KR20180029139A

KR20180029139A - Methods for preparing high-concentrated cadaverine

Info

Publication number: KR20180029139A
Application number: KR1020160116342A
Authority: KR
Inventors: 박경문; 양영헌; 신지현; 이은지; 김현중
Original assignee: 홍익대학교세종캠퍼스산학협력단; 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2016-09-09
Filing date: 2016-09-09
Publication date: 2018-03-20

Abstract

The present invention relates to a method of producing high-concentration cadaverine from a L-lysine or L-lysine monohydrochloride substrate by using a microorganism strain carrying a lysine decarboxylase (LDC), ldcC, as a whole cell biocatalyst. The method of producing highly concentrated cadaverine according to the present invention involves treating a microorganism strain recombinated with ldcC, which is an LDC active in a broader pH range compared to an E.coli-derived LDC, cadA, with low-concentration isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside having a final concentration of 0.001 to 0.1 mM, when producing cadaverine from a L-lysine or L-lysine monohydrochloride substrate; and using the microorganism strain as a whole cell biocatalyst in a reusable manner, thereby reducing the cost of biocatalyst production from the production processes. Further, the method of the present invention can reduce the amount of expensive coenzymes, such as pyridoxal 5-phosphate (PLP), to be used, and does not require a separate LDC purification process, and thus can reduce the time and financial burden required for the purification to dramatically improve the production cost of cadaverine.

Description

고농도 카다베린의 제조방법{Methods for preparing high-concentrated cadaverine}Methods for preparing high-concentrated cadaverine [0002]

본 발명은 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)인 ldcC를 보유하고 있는 미생물 균주를 전세포(whole cell) 생촉매(biocatalyst)로 사용하여 리신(L-lysine) 또는 리신 염산염(L-lysine monohydrochloride) 기질로부터 고농도의 카다베린(cadaverine)을 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a lysine decarboxylase (LDC), which comprises using a microbial strain having ldcC as a whole cell biocatalyst to produce L-lysine or L-lysine monohydrochloride < / RTI > substrate. < RTI ID = 0.0 > [0002] < / RTI >

1,5-디아미노펜탄(1,5-diaminopentane)으로 알려진 카다베린(cadaverine)은 많은 산업적 응용에 있어서 중요한 기반 화학물질이다. 카다베린은 폴리아마이드나 폴리우레탄과 같은 고분자의 구성요소, 킬레이팅제 또는 다른 첨가제로 사용될 수 있다. 특히 카다베린은 탄소수가 5개인 다이아민으로서, 숙신산(succinic acid), 세바식산(sebacic acid)과 중합하여 폴리아미드-5,4(polyamide 5,4)나 폴리아미드-5,10(polyamide 5,10) 등 다양한 나일론의 단량체로 사용될 수 있어 산업계의 많은 관심을 끌어 왔다. 연간 350만 톤의 세계 시장을 가진 폴리아마이드-5,4는 전통적 석유기반의 폴리아마이드에서 바이오 기반 대체제로부터 생산될 것으로 기대된다(Biosci. Biotechnol . Biochem ., 71:2130-2135, 2007; Met. Eng ., 12:341-351, 2010). 이러한 카다베린 생산공정에는 재생산 가능한 바이오매스 기반 탄소공급원이 요구된다.Cadaverine, known as 1,5-diaminopentane, is an important base chemical in many industrial applications. Cadaverine can be used as a component of polymers, chelating agents or other additives, such as polyamides or polyurethanes. In particular, cadaverine is a 5-carbon diamine which is polymerized with succinic acid and sebacic acid to form polyamide-5,4, polyamide 5,10, 10), which have attracted a great deal of attention from the industry. -5,4 polyamide with a global market of 350 million tons a year is expected to be produced from bio-based substitutes for traditional petroleum-based polyamides in (Biosci Biotechnol Biochem, 71:. .. 2130-2135, 2007; Met. Eng . , 12: 341-351, 2010). Such cadaverine production processes require renewable biomass-based carbon sources.

카다베린은 몇몇 미생물로부터 발견되는 폴리아민이다(Microbiol Rev., 49:81-99, 1985). 그람음성 박테리아인 대장균에서 카다베린은 리신(L-lysine)으로부터 리신 탈탄산효소(L-lysine decarboxylase, LDC)를 이용하여 탈카르복실화 반응(decarboxylation)에 의하여 직접 생합성된다(도 1). 이와 같이 카다베린은 LDC에 의한 리신의 탈카르복실화 반응에 의하여 생성될 수 있기 때문에 이미 산업적으로 대량생산되고 있는 리신을 활용할 수 있는 새로운 화학제품으로 각광받고 있다.Cadabelin is a polyamine found in several microorganisms ( Microbiol Rev. , 49: 81-99, 1985). In the Gram-negative bacterium Escherichia coli, cadaverine is biosynthesized directly from L-lysine by decarboxylation using L-lysine decarboxylase (LDC) (Fig. 1). Since cadabelin can be produced by the decarboxylation reaction of lysine by LDC, it is now regarded as a new chemical product that can utilize lysine which is already mass-produced industrially.

현재까지 대장균 유래의 LDC인 CadA와 LdcC를 이용한 다양한 연구가 보고되어 있는데, 미생물 기반의 카다베린의 생산은 대부분 대장균의 CadA와 LdcC를 이용하여 진행되어 왔다(Appl . Microbiol . Biotechnol ., 91:1287-1296, 2011). 이 중 CadA는 LdcC보다 먼저 발견이 되어 사용되었으나, 활성과 pH의 스펙트럼 등의 약점 등을 보유하고 있다(Appl . Microbiol . Biotechnol ., 91:1287-1296, 2011; J. Bacteriol., 178:5522-5528, 1996). 반면 LdcC는 보다 넓은 pH에서 활성을 갖는다는 장점을 갖고 있지만 프로모터(promoter)가 약해 자연적인 발현이 제한된다는 단점을 갖는다(Genes Genet. Syst., 72:167-172, 1997).Various studies have been reported using CadA and LdcC, which are LDC derived from Escherichia coli. Most of the microbial-based production of cadaverine has been carried out using CadA and LdcC of E. coli ( Appl . Microbiol . Biotechnol . , 91: 1287 -1296, 2011). Among these, CadA was found to be found before LdcC, but it has weaknesses such as activity and pH spectrum ( Appl . Microbiol . Biotechnol . , 91: 1287-1296, 2011; J. Bacteriol. , 178: 5522 -5528, 1996). LdcC, on the other hand, has the advantage of being active at a wider pH, but has the disadvantage that its promoter is weak and its natural expression is restricted ( Genes Genet. Syst. , 72: 167-172, 1997).

대장균 내의 카다베린 농도는 카다베린의 생합성과 분해, 흡수와 방출로써 조절된다(Mol Microbiol ., 51:1401-1412, 2004). 이러한 조절을 이유로 야생형 대장균 내에서 카다베린은 검출되지 않고, 단지 폴리아민의 생합성에 결함이 있는 돌연변이 균주 내에서 카다베린이 존재하는 것으로 보고되었다(J. Biol . Chem ., 254: 12419-12426, 1979). 비록 매우 적은 양의 카다베린이 미생물 내에 존재하는 것이 확인되었지만 미생물의 카다베린에 대한 내성은 더욱 높다. 예를 들어, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 비록 카다베린을 생합성 하지는 않지만 약 0.3M의 카다베린이 있는 환경에서 성장할 수 있다(Biosci . Biotechnol. Biochem ., 71:2130-2135, 2007). 이러한 미생물의 카다베린에 대한 높은 내성은 대사공학적으로 산업적으로 이용 가능한 수준까지 카다베린을 과생산할 수 있는 가능성을 보여준다.The concentration of cadaverine in E. coli is regulated by biosynthesis and degradation, absorption and release of cadaverine ( Mol Microbiol . , 51: 1401-1412, 2004). Cadaverine was not detected in wild-type E. coli due to this modulation, and it was reported that cadaverine exists in a mutant strain that is defective in polyamine biosynthesis ( J. Biol . Chem . , 254: 12419-12426, 1979 ). Although a very small amount of cadaverine was found to be present in the microorganism, the resistance of the microorganism to cadaverine is higher. For example, the wild-type Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum ) can grow in an environment with about 0.3M of cadaverine, although it does not biodegrade cadaverine ( Biosci . Biotechnol. Biochem . , 71: 2130-2135, 2007). The high resistance of these microorganisms to cadaverine demonstrates the potential to produce cadaverine with up to an industrially available level of metabolism.

값싼 산업 폐기물 또는 단백질과 주요 구성요소를 포함한 원료를 사용한 발효를 통해 카다베린을 생산하는 방법에 관한 유럽 특허 No. 0726240 A1가 공개되었다. 그러나 공개된 원료가 매우 복잡하기 때문에 카다베린을 획득하기 위하여 여러 단계의 정제과정을 거쳐야 하는 문제가 있다. 또 재조합 미생물을 이용한 카다베린을 생화학적으로 생산하는 공정에 관한 특허 WO 2007/113127 A1가 공개되었다. 이 특허에 따르면, 리신에서 카다베린으로 전환을 증가시키기 위해서 이러한 전환에 관여하는 유전자 ldcC로 코딩된 리신 탈탄산효소를 과발현시킴으로써 리신 탈탄산 효소의 활성을 증가시켰다. 그러나 이러한 경우 증가된 리신 탈탄산효소의 결과로써 카다베린 양이 증가되었지만 동시에 카다베린의 분해가 유도된다는 문제점이 있었다.European Patent No. 5,202,305, which is directed to a method for producing cadaverine through fermentation using raw materials including cheap industrial wastes or proteins and major constituents. 0726240 A1 was released. However, since the raw materials are very complex, there is a problem in that several steps of purification are required to obtain the cadaverine. Patent WO 2007/113127 A1 discloses a process for biochemically producing cadaverine using a recombinant microorganism. According to this patent, the activity of lysine decarboxylase was increased by overexpressing the lysine decarboxylase encoded by the gene ldcC involved in this conversion in order to increase the conversion from lysine to cadaverine. However, in this case, as a result of the increased lysine decarboxylase, there was a problem that the amount of cadaverine was increased but the decomposition of cadaverine was induced at the same time.

미생물 균주를 이용한 카다베린 생산의 경우 유기산 등의 부산물이 다량 발생하여 폴리머를 합성하는 공정에서 고분자 합성, 분자량 조절, 합성된 고분자의 품질 저하 등의 다양한 문제가 발생하게 된다. 효과적으로 전환하여 순도가 높은 카다베린을 생산하기 위해 안정성이 향상되고 재사용이 가능한 생촉매(biocatalyst)의 개발이 필요하다. In the case of production of cadaverine using a microorganism strain, various problems such as polymer synthesis, molecular weight control, and degradation of synthesized polymer occur in the process of polymer synthesis due to generation of a large amount of byproducts such as organic acid. There is a need to develop a biocatalyst that is more stable and reusable to produce cadaverine with high conversion efficiency.

경제성 있는 C5용 바이오 화학소재생산을 위해서는 대사산물인 리신을 단량체인 카다베린으로 고수율로 전환할 수 있어야 하며, 대사산물에 대한 추가적 분리과정을 생략할 수 있도록 개선된 카다베린 생산 공정의 개발이 필요하다. 기존의 카다베린 생산 공정은, 최근에 반응 속도를 향상시키기 위해 미생물을 파쇄한 뒤 그 파쇄액을 사용하거나 파쇄액에서 LDC를 분리 정제하여 카다베린 생산 반응을 수행하는 방법이 공개되었다. 또한 분리 정제된 LDC를 고정화하여 카다베린을 생산하는 방법 역시 공개된 바 있으나 이들 모두 촉매를 준비하는데 소요되는 비용이 매우 고가이어서 이러한 방법을 통해 제조된 카다베린을 이용하여 폴리아미드-5,4(polyamide 5,4)나 폴리아미드-5,10(polyamide 5,10) 등과 같은 C5용 화학소재를 제조할 경우 석유로부터 생산되는 제품과의 가격경쟁력 측면에서 불리한 점으로 작용하기 때문에 C5용 화학소재를 생산하기 위한 산업적 용도로는 적합하지 않다는 단점이 있다.To produce cost-effective biochemical materials for C5, it is necessary to convert lysine, which is metabolite, into high yield by using monomer, cadaverine, and to develop improved cadaverine production process so as to omit additional separation process for metabolites need. In the existing process of producing the cataractine, recently, a method of disrupting the microorganism and then using the disrupted liquid or separating and purifying the LDC from the disruption liquid to perform the reaction of producing the catargine has been disclosed. In addition, a method of producing cadaverine by immobilizing the separated purified LDC has also been disclosed, but the cost of preparation of the catalyst is very high. Therefore, the cadaverine prepared by this method is used to produce polyamide-5,4 ( When manufacturing chemical materials for C5 such as polyamide 5,4) and polyamide 5,10 (polyamide 5,10), it is disadvantageous in terms of price competitiveness with products produced from petroleum. Therefore, But it is not suitable for industrial use for production.

따라서, 카다베린을 산업적 스케일로 경제적으로(cost-effective) 생산하는 신규한 공정에 대한 당업계의 요구가 대두되고 있다.There is therefore a growing need in the art for a novel process for the cost-effective production of cadaverine on an industrial scale.

이에, 본 발명자들은 기존의 카다베린의 생산 방법이 카다베린의 함유량이 낮고, 생산비용이 고가라는 문제점에 착안하여, 카다베린의 함유량이 높고, 생산비용이 저렴한 카다베린 제조방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)인 ldcC를 생산하는 미생물 균주에 최종농도 0.001 내지 0.1 mM 범위의 저농도의 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside; IPTG)를 처리하여 활성형의 가용성(soluble) ldcC 단백질 발현량이 증대됨을 확인하고, 이를 전세포(whole cell) 생촉매(biocatalyst)로 이용할 경우, 원 포트 반응(one-pot reaction)을 통해 낮은 생산비용에 효과적으로 높은 함유량의 카다베린을 제조할 수 있다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The inventors of the present invention have found that the conventional method of producing cadaverine has a low content of cadaverine and a high production cost, and therefore, it is desired to develop a method for producing cadaverine which has a high content of cadaverine and a low production cost I tried. As a result, the present inventors have found that a microbial strain producing ldcC, which is a lysine decarboxylase (LDC), has a low concentration of isopropyl-1-thio-β-D-galactopyrano (LdcC) protein is increased by treatment with isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), and when it is used as a whole cell biocatalyst, The present inventors have completed the present invention by discovering that a high content of cadaverine can be efficiently produced at a low production cost through a one-pot reaction.

유럽 공개특허 0726240 A1European Published Patent 0726240 A1 국제 공개특허 WO 2007/113127 A1WO 2007/113127 A1

Biosci. Biotechnol. Biochem., 71:2130-2135, 2007Biosci. Biotechnol. Biochem., 71: 2130-2135, 2007 Met. Eng., 12:341-351, 2010Met. Eng., 12: 341-351, 2010 Microbiol Rev., 49:81-99, 1985Microbiol Rev., 49: 81-99, 1985 Appl. Microbiol. Biotechnol., 91:1287-1296, 2011Appl. Microbiol. Biotechnol., 91: 1287-1296, 2011 Appl. Microbiol. Biotechnol., 91:1287-1296, 2011Appl. Microbiol. Biotechnol., 91: 1287-1296, 2011 J. Bacteriol., 178:5522-5528, 1996J. Bacteriol., 178: 5522-5528, 1996 Genes Genet. Syst., 72:167-172, 1997Genes Genet. Syst., 72: 167-172, 1997 Mol Microbiol., 51:1401-1412, 2004Mol Microbiol., 51: 1401-1412, 2004 J. Biol. Chem., 254: 12419-12426, 1979J. Biol. Chem., 254: 12419-12426, 1979 Biosci. Biotechnol. Biochem., 71:2130-2135, 2007Biosci. Biotechnol. Biochem., 71: 2130-2135, 2007

본 발명의 목적은 고농도 카다베린(cadaverine)의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for producing a high concentration cadaverine.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 카다베린(cadaverine)의 제조방법을 제공한다:According to one aspect of the present invention, there is provided a process for preparing a cadaverine comprising the steps of:

(a) 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)인 ldcC를 보유하고 있는 미생물 균주를 최종농도 0.001 내지 0.1 mM의 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside; IPTG)로 처리하여 전세포(whole cell) 생촉매(biocatalyst)를 제조하는 단계; 및(a) A microbial strain having ldcC, which is a lysine decarboxylase (LDC), is added to a final concentration of isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) to produce a whole cell biocatalyst; And

(b) 상기 단계 (a)의 전세포 생촉매에 리신(L-lysine) 또는 리신 염산염(L-lysine monohydrochloride) 기질을 접촉시켜 탈카르복실화 반응(decarboxylation)을 진행하여 카다베린을 제조하는 단계.(b) contacting the whole cell biocatalyst of step (a) with L-lysine or L-lysine monohydrochloride substrate to effect decarboxylation to produce cadaverine .

