일해 독소) 및 표지(예컨대 형광단, 예를 들어 플루오레세인 또는 로다민과 같은 형광 염료, 화학 발광 표지 또는 전기화학발광 표지, 방사성 표지, 금속 킬레이트 착물(영상화 또는 방사선치료용), 효소, 또는 GFP와 같은 형광 단백질)일 수 있다.
하나의 구현예에서, 태그는 결합 쌍의 파트너이다. 본원에 사용되는 바와 같은 결합 쌍은 서로 간에 높은 친화도, 즉 1 나노 몰 이상의 친화도로 결합하는 2개 파트너로 이루어진다. 결합 쌍에 대한 구현예로서는, 예를 들어 수용체와 리간드, 합텐과 항-합텐 항체로 이루어지는 결합 쌍, 그리고 자연 발생 고 친화성 결합 쌍을 기반으로 하는 결합 쌍이 있다.
수용체-리간드 결합 쌍의 일례로서는, 스테로이드 호르몬 수용체와 상응하는 스테로이드 호르몬으로 이루어지는 쌍이 있다.
본 발명에 따른 방법에 적합한 결합 쌍의 한 가지 유형은 합텐 및 항-합텐 항체 결합 쌍이다. 합텐은 분자량이 100 달톤 내지 2000 달톤, 바람직하게 150 달톤 내지 1000 달톤인 유기 분자이다. 이러한 소형 분자는, 담체 분자에 결합함으로써 면역원성이 될 수 있으며, 항-합텐 항체는 표준 절차에 따라서 생성될 수 있다. 합텐은 스테롤, 담즙산, 성 호르몬, 코르티코이드, 카르데놀라이드, 카르데놀라이드-글리코시드, 부파디에놀라이드, 스테로이드-사포게닌 및 스테로이드 알칼로이드, 카르데놀라이드 및 카르데놀라이드-글리코시드를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 물질 부류를 대표하는 것으로서는, 디곡시게닌, 디기톡시게닌, 기톡시게닌, 스트로판티딘, 디곡신, 디기톡신, 디톡신, 스트로판틴이 있다. 기타 적합한 합텐으로서는, 예컨대 플루오레세인이 있다.
자연 발생 고 친화성 결합 쌍을 기반으로 하는 결합 쌍의 예는, 바이오틴 또는 바이오틴 유사체, 예컨대 아미노바이오틴, 이미노바이오틴 또는 데스티오바이오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘 뿐만 아니라, FimG 및 DsF 결합 쌍이 있다. 바이오틴-(스트렙트)아비딘 결합 쌍은 당업계에 널리 공지되어 있다. FimG-DsF 결합 쌍의 기본 원리는 예를 들어 WO 2012/028697에 기술되어 있다.
하나의 구현예에서, 결합 쌍은 합텐 및 항-합텐 항체, 바이오틴 또는 바이오틴 유사체, 예컨대 아미노바이오틴, 이미노바이오틴 또는 데스티오바이오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘, FimG 및 DsF, 그리고 수용체와 리간드로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 결합 쌍은 합텐 및 항-합텐 항체 및 바이오틴 또는 바이오틴 유사체, 예컨대 아미노바이오틴, 이미노바이오틴 또는 데스티오바이오틴/아비딘 또는 스트렙타비딘, FimG 및 DsF로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 결합 쌍은 바이오틴(또는 바이오틴 유사체, 예컨대 아미노바이오틴, 이미노바이오틴 또는 데스티오바이오틴) 및 아비딘 또는 스트렙타비딘이다.
하나의 구현예에서, 결합 쌍은 바이오틴과 스트렙타비딘으로 이루어진다.
하나의 구현예에서, 태그는 알데히드, 카르복실산, 카르복실산 에스테르, 에폭시드, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 아미노기, 할로겐, 히드라진, 하이드록실, 설프히드릴, 말레이미도, 알키닐, 아지드, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트 및 포스포라미다이트, 트랜스-사이클로옥텐, 테트라진으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 작용기이다.
하나의 구현예에서, 태그는 카르복실산, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 아미노기, 할로겐, 설프히드릴, 말레이미도, 알키닐, 아지드, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트 및 포스포라미다이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 작용기이다.
태그는 치료제(약물)일 수 있는데, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 세포 표면 분자와 이의 리간드에 대해 유도된 다수의 치료용 항체, 예컨대 리툭산/맙테라/리툭시맙, 2H7/오크렐리주맙, 제발린/이브리주모맙, 아르제라/오파투무맙(CD20), HLL2/에프라투주맙, 이노투조맙 (CD22), 제나팍스/다클리주맙, 시뮬렉트/바실릭시맙(CD25), 허셉틴/트라스투주맙, 페르투주맙(Her2/ERBB2), 마일로타그/겜투주맙(CD33), 랍티바/에팔리주맙(Cd11a), 어비툭스/세툭시맙(EGFR, 상피 성장 인자 수용체), IMC-1121B(VEGF 수용체 2), 티사브리/나탈리주맙(α4β1 및 α4β7 인테그린의 α4-서브유닛), 레오프로/압식시맙(gpIIb-gpIIa 및 ανβ3-인테그린), 오르노클론 OKT3/뮤로모납-CD3(CD3), 벤리스타/벨리무맙(BAFF), 톨럭스/오텔릭시맙(CD3), 솔리리스/에쿨리주맙(C5 보체 단백질), 악템라/토실리주맙(IL-6R), 파노렉스/에드레콜로맙(EpCAM, 상피 세포 부착 분자), CEA-CAM5/라베투주맙(CD66/CEA, 암배아 항원), CT-11(PD-1, 프로그래밍된 사멸-1 T-세포 억제 수용체, CD-d279), H224G11(c-Met 수용체), SAR3419(CD19), IMC-A12/식수투무맙(Cixutumumab)(IGF-1R, 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체), MEDI-575(PDGF-R, 혈소판 유래 성장 인자 수용체), CP-675, 206/트레멜리무맙(세포 독성 T 림프구 항원 4), RO5323441(태반 성장 인자 또는 PGF), HGS1012/마파투무맙(TRAIL-R1), SGN-70(CD70), 베도틴(SGN-35)/브렌툭시맙(CD30), 및 ARH460-16-2(CD44)가 공지되어 있다.
태그는 또한 (i) 미세소관 억제제, 유사분열 억제제, 토오이소머라아제 억제제 또는 DNA 개입제로서 기능할 수 있는 화학요법제; (ii) 효소적으로 기능할 수 있는 단백질 독소; 및 (iii) 치료용 방사성 동위원소로부터 선택되는 세포 독성 제제일 수 있다.
예시적 화학요법제로서는 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065, 칼리키아미신 및 기타 에네다인 항생제, 탁산, 안트라사이클린 및 이들의 입체이성체, 동배체, 유사체 또는 유도체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
단백질 독소는 디프테리아-A 사슬, 디프테리아 독소의 비-결합형 활성 단편, 외독소 A 사슬(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 사슬(Vitetta et al (1987) Science, 238:1098), 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레루리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-5), 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(Sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센(WO 93/21232)을 포함한다.
치료용 방사성 동위원소는 32P, 33P, 90Y, 125I, 131I, 131In, 153Sm, 186Re, 188Re, 211At, 212B, 212Pb 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다.
방사성 동위원소는 공지된 방법으로 통합될 수 있다(Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57; "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" Chatal, CRC Press 1989). 14번 탄소로 표지화된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(MX-DTPA)은 착물에의 방사성 핵종 접합을 위한 예시적 킬레이트화제이다(WO 94/11026).
