KR20180032274A - Method of quantitative analysys of biopharmaceuticals contaning glycan using mass spectroscopy - Google Patents

Abstract

The present invention relates to a quantitative analysis method in a biological sample of a protein drug, and a composition thereof, and more particularly, to a mass analysis method for quantifying by using tandem mass analysis for glycan-containing fragment peptide, and a composition thereof.

Description

질량분석을 이용한 바이오 의약품 글라이칸 정량 분석법{METHOD OF QUANTITATIVE ANALYSYS OF BIOPHARMACEUTICALS CONTANING GLYCAN USING MASS SPECTROSCOPY}METHOD OF QUANTITATIVE ANALYSIS OF BIOPHARMACEUTICALS CONTANNING GLYCAN USING MASS SPECTROSCOPY BACKGROUND OF THE INVENTION [0001]

본 발명은 단백질 의약품의 분석법에 관한 것으로서, 직접 질량분석을 이용하여 글라이칸을 동정, 정량하는 질량분석 방법 및 그 조성물에 관한 것이다.
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for analyzing a protein drug, and more particularly, to a mass spectrometry method and composition for identifying and quantifying glycans using direct mass spectrometry.

최근 신약 개발과 바이오시밀러의 개발 증가로 혈장과 같은 생체 시료내 존재하는 단백질의약품에 대한 정량분석 요구가 점차 증가하고 있다. 특히, 단백질의약품은 chemical과는 다른 고분자로서 생산공정상의 어려움이 있을 뿐만 아니라 단백질의약품의 특성분석 및 정량분석에 많은 기술적인 한계를 가지고 있다. 최근 질량분석법의 개발로 펩티드맵핑, Glycan 동정 및 상대정량, 이황화결합자리 결정과같은 단백질의약품의 특성분석법이 개발되고 있으며 바이오시밀러 개발을 위해서는 필수적인 분석들이라고 할 수 있다. 단백질의약품의 생체내 대사나 시간에 따른 혈액내 잔존량등에 대한 관심이 높은데 이를 위해 사용하는 방법은 ELISA법이 주된 방법이다. 항체를 기반으로 하는 ELISA는 단백질의약품에 대한 적절한 항체가 개발되어 있으면 활용이 용이하나 그렇지 못한 경우는 항체개발을 위한 소요시간과 분석법 개발자체에 대한 시간 등의 이유로 다른 방법 등이 요구되는 실정이다. 또한, 글라이칸을 포함하는 단백질의약품과 단일클론 항체단백질 의약품의 경우는 상대적으로 ELISA를 이용한 정량방법에 제한적이다. 특히, 혈액 내에서 다른 효소나 기타Recently, the development of new drugs and the development of biosimilar have led to an increasing demand for quantitative analysis of protein drugs present in biological samples such as plasma. In particular, protein drugs are different from chemicals and have difficulties in production process and have many technical limitations in the characterization and quantitative analysis of protein drugs. Recent developments in mass spectrometry have developed methods for characterizing protein drugs such as peptide mapping, Glycan identification and relative quantification, and disulfide bond site determination, and are essential for the development of biosimilars. In vivo metabolism of protein drugs and the amount of residual blood in the blood are of great interest. The ELISA method is the main method used for this. Antibody-based ELISA is easy to use if appropriate antibodies are developed for protein drugs, but other methods are required because of the time required for antibody development and the time for developing the assay. In addition, in the case of glycans-containing protein drugs and monoclonal antibody protein drugs, it is relatively limited to quantitative methods using ELISA. In particular, other enzymes or other substances in the blood

요소 등에 의해 변형되는 단백질의약품에 대한 모니터링의 방법으로는 적합하지 않다. 하지만, 최근 멀티플렉싱이 가능한 질량분석법의 활용으로 혈액과 같은 생체시료내의 원래 형태의 단백질의약품은 물론 기타 변형된 단백질의약품의 정량분석이 가능한 잠재력이 있다. 또한, 혈액내의 다양한 항체에 대하여 선택적으로 다수의 단백질의약품을 동시에 정량분석을 수행할 수 있다는 것도 장점이다.
It is not suitable as a method of monitoring for protein drugs that are modified by the factors. However, recent multiplexing mass spectrometry has the potential to quantitatively analyze the original form of protein drug in biological samples such as blood as well as other modified protein drugs. It is also advantageous that quantitative analysis of a plurality of protein drugs simultaneously with various antibodies in the blood can be performed simultaneously.

공개특허 특2003-0031911Patent Publication No. 2003-0031911

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 고안된 것으로서 본 발명의 목적은 효과적인 시료 전처리 및 새로운 바이오의약품의 글라이칸 분석 방법을 제공하는 것이다.The present invention has been devised in view of the above-mentioned needs, and it is an object of the present invention to provide an effective sample pretreatment and a method of analyzing glycan of a new biopharmaceutical product.