본 발명의 카다베린 제조방법을 상술하면 다음과 같다:The method for producing the cadaverine of the present invention is as follows:

단계 (a): Step (a): 전세포Whole cell (whole cell) (whole cell) 생촉매(biocatalyst)의Biocatalyst 제조 Produce

본 발명에 따르면, 먼저 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)인 ldcC를 보유하고 있는 미생물 균주의 활성형의 가용성(soluble) ldcC 단백질의 발현량을 증가시켜 전세포 생촉매를 제조하기 위하여, 상기 미생물 균주에 최종농도 0.001 내지 0.1 mM의 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside; IPTG)로 처리하여 배양한다.According to the present invention, in order to increase the expression level of an active type soluble ldcC protein of a microorganism strain having ldcC, which is a lysine decarboxylase (LDC), to produce a whole cell biocatalyst, The microorganism strain is treated with isopropyl-beta-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) at a final concentration of 0.001-0.1 mM.

본 발명에서 이용되는 미생물은 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)인 ldcC를 보유하고 있는 미생물로서, 바람직하게는 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 바실러스 속(Bacillus sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 미생물이고, 보다 바람직하게는 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 또는 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.)이며, 가장 바람직하게는 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 미생물을 이용할 수 있다. The microorganism used in the present invention is a microorganism having ldcC, which is lysine decarboxylase (LDC), preferably Escherichia sp., Corynebacterium sp. Bacillus sp., Pichia sp., Pseudomonas sp., And Saccharomyces sp. Microorganisms, and more preferably Escherichia sp. ) Or Corynebacterium sp., And most preferably Escherichia sp. Microorganisms can be used.

상기 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 미생물에는 에스케리치어콜라이(E. coli), 에스케리치어알베르티(E. albertii), 에스케리치어 블라태(E. blattae), 에스케리치어페르구소니(E. fergusonii), 에스케리치어 헤르마니(E. hermannii) 또는 에스케리치어벌너리스(E. vulneris)를 사용할 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 에스케리치어콜라이(E. coli), 에스케리치어블라태(E. blattae) 또는 에스케리치어 페르구소니(E. fergusonii)를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 에스케리치어콜라이(E. coli)를 사용할 수 있다. 상기 에스케리치어콜라이(E. coli)는 일반적인 에스케리치어 콜라이(E. coli)를 이용할 수도 있으나, 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)인 ldcC가 대량 생산되도록 유전자 조작이 이루어진 에스케리치어콜라이(E. coli)를 이용하는 것이 바람직하다.Wherein S is in the microorganism Escherichia (Escherichia sp.) Escherichia coli fry (E. coli), Escherichia fry Alberti (E. albertii), Escherichia fry Blossom state (E. blattae), Escherichia fry FER obtain Sony ( E. fergusonii , E. hermannii or E. vulneris may be used, and more preferably E. coli , Escherichia coli , state can be used for (E. blattae) or Escherichia fry FER obtain Sony (E. fergusonii), can be used and most preferably Escherichia coli fry (E. coli). The Escherichia coli fry (E. coli) is a general Escherichia coli Escherichia pom pom the genetic modification made to the ldcC the mass production (E. coli), but to be used, the lysine decarboxylase lyase (lysine decarboxylase, LDC) E. coli is preferably used.

이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyr anoside; IPTG)는 분자 생물학 시약으로, 이 화합물은 알로락토스(allolactose)와 분자적으로 유사하며, 젖당 대사물(lactose metabolite)로서 락 오페론(lac operon)의 전사를 개시한다. 이러한 이유로, 유전자가 락 오페론 통제하에 있을 때 단백질 발현을 유도하는데 쓰인다. Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyr anoside (IPTG) is a molecular biology reagent, which is molecularly similar to allolactose , And initiates transcription of the lac operon as a lactose metabolite. For this reason, it is used to induce protein expression when genes are under the control of lactoperon.

본 발명에서 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)인 ldcC를 보유하고 있는 미생물의 활성형의 가용성(soluble) ldcC 단백질의 발현량을 증가시키기 위한 IPTG의 최종농도는 이에 제한되지는 않으나, 0.001 내지 0.1 mM 일 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.002 내지 0.05 mM 일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 0.003 내지 0.007 mM 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.005 mM 일 수 있다.In the present invention, the final concentration of IPTG for increasing the amount of soluble ldcC protein in the active form of a lysine decarboxylase (LDC) -containing microorganism is not limited to 0.001 To 0.1 mM, more preferably 0.002 to 0.05 mM, still more preferably 0.003 to 0.007 mM, and most preferably 0.005 mM.

본 발명의 용어 "전세포(whole cell)"는 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)인 ldcC를 보유하고 있는 미생물 균주의 활성형의 가용성(soluble) ldcC 단백질의 발현량을 증가시키기 위하여, 상기 미생물을 최종농도 0.001 내지 0.1 mM의 IPTG와 배양한 세포를 의미한다. The term "whole cell" of the present invention is used to increase the expression level of an active type soluble ldcC protein of a microorganism strain having ldcC, which is a lysine decarboxylase (LDC) Means a cell in which the microorganism has been cultured with IPTG at a final concentration of 0.001 to 0.1 mM.

본 발명의 용어 "생촉매(biocatalyst)"는 반응을 촉진하는 기능을 가진 생체 또는 생체 유래의 물질을 의미한다.The term "biocatalyst " of the present invention means a substance derived from a living body or a living body having a function of promoting the reaction.

한편, 하기 단계 (b)에서 기질로서 리신(L-lysine) 또는 리신 염산염(L-lysine monohydrochloride)을 이용하여 탈카르복실화 반응(decarboxylation)을 진행하는 동안, 반응 온도는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 37 내지 65℃일 수 있으며, 보다 바람직하게는 40 내지 60℃일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 45 내지 55℃일 수 있으며, 가장 바람직하게는 52℃일 수 있다.Meanwhile, during decarboxylation using L-lysine or L-lysine monohydrochloride as a substrate in the following step (b), the reaction temperature is not limited thereto, Preferably from 37 to 65 ° C, more preferably from 40 to 60 ° C, even more preferably from 45 to 55 ° C, and most preferably 52 ° C.

또한, 탈카르복실화 반응(decarboxylation) 진행 동안, 본 발명에 이용되는 완충용액의 pH는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 pH 5 내지 10일 수 있으며, 보다 바람직하게는 pH 5.5 내지 8.5일 수 있으며, 가장 바람직하게는 pH 6일 수 있다. 완충용액의 제조는 인산을 사용하나 이에 제한되는 것은 아니다. Also, during the decarboxylation process, the pH of the buffer solution used in the present invention is not limited thereto, but may preferably be a pH of 5 to 10, more preferably a pH of 5.5 to 8.5 , And most preferably at pH 6. [ The preparation of the buffer solution uses, but is not limited to, phosphoric acid.

단계 (b): 카다베린의 제조Step (b): Preparation of cadaverine

본 발명에 따르면 상기 단계 (a)에서 제조된 전세포 생촉매와 리신 또는 리신 염산염과 반응하여 카다베린을 제조한다.According to the present invention, the whole cell biocatalyst prepared in step (a) and lysine or lysine hydrochloride are reacted to prepare cardavulin.

상기 단계(a)에서 제조된 전세포 생촉매의 농도는 촉매가 보유하고 있는 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC) ldcC의 양에 따라 조절한다. The concentration of the whole cell biocatalyst prepared in step (a) is controlled by the amount of lysine decarboxylase (LDC) ldcC possessed by the catalyst.

본 발명의 일실시예에 따르면, ldcC가 대량 생산되도록 유전자 조작이 이루어진 E. coli 균주의 경우 농도는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 5 내지 17 g/L의 균주일 수 있으며, 보다 바람직하게는 8 내지 17 g/L 균주일 수 있으며, 가장 바람직하게는 8 내지 11 g/L의 균주를 사용하는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, in the case of an E. coli strain genetically engineered to mass-produce ldcC, the concentration may be, but not limited to, 5 to 17 g / L, more preferably, May be from 8 to 17 g / L, and most preferably from 8 to 11 g / L.

상기 단계 (a)에서 제조된 전세포 촉매와 반응하는 리신 또는 리신 염산염은 바이오매스로부터 생물학적으로 제조가 되며, 분말 형태 또는 수용액 상태로 전세포 생촉매가 포함되어 있는 반응조에 투입될 수 있다. The lysine or lysine hydrochloride reacting with the whole cell catalyst prepared in the step (a) may be prepared biologically from the biomass and may be added to the reaction vessel containing the whole cell biocatalyst in a powder form or an aqueous solution state.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 단계 (b)에서 전세포 생촉매와 리신 또는 리신 염산염을 반응함에 있어서 피리독살-5-인산(Pyridoxal 5-phosphate, PLP)을 추가적으로 포함하여 반응을 진행할 수 있다. 피리독살-5-인산은 아미노산의 라세미화, 아미노기 전이반응, 카복시이탈반응, 수소이탈반응, 알데히드이탈반응, 세린과 인돌로부터의 트립토판의 합성반응 등 생체 내에 있어서의 각종 효소 반응에 작용하는 조효소 중 하나로서, (b) 단계의 반응을 촉진하는 역할을 수행하기 때문이다.According to an embodiment of the present invention, in the step (b), the reaction may be carried out by additionally containing pyridoxal-5-phosphate (PLP) in the reaction of whole cell biocatalyst with lysine or lysine hydrochloride have. Pyridoxal-5-phosphate is a coenzyme involved in various enzymatic reactions in vivo such as racemization of amino acids, amino group transfer reaction, carboxy leaving reaction, hydrogen elimination reaction, aldehyde elimination reaction, and synthesis reaction of tryptophan from serine and indole As a result, it plays a role of promoting the reaction of step (b).

상기 단계 (b)의 탈카르복실화 반응(decarboxylation) 동안, 본 발명에 첨가되는 PLP의 최종농도는 이에 제한되지는 않으나, 1.0 내지 100.0 μM 일 수 있으며, 보다 바람직하게는 2.5 내지 20.0 μM 일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 5.0 내지 10.0 μM 일 수 있다.During the decarboxylation of step (b), the final concentration of PLP added to the present invention may be, but is not limited to, 1.0 to 100.0 μM, more preferably 2.5 to 20.0 μM And even more preferably from 5.0 to 10.0 [mu] M.

또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 단계 (b) 이후, 상기 전세포 생촉매와 상기 카다베린을 분리하고, 분리된 전세포 생촉매를 재사용하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 방법이 미생물의 파쇄과정을 거치지 않고 최종농도 0.001 mM 내지 0.1 mM 범위의 낮은 농도의 IPTG를 처리하여 가용성(soluble) 형태의 ldcC가 대량 발현되도록 유도(induction)된 미생물을 사용하기 때문에 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)인 ldcC를 보유하고 있는 미생물을 원심분리를 통해 쉽게 회수하여 다시 사용할 수 있다. 회수된 미생물만을 이용하여 상기 단계(b)를 반복할 수 있으며, 이미 카다베린 제조 반응이 시작된 반응조에 회수된 미생물을 추가로 주입하여 카다베린을 제조할 수도 있다.In addition, according to an embodiment of the present invention, after the step (b), the step of separating the whole cell biocatalyst and the cadaverine and reusing the separated whole cell biocatalyst may be further included. The method provided in the present invention uses a microorganism inducible to mass-express soluble forms of ldcC by treating IPTG at a final concentration ranging from 0.001 mM to 0.1 mM without destroying microorganisms. Therefore, the microorganism having ldcC, lysine decarboxylase (LDC), can be easily recovered by centrifugation and reused. The step (b) may be repeated using only the recovered microorganism. Alternatively, the recovered microorganism may be further injected into the reaction vessel in which the reaction for preparing the cadaverine is initiated to produce cadaverine.

본 발명의 용어 "탈카르복실화 반응(decarboxylation)"은 카르복실기(carboxyl group, -COOH기)을 제거하고, 이산화탄소(CO₂)를 방출하는 화학반응으로서, 본 발명의 기질인 리신으로부터 카다베린을 제조하는 탈카르복실화 반응(decarboxylation)은 하기와 같다.The term " decarboxylation "of the present invention is a chemical reaction that removes a carboxyl group (-COOH group) and releases carbon dioxide (CO ₂ ) The decarboxylation to be prepared is as follows.

본 발명의 일실시예에 의하면, 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC) cadA를 보유하고 있는 E. coli 균주의 경우, 최종농도 1.0 mM의 고농도의 IPTG를 처리한 경우에 활성형의 가용성(soluble) 단백질이 잘 발현된 반면, ldcC를 보유하고 있는 E. coli 균주의 경우, 최종농도 0.1 mM 이하의 낮은 농도의 IPTG를 처리한 경우에 활성형의 가용성(soluble) 단백질 발현량이 증가함을 확인하였다(도 3 및 도 4). 이에, 0.1 mM 이하의 낮은 농도의 IPTG, 특히 0.05 mM의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 전세포를 생촉매로 사용하여 탈카르복실화 반응을 진행하여 카다베린을 제조해 본 결과, 52℃의 온도 조건 및 pH 6의 약산성 조건에서 기질인 리신으로부터 카다베린으로의 전환율이 높음, 즉 카다베린 생산성이 우수함을 확인하였으며(도 5 내지 도 7), 상기 ldcC 보유 E. coli 전세포 생촉매 농도가 높아질수록 카다베린 초기 전환 속도 또한 증가함을 확인하였다(도 8). 더욱이, 값비싼 조효소인 PLP의 농도를 100.0 μM에서 2.5 μM까지 감소시켜도 높은 카다베린 전환 효율을 가짐을 확인하였다(도 9). 뿐만 아니라, 저순도의 산업용 리신 기질을 사용할지라도 생촉매로서 상기 ldcC 보유 E. coli 전세포 생촉매 농도를 증가시킴에 따라 경제적으로 고농도의 카다베린을 생성할 수 있음도 확인하였다(도 13).According to one embodiment of the present invention, E. coli strains having lysine decarboxylase (LDC) cadA were treated with high concentration of IPTG at a final concentration of 1.0 mM, soluble protein was expressed well, whereas the E. coli strains with ldcC showed that the soluble protein expression level of the active form was increased when IPTG at a final concentration of 0.1 mM or less was treated (Figs. 3 and 4). As a result, decarboxylation was carried out using all cells of ldcC-containing E. coli treated with IPTG at a low concentration of 0.1 mM or less, especially 0.05 mM IPTG, the temperature and the conversion rate of the cadaverine from the lysine substrate in a weakly acidic condition of pH 6 High, that cadaverine was suberic determine the productivity is excellent (5 to 7), and the ldcC holding E. coli whole cell biocatalyst concentration The initial conversion rate of cadaverine was also increased (Fig. 8). Furthermore, it was confirmed that even when the concentration of PLP, which is an expensive coenzyme, was reduced from 100.0 μM to 2.5 μM, it had a high conversion efficiency of cadaverine (FIG. 9). In addition, even if a low purity industrial lysine substrate is used, It was also confirmed that high concentration of cadaverine could be produced economically by increasing the ldcC-containing E. coli whole cell biocatalyst concentration (Fig. 13).

따라서, 리신(L-lysine) 또는 리신 염산염(L-lysine monohydrochloride) 기질로부터 카다베린 제조시 대장균(E. coli) 유래의 LDC인 ldcC가 재조합된 미생물 균주에 최종농도 0.001 내지 0.1 mM 범위의 저농도의 IPTG를 처리하여 전세포(whole cell) 생촉매(biocatalyst)로 사용한 본 발명의 카다베린 제조방법에 따르면, 원 포트 반응(one-pot reaction)을 통해 효과적으로 높은 함유량의 카다베린을 제조할 수 있을 뿐만 아니라, PLP와 같은 값비싼 조효소의 사용량을 절감할 수 있으며, 별도의 LDC 정제 과정이 필요하지 않으므로, 정제에 필요한 시간과 경제적 부담 또한 줄일 수 있어 낮은 생산비용에 효과적으로 카다베린을 제조할 수 있음을 알 수 있다.Therefore, a microbial strain in which recombinant ldcC, an LDC derived from E. coli , is recombinantly produced from lysine or L-lysine monohydrochloride substrate in the production of cataractine, has a low concentration of 0.001-0.1 mM According to the method for producing cadaverine of the present invention using IPTG as a whole cell biocatalyst, it is possible to effectively produce a high content of cadaverine through a one-pot reaction Since the use of expensive coenzyme such as PLP can be reduced and the separate LDC purification process is not required, it is possible to reduce the time and the economical burden required for purification, so that the production of cadaverine can be effectively performed at a low production cost Able to know.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기의 본 발명에 방법에 의해 제조된 카다베린을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a cadaverine produced by the method of the present invention as described above.