하나의 구현예에서, 태그는 표지이다. 소르타아제 결찰 모티브 아미노산 서열에 공유 부착될 수 있는 임의의 표지 모이어티(moiety)가 사용될 수 있다(예를 들어 문헌(Singh et al (2002) Anal. Biochem. 304:147-15; Harlow E. and Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Lundblad R. L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, Fla.) 참조). 표지는 (i) 검출 가능 신호를 제공하고; (ii) 제2 표지와 상호작용하여, 제1 표지 또는 제2 표지에 의해 제공되는 검출 가능 신호를 변형하여, 예컨대 FRET(형광 공명 에너지 전이)를 일으키고; (iii) 전하, 소수성, 형태 또는 기타 물리적 매개변수에 의해 이동도, 예컨대 전기영동 이동도 또는 세포-투과도에 영향을 미치게 하거나; (iv) 예컨대 이온성 착화를 조정하기 위해 포착 모이어티(capture moiety)를 제공하는 기능을 할 수 있다.
일반적으로 하기 범주로 구분될 수 있는 다수의 표지가 사용 가능하다:
(a) 형광 염료, 화학발광 염료(Briggs et al "Synthesis of Functionalized Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1 (1997) 1051-1058) 및 전기화학발광 표지는 검출 가능 신호를 제공하고, 일반적으로는 표지화에 적용 가능하다.
형광 표지 또는 형광단은 희토류 킬레이트(유로퓸 킬레이트), 플루오레세인 류의 표지, 예컨대 FITC, 5-카르복시플루오레세인, 6-카르복시 플루오레세인; 로다민형 표지, 예컨대 TAMRA; 단실; 리사민; 시아닌; 피코에리트린; 텍사스 레드; 및 이들의 유사체를 포함한다. 형광 표지는, 예컨대 문헌(Current Protocols in Immunology, 상동)에 개시된 기술을 사용하여 소르타아제 결찰 모티브에 접합될 수 있다. 형광 염료 및 형광 표지 시약으로서는, Invitrogen/Molecular Probes(Eugene, Oregon, USA) 및 Pierce Biotechnology, Inc.(Rockford, Ill)로부터 시판되는 것을 포함한다.
화학발광 표지의 상이한 부류로서는, 루미놀, 아크리디늄 화합물, 코엘렌테라진 및 유사체, 디옥세탄, 퍼옥시옥살산 기반 계 및 이의 유도체를 포함한다. 면역진단 절차용으로서는 주로 아크리디늄 기반 표지가 사용되고 있다(이에 관한 자세한 개관은 문헌(Dodeigne C. et al., Talanta 51 (2000) 415-439)에 제공되어 있음).
전기화학발광 표지와 관련된 주요 태그는 각각 루테늄 기반 및 이리듐 기반 전기화학발광 착물이다. 전기화학발광법(ECL)은 분석 적용에 있어 감수성과 선택성이 큰 방법으로서 매우 유용한 것으로 판명되었다. ECL은 화학발광 분석의 분석상 이점(즉 백그라운드 광신호가 발생하지 않는다는 점)과, 전극 전위를 적용함으로써 반응의 제어가 용이하다는 점을 조합한다. 일반적으로 액체 상 또는 액체-고체 계면에서 TPA(트리프로필아민)로 재생성되는 루테늄 착물, 특히 (약 620 ㎚에서 광자를 방출하는) [Ru (Bpy)3]2 +가 ECL 표지로서 사용된다. 최근에는 또한 이리듐 기반 ECL 표지가 기술된 바 있다(WO 2012107419(A1)).
(b) 방사성 표지는 방사성 동위원소(방사성 핵종), 예컨대 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Gn, 86Y, 89Zr, 99TC, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At 또는 131Bi를 이용한다.
(c) 영상화 및 치료 목적의 표지로서 적합한 금속-킬레이트 착물은 당업계에 널리 공지되어 있다[US 2010/0111856; US 5,342,606; US 5,428,155; US 5,316,757; US 5,480,990; US 5,462,725; US 5,428,139; US 5,385,893; US 5,739,294; US 5,750,660; US 5,834,456; Hnatowich et al, J. Immunol. Methods 65 (1983) 147-157; Meares et　al, Anal. Biochem. 142 (1984) 68-78; Mirzadeh et al, Bioconjugate Chem.　1 (1990) 59-65; Meares et al, J. Cancer (1990), Suppl. 10:21-26; Izard et al, Bioconjugate Chem. 3 (1992) 346-350; Nikula et al, Nucl. Med. Biol. 22 (1995) 387-90; Camera et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 955-62; Kukis et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 2105-2110; Verel et al., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Camera et al, J. Nucl. Med. 21 (1994) 640-646; Ruegg et al, Cancer Res. 50 (1990) 4221-4226; Verel et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Lee et al, Cancer Res. 61 (2001) 4474-4482; Mitchell, et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1105-1112; Kobayashi et al Bioconjugate Chem. 10 (1999) 103-111; Miederer et al, J. Nucl. Med. 45 (2004) 129-137; DeNardo et al, Clinical Cancer Research 4 (1998) 2483-90; Blend et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18 (2003) 355-363; Nikula et al J. Nucl. Med. 40 (1999) 166-76; Kobayashi et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 829-36; Mardirossian et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 65-74; Roselli et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14 (1999) 209-20].
(d) 효소도 또한 소르타아제 친핵체에 있어서 태그/표지로서 사용될 수 있다. 다양한 효소-기질 표지 계가 사용 가능하다. 효소는, 일반적으로 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색 기질의 화학적 변경을 촉매화한다. 예를 들어 효소는 분광분석에 의해 측정될 수 있는 기질의 변색을 촉매화할 수 있다. 대안적으로, 효소는 기질의 형광성 또는 화학발광성을 변경할 수 있다. 화학발광성 기질은 화학 반응에 의해 전자 여기되게 되고, 그런 다음 (예컨대 화학발광측정계를 사용하여) 측정될 수 있는 빛을 방출할 수 있거나, 또는 형광 수용체에 에너지를 공여한다. 효소 표지의 예로서는 루시퍼라아제(예컨대 반딧불이 루시퍼라아제 및 박테리아 루시퍼라아제; US 4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 탈수소효소, 우레아제, 퍼옥시다아제, 예컨대 호스래디시 퍼옥시다아제(HRP), 알칼리 포스파타아제(AP), 3-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 당류 옥시다아제(예컨대 글루코스 옥시다아제, 갈락토스 옥시다아제 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소), 헤테로사이클릭 옥시다아제(예컨대 우리카아제 및 잔틴 옥시다아제), 락토퍼옥시다아제, 마이크로퍼옥시다아제 등을 포함한다.
효소-기질 조합의 예로서는, 예를 들어 하기의 것을 포함한다(US 4,275,149; US 4,318,980 을 또한 참조):
(i) 호스래디시 퍼옥시다아제(HRP)와 하이드로젠 퍼옥시다아제(기질로서)[여기서, 하이드로젠 퍼옥시다아제는 염료 전구체(예컨대 오르토페닐렌 디아민(OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 하이드로클로라이드(TMB))를 산화시킴];
(ii) 알칼리 포스파타아제(AP)와 파라-니트로페닐 포스페이트(발색 기질로서); 및
(iii) 3-D-갈락토시다아제(3-D-Gal))와 발색 기질(예컨대 p-니트로페닐-(3-D-갈락토시다아제) 또는 형광원 기질 4-메틸움벨리페릴-(3-D-갈락토시다아제).
하나의 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법 중 임의의 방법에 따라 제조된 접합체에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법에 따라서 제조된 접합체는 VH 도메인, CH1 도메인, 중간 경첩 영역의 마지막 시스테인에 이르기까지의 경첩 영역, 중간 경첩 영역의 가장 C-말단에 있는 시스테인과, 서열 LPXT(SEQ ID NO: 3으로서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 사이의 2개 이상의 아미노산, 및 적어도 2개의 글리신 잔기를 포함하는 재조합 면역글로불린 중쇄 단편을 포함할 것이다.
