KR20180004242A

KR20180004242A - 알쯔하이머병의 치료를 위한 뉴런 저장소-작동된 칼슘 진입 경로의 활성화

Info

Publication number: KR20180004242A
Application number: KR1020177035257A
Authority: KR
Inventors: 일리아 베즈프로즈반니; 후아 장
Original assignee: 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
Priority date: 2015-05-08
Filing date: 2016-05-04
Publication date: 2018-01-10
Also published as: CN107835688A; JP2018515507A; WO2016182812A8; US20180147206A1; WO2016182812A1; HK1250658A1

Abstract

본 명세는 알쯔하이머병의 신규의 치료 방법을 제공한다. 특히, 본 명세는 알쯔하이머병 환자에서 뉴런 저장소-작동된 칼슘 진입 경로의 활성화에 관한 것이다.

Description

알쯔하이머병의 치료를 위한 뉴런 저장소-작동된 칼슘 진입 경로의 활성화

우선권 주장

본 출원은 2015년 5월 8일자로 출원된 미국 가 출원 제 62/159,083 호에 대한 우선권의 이점을 주장하며, 상기 출원의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 인용된다.

연방 자금지원의 진술

본 발명은 국립보건원에 의해 부여된 허가번호 1R01NS080152-01A1하에서 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.

I. 분야

본 명세는 일반적으로 신경생물학, 신경생리학, 약물학 및 생화학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 명세는 알쯔하이머병 환자에서 뉴런 저장소-작동된 칼슘 진입 경로의 활성화에 관한 것이다.

II. 관련 기술의 설명

알쯔하이머병(AD)은 증가된 인간 수명에 의해 야기되는 현대 인류의 위협이다. 100년 넘게 AD 병리학에 대한 광범위 연구에도 불구하고, AD에 대한 질병-개질 치료법은 존재하지 않는다. AD에서 기억상실은 "시냅스 기능상실"로부터 발생한다(Koffie et al., 2011; Selkoe et al., 2002 and Tu et al., 2014). 시냅스후 수상돌기 가시는 학습과 기억에서 중요한 역할을 한다(Bourne et al., 2008 and Kasai et al., 2003). 시냅스후 가시들은 대개 그들의 형태학적 구조에 따라 3개의 그룹 - 버섯 가시, 얇은 가시 및 뭉툭한 가시로 분류된다(Bourne et al., 2008 and Kasai et al., 2003). 상기 버섯 가시는 기억 저장을 맡고 있는 시냅스를 기능적으로 더 강하게 하는 안정한 "기억력 가시"인 것으로 제안되었다(Bourne et al., 2007). 상기 발명자 등은 앞서 버섯 가시가 AD에서 강하게 제거되며 버섯 가시의 손실은 상기 질병의 진행 동안 인지력 감퇴에 근원할 수 있음을 제안하였다(Popugaeva et al., 2013; Popugaeva et al., 2012; Tackenberg et al., 2009 and Bezprozvanny et al., 2013). 그러나, AD에서 버섯 가시의 손실에 원인이 되는 세포 생물학 기전은 이해가 충분하지 않다.

최근에, 발명자들은 시냅스후 가시에서 뉴런 저장소-작동된 칼슘 진입(nSOC)이, 시냅스 CaMKII를 구성적으로 활성화시킴으로써 버섯 가시를 안정화하는데 핵심적인 역할을 함을 입증하였다(Sun et al., 2014). 발명자들은 시냅스 nSOC가 기질 상호작용 분자 2(STIM2)에 의해 조절되며 STIM2-nSOC-CaMKII 경로가 PS1M146V 녹-인(PS1KI) 뉴런, 노화 뉴런 및 산발성 AD 뇌에서 STIM2 단백질의 하향조절로 인해 손상됨을 추가로 입증하였다(Sun et al., 2014]. 더욱이, 발명자들은 STIM2 단백질의 발현이 PS1KI 해마 뉴런에서 시냅스 nSOC 및 버섯 가시 손실을 구제함을 입증하였다(Sun et al., 2014). 추적 연구에서, 이들은 STIM2-nSOC 경로가 아밀로이드 독성 상태에서 하향조절되고 STIM2의 과발현이 아밀로이드-유발된 손실로부터 해마 버섯 가시를 보호함을 입증하였다(Popugaeva et al., 2015 and Zhang et al., 2015). 이들 연구는 STIM2-nSOC 경로가 잠재적으로 중요한 AD 치료 표적이나, 상기 시냅스 가시 중의 STIM2-조절된 nSOC 채널의 분자 정체는 알 수 없음을 암시하였다.

