KR20180027832A - Cell Hypothermic Protectants of Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cell using Artifical Cerebrospinal Fluid - Google Patents

Cell Hypothermic Protectants of Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cell using Artifical Cerebrospinal Fluid Download PDF

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KR20180027832A
KR20180027832A KR1020160114978A KR20160114978A KR20180027832A KR 20180027832 A KR20180027832 A KR 20180027832A KR 1020160114978 A KR1020160114978 A KR 1020160114978A KR 20160114978 A KR20160114978 A KR 20160114978A KR 20180027832 A KR20180027832 A KR 20180027832A
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csf
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이준호
김동욱
이정태
김경숙
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코아스템(주)
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Abstract

The present invention provides artificial cerebrospinal fluid as a cell hypothermic preservative for bone marrow-derived mesenchymal stem cells. The cell preservative using artificial cerebrospinal fluid of the present invention is very useful for securing a high survival rate of cells during time taken for a cell therapy agent to be administered to a patient and can be applied not only to stem cells but also to various animal cells. The cell preservative of the present invention is useful as a preservative that can be used for cryopreservation and migration of cells for use as a cell therapy agent.

Description

골수 유래 중간엽 줄기세포의 세포 저온 보존제로서의 인공 뇌척수액{Cell Hypothermic Protectants of Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cell using Artifical Cerebrospinal Fluid}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to an artificial cerebrospinal fluid (MSF) as a cell cold preserving agent for bone marrow-derived mesenchymal stem cells,

본 발명은 골수 유래 중간엽 줄기세포의 저온 보관 및 보호용 세포 보존제에 관한 것이다. The present invention relates to a cell-preserving agent for cryopreservation and protection of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.

줄기세포치료제는 복용하는 제품이 아니며, 단순히 피하주입이나 정맥주사의 경우 체내에서 세포농도가 희석되거나 대사 또는 배출되어서 원하는 병소부위에 도달하는 세포수가 극미량이어서 치료효과를 기대하기 어려우므로 의료기술를 응용하여 병소부위로 직접 이식하는 치료 사례가 많으며, 주입경로의 생체 내 환경특성에 따라 세포 현탁에 사용하는 부형제가 달라지고 있다.Stem cell therapy is not a product to be taken. It is difficult to expect a therapeutic effect because the cell concentration is diluted, metabolized or released in the body in case of subcutaneous injection or intravenous injection, and the number of cells reaching a desired lesion site is very small. There are many cases of direct transplantation to the lesion site. Depending on the characteristics of the in vivo environment of the injection route, the excipient used for cell suspension is changing.

줄기세포치료제는 살아있는 세포(live cell)가 치료제의 주성분인 특성을 가지므로 일반적인 의약품과 같이 유효기간을 연장하기 위한 방법으로 동결건조가 불가능하며, 기존 주사제와 같이 단순히 정제수나 식염수(saline) 또는 PBS 등의 화학적 완충액(buffer solution)을 부형제로 사용할 경우 완제품 보관기간동안 세포가 사멸되어 치료 효과(역가)가 떨어지게 된다.Since the stem cell treatment agent is a main component of the therapeutic agent, it is impossible to freeze-dry it as a method to prolong the shelf life like a general medicine. In addition, it is possible to use merely purified water, saline or PBS The use of a buffer solution as an excipient causes the cells to die during the storage period of the final product, resulting in a decrease in the therapeutic effect (potency).

현재 루게릭병 골수유래 줄기세포치료제의 경우, 주입경로가 뇌경막 내 주사(intrathecal injection)이며, 현탁제로 환자 자신의 자가 뇌척수액(Cerebrospinal fluid, CSF)을 사용하고 있어 환자자신의 뇌척수액 채취에 따른 고통 동반의 문제점이 있다.In the case of the stem cell therapy for LUTS, the injection route is intrathecal injection, and the patient uses his own CSF (cerebrospinal fluid) as a suspending agent. There is a problem.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

대한민국 등록특허 10-1368924Korean Patent No. 10-1368924 대한민국 등록특허 10-0987949Korea Patent No. 10-0987949 대한민국 등록특허 10-1435786Korean Patent No. 10-1435786

본 발명자들은 혈청 등의 동물 유래 성분을 포함하지 않으면서 장기 보관 시 높은 세포 생존율을 나타내는 세포 보존제를 개발하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 인공 뇌척수액(artificial cerebrospinal fluid, aCSF)이 중간엽 줄기세포에 대하여 저온 보존 효과가 우수하고, 안전성 측면에서 뇌경막 내 주사가 가능함을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다. The present inventors have made efforts to develop a cell-preserving agent exhibiting a high cell viability when stored for an extended period without containing an animal-derived component such as serum. As a result, the present inventors have completed the present invention by confirming that the artificial cerebrospinal fluid (aCSF) has excellent cold preservation effect on mesenchymal stem cells and that intracerebral injection can be performed in terms of safety.

따라서, 본 발명의 목적은 골수 유래 중간엽 줄기세포에 대한 세포 보존제를 제공하는데 있다. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a cell preservative for bone marrow-derived mesenchymal stem cells.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다. Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention and claims.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 나트륨 이온 120 내지 160 mEq/L, 칼륨 이온 1 내지 6 mEq/L, 염소 이온 75 내지 155 mEq/L, 칼슘 이온 0.5 내지 5 mEq/L, 마그네슘 이온 0.5 내지 5 mEq/L, 중탄산 이온 5 내지 45 mEq/L, 인산 0.1 내지 5 mmol/L 및 환원당 0.1 내지 10 g/L을 포함하고, N-아세틸시스테인 및 N,N-디아세틸시스틴을 포함하지 않으며, 팽창제(oncotic agent)를 포함하지 않는, pH 6.8 ~ 8.2의 수용액으로 이루어진 세포 보존제를 제공한다. According to one aspect of the present invention, the present invention provides a process for the preparation of a compound of formula I, which comprises 120-160 mEq / L sodium ion, 1-6 mEq / L potassium ion, 75-155 mEq / L chlorine ion, 0.5-5 mEq / L calcium ion, To 5 mEq / L of bicarbonate ions, 5 to 45 mEq / L of bicarbonate ions, 0.1 to 5 mmol / L of phosphoric acid and 0.1 to 10 g / L of reducing sugar, and does not include N-acetylcysteine and N, , An aqueous solution of pH 6.8 to 8.2, which does not contain an oncotic agent.

본 발명자들은 혈청 등의 동물 유래 성분을 포함하지 않으면서 장기 보관 시 높은 세포 생존율을 나타내는 세포 보존제를 개발하고자 연구 노력하였고 그 결과, 인공 뇌척수액(artificial cerebrospinal fluid)이 중간엽 줄기세포에 대하여 저온 보존 효과가 우수하고, 안전성 측면에서 뇌경막 내 주사가 가능하다는 것을 규명하였다. The present inventors have made efforts to develop a cell-preserving agent exhibiting a high cell survival rate in the long-term storage without containing an animal-derived component such as serum. As a result, artificial cerebrospinal fluid (CSF) , And it is possible to inject intraperitoneally in terms of safety.

본 발명의 세포 보존제는 골수 유래 중간엽 줄기 세포를 이용한 어떤 실험이나 시술 또는 처치에 사용되기 전까지 사용될 세포를 저온 내지 실온에서 몇 시간 또는 수일간 보호하고 보관하기 위한 조성물을 말한다. 특정 세포의 배양 및 증식에 최적화되어 사용되는 일반적인 동물세포 배양배지와는 구성성분, 함량 및 사용용도가 다르며, 본 발명의 세포 보존제는 세포의 배양 및 증식에 있어서 일부 첨가제로 이용될 수 있지만 그 자체를 이용하는 것에는 적합하지 않다. 즉, 특정세포의 배양 및 증식에는 특정 세포마다 최적화된 배지(optimized media)가 있기 때문에, 본 발명의 세포 보존제는 그 자체를 세포배양배지로 사용하기에는 적합하지 않고, 단지 세포 보존 용액으로 사용하거나 세포의 생존율을 일정 시간 유지하기 위한 목적으로 사용하는 것이 바람직하다. The cell preserving agent of the present invention refers to a composition for protecting and storing cells to be used for a few hours or several days at low temperature or room temperature before being used for any experiment, treatment or treatment using bone marrow-derived mesenchymal stem cells. The composition, content, and purpose of use differ from the general animal cell culture medium used for culturing and proliferation of specific cells. The cell preserving agent of the present invention can be used as a part of additives in the cultivation and propagation of cells, Is not suitable for use. That is, since the optimized medium for each specific cell is used for culturing and proliferation of a specific cell, the cell preservative of the present invention is not suitable for use as a cell culture medium, It is preferable to use it for the purpose of maintaining the survival rate for a certain period of time.