본 발명의 고농도 카다베린(cadaverine) 제조방법은, 리신(L-lysine) 또는 리신 염산염(L-lysine monohydrochloride) 기질로부터 카다베린 제조시 대장균(E.coli) 유래의 LDC인 cadA와 비교하여 보다 넓은 범위의 pH에서 활성을 가지는 LDC인 ldcC가 재조합된 미생물 균주에 최종농도 0.001 내지 0.1 mM 범위의 저농도의 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드(IPTG)를 처리하여 전세포(whole cell) 생촉매(biocatalyst)로 사용하고, 재사용할 수 있는 방법을 제공하여 제조 공정 중 생촉매 제조 비용을 줄일 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 방법에 의하면, 피리독살-5-인산(pyridoxal 5-phosphate, PLP)과 같은 값비싼 조효소의 사용량을 절감할 수 있으며, 별도의 LDC 정제 과정이 필요하지 않으므로, 정제에 필요한 시간과 경제적 부담 또한 줄일 수 있어 카다베린 제조 원가를 획기적으로 개선할 수 있는 장점이 있다.The method for producing a high concentration cadaverine of the present invention is a method for producing cadaverine from a L-lysine or L-lysine monohydrochloride substrate to a wider range of cadavagin compared to cadA, an LDC derived from E. coli , 1-thio-beta-D-galactopyranoside (IPTG) at a final concentration ranging from 0.001 to 0.1 mM was treated with the recombinant microorganism strain ldcC, it can be used as a whole cell biocatalyst and can be reused to reduce the cost of producing biocatalyst during the manufacturing process. In addition, according to the method of the present invention, the amount of expensive coenzyme such as pyridoxal-5-phosphate (PLP) can be reduced and a separate LDC purification process is not required. Time and economic burden can also be reduced, which can significantly improve the manufacturing cost of cadaverine.

도 1은 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)에 의해 기질인 리신(lysine)으로부터 카다베린(cadaverine)을 제조하는 탈카르복실화 반응(decarboxylation)을 나타낸 도이다.
도 2는 pET24ma 벡터를 이용하여 구축한 E. coli 유래 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)인 cadA 및 ldcC가 포함된 pET24ma-cadA 플라스미드(A)와 pET24ma-ldcC 플라스미드(B)를 나타낸 도이다.
도 3은 1.0 mM의 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 처리함에 따라, 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)인 cadA 및 ldcC가 재조합된 E. coli 균주(E. coli BL21(DE3) pET24ma cadA 및 E. coli BL21(DE3) pET24ma ldcC)로부터 발현이 유도된, 전체(total), 가용성(soluble) 및 불용성(insoluble) 형태의 cadA 및 ldcC 단백질의 발현 정도를 확인한 전기영동 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, M은 단백질 사이즈 마커(protein ladder marker)를, 1은 전체(total) cadA 단백질 발현 정도, 2는 가용성(soluble) 형태의 cadA 단백질 발현 정도, 3은 불용성(insoluble) 형태의 cadA 단백질 발현 정도, 4는 전체(total) ldcC 단백질 발현 정도, 5는 가용성(soluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 6은 불용성(insoluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 4는 다양한 농도의 IPTG 처리에 따른, 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)인 ldcC가 재조합된 E. coli 균주(E. coli BL21(DE3) pET24ma ldcC)로부터 발현이 유도된, 전체(total), 가용성(soluble) 및 불용성(insoluble) 형태의 ldcC 단백질의 발현 정도를 확인한 전기영동 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, M은 단백질 사이즈 마커(protein ladder marker)를, 1은 0.001 mM의 IPTG 처리에 따른 전체(total) ldcC 단백질 발현 정도, 2는 0.001 mM의 IPTG 처리에 따른 가용성(soluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 3은 0.001 mM의 IPTG 처리에 따른 불용성(insoluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 4는 0.002 mM의 IPTG 처리에 따른 전체(total) ldcC 단백질 발현 정도, 5는 0.002 mM의 IPTG 처리에 따른 가용성(soluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 6은 0.002 mM의 IPTG 처리에 따른 불용성(insoluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 7은 0.003 mM의 IPTG 처리에 따른 전체(total) ldcC 단백질 발현 정도, 8은 0.003 mM의 IPTG 처리에 따른 가용성(soluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 9는 0.003 mM의 IPTG 처리에 따른 불용성(insoluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 10은 0.004 mM의 IPTG 처리에 따른 전체(total) ldcC 단백질 발현 정도, 11은 0.004 mM의 IPTG 처리에 따른 가용성(soluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 12는 0.004 mM의 IPTG 처리에 따른 불용성(insoluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 13은 0.005 mM의 IPTG 처리에 따른 전체(total) ldcC 단백질 발현 정도, 14는 0.005 mM의 IPTG 처리에 따른 가용성(soluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 15는 0.005 mM의 IPTG 처리에 따른 불용성(insoluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 16은 0.006 mM의 IPTG 처리에 따른 전체(total) ldcC 단백질 발현 정도, 17은 0.006 mM의 IPTG 처리에 따른 가용성(soluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 18은 0.006 mM의 IPTG 처리에 따른 불용성(insoluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 19는 0.007 mM의 IPTG 처리에 따른 전체(total) ldcC 단백질 발현 정도, 20은 0.007 mM의 IPTG 처리에 따른 가용성(soluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 21은 0.007 mM의 IPTG 처리에 따른 불용성(insoluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 22는 0.008 mM의 IPTG 처리에 따른 전체(total) ldcC 단백질 발현 정도, 23은 0.008 mM의 IPTG 처리에 따른 가용성(soluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 24는 0.008 mM의 IPTG 처리에 따른 불용성(insoluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 25는 0.009 mM의 IPTG 처리에 따른 전체(total) ldcC 단백질 발현 정도, 26은 0.009 mM의 IPTG 처리에 따른 가용성(soluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 27은 0.009 mM의 IPTG 처리에 따른 불용성(insoluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 28은 0.01 mM의 IPTG 처리에 따른 전체(total) ldcC 단백질 발현 정도, 29는 0.01 mM의 IPTG 처리에 따른 가용성(soluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 30은 0.01 mM의 IPTG 처리에 따른 불용성(insoluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 31은 0.05 mM의 IPTG 처리에 따른 전체(total) ldcC 단백질 발현 정도, 32는 0.05 mM의 IPTG 처리에 따른 가용성(soluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 33은 0.05 mM의 IPTG 처리에 따른 불용성(insoluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 34는 0.1 mM의 IPTG 처리에 따른 전체(total) ldcC 단백질 발현 정도, 35는 0.1 mM의 IPTG 처리에 따른 가용성(soluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도, 36은 0.1 mM의 IPTG 처리에 따른 불용성(insoluble) 형태의 ldcC 단백질 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 IPTG 처리 농도에 따른, ldcC 보유 E. coli 전세포(whole cell) 생촉매(biocatalyst)를 이용한 리신으로부터 카다베린의 전환 효과 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 다양한 온도 조건에 따른, ldcC 보유 E. coli 전세포 생촉매를 이용한 리신으로부터 카다베린의 전환 효과 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 완충용액의 다양한 pH 조건에 따른, ldcC 보유 E. coli 전세포 생촉매를 이용한 리신으로부터 카다베린의 전환 효과 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 리신으로부터 카다베린 생산을 위한 생촉매로서의 ldcC 보유 E. coli 균주의 세포농도 조건에 따른 카다베린 전환 속도 증대 효과 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 피리독살-5-인산(pyridoxal 5-phosphate, PLP)의 다양한 농도 조건에 따른, ldcC 보유 E. coli 전세포 생촉매를 이용한 리신으로부터 카다베린의 전환 효과 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 기질인 리신염(L-lysine HCl)의 다양한 농도 조건에 따른, ldcC 보유 E. coli 전세포 생촉매를 이용한 고농도 카다베린의 시간별 생산 정도 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 0.1 M 리신은 기질로서 0.1 M의 리신염이 카다베린 전환 후 잔존하는 농도, 0.1 M 카다베린은 기질로서 0.1 M의 리신염을 사용하였을 때 전환된 카다베린의 생산 정도를, 0.6 M 리신은 기질로서 0.6 M의 리신염이 카다베린 전환 후 잔존하는 농도, 0.6 M 카다베린은 기질로서 0.6 M의 리신염을 사용하였을 때 전환된 카다베린의 생산 정도를, 1 M 리신은 기질로서 1 M의 리신염이 카다베린 전환 후 잔존하는 농도, 1 M 카다베린은 기질로서 1 M의 리신염을 사용하였을 때 전환된 카다베린의 생산 정도를 나타낸 것이다.
도 11은 1 M의 리신염(L-lysine HCl)으로부터 카다베린 생산을 위한 생촉매로서의 ldcC 보유 E. coli 균주의 세포농도에 따른 고농도 카다베린의 시간별 생산 정도 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 리신_OD₆₀₀ 1.2는 세포농도 OD₆₀₀=1.2일때의 카다베린 전환 후 잔존하는 리신염의 농도를, 카다베린_OD₆₀₀ 1.2는 세포농도가 OD₆₀₀=1.2일때의 1 M의 리신염 기질로부터 전환된 카다베린의 생산 정도를, 리신_OD₆₀₀ 2는 세포농도 OD₆₀₀=2일때의 카다베린 전환 후 잔존하는 리신염의 농도를, 카다베린_OD₆₀₀ 2는 세포농도가 OD₆₀₀=2일때의 1 M의 리신염 기질로부터 전환된 카다베린의 생산 정도를, 리신_OD₆₀₀ 4는 세포농도 OD₆₀₀=4일때의 카다베린 전환 후 잔존하는 리신염의 농도를, 카다베린_OD₆₀₀ 4는 세포농도가 OD₆₀₀=4일때의 1 M의 리신염 기질로부터 전환된 카다베린의 생산 정도를 나타낸 것이다.
도 12는 저순도의 크루드 리신(crude lysine) 기질의 다양한 농도 조건에 따른, ldcC 보유 E. coli 전세포 생촉매를 이용한 고농도 카다베린의 시간별 생산 정도 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 0.1 M 리신은 기질로서 0.1 M의 크루드 리신이 카다베린 전환 후 잔존하는 농도, 0.1 M 카다베린은 기질로서 0.1 M의 크루드 리신을 사용하였을 때 전환된 카다베린의 생산 정도를, 0.6 M 리신은 기질로서 0.6 M의 크루드 리신이 카다베린 전환 후 잔존하는 농도, 0.6 M 카다베린은 기질로서 0.6 M의 크루드 리신을 사용하였을 때 전환된 카다베린의 생산 정도를, 1 M 리신은 기질로서 1 M의 크루드 리신이 카다베린 전환 후 잔존하는 농도, 1 M 카다베린은 기질로서 1 M의 크루드 리신을 사용하였을 때 전환된 카다베린의 생산 정도를 나타낸 것이다.
도 13은 1 M의 저순도 크루드 리신(crude lysine)으로부터 카다베린 생산을 위한 생촉매로서의 ldcC 보유 E. coli 균주의 세포농도에 따른 고농도 카다베린의 시간별 생산 정도 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 리신_OD₆₀₀ 1.2는 세포농도 OD₆₀₀=1.2일때의 카다베린 전환 후 잔존하는 크루드 리신의 농도를, 카다베린_OD₆₀₀ 1.2는 세포농도가 OD₆₀₀=1.2일때의 1 M의 크루드 리신 기질로부터 전환된 카다베린의 생산 정도를, 리신_OD₆₀₀ 2는 세포농도 OD₆₀₀=2일때의 카다베린 전환 후 잔존하는 크루드 리신의 농도를, 카다베린_OD₆₀₀ 2는 세포농도가 OD₆₀₀=2일때의 1 M의 크루드 리신 기질로부터 전환된 카다베린의 생산 정도를, 리신_OD₆₀₀ 4는 세포농도 OD₆₀₀=4일때의 카다베린 전환 후 잔존하는 크루드 리신의 농도를, 카다베린_OD₆₀₀ 4는 세포농도가 OD₆₀₀=4일때의 1 M의 크루드 리신 기질로부터 전환된 카다베린의 생산 정도를 나타낸 것이다.
도 14는 리신으로부터 카다베린 생산을 위한 반응 종결 후 회수된, cadA 및 ldcC가 재조합된 E. coli 균주(E. coli BL21(DE3) pET24ma cadA 및 E. coli BL21(DE3) pET24ma ldcC)를 생촉매로서 이용한 카다베린 생산 효과 결과를 나타낸 도이다.FIG. 1 is a diagram showing decarboxylation for producing cadaverine from a substrate lysine by lysine decarboxylase (LDC). FIG.
Figure 2 is a diagram showing a pET24ma-cadA plasmid (A) and the ldcC pET24ma-plasmid (B) that contains an E. coli origin cadA and ldcC lysine decarboxylase lyase (lysine decarboxylase, LDC) constructed using the vector pET24ma to be.
FIG. 3 is a graph showing the effect of 1.0 mM IPTG (isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside) The expression of ladine decarboxylase (LDC), cadA and ldcC, from recombinant E. coli strains ( E. coli BL21 (DE3) pET24ma cadA and E. coli BL21 (DE3) pET24ma ldcC) Fig. 4 shows electrophoresis results confirming the expression levels of cadA and ldcC proteins in the total, soluble, and insoluble forms. Here, M represents a protein ladder marker, 1 represents the degree of expression of total cadA protein, 2 represents the degree of expression of cadA protein in soluble form, 3 represents expression of cadA protein in insoluble form 4 shows the degree of total ldcC protein expression, 5 indicates the soluble form of ldcC protein, and 6 indicates the insoluble form of ldcC protein expression.
The expression 4 is derived from a lysine decarboxylase lyase (lysine decarboxylase, LDC) is ldcC a recombinant strain of E. coli (E. coli BL21 (DE3) pET24ma ldcC) according to the treatment with different concentrations of IPTG, all ( total, soluble and insoluble forms of the ldcC protein. Here, M represents a protein ladder marker, 1 represents the total ldcC protein expression level after treatment with 0.001 mM IPTG, 2 represents soluble ldcC protein according to IPTG treatment at 0.001 mM, 3 is the degree of insoluble ldcC protein expression by 0.001 mM IPTG treatment, 4 is total ldcC protein expression level after treatment with 0.002 mM IPTG and 5 is IPTG treated with 0.002 mM 6 is the degree of insoluble ldcC protein expression by 0.002 mM IPTG treatment, 7 is the degree of total ldcC protein expression by treatment with 0.003 mM IPTG, 9 shows the degree of expression of the insoluble ldcC protein by treatment with 0.003 mM IPTG, and 10 shows the degree of expression of ldcC protein after treatment with 0.004 mM IPTG. total) ldcC protein expression, 11 is the soluble level of ldcC protein expressed by 0.004 mM IPTG treatment, 12 is the insoluble ldcC protein expression level after treatment with 0.004 mM IPTG, 13 is the total amount of IPTG treated with 0.005 mM (total) ldcC protein expression level, 14 is the soluble form of ldcC protein expression by 0.005 mM IPTG treatment, 15 is the insoluble type ldcC protein expression level after treatment with 0.005 mM IPTG, The total ldcC protein expression level after treatment with 0.006 mM IPTG, 17 the degree of soluble ldcC protein expression with 0.006 mM IPTG treatment, 18 the insoluble form according to IPTG treatment with 0.006 mM 19 shows the degree of expression of total ldcC protein by treatment with 0.007 mM IPTG, 20 shows the degree of soluble ldcC protein expression according to IPTG treatment with 0.007 mM, 21 shows the degree of expression of ldcC protein with 0.007 mM IPTG Insolubility by treatment 22 is the degree of total ldcC protein expression by 0.008 mM IPTG treatment, 23 is the soluble level of ldcC protein expressed by IPTG treatment at 0.008 mM, 24 is the degree of ldcC protein expression in the insoluble form, 25 shows the total ldcC protein expression level after 0.009 mM IPTG treatment, 26 shows the soluble form according to IPTG treatment at 0.009 mM, and 25 indicates the total ldcC protein expression level with 0.009 mM IPTG treatment. 27 represents the degree of expression of the insoluble ldcC protein by 0.009 mM IPTG treatment, 28 represents the degree of total ldcC protein expression by 0.01 mM IPTG treatment, 29 represents the IPTG of 0.01 mM, 30 was the insoluble form of ldcC protein expression by 0.01 mM IPTG treatment, 31 was the total ldcC protein expression by 0.05 mM IPTG treatment, , 32 is 0.05 mM 33 shows the degree of expression of the insoluble form of ldcC protein by 0.05 mM IPTG treatment and 34 shows the total ldcC protein according to the IPTG treatment at 34 mM. 35 is the soluble form of ldcC protein expressed by 0.1 mM IPTG treatment, and 36 is the insoluble form of ldcC protein after 0.1 mM IPTG treatment.
FIG. 5 is a graph showing the results of conversion of lycin to cadaverine using biocatalyst of whole cell of E. coli carrying ldcC according to IPTG treatment concentration.
FIG. 6 shows the results of conversion of lidocin to lidoc using ldcC-containing E. coli whole cell biocatalyst according to various temperature conditions.
Fig. 7 is a graph showing the conversion effect of lidocin to lidoc using ldcC-containing E. coli whole cell biocatalyst according to various pH conditions of a buffer solution. Fig.
8 shows the results of increasing the conversion rate of cataryline according to the cell concentration conditions of the ldcC-retaining E. coli strain as a biocatalyst for production of cadaverine from lysine.
FIG. 9 is a graph showing the conversion effect of lidocene from lysine using ldcC-containing E. coli whole cell biocatalyst according to various concentration conditions of pyridoxal-5-phosphate (PLP).
FIG. 10 is a graph showing the results of the hourly production of high concentration cadaverine using ldcC-containing E. coli whole cell biocatalyst according to various concentration conditions of L-lysine HCl as a substrate. Here, 0.1 M lysine was used to measure the concentration of 0.1 M lysine salt remaining after conversion to cataryline, 0.1 M cadaverine 0.1 m lysine salt as a substrate, Lysine was used to determine the concentration of 0.6 M lysine salt remaining after the conversion to cataractine, 0.6 M cadaverine used 0.6 m lysine salt as substrate and 1 M lysine was used as substrate The concentration at which M lysine salt remained after conversion to cadaverine, 1 M cadaverine indicates the degree of production of converted cadaverine when 1 M lysine salt was used as a substrate.
11 is a graph showing the results of the hourly production of high concentration of cadaverine according to the cell concentration of ldcC-bearing E. coli strain as a biocatalyst for producing cadaverine from 1 M lysine salt (L-lysine HCl). Here, lysine _OD ₆₀₀ 1.2 is cell density of OD ₆₀₀ = 1.2 when cadaverine after conversion, the concentration of Li remaining nephritis, cadaverine _OD ₆₀₀ 1.2 is the cell concentration of OD ₆₀₀ = 1.2 1 M of nephritis when Li the production level of the cadaverine from the switching matrix, lysine _OD ₆₀₀ 2 is the concentration of Li nephritis remaining after conversion of cadaverine cell density OD ₆₀₀ = 2 when, cadaverine _OD ₆₀₀ 2 is cell density is OD ₆₀₀ = the production level of the cadaverine from the first conversion Lee nephritis substrate of M 2 when, lysine ₆₀₀ _OD 4 is cell density OD ₆₀₀ = 4 when the cadaverine-through conversion, the concentration of Li remaining nephritis, cadaverine _OD ₆₀₀ 4 shows the degree of production of cadaverine converted from 1 M lysine salt substrate at a cell concentration of OD ₆₀₀ = 4.
FIG. 12 is a graph showing the results of hourly production of high concentration cadaverine using ldcC-containing E. coli whole cell biocatalyst according to various concentration conditions of low purity crude lysine substrate. Here, the 0.1 M lysine is the concentration at which 0.1 M of crude lysine remains as a substrate after the conversion of the cardavalin, 0.1 M of cadaverine is the level of production of the converted catarrhine when 0.1 d of crude lysine is used as a substrate, The concentration of 0.6 M lysine was 0.6 M in the concentration of crude ricin, and the concentration of 0.6 M cadaverine was 0.6 m in crude ricin, Shows the concentration at which 1 M of crude lysine remains as a substrate after conversion to cadaverine, and 1 M cadaverine indicates the degree of production of converted cadaverine when 1 M of crude lysine is used as a substrate.
FIG. 13 shows the results of the hourly production of high concentration of cadaverine according to the cell concentration of the ldcC-bearing E. coli strain as a biocatalyst for the production of cadaverine from a low-purity crude lysine of 1M. Herein, lysine_OD ₆₀₀ 1.2 indicates the concentration of the remaining crude lysine after the conversion of the catargine at the cell concentration OD ₆₀₀ = 1.2, and the concentration of the lysine_OD ₆₀₀ 1.2 indicates the concentration of the remaining lysine at the cell concentration OD ₆₀₀ = the level of production of cadaverine converted from dE-lysine substrate, lysine _OD ₆₀₀ 2 is cell density OD ₆₀₀ = cadaverine after conversion of the second when the concentration of the crude residual lysine, cadaverine _OD ₆₀₀ 2 is the cell concentration an OD ₆₀₀ = 1 2 when the production level of the cadaverine converted from crude lysine substrate of the M, lysine ₆₀₀ _OD 4 is cell density OD ₆₀₀ = cadaverine after conversion of the 4 when the concentration of the crude residual lysine, Cadaverine_OD ₆₀₀ shows the degree of production of cadaverine converted from a 1 M Crudrrysin substrate at a cell concentration of OD ₆₀₀ = 4.
Figure 14 shows the results of the transformation of recombinant E. coli strains ( E. coli BL21 (DE3) pET24ma cadA and E. coli BL21 (DE3) pET24ma ldcC) recovered from cadA and ldcC after termination of reaction for production of cadaverine from lysine, &Lt; tb >< / TABLE >