따라서, 본 명세에 따라, 알쯔하이머병이 있는 포유동물 대상체에게 하기 화학식 I으로 추가로 정의되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 투여함을 포함하는, 상기 대상체의 치료 방법을 제공한다:

[화학식 I]

상기 식에서,

각각의 R₁은 아미노, 시아노, 카복실, 할로, 하이드록시 또는 니트로; 또는 알킬아미노_(C≤8), 디알킬아미노_(C≤8), 사이클로알킬아미노_(C≤8), 디사이클로알킬아미노_(C≤8) 또는 이들 기 중 어느 하나의 치환된 버전 중에서 독립적으로 선택되고;

x는 1, 2, 3, 4 또는 5이고;

R₂는 수소, 알킬_(C≤8), 또는 치환된 알킬_(C≤8)이고;

n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;

각각의 R₃은 아미노, 카복실, 시아노, 할로, 하이드록시 또는 니트로; 또는 알킬_(C≤8), 사이클로알킬_(C≤8), 알케닐_(C≤8), 알키닐_(C≤8), 아실_(C≤8), 아미도_(C≤8) 또는 이들 기 중 어느 하나의 치환된 버전 중에서 독립적으로 선택되고;

y는 1, 2, 3, 4 또는 5이다.

일부 실시태양에서, 상기 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 II로서 추가로 정의된다:

[화학식 II]

상기 식에서,

R₁, x, R₂, n 및 R₃은 상기에 정의된 바와 같다.

일부 실시태양에서, 상기 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 III로서 추가로 정의된다:

[화학식 III]

상기 식에서,

R₁, x, n 및 R₃은 상기에 정의된 바와 같다.

일부 실시태양에서, 상기 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 IV로서 추가로 정의된다:

[화학식 IV]

상기 식에서,

R₁, n 및 R₃은 상기에 정의된 바와 같다.

일부 실시태양에서, R₁은 니트로이다. 다른 실시태양에서, R₁은 아미노, 알킬아미노_(C≤8), 치환된 알킬아미노_(C≤8), 디알킬아미노_(C≤8), 또는 치환된 디알킬아미노_(C≤8), 이다. 일부 실시태양에서, n은 2 또는 3이다. 일부 실시태양에서, n은 2이다. 일부 실시태양에서, R₃은 할로, 예를 들어 클로로이다. 다른 실시태양에서, R₃은 아미도_(C≤8), 또는 치환된 아미도_(C≤8), 예를 들어 -NHC(O)CH₃이다. 일부 실시태양에서, 상기 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식들로서 추가로 정의된다:

알쯔하이머병이 있는 포유동물 대상체에게 작용물질 또는 TRPC6 또는 Orai2를 투여함을 포함하는 상기 대상체의 치료 방법을 또한 제공하며, 여기에서 상기 작용물질은 하이퍼포린 또는 하이퍼포린 유도체가 아니다. 알쯔하이머병이 있는 포유동물 대상체에게 nSOC 경로의 작용물질을 투여함을 포함하는 상기 대상체의 치료 방법을 또한 제공하며, 여기에서 상기 작용물질은 하이퍼포린 또는 하이퍼포린 유도체 또는 유사체가 아니다. 알쯔하이머병이 있는 포유동물 대상체에게 디아실글리세롤(DAG)-유도된 TRPC6 활성화의 강화제(potentiator)를 투여함을 포함하는, 상기 대상체의 치료 방법을 더욱 추가로 제공한다.