본 발명의 세포 보존제가 사용될 수 있는 세포는 다양한 동물세포, 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 가장 바람직하게는 골수 유래 중간엽 줄기 세포(bone-marrow derived mesenchymal stem cell)이다. 일반적으로 동물세포는 생존에 아미노산, 무기질, 비타민 등을 필요로 하며 통상적인 동물세포 배양배지는 이러한 성분들을 포함한다. 본 발명의 세포 보존제는 이러한 무기질, 당류 등의 성분들을 포함하지만 특정 세포의 배양 및 증식이 목적이 아닌, 다양한 동물세포를 보존하기 위한 목적으로 사용되기 때문에 기존의 동물세포 배양용 배지와는 성분 및 그 함량을 달리한다(표 1의 성분조성표 참조).Cells in which the cell preserving agent of the present invention can be used are various animal cells, preferably mesenchymal stem cells, and most preferably bone marrow derived mesenchymal stem cells. In general, animal cells require amino acids, minerals, vitamins and the like for survival, and conventional animal cell culture media include these components. The cell preserving agent of the present invention contains components such as minerals and saccharides, but is used for the purpose of preserving various animal cells, not for culturing and propagation of specific cells. Therefore, (See the ingredient composition table in Table 1).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 세포 보존제는 나트륨 이온 145 mEq/L, 칼륨 이온 2.8 mEq/L, 염소 이온 129 mEq/L, 칼슘 이온 2.3 mEq/L, 마그네슘 이온 2.2 mEq/L, 중탄산 이온 23.1 mEq/L, 인산 1.1 mmol/L 및 환원당 0.61 g/L을 포함하고, N-아세틸시스테인 및 N,N-디아세틸시스틴을 포함하지 않으며, 팽창제(oncotic agent)를 포함하지 않는, pH 7 ~ 7.5의 수용액으로 이루어진다.According to one embodiment of the present invention, the cell preservative of the present invention is a cell preservative comprising 145 mEq / L of sodium ion, 2.8 mEq / L of potassium ion, 129 mEq / L of chlorine ion, 2.3 mEq / L of calcium ion, 2.2 mEq / A pH of 23.1 mEq / L of bicarbonate ions, 1.1 mmol / L of phosphoric acid and 0.61 g / L of reducing sugar and no N-acetylcysteine and N, N-diacetylcystine and no oncotic agent 7 to 7.5 aqueous solution.

본 발명의 세포 보존제에 현탁된 세포는 뇌경막 내 주사가 가능하다. Cells suspended in the cell preservative of the present invention can be injected intraperitoneally.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 세포 보존제에 대하여 골수 유래 중간엽 줄기세포를 이용하여 세포생존율 시험을 수행한 결과, 72시간 동안 저온보관한 후에도 80% 이상의 생존율을 나타내었으며, 이러한 결과는 인간 CSF 및 기존의 저온보존액과 비교하여 현저히 우수한 효과였다(도 1, 도 8 참조). According to one embodiment of the present invention, cell survival rate test using bone marrow-derived mesenchymal stem cells against the cell preservative of the present invention showed a survival rate of 80% or more even after 72 hours of low temperature storage, Were significantly superior to human CSF and conventional low-temperature preserving liquids (see FIGS. 1 and 8).

본 발명에 따르면, 본 발명의 세포 보존제에 보존 후의 세포 생존율은 적어도 70% 이상을 나타낸다. According to the present invention, the cell survival rate after storage in the cell preservative of the present invention is at least 70% or more.

기존의 동물세포 배양배지는 영양성분으로 동물혈청을 첨가하게 되는데, 세포배양시 세포가 안정적으로 자라도록 도와주지만, 이를 세포보존제로 사용하여 초저온이 아닌 실온 혹은 저온에 장시간 보관할 경우 세포의 생존율이 저하되게 된다. 그러나 본 발명의 세포 보존제는 세포 배양 및 증식을 목적으로 하지 않기 때문에 혈청을 함유하지 않으며 실험 혹은 시술에 사용되기 직전까지 세포를 보관할 시에 세포 생존율을 높이는데 주된 목적이 있으므로 생존에 필요한 성분들을 더 함유하고 있다.The existing animal cell culture medium is added with animal serum as a nutritional ingredient. It helps cell to grow stably during cell culture, but when it is stored at room temperature or low temperature for a long period of time, . However, since the cell preservative of the present invention is not intended for cell culture and proliferation, it does not contain serum, and since the main purpose is to increase the cell survival rate when the cells are stored until just before being used for the experiment or treatment, .

특히, 본 발명의 세포 보존제는 줄기세포의 보존에 유용하게 사용될 수 있는데, 최근 많이 연구되고 있는 세포 치료제와 관련하여 줄기세포의 보관 및 이동 시 사용될 수 있는 보존제로서 유용하다. In particular, the cell preserving agent of the present invention can be useful for preservation of stem cells, and is useful as a preservative that can be used for storage and transportation of stem cells in connection with cell therapy agents, which have been recently studied.

본 발명의 세포 보존제에 있어서, 상기 세포 보존제는 0 내지 37℃에서 보관 시 사용될 수 있으나, 바람직하게는 0 내지 10℃의 저온 보관 시, 더욱 바람직하게는 2 내지 8℃의 저온 보관 시, 가장 바람직하게는 4℃의 저온 보관 시 세포의 생존율을 높이는데 사용될 수 있다.In the cell preserving agent of the present invention, the cell preserving agent can be used when stored at 0 to 37 캜, but is preferably stored at a low temperature of 0 to 10 캜, more preferably at a low temperature of 2 to 8 캜 Can be used to increase cell viability at low temperature storage at 4 ° C.

본 발명에 있어서, 상기 세포 보존제는 세포치료제의 보관 및 이동에 사용함으로써 세포치료제의 치료효과를 증대시킬 수 있다. 상기 용어 ‘세포치료제’는 세포와 조직의 기능을 복원 또는 향상시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 또는 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식 혹은 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 행위를 통해 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 신개념 의약품을 말한다. 구체적으로는 환자 자신이나 타인의 체세포를 채취하여 증식시키거나 줄기세포를 원하는 세포로 분화시켜 치료에 이용하는 등 적용범위가 넓고, 화상이나 암, 치매 등 각종 난치성 질환의 치료에 무한한 가능성을 가지고 있다. In the present invention, the cell preservative can be used for storage and transportation of a cell therapeutic agent, thereby enhancing the therapeutic effect of the cell therapeutic agent. The term " cell therapeutic agent " refers to an agent capable of proliferating or screening an autologous, allogenic, or xenogenic cell in vitro or in vitro to improve or improve the biological properties of the cell Which is used for the purpose of treatment, diagnosis and prevention through the act of changing, Specifically, there is a wide range of applications such as collecting somatic cells of the patient himself or others and multiplying them or differentiating stem cells into desired cells to be used for treatment, and there is an infinite possibility of treating various intractable diseases such as burns, cancer, and dementia.

이와 같은 세포치료제에 사용되는 배양 및 증식된 세포들은 세포치료 대상에 적용하는데 까지 보관 및 이동이 매우 중요하다. 동물세포, 특히 줄기세포는 배양 및 증식 후 보관 및 이동 시 상당수가 죽거나 활성이 떨어지게 된다. 본 발명의 세포 보존제는 세포치료제가 환자에 적용되는데 걸리는 시간동안 세포의 높은 생존율을 확보하는데 매우 유용하다.The cultured and proliferated cells used in the cell therapy agent are very important to be stored and transferred until they are applied to a cell therapy target. Animal cells, especially stem cells, die or become inactive when stored and transported after culture and proliferation. The cell preservative of the present invention is very useful for ensuring a high survival rate of cells during the time it takes for a cell therapeutic to be applied to a patient.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(ⅰ) 본 발명은 세포 보존제를 제공한다. (I) The present invention provides a cell preservative.