본원에서 상기 언급된 바와 같이, 완전 항체, 즉 본원에 개시된 바와 같은 재조합 면역글로불린 중쇄와 면역글로불린 경쇄 둘 다를 가지는 항체를 제조하는 것이 유리하다. 이러한 항체가 본 발명에 따른 방법에서 ("소르태깅(sortagging)"에) 사용되는 경우, F(ab')2-유사 단편이 수득된다. 이러한 F(ab')2-유사 단편은, 표준 절차를 통하여 수득된 F(ab')2 단편과 매우 유사하다. 만일 본원에 개시된 바와 같은 재조합 중쇄를 포함하는 동일 항체가 표준 절차 또는 소르태깅 절차에 사용되면, 서열은 마지막 시스테인에 이르기까지 동일할 것이지만, 중간 경첩 영역의 마지막 시스테인에 대해 C-말단에 있는 아미노산에 관해서는 유의적으로 상이할 것이다(즉 하나의 절차는 표준적인 F(ab')2 단편을, 또 다른 절차(소르태깅)는 매우 유사하나 동일하지는 않은 F(ab')2-유사 단편을 생성할 것이다). 소르태깅 후 이러한 F(ab')2-유사 단편은 또한 적어도, 분명히 최소한의 필수 소르타아제 결찰 모티브, 즉 글리신 잔기 2개를 함유할 것이다.
하나의 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 접합체에는 VH 도메인, CH1 도메인, 중간 경첩 영역의 마지막 시스테인에 이르기까지의 경첩 영역, 중간 경첩 영역의 가장 C-말단에 있는 시스테인과 서열 LPXT(SEQ ID NO: 3으로서, X는 임의의 아미노산일 수 있음) 사이의 2개 이상의 아미노산, 및 적어도 2개의 글리신 잔기를 포함하는 2개의 재조합 면역글로불린 중쇄 단편이 시스틴 결합을 통해 서로 결합한 것이 포함되어 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 접합체는 시스틴 결합을 통하여 서로 결합된 2개의 재조합 면역글로불린 중쇄 단편 (상기 중쇄 단편은 VH1 도메인, CH1 도메인, 중간 경첩 영역의 마지막 시스테인에 이르기까지의 경첩 영역, 중간 경첩 영역의 가장 C-말단에 있는 시스테인과 서열 LPXT(SEQ ID NO: 3으로서, X는 임의의 아미노산일 수 있음) 사이의 2개 이상의 아미노산, 및 적어도 2개의 글리신 잔기를 포함함); 및 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함할 것이다.
본원에 보고된 바와 같은 표지를 포함하는 접합체는, 예컨대 전혈, 혈장 또는 혈청 시료 중 관심 항원을 검출하기 위한 진단 분석에 유용할 수 있다. 본원에 보고된 바와 같이 표지화된 접합체는 임의의 공지된 검정 방법, 예컨대 ELISA, 경쟁적 결합 검정, 직간접 샌드위치 검정 및 면역침전 검정에 사용될 수 있다[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (1987) pp. 147-158, CRC Press, Inc.].
본원에 보고된 바와 같이 표지화된 접합체는 또한 대안적으로 (i) MRI(자기공명영상화); (ii) MicroCT(컴퓨터 단층촬영); (iii) SPECT(단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영); (iv) PET(양전자 방출 단층촬영)(Tinianow, J. et al, Nuclear Medicine and Biology, 37(3) (2010) 289-297; Chen et al, Bioconjugate Chem. 15 (2004) 41-49; US 2010/0111856); (v) 생물발광; (vi) 형광; 및 (vii) 초음파와 같은, 생물 의학 및 분자 영상화의 다양한 방법 및 기술에 의한 영상화 바이오마커 및 프로브로서 유용할 것이다. 면역섬광조영술은, 방사성 물질로 표지화된 접합체를 동물이나 인간 환자에게 투여하고, 접합체가 국소화된 몸속 부위를 촬상하는 영상화 방법이다(US 6,528,624). 영상화 바이오마커는 정상적인 생체 과정, 발병 과정 또는 치료적 개입에 대한 약리학적 반응에 관한 지표로서 객관적으로 측정 및 평가될 수 있다.
하나의 구현예에서, 소르타아제 친핵체는 소르타아제 결찰 모티브와 태그로 이루어져 있다. 추가의 구현예에서, 소르타아제 친핵체는 소르타아제 결찰 모티브, 링커 및 태그로 이루어진다. 본원에서 "링커"라는 용어는, 제1 모이어티를 제2 모이어티와 접합(연결)시키는데 사용될 수 있었던 이작용성 또는 다작용성 모이어티를 지칭한다. 링커 포함 소르타아제 친핵체는 2개의 반응성 작용기를 가지는 링커를 사용하여 편리하게 제조될 수 있다.
링커는 소르타아제 결찰 모티브를 태그에 연결시키는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 아미노산 잔기는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 헥사펩티드, 헵타펩티드, 옥타펩티드, 노나펩티드, 데카펩티드, 운데카펩티드 또는 도데카펩티드 단위를 형성할 수 있다. 아미노산 잔기는 자연 발생된 아미노산 잔기 뿐만 아니라, 자연 발생되지 않은 아미노산 유사체, 예컨대 시트룰린 또는 β-아미노산, 예컨대 β-알라닌 또는 ω-아미노산, 예컨대 4-아미노-부티르산을 포함한다.
통상적으로 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에 펩티드 결합을 형성시킴으로써 펩티드 유형 링커가 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은, 예를 들어 펩티드 화학 분야에 널리 공지된 액체상 합성 방법(E. Schroder and K. Lubke "The Peptides", volume 1 (1965) 76-136, Academic Press)에 따라서 제조될 수 있다.
다른 구현예에서, 링커는 가용성 또는 반응성을 조정하는 기를 포함할 수 있거나, 이것으로 이루어질 수 있거나 치환될 수 있다. 예를 들어 링커 내 하전된 치환기, 예컨대 설포네이트(SO3 -) 또는 암모늄은 소르타아제 친핵체의 수용성을 증가시킬 수 있다. 중합체, 예컨대 PEG로 이루어진 링커도 또한 긍정적인 효과를 보일 수 있는데, 예를 들어 비특이적 결합의 감소를 초래할 수 있다.
하기 실시예에 보인 바와 같이, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 F(ab')2-유사 접합체는, 최신식 절차로 수득된 F(ab')2 접합체에 비하여 유의한 이점을 보인다.
도 1: 소르타아제 반응 개략도; (A) LPXTG 인지 모티브를 함유하는 폴리펩티드; (B) 소르타아제 친핵체
도 2: 소르타아제 매개 1단계 절단 및 접합 프로토콜의 개략도. 본 도면에 표시된 부호는 다음과 같다:
VL, VH, CL, CH1, CH2, CH3 = IgG의 공통 도메인
G = 글리코실화
SCL = 소르타아제 접합 루프
Tag = 친핵체를 가지는 소르타아제 태그
도 3: GGGG 결찰 모티브 및 바이오틴 태그를 포함하는 소르타아제 친핵체의 구조.
도 4: 소르타아제 매개 절단의 모니터링;
반응 개시 후 각각 1시간, 3시간, 10시간 및 15시간 경과시에 수행된, 절단 반응의 GPC 모니터링에 의해 수득한, 선택 크로마토그램.
(A) IgG; (B) C-말단 바이오틴화된 F(ab')2 단편; (C) Fcγ 단편.
도 5: 최신식 접합체와 본 발명에 따른 접합체의 비교 평가 결과; 바이오틴-NHS 표지화된, 효소(파페인) 절단 F(ab')2 단편(A) 및 소르타아제 절단/바이오틴-접합 F(ab')2 단편(B)에 대한 ECL 신호가 표시되어 있다.