상기 대상체를 적어도 제2 알쯔하이머병 치료제(therapy), 예를 들어 콜린에스테라제 억제제, 무스카린 작용물질, 산화방지제, 소염제, 갈란타민(Reminyl: 레미닐), 타크린(Cognex: 코그넥스), 셀레질린(selegiline), 피소스티그민(physostigmine), 레비스티그민, 도네페질(donepezil), (아리셉트: Aricept), 리바스티그민(Exelon: 엑셀론), 메트리포네이트(metrifonate), 밀라멜린(milameline), 자노멜린(xanomeline), 사에루졸(saeluzole), 아세틸-L-카르니틴, 이데베논(idebenone), ENA-713, 멤릭(memric), 쿠에티아핀(quetiapine), 뉴레스트롤(neurestrol) 또는 뉴로미달(neuromidal)로 추가로 치료할 수 있다. 치료는 기역력, 인지력 또는 학습의 개선, 증상 또는 병태생리학의 진행의 늦춤, 삶의 질의 개선, 또는 수명의 증가 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 화합물 또는 작용물질을 경구로, 또는 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 두개내, 관절내, 전립선내, 흉막내, 근육내 또는 피하를 포함한 주사에 의해 투여할 수 있다. 상기 화합물 또는 작용물질을 하루에 1, 2, 3 또는 4회 투여할 수 있다. 상기 화합물 또는 작용물질을 만성적으로 투여할 수 있다. 상기 방법은 상기 대상체에서 상기 화합물 또는 작용물질 투여 전 및/또는 투여 후의 인지력 또는 기억력을 측정함을 추가로 포함할 수 있다. 상기 포유동물 대상체는 인간, 예를 들어 조기 발병 알쯔하이머병 또는 후기 발병 알쯔하이머병을 앓고 있는 인간일 수 있다. 상기 포유동물 대상체는 비-인간 동물 대상체일 수 있다.

더욱 더 또 다른 실시태양에서, 약학적 완충제, 희석제 또는 부형제 중에서 제형화된 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학 조성물을 제공한다:

[화학식 I]

상기 식에서,

각각의 R₁은 아미노, 시아노, 카복실, 할로, 하이드록시 또는 니트로; 또는

알킬아미노_(C≤8), 디알킬아미노_(C≤8), 사이클로알킬아미노_(C≤8), 디사이클로알킬아미노_(C≤8), 또는 이들 기 중 어느 하나의 치환된 버전 중에서 독립적으로 선택되고;

x는 1, 2, 3, 4 또는 5이고;

R₂는 수소, 알킬_(C≤8), 또는 치환된 알킬_(C≤8)이고;

n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;

각각의 R₃은 아미노, 카복실, 시아노, 할로, 하이드록시 또는 니트로; 또는

알킬_(C≤8), 사이클로알킬_(C≤8), 알케닐_(C≤8), 알키닐_(C≤8), 아실_(C≤8), 아미도_(C≤8), 또는 이들 기 중 어느 하나의 치환된 버전 중에서 독립적으로 선택되고;

y는 1, 2, 3, 4 또는 5이다.

일부 실시태양에서, 상기 조성물은 하기 화학식들에 의해 추가로 정의되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 추가로 포함한다:

상기 조성물은 정제, 캡슐 또는 분말과 같은 고체 투여형으로 존재할 수 있다. 상기 조성물은 경구 액체 투여형 또는 주사가능한 액체 투여형으로 존재할 수 있다. 상기 조성물은 1 내지 100 ㎎/㎏, 5 내지 50 ㎎/㎏ 또는 약 10 ㎎/㎏, 15 ㎎/㎏, 20 ㎎/㎏, 25 ㎎/㎏ 또는 30 ㎎/㎏의 상기 화합물을 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 임의의 방법 또는 조성물을 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물에 관하여 실행할 수 있음이 고려된다.

"하나의"란 단어의 사용은 청구범위 및/또는 명세서에서 "포함하는"이란 용어와 함께 사용될 때 "하나"를 의미할 수 있으나, 상기는 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치한다.

본 명세서에서 논의된 임의의 실시태양을 상기 명세의 임의의 방법 또는 조성물에 대해서 실행할 수 있으며, 이와 역으로도 실행할 수 있음이 고려된다. 더욱 또한, 상기 명세의 조성물 및 키트를 사용하여 상기 명세의 방법들을 성취할 수 있다.

본 출원 전체를 통해서, "약"이란 용어는 하나의 값이 장치, 상기 값을 측정하는데 사용되는 방법, 또는 연구 대상체들 간에 존재하는 변화에 대한 오차의 내재하는 변화를 포함함을 가리키는데 사용된다.