본 발명의 다른 목적은 바이오의약품으로부터 유래된 단편 즉, 효소절단 글라이칸 동정용 조성물을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a fraction derived from a biopharmaceutical, that is, a composition for identifying enzyme-cleaving glycans.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a) 혈장 시료로부터 단백질을 분리하는 단계; b)상기 단백질을 단백질 분해 효소를 처리하여 펩티드로 만드는 단계;c) 필요한 경우에 상기 펩티드와 동일 서열이며, 안정 동위원소(stable isotope)를 포함하는 스탠다드 펩티드를 첨가하는 단계;및 d) 상기 단백질 또는 펩티드 시료를 액체크로마토그래피법을 이용하여 분리하되, 질량 분석법을 이용하는 단계를 포함하는 생체 시료내 단백질 정량분석 방법을 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for detecting a protein, comprising: a) separating a protein from a plasma sample; b) treating the protein with a protease to form a peptide, c) adding a standard peptide, if necessary, having the same sequence as the peptide and containing a stable isotope, and d) Or a peptide sample is separated by a liquid chromatography method, and mass spectrometry is used.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 질량 분석법은 목표 단백질 및 펩티드의 특정 m/z 구간에 대하여 LC-MS/MS 수행 동안 지속적으로 텐덤스펙트럼을 얻고 특정 절편 이온(fragment ion)의 강도(intensity)를 고려하여 정량하고, 이때 얻어지는 풀 레인지(full range) 질량 스펙트럼 내의 타겟 단백질 및 펩티드 유래 특이적 절편의 최적 조합을 찾아내어 정량에 활용하고, 민감도의 증가를 위해 타겟 이온의 분리 폭(isolation width를 넓히거나 직접 시간(accumulation time)을 조절하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, the mass spectrometry continuously obtains a tandem spectrum during the LC-MS / MS run for a specific m / z section of the target protein and peptide and determines the intensity of a particular fragment ion, And the optimal combination of the target protein and the peptide-derived specific fragments in the full-range mass spectrum obtained at this time is found and utilized for quantitation, and the isolation width of the target ion It is desirable, but not limited, to widen or adjust the accumulation time.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 타깃 분자가 없는 배경(background) 혈장 시료로부터 얻어지는 타겟 단백질 및 펩티드 텐덤스펙트럼들 에 비교하여 타겟 단백질 및 펩티드 포함 혈장시료에서만 관측되는 절편 이온들을 대상으로 정량하는 것을 특징으로 하고, 이들 대상은 타겟 단백질 및 펩티드의 특정 b-이온 또는 y-이온이거나 이들의 조합이거나 다른 인터널 절편(internalfragment)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In another embodiment of the present invention, the method comprises quantitatively measuring interceptions observed only in plasma samples containing target proteins and peptides, as compared to the target protein and peptide tandem spectra obtained from background plasma samples without target molecules , And these objects are preferably, but not limited to, specific b-ions or y-ions of the target protein and peptide, or a combination thereof or other internal fragment.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 시스테인(Cysteine)-특이적 혹은 라이신-특이적 반응성 화학물질을 이용하여 단백질을 표지한 후 얻어지는 특이적 절편을 정량에 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In another embodiment of the present invention, it is preferable that a specific fragment obtained after labeling a protein using a cysteine-specific or lysine-specific reactive chemical is used for quantitation, Or more.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 질량 분석방법에 농도를 알고 있는 펩티드를 첨가하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In another embodiment of the present invention, it is preferable, but not limited, to add the known peptide to the mass spectrometry.

또 본 발명은 생체 시료내에서 분리된 타겟 단백질의 펩티드와 동일 서열이 며, 안정 동위원소(stable isotope)를 포함하고, 해당 펩티드는 분석하려는 타겟 단백질 특이적이거나 혹은 다른 단백질과 공통의 펩티드이며, 질량이 서로 다른 안정 동위원소를 포함하는 것을 특징으로 하는 질량분석법을 이용한 생체시료 내의 단백질 정량분석용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a method for detecting a target protein in a biological sample, the method comprising the steps of: (a) isolating the target protein from the biological sample; (b) The present invention provides a composition for quantitative analysis of proteins in a biological sample using mass spectrometry, wherein the mass spectrometric method comprises stable isotopes having different masses.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 펩티드는 바이오 의약품의 글라이칸을 포함하는 잔기 부위에서 유래한 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다. 통상 항체 중사슬 (heavy chain)의 불변영역 (constant region)에 존재하는 N299를 포함하는 펩티드로서 트립신 효소에 의해 절단되어 글라이칸과 함께 관측가능한 EEQYNSTYR 혹은 TKPREEQYNSTYR 펩티드를 포함한다.
In an embodiment of the present invention, the peptide is preferably derived from a residue site including glycans of a biologic drug, but is not limited thereto. A peptide comprising N299 that is usually present in the constant region of the heavy chain of the antibody, includes an EEQYNSTYR or TKPREEQYNSTYR peptide that is cleaved by trypsin enzyme and can be observed with glycans.