도 6: 최신식 접합체와 본 발명에 따른 접합체의 비교 평가 결과; 바이오틴-NHS 표지화된 IgG(A) 및 소르타아제 절단/바이오틴-접합 F(ab')2 단편(B)에 대한 ECL 신호가 표시되어 있다.
하기 실시예, 도면 및 서열은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구범위에 제시되어 있다. 제시된 절차에는 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 변형이 가해질 수 있음이 이해된다.
앞서 말한 발명은 분명한 이해를 도모하기 위하여 예시와 실시예에 의해 어느 정도 상세히 기술되었지만, 이러한 발명의 설명과 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로서 해석되어서는 안될 것이다.
실시예
재조합 DNA 기술
문헌(Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)에 기술된 바와 같이, DNA를 조작하기 위해 표준 방법을 사용하였다. 제조자의 지침에 따라서 분자 생물학적 시약을 사용하였다.
유전자 및 올리고뉴클레오티드 합성
Geneart GmbH(Regensburg, Germany)의 화학 합성법에 의해 원하는 유전자 분절을 제조하였다. 합성된 유전자 단편을 증식/증폭시키기 위해 대장균 플라스미드에 클로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열결정으로 확인하였다. 대안적으로는, 화학 합성된 올리고뉴클레오티드를 어닐링(annealing)하거나 PCR에 의해 짧은 합성 DNA 단편을 조립하였다. Metabion GmbH(Planegg-Martinsried, Germany)에 의해 각각의 올리고뉴클레오티드를 제조하였다.
기본적/표준 포유동물 발현 플라스미드의 설명
원하는 유전자/단백질(예컨대 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄 또는 N-말단에 올리고글리신을 함유하는 Fc 사슬)을 발현하기 위해, 하기와 같은 작용 요소를 포함하는 전사 단위를 사용하였다:
- 인트론 A를 포함하는, 인간 거대세포바이러스로부터의 프로모터(P-CMV) 및 즉시 초기 인핸서,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'-UTR),
- 쥐과 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 발현될 유전자/단백질(예컨대 전장 항체 중쇄), 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).
발현시킬 원하는 유전자를 포함하는 발현 단위/카세트 이외에, 기본/표준 포유동물 발현 플라스미드는 하기:
- 대장균 내 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는, 벡터 pUC18로부터의 복제 기원, 및
- 대장균 내 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자
를 함유한다.
단백질 측정
폴리펩티드의 아미노산 서열을 기초로 산정된 몰 소광 계수(molar extinction coefficient)를 이용하여, 280 ㎚에서의 광학 밀도(OD)를 측정함으로써, 정제된 폴리펩티드의 단백질 농도를 측정하였다.
실시예 1
가용성 에스.아우레우스 소르타아제 A를 위한 발현 플라스미드의 제조
소르타아제 유전자는 N-말단이 절단된 스타필로코커스 아우레우스 소르타아제 A(60 ~ 206) 분자(SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열)를 암호화한다.
HEK293 세포 중 가용성 소르타아제의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 가용성 소르타아제 발현 카세트 이외에, 대장균 내 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는, 벡터 pUC18로부터의 복제 기원, 및 대장균 내 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자를 포함하였다.
가용성 소르타아제의 전사 단위는 하기 작용 요소를 포함하였다:
- 인트론 A를 포함하는, 인간 거대세포바이러스로부터의 프로모터(P-CMV) 및 즉시 초기 인핸서,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'-UTR),
- 쥐과 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 핵산을 암호화하는 정제 태그,
- N-말단이 절단된 에스.아우레우스 소르타아제 A 암호화 핵산, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).
성숙한 가용성 소르타아제의 아미노산 서열은 하기의 것이다:
Figure pct00002
정제 태그는 아미노산 서열 MRGSHHHHHHGS(SEQ ID NO: 18)를 가진다.
실시예 2
소르타아제 접합 루프를 포함하는 재조합 면역글로불린 중쇄의 일시적 발현 및 분석적 특성규명
F17 배지(Invitrogen Corp.) 중에 배양한 HEK293 세포(인간 배아 신장 세포주 293 유래)의 일시적 형질감염에 의하여 재조합체 생산을 수행하였다. 형질감염을 위해 "293-Fectin" 형질감염 시약(Invitrogen)을 사용하였다. 제조자의 지침에 지정된 바와 같이 형질감염을 수행하였다. 형질감염 후, 세포 배양액 상청액을 3일 내지 7일(3 ~ 7일) 수집하였다. 상청액을 낮은 온도(예컨대 -80℃)에 보관하였다.
예컨대 HEK293 세포 내 인간 면역글로불린 재조합체의 발현에 대한 일반적인 정보는 문헌(Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203)에 제시되어 있다.
소르타아제 접합 루프를 포함하는 M-IgG1 하위 부류의 재조합 면역글로불린 중쇄를 약염기성 조건(예컨대 pH8.0)에서 단백질 A 세파로스 크로마토그래피 고정상 재료(bed material)(예컨대 MabSelect Sure, GE Healtcare) 상에 포착시킴으로써 정제하였다. 시트르산 완충액(100 mM, pH 4.0)을 사용하여 고정상 재료로부터 IgG를 용리시키고, 마지막으로 적당한 크로마토그래피 조건(예컨대 100 mM 포스페이트 완충액, pH7.4) 하에 GPC 컬럼(예컨대 Superdex 200 Increase, GE Healthcare) 상 폴리싱(polishing) 단계에서 정제하였다.
아미노산 서열을 기초로 산정된 몰 소광 계수를 사용하여, 280 ㎚에서의 광학 밀도(OD)를 측정함으로써, 정제된 폴리펩티드의 단백질 농도를 측정하였다. 환원제(5 mM 1,4-디티오트레이톨)의 존재 및 부재 하에서 SDS-PAGE 뿐 아니라 GPC 크로마토그래피를 수행하고, 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색하여 순도를 분석하였다.
재조합 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 둘 다의 이론상 분자량 및 실험에 의해 측정된 분자량의 비교 측면에서, 소르타아제 접합 루프를 포함하는 발현된 재조합 면역글로불린 중쇄의 동일성을 ESI TOF MS에 의해 확인하였다.
실시예 3
재조합 면역글로불린을 위한 벡터의 합성 및 생산
문헌(Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)에 기술된 바와 같이, DNA를 조작하기 위해 표준 방법을 사용하였다. 제조자의 지침에 따라서 분자 생물학적 시약을 사용하였다.
자세히 말하면, 소르타아제 접합 루프를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 둘 다의 원하는 유전자 분절을 종래의 PCR 기반 클로닝 기술에 의해 생성시켰다. 따라서, 원하는 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 유전자의 cDNA를, 분자 클로닝용 제한 부위를 함유하는 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드/프라이머로 증폭시켰다. 유전자 특이적 프라이머와 함께 소르타아제 접합 루프 함유 프라이머를 사용하여, 소르타아제 접합 루프를 암호화하는 서열을 2 단계 PCR 전략에 도입하였다. Metabion GmbH(Planegg-Martinsried, Germany) 또는 ThermoFisher에 의해 각각의 올리고뉴클레오티드를 제조하였다.
대안적으로, 소르타아제 접합 루프를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 둘 다의 원하는 유전자 분절을 GeneArt® ThermoFisher에서 화학 합성을 통해 제조하였다.
합성된 유전자 단편을, 대장균 내 증식/증폭과, HEK293 세포 내에서의 일시적 발현을 위한 대장균 셔틀 벡터(shuttle vector)에 클로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열결정에 의해 확인하였다.