(ⅱ) 본 발명의 세포 보존제는 세포치료에 적용되는데 걸리는 시간동안 세포의 높은 생존율을 확보하는데 매우 유용하며, 줄기세포 뿐만 아니라 다양한 동물세포에 적용할 수 있다.(Ii) The cell preserving agent of the present invention is very useful for ensuring a high survival rate of cells during the time taken for application to cell therapy, and can be applied not only to stem cells but also to various animal cells.

(ⅲ) 본 발명의 세포 보존제는 세포 치료제로 사용하기 위한 세포의 저온보관 및 이동 시 사용될 수 있는 보존제로서 유용하다. (Iii) The cell preservative of the present invention is useful as a preservative that can be used for cryopreservation and migration of cells for use as a cell therapy agent.

도 1은 인간 CSF와 인공 CSF에서 저온보존(4℃) 된 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)의 세포 생존율을 측정한 결과이다.
1×107 세포/주사기의 세포 생존율을 측정함. ##은 인간 CSF와 인공 CSF와의 유의적인 차이를 나타냄, p<0.05, p<0.001.
도 2는 인간 CSF와 인공 CSF에 보관된 골수 유래 중간엽 줄기세포들의 저온 보존 기간(0, 24, 48, 72 시간) 동안의 세포성상을 관찰한 결과이다. 화살표(↑)는 세포응집을 나타냄. 스케일 바: 100 μm
도 3은 Annexin V/PI 어세이를 이용하여 인간 CSF와 인공 CSF를 이용한 골수 유래 중간엽 줄기세포의 저온 보존에 의한 세포사멸 정도를 측정한 결과이다.
(a) 파란색(살아있는 세포), 빨간색(세포 괴사), 노란색(초기 세포사멸), 녹색(후기 세포사멸). (b) 빨간색으로 게이팅된 것은 살아있는 세포임. 초록색은 죽은 세포를 나타냄. (c) 저온보존에 따른 세포사멸율(%)을 측정함.
도 4는 CCK-8 어세이를 이용하여 인간 CSF와 인공 CSF에 저온보존된 골수 유래 중간엽 줄기세포의 세포 증식력을 측정한 결과이다.
72시간 동안 저온보존된 세포를 7일간 CO2 배양기에 배양함. O.D.값은 배양기간 동안 측정된 세포 증식정도임.
도 5는 인간 CSF와 인공 CSF에 저온보존된 골수 유래 중간엽 줄기세포의 증식력 회복 정도를 확인한 결과이다.
72시간 저온보존 세포를 7일간 T175 플라스크에서 배양한 세포의 세포 생존율을 측정함. 인간 CSF와 인공 CSF에 보존된 골수 유래 중간엽 줄기세포의 증식력에 유의적 차이를 보이지 않음.
도 6은 인간 CSF와 인공 CSF에 저온보존된 골수 유래 중간엽 줄기세포의 회복력 확인을 위해 세포성상을 관찰한 결과이다. 스케일 바: 100 μm
도 7은 인공 CSF와 3종의 세포 저온 보존액들에 저온 보존(4℃) 된 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)의 세포 생존율의 변화를 측정한 결과이다.
도 8은 인공 CSF와 3종의 세포 저온 보존액들에 보관된 골수 유래 중간엽 줄기세포의 저온 보존 기간(0, 24, 48, 72 시간) 동안의 세포성상을 관찰한 결과이다. 화살표(↑)는 세포응집을 나타냄. 스케일 바: 100 μm FIG. 1 shows the results of measurement of cell viability of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSC) preserved at low temperature (4 ° C) in human CSF and artificial CSF.
The cell viability of 1 x 10 < 7 &gt; cells / syringe was measured. ## indicates a significant difference between human CSF and artificial CSF, p <0.05, p <0.001.
FIG. 2 shows the results of observing cellular morphology during the cold storage period (0, 24, 48, 72 hours) of bone marrow-derived mesenchymal stem cells stored in human CSF and artificial CSF. Arrow (↑) indicates cell aggregation. Scale bar: 100 μm
FIG. 3 shows the results of measurement of cell death by cold storage of bone marrow-derived mesenchymal stem cells using human CSF and artificial CSF using Annexin V / PI assay.
(a) blue (living cells), red (cell necrosis), yellow (early cell death), green (late cell death). (b) Gated in red is a living cell. Green indicates dead cells. (c) Measuring cell death rate (%) due to low temperature preservation.
FIG. 4 shows cell proliferation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells preserved at low temperature in human CSF and artificial CSF using a CCK-8 assay.
The cells, which were kept at low temperature for 72 hours, were cultured in a CO 2 incubator for 7 days. The OD value is the degree of cell proliferation measured during the incubation period.
FIG. 5 shows the results of confirming the degree of recovery of proliferation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells preserved at low temperature in human CSF and artificial CSF.
Cell viability of cells cultured in a T175 flask for 72 hours at 72 hours was measured. There was no significant difference in the proliferative capacity of bone marrow-derived mesenchymal stem cells preserved in human CSF and artificial CSF.
Fig. 6 shows the result of observing cellular morphology for confirming the resilience of bone marrow-derived mesenchymal stem cells preserved at low temperature in human CSF and artificial CSF. Scale bar: 100 μm
FIG. 7 shows the results of measurement of changes in cell viability of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSC) preserved at low temperature (4 ° C) in artificial CSF and three cell cold storage solutions.
FIG. 8 shows the results of observing cellular morphology during cold storage (0, 24, 48, 72 hours) of bone marrow-derived mesenchymal stem cells stored in artificial CSF and three cell cold storage solutions. Arrow (↑) indicates cell aggregation. Scale bar: 100 μm

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

실험방법Experimental Method

1. 인간 CSF(뇌척수액)과 인공 CSF의 중간엽줄기세포 저온보존 효과 비교1. Comparison of low-temperature preservation effects of human CSF (CSF) and artificial CSF on mesenchymal stem cells

본 시험에서는 중간엽줄기세포의 저온 세포 보존액으로 인공 뇌척수액 (artificial CSF, aCSF)(표 1)을 사용하고자 인간 CSF와의 저온보존효과를 비교 검증하였으며, 검증방법은 표 2와 같이 수행하였다(표 2).In this study, the low-temperature preservation effect of human CSF with human CSF (artificial CSF, aCSF) (Table 1) as a cold cell preservation solution of mesenchymal stem cells was verified and the verification method was performed as shown in Table 2 ).

인공 뇌척수액 Artificial cerebrospinal fluid 구성Configuration 함량content 나트륨 이온Sodium ion 145 mEq/L145 mEq / L 칼륨 이온Potassium ion 2.8 mEq/L2.8 mEq / L 염소 이온Chlorine ion 129 mEq/L129 mEq / L 칼슘 이온Calcium ion 2.3 mEq/L2.3 mEq / L 마그네슘 이온Magnesium ion 2.2 mEq/L2.2 mEq / L 중탄산 이온Bicarbonate ion 23.1 mEq/L23.1 mEq / L 인산Phosphoric acid 1.1 mmol/L1.1 mmol / L 환원당Reducing sugar 0.61 g/L0.61 g / L

N-아세틸시스테인 및 N,N-디아세틸시스틴을 포함하지 않고, 팽창제(oncotic agent)를 포함하지 않는, pH 6.8 ~ 8.2의 수용액.An aqueous solution of pH 6.8 to 8.2, which does not contain N-acetyl cysteine and N, N-diacetylcystine and does not contain an oncotic agent.