하기의 도면은 본 명세서의 부분을 형성하며 본 명세의 몇몇 태양을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 상기 명세는 본 명세서에 제공된 특정한 실시태양의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조하여 보다 양호하게 이해될 수 있다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 제작된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 컬러 도면(들)과 함께 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청시 및 필요한 수수료 지불시 관청에 의해 제공될 것이다.
도 1A 내지 E. TRPC6 및 Orai2는 해마 시냅스 중에 STIM2 조절된 복합체를 형성한다. (도 1A) TRPC6 및 Orai2 토끼 다클론 항체를 사용하여 해마 시냅스 용해물로부터 STIM2를 동시-면역침전시켰다. 투입물은 면역침전에 사용된 용해물의 1/10이다. (도 1B) GST, GST-S2-SOAR 및 GST-S2-LASS 재조합 단백질을, HA-Orai2 또는 YFP-TRPC6 발현 구조물로 형질감염된 HEK293 세포로부터의 용해물과 함께 풀-다운 실험에 사용하였다. 투입물은 풀다운 실험에 사용된 용해물의 1/50이다. (도 1C) 항-HA 마우스 단클론 항체 또는 항-TRPC6 토끼 다클론 항체를, YFP-TRPC6 및 HA-Orai2 발현 플라스미드로 동시-형질감염된 HEK293 세포로부터의 용해물과 함께 면역침전 실험에 사용하였다. 투입물 레인은 면역침전에 사용된 용해물의 1/20이다. (도 1D) 항-TRPC6 토끼 다클론 항체를, HA-Orai2, HA-TRPC6 및 YFP-STIM2 또는 YFP-STIM2-LASS 구조물로 동시-형질감염된 HEK293 세포로부터의 용해물과 함께 면역침전 실험에 사용하였다. 실험 1 및 3을 용해에 앞서 10분 동안 통상적인 ACSF(2 mM Ca²⁺)에서 배양된 세포로부터 제조된 용해물로 수행하였다. 실험 2 및 4는 용해에 앞서 10분 동안 Ca²⁺-부재 ACSF(400 μM EGTA가 첨가됨) 중에서 배양된 세포로부터 제조된 용해물로 수행하였다. 실험 1 내지 4에 대한 투입물 레인은 면역침전에 사용된 전체 용해물의 1/50을 함유한다. (도 1E) 도 1D에 나타낸 결과들(실험 1 내지 4)을 설명하는 모델. STIM2는 SOAR 도메인을 통해 Orai2에 직접 강하게 결합하고 상이한 영역을 통해 TRPC6에 약하게 결합한다(실험 1). Ca²⁺ 저장소의 고갈은 기능성 TRPC6/Orai2-STIM2 복합체의 조립을 촉진한다(실험 2). STIM2-LASS 돌연변이체는 Orai2에 결합하지 않으며 대신에 TRPC6와의 비-생산적인 복합체로 모인다(실험 3). STIM2-LASS 돌연변이체와 Orai2 및 TRPC6와의 회합은 ER 저장소 고갈에 의해 영향을 받지 않는다(실험 4).
도 2A 내지 J. TRPC6 및 Orai2가 가시 nSOC 및 버섯 가시 유지에 필요하다. (도 2A 내지 B) 대조용 RNAi(siCtrl), TRPC6에 대한 RNAi(siT6, 도 2A) 또는 Orai2에 대한 RNAi(siO2, 도 2B)를 암호화하는 렌티바이러스로 감염된 야생형 해마 뉴런 배양물로부터의 용해물 분석의 웨스턴 블럿. 상기 용해물을 나타낸 바와 같이 TRPC6, Orai2, PSD95, pCaMKII, 및 CAMKII에 대한 항체들로 블럿팅하였다. GAPDH가 로딩 대조용으로서 사용되었다. 3개의 독립적인 배양물로부터의 전형적인 결과를 나타낸다. (도 2C 및 2G) 야생형(도 2C) 및 PS1KI(도 2G) 해마 뉴런 가시에서 GCaMP5.3 형광 신호 변화의 시간 과정. 