원하는 유전자/단백질(예컨대 소르타아제 접합 루프를 포함하는 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄)의 발현을 위해, 하기의 작용 요소를 포함하는 전사 단위를 사용하였다:
- 인간 거대세포바이러스로부터의 프로모터(P-CMV) 및 즉시 초기 인핸서,
- 인트론을 포함하는 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- (소르타아제 접합 루프, 전장 항체 경쇄를 포함하는) 발현될 유전자/단백질, ??
-소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).
발현될 원하는 유전자를 포함하는 발현 단위/카세트 이외에, 기본/표준 포유동물 발현 플라스미드는
- 대장균 내 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는, 벡터 pUC18로부터의 복제 기원과,
- 대장균 내 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자
를 함유하였다.
실시예 4
글루코스 탈수소효소 및 바이오틴화 올리고글리신의 소르타아제 매개 융합
하기 개략적으로 기술된 바와 같은 방법으로, 리포터 효소로서 글루코스 탈수소효소를 소르타아제 아미노산 모티브(LPETG 또는 LPETA)에 융합하고, 이를 제1 기질로 사용하여, 소르타아제 매개 효소 접합/커플링 반응의 활성을 광도계로 측정할 수 있었다. 제2 기질로서 바이오틴화 올리고글리신 또는 올리고알라닌(친핵체)을 사용하였다. 소르타아제를 제1 기질 및 제2 기질을 함유하는 용액에 첨가하였을 때, 제1 기질 및 제2 기질(바이오틴화된 리포터 효소임)의 소르타아제 매개 접합에 의해 접합체가 형성되었다. 바이오틴화된 리포터 효소를, 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드를 사용하여 회수할 수 있었다. 리포터 효소에 대한 기질을 첨가하였을 때, 광학 밀도의 변화에 의해 생성물을 검출할 수 있었다.
200 mM NaCl을 함유하는 50 mM Tris 완충액(pH 7.5) 중에서, 정제된 소르타아제를 그의 기질, 즉 LPETG 또는 LPETA 모티브를 함유하는 글루코스 탈수소효소(20 μM), 및 N-말단 글리신 또는 알라닌을 함유하는 바이오틴 유도체(330 μM)와 혼합하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 여기에 10배 내지 20배 과량의 억제 완충액(50 mM Tris, pH 7.5, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 5 mM 요오도아세트아미드)을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 중단된 반응 혼합물을 10분 동안 5000 × g에서 원심분리하였다. 200 mM NaCl, 10 mM CaCl2　및 스트렙타비딘 코팅 자성 비드를 포함하는 50 mM Tris 완충액(pH 7.5) 100 ㎕에 상청액(50 ㎕)을 첨가하고, 200 rpm 에서 30℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그후, 자석 및 진공 펌프를 사용하여 V형 바닥 다중 웰 플레이트에서 매 세정시 300 ㎕ 세정 완충액(50 mM Tris, pH 7.5, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 5 ㎎/㎖ BSA, 0.1 % Triton　X-100)으로 자성 비드를 5회 세정하였다. 그 다음, 비드를 100 ㎕ 시트레이트 시험 완충액 중에 재현탁하였고, 재현탁액 10 ㎕ 내지 80 ㎕를 새 웰에 옮겼다. 여기에 시험 완충액(0.2 M 시트르산나트륨, pH 5.8, 0.3 g/L 4-니트로소아닐린, 1 mM CaCl2, 30 mM 글루코스) 150 ㎕를 첨가하였다.
5분의 기간에 걸쳐 620 ㎚에서 리포터 효소의 반응속도를 측정하였다. 리포터 효소의 활성은 고정된 효소의 양에 비례하였으며(바이오틴화된 효소의 양에 비례), 소르타아제 활성에도 비례하였다.
실시예 5
소르타아제 접합 루프를 포함하는 재조합 면역글로불린의 소르타아제 매개 융합
하기에 개략적으로 기술된 바와 같은 방법으로, 소르타아제 접합 루프를 포함하는 IgG(기질 1)의 효소 절단과, 이에 후속하는 바이오틴 태그(기질 2)의 접합/커플링 반응을 진행하였다. 제1 기질 및 제2 기질을 함유하는 용액에 소르타아제를 첨가하였을 때, C-말단 바이오틴화된 F(ab')2 단편이 제1 기질 및 제2 기질의 소르타아제 매개 접합에 의하여 형성되었다(도 2 참조).
IgG 면역글로불린의 중쇄 내 소르타아제 접합 루프의 아미노산 서열을 표준 절차에 따라 설계하였다. 마우스 면역글로불린 G1 중쇄의 예시적 서열은 하기와 같았다:
(VH 도메인)-(CH1 도메인)-(소르타아제 접합 루프가 삽입된 경첩 영역 = VPRDCGCKPCICTGSGSGGVLPETGVGSGSGGAGSGSS)(SEQ ID NO: 19)-(CH2 도메인)-(CH3 도메인).
19번 서열(SEQ ID NO: 19)은 하기 부분을 포함하였다:
상부 경첩 영역 및 중간 경첩 영역 VPRDCGCKPCICT(SEQ ID NO: 20)와, 소르타아제 접합 루프 GSGSGGVLPETGVGSGSGGAGSGSS(SEQ ID NO: 21).
태그(바이오틴) 및 결찰 모티브(GGGG)를 포함하는 소르타아제 친핵체의 구조는 요구되는 바에 따라서 설계될 수 있다(이러한 구조의 일례를 도 3에 제시하였다).
150　mM KCl 및 5mM CaCl2를 함유하는 50 mM Tris 완충액(pH 8.0) 중에서, 정제된 소르타아제(20 μM)를, 그의 기질, 즉 소르타아제 접합 루프를 포함하는 재조합 면역글로불린(30 μM) 및 N-말단 GGGG 친핵체 모티브를 함유하는 바이오틴 유도체(1500 μM)와 혼합하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 17시간 동안(밤새도록) 인큐베이션하였다. 반응 혼합물에서 합하여 5 mM이 되는 양으로 0.5 M EDTA(pH7.5)을 첨가하여 반응을 중단시켰다.
GPC 크로마토그래피(GFC300 Tosoh; 100 mM 포스페이트 완충액, pH 7.0; 1 ㎖/분; 280 ㎚에서 검출)와 SDS PAGE에 의해 절단 반응의 과정을 모니터링하였다. 전 IgG의 잔여량은, 소르타아제를 반응 혼합물에 첨가하고 나서 각각 6시간 이내에는 5% 미만으로 감소하였고, 15시간 이내에는 3.6% 미만으로 감소하였다(도 4 참조).
절단되고 바이오틴-접합된 F(ab')2 단편을, 약 염기 조건(예컨대 pH 8.0)에서 단백질 A 세파로스 크로마토그래피 고정상 재료(예컨대 MabSelect Sure, GE Healtcare)를 사용하여 정제하였다. 잔여 IgG 뿐만 아니라, Fc 부분은 고정상 재료에 포착되었다. 바이오틴화된 F(ab')2의 통과액 분획을 한외 여과 막(15 MWCO, Amicon-Ultra)에 의해 농축하고 나서, 마지막으로 적당한 크로마토그래피 조건(예컨대 50 mM 포스페이트 완충액, 150 mM KCl, pH7.4) 하에 GPC 컬럼(예컨대 Superdex 200 Increase, GE Healtcare) 상 폴리싱 단계에서 정제하였다.