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the constitution and effects of the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.

실시예Example 1: 리신 1: lysine 탈탄산Decarbonic acid 분해효소(lysine Lysine decarboxylasedecarboxylase , , LDCLDC ) 유전자 삽입을 위한 플라스미드 구축 및 리신 탈탄산 분해효소 보유 균주 제조) Construction of plasmid for gene insertion and production of lysine decarboxylase-containing strains

리신 탈탄산 분해효소 유전자 삽입을 위한 플라스미드(plasmid) 구축을 위해, E. coli 균주(strain)는 선정(selection) 및 스크리닝(screening) 목적으로 50㎍/㎖ 카나마이신(kanamycin, Km)이 추가된 LB 배지(Luria-Bertani broth)[10g/ℓ 트립톤(tryptone), 10g/ℓ 염화나트륨(NaCl), 5g/ℓ 효모 추출액(yeast extract)]를 이용하여 37℃에서 배양하였다. 리신 탈탄산 분해효소 유전자인 cadA 및 ldcC 복제(cloning)를 위해 E. coli K12 MG1655의 게놈 DNA(genomic DNA)를 사용하였다. pET24ma 벡터(vector)는 E. coli K12 MG1655 유래 cadA 및 ldcC가 포함된 플라스미드(plasmid) pET24ma-cadA 및 pET24ma-ldcC를 구축하는데 사용되었다(도 2). 상기 구축된 각각의 플라스미드를 E. coli BL21(DE3) 컴피턴트 세포(competent cell)로 형질전환(transformation) 시켜 리신 탈탄산 분해효소인 cadA 및 ldcC가 재조합된 E.coli 균주를 제조하였다.For constructing plasmids for lysine decarboxylase gene insertion, the E. coli strain was transformed with LB (kanamycin, Km) supplemented with 50 / / ml kanamycin (Km) for selection and screening purposes And cultured at 37 占 폚 using Luria-Bertani broth (10 g / l tryptone, 10 g / l sodium chloride (NaCl), 5 g / l yeast extract). Genomic DNA of E. coli K12 MG1655 was used for cadA, the lysine decarboxylase gene, and ldcC cloning. The pET24ma vector was used to construct plasmids pET24ma-cadA and pET24ma-ldcC containing E. coli K12 MG1655 derived cadA and ldcC (FIG. 2). Each of the constructed plasmids was transformed into E. coli BL21 (DE3) competent cells to prepare E.coli strains recombinant with lysine decarboxylase enzymes cadA and ldcC.

실시예Example 2: 2: IPTGIPTG (Isopropyl β-D-1-(Isopropyl [beta] -D-1- thiogalactopyranosidethiogalactopyranoside ) 처리에 따른 ) Treatment E.coliE. coli 유래 리신 Derived lysine 탈탄산Decarbonic acid 분해효소(lysine Lysine decarboxylasedecarboxylase , , LDCLDC ) ) cadAcadA 및 And ldcC의of ldcC 발현 유도 Induction of expression

상기 실시예 1에서 제조한 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)인 cadA 및 ldcC가 재조합된 E. coli 균주, E. coli BL21(DE3) pET24ma cadA 및 E. coli BL21(DE3) pET24ma ldcC를 각각 250 ㎖ 용량의 배플(baffle) 타입 배양기에 준비된 50 ㎖의 LB 배지에 각각 접종(inoculation)하고 200 rpm, 30℃에서 12시간 동안 배양(culture)하였다. 이때, E. coli 균주의 OD₆₀₀ 값이 0.5에 도달하였을 때, IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) 1.0 mM을 처리하여 cadA 및 ldcC의 발현을 유도하였다. cadA 및 ldcC 발현 유도 후 배양된 각각의 세포를 13,000 rpm, 4℃에서 1분간 원심분리(centrifugation)하여 수집(harvest)하였다. 이후 세척 과정 및 소듐 포스페이트(sodium phosphate, pH7) 버퍼를 사용한 세포 용해(cell lysis) 과정을 거친 후 원심분리하고, 상등액(supernatant)과 세포 펠렛(pellet)을 수집하여 전체(total), 가용성(soluble) 및 불용성(insoluble) 형태의 cadA 및 ldcC 단백질의 발현 정도를 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 전기영동법을 통해서 각각 확인하였다. 이때, 단백질 로딩 양은 동일한 세포 농도를 기준으로 20 ㎕의 단백질을 각각 로딩하였다.Example 1 a lysine decarboxylase lyase (lysine decarboxylase, LDC) the cadA and ldcC the recombinant E. coli strains, E. coli BL21 (DE3) pET24ma cadA and E. coli BL21 (DE3) pET24ma ldcC prepared from Each was inoculated in 50 ml of LB medium prepared in a 250 ml baffle type incubator, and cultured at 200 rpm and 30 ° C for 12 hours. At this time, E. coli When the OD ₆₀₀ value of the strain reached 0.5, 1.0 mM of IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) was treated to induce the expression of cadA and ldcC. After induction of cadA and ldcC expression, each of the cultured cells was harvested by centrifugation at 13,000 rpm for 1 minute at 4 ° C. After washing and cell lysis using sodium phosphate (pH 7) buffer, the cells were centrifuged, supernatant and cell pellets were collected, and total, soluble ) And insoluble forms of cadA and ldcC proteins were confirmed by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) electrophoresis, respectively. At this time, 20 μl of the protein was loaded on the basis of the same cell concentration.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)로서 ldcC보다 먼저 발견이 되어 사용되어 온 cadA와 달리 ldcC는 1.0 mM의 높은 농도의 IPTG를 처리한 경우 활성형의 가용성(soluble) 단백질이 잘 발현되지 않고, 불용성(insoluble) ldcC 단백질 발현이 증가함을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 3, unlike cadA, which was found earlier than ldcC as a lysine decarboxylase (LDC), ldcC was found to be more active when treated with 1.0 mM IPTG It was confirmed that the soluble protein was not expressed well and the insoluble ldcC protein expression was increased.

실시예Example 3: 3: IPTGIPTG 처리 농도에 따른 Depending on treatment concentration E.E. colicoli 유래 가용성(soluble) 형태의 리신 탈탄산 분해효소(lysine The soluble form of lysine decarboxylase (lysine decarboxylasedecarboxylase , , LDCLDC ) ) ldcC의of ldcC 고발현High expression 유도 Judo

E.coil 유래의 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)인 cadA와 ldcC를 이용한 다양한 연구가 보고되어 있는데, 미생물 기반의 카다베린의 생산은 대부분 E.coil의 cadA와 ldcC를 이용하여 진행되어 왔다(Appl . Microbiol . Biotechnol., 91, 1287-1296 (2011)). 이 중 cadA는 ldcC보다 먼저 발견이 되어 사용되었으나, 활성과 pH의 스펙트럼 등의 약점 등을 보유하고 있다(Appl . Microbiol. Biotechnol ., 91, 1287-1296 (2011),J . Bacteriol ., 178, 5522-5528 (1996)). 반면 ldcC는 보다 넓은 pH에서 활성을 갖는다는 장점을 갖고 있지만 프로모터(promoter)가 약해 자연적인 발현이 제한된다는 단점을 가지고 있는 것으로 알려져있다(Genes Genet. Syst., 72, 167-172 (1997)).There are E.coil lysine decarboxylase lyase various studies using the cadA and ldcC (lysine decarboxylase, LDC) derived from the reported production of a microorganism-based cadaverine is mostly conducted by using a E.coil cadA and ldcC of ( Appl . Microbiol . Biotechnol. , 91, 1287-1296 (2011)). Among cadA has been used in the first, found more ldcC, hold such weaknesses, such as the spectrum of activity and pH (Appl. Microbiol. Biotechnol. , 91, 1287-1296 (2011), J. Bacteriol., 178, 5522-5528 (1996)). On the other hand, ldcC has the advantage that it has activity at a wider pH, but it has a disadvantage of being weak in promoter and limiting natural expression ( Genes Genet. Syst. , 72, 167-172 (1997) .

자연적인 발현이 제한되는 단점을 지니고 있으나 보다 넓은 pH에서 활성을 가져, cadA와 달리 카다베린 생산시 효소 효율성 측면에서 훨씬 우수하고 반복사용이 가능한 ldcC의 고발현을 유도하고자, 상기 실시예 2에서 ldcC가 재조합된 E.coli BL21(DE3) pET24ma ldcC 균주 배양시 1.0 mM 농도로 고농도의 IPTG를 처리하여 ldcC의 발현을 유도하였으나, 활성형의 가용성(soluble) ldcC 단백질이 잘 발현되지 않음을 확인하였다.However, in order to induce high expression of ldcC which is more excellent in terms of efficiency of enzyme in the production of cadaverine and which can be used repeatedly, unlike cadA, which has a disadvantage that natural expression is restricted, ldcC The recombinant E. coli BL21 (DE3) pET24ma ldcC strain was treated with high concentration of IPTG at a concentration of 1.0 mM to induce the expression of ldcC, but the soluble ldcC protein was not expressed well.

이에, E.coil 유래 가용성(soluble) 형태의 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC) ldcC의 고발현을 유도하기 위해, 상기 실시예 1에서 제조한 ldcC가 재조합된 E. coli 균주인 E. coli BL21(DE3) pET24ma ldcC 배양시, 젖당오페론(lactose operon) 유도물질(inducer)인 IPTG를 농도별로 처리하여 ldcC의 발현을 유도하고, 다양한 농도의 IPTG 처리에 따른 가용성(soluble) ldcC 단백질의 발현 정도를 확인해 보았다.Thus, E.coil derived soluble (soluble) form of the lysine decarboxylase enzyme decomposition (lysine decarboxylase, LDC) to drive high expression of the ldcC, the first embodiment of the ldcC the recombinant E. coli strain prepared in E. Expression of ldcC was induced by treatment of IPTG, a lactose operon inducer, at the concentration of E. coli BL21 (DE3) pET24ma ldcC, and the expression of soluble ldcC protein by various concentrations of IPTG treatment I checked the degree.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조한 ldcC가 재조합된 E. coli 균주, E.coli BL21(DE3) pET24ma ldcC를 250 ㎖ 용량의 배플(baffle) 타입 배양기에 준비된 50 ㎖의 LB 배지에 접종하여 200 rpm, 30℃에서 12시간 동안 배양하였다. 이때, E.coli 균주의 OD₆₀₀ 값이 0.5에 도달하였을 때, IPTG를 최종농도 0.001 mM, 0.002 mM, 0.003 mM, 0.004 mM, 0.005 mM, 0.006 mM, 0.007 mM, 0.008 mM, 0.009 mM, 0.01 mM, 0.05 mM, 및 0.1 mM로 각각 처리하여 ldcC의 발현을 유도하였다. ldcC 발현 유도 후, IPTG 처리 농도별로 배양된 각각의 세포를 13,000 rpm, 4℃에서 1분간 원심분리 이후 세척 과정 및 소듐 포스페이트(sodium phosphate, pH7) 버퍼를 사용한 세포 용해(cell lysis) 과정을 거친 후 원심분리하고, 상등액(supernatant)과 세포 펠렛(pellet)을 수집하여, 각각의 IPTG 처리 농도에 따른 전체(total), 가용성(soluble) 및 불용성(insoluble) 형태의 ldcC 단백질의 발현 정도를 SDS-PAGE 전기영동법을 통해서 확인하였다. 이때, 단백질 로딩 양은 동일한 세포 농도를 기준으로 20 ㎕의 단백질을 각각 로딩하였다.Specifically, in Example 1 by the ldcC it is inoculated into LB medium 50 ㎖ prepared a recombinant E. coli strain, E.coli BL21 (DE3) pET24ma ldcC a baffle (baffle) the type of incubator 250 ㎖ production capacity at 200 rpm, 30 < 0 > C for 12 hours. At this time, when the OD ₆₀₀ value of the E. coli strain reached 0.5, IPTG was added to final concentrations of 0.001 mM, 0.002 mM, 0.003 mM, 0.004 mM, 0.005 mM, 0.006 mM, 0.007 mM, 0.008 mM, , 0.05 mM, and 0.1 mM, respectively, to induce the expression of ldcC. After induction of ldcC expression, each cell cultured according to the IPTG treatment concentration was centrifuged at 13,000 rpm for 1 minute at 4 ° C and then subjected to a cell lysis process using sodium phosphate (pH7) buffer The supernatants and cell pellets were collected and the degree of expression of the total, soluble and insoluble forms of ldcC protein according to each IPTG treatment concentration was determined by SDS-PAGE Electrophoresis. At this time, 20 μl of the protein was loaded on the basis of the same cell concentration.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC) ldcC는 0.1 mM 이하의 낮은 농도의 IPTG를 처리한 경우 전체(total) 단백질 양의 변화는 거의 없었지만, 활성형의 가용성(soluble) ldcC 단백질의 발현량이 증가됨을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 4, ldcC of lysine decarboxylase (LDC) showed almost no change in the total protein amount when IPTG at a low concentration of 0.1 mM or less was treated, And the expression level of soluble ldcC protein was increased.