세포외 Ca²⁺ 재첨가 시간을 자취 위에 검은색 막대로 나타낸다. Ca²⁺ 재-첨가 50초 전에 100 μM DHPG를 가하였다. 뉴런을 대조용 RNAi(siCtrl), TRPC6에 대한 RNAi(siT6) 또는 Orai2에 대한 RNAi(siO2)를 암호화하는 렌티바이러스로 감염시켰다. 대조용 뉴런(Con) 및 STIM2 발현 플라스미드로 동시-형질감염된 뉴런(+STIM2)에 대한 결과를 나타낸다. 각 실험 그룹에 대해서 개별적인 가시(회색) 및 평균(적색) 형광 자취를 나타낸다. (도 2D 및 2H) 평균 nSOC 가시 피크 진폭을 도 2C(도 2D) 및 도 2G(도 2H)에 나타낸 각 그룹의 세포에 대해서 나타낸다. 각 그룹에 대해 평균±SE(n≥45 가시)로서 나타낸 평균 ΔF/F₀ 신호. ***, p<0.001. 도 2E 및 2I. DIV7에서 TD-토마토로 형질감염되고 DIV15-16에서 고정된 야생형(도 2E) 및 PS1KI(도 2I) 해마 뉴런의 공초점 상들. 상기 뉴런들은 대조용 RNAi(siCtrl), TRPC6에 대한 RNAi(siT6) 또는 Orai2에 대한 RNAi(siO2)를 암호화하는 렌티바이러스로 감염되었다. 대조용 뉴런(Con) 및 STIM2 발현 플라스미드로 동시-형질감염된 뉴런(+STIM2)에 대한 결과를 나타낸다. 스케일 바는 10 ㎛이다. (도 2F 및 2J) 도 2E(도 2F) 및 도 2I(도 2J)에 나타낸 각 그룹의 세포에 대한 버섯 가시의 평균 분율을 평균±SE(n≥20 뉴런)로서 나타낸다. ***, p<0.001, *, p<0.05.
도 3A 내지 D. 시냅스 nSOC의 지지에서 TRPC6 및 Orai2의 기능적 역할. (도 3A) 야생형, PS1KI 및 APPKI 해마 뉴런의 가시에서 GCaMP5.3 형광 신호 변화의 시간 과정. 세포외 Ca²⁺ 재첨가 시간을 자취 위에 검은색 막대로 나타낸다. Ca²⁺ 재-첨가 50초 전에 100 μM DHPG를 가하였다. 결과를 대조용(CON) 뉴런 및 나타낸 바와 같이 TRPC6, Orai2, STIM2 또는 STIM2-LASS 플라스미드로 동시-형질감염된 뉴런에 대해 나타낸다. 각 실험 그룹에 대해서 개별적인 가시(회색) 및 평균(적색) 형광 자취를 나타낸다. (도 3B) 평균 nSOC 가시 피크 진폭을 도 3A에 나타낸 각 그룹의 세포에 대해서 나타낸다. 각 그룹에 대해 평균±SE(n≥73 가시)로서 나타낸 평균 ΔF/F₀ 신호. ***, p<0.001. (도 3C) DIV7에서 TD-토마토로 형질감염되고 DIV15-16에서 고정된 야생형, PS1KI 및 APPKI 해마 뉴런의 공초점 상들. 대조용 뉴런(CON) 및 TRPC6, STIM2 또는 STIM2-LASS 플라스미드로 동시-형질감염된 뉴런에 대한 상들을 나타낸다. 스케일 바는 10 ㎛이다. (도 3D) 도 3C에 나타낸 각 그룹의 세포에 대한 버섯 가시의 평균 분율을 평균±SE(n≥19 뉴런)로서 나타낸다. ***, p<0.001.
도 4A 내지 E. NSN21778 및 하이퍼포린은 AD 해마 뉴런에서 시냅스 nSOC 및 버섯 가시 손실을 구제한다. (도 4A) NSN21778 및 하이퍼포린의 화학적 구조. (도 4B) 야생형, PS1KI 및 APPKI 해마 뉴런의 가시에서 GCaMP5.3 형광 신호 변화의 시간 과정. 세포외 Ca²⁺ 재첨가 시간을 자취 위에 검은색 막대로 나타낸다. Ca²⁺ 재-첨가 50초 전에 100 μM DHPG를 가하였다. 결과를 대조용(CON) 뉴런 및 나타낸 바와 같이 30분 동안 300 nM NSN21778(+NSN) 또는 300 nM 하이퍼포린(+Hyp)으로 전처리한 뉴런에 대해 나타낸다. 