1-1. 시험항목1-1. Test Items

인공 CSF의 세포 저온 보존 검증실험 메트릭스 디자인Assay of cell cold storage of artificial CSF 번호number 시험법Test method 분석법Analysis method 대조군
Control group
저온보존 세포 생존율 시험Cryopreserved cell viability test 회복능 시험Recovery test Sampling periodSampling period 대조군
(fresh cell)Control group
(fresh cell) 시험군
(recovery cell*)Test group
(recovery cell * ) 0hr0hr 24hr24hr 48hr48hr 72hr72hr 1One 세포성상
(cell morphology)Cellular property
(cell morphology) 현미경
육안확인시험microscope
Visual confirmation test ●● ○○ ○○ ○○ ○○ ●● ●● 22 세포생존율 분석
(cell viability analysis)Cell survival analysis
(cell viability analysis) 트립판 블루
색소배제법Trippan Blue
Dye exclusion method ●● ●● ●● ●● ●● ●● ●● 33 세포사멸 분석시험
(Annexin V apoptosis analysis)Cell death assay
(Annexin V apoptosis analysis) 유세포분석법Flow cytometry ○○ ○○ ●● ●● ●● ○○ ○○ 44 세포증식율 분석시험
(CCK-8 proliferation assayCell proliferation assay
(CCK-8 proliferation assay CCK-8 어세이CCK-8 assay ○○ ○○ ○○ ○○ ○○ ●● ●●

* Recovery cell은 72시간 동안 저온보존한 세포를 1회 배양한 세포를 의미함. * Recovery cell means a cell that has been incubated for 72 hours at low temperature.

1-2. 세포배양(cell culture)1-2. Cell culture

1-2-1. 동결세포 해동(thawing of cryopreserved cells)1-2-1. Thawing of cryopreserved cells

1×106 세포 농도의 동결세포(P1)가 담긴 바이알(vial)을 37℃의 항온수조 (water bath)에 해동(thawing)시킨 후 세포배양 배지가 담간 T175 플라스크에 2×105 개의 세포를 접종한 다음 7일간 배양하며, 배양 4일째에 배지교환 하였다. 세포배양 시 배양환경 조건은 CO2 7%, 37℃이며, 세포배양배지는 CSBM-A06 기본배지(basam medium)에 L-alanyl-L-glutamine(L-Aln-L-Gln; 200 mM), 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL), 10% FBS(fetal bovine serum)을 첨가하여 사용하였다(표 3).A vial containing 1 × 10 6 cell-freezing cells (P1) was thawed in a constant-temperature water bath at 37 ° C., and 2 × 10 5 cells were added to the T175 flask containing the cell culture medium After inoculation, the cells were cultured for 7 days, and the culture medium was changed on the fourth day. L-alanyl-L-glutamine (L-Aln-L-Gln; 200 mM) was added to the CSBM-A06 basal medium, and the cell culture medium was incubated at 37 ° C in CO 2 Penicillin-streptomycin (10,000 U / mL), and 10% FBS (fetal bovine serum) were added (Table 3).

세포배양조건Cell culture conditions 배지종류Badge type 혈청농도Serum concentration 세포접종 농도
(세포수/cm2)Cell inoculation concentration
(Number of cells / cm 2 ) 배양
일수culture
Days 배양환경조건
(CO2농도, 온도)Culture environmental condition
(CO 2 concentration, temperature) CSBM-A06CSBM-A06 FBS 10%FBS 10% 2.0×105 세포
(0.01×105 세포/cm2)2.0 × 10 5 cells
(0.01 × 10 5 cells / cm 2) 7일7 days CO2 7%, 37℃CO 2 7%, 37 ° C

1-2-2. 계대배양(subculture)1-2-2. Subculture

세포 배양 플라스크 내 80-90% 채워진 상태의 세포를 0.125% 트립신-EDTA를 이용하여 탈착한 후 세포배양 배지가 담간 T175 플라스크에 2×105 개의 세포를 접종한 다음 7일간 배양하며, 배양 4일째에 배지교환 하였다. 세포배양 시 배양환경 조건은 CO2 7%, 37℃이며, 세포 배양배지는 CSBM-A06 기본배지(basal medium)에 L-alanyl-L-glutamine(Aln-Glu; 200 mM), 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL), 10% FBS(fetal bovine serum)을 첨가하여 사용하였다.Cells in an 80-90% filled cell culture flask were desorbed using 0.125% trypsin-EDTA. Cells were inoculated with 2 x 10 5 cells in a T175 flask containing cell culture medium, and cultured for 7 days. . During cell culture cultivation environment condition is CO 2 7%, 37 ℃, the cell culture medium is CSBM-A06 basal medium (basal medium) L-alanyl- L-glutamine in (Aln-Glu; 200 mM) , penicillin-streptomycin (10,000 U / mL) and 10% fetal bovine serum (FBS).

1-2-3. 세포수확(cell harvest)1-2-3. Cell harvest

세포 배양 플라스크 내 80-90% 채워진 상태의 세포를 0.125% 트립신-EDTA를 이용하여 탈착한 후 세포배양배지로 현탁하였다. 세포배양배지는 CSBM-A06 기본배지(basal medium)에 L-alanyl-L-glutamine(L-Aln-L-Gln; 200 mM), 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL), 10% FBS(fetal bovine serum)를 첨가하여 사용하였다.Cells in an 80-90% filled state in a cell culture flask were desorbed using 0.125% trypsin-EDTA and then suspended in a cell culture medium. Cell culture medium was prepared by adding L-alanyl-L-glutamine (L-Aln-L-Gln; 200 mM), penicillin-streptomycin (10,000 U / mL), 10% fetal bovine serum bovine serum) was added.

총 세포수의 계산방법은 “(생세포수 + 사멸세포수 평균) × 104/mLX(1/측정구획 수) × 세포 부유액(mL) × 희석배수”의 식으로 나타낼 수 있다.The calculation method of the total cell number can be expressed by the expression "(number of living cells + number of dead cells) × 10 4 / mL × (1 / number of measurement compartments) × cell suspension (mL) × dilution multiple".

1-3. 세포 생존율 시험(Cell viability test)1-3. Cell viability test

세포 계대 시에는 총 7일간 배양된 세포 배양 플라스크 내 80-90% 채워진 상태의 세포를 0.125% 트립신/EDTA 처리하여 수확하였다. 트립판 블루 색소 배제법(Trypan blue dye exclusion method)을 적용해 염색하고 혈구계수기(Neubauer improved bright-line, Marienfeld)를 사용하여 세포생존율을 확인하였다. 세포현탁액 0.065 mL을 채취한 후 0.013 mL의 검체와 0.015 mL 트립판 블루를 혼합하여 2분간 반응시킨 후 혈구계수기를 이용하여 총 세포수를 5회 측정하였다. 세포생존율 측정 시 트립판 블루에 염색된 세포와 염색되지 않은 세포를 측정하여, 세포 생존율을 계산하였다. 세포생존율 계산방법은 “세포생존율(%) = 염색되지 않은 세포 수/ 전체 세포 수 × 100%” 의 식으로 나타낼 수 있다.In the cell passage, cells in an 80-90% filled state in a cell culture flask cultured for a total of 7 days were harvested by treatment with 0.125% trypsin / EDTA. The trypan blue dye exclusion method was used to stain and cell viability was confirmed using a hemovalent counter (Neubauer improved bright-line, Marienfeld). After 0.065 mL of cell suspension, 0.013 mL of sample and 0.015 mL of Trypan blue were mixed and allowed to react for 2 min. Total cell count was then measured 5 times using a hemocytometer. Cell viability was determined by measuring the stained and unstained cells on the trypan blue. The method of calculating the cell survival rate can be expressed by the expression "cell survival rate (%) = number of unstained cells / number of whole cells × 100%".