상기 실시예 2 및 실시예 3의 결과를 통해, 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)인 cadA는 고농도의 IPTG 처리에 의해 가용성(soluble) 형태의 cadA 단백질이 잘 발현됨을 확인하였으나, 이와 다르게 ldcC는 저농도의 IPTG 처리에 의해 가용성(soluble) 형태의 ldcC 단백질이 잘 발현됨을 알 수 있었다. The results of Example 2 and Example 3 showed that cadA, a lysine decarboxylase (LDC), was well expressed in soluble form of cadA protein by high concentration of IPTG treatment, ldcC showed that the soluble form of ldcC protein was well expressed by low concentration of IPTG treatment.

실시예Example 4: 4: IPTGIPTG 처리 농도에 따른 Depending on treatment concentration 전세포Whole cell (whole cell) (whole cell) 생촉매(biocatalyst)Biocatalyst 를 이용한 리신으로부터 카다베린의 전환 효과Effect of lysine to cadaverine using

상기 실시예 3에서 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC) ldcC가 재조합된 E. coli 균체, E. coli BL21(DE3) pET24ma ldcC 배양시, 최종농도 0.001 mM 내지 0.1 mM 범위의 다양한 농도의 IPTG 처리에 의해 가용성(soluble) 형태의 ldcC 단백질이 잘 발현됨을 확인하였다.In Example 3, when lysine decarboxylase (LDC) ldcC recombinant E. coli cells and E. coli BL21 (DE3) pET24ma ldcC cultures were cultured in various concentrations of IPTG ranging from 0.001 mM to 0.1 mM It was confirmed that the soluble ldcC protein was expressed well by the treatment.

이에, 리신으로부터 카다베린을 생산하기 위한 생촉매(biocatalyst)로서 다양한 농도의 IPTG를 처리한 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC) ldcC를 보유하고 있는 E. coli 전세포(whole cell)를 이용하여, 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)의 활성도를 측정하였다.Thus, using the E. coli whole cells (whole cell), which has a lysine decarboxylase lyase (lysine decarboxylase, LDC) ldcC treated with different concentrations of IPTG to a biocatalyst (biocatalyst) to produce cadaverine from lysine The activity of lysine decarboxylase (LDC) was measured.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조한 ldcC가 재조합된 E. coli 균주, E.coli BL21(DE3) pET24ma ldcC를 250 ㎖ 용량의 배플(baffle) 타입 배양기에 준비된 50 ㎖의 LB 배지에 접종하여 200 rpm, 30℃에서 12시간 동안 배양하였다. 이때, E.coli 균주의 OD₆₀₀ 값이 0.5에 도달하였을 때, IPTG를 최종농도 0.001 mM, 0.002 mM, 0.003 mM, 0.004 mM, 0.005 mM, 0.006 mM, 0.007 mM, 0.008 mM, 0.009 mM, 0.01 mM, 0.05 mM, 및 0.1 mM로 각각 처리하였다. Specifically, in Example 1 by the ldcC it is inoculated into LB medium 50 ㎖ prepared a recombinant E. coli strain, E.coli BL21 (DE3) pET24ma ldcC a baffle (baffle) the type of incubator 250 ㎖ production capacity at 200 rpm, 30 < 0 > C for 12 hours. At this time, when the OD ₆₀₀ value of the E. coli strain reached 0.5, IPTG was added to final concentrations of 0.001 mM, 0.002 mM, 0.003 mM, 0.004 mM, 0.005 mM, 0.006 mM, 0.007 mM, 0.008 mM, , 0.05 mM, and 0.1 mM, respectively.

카다베린 생산을 위한 효소 전환반응은, 생촉매로서 상기와 같이 IPTG 처리 농도별로 배양된 각각의 세포를 전체 반응 부피(total reaction volume; 1.5 ㎖)의 4%(v/v)[5 g/L]가 되도록 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 옮긴 후, 기질인 0.1 M의 리신(L-lysine), 완충용액인 500 mM의 소듐 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer, pH6) 및 조효소인 0.1 mM의 PLP(pyridoxal 5-phosphate)를 첨가하여 잘 혼합시킨 뒤 2시간 동안 52℃에서 반응시켰다. 반응 2시간 후, 반응액은 100℃에서 10분간 방치하여 반응을 종료시키고, 리신과 카다베린 농도 측정 전까지 반응액의 변성을 막기 위해 4℃에 보관하였다.The enzyme conversion reaction for the production of cadaverine was carried out in the same manner as in Example 1, except that 4% (v / v) [5 g / L of the total reaction volume (1.5 ml) ], And then transferred to an eppendorf tube so that the substrate was washed with 0.1 M of L-lysine, 500 mM of sodium acetate buffer (pH 6) as a buffer solution and 0.1 mM of PLP as a coenzyme pyridoxal 5-phosphate) were added and mixed well. The mixture was reacted at 52 ° C for 2 hours. After 2 hours of the reaction, the reaction solution was allowed to stand at 100 占 폚 for 10 minutes to terminate the reaction and kept at 4 占 폚 to prevent denaturation of the reaction solution until lysine and cadaverine concentration were measured.

반응액의 리신과 카다베린 농도 측정은 디에틸메톡시메틸렌 말로네이트(DEEMM, diethyl ethoxymethylenemalonate) 유도체화를 실시하고 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, high performance liquid chromatography) 분석법을 통해 측정하였다. 이때, DEEMM 유도체화 반응 용액은 0.05M의 보레이트 버퍼(borate buffer, pH9), 0.04M의 메탄올(methanol), 3㎕의 DEEMM, 50㎕의 반응액(1M 이하로 희석)을 넣고 증류수로 전체 반응 부피(total reaction volume)를 500㎕로 맞춘 뒤, 70℃에서 2시간 동안 반응시켜 제조하였다. 또한, DEEMM 유도체화를 거친 반응액은 Capcellpak^® C18 UG 컬럼(columm)을 사용하고, 이동상은 아세테이트 버퍼(acetate buffer, 25mM, pH4.8)와 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용하여 HPLC 분석을 수행하였다. HPLC 분석시, 유속은 1 ㎖/min, 온도는 35℃의 조건으로 수행하였으며, 디텍터(detector)는 UV(284 nm)를 사용하여 분석을 실시하였다.The lysine and cadaverine concentrations of the reaction solutions were measured by high performance liquid chromatography (HPLC) using derivatization with diethyl ethoxymethylenemalonate (DEEMM). At this time, the DEEMM derivatization reaction solution was prepared by adding 0.05M borate buffer (pH 9), 0.04M methanol, 3μ DEEMM and 50μl reaction solution (diluted to 1M or less) The total reaction volume was adjusted to 500 μl, followed by reaction at 70 ° C for 2 hours. HPLC analysis was performed using a Capcellpak ^® C18 UG column as a reaction solution subjected to DEEMM derivatization and a mobile phase as an acetate buffer (25 mM, pH 4.8) and acetonitrile . In the HPLC analysis, the flow rate was 1 ml / min, the temperature was 35 ° C, and the detector was analyzed using UV (284 nm).

기질인 리신으로부터 카다베린 생산을 위한 생촉매(biocatalyst)로서, 최종농도 0.001 mM 내지 0.1 mM 범위의 낮은 농도의 IPTG를 처리한 ldcC를 보유하고 있는 E. coli 전세포(whole cell)를 사용하여 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)의 활성도를 측정해 본 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, IPTG 처리 농도가 0.1 mM 이하로 낮아질수록 카다베린 전환율이 높음, 즉 효소 활성도가 높음을 확인하였다. 특히, 0.05 mM의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 전세포를 생촉매로 사용한 경우, 카다베린 전환 효과가 우수함을 알 수 있었다.As a biocatalyst for the production of cadaverine from the substrate lysine, a whole cell of E. coli carrying ldcC treated with a low concentration IPTG in the final concentration range of 0.001 mM to 0.1 mM, As shown in FIG. 5, the activity of lysine decarboxylase (LDC) was measured. As the IPTG treatment concentration was lowered to 0.1 mM or less, the conversion of cadaverine was high, that is, the enzyme activity was high. Especially, when the whole cells of ldcC-containing E. coli treated with 0.05 mM IPTG were used as a biocatalyst, the conversion effect of cadaverine was excellent.

상기 실시예 3 및 실시예 4의 결과를 통해, 최종농도 0.001 mM 내지 0.1 mM 범위의 낮은 농도의 IPTG를 처리하여 ldcC가 재조합된 E. coli 균체, E. coli BL21(DE3) pET24ma의 ldcC 발현 유도시, IPTG 처리 농도가 낮아질수록 가용성(soluble) 형태의 ldcC 단백질 발현량이 증가하고, 이에 따라 0.1 mM 이하의 낮은 농도의 IPTG, 특히 0.05 mM의 IPTG를 처리한 E. coli 전세포를 생촉매로 사용함으로써, 기질인 리신으로부터 카다베린을 효율적으로 전환, 즉 전세포 반응(whole cell reaction)을 통해 카다베린을 효율적으로 제조할 수 있음을 알 수 있었다. From the results of Examples 3 and 4, IPTG at a final concentration ranging from 0.001 mM to 0.1 mM was treated to induce ldcC expression of ldcC recombinant E. coli , E. coli BL21 (DE3) pET24ma As the concentration of IPTG treatment decreased, the soluble form of ldcC protein increased. Thus, all of the E. coli cells treated with IPTG at a low concentration of 0.1 mM or less, especially 0.05 mM IPTG, , It was found that cadaverine can efficiently be produced from lysine, which is a substrate, through efficient conversion of cadaverine, that is, whole cell reaction.

실시예Example 5: 다양한 온도 조건에 따른 5: Depending on various temperature conditions 전세포Whole cell 생촉매를The biocatalyst 이용한 리신으로부터 카다베린의 전환 효과 Conversion effect of lysine to cadaverine

상기 실시예 4에서 0.1 mM 이하의 낮은 농도의 IPTG, 특히 0.005 mM의 IPTG를 처리한 E. coli 전세포를 생촉매로 사용하여 기질인 리신으로부터 카다베린으로의 전환 효과가 우수함을 확인하였다.In Example 4, it was confirmed that the effect of lysine to cadaverine, which is a substrate, was excellent using all cells of E. coli treated with IPTG at a low concentration of 0.1 mM or less, particularly 0.005 mM IPTG.

이에, 리신으로부터 카다베린을 생산하기 위한 생촉매로서 낮은 농도의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 전세포를 이용하여 카다베린을 제조하는 데 있어서, 최적의 카다베린 생산 공정을 구축하고자 다양한 온도 조건에서 카다베린의 생산성 증대 정도를 확인하였다.Therefore, in order to produce cadaverine using all cells of ldcC-treated E. coli cells treated with a low concentration of IPTG as a biocatalyst for producing cadaverine from lysine, And the productivity increase of cadaverine was confirmed.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조한 ldcC가 재조합된 E. coli 균주, E.coli BL21(DE3) pET24ma ldcC를 250 ㎖ 용량의 배플(baffle) 타입 배양기에 준비된 50 ㎖의 LB 배지에 접종하여 200 rpm, 30℃에서 12시간 동안 배양하였다. 이때, E.coli 균주의 OD₆₀₀ 값이 0.5에 도달하였을 때, IPTG를 최종농도 0.005 mM로 처리하였다. Specifically, in Example 1 by the ldcC it is inoculated into LB medium 50 ㎖ prepared a recombinant E. coli strain, E.coli BL21 (DE3) pET24ma ldcC a baffle (baffle) the type of incubator 250 ㎖ production capacity at 200 rpm, 30 < 0 > C for 12 hours. At this time, when the OD ₆₀₀ value of the E. coli strain reached 0.5, IPTG was treated to a final concentration of 0.005 mM.

다양한 온도 조건에서의 카다베린의 생산성 증대 정도를 확인하기 위한 전세포 반응(whole cell reaction)은, 생촉매로서 상기와 같이 IPTG를 처리하여 배양된 세포를 전체 반응 부피(total reaction volume; 1.5 ㎖)의 4%(v/v)[5 g/L]가 되도록 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 옮긴 후, 기질인 0.1 M의 리신(L-lysine), 완충용액인 500 mM의 소듐 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer, pH6) 및 조효소인 0.1 mM의 PLP(pyridoxal 5-phosphate)를 첨가하여 잘 혼합시킨 뒤, 각각 37℃, 40℃, 45℃, 52℃, 55℃, 60℃, 65℃의 온도 조건에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 2시간 후, 반응액은 100℃에서 10분간 방치하여 반응을 종료시키고, 리신과 카다베린 농도 측정 전까지 반응액의 변성을 막기 위해 4℃에 보관하였다.The whole cell reaction for confirming the degree of increase in the productivity of cadaverine under various temperature conditions was carried out in the same manner as in Example 1 except that the cells cultured by treating IPTG as a biocatalyst as described above were added to a total reaction volume (1.5 ml) Lysine was added to the eppendorf tube to a concentration of 4% (v / v) [5 g / L] of L-lysine in a buffer of 500 mM sodium acetate buffer acetate buffer (pH 6) and 0.1 mM PLP (pyridoxal 5-phosphate) as coenzyme were added and mixed well. The mixture was incubated at 37 ° C, 40 ° C, 45 ° C, 52 ° C, 55 ° C, 60 ° C and 65 ° C For 2 hours. After 2 hours of the reaction, the reaction solution was allowed to stand at 100 占 폚 for 10 minutes to terminate the reaction and kept at 4 占 폚 to prevent denaturation of the reaction solution until lysine and cadaverine concentration were measured.

리신으로부터 카다베린을 생산하기 위한 생촉매로서 저농도의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 전세포를 이용하여 카다베린을 제조하는 데 있어서, 최적의 카다베린 생산 공정을 구축하고자 다양한 온도 조건에서 카다베린의 생산성 증대 정도를 확인해 본 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 40℃~55℃의 넓은 범위의 온도 조건에서 높은 효율로 카다베린 전환이 가능함을 확인하였다. 특히, 52℃의 온도 조건에서 카다베린 생산성이 현저하게 증대됨을 알 수 있었다.In order to produce cadaverine using ldcC whole cell E. coli treated with low concentration of IPTG as a biocatalyst to produce cadaverine from lysine, in order to construct optimal cadaverine production process, cadaverine As a result, it was confirmed that cadarin conversion can be performed with high efficiency at a wide temperature range of 40 ° C to 55 ° C as shown in FIG. In particular, it was found that the productivity of cadaverine was remarkably increased at a temperature of 52 ° C.