이론상 분자량 및 실험에 의해 측정된 분자량 비교의 측면에서, 바이오틴화된 F(ab')2에 대한 소르타아제 접합 루프를 포함하는 절단/접합 재조합 면역글로불린의 동일성을 ESI TOF MS에 의해 확인하였다. 바이오틴의 통합률(incorporation rate)은 정확히 2였다(각각의 중쇄는 절단되고 C-말단 바이오틴화된 형태로 존재함). NHS 접합 모노-바이오틴화 F(ab')2 단편의 수율이 약 10% 내지 15%인 것과 비교하여, 절단/접합/정제 절차의 수율은 약 33%(이론상 최대 수율은 약 60%)였다. 기능 시험은 실시예 7과 실시예 8에 각각 기술되어 있다.
실시예 6
소르타아제 접합 루프를 포함하는 재조합 토끼 면역글로불린의 소르타아제 매개 융합
실시예 5에 개략적으로 기술된 방법으로, 토끼/마우스 IgG 키메라, 소르타아제 접합 루프를 포함하는 클론 B(기질 1)의 효소 절단을 수행한 후, 바이오틴 태그(기질 2)와의 접합/커플링 반응을 시험하였다.
본질적으로 실시예 5에 기술된 바와 같이, IgG 면역글로불린의 중쇄 중 소르타아제 접합 루프의 아미노산 서열을 설계하였다.
150　mM KCl 및 5mM CaCl2를 함유하는 50 mM Tris 완충액(pH 8.0) 중에서, 정제된 소르타아제(40 μM)를, 그의 기질, 즉 소르타아제 접합 루프를 포함하는 재조합 면역글로불린(60 μM)과 N-말단 GGGG 친핵체 모티브를 함유하는 바이오틴 유도체(3000 μM)와 혼합하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 17시간 동안(밤새도록) 인큐베이션하였다. 반응 혼합물에서 합하여 5 mM이 되는 양으로 0.5 M EDTA(pH 7.5)를 첨가하여 반응을 중단시켰다.
GPC 크로마토그래피(GFC300 Tosoh; 100 mM 포스페이트 완충액, pH 7.0; 1 ㎖/분; 280 ㎚에서 검출)와 SDS PAGE에 의해 절단 반응의 과정을 모니터링하였다. 전장, 즉 비-소르타아제 절단 IgG의 잔여량은 15시간 이내에 10% 미만으로 감소하였다. 바이오틴 통합률 2로, F(ab')2 생성물을 완전히 바이오틴화하였(데이터는 제시하지 않음).
실시예 7
실시예 5에서 제조된 바와 같은 F(ab')2-유사 단편과 종래의 F(ab')2 단편을 이용하는 면역검정 데이터
제시된 소르타아제 매개 프로토콜(실시예 5 참조)에 따라서 제조된 바이오틴화 F(ab')2 접합체를, 동일한 모노클로날 항체의 NHS-접합 모노-바이오틴화 펩신 제조된 F(ab')2와 비교하였다.
첫 번째 경우, 바이오틴을 소르타아제 접합 루프로 이루어지는 중쇄의 C-말단에 부위 지정 부착하여, 접합 단편의 한정된 균일 군집을 제공하였다(실시예 5 참조).
두 번째 경우, 바이오틴을 표준 프로토콜에 따라서 F(ab')2 단편의 상이한 리신에 확률적으로 부착하였다. 모노-바이오틴화된 항체 접합체를 수득하기 위해, 황산암모늄 0.5 M ~ 1 M을 접합체 용액에 첨가하였다. 50 mM 인산칼륨(pH7.5), 150 mM KCl, 0.5 M ~ 1 M 황산암모늄으로 평형화된 스트렙타비딘 뮤테인 흡착제에 이 용액을 통과시켰다(DE 19637718 참조). 어떠한 바이오틴도 커플링/결합되지 않은 항체는 흡착제에 결합할 수 없었고, 씻겨 나갔다. 모노-바이오틴화된 항체 접합체를 50 mM 인산칼륨(pH7.5), 150 mM KCl 및 2% DMSO로 용리하였다. 그 다음, 항체당 하나를 초과하는 바이오틴을 가지는 항체 접합체를 50 mM 인산칼륨(pH7.5), 150 mM KCl 및 2 mM 바이오틴으로 용리하였다. 수득된 모노-바이오틴화 분획은 상이한 모노-바이오틴화 F(ab')2 단편의 불균일 군집을 포함하였다.
실험적 TSH 전기화학발광 검정을 사용하여 비교 평가를 수행하였다. cobas® e411 분석기(Roche) 상에서 샌드위치 검정 방식으로 측정을 수행하였다. cobas® e411 분석기 내 신호 검출은 전기화학발광을 기반으로 하였다. 이러한 샌드위치 검정에서, 바이오틴-접합체(즉 포착 항체)는 스트렙타비딘 코팅 자성 비드의 표면상에 고정되었다. 검출 항체는 신호전달 모이어티로서 착화된 루테늄 양이온을 보유하였다. 분석물의 존재 하에, 발색 루테늄 착물은 고체상에 가교되었고, cobas® e601 분석기의 측정 셀 내에 포함되어 있던 백금 전극에서 여기된 후, 620 ㎚에서 빛을 방출하였다. 신호 출력은 임의의 광 단위이다. 몇몇 공급처로부터 구입한 인간 혈청 시료와 TSH로 스파이킹(spiking)한 교정자로 측정을 수행하였다.
실험적 TSH 검정을 하기와 같이 수행하였다. 인간 혈청 시료(또는 스파이킹한 교정자) 50 ㎕, 2 ㎍/㎖의 포착 항체-바이오틴 접합체 35 ㎕, 및 1 ㎍/㎖의 검출 항체 루테늄 표지 접합체 50 ㎕를 9분 동안 함께 인큐베이션한 후, 여기에 스트렙타비딘 코팅 상자성 극미립자 40 ㎕를 첨가하였다. 혼합물을 9분 더 인큐베이션하였다. 그 다음, (이들 실험으로부터 발생한 전기화학발광 신호를 통하여) TSH를 검출하였다.
실험적 TSH Elecsys에서 수득한 결과 또는 교정자를 하기 표에 요약하였다. 결과는, F(ab')2 단편의 C-말단 부위 지정 바이오틴화가, 유리 리신을 통해 확률적으로 접합된 모노-바이오틴화 F(ab')2 단편의 경우에 비하여 유리함을 입증해준다. 검정 동태(assay dynamics)는, 교정자 6에 대해서는 92에서 145로, 그리고 교정자 2에 대해서는 6.8에서 10.2로 각각 증가하였다(도 5 참조). 공 시험 값은 영향을 받지 않은 채 유지되었다.
Figure pct00003
실시예 8
실시예 5에서 제조된 바와 같은 F(ab')2 단편과 종래의 IgG 접합체를 이용하였을 때의 면역검정 데이터
제시된 소르타아제 매개 프로토콜(실시예 5 참조)에 따라서 제조된 바이오틴화 F(ab')2 접합체를, 동일한 모노클로날 항체의 NHS-접합 모노-바이오틴화 IgG와 비교하였다.
첫 번째 경우, 바이오틴을 소르타아제 접합 루프로 이루어지는 중쇄의 C-말단에 부위 지정 부착하여, 접합 단편의 한정된 균일 군집을 제공하였다(실시예 5 참조).
두 번째 경우, 바이오틴을 표준 프로토콜에 따라서 IgG의 상이한 리신에 확률적으로 부착하였다. 모노-바이오틴화된 항체를 수득하기 위해, 실시예 6에 기술된 종래 접합체 제조를 위한 절차를 적용하였다.
실험적 pTau 전기화학발광 검정을 이용하여 비교 평가를 수행하였다. cobas® e411 분석기(Roche) 상에서 샌드위치 검정 방식으로 측정을 수행하였다. cobas® e411 분석기 내 신호 검출은 전기화학발광을 기반으로 하였다. 샌드위치 검정의 기술 실현은 실시예 6에 기술되어 있다.