이하 본 발명을 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described.

본 발명은 혈액과 같은 생체시료에서 효과적으로 단백질의약품을 분리 정제하고 질량분석을 이용하여 단백질 의약품의 글라이코 펩티드를 손쉽게 정량분석을 수행할 수 있는 방법을 포함한다.The present invention includes a method for efficiently separating and purifying a protein drug in a biological sample such as blood and quantitatively analyzing a glycopeptide of a protein drug using mass spectrometry.

한 구체예에서, 질량 분석기는 본 발명의 기질과 함께 사용되다. 본 발명에 따른 기질의 한 지형에 위치한 시료는 질량분석기의 입력 시스템에 도입한다. 이후, 시료는 이온화 소스로 이온화시킨다. 전형적인 이온화 소스에는 레이저, 고속원자 충격 또는 플라즈마가 포함된다. 생성된 이온은 이온 광학적 어셈블리로 수집하고, 이후 질량 분광기로 지나가는 이온을 분석한다. 질량 분광기를 빠져 나온 이온은 검출기로 검출한다. 그 다음, 검출기는 검출된 이온의 정보를 질량-대-전하비율로 해독한다. 검출물의 검출에는 일반적으로 신호 강도의 검출이 포함되는데, 이는 기질에 결합된 검출물의 함량을 반영한다. 질량 분석기와 관련된 추가적인 정보는 Principles of Instrument Analysis, 3 rd ed., Skoog, Saunders College Publishing, Philadelphia, 1985 및 Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4 thed. Vol. 15(John Wiley & Sons, New York 1995), pp. 1071-1094를 참조한다.In one embodiment, a mass spectrometer is used with the substrate of the present invention. A sample located on a terrain of the substrate according to the invention is introduced into the input system of the mass spectrometer. Thereafter, the sample is ionized with an ionization source. Typical ionization sources include lasers, fast atom bombardment, or plasma. The resulting ions are collected by an ion optical assembly and then analyzed for ions passing through a mass spectrometer. Ions exiting the mass spectrometer are detected by a detector. The detector then decodes the information of the detected ions in a mass-to-charge ratio. Detection of the detectable substance generally involves detection of the signal intensity, which reflects the content of the detectable substance bound to the substrate. Further information related to mass spectrometry can be found in Principles of Instrument Analysis, 3 rd ed., Skoog, Saunders College Publishing, Philadelphia, 1985 and Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4th ed. Vol. 15 (John Wiley & Sons, New York 1995), pp. 1071-1094.

텐덤 질량 분석법(예, MS/MS. MS/MS/MS, ESI-MS/MS 등)은 단백질과 펩티드와 같은 생물분자에 대한 서열 정보를 얻는데 활용할 수 있다. 텐덤 질량 분석법은 어미 이온을 발생시키는 질량 분석법을 의미하는데, 여기서 상기 어미 이온은 딸 이온으로 단편화되고, 이는 이후 질량 분석된다. 일반적으로, 메스필터(Mass Filter)를 이용하여, 단편화되는 특정 질량-대-전하 비율을 갖는 어미 이온을 선별한다.Tandem mass spectrometry (eg, MS / MS, MS / MS / MS, and ESI-MS / MS) can be used to obtain sequence information for biological molecules such as proteins and peptides. Tandem mass spectrometry refers to mass spectrometry that generates a parent ion, wherein the parent ion is fragmented into daughter ions, which are then mass analyzed. Generally, a mass filter is used to select mother ions having a specific mass-to-charge ratio that are fragmented.

특정 구체예에서, 단편화(fragmentation)는 충돌-유도된 해리(CID)이다. CID는 제 1 질량 분석기와 제 2 질량 분석기사이에 위치하는 충돌 쳄버에서 실시할 수 있다. 충돌 쳄버는 완충 가스, 특히 헬륨과 같은 불활성 가스로 채워진다. 대안으로, 어미 이온은 표면 유도된 해리, 광해리(예, 레이저로), 전자 유도된 해리(예,전자빔으로)로 단편화시킬 수 있다.In certain embodiments, the fragmentation is a collision-induced dissociation (CID). The CID can be performed in a collision chamber located between the first mass analyzer and the second mass analyzer. The impingement chamber is filled with a buffer gas, particularly an inert gas such as helium. Alternatively, parent ions can be fragmented into surface-induced dissociation, optical dissociation (eg, with a laser), and electron-induced dissociation (eg, with an electron beam).