실시예Example 6: 6: 완충용액의Buffer solution 다양한 pH 조건에 따른 Depending on various pH conditions 전세포Whole cell 생촉매를The biocatalyst 이용한 리신으로부터 카다베린의 전환 효과 Conversion effect of lysine to cadaverine

상기 실시예 4에서 0.1 mM 이하의 낮은 농도의 IPTG, 특히 0.005 mM의 IPTG를 처리한 E. coli 전세포를 생촉매로 사용하여 기질인 리신으로부터 카다베린으로의 전환 효과가 우수함을 확인하였다. 또한, 상기 실시예 5에서 52℃의 온도 조건에서 카다베린 생산성이 현저하게 증대됨을 확인하였다.In Example 4, it was confirmed that the effect of lysine to cadaverine, which is a substrate, was excellent using all cells of E. coli treated with IPTG at a low concentration of 0.1 mM or less, particularly 0.005 mM IPTG. Further, it was confirmed that the productivity of cadaverine was remarkably increased at the temperature of 52 ° C in Example 5 above.

이에, 리신으로부터 카다베린을 생산하기 위한 생촉매로서 낮은 농도의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 전세포를 이용하여 카다베린을 제조하는 데 있어서, 최적의 카다베린 생산 공정을 구축하고자 완충용액의 다양한 pH 조건 및 최적의 온도 조건인 52℃ 온도 조건하에서 카다베린의 생산성 증대 정도를 확인하였다.Therefore, in order to produce cadaverine using all ldcC-containing E. coli cells treated with a low concentration of IPTG as a biocatalyst for producing cadaverine from lysine, in order to construct an optimal cadaverine production process, The degree of increase in the productivity of cadaverine was confirmed under various pH conditions and temperature conditions of 52 ° C which is the optimum temperature condition.

완충용액의 다양한 pH 조건에서의 카다베린의 생산성 증대 정도를 확인하기 위한 전세포 반응(whole cell reaction)은, 생촉매로서 상기와 같이 IPTG를 처리하여 배양된 세포를 전체 반응 부피(total reaction volume; 1.5 ㎖)의 4%(v/v)[5 g/L]가 되도록 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 옮긴 후, 기질인 0.1 M의 리신(L-lysine), 완충용액인 500 mM의 소듐 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer, pH6) 및 조효소인 0.1 mM의 PLP(pyridoxal 5-phosphate)를 첨가하여 잘 혼합시킨 뒤, 10N HCl을 이용하여 각각 pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, pH 9, pH 10의 다양한 pH 조건으로 적정하였다. 적정 후, 52℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 2시간 후, 반응액은 100℃에서 10분간 방치하여 반응을 종료시키고, 리신과 카다베린 농도 측정 전까지 반응액의 변성을 막기 위해 4℃에 보관하였다.The whole cell reaction for confirming the degree of increase in the productivity of cadaverine at various pH conditions of the buffer solution was performed by using IPTG as a biocatalyst as described above to measure the total reaction volume of the cultured cells. 1.5 ml) was transferred to an eppendorf tube so as to have a concentration of 4% (v / v) [5 g / L], and then 0.1 M of L-lysine as a substrate, 500 mM of sodium acetate PH 8, pH 7, pH 8, pH 8, and 10 mM HCl were added to the wells, followed by addition of sodium acetate buffer (pH 6) and 0.1 mM pyridoxal 5-phosphate (PLP) pH 9 and pH 10, respectively. After titration, reaction was carried out at 52 캜 for 2 hours. After 2 hours of the reaction, the reaction solution was allowed to stand at 100 占 폚 for 10 minutes to terminate the reaction and kept at 4 占 폚 to prevent denaturation of the reaction solution until lysine and cadaverine concentration were measured.

리신으로부터 카다베린을 생산하기 위한 생촉매로서 저농도의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 전세포를 이용하여 카다베린을 제조하는 데 있어서, 최적의 카다베린 생산 공정을 구축하고자 완충용액의 다양한 pH 조건 및 최적의 온도 조건인 52℃ 온도 조건하에서 카다베린의 생산성 증대 정도를 확인해 본 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, pH 6~pH 9의 넓은 범위의 pH 조건에서 높은 효율로 카다베린 전환이 가능함을 확인하였다. In order to produce cadaverine using ldcC whole cell E. coli cells treated with IPTG at a low concentration as a biocatalyst to produce cadaverine from lysine, various pH conditions of the buffer solution And the degree of increase in the productivity of cadaverine under the temperature condition of 52 ° C. which is the optimum temperature condition was checked. As a result, as shown in FIG. 7, it is possible to switch the cadaverine with high efficiency under a wide pH range of pH 6 to pH 9 Respectively.

특히, pH 6의 약산성 조건에서 카다베린 생산성이 우수함을 알 수 있었으며, 이로써 리신으로부터 카다베린 전환시 탈카르복실화 반응(decarboxylation)에 의해 상승하는 pH 조절을 위해 반응액에 투입하여야 하는 산의 양을 줄일 수 있고, 이에 따른 반응으로써 생성되는 염을 제거하기 위해 이용되는 이온교환수지 공정, 재결정과 같은 정제공정을 최소화할 수 있으므로 카다베린의 생산단가를 절감할 수 있다.Particularly, it was found that the productivity of cadaverine was excellent under a weakly acidic condition of pH 6, whereby the amount of acid to be added to the reaction solution for pH control by decarboxylation upon conversion of cadaverine from lysine And the purification process such as the ion exchange resin process and the recrystallization process used to remove the salt generated by the reaction can be minimized, so that the production cost of the cadaverine can be reduced.

실시예Example 7: 리신으로부터 카다베린 생산을 위한 7: for production of cadaverine from lysine 생촉매로서의As a biocatalyst ldcCldCC 보유 possesion E.coliE. coli 균주의 세포농도 조건에 따른 카다베린 전환 속도 증대 효과 Increase of conversion rate of cadaverine according to cell concentration condition of strain

상기 실시예 4 내지 실시예 6에서 0.1 mM 이하의 낮은 농도의 IPTG, 특히 0.005 mM의 IPTG를 처리한 E. coli 전세포를 생촉매로 사용하여 기질인 리신으로부터 카다베린으로의 전환율이 높고, 52℃의 온도 조건 및 pH 6의 약산성 조건에서 카다베린 생산성이 우수함을 확인하였다. Using the whole cell of E. coli treated with IPTG at a low concentration of 0.1 mM or less, especially 0.005 mM of IPTG in Examples 4 to 6, the conversion rate from the substrate lysine to cadaverine was high, and 52 C and a weak acidic condition of pH 6.

이에, 카다베린 전환 효율성을 평가하고자 리신으로부터 카다베린을 생산하기 위한 최적의 조건인 52℃의 온도 및 pH 6의 약산성 조건에서, 낮은 농도의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 균주의 세포농도에 따른 카다베린 초기 전환 속도를 전세포 반응을 통해 확인하였다.In order to evaluate the conversion efficiency of cadaverine, the cell concentration of ldcC-containing E. coli strain treated with IPTG at a low concentration at a temperature of 52 ° C and a weak acidic condition of pH 6, which is an optimal condition for producing cadaverine from lysine, The initial conversion rate of cadaverine was confirmed by whole cell reaction.

낮은 농도의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 균주의 세포농도에 따른 카다베린 초기 전환 속도 증대 정도를 확인하기 위한 전세포 반응(whole cell reaction)은, 생촉매로서 상기와 같이 IPTG를 처리하여 배양된 세포를 전체 반응 부피(total reaction volume; 1.5 ㎖)의 4%(v/v)가 되도록 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 옮긴 후, 기질인 0.1 M의 리신(L-lysine), 완충용액인 500 mM의 소듐 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer, pH6) 및 조효소인 0.1 mM의 PLP(pyridoxal 5-phosphate)를 첨가하여 잘 혼합시킨 뒤, 10N HCl을 이용하여 pH 6으로 적정하였다. 적정 후, 52℃에서 30분 동안 반응하여 카다베린 초기 전환 속도를 확인하였다. 이때, 전체 반응 부피의 4%(v/v)가 되도록 에펜도르프 튜브에 옮겨 담은 세포의 농도는 각각 5g/L(OD₆₀₀을 기준으로 OD₆₀₀=1.2), 7.5g/L(OD₆₀₀을 기준으로 OD₆₀₀=2), 15g/L(OD₆₀₀을 기준으로 OD₆₀₀=2.8)가 되도록 맞추었다. 반응 30분 후, 반응액은 100℃에서 10분간 방치하여 반응을 종료시키고, 리신과 카다베린 농도 측정 전까지 반응액의 변성을 막기 위해 4℃에 보관하였다.The whole cell reaction for confirming the degree of increase of the initial conversion rate of cadaverine according to the cell concentration of the ldcC-containing E. coli strain treated with IPTG at a low concentration was performed by culturing the IPTG as the biocatalyst The cells were transferred to an eppendorf tube to be 4% (v / v) of the total reaction volume (1.5 ml), and then lysine (L-lysine) 500 mM sodium acetate buffer (pH 6) and 0.1 mM PLP (pyridoxal 5-phosphate) as coenzyme were added, mixed well and titrated to pH 6 with 10N HCl. After titration, the reaction was carried out at 52 캜 for 30 minutes to confirm the initial conversion rate of cadaverine. At this time, 4% of the reaction volume (v / v) concentration of cells containing transferred to Eppendorf tubes such that is based _{on, 7.5g / L (OD 600 (} OD 600 = 1.2 relative to the OD ₆₀₀₎ 5g / L respectively, by OD ₆₀₀ = 2), was adjusted such that the OD ₆₀₀ = 2.8) on the basis of 15g / L (OD _600. After 30 minutes of reaction, the reaction solution was allowed to stand at 100 占 폚 for 10 minutes to terminate the reaction, and kept at 4 占 폚 to prevent denaturation of the reaction solution until lysine and cadaverine concentration were measured.

카다베린 전환 효율성을 평가하고자 리신으로부터 카다베린을 생산하기 위한 최적의 조건인 52℃의 온도 및 pH 6의 약산성 조건에서, 낮은 농도의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 균주의 세포농도에 따른 카다베린 초기 전환 속도 증대 정도를 확인해 본 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 세포농도가 높아질수록 카다베린 초기 전환 속도가 증가함을 확인하였으며, 이에 시간 대비 카다베린 전환 효율성이 우수함을 알 수 있었다. In order to evaluate the conversion efficiency of cadaverine, it was found that, at a temperature of 52 ° C and a mild acidic condition of pH 6, which is an optimal condition for producing cadaverine from lysine, Kada according to the cell concentration of ldcC-containing E. coli strains treated with a low concentration of IPTG As shown in FIG. 8, it was confirmed that the initial conversion rate of cadaverine increased as the cell concentration was increased. Thus, it was found that the conversion efficiency of cadaverine over time was excellent.

실시예Example 8: 피리독살-5-인산( 8: Pyridoxal-5-phosphate ( pyridoxalpyridoxal 5-phosphate, 5-phosphate, PLPPLP )의 다양한 농도 조건에 따른 ) According to various concentration conditions 전세포Whole cell 생촉매를The biocatalyst 이용한 리신으로부터 카다베린의 전환 효과 Conversion effect of lysine to cadaverine

이에, 리신으로부터 카다베린을 생산하기 위한 생촉매로서 낮은 농도의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 전세포를 이용하여 카다베린을 제조하는 데 있어서, 최적의 카다베린 생산 공정을 구축하고자 조효소인 피리독살-5-인산(pyridoxal 5-phosphate, PLP)의 다양한 농도 조건 및, 최적의 조건인 52℃의 온도와 pH 6의 약산성 조건하에서 카다베린의 생산성 증대 정도를 확인하였다.Therefore, in order to produce cadaverine using all ldcC-containing E. coli cells treated with IPTG at a low concentration as a biocatalyst for production of cadaverine from lysine, The degree of increase in productivity of cadaverine was confirmed under various concentration conditions of pyridoxal 5-phosphate (PLP) and at acidic conditions of 52 ° C and pH 6, which are optimum conditions.

조효소인 피리독살-5-인산(pyridoxal 5-phosphate, PLP)의 다양한 농도 조건에서의 카다베린의 생산성 증대 정도를 확인하기 위한 전세포 반응(whole cell reaction)은, 생촉매로서 상기와 같이 IPTG를 처리하여 배양된 세포를 전체 반응 부피(total reaction volume; 1.5 ㎖)의 4%(v/v)[5 g/L]가 되도록 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 옮긴 후, 기질인 0.1 M의 리신(L-lysine), 완충용액인 500 mM의 소듐 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer, pH6) 및 조효소인 PLP(pyridoxal 5-phosphate)를 각각 1.0 μM, 2.5 μM, 5.0 μM, 7.5 μM, 10.0 μM, 100.0 μM의 농도로 첨가하여 잘 혼합시킨 뒤, 10N HCl을 이용하여 pH 6으로 적정하였다. 적정 후, 52℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 2시간 후, 반응액은 100℃에서 10분간 방치하여 반응을 종료시키고, 리신과 카다베린 농도 측정 전까지 반응액의 변성을 막기 위해 4℃에 보관하였다.The whole cell reaction for confirming the degree of increase of the productivity of cadaverine at various concentration conditions of the coenzyme pyridoxal-5-phosphate (PLP) The cultured cells were transferred to an eppendorf tube so as to have a 4% (v / v) [5 g / L] of the total reaction volume (1.5 ml) 2.5 μM, 5.0 μM, 7.5 μM, 10.0 μM, and 100.0 mM of L-lysine, 500 mM sodium acetate buffer (pH 6) and pyridoxal 5-phosphate PLP μM, mixed well, and titrated to pH 6 with 10 N HCl. After titration, reaction was carried out at 52 캜 for 2 hours. After 2 hours of the reaction, the reaction solution was allowed to stand at 100 占 폚 for 10 minutes to terminate the reaction and kept at 4 占 폚 to prevent denaturation of the reaction solution until lysine and cadaverine concentration were measured.

리신으로부터 카다베린을 생산하기 위한 생촉매로서 저농도의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 전세포를 이용하여 카다베린을 제조하는 데 있어서, 최적의 카다베린 생산 공정을 구축하고자 조효소인 피리독살-5-인산(pyridoxal 5-phosphate, PLP)의 다양한 농도 조건 및 최적의 조건인 52℃의 온도와 pH 6의 약산성 조건하에서 카다베린의 생산성 증대 정도를 확인해 본 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 값비싼 조효소인 PLP의 농도를 100.0 μM에서 2.5 μM까지 감소시켜도 높은 카다베린 전환 효율을 가짐을 확인하였다. 이에, 값비싼 조효소인 PLP의 사용량을 절감하여도 카다베린 생산성이 우수하므로, 카다베린 제조 비용을 줄일 수 있음을 알 수 있었다. In order to produce cadaverine using ldcC whole E. coli cells treated with IPTG at a low concentration as a biocatalyst to produce cadaverine from lysine, pyridoxal-5 -Pyridoxal 5-phosphate (PLP), and the degree of increase in the productivity of cadaverine under the conditions of 52 ° C and pH 6, which are optimum conditions, were examined. As a result, as shown in FIG. 9, It was confirmed that even when the concentration of coenzyme PLP was decreased from 100.0 μM to 2.5 μM, the conversion efficiency of cadarin was high. Therefore, it was found that the cost of manufacturing catavellin can be reduced because the productivity of cadaverine is excellent even if the amount of PLP, which is a costly coenzyme, is reduced.

실시예Example 9: 기질인 리신의 다양한 농도 조건에 따른 9: According to various concentration conditions of substrate lysine 전세포Whole cell 생촉매를The biocatalyst 이용한 고농도 카다베린의 생산 효과 Production effect of high concentration cadaverine used

이에, 리신으로부터 카다베린을 생산하기 위한 생촉매로서 낮은 농도의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 전세포를 이용하여 카다베린을 제조하는 데 있어서, 최적의 카다베린 생산 공정을 구축하여 고농도의 카다베린을 제조하고자 기질인 리신의 다양한 농도 조건 및, 최적의 조건인 52℃의 온도와 pH 6의 약산성 조건하에서 카다베린 생성 정도를 확인하였다. 이때, 리신은 용액 상태의 산업용 리신 염산염(L-lysine monohydrochloride)을 이용하였다.Therefore, in the production of cadaverine using all ldcC-containing E. coli cells treated with a low concentration of IPTG as a biocatalyst for production of cadaverine from lysine, an optimal cadaverine production process was established, In order to prepare berin, the degree of production of cadaverine was confirmed under various concentration conditions of lysine as a substrate and under a mild acidic condition of 52 ° C and pH 6, which are optimum conditions. Lysine used L-lysine monohydrochloride in solution.