1-4. 인간 1-4. human CSF와CSF and 인공  art CSFCSF 세포 보존제를 이용한 저온 보관 세포의 생존율 확인시험(hypothermic preserved cell’s cell viability test) Hypothermic preserved cell viability test using cell-preserving agent

총 7일간 배양된 세포 배양 플라스크 내 80-90% 채워진 상태의 세포에 0.125% 트립신/EDTA를 처리하고 세포를 수확한 다음 400 ×g 조건에서 4분간 원심분리 후 상층액을 제거하였다. DPBS로 현탁 후 총세포수 및 세포생존율을 측정하였다. 1.1×107 세포 농도의 세포현탁액을 각각의 튜브에 분주한 다음 400 ×g 조건에서 4분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하였다. 1.1×107 세포의 백색세포층이 담긴 튜브에 1.1 mL의 인간 CSF 또는 인공 CSF를 첨가하여 조심히 현탁한 후 이 중 1 mL의 세포현탁액을 주사바늘(17G)이 장착된 주사기(5 mL)에 각각 충전하였다. 세포현탁액 충전 완료 후 주사바늘을 제거하고, 주사기에 캡을 장착한 다음 2차 포장지(멸균 파우치 포장지)에 넣어 밀봉하여 냉장보관(2-8℃) 후 0, 24, 48, 72시간 간격으로 세포생존율을 측정하였다.Cells in 80-90% filled cells in a 7-day-old cell culture flask were treated with 0.125% trypsin / EDTA, harvested, and centrifuged at 400 × g for 4 minutes to remove the supernatant. Total cell number and cell viability after suspension in DPBS were measured. The cell suspension at a concentration of 1.1 × 10 7 cells was dispensed into each tube and centrifuged at 400 × g for 4 minutes before removing the supernatant. 1.1 mL of human CSF or artificial CSF was added to the tube containing the 1.1 × 10 7 white cell layer and carefully suspended. One mL of the cell suspension was added to a syringe (5 mL) equipped with a needle (17G) . After filling the cell suspension, remove the needles, place the cap on the syringe, seal it in the secondary packaging paper (sterile pouch wrapping paper), and store it at 0, 24, 48, Survival rate was measured.

1-5. 저온보관 세포의 회복능 시험(Recovery test of hypothermic preserved cells)1-5. Recovery test of hypothermic preserved cells

72시간째 저온보존된 세포현탁액 일부를 채취한 후 세포생존율을 측정하였다. 회복능 시험항목 중 세포수확량 확인시험을 위해 생세포수를 기준으로 세포배양 배지가 담간 T175 플라스크에 2×105 세포를 접종한 다음 7일간 배양하였다. CCK-8 cell proliferation assay를 이용한 세포증식율 시험은 생세포수를 기준으로 96웰에 5.0×103 세포/웰의 농도로 접종 후 7일간 배양하며, 0, 4, 7일 간격으로 CCK-8 어세이를 수행하였다. 세포배양 시 배양환경조건은 CO2 7%, 37℃이며, 세포배양배지는 CSBM-A06 기본배지(basal medium)에 L-alanyl-L-glutamine(L-Aln-L-Gln; 200 mM), 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL), 10% FBS(Life Technology)을 첨가하여 사용하였다.The cell viability was measured after a portion of the low-temperature preserved cell suspension was collected for 72 hours. For confirmation of cell yield among the test items, 2 × 10 5 cells were inoculated in a T175 flask containing cell culture medium based on the number of viable cells, and then cultured for 7 days. Cell proliferation assay using CCK-8 cell proliferation assay was performed in 96-well cells at a concentration of 5.0 × 10 3 cells / well for 7 days after incubation, and CCK-8 assay was performed at 0, 4, Respectively. L-alanyl-L-glutamine (L-Aln-L-Gln; 200 mM) was added to the CSBM-A06 basal medium, and the cell culture medium was incubated at 37 ° C in CO 2 Penicillin-streptomycin (10,000 U / mL), and 10% FBS (Life Technology).

1-6. 세포증식율 분석시험(CCK-8 cell proliferation assay)1-6. Cell proliferation assay (CCK-8 cell proliferation assay)

Cell Counting Kit-8(Dojindo MolecularTechnologies, US) 키트를 사용하여 세포 증식력을 측정하였으며, 제조사의 매뉴얼대로 실험하였다. Cell proliferation was measured using a Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, US) kit and tested according to the manufacturer's manual.

동결보관 3일째에 반제품 보관실(청정도 D)에 위치한 LN2 탱크에서 반제품(동결 바이알)을 꺼냈다. 반제품을 37℃의 항온수조(water bath)에서 신속하게 3-4분간 해동(thawing)시킨 후 세포 현탁액을 빈 튜브에 옮긴 후 세포배양 배지(CSBM-A06 + 10% FBS)를 넣어 세척하였다. 72시간 저온보존된 세포 중 생세포를 기준으로 5.0×103 세포/웰의 밀도로 96웰 플레이트에 검체 조건당 3반복으로 100 μl 씩 접종한 후 37℃, 7% CO2 조건에서 7일간 배양하며, 배양 4일째에 배지교환하였다. 0, 4, 7일 간격으로 세포 증식율을 측정하였다. 각 웰에 CCK-8 시약을 10 μL씩 첨가한 다음 37℃ 조건에서 1시간 반응시킨 후 ELISA 리더(Bio-rad)를 이용하여 450 nm 조건에서 흡광도를 측정하며, 분석은 Microplate Manager 6 software(ver. 6.2)를 이용하여 분석하였다. 결과분석은 각 CPA 조성물별 0, 4, 7일차 O.D값의 기울기값(slope value)을 도출하였다.On the third day of freezing storage, the semi-finished product (freezing vial) was taken out from the LN 2 tank located in the semi-finished product storage room (cleanliness D). The semi-product was thawed rapidly in a 37 ° C water bath for 3 to 4 minutes. The cell suspension was transferred to an empty tube and washed with cell culture medium (CSBM-A06 + 10% FBS). The cells were incubated for 72 hours at a density of 5.0 × 10 3 cells / well on a viable cell basis at a density of 3 × 10 6 cells / well in a 96-well plate at 37 ° C. under 7% CO 2 for 7 days , And the medium was changed on the fourth day of culture. Cell proliferation was measured at 0, 4, and 7 days intervals. Add 10 μL of CCK-8 reagent to each well, react at 37 ° C for 1 hour, and measure the absorbance at 450 nm using an ELISA reader (Bio-Rad). Analyze with Microplate Manager 6 software (ver 6.2). Results analysis yielded a slope value of 0, 4, and 7 day OD values for each CPA composition.

1-7. 세포사멸 분석시험(Annexin V apoptosis analysis)1-7. Annexin V apoptosis analysis

형광 활성화 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting: FACS)을 이용하여 세포의 표면항원 발현특성을 확인하고자 하였다. 24, 48, 72시간 간격으로 저온보존된 1×106 개 세포를 채취하여 저온보관된 PBS로 2회 세척한 후 1X 바인딩 버퍼로 조심히 현탁한 다음 FACS 튜브에 1×105 세포/100 μL를 분주하였다. 튜브에 FITC-Annexin V와 PI(Propidium Iodide)를 5 μL씩 첨가한 후 조심히 현탁하여 차광조건의 실온(15-25℃)에서 15분간 반응시켰다. 400 μL의 1X 바인딩 버퍼를 넣은 후 1시간 이내에 분석하였다. FACS 장비는 FACS CantoII(Becton Dickinson, NJ, 미국)를 이용하며, 데이터 분석은 BD FACSDivaTM Software(BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다.(FACS) to identify the surface antigen expression of the cells. 1 × 10 6 cryopreserved at 24, 48, and 72 hour intervals Cells were harvested, washed twice with cold PBS, carefully suspended in 1X binding buffer, and then dispensed at 1 × 10 5 cells / 100 μL into FACS tubes. After adding 5 μL of FITC-Annexin V and PI (Propidium Iodide) to the tube, the tube was carefully suspended and reacted at room temperature (15-25 ° C) for 15 minutes. 400 μL of 1X binding buffer was added and analyzed within 1 hour. The FACS instrument is a FACS Canto II (Becton Dickinson, NJ, USA) and data analysis is performed using a BD FACSDiva TM Software (BD Biosciences).

2. 인공 CSF와 줄기세포 저온보존액들과의 중간엽줄기세포 저온보존 효과 비교2. Comparison of cold storage effect of mesenchymal stem cells with artificial CSF and stem cell cold storage solutions

본 시험에서는 중간엽줄기세포에 대한 인공 CSF (표 1)의 세포 저온 보존 효과을 보다 확인하기 위하여 기존 3종의 저온 세포 보존액 (hypothermic preservation solution) 제품을 사용하여 인간 CSF와의 저온보존효과를 비교 검증하였으며, 검증방법은 표 4와 같이 수행하였다(표 2).In order to further confirm the cell cold preservation effect of artificial CSF (Table 1) on mesenchymal stem cells, low temperature preservation effect with human CSF was compared using three existing hypothermic preservation solution products , And the verification method was performed as shown in Table 4 (Table 2).