비행 시간 분광기를 이용하는 질량 분석기에서, 포스트-소스 붕괴(PSD)와 인-소스 붕괴(ISD)를 활용하여 단편화를 유발한다(Li et al.(2000) supra). PSD에는 타임드-이온-셀렉터(timed-ion-selector)를 이용하여 펩티드 이온 조성물로부터 전구물질 이온을 " 여과" 하는 단계가 포함된다. 선택된 질량 이온은 레플렉트론(reflectron)에서 분리되는 단편 이온으로 자발적으로 붕괴된다. ISD는 PSD와 상이한 조건을 이용하는데, 여기에는 이온 공급원에서 급속한 준안정(metastable) 붕괴가 포함된다.In mass spectrometers using time-of-flight spectroscopy, post-source decay (PSD) and in-source decay (ISD) are used to trigger fragmentation (Li et al. PSDs include the step of "filtering" precursor ions from a peptide ion composition using a timed-ion-selector. The selected mass ion spontaneously collapses into a fragment ion that separates from the reflectron. ISD uses a different condition than PSD, which includes rapid metastable collapse at the ion source.

적절한 구체예에서, 텐덤 질량 분석법은 사중극자 시간비행 질량 분석기 QqTOF MS(Krutchinsky et al., WO 99/38 185)에 추가로 연결되는 레이저 탈착/이온화 질량 분석기를 포함하는 모든 텐덤 질량분석법을 포함한다. MALDI-QqTOF MS(Krutchinsky et al., WO 99/38185; Shevchenko et al. (2000) Anal. Chem. 72:2132-2141), ESI-QqTOF MS(Figeys et al. (1998) Rapid Comm'ns. Mass Spec. 12: 1435-144), 칩 모세관 전기이동(칩-CE)-QqTOF MS(Li et al.(2000) Anal.Chem. 72: 599-609)를 참고하였다.In a preferred embodiment, the tandem mass spectrometry comprises all tandem mass spectrometry including a laser desorption / ionization mass spectrometer further coupled to a quadrupole time-of-flight mass spectrometer QqTOF MS (Krutchinsky et al., WO 99/38 185) . MALDI-QqTOF MS (Krutchinsky et al., WO 99/38185; Shevchenko et al. (2000) Anal. Chem. 72: 2132-2141), ESI-QqTOF MS (Fig. Mass Spec. 12: 1435-144) and chip capillary electrophoresis (Chip-CE) -QqTOF MS (Li et al. (2000) Anal. Chem. 72: 599-609).

본 발명의 질량 분석법으로 수득된 질량 스펙트럼 데이터는 함수와 같은 분석 알고리즘을 적용하여 산물의 함량 및 고유성에 관한 정보를 얻는데 활용될 수 있다. 폴리펩티드의 탈착 및 검출로 만들어진 데이터는 임의의 적절한 수단(예, 시각, 컴퓨터 등)으로 분석할 수 있다. 한 구체예에서, 데이터는 프로그램가능한 디지털 컴퓨터를 이용하여 분석한다. 컴퓨터 프로그램은 코드를 저장하는 판독가능 매체를 포함한다. 특정 코드는 기질에서 각 특징의 위치, 각 특징에서 흡수제의 고유성, 흡수제를 세척하는데 사용되는 용리 조건을 포함하는 메모리로 충실하게 전달될 수 있다. 이후, 프로그램은 이런 정보를 활용하여, 특징적인 선택성(예, 사용한 흡수제와 용리액의 유형)을 정의하는 기질상의 일단의 특징을 확인할 수 있다. 컴퓨터는 또한 기질에서 어드레스가능한 특정 위치로부터 접수된 다양한 분자 질량에서 신호의 강도에 대한 데이터를 입력으로 받아들이는 코드를 보유한다. 이런 데이터는 피크 값의 신호 강도 및 검출된 각 산물에서 측정된 분자 질량을 비롯하여 산물의 총수를 시사한다.The mass spectral data obtained by the mass spectrometry of the present invention can be utilized to obtain information on the content and uniqueness of the product by applying an analysis algorithm such as a function. Data generated by polypeptide desorption and detection can be analyzed by any suitable means (e.g., time, computer, etc.). In one embodiment, the data is analyzed using a programmable digital computer. A computer program includes a readable medium storing code. Certain codes can be faithfully delivered to the memory including the location of each feature in the substrate, the identity of the absorbent in each feature, and the elution conditions used to clean the absorbent. The program can then use this information to identify a set of characteristics on the substrate that define the characteristic selectivity (eg, the type of absorbent and eluent used). The computer also has a code that accepts as input data about the strength of the signal at various molecular masses received from a particular addressable location in the substrate. This data suggests the total number of products, including the signal intensity of the peak value and the molecular mass measured at each detected product.