기질인 리신의 다양한 농도 조건에서의 카다베린의 생산성 증대 정도를 확인하기 위한 전세포 반응(whole cell reaction)은, 생촉매로서 상기와 같이 IPTG를 처리하여 배양된 세포를 전체 반응 부피(total reaction volume; 1.5 ㎖)의 4%(v/v)[5 g/L]가 되도록 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 옮긴 후, 각각 0.1 M, 0.6 M, 1 M 농도의 리신염(L-lysine HCl)과 완충용액인 500 mM의 소듐 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer, pH6) 및 조효소인 0.1 mM의 PLP(pyridoxal 5-phosphate)를 첨가하여 잘 혼합시킨 뒤, 10N HCl을 이용하여 pH 6으로 적정하였다. 적정 후, 52℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 반응 동안, 1시간 단위로 반응액을 채취하여 100℃에서 10분간 방치하여 반응을 종료시키고, 리신과 카다베린 농도 측정 전까지 반응액의 변성을 막기 위해 4℃에 보관하였다.The whole cell reaction for confirming the degree of productivity increase of cadaverine at various concentration conditions of lysine, which is a substrate, was performed by using IPTG as a biocatalyst, as described above, and the cells were cultured in a total reaction volume L-lysine HCl at a concentration of 0.1 M, 0.6 M, and 1 M, respectively, after transferring the cells to an eppendorf tube so as to have a concentration of 4% (v / v) [5 g / , 500 mM sodium acetate buffer (pH 6) and 0.1 mM PLP (pyridoxal 5-phosphate) as a buffer were mixed well and the mixture was titrated to pH 6 with 10 N HCl. After titration, reaction was carried out at 52 캜 for 6 hours. During the reaction, the reaction solution was sampled for 1 hour and left at 100 캜 for 10 minutes to terminate the reaction. The reaction solution was stored at 4 캜 to prevent denaturation of the reaction solution until measurement of lysine and cadaverine concentration.

리신으로부터 카다베린을 생산하기 위한 생촉매로서 저농도의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 전세포를 이용하여 카다베린을 제조하는 데 있어서, 최적의 카다베린 생산 공정을 구축하여 고농도의 카다베린을 제조하고자 기질인 리신의 다양한 농도 조건 및, 최적의 조건인 52℃의 온도와 pH 6의 약산성 조건하에서 카다베린 생성 정도를 확인해 본 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 기질의 농도가 높아질수록 같은 시간 내에 기질로서 사용한 용액 상태의 산업용 리신 염산염(L-lysine monohydrochloride)을 카다베린으로 전환할 수 있는 효율이 증가함을 확인하였다. 이에 따라 기질의 양을 증가시킴에 따라 고농도의 카다베린을 생성할 수 있음을 알 수 있었다.In the manufacturing of the cadaverine by using a low concentration of IPTG ldcC hold a handle of the E. coli whole cell biocatalyst as to produce cadaverine from lysine, producing a high concentration of cadaverine to establish optimal cadaverine production process As shown in FIG. 10, the concentration of lysine was found to be within the same time as the concentration of lysine was increased, and the degree of formation of cadaverine was examined under the optimum condition of 52 ° C and weak acidic condition of pH 6 Lysine monohydrochloride (L-lysine monohydrochloride) as a substrate was increased. Thus, it was found that high concentration of cadaverine can be produced by increasing the amount of the substrate.

실시예Example 10: 고농도의 리신으로부터 카다베린 생산을 위한 10: for the production of cadaverine from high concentrations of lysine 생촉매로서의As a biocatalyst ldcCldCC 보유 possesion E.coliE. coli 균주의 세포농도에 따른 고농도 카다베린의 생산 효과 Production effect of high concentration of cadaverine according to the cell concentration of the strain

상기 실시예 4 내지 실시예 6에서 0.1 mM 이하의 낮은 농도의 IPTG, 특히 0.005 mM의 IPTG를 처리한 E. coli 전세포를 생촉매로 사용하여 기질인 리신으로부터 카다베린으로의 전환율이 높고, 52℃의 온도 조건 및 pH 6의 약산성 조건에서 카다베린 생산성이 우수함을 확인하였다. 또한, 상기 실시예 9에서 기질의 농도가 높아질수록 같은 시간 내에 기질로서 사용한 용액 상태의 산업용 리신 염산염(L-lysine monohydrochloride)을 카다베린으로 전환할 수 있는 효율이 증가함을 확인하였다.Using the whole cell of E. coli treated with IPTG at a low concentration of 0.1 mM or less, especially 0.005 mM of IPTG in Examples 4 to 6, the conversion rate from the substrate lysine to cadaverine was high, and 52 C and a weak acidic condition of pH 6. Further, it was confirmed that as the concentration of the substrate was increased in Example 9, the efficiency of converting L-lysine monohydrochloride in solution as a substrate into cadaverine was increased within the same time.

이에, 최적의 카다베린 생산 공정을 구축하여 고농도의 카다베린을 제조하고자 카다베린을 생산하기 위한 최적의 조건인 52℃의 온도와 pH 6의 약산성 조건하에서, 낮은 농도의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 균주의 세포농도에 따른 고농도의 리신으로부터 전환되는 카다베린의 생성 정도를 확인하였다. 이때, 리신은 용액 상태의 산업용 리신 염산염(L-lysine monohydrochloride)을 이용하였다.In order to produce cadaverine at a high concentration by constructing optimal cadaverine production process, it was found that a low concentration IPTG treated ldcC possessing E ( C) at a temperature of 52 ° C and a weak acidic condition of pH 6 . it confirmed the creation of a degree of cadaverine is switched from the high concentration of lysine in accordance with the cell density of the coli strain. Lysine used L-lysine monohydrochloride in solution.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조한 ldcC가 재조합된 E. coli 균주, E.coli BL21(DE3) pET24ma ldcC를 250 ㎖ 용량의 배플(baffle) 타입 배양기에 준비된 50 ㎖의 LB 배지에 접종하여 200 rpm, 30℃에서 12시간 동안 배양하였다. 이때, E.coli 균주의 OD₆₀₀ 값이 0.5에 도달하였을 때, IPTG를 최종농도 0.005 mM로 처리하였다.Specifically, in Example 1 by the ldcC it is inoculated into LB medium 50 ㎖ prepared a recombinant E. coli strain, E.coli BL21 (DE3) pET24ma ldcC a baffle (baffle) the type of incubator 250 ㎖ production capacity at 200 rpm, 30 < 0 > C for 12 hours. At this time, when the OD ₆₀₀ value of the E. coli strain reached 0.5, IPTG was treated to a final concentration of 0.005 mM.

낮은 농도의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 균주의 세포농도에 따른 고농도의 리신으로부터 전환되는 카다베린의 생성 정도를 확인하기 위한 전세포 반응(whole cell reaction)은, 생촉매로서 상기와 같이 IPTG를 처리하여 배양된 세포를 전체 반응 부피(total reaction volume; 1.5 ㎖)의 4%(v/v)가 되도록 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 옮긴 후, 1 M의 고농도의 리신염(L-lysine HCl)과 완충용액인 500 mM의 소듐 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer, pH6) 및 조효소인 0.1 mM의 PLP(pyridoxal 5-phosphate)를 첨가하여 잘 혼합시킨 뒤, 10N HCl을 이용하여 pH 6으로 적정하였다. 적정 후, 52℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 이때, 전체 반응 부피의 4%(v/v)가 되도록 에펜도르프 튜브에 옮겨 담은 세포의 농도는 각각 5g/L(OD₆₀₀을 기준으로 OD₆₀₀=1.2), 7.5g/L(OD₆₀₀을 기준으로 OD₆₀₀=2), 17g/L(OD₆₀₀을 기준으로 OD₆₀₀=4)가 되도록 맞추었다. 반응 동안, 1시간 단위로 반응액을 채취하여 100℃에서 10분간 방치하여 반응을 종료시키고, 리신과 카다베린 농도 측정 전까지 반응액의 변성을 막기 위해 4℃에 보관하였다.The whole cell reaction for confirming the degree of production of cadaverine converted from lysine at a high concentration according to the cell concentration of the ldcC-bearing E. coli strain treated with IPTG at a low concentration was carried out by using IPTG , And the cultured cells were transferred to an eppendorf tube so as to have a concentration of 4% (v / v) of the total reaction volume (1.5 ml), and the cells were treated with 1 M high-concentration lysine HCl), 500 mM sodium acetate buffer (pH 6), and 0.1 mM PLP (pyridoxal 5-phosphate) as a buffer were mixed well, and the mixture was titrated to pH 6 with 10N HCl . After titration, reaction was carried out at 52 캜 for 6 hours. At this time, 4% of the reaction volume (v / v) concentration of cells containing transferred to Eppendorf tubes such that is based _{on, 7.5g / L (OD 600 (} OD 600 = 1.2 relative to the OD ₆₀₀₎ 5g / L respectively, by OD ₆₀₀ = 2), was adjusted so that _{17g / L (OD 600 = 4} ) , based on the OD _600. During the reaction, the reaction solution was sampled for 1 hour and left at 100 캜 for 10 minutes to terminate the reaction. The reaction solution was stored at 4 캜 to prevent denaturation of the reaction solution until measurement of lysine and cadaverine concentration.

최적의 카다베린 생산 공정을 구축하여 고농도의 카다베린을 제조하고자 카다베린을 생산하기 위한 최적의 조건인 52℃의 온도와 pH 6의 약산성 조건하에서, 낮은 농도의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 균주의 세포농도에 따른 고농도의 리신으로부터 전환되는 카다베린의 생성 정도를 확인해 본 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 세포농도가 높아질수록 같은 시간 내에 기질로서 사용한 1 M의 용액 상태의 산업용 리신 염산염(L-lysine monohydrochloride)을 카다베린으로 전환할 수 있는 효율이 증가함을 확인하였다. 이에 따라 생촉매로서 E. coli 전세포의 세포농도를 증가시킴에 따라 고농도의 카다베린을 생성할 수 있음을 알 수 있었다. Under optimum cadaverine production process optimum temperature and slightly acidic condition of pH 6 of 52 ℃ conditions for the production of cadaverine to prepare a high concentration of cadaverine to build up, holding ldcC treated with low levels of IPTG E. coli As shown in FIG. 11, when the cell concentration was increased, the concentration of the lysine-induced industrial lysine hydrochloride (hereinafter referred to as " lysine hydrochloride " L-lysine monohydrochloride) to cadaverine was increased. As a result, it was found that high concentration of cadaverine could be produced by increasing the cell concentration of whole cell of E. coli as a biocatalyst.

실시예Example 11: 11: 저순도의Low-purity 크루드Crud 리신(crude lysine) 기질의 다양한 농도 조건에 따른 전세포 생촉매를 이용한 고농도 카다베린의 생산 효과 Production of high concentration of cadaverine by whole cell biocatalysts under various concentration conditions of crude lysine substrate

상기 실시예 4 내지 실시예 6에서 0.1 mM 이하의 낮은 농도의 IPTG, 특히 0.005 mM의 IPTG를 처리한 E. coli 전세포를 생촉매로 사용하여 기질인 리신으로부터 카다베린으로의 전환율이 높고, 52℃의 온도 조건 및 pH 6의 약산성 조건에서 카다베린 생산성이 우수함을 확인하였다. 또한, 상기 실시예 9에서 고순도의 산업용 리신 염산염(L-lysine monohydrochloride) 기질의 양을 증가시킴에 따라 카다베린으로 전환할 수 있는 효율이 증가함을 확인하였다. Using the whole cell of E. coli treated with IPTG at a low concentration of 0.1 mM or less, especially 0.005 mM of IPTG in Examples 4 to 6, the conversion rate from the substrate lysine to cadaverine was high, and 52 C and a weak acidic condition of pH 6. In addition, it was confirmed that the efficiency to convert to cadaverine was increased by increasing the amount of high-purity L-lysine monohydrochloride substrate in Example 9 above.

이에, 리신으로부터 카다베린을 생산하기 위한 생촉매로서 낮은 농도의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 전세포를 이용하여 카다베린을 제조하는 데 있어서, 경제적으로 최적의 카다베린 생산 공정 구축을 통해 고농도의 카다베린을 제조하고자 저순도의 크루드 리신(crude lysine) 기질의 다양한 농도 조건 및, 최적의 조건인 52℃의 온도와 pH 6의 약산성 조건하에서 카다베린 생성 정도를 확인하였다. 이때, 리신은 용액 상태의 크루드 리신(제조사 대상, 순도 50%)을 이용하였다.Thus, in the production of cadaverine using the whole cells of ldcC-treated E. coli cells treated with a low concentration of IPTG as a biocatalyst for producing cadaverine from lysine, The degree of formation of cadaverine was determined under various conditions of low purity crude lysine substrate and at a temperature of 52 ° C, which is an optimal condition, and a weak acidic condition, pH 6, in order to produce cadaverine. At this time, lysine was used in the form of solution of crude lysine (manufacturer, purity: 50%).

저순도의 크루드 리신(crude lysine) 기질의 다양한 농도 조건에서의 카다베린의 생산성 증대 정도를 확인하기 위한 전세포 반응(whole cell reaction)은, 생촉매로서 상기와 같이 IPTG를 처리하여 배양된 세포를 전체 반응 부피(total reaction volume; 1.5 ㎖)의 4%(v/v)[5g/L(OD₆₀₀을 기준으로 OD₆₀₀=1.2)]가 되도록 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 옮긴 후, 각각 0.1 M, 0.6 M, 1 M 농도의 크루드 리신과 완충용액인 500 mM의 소듐 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer, pH6) 및 조효소인 0.1 mM의 PLP(pyridoxal 5-phosphate)를 첨가하여 잘 혼합시킨 뒤, 10N HCl을 이용하여 pH 6으로 적정하였다. 적정 후, 52℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 반응 동안, 1시간 단위로 반응액을 채취하여 100℃에서 10분간 방치하여 반응을 종료시키고, 리신과 카다베린 농도 측정 전까지 반응액의 변성을 막기 위해 4℃에 보관하였다.The whole cell reaction for confirming the degree of increase in the productivity of cadaverine at various concentrations of a crude lysine substrate of low purity is performed by culturing cells cultured by treating IPTG as a biocatalyst as described above the total reaction volume; 4% (total reaction volume 1.5 ㎖) ( v / v) was transferred to Eppendorf tubes (eppendorf tube) such that [(the OD ₆₀₀ = 1.2 relative to the OD ₆₀₀₎ 5g / L], respectively, Crude lysine at concentrations of 0.1 M, 0.6 M and 1 M, 500 mM sodium acetate buffer (pH 6) as a buffer solution and 0.1 mM pyridoxal 5-phosphate as a coenzyme were added and mixed well , And titrated to pH 6 with 10N HCl. After titration, reaction was carried out at 52 캜 for 6 hours. During the reaction, the reaction solution was sampled for 1 hour and left at 100 캜 for 10 minutes to terminate the reaction. The reaction solution was stored at 4 캜 to prevent denaturation of the reaction solution until measurement of lysine and cadaverine concentration.

리신으로부터 카다베린을 생산하기 위한 생촉매로서 낮은 농도의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 전세포를 이용하여 카다베린을 제조하는 데 있어서, 경제적으로 최적의 카다베린 생산 공정 구축을 통해 고농도의 카다베린을 제조하고자 저순도의 크루드 리신(crude lysine) 기질의 다양한 농도 조건 및, 최적의 조건인 52℃의 온도와 pH 6의 약산성 조건하에서 카다베린 생성 정도를 확인해 본 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 저순도의 리신 기질일지라도 기질의 농도가 높아질수록 같은 시간 내에 기질로서 사용한 용액 상태의 크루드 리신(제조사 대상, 순도 50%)을 카다베린으로 전환할 수 있는 효율이 증가함을 확인하였다. 구체적으로는 5g/L의 낮은 농도의 ldcC 보유 E. coli 전세포로 크루드 리신을 최대 400 mM의 카다베린으로 전환할 수 있음을 확인하였다. 이에 따라 저순도의 리신 기질일지라도 기질의 양을 증가시킴에 따라 경제적으로 고농도의 카다베린을 생성할 수 있음을 알 수 있었다.In the manufacturing of the cadaverine using ldcC holding E. coli whole cell treated with lower concentrations of IPTG as a biocatalyst for the production of cadaverine from lysine, economically high concentration of cadaverine by establishing optimum cadaverine production process In order to prepare berlin, the degree of formation of cadaverine under various conditions of low purity crude lysine substrate and under a slightly acidic condition of 52 ° C and pH 6, which are optimum conditions, Likewise, it was confirmed that the efficiency of converting crude lysine (manufactured by the manufacturer, purity: 50%) used as a substrate in the same time to catarrh was increased as the concentration of the substrate increased even at low purity lysine substrate. Specifically, it was confirmed that low concentration of 5 g / L of ldcC-enriched E. coli charcoaldrochloxin could be converted to maximum 400 mM of cadaverine. As a result, it was found that even with a low purity lysine substrate, it is possible to produce cadaverine at an economically high concentration by increasing the amount of the substrate.

실시예Example 12: 고농도의 12: High concentration 저순도Low purity 크루드Crud 리신(crude lysine)으로부터 카다베린 생산을 위한 From crude lysine to cadaverine production 생촉매로서의As a biocatalyst ldcCldCC 보유 possesion E.E. colicoli 균주의 Strain 세포농도에On cell concentration 따른 고농도 High concentration 카다Kada 베린의 생산 효과Production effect of Berin

상기 실시예 4 내지 실시예 6에서 0.1 mM 이하의 낮은 농도의 IPTG, 특히 0.005 mM의 IPTG를 처리한 E. coli 전세포를 생촉매로 사용하여 기질인 리신으로부터 카다베린으로의 전환율이 높고, 52℃의 온도 조건 및 pH 6의 약산성 조건에서 카다베린 생산성이 우수함을 확인하였다. 또한, 상기 실시예 11에서 저순도의 리신 기질일지라도 기질의 농도가 높아질수록 같은 시간 내에 기질로서 사용한 용액 상태의 크루드 리신(제조사 대상, 순도 50%)을 카다베린으로 전환할 수 있는 효율이 증가함을 확인하였다.Using the whole cell of E. coli treated with IPTG at a low concentration of 0.1 mM or less, especially 0.005 mM of IPTG in Examples 4 to 6, the conversion rate from the substrate lysine to cadaverine was high, and 52 C and a weak acidic condition of pH 6. Further, even in the case of the lysine substrate of low purity in Example 11, the efficiency to convert the crude chromosyl lysine (manufactured by the manufacturer, purity of 50%) used as a substrate in the same time as the substrate concentration was increased Respectively.

이에, 경제적으로 최적의 카다베린 생산 공정 구축을 통해 고농도의 카다베린을 제조하고자 카다베린을 생산하기 위한 최적의 조건인 52℃의 온도와 pH 6의 약산성 조건하에서, 낮은 농도의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 균주의 세포농도에 따른 고농도의 저순도 크루드 리신으로부터 전환되는 카다베린의 생성 정도를 확인하였다. 이때, 리신은 용액 상태의 크루드 리신(제조사 대상, 순도 50%)을 이용하였다.Thus, in order to produce cadaverine at a high concentration through economical optimum construction of the cadaverine production process, ldcC treated with a low concentration of IPTG at a temperature of 52 ° C and a weak acidic condition of pH 6, which is an optimal condition for producing cadaverine, The degree of production of cadaverine, which is converted from high purity low purity crude lysine according to the cell concentration of E. coli strains, was confirmed. At this time, lysine was used in the form of solution of crude lysine (manufacturer, purity: 50%).

낮은 농도의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 균주의 세포농도에 따른 고농도의 저순도 크루드 리신으로부터 전환되는 카다베린의 생성 정도를 확인하기 위한 전세포 반응(whole cell reaction)은, 생촉매로서 상기와 같이 IPTG를 처리하여 배양된 세포를 전체 반응 부피(total reaction volume; 1.5 ㎖)의 4%(v/v)가 되도록 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 옮긴 후, 1 M의 고농도의 저순도 크루드 리신과 완충용액인 500 mM의 소듐 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer, pH6) 및 조효소인 0.1 mM의 PLP(pyridoxal 5-phosphate)를 첨가하여 잘 혼합시킨 뒤, 10N HCl을 이용하여 pH 6으로 적정하였다. 적정 후, 52℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 이때, 전체 반응 부피의 4%(v/v)가 되도록 에펜도르프 튜브에 옮겨 담은 세포의 농도는 각각 5g/L(OD₆₀₀을 기준으로 OD₆₀₀=1.2), 7.5g/L(OD₆₀₀을 기준으로 OD₆₀₀=2), 17g/L(OD₆₀₀을 기준으로 OD₆₀₀=4)가 되도록 맞추었다. 반응 동안, 1시간 단위로 반응액을 채취하여 100℃에서 10분간 방치하여 반응을 종료시키고, 리신과 카다베린 농도 측정 전까지 반응액의 변성을 막기 위해 4℃에 보관하였다.The whole cell reaction to determine the degree of production of cadaverine, which is converted from low concentration purity of crude lidocin according to the cell concentration of ldcC-containing E. coli strains treated with low concentrations of IPTG, The IPTG-treated cells were transferred to an eppendorf tube at 4% (v / v) of the total reaction volume (1.5 ml) as described above. Crude lysine and 500 mM sodium acetate buffer (pH 6) and 0.1 mM PLP (pyridoxal 5-phosphate) as buffer solutions were mixed well and mixed with 10N HCl to pH 6 Respectively. After titration, reaction was carried out at 52 캜 for 6 hours. At this time, 4% of the reaction volume (v / v) concentration of cells containing transferred to Eppendorf tubes such that is based _{on, 7.5g / L (OD 600 (} OD 600 = 1.2 relative to the OD ₆₀₀₎ 5g / L respectively, by OD ₆₀₀ = 2), was adjusted so that _{17g / L (OD 600 = 4} ) , based on the OD _600. During the reaction, the reaction solution was sampled for 1 hour and left at 100 캜 for 10 minutes to terminate the reaction. The reaction solution was stored at 4 캜 to prevent denaturation of the reaction solution until measurement of lysine and cadaverine concentration.

경제적으로 최적의 카다베린 생산 공정 구축을 통해 고농도의 카다베린을 제조하고자 카다베린을 생산하기 위한 최적의 조건인 52℃의 온도와 pH 6의 약산성 조건하에서, 낮은 농도의 IPTG를 처리한 ldcC 보유 E. coli 균주의 세포농도에 따른 고농도의 저순도 크루드 리신으로부터 전환되는 카다베린의 생성 정도를 확인해 본 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 세포농도가 높아질수록 같은 시간 내에 기질로서 사용한 1 M의 용액 상태의 저순도 크루드 리신(제조사 대상, 순도 50%)을 카다베린으로 전환할 수 있는 효율이 증가함을 확인하였다. 이에 따라 카다베린 제조시 사용하는 기질이 저순도의 산업용 리신 기질일지라도 생촉매로서 E. coli 전세포의 세포농도를 증가시킴에 따라 경제적으로 고농도의 카다베린을 생성할 수 있음을 알 수 있었다. Under economically optimum cadaverine production processes build the best weakly acidic conditions of 52 ℃ temperature and pH 6 in the condition for the production of cadaverine to prepare a high concentration of cadaverine through, ldcC holding a handle IPTG low concentrations of E the solution of coli After checking the degree of generation of the cadaverine which is converted from a high concentration of low purity crude lysine according to the cell concentration of the strain, 1 M used as a substrate in a cell concentration is higher at the same time as shown in Figure 13 It was confirmed that the efficiency of converting low purity crude lysine (manufacturer, purity 50%) into cadaverine was increased. As a result, it was found that even if the substrate used in the production of cadaverine is an industrially lysine substrate of low purity, high concentration of cadaverine can be produced economically as the cell concentration of whole cells of E. coli is increased as a biocatalyst.

실시예Example 13: 반응 종결 후 회수된 리신 13: Lysine recovered after completion of reaction 탈탄산Decarbonic acid 분해효소 보유 균주를 이용한 카다베린 생산 효과 Effect of production of cadaverine using a strain carrying a degradative enzyme

기질인 리신으로부터 카다베린을 생산하기 위한 생촉매로서, 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)인 cadA 또는 ldcC가 재조합된 E. coli 균주의 재사용 효율을 비교하기 위해, 상기 실시예 1에서 제조한 재조합 E. coli 균주, E.coli BL21(DE3) pET24ma cadA 및 E. coli BL21(DE3) pET24ma ldcC를 250 ㎖ 용량의 배플(baffle) 타입 배양기에 준비된 50 ㎖의 LB 배지에 각각 접종하여 200 rpm, 30℃에서 12시간 동안 배양하였다. 이때, E. coli 균주의 OD₆₀₀ 값이 각각 0.5에 도달하였을 때, cadA가 재조합된 E. coli 균주의 경우 IPTG를 최종농도 0.1 mM로 처리하고, ldcC가 재조합된 E. coli 균주의 경우 IPTG를 최종농도 0.005 mM로 처리하여 cadA 및 ldcC의 발현을 각각 유도하였다.In order to compare the reuse efficiency of E. coli strains recombinant with cadA or ldcC, a lysine decarboxylase (LDC), as a biocatalyst for producing cadaverine from a substrate lysine, One recombinant E. coli E. coli BL21 (DE3) pET24ma cadA and E. coli BL21 (DE3) pET24ma ldcC were inoculated into 50 ml of LB medium prepared in a 250 ml baffle type incubator, Lt; / RTI > At this time, when, in the case of the cadA the case of the recombinant E. coli strain handle IPTG to a final concentration of 0.1 mM and, ldcC the recombinant E. coli strains IPTG the OD ₆₀₀ value of the E. coli strain reached 0.5, respectively CadA and ldcC were induced by treatment with a final concentration of 0.005 mM.

리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)인 cadA 또는 ldcC가 재조합된 E. coli 균주의 재사용 효율을 비교하기 위한 전세포 반응(whole cell reaction)은, 생촉매로서 상기와 같이 IPTG를 처리하여 배양된 세포를 전체 반응 부피(total reaction volume; 1.5 ㎖)의 4%(v/v)[17 g/L]가 되도록 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 옮긴 후, 기질인 0.1 M의 리신(L-lysine), 완충용액인 500 mM의 소듐 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer, pH6) 및 조효소인 0.1 mM의 PLP(pyridoxal 5-phosphate)를 첨가하여 잘 혼합시켰다. 혼합 후, cadA가 재조합된 E.coli 균주의 경우에는 37℃의 온도 조건에서, ldcC가 재조합된 E. coli 균주의 경우에는 52℃의 온도 조건에서 각각 2시간 동안 반응시켰다. 반응 2시간 후, 각각의 반응액을 13,000 rpm, 4℃에서 1분간 원심분리하여 균주를 제외한 상등액을 수집하여 100℃에서 10분간 방치하여 반응을 종료시키고, 리신과 카다베린 농도 측정 전까지 반응액의 변성을 막기 위해 4℃에 보관하였다.The whole cell reaction for comparing the reuse efficiency of the recombinant E. coli strains cadA or ldcC, which is lysine decarboxylase (LDC), was carried out by culturing the IPTG as a biocatalyst The cells were transferred to an eppendorf tube to a concentration of 4% (v / v) [17 g / L] of the total reaction volume (1.5 ml) lysine, 500 mM sodium acetate buffer (pH 6), and 0.1 mM PLP (pyridoxal 5-phosphate) as a coenzyme were mixed well. After mixing, E.coli strains were reacted at a temperature of 37 ℃ for cadA recombinant strain, and for 52 hours at 52 ℃ for 2 hrs in the case of recombinant E. coli strains. After 2 hours of the reaction, each reaction solution was centrifuged at 13,000 rpm at 4 ° C for 1 minute to collect the supernatant except for the strain. The supernatant was collected and left at 100 ° C for 10 minutes to terminate the reaction. And stored at 4 ° C to prevent denaturation.

또한, 상기 상등액을 제외한 cadA 또는 ldcC가 재조합된 각각의 E. coli 균주는, 각 균주의 재사용 효율을 비교하기 위해 상기와 같은 방법으로 전세포 반응(whole cell reaction)을 10회 반복하여 수행하였다.In addition, each of E. coli recombined with cadA or ldcC except for the supernatant In order to compare the efficiency of reuse of each strain, the whole cell reaction was repeated 10 times in the same manner as above.

이후, 상등액의 리신과 카다베린 농도 측정은 디에틸메톡시메틸렌 말로네이트(DEEMM, diethyl ethoxymethylenemalonate) 유도체화를 실시하고 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, high performance liquid chromatography) 분석법을 통해 측정하였다. 이때, DEEMM 유도체화 반응 용액은 0.05M의 보레이트 버퍼(borate buffer, pH9), 0.04M의 메탄올(methanol), 3㎕의 DEEMM, 50㎕의 반응액(1M 이하로 희석)을 넣고 증류수로 전체 반응 부피(total reaction volume)를 500㎕로 맞춘 뒤, 70℃에서 2시간 동안 반응시켜 제조하였다. 또한, DEEMM 유도체화를 거친 반응액은 Capcellpak^® C18 UG 컬럼(columm)을 사용하고, 이동상은 아세테이트 버퍼(acetate buffer, 25mM, pH4.8)와 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용하여 HPLC 분석을 수행하였다. HPLC 분석시, 유속은 1 ㎖/min, 온도는 35℃의 조건으로 수행하였으며, 디텍터(detector)는 UV(284 nm)를 사용하여 분석을 실시하였다.Lysine and cadaverine concentrations of the supernatant were then measured by high performance liquid chromatography (HPLC) and derivatization with diethyl ethoxymethylenemalonate (DEEMM). At this time, the DEEMM derivatization reaction solution was prepared by adding 0.05M borate buffer (pH 9), 0.04M methanol, 3μ DEEMM and 50μl reaction solution (diluted to 1M or less) The total reaction volume was adjusted to 500 μl, followed by reaction at 70 ° C for 2 hours. HPLC analysis was performed using a Capcellpak ^® C18 UG column as a reaction solution subjected to DEEMM derivatization and a mobile phase as an acetate buffer (25 mM, pH 4.8) and acetonitrile . In the HPLC analysis, the flow rate was 1 ml / min, the temperature was 35 ° C, and the detector was analyzed using UV (284 nm).

반응 종결 후 회수된 리신 탈탄산 분해효소 보유 균주를 이용한 카다베린 생산 효과를 비교해 본 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 기질인 리신으로부터 카다베린을 생산하기 위한 생촉매로서, cadA가 재조합된 E. coli 균주에 비해 ldcC가 재조합된 E.coli 균주의 재사용 효율이 우수함을 알 수 있었다.The results compare the reaction was completed after the number of times lysine decarboxylase lyase holding cadaverine produced by the strain effect, as shown in Figure 14, as a biocatalyst for the production of cadaverine from the lysine substrate, the cadA the recombinant E. The recombinant E.coli strains were more efficient than E. coli strains.

Claims

(a) 리신 탈탄산 분해효소(lysine decarboxylase, LDC)인 ldcC를 보유하고 있는 미생물 균주를 최종농도 0.001 내지 0.1 mM의 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside; IPTG)로 처리하여 전세포(whole cell) 생촉매(biocatalyst)를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 전세포 생촉매에 리신(L-lysine) 또는 리신 염산염(L-lysine monohydrochloride) 기질을 접촉시켜 탈카르복실화 반응(decarboxylation)을 진행하여 카다베린을 제조하는 단계;를 포함하는 카다베린(cadaverine)의 제조방법.
(a) A microbial strain having ldcC, which is a lysine decarboxylase (LDC), is added to a final concentration of isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) to produce a whole cell biocatalyst; And
(b) contacting the whole cell biocatalyst of step (a) with L-lysine or L-lysine monohydrochloride substrate to effect decarboxylation to produce cadaverine &Lt; / RTI >;

제1항에 있어서, 상기 단계 (b)는 37 내지 65℃의 온도 조건에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 1, wherein the step (b) is carried out at a temperature of 37 to 65 ° C.

제1항에 있어서, 상기 단계 (b)는 완충영역 pH 5 내지 10의 완충용액 내에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, wherein step (b) is carried out in a buffer solution at a buffering pH of from 5 to 10.

제3항에 있어서, 상기 완충용액의 완충영역은 pH 5.5 내지 8.5인 것을 특징으로 하는 방법.
4. The method according to claim 3, wherein the buffer region of the buffer solution has a pH of 5.5 to 8.5.

제1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 탈카르복실화 반응(decarboxylation)에 최종농도 1.0 내지 100.0 μM의 피리독살-5-인산(pyridoxal 5-phosphate, PLP)을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 1, wherein pyridoxal-5-phosphate (PLP) is added to the decarboxylation of step (b) at a final concentration of 1.0 to 100.0 μM .

제1항에 있어서, 상기 단계(b) 이후, 상기 전세포 생촉매를 분리하고 분리된 전세포 생촉매를 재사용하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, further comprising, after step (b), separating the whole cell biocatalyst and reusing the isolated whole cell biocatalyst.

제1항에 있어서, 상기 단계(a)의 ldcC를 보유하고 있는 미생물 균주는 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 바실러스 속(Bacillus sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.2. The method according to claim 1, wherein the microorganism strain having ldcC in step (a) is selected from the group consisting of Escherichia sp., Corynebacterium sp., Bacillus sp. Wherein the composition is selected from the group consisting of Pichia sp., Pseudomonas sp., And Saccharomyces sp.