2-1. 시험항목2-1. Test Items

인공 CSF와 세포 저온 보존액과의 저온 보존 효능 검증 메트릭스 디자인Low-temperature preservation efficacy of artificial CSF and cell cold storage 번호number 시험법Test method 분석법Analysis method 대조군
(0hr)Control group
(0hr) 저온보존 세포 생존율 시험Cryopreserved cell viability test Sampling periodSampling period 24hr24hr 48hr48hr 72hr72hr (P3)(P3) (P3)(P3) (P3)(P3) (P3)(P3) 1One 세포성상
(cell morphology)Cellular property
(cell morphology) 현미경
육안확인시험microscope
Visual confirmation test ●● ●● ●● ●● 22 세포생존율 분석
(cell viability analysis)Cell survival analysis
(cell viability analysis) 트립판 블루
색소배제법Trippan Blue
Dye exclusion method ●● ●● ●● ●●

2-2. 세포배양(cell culture)2-2. Cell culture

2-2-1. 동결세포 해동(thawing of cryopreserved cells)2-2-1. Thawing of cryopreserved cells

1×106 세포 농도의 동결세포(P1)가 담긴 바이알(vial)을 37℃의 항온수조 (water bath)에 해동(thawing)시킨 후 세포배양 배지가 담간 T175 플라스크에 2×105 개의 세포를 접종한 다음 7일간 배양하며, 배양 4일째에 배지교환 하였다. 세포배양 시 배양환경 조건은 CO2 7%, 37℃이며, 세포배양배지는 CSBM-A06 기본배지(basam medium)에 L-alanyl-L-glutamine(L-Aln-L-Gln; 200 mM), 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL), 10% FBS(fetal bovine serum)을 첨가하여 사용하였다(표 3).A vial containing 1 × 10 6 cell-freezing cells (P1) was thawed in a constant-temperature water bath at 37 ° C., and 2 × 10 5 cells were added to the T175 flask containing the cell culture medium After inoculation, the cells were cultured for 7 days, and the culture medium was changed on the fourth day. L-alanyl-L-glutamine (L-Aln-L-Gln; 200 mM) was added to the CSBM-A06 basal medium, and the cell culture medium was incubated at 37 ° C in CO 2 Penicillin-streptomycin (10,000 U / mL), and 10% FBS (fetal bovine serum) were added (Table 3).

2-2-2. 계대배양(subculture)2-2-2. Subculture

세포 배양 플라스크 내 80-90% 채워진 상태의 세포를 0.125% 트립신-EDTA를 이용하여 탈착한 후 세포배양 배지가 담간 T175 플라스크에 2×105 개의 세포를 접종한 다음 7일간 배양하며, 배양 4일째에 배지교환 하였다. 세포배양 시 배양환경 조건은 CO2 7%, 37℃이며, 세포 배양배지는 CSBM-A06 기본배지(basal medium)에 L-alanyl-L-glutamine(Aln-Glu; 200 mM), 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL), 10% FBS(fetal bovine serum)을 첨가하여 사용하였다.Cells in an 80-90% filled cell culture flask were desorbed using 0.125% trypsin-EDTA. Cells were inoculated with 2 x 10 5 cells in a T175 flask containing cell culture medium, and cultured for 7 days. . During cell culture cultivation environment condition is CO 2 7%, 37 ℃, the cell culture medium is CSBM-A06 basal medium (basal medium) L-alanyl- L-glutamine in (Aln-Glu; 200 mM) , penicillin-streptomycin (10,000 U / mL) and 10% fetal bovine serum (FBS).

2-2-3. 세포수확(cell harvest)2-2-3. Cell harvest

세포 배양 플라스크 내 80-90% 채워진 상태의 세포를 0.125% 트립신-EDTA를 이용하여 탈착한 후 세포배양배지로 현탁하였다. 세포배양배지는 CSBM-A06 기본배지(basal medium)에 L-alanyl-L-glutamine(L-Aln-L-Gln; 200 mM), 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL), 10% FBS(fetal bovine serum)를 첨가하여 사용하였다.Cells in an 80-90% filled state in a cell culture flask were desorbed using 0.125% trypsin-EDTA and then suspended in a cell culture medium. Cell culture medium was prepared by adding L-alanyl-L-glutamine (L-Aln-L-Gln; 200 mM), penicillin-streptomycin (10,000 U / mL), 10% fetal bovine serum bovine serum) was added.

총 세포수의 계산방법은 “(생세포수 + 사멸세포수 평균) × 104/mLX(1/측정구획 수) × 세포 부유액(mL) × 희석배수”의 식으로 나타낼 수 있다.The calculation method of the total cell number can be expressed by the expression "(number of living cells + number of dead cells) × 10 4 / mL × (1 / number of measurement compartments) × cell suspension (mL) × dilution multiple".

2-3. 세포 생존율 시험(Cell viability test)2-3. Cell viability test

세포 계대 시에는 총 7일간 배양된 세포 배양 플라스크 내 80-90% 채워진 상태의 세포를 0.125% 트립신/EDTA 처리하여 수확하였다. 트립판 블루 색소 배제법(Trypan blue dye exclusion method)을 적용해 염색하고 혈구계수기(Neubauer improved bright-line, Marienfeld)를 사용하여 세포생존율을 확인하였다. 세포현탁액 0.065 mL을 채취한 후 0.013 mL의 검체와 0.015 mL 트립판 블루를 혼합하여 2분간 반응시킨 후 혈구계수기를 이용하여 총 세포수를 5회 측정하였다. 세포생존율 측정 시 트립판 블루에 염색된 세포와 염색되지 않은 세포를 측정하여, 세포 생존율을 계산하였다. 세포생존율 계산방법은 “세포생존율(%) = 염색되지 않은 세포 수/ 전체 세포 수 × 100%” 의 식으로 나타낼 수 있다.In the cell passage, cells in an 80-90% filled state in a cell culture flask cultured for a total of 7 days were harvested by treatment with 0.125% trypsin / EDTA. The trypan blue dye exclusion method was used to stain and cell viability was confirmed using a hemovalent counter (Neubauer improved bright-line, Marienfeld). After 0.065 mL of cell suspension, 0.013 mL of sample and 0.015 mL of Trypan blue were mixed and allowed to react for 2 min. Total cell count was then measured 5 times using a hemocytometer. Cell viability was determined by measuring the stained and unstained cells on the trypan blue. The method of calculating the cell survival rate can be expressed by the expression "cell survival rate (%) = number of unstained cells / number of whole cells × 100%".

2-4. 인공 2-4. art CSF와 줄기세포CSF and stem cells 저온보존액들을 이용한 저온 보관 세포에 대한 생존율 확인시험(hypothermic preserved cell’s cell viability test) Hypothermic preserved cell viability test for cryopreserved cells using cold preservation solutions

총 7일간 배양된 세포 배양 플라스크 내 80-90% 채워진 상태의 세포에 0.125% 트립신/EDTA를 처리하고 세포를 수확한 다음 400 ×g 조건에서 4분간 원심분리 후 상층액을 제거하였다. DPBS로 현탁 후 총세포수 및 세포생존율을 측정하였다. 1.1×107 세포 농도의 세포현탁액을 각각의 튜브에 분주한 다음 400 ×g 조건에서 4분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하였다. 1.1×107 세포의 백색세포층이 담긴 튜브에 1.1 mL의 인공 CSF 또는 세포 저온 보존액을 첨가하여 조심히 현탁한 후 이 중 1 mL의 세포현탁액을 주사바늘(17G)이 장착된 주사기(5 mL)에 각각 충전하였다. 세포현탁액 충전 완료 후 주사바늘을 제거하고, 주사기에 캡을 장착한 다음 2차 포장지(멸균 파우치 포장지)에 넣어 밀봉하여 냉장보관(2-8℃) 후 0, 24, 48, 72시간 간격으로 세포생존율을 측정하였다.Cells in 80-90% filled cells in a 7-day-old cell culture flask were treated with 0.125% trypsin / EDTA, harvested, and centrifuged at 400 × g for 4 minutes to remove the supernatant. Total cell number and cell viability after suspension in DPBS were measured. The cell suspension at a concentration of 1.1 × 10 7 cells was dispensed into each tube and centrifuged at 400 × g for 4 minutes before removing the supernatant. 1.1 mL of artificial CSF or low temperature preservation solution was added to the tube containing the 1.1 × 10 7 white cell layer and carefully suspended. 1 mL of the cell suspension was added to a syringe (5 mL) equipped with a needle (17G) Respectively. After filling the cell suspension, remove the needles, place the cap on the syringe, seal it in the secondary packaging paper (sterile pouch wrapping paper), and store it at 0, 24, 48, Survival rate was measured.

3. 통계학적 처리방법3. Statistical Processing Method

실험결과는 평균±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였고, 대조군과 실험군 사이 또는 실험군 사이의 비교는 Student's t-test로 하였으며, 통계학적 유의수준은 p값이 0.05 미만일 때 유의하다고 정의하였다.The test results were expressed as mean standard deviation (SD), and comparisons between the control and experimental groups were made by Student's t-test. Statistical significance was defined as significant when the p value was less than 0.05.

실험결과Experiment result

1. 인간 CSF와 인공 CSF 저온 보존 세포의 생존율 확인시험1. Survival rate test of human CSF and artificial CSF cold preserved cells

수확한 세포를 1×107 세포/mL의 농도로 인간 CSF, 인공 CSF 제품에 각각 현탁한 다음 최종 주사기에 충전하여 72시간 동안 저온보존하여 0, 24, 48, 72시간 간격으로 세포생존율을 측정하였다.The harvested cells were each suspended in human CSF and artificial CSF products at a concentration of 1 × 10 7 cells / mL, and then filled in a final syringe and stored at low temperature for 72 hours to measure cell viability at 0, 24, 48 and 72 hours intervals Respectively.

인간 CSF와 인공 CSF에 72시간 저온보존한 세포의 생존율을 측정한 결과, 24시간에 인간 CSF는 90.3±1.4%, 인공 CSF은 93.0±0.5%로 확인되었으며, 48시간에 인간 CSF는 84.3±2.6%, 인공 CSF은 87.3±1.2%로 확인되었다. 72시간에 인간 CSF는 77.0±1.5%, 인공 CSF은 83.0±1.0%로 확인되었다(도 1). The survival rate of human CSF and artificial CSF was 72.3 hours, and as a result, the human CSF and artificial CSF were found to be 90.3 ± 1.4% and 93.0 ± 0.5% at 24 hours and 84.3 ± 2.6 , And artificial CSF was 87.3 ± 1.2%. At 72 hours, the human CSF was 77.0 ± 1.5% and the artificial CSF was 83.0 ± 1.0% (FIG. 1).

24시간에 총 2종의 현탁제 모두 80% 이상의 생존율을 보였으며, 48시간에도 2종 모두 80% 이상의 생존율을 보였다. 72시간에는 인간 CSF은 약 70% 대의 생존율 및 세포응집 현상을 보인 반면, 인공 CSF는 80% 이상의 생존율과 단일세포(single cell)의 성상을 유지한 것으로 확인되어 세포 저온보존효과가 높았다(도 2).The survival rate was 80% or more in all of the two suspensions at 24 hours, and 80% or more in both of them at 48 hours. At 72 hours, human CSF showed a survival rate and cell aggregation of about 70%, whereas artificial CSF showed survival rate of 80% or more and maintained the characteristic of single cell (Fig. 2 ).

2. 인간 CSF와 인공 CSF의 세포사멸 분석시험2. Cell death assay of human CSF and artificial CSF

수확한 세포를 인간 CSF와 인공 CSF로 각각 1×107 세포/mL의 농도로 현탁한 다음 최종 주사기에 충전하여 72시간 동안 저온보존하여 24, 48, 72시간 간격으로 Annexin-V apoptosis kit를 이용하여 세포사멸정도를 분석하였다. 그 결과, 인공 CSF는 24시간을 기준으로 48, 72시간의 생존율 및 여러 기전의 사멸율을 조사한 결과, 모두 유의적인 차이가 발생하지 않음을 확인하였다(도 3a, b, c). 그러나 인공 CSF는 후기 세포사멸(lately apoptosis)의 세포 사멸율이 시간 의존적으로 24시간(4.5±1.0%)에 비해 72시간(9.6±3.1%)으로 서서히 증가된 반면, 인간 CSF는 24시간과 72시간에 각각 12.0±1.0%, 22.5±0.1%로 증가된 것으로 확인되어 인공 CSF의 세포사멸 방지효과를 통해 장기간 저온보존 효과가 높은 것으로 사료된다(도 3c).The harvested cells were suspended in human CSF and artificial CSF at a concentration of 1 × 10 7 cells / mL, respectively. Then, the cells were stored in a final syringe for 72 hours at an interval of 24, 48, and 72 hours using the Annexin-V apoptosis kit And the degree of apoptosis was analyzed. As a result, the survival rate of 48 and 72 hours and the mortality rate of various mechanisms of artificial CSF were examined on the basis of 24 hours, and it was confirmed that there was no significant difference between them (Figs. 3a, b, c). However, in artificial CSF, the apoptosis rate of lately apoptosis was gradually increased to 72 hours (9.6 ± 3.1%) in 24 hours (4.5 ± 1.0%) compared with 24 hours in human CSF, Time to 12.0 ± 1.0% and 22.5 ± 0.1%, respectively. Thus, long-term low-temperature preservation effect is believed to be high through the effect of preventing the apoptosis of artificial CSF (FIG. 3C).

3. 인간 CSF와 인공 CSF 저온보존 세포의 회복능 시험3. Recovery test of human CSF and artificial CSF cold preserved cells

72시간 저온보존된 세포를 1회 배양하여 증식된 세포(recovery cell)의 세포수확량 확인 및 CCK8-어세이 방법을 이용하여 세포의 증식력을 확인하였다.Cells incubated for 72 hours at low temperature were cultured once, and cell proliferation was confirmed using CCK8-assay method and confirmation of cell harvest of the recovery cells.

72시간 저온보존된 세포를 생세포수 기준으로 5.0×103 세포/웰 밀도로 96웰 플레이트에 접종한 후 7일간 배양하였으며, 0, 4, 7일차 간격으로 CCK-8 어세이를 측정하여 세포증식력(cell proliferation ability)을 확인하였다. 인간 CSF와 인공 CSF 별로 0일차, 4일차, 7일차별 O.D 값에 대한 기울기 값(slope values)은 인간 CSF(0.122±0.009), 인공 CSF(0.105±0.014)로 도출되었으며, 통계적 유의성 검증한 결과, 인간 CSF 또는 인공 CSF 기준으로 비교하였을 시, 인공 CSF은 유의적으로 차이가 없는 것으로 사료된다(도 4).The cells were incubated for 72 hours at a density of 5.0 × 10 3 cells / well on a 96-well plate. Cells were cultured for 7 days. CCK-8 assay was performed at 0, 4, (cell proliferation ability). The slope values for the 0th, 4th and 7th discrimination OD values of human CSF and artificial CSF were derived from human CSF (0.122 ± 0.009) and artificial CSF (0.105 ± 0.014) , Human CSF or artificial CSF, artificial CSF was not significantly different (FIG. 4).

72시간 저온보관된 세포를 생세포수 기준으로 2.0×105 세포의 밀도로 T175 플라스크에 접종한 후 7일간 배양하였으며, 7일차에 세포를 수확하여 세포생존율을 측정한 결과, 대조군인 control(fresh cell)은 97.2±1.4%, 시험군인 인간 CSF, 인공 CSF은 각각 95.5±1.2%, 97.1±1.7%로 측정되었다. 대조군인 control(fresh cell)을 기준으로 시험군에 대한 통계적 유의성 검증한 결과, 인간 CSF, 인공 CSF은 유의적 차이가 없는 것으로 확인되었다(도 5). 또한 각각의 세포들에 대한 성상을 확인한 결과, 육안으로도 차이가 없음을 확인하였다(도 6).Cells harvested at day 7 were inoculated into T175 flasks at a density of 2.0 × 10 5 cells per 72 hours, and the cell viability was measured. As a result, control (fresh cell ) Were 97.2 ± 1.4%, and test human CSF and artificial CSF were 95.5 ± 1.2% and 97.1 ± 1.7%, respectively. As a result of the statistical significance test on the test group based on the control (fresh cell) as the control group, it was confirmed that there was no significant difference between the human CSF and the artificial CSF (FIG. 5). As a result of confirming the characteristics of each cell, it was confirmed that there was no difference with the naked eye (FIG. 6).