데이터 분석에는 검출된 피크 값(예, 특정 질량-대-전하 값 또는 값의 범위)의 신호 강도(예, 피크의 높이)를 측정하고 "극단치" (사전측정된 통계적 분포를 벗어나는 데이터)를 제거하는 단계가 포함될 수 있다. 관찰된 피크는 정규화시킬수 있는데, 여기서 일부 기준군에 상대적인 각 피크의 높이가 계산된다. 가령, 기준군은 스케일에서 0으로 설정되는 장치와 화학약품(예, 에너지 흡수 분자)에 의해 발생하는 기준 소음일 수 있다. 이후, 각 폴리펩티드 또는 다른 물질에서 검출된 신호 강도는 소요의 스케일(예, 100)로 상대적 강도 형태로 제시할 수 있다. 대안으로, 시료에 표준을 도입하고, 이런 표준으로부터 피크는 검출된 산물에서 관찰되는 신호의 상대적 강도를 측정하는 기준군으로 활용할 수 있다. Biomarker Wizard 프로그램(Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, CA)과 같은 소프트웨어 프로그램은 질량 스펙트럼의 분석을 보조하는데 사용할 수 있다.
Data analysis involves measuring the signal strength (eg, the height of the peak) of the detected peak value (eg, a specific mass-to-charge value or range of values) and measuring the "extreme value" (data outside the pre-measured statistical distribution) And a step of removing the data. The observed peaks can be normalized, where the height of each peak relative to some reference group is calculated. For example, the reference group may be a reference noise generated by a device and a chemical (e.g., energy absorbing molecules) set to zero on the scale. Subsequently, the signal intensity detected in each polypeptide or other material can be presented in relative intensity form with a desired scale (e.g., 100). Alternatively, standards may be introduced into the sample, and peaks from these standards may be used as a reference for measuring the relative intensities of the signals observed in the detected products. Software programs such as the Biomarker Wizard program (Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Calif.) Can be used to assist in the analysis of mass spectra.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 혈액내의 다양한 항체에 대하여 선택적으로 다수의 단백질의약품을 동시에 정량분석을 수행할 수 있다는 것도 장점이다. 본 발명은 혈액과 같은 생체시료에서 효과적으로 단백질의약품을 분리정제하고 질량분석을 이용하여 단백질의약품을 손쉽게 정량분석을 수행할 수 있다.
As can be seen from the present invention, the present invention is also advantageous in that quantitative analysis of a plurality of protein drugs can be selectively performed simultaneously on various antibodies in blood. The present invention can effectively separate and purify a protein drug from a biological sample such as blood and quantitatively analyze a protein drug using mass spectrometry.

도 1은 아바스틴(Avastin)을 트립신 처리하여 얻은 시료를 질량분석을 수행하여 데이터를 얻고, 글라이칸을 포함한 펩티드에 대하여 추출 이온 크로마토그램(Extracted Ion chromatogram)이다.
도 2는 해당되는 글라이코 펩티드의 딸이온의 각각 질량값을 이용하여 XIC로 추출한 예 (MS2 수준에서 추출)이다.FIG. 1 shows a sample obtained by trypsin treatment of avastin, which is subjected to mass spectrometry to obtain data and an extracted ion chromatogram for a peptide containing glycans.
2 is an example (extracted at the MS2 level) extracted with XIC using the respective mass values of daughter ions of the corresponding glycopeptide.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
The present invention will now be described in more detail by way of non-limiting examples. The following examples are intended to illustrate the invention and the scope of the invention is not to be construed as being limited by the following examples.

혈액 시료로부터 항체의약품을 분리하고 질량분석을 이용한 정량하는 방법은 실시예는 다음과 같다.
A method for separating an antibody drug from a blood sample and quantifying using the mass spectrometry is as follows.

A. 혈액시료의 항체분리정제 용액의 조성은 하기 표 1과 같다.
A. Detection of antibody from blood sample The composition of the purified solution is shown in Table 1 below.

정제 용액 조성Tablet solution composition Ammonium Biocarbonate buffer (이하 Ambic)Ammonium Biocarbonate buffer (Ambic) 100mM (pH8.0)100 mM (pH 8.0) Acetic acidAcetic acid 50mM (pH3.0)50 mM (pH 3.0)

B. 시료 준비 B. Sample Preparation

1. 혈장 시료 50uL를 정제용액과 1:1 (v/v)로 섞은 후 18,000 X g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 시료에 남아있는 세포와 잔해물(debris)들을 제거한다.1. Mix 50 μL of plasma sample with purified solution at 1: 1 (v / v) and centrifuge at 18,000 x g for 20 min at 4 ° C to remove remaining cells and debris from the sample.

2. 원심분리된 잔해물들이 섞이지 않도록 주의하면서 Protein G fragment로 이루어진 컬럼을 이용하여 항체단백질을 포집하고 정제용액으로 3회 wash한 후, D.W을 가하여 1회 wash하자마자 50mM acetic acid (pH3)를 이용하여 항체의약품을 용출하는 방식으로 부분 정제한다.2. Capture the antibody protein using a column made of Protein G fragments, wash it three times with purified solution, add DW, and wash once with 50 mM acetic acid (pH 3), while taking care not to mix the centrifuged debris. Partially purified by dissolving the antibody drug.

3. 용액을 speed-vac을 이용하여 모두 dry한후 5mM TCEP/5mM Iodoacetamide/50mM Ambic buffer(pH8.0)를 50uL가하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨다.3. Wash the solution using speed-vac, add 50 uL of 5 mM TCEP / 5 mM Iodoacetamide / 50 mM Ambic buffer (pH 8.0) and incubate at 37 ° C for 30 minutes.

4. Cold acetone 300uL를 가하여 4℃에서 10분동안 반응시켜 침전시키고 상등액은 버린다. 이후 8M Urea solution을 15uL가하여 변성시킨 후 500uL의 Ambic buffer와 프로테아제 (예, trypsin)를 첨가하여 3시간 동안 반응 후 필요한 경우 heavy 합성 펩티드의 적절한 양을 첨가하여 섞은 후 SEP-PAK(C18)을 이용하여 함께 desalting하고 dry하여 보관한다. 질량분석 직전에 0.1% formic acid 50uL로 resuspension하여 분석 시료를 준비한다. 항체단백질을 직접 질량분석을 수행하는 경우 시료준비 2번을 수행한 후에 용액을 speed-vac을 이용하여 모두 dry한후 질량 분석 직전에 1% formic acid 50uL로 resuspension한다.
4. Add 300 μL of cold acetone and incubate at 4 ° C for 10 minutes to precipitate. Discard the supernatant. After the addition of 15 μL of 8 M Urea solution, 500 uL of Ambic buffer and protease (eg, trypsin) were added. After 3 hours of reaction, appropriate amounts of heavy synthetic peptides were added and mixed. SEP-PAK (C18) Keep together by desalting and dry. Prepare analytical samples by resuspension in 50 uL of 0.1% formic acid immediately prior to mass spectrometry. When performing direct mass spectrometry of the antibody protein, sample preparation 2 is performed, then the solution is dried using speed-vac, and resuspension is performed with 50 uL of 1% formic acid immediately before the mass analysis.

C. 액체크로마토그래피C. Liquid Chromatography

1. 앞서 준비된 단백질/펩티드 시료를 Waters UPLC 및 Triple-Tof 5600 mass spectrometry를 이용하여 분석할 수 있다.1. The previously prepared protein / peptide samples can be analyzed using Waters UPLC and Triple-Tof 5600 mass spectrometry.

2. 액체크로마토그래피 실시의 예는 표 2와 표 3과 같다.
2. Examples of liquid chromatography are shown in Tables 2 and 3.

1. HPLC 운용조건
1. HPLC operating conditions
System System Waters iClass UPLCWaters iClass UPLC ColumnColumn Column tempColumn temp Room temperatureRoom temperature Flow rateFlow rate 0.4 mL/min0.4 mL / min Injection volumnInjection volumn 2uL2uL Mobile phaseMobile phase A) 0.1% formic acid in HPLC grade water
B) 0.1% formic acid in acetonitrileA) 0.1% formic acid in HPLC grade water
B) 0.1% formic acid in acetonitrile Running conditionRunning condition TimeTime %A% A %B% B 00 9898 22 22 9898 22 66 8585 1515 4242 6060 4040 4444 2020 8080 5454 2020 8080 5656 9898 22 6060 9898 22

2. Triple-TOF MS/MS 운용조건 (AB Sciex, Triple-TOF 5600)
2. Triple-TOF MS / MS operating conditions (AB Sciex, Triple-TOF 5600)
Mass rangeMass range 100-2000 Da100-2000 Da Ion polarityIon polarity PositivePositive Time binTime bin 44 Mass toleranceMass tolerance 50mDa50mDa Accumulation timeAccumulation time 0.25 sec0.25 sec Charge stateCharge state 2~52 to 5 Declustering potentialDeclustering potential 6060 TemperatureTemperature 200℃200 ℃ Data analysis softwareData analysis software Peakview (ABSciex), Protein pilot (ABSciex)Peakview (ABSciex), Protein pilot (ABSciex)

D. 항체의약품 특이적 펩티드 선정 및 펩티드 합성
D. Antibody Drug-Specific Peptide Selection and Peptide Synthesis

1. 본 발명은 예로서 Avastin의 항 VEGF 항체단백질의 경우 trypsin으로 펩티드 단편을 생성할 수 있는데 이때 Herceptin과 같은 다른 항체의약품과 선택적으로 혹은 공통적으로 항체량을 대변하는 항체 단편 (펩티드조각)을 선정을 포함하고 있다. 선택적인 서열을 포함하는 펩티드를 정량목표로 삼거나 (예, Variable region 의 특이적인 tryptic fragment로 Avastin 혹은 Herceptin과 같은 다른 항체의약품 들과 구별할 수 있는 서열 포함 펩티드) 공통적으로 확인할 수 있는 효소부산물 펩티드를 선정할 수 있다. 또한, 이들과 동일한 서열이며 stable isotope를 포함한 heavy standard peptide를 합성하고 이를 절대 정량분석에 활용하는 것도 가능하다.1. In the case of Avastin's anti-VEGF antibody protein, the present invention can generate a peptide fragment with trypsin. In this case, an antibody fragment (peptide fragment) that selectively or commonly shares the antibody amount with other antibody drugs such as Herceptin is selected . A quantitative target of a peptide containing an optional sequence (eg, a sequence-containing peptide that can be distinguished from other antibody drugs, such as Avastin or Herceptin, as a specific tryptic fragment of the variable region) or a commonly identifiable enzyme by-product peptide Can be selected. It is also possible to synthesize heavy standard peptides containing the stable isotope sequence, and to use them for absolute quantitative analysis.

Avastin의 경우 295번정도부터 303번정도까지 글라이칸을 포함하는 트립신 절단 펩티드 영역으로 이 부분 펩티드가 우선적으로 글라이칸 동정 및 정량이 가능한 영역이다. 이 영역 주변 혹은 서열의 차이를 보이는 구간에 해당하는 효소 단편을 활용하여 정량분석을 실시할 수 있다.
In the case of Avastin, it is a trypsin cleavage peptide region containing glycans from about 295 to about 303, and this partial peptide is preferentially glycan-identified and quantifiable. Quantitative analysis can be carried out using the enzyme fragments corresponding to the region or region showing the difference in sequence.

E. 새로운 질량분석법
E. New Mass Spectrometry

1. 앞서 준비된 단백질/펩티드 용액 시료를 상기 액체크로마토그래피법을 이용하여 분리하되 다음의 새로운 질량분석법을 이용하여 항체의약품을 정량분석을 수행하는 방법을 제공한다.1. A method for quantitatively analyzing an antibody drug using the new mass spectrometry method by separating the previously prepared protein / peptide solution sample using the liquid chromatography method.

2. 목표 단백질 및 펩티드의 특정 m/z 구간 (예: 0.7~20Da)에 대하여 LCMS/MS수행동안 지속적으로 텐덤스펙트럼을 얻고 특정 fragment ion의 intensity만을 고려하여 정량하는 방법을 제공한다. 이때 얻어지는 full range mass spectrum 내의 타겟 단백질/펩티드 유래 특이적 fragment의 최적 조합을 찾아내어 정량에 활용할 수 있으며, 민감도의 증가를 위해 타겟 ion의 isolation width를 넓힐 수 있고, accumulation time을 조절할 수도 있는 방법을 제공한다.2. Provides a method for continuously obtaining the tandem spectrum during LCMS / MS performance for a specific m / z interval (eg, 0.7 to 20 Da) of the target protein and peptide, and quantitatively considering only the intensity of a specific fragment ion. In this case, the optimal combination of specific fragments derived from the target protein / peptide in the full range mass spectrum can be found and used for quantification, a method of widening the isolation width of the target ion for increasing the sensitivity and controlling the accumulation time to provide.

3. 타겟 molecule이 없는 background 혈장시료로부터 얻어지는 타겟 단백질/펩티드 텐덤스펙트럼들에 대하여 타겟 단백질/펩티드 포함 혈장시료에서만 관측되는 fragment ion들을 대상으로 정량하는 방법을 제공한다. 이들은 타겟 단백질/펩티드의 특정 b-ion 혹은/그리고 y-ion의 조합일 수 있다 (혹은 다른 internal fragment일수도 있다).3. Provides a method for quantifying target fragment / peptide tandem spectra obtained from a background plasma sample without a target molecule against fragment ions observed only in a plasma sample containing a target protein / peptide. These may be combinations of specific b-ions or / and y-ions of the target protein / peptide (or other internal fragments).

4. Cysteine-specific 혹은 lysine-specific 반응성 chemical (예, iTRAQ)을 이용하여 항체단백질을 labeling한 후 얻어지는 특이적 fragment를 정량에 사용하는 방법을 제공한다 (예, iTRAQ의 reporter ion, 특정 chemical의 immonium ion).4. Provide a method for quantitation of specific fragments obtained after labeling antibody proteins using cysteine-specific or lysine-specific reactive chemicals (eg, iTRAQ) (eg, reporter ions of iTRAQ, immonium ion).

5. 텐덤스펙트럼을 대상으로 Extracted Ion chromatogram (XIC)법을 이용한 펩티드의 동정 및 시료 확인: 질량분석을 통해 얻어진 텐덤스펙트럼 데이터를 대상으로 앞서 얻은 스펙트럼 라이브러리와 비교하여 동일한 peak들의 신호세기들을 추출하고 얻어진 신호세기를 모두 합한 값을 정량에 사용한다. 이때, retention time을 확인한다.
5. Identification and Identification of Peptides Using the Extracted Ion Chromatogram (XIC) Method for Tandem Spectrum: The tandem spectral data obtained through mass spectrometry were compared with the previously obtained spectral library, and signal intensities of the same peaks were extracted and obtained The sum of the signal strengths is used for quantification. At this time, confirm the retention time.

Claims (6)

글라이칸을 함유하는 펩티드를 포함하는 바이오 의약품을 질량 분석법을 이용하여 생체 시료내 정량분석 방법으로서,
목표 펩티드의 특정 m/z 구간에 대하여 LC-MS/MS 수행 동안 지속적으로 텐덤스펙트럼을 얻어 특정 절편 이온(fragment ion)의 강도(intensity)를 고려하여 정량하는 단계;
상기 정량 단계에서 얻어지는 풀 레인지(full range) 질량 스펙트럼 내의 타겟 펩티드 유래 특이적 절편의 최적 조합을 찾아내는 단계; 및
선택적으로, 민감도의 증가를 위해 타겟 이온의 분리폭(isolation width)을 넓히거나 직접 시간(accumulation time)을 조절하는 단계를 포함하는 방법.
As a method for quantitative analysis in a biological sample using mass spectrometry, a biopharmaceutical containing a glycane-
Continuously obtaining a tandem spectrum during the LC-MS / MS performance for a specific m / z section of the target peptide, quantitatively taking into account the intensity of a specific fragment ion;
Finding an optimal combination of specific fragments from the target peptide in the full range mass spectrum obtained in said quantifying step; And
Optionally, widening the isolation width of the target ions or adjusting the accumulation time for increased sensitivity.
제1항에 있어서,
타깃 분자가 없는 배경(background) 혈장 시료로부터 얻어지는 타겟 펩티드의 텐덤스펙트럼과 비교하여, 타겟 펩티드 포함 혈장시료에서만 관측되는 절편 이온을 대상으로 정량하는 단계를 더 포함하고,
이때 타겟 펩티드의 특정 b-이온 또는 y-이온이나 이들의 조합, 또는 다른 인터널 절편(internal fragment)을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 1,
Further comprising quantifying the intercept ion observed only in the target peptide-containing plasma sample, as compared to the tandem spectrum of the target peptide obtained from the background plasma sample without the target molecule,
Wherein a target b-ion or a y-ion of the target peptide, or a combination thereof, or another internal fragment is targeted.
제1항에 있어서,
상기 방법은 시스테인(Cysteine)-특이적 혹은 라이신-특이적 반응성 화학물질을 이용하여 단백질을 표지한 후 얻어지는 특이적 절편을 정량에 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 1,
Characterized in that a specific fragment obtained after labeling the protein with a cysteine-specific or lysine-specific reactive chemical is used for quantification.
제 1항에 있어서, 상기 방법은 질량 분석방법에 농도를 알고 있는 펩티드를 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. The method of claim 1, wherein the method comprises adding a known concentration of a peptide to a mass spectrometry method.
생체 시료내에서 분리된 타겟 펩티드와 동일 서열이며, 안정 동위원소(stable isotope)를 포함하는 조성물로서,
상기 펩티드는 분석하려는 타겟 단백질 특이적이거나 혹은 다른 단백질과 공통의 펩티드이며, 질량이 서로 다른 안정 동위원소를 포함하는 질량분석법을 이용한 생체시료 내의 단백질 정량분석용 조성물.
A composition comprising the same sequence as a target peptide isolated in a biological sample and containing a stable isotope,
The composition for quantitative analysis of a protein in a biological sample using mass spectrometry wherein the peptide is a peptide common to the target protein to be analyzed or a different protein and contains stable isotopes having different masses.
제 5항에 있어서,
상기 타겟 단백질은 항체 의약품이고, 상기 항체의 중사슬 N299번 잔기에서 유래한 펩티드를 대상으로 하는 질량분석법을 이용하는 것을 특징으로 하는 생체시료 내의 단백질 정량분석용 조성물.
6. The method of claim 5,
Wherein the target protein is an antibody drug, and a mass spectrometry method is used for a peptide derived from the amino acid residue N299 of the antibody.

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