실험적 포스포-Tau(181P) 검정을 하기와 같이 수행하였다. 인간 혈청 시료(또는 스파이킹한 교정자) 55 ㎕, 1 ㎍/㎖의 포착 항체-바이오틴 접합체 50 ㎕, 및 2 ㎍/㎖의 검출 항체 루테늄 표지 접합체 60 ㎕를 9분 동안 함께 인큐베이션한 후, 스트렙타비딘-코팅 상자성 극미립자 35 ㎕를 첨가하였다. 혼합물을 9분 더 인큐베이션하였다. 그 다음, (이들 실험으로부터 발생한 전기화학발광 신호를 통하여) 포스포-Tau를 검출하였다.
실험적 포스포-Tau Elecsys에서 수득한 교정자에 대한 결과를 하기 표에 요약하였다. 결과는, F(ab')2 단편의 C-말단 부위 지정 바이오틴화가, 유리 리신을 통해 확률적으로 접합된 모노-바이오틴화 IgG 의 경우에 비하여 유리함을 입증해준다. 검정 동태는, 교정자 7에 대해서는 57에서 86으로, 그리고 교정자 3에 대해서는 3.0에서 4.1로 각각 증가하였다(도 6 참조). 공 시험 값은 영향을 받지 않은 채 유지되었다.
Figure pct00004
SEQUENCE LISTING <110> Roche Diagnostics GmbH F. Hoffmann-La Roche AG <120> Recombinant immunoglobulin heavy chains comprising a sortase conjugation loop and conjugates thereof <130> P33076-WO <150> EP15186821.3 <151> 2015-09-25 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> any amino acid, selected independently from X at position 5 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> an amino acid selected from A and G, selected independently from X at position 3 <400> 1 Leu Pro Xaa Thr Xaa 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <220> <221> position <222> (3)..(3) <223> X in position three is either L or I <400> 2 Val Phe Xaa Phe Pro Pro 1 5 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <220> <221> position <222> (3)..(3) <223> X at position 3 can be any amino acid <400> 3 Leu Pro Xaa Thr 1 <210> 4 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 1 5 10 15 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 20 25 30 Phe Leu Phe 35 <210> 5 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro 1 5 10 15 Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 20 25 30 <210> 6 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 20 25 30 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro 1 5 10 15 Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe 20 25 30 <210> 8 <211> 36 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro 1 5 10 15 Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Val Phe Ile Phe 35 <210> 9 <211> 41 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Val Pro Ile Thr Gln Asn 1 5 10 15 Pro Cys Pro Pro Leu Lys Glu Cys Pro Pro Cys Ala Ala Pro Asp Leu 20 25 30 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe 35 40 <210> 10 <211> 42 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Thr Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile 1 5 10 15 Asn Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn 20 25 30 Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe 35 40 <210> 11 <211> 36 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Thr Glu Leu Ile Lys Arg Ile Glu Pro Arg Ile Pro Lys Pro Ser Thr 1 5 10 15 Pro Pro Gly Ser Ser Cys Pro Ala Gly Asn Ile Leu Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Val Phe Ile Phe 35 <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 12 Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr 1 5 10 15 Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe 20 25 30 <210> 13 <211> 34 <212> PRT <213> Ovis aries <400> 13 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Gly Cys Pro Asp Pro Cys Lys 1 5 10 15 His Cys Arg Cys Pro Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe 20 25 30 Ile Phe <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 1 5 <210> 15 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Pro Cys 20 25 30 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Pro Cys Glu 35 40 45 Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Pro Cys 50 55 60 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 1 5 10 <210> 17 <211> 147 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 17 Gln Ala Lys Pro Gln Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Val Ala Gly Tyr 1 5 10 15 Ile Glu Ile Pro Asp Ala Asp Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro 20 25 30 Ala Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Glu Asn 35 40 45 Glu Ser Leu Asp Asp Gln Asn Ile Ser Ile Ala Gly His Thr Phe Ile 50 55 60 Asp Arg Pro Asn Tyr Gln Phe Thr Asn Leu Lys Ala Ala Lys Lys Gly 65 70 75 80 Ser Met Val Tyr Phe Lys Val Gly Asn Glu Thr Arg Lys Tyr Lys Met 85 90 95 Thr Ser Ile Arg Asp Val Lys Pro Thr Asp Val Gly Val Leu Asp Glu 100 105 110 Gln Lys Gly Lys Asp Lys Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asp Tyr 115 120 125 Asn Glu Lys Thr Gly Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Val Ala Thr 130 135 140 Glu Val Lys 145 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 18 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser 1 5 10 <210> 19 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 19 Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Val Leu Pro Glu Thr Gly Val Gly Ser Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Ala Gly Ser Gly Ser Ser 35 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr 1 5 10 <210> 21 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 21 Gly Ser Gly Ser Gly Gly Val Leu Pro Glu Thr Gly Val Gly Ser Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Ala Gly Ser Gly Ser Ser 20 25

Claims (15)

  1. VH 도메인, CH1 도메인, 중간 경첩 영역의 가장 C-말단에 있는 시스테인에 이르기까지의 경첩 영역, 소르타아제(sortase) 접합 루프, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 재조합 면역글로불린 중쇄로서,
    여기서, 소르타아제 접합 루프는
    a) 중간 경첩 영역의 가장 C-말단에 있는 시스테인과, 면역글로불린 중쇄 CH2 도메인의 N-말단에서의 VFX1FPP(SEQ ID NO: 2로서, X1은 L 또는 I임) 공통 서열 사이에 위치하는 적어도 16개의 아미노산으로 이루어지고,
    b) 아미노산 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1)(여기서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)로 이루어지는 소르타아제 인지 모티브를 포함하고,
    c) b)의 서열에 대한 N-말단에 적어도 2개의 아미노산을 포함하고,
    d) b)의 서열에 대한 C-말단에 적어도 6개의 아미노산을 포함하고,
    e) b)의 서열에 대한 C-말단 및 N-말단 아미노산은 시스테인이 아닌,
    재조합 면역글로불린 중쇄.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 소르타아제 접합 루프는 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)에 대한 C-말단에 적어도 9개의 아미노산을 포함하는 재조합 면역글로불린 중쇄.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 소르타아제 접합 루프는 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)에 대한 N-말단에 적어도 5개의 아미노산을 포함하는 재조합 면역글로불린 중쇄.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 소르타아제 접합 루프는 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)에 대한 N-말단에 적어도 8개의 아미노산을 포함하는 재조합 면역글로불린 중쇄.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소르타아제 접합 루프는 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)에 대한 N-말단에 적어도 5개의 아미노산과, 상기 서열에 대한 C-말단에 적어도 9개의 아미노산을 포함하는 재조합 면역글로불린 중쇄.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소르타아제 접합 루프는 서열 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2는 G 또는 A임)에 대한 N-말단에 적어도 8개의 아미노산과, 상기 서열에 대한 C-말단에 적어도 9개의 아미노산을 포함하는 재조합 면역글로불린 중쇄.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소르타아제 접합 루프의 길이는 최대 아미노산 50개인 재조합 면역글로불린 중쇄.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 2개의 재조합 면역글로불린 중쇄를 포함하는 항체.
  9. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 2개의 재조합 면역글로불린 중쇄를 가지는 IgG 부류 항체.