4. 인공 CSF와 줄기세포 저온 보존액들을 이용한 저온 보존 세포의 생존율 확인 시험 4. Examination of survival rate of low-temperature preserved cells using artificial CSF and stem cell cold storage solutions

수확한 세포를 인공 CSF 및 3종의 저온 보존액 제품으로 각각 1×107 세포/mL의 농도로 현탁한 다음 최종 주사기에 충전하여 72시간 동안 냉장보관(2-8℃)하여 0, 24, 48, 72시간 간격으로 세포생존율을 측정하였다.The harvested cells were suspended in artificial CSF and 3 kinds of cold storage products at a concentration of 1 × 10 7 cells / mL, and then filled in a final syringe and refrigerated (2-8 ° C) for 72 hours. , And cell viability was measured at 72 hour intervals.

인공 CSF와 3종의 저온 보존액 제품 각각에서 72 시간 동안 저온 보관한 세포의 생존율을 측정한 결과, 24시간에서 인공 CSFS는 90.3±3.6%의 세포 생존율을 나타냈으며, 저온 보존액인 FRS, ChillProtec, ChillProtec plus는 각각 83.3±3.6%, 82.9±3.4%. 92.6±1.2%의 세포 생존율을 나타냈다. 48시간에서 인공 CSF는 84.4±3.3%의 세포 생존율을 나타냈으며, FRS, ChillProtec, ChillProtec plus는 81.9±2.9%, 76.1±1.4%. 90.0±1.7%의 세포 생존율을 나타냈다. 또한, 72시간에서 인공 CSF는 83.4±3.0%의 세포 생존율을 나타냈고, FRS, ChillProtec, ChillProtec plus는 73.3±1.1%, 71.0±2.6%. 87.6±1.5%의 세포 생존율을 나타냈다(도 7).The survival rates of artificial CSF and 3 kinds of low temperature storage products were found to be 90.3 ± 3.6% at 24 hours, respectively. The survival rate of FRS, ChillProtec, ChillProtec plus were 83.3 ± 3.6% and 82.9 ± 3.4%, respectively. The cell viability was 92.6 ± 1.2%. At 48 h, artificial CSF showed cell survival rate of 84.4 ± 3.3%, and FRS, ChillProtec, and ChillProtec plus were 81.9 ± 2.9% and 76.1 ± 1.4%, respectively. The cell viability was 90.0 ± 1.7%. In addition, at 72 hours, the survival rate of artificial CSF was 83.4 ± 3.0%, and FRS, ChillProtec, and ChillProtec plus were 73.3 ± 1.1% and 71.0 ± 2.6%, respectively. And the cell viability was 87.6 ± 1.5% (FIG. 7).

24시간에서 인공 CSF와 모든 세포 저온 보존액들은 80% 이상의 생존율을 보였으나, 72시간에서는 인공 CSF와 ChillProtec plus제품에서 80% 이상의 생존율을 보였다. ChillProtec plus 제품이 가장 높은 세포 보존 생존율을 나타냈으나, 저온보존 기간 동안의 세포 성상을 관찰한 결과, 시간 의존적으로 세포응집현상의 문제가 발생하였다. 이는 줄기 세포를 환자에게 투여 시 혈관이 막히거나 전달 경로가 막히는 등에 부작용을 보일 수 있기에 환자 투여용 세포 저온 보존 주사 제형으로는 적합하지 않은 특징을 보였다. 이에 단일 세포의 성상을 보존 기간 동안 유지한 인공 CSF가 가장 세포에 대한 저온 보존 효과가 높은 환자 투여용 세포 보존 제형인 것으로 확인되었다(도 8).At 24 hours, the survival rate of artificial CSF and all cell cold storage was 80% or more, but the survival rate was over 80% in artificial CSF and ChillProtec plus at 72 hours. ChillProtec plus showed the highest cell preservation survival rate, but the cell structure during the cold storage period showed time - dependent cell aggregation problem. This is because the stem cells can not be used as a low-temperature preservative injection for patient administration because they can cause side effects such as clogging of blood vessels or clogging of delivery channels when administered to patients. Thus, it was confirmed that the artificial CSF maintained the single cell property during the preservation period was the cell preservation formulation for patient administration which has the highest cold preservation effect on the cells (Fig. 8).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims (7)

나트륨 이온 120 내지 160 mEq/L, 칼륨 이온 1 내지 6 mEq/L, 염소 이온 75 내지 155 mEq/L, 칼슘 이온 0.5 내지 5 mEq/L, 마그네슘 이온 0.5 내지 5 mEq/L, 중탄산 이온 5 내지 45 mEq/L, 인산 0.1 내지 5 mmol/L 및 환원당 0.1 내지 10 g/L을 포함하고, N-아세틸시스테인 및 N,N-디아세틸시스틴을 포함하지 않으며, 팽창제(oncotic agent)를 포함하지 않는, pH 6.8 ~ 8.2의 수용액으로 이루어진 세포 보존제.
L of sodium ions, 1 to 6 mEq / L of potassium ions, 75 to 155 mEq / L of chlorine ions, 0.5 to 5 mEq / L of calcium ions, 0.5 to 5 mEq / L of magnesium ions, 5 to 45 mEq / wherein the composition does not contain N-acetylcysteine and N, N-diacetylcystine and does not include an oncotic agent, wherein the composition contains 0.1 to 5 mmol / L of mEq / L, 0.1 to 5 mmol / L of phosphoric acid, A cell preservative consisting of an aqueous solution having a pH of 6.8 to 8.2.
제 1 항에 있어서, 상기 세포 보존제는 나트륨 이온 145 mEq/L, 칼륨 이온 2.8 mEq/L, 염소 이온 129 mEq/L, 칼슘 이온 2.3 mEq/L, 마그네슘 이온 2.2 mEq/L, 중탄산 이온 23.1 mEq/L, 인산 1.1 mmol/L 및 환원당 0.61 g/L을 포함하고, N-아세틸시스테인 및 N,N-디아세틸시스틴을 포함하지 않으며, 팽창제(oncotic agent)를 포함하지 않는, pH 7 ~ 7.5의 수용액으로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포 보존제.
The method of claim 1, wherein the cell preservative is selected from the group consisting of sodium ion 145 mEq / L, potassium ion 2.8 mEq / L, chlorine ion 129 mEq / L, calcium ion 2.3 mEq / L, magnesium ion 2.2 mEq / L, bicarbonate ion 23.1 mEq / L, an aqueous solution of pH 7 to 7.5 containing 1.1 mmol / L of phosphoric acid and 0.61 g / L of reducing sugar and no N-acetyl cysteine and N, N-diacetylcystine and no oncotic agent &Lt; / RTI &gt;
제 1 항에 있어서, 상기 세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 세포 보존제.
The cell preserving agent according to claim 1, wherein the cell is a bone marrow-derived mesenchymal stem cell.
제 1 항에 있어서, 상기 세포 보존제는 0 내지 10℃의 온도에서 보관 시 세포의 생존율을 높이는 것을 특징으로 하는 세포 보존제.
The cell preserving agent according to claim 1, wherein the cell preservative enhances the cell survival rate when stored at a temperature of 0 to 10 ° C.
제 1 항에 있어서, 상기 세포 보존제에 현탁된 세포는 뇌경막 내 주사가 가능한 것을 특징으로 하는 세포 보존제.
The cell preserving agent according to claim 1, wherein the cells suspended in the cell preserving agent are intraperitoneally injectable.
제 1 항에 있어서, 상기 세포 보존제는 세포치료제의 보관 및 이동에 사용함으로써 세포치료제의 치료효과를 증대시키는 것을 특징으로 하는 세포 보존제.
The cell preserving agent according to claim 1, wherein the cell preservative is used for storage and transportation of a cell therapeutic agent to increase the therapeutic effect of the cell therapeutic agent.
제 1 항에 있어서, 보존 후의 세포 생존율이 적어도 70% 이상인 세포 보존제. The cell preservative according to claim 1, wherein the cell viability after storage is at least 70% or more.
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