각 실험 그룹에 대해서 개별적인 가시(회색) 및 평균(적색) 형광 자취를 나타낸다. (도 4C) 평균 nSOC 가시 피크 진폭을 패널 B에 나타낸 각 그룹의 세포에 대해서 나타낸다. 각 그룹에 대해 평균±SE(n≥45 가시)로서 나타낸 평균 ΔF/F₀ 신호. ***, p<0.001. (도 4D) TD-토마토로 형질감염되고 DIV15-16에서 고정된 야생형, PS1KI 및 APPKI 해마 뉴런의 공초점 상들. 대조용 뉴런(CON) 및 고정에 앞서 16시간 동안 30 nM NSN21778(+NSN) 또는 30 nM 하이퍼포린(+Hyp)으로 처리된 뉴런에 대한 상들을 나타낸다. 스케일 바는 10 ㎛이다. (도 4E) 도 4D에 나타낸 각 그룹의 세포에 대한 버섯 가시의 평균 분율을 평균±SE(n≥18 뉴런)로서 나타낸다. ***, p<0.001.
도 5A 내지 E. TRPC6은 NSN21778 및 하이퍼포린에 대한 분자 표적이다. (도 5A 내지 B) Fura-2 Ca²⁺ 신호의 시간 과정을, EGFP 플라스미드(GFP) 또는 EGFP 및 TRPC6 플라스미드의 조합(TRPC6)으로 형질감염된 HEK293 세포에 대해 나타낸다. 세포를 2 mM Ca²⁺를 함유하는 ACSF 배지에서 배양하였다. 도 5B에 나타낸 실험에서, 세포를 0.1 mM Ca²⁺를 함유하는 변형된 ACSF 배지에 2분 동안 이동시키고 이어서 100 μM OAG의 첨가와 함께 2 mM Ca²⁺를 함유하는 배지로 복귀시켰다. 1 μM 하이퍼포린(Hyp) 또는 NSN21778(NSN)의 첨가 시간을 상기 Fura-2 자취 위에 붉은색 막대로 나타낸다. 각 실험 그룹에 대해서 개별적인 가시(회색) 및 평균(적색) 형광 자취를 나타낸다. (도 5C) 평균 Ca²⁺ 유입 피크를 평균±SE(n≥81)로서 도 5A 내지 B상에 나타낸 실험에 대해 나타낸다. (도 5D) TD-토마토로 형질감염되고 DIV15-16에서 고정된 야생형 및 PS1KI 해마 뉴런의 공초점 상들. 상기 뉴런을 대조용 RNAi(siCtrl), TRPC6에 대한 RNAi(siT6) 또는 Orai2에 대한 RNAi(siO2)를 암호화하는 렌티바이러스로 감염시켰다. 대조용 뉴런(CON) 및 고정에 앞서 16시간 동안 30 nM NSN21778(+NSN) 또는 30 nM 하이퍼포린(+Hyp)으로 처리된 뉴런에 대한 상들을 나타낸다. 스케일 바는 10 ㎛이다. 야생형 및 PS1KI 뉴런의 약물 처리되지 않은 그룹은 도 2A 내지 J 상에 나타낸 바와 동일한 실험으로부터의 것이다. (도 5E) 패널 A에 나타낸 각 그룹의 세포에 대한 버섯 가시의 평균 분율을 평균±SE(n≥19 뉴런)로서 나타낸다. ***, p<0.001.
도 6A 내지 E. NSN21778은 AD 해마 조각에서 버섯 가시 및 시냅스 가소성 결함을 구제한다. (도 6A) 6개월 된 WTGFP, PS1KIGFP 및 APPKIGFP 마우스로부터 CA1 해마 조각의 공초점 상. 처리되지 않은 조각(CON) 및 고정에 앞서 3.5시간 동안 300 nM NSN21778로 처리된 조각(+NSN)에 대한 상들을 나타낸다. 스케일 바는 10 ㎛이다. (도 6B) 6개월 된 WTGFP, PS1KIGFP 및 APPKIGFP 마우스로부터의 해마 CA1 뉴런 중 버섯 가시의 분율. 결과를 처리되지 않은 조각(CON) 및 300 nM NSN21778로 처리된 조각(+NSN)에 대해서 나타낸다. 각 그룹의 세포에 대한 버섯 가시의 평균 분율을 평균±SE(n≥31 뉴런)로서 나타낸다. ***, p<0.001. (도 6C) 샘플 fEPSP 자취를 자극에 앞서(기본), 파상풍 자극 직후(유도) 및 파상풍 자극 1시간 후(1시간 후)의 6개월 된 WT 및 APPKI 해마 조각에 대해 나타낸다. 결과를 처리되지 않은 조각 및 파상풍 자극에 앞서 2 내지 3시간 동안 300 nM NSN21778로 전처리된 조각(+NSN)에 대해서 나타낸다. 표준