  10. 재조합 면역글로불린 중쇄의 소르타아제 절단 단편과 소르타아제 친핵체의 접합체 제조 방법으로서,
    i) 제 7 항 또는 제 8 항에 따른 항체,
    ii) 소르타아제 친핵체를 포함하는 화합물,
    iii) 소르타아제 활성을 가지는 폴리펩티드
    를 인큐베이션하고, 이로써 재조합 항체 중쇄를 LPX1TX2(SEQ ID NO: 1로서, X1은 임의의 아미노산 잔기일 수 있으며, X2는 G 또는 A임) 내부의 트레오닌 뒤에서 절단하고, 소르타아제 친핵체의 N-말단을 상기 트레오닌에 접합하는 것을 포함하는 제조 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 소르타아제 친핵체는 화학식 (Gly)n-태그(여기서, n은 적어도 2임)를 가지는 관심 태그를 포함하는, 재조합 면역글로불린 중쇄의 소르타아제 절단 단편과 소르타아제 친핵체의 접합체 제조 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 소르타아제 친핵체는 화학식 (Gly)n-태그(여기서, n은 2, 3, 4, 5 또는 6으로부터 선택됨)를 가지는 관심 태그를 포함하는, 재조합 면역글로불린 중쇄의 소르타아제 절단 단편과 소르타아제 친핵체의 접합체 제조 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, 소르타아제 친핵체는 화학식 (Gly)n-태그(여기서, n은 최대 30임)를 가지는 관심 태그를 포함하는, 재조합 면역글로불린 중쇄의 소르타아제 절단 단편과 소르타아제 친핵체의 접합체 제조 방법.
  14. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법에 의해 제조된 접합체.
  15. VH 도메인, CH1 도메인, 중간 경첩 영역의 마지막 시스테인에 이르기까지의 경첩 영역, 중간 경첩 영역의 가장 C-말단에 있는 시스테인과 서열 LPXT(SEQ ID NO: 3으로서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 사이의 2개 이상의 아미노산, 및 적어도 2개의 글리신 잔기를 포함하는 재조합 면역글로불린 중쇄 단편을 포함하는 접합체.
KR1020187011806A 2015-09-25 2016-09-22 소르타아제 접합 루프를 포함하는 재조합 면역글로불린 중쇄 및 이의 접합체 KR20180053751A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15186821 2015-09-25
EP15186821.3 2015-09-25
PCT/EP2016/072529 WO2017050889A1 (en) 2015-09-25 2016-09-22 Recombinant immunoglobulin heavy chains comprising a sortase conjugation loop and conjugates thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20180053751A true KR20180053751A (ko) 2018-05-23

Family

ID=54207340

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187011806A KR20180053751A (ko) 2015-09-25 2016-09-22 소르타아제 접합 루프를 포함하는 재조합 면역글로불린 중쇄 및 이의 접합체

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11136376B2 (ko)
EP (1) EP3353201B1 (ko)
JP (1) JP6861702B2 (ko)
KR (1) KR20180053751A (ko)
CN (1) CN108271375A (ko)
BR (1) BR112018003594A2 (ko)
ES (1) ES2896475T3 (ko)
WO (1) WO2017050889A1 (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
BR112018003594A2 (pt) 2015-09-25 2018-09-25 Hoffmann La Roche cadeia pesada de imunoglobulina recombinante, anticorpos, método de produção de conjugado e conjugados
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
CN109311949B (zh) 2016-05-11 2022-09-16 思拓凡生物工艺研发有限公司 储存分离基质的方法
ES2909833T3 (es) 2016-05-11 2022-05-10 Cytiva Bioprocess R & D Ab Método de limpieza y/o desinfección de una matriz de separación
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
ES2874974T3 (es) 2016-05-11 2021-11-05 Cytiva Bioprocess R & D Ab Matriz de separación
WO2023108093A2 (en) * 2021-12-10 2023-06-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Affinity purification, proximity-based sortase ligation, and detection of proteins with precursor peptides and b1 proteins from lasso peptide biosynthesis systems

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US5342606A (en) 1984-10-18 1994-08-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Polyazamacrocyclic compounds for complexation of metal ions
US5316757A (en) 1984-10-18 1994-05-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Synthesis of polyazamacrocycles with more than one type of side-chain chelating groups
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
EP0861893A3 (en) 1991-09-19 1999-11-10 Genentech, Inc. High level expression of immunoglobulin polypeptides
US5739294A (en) 1991-12-10 1998-04-14 The Dow Chemical Company Bicyclopol yazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as contrast agents
US5480990A (en) 1991-12-10 1996-01-02 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclocarboxylic acid complexes for use as contrast agents
US5428139A (en) 1991-12-10 1995-06-27 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as radiopharmaceuticals
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
DK0669836T3 (da) 1992-11-13 1996-10-14 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimære og radioaktivt mærkede antistoffer og humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantigen til behandling af B-cellelymfom
US5385893A (en) 1993-05-06 1995-01-31 The Dow Chemical Company Tricyclopolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
US5462725A (en) 1993-05-06 1995-10-31 The Dow Chemical Company 2-pyridylmethylenepolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5834456A (en) 1996-02-23 1998-11-10 The Dow Chemical Company Polyazamacrocyclofluoromonoalkylphosphonic acids, and their complexes, for use as contrast agents
DE19637718A1 (de) 1996-04-01 1997-10-02 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinante inaktive Core-Streptavidin Mutanten
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
AU782626B2 (en) 1999-10-04 2005-08-18 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
US20110111856A1 (en) 2008-06-04 2011-05-12 Andrew William White Slot machine group tournament management and scoring system
WO2010087994A2 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
WO2012028697A1 (en) 2010-09-01 2012-03-08 Eth Zürich, Institute Of Molecular Biology And Biophysics Affinity purification system based on donor strand complementation
BR112013019503B1 (pt) 2011-02-09 2021-05-25 F. Hoffmann-La Roche Ag composto quimioluminescente à base de irídio, conjugado, usos de um composto e método para medir um analito
CA2840409A1 (en) 2011-06-28 2013-01-03 Whitehead Institute For Biomedical Research Using sortases to install click chemistry handles for protein ligation
WO2013155526A2 (en) 2012-04-13 2013-10-17 Whitehead Institute For Biomedical Research Sortase- modified vhh domains and uses thereof
JP6203838B2 (ja) * 2012-06-27 2017-09-27 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 少なくとも２つの異なる結合実体を含む、テーラーメイドの高度に選択的かつ多重特異的なターゲティング実体を選択および作製するための方法、ならびにその使用
WO2014001325A1 (en) * 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
JP6405311B2 (ja) * 2012-09-14 2018-10-17 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 少なくとも２つの異なる実体を含む分子を作製および選択するための方法ならびにその使用
EP3197456B2 (en) 2015-05-14 2023-10-11 NuCana plc Cancer treatments
BR112018003594A2 (pt) 2015-09-25 2018-09-25 Hoffmann La Roche cadeia pesada de imunoglobulina recombinante, anticorpos, método de produção de conjugado e conjugados

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017050889A1 (en) 2017-03-30
US20210009660A1 (en) 2021-01-14
JP6861702B2 (ja) 2021-04-21
BR112018003594A2 (pt) 2018-09-25
JP2018531235A (ja) 2018-10-25
US11136376B2 (en) 2021-10-05
EP3353201A1 (en) 2018-08-01
CN108271375A (zh) 2018-07-10
ES2896475T3 (es) 2022-02-24
EP3353201B1 (en) 2021-09-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11136376B2 (en) Recombinant immunoglobulin heavy chains comprising a sortase conjugation loop and conjugates thereof
JP2018531235A6 (ja) ソルターゼ・コンジュゲート化ループを含む組換え免疫グロブリン重鎖およびそのコンジュゲート
US11572552B2 (en) Sortase
US10190182B2 (en) Methods for enzyme mediated polypeptide conjugation
US11174502B2 (en) Transamidation reaction in deep eutectic solvents
US11162088B2 (en) Production of thioesters using sortase
US11162127B2 (en) Enzymatic one-pot reaction for double polypeptide conjugation in a single step
US11306302B2 (en) Soluble Sortase A
TW202323286A (zh) 抗EphA4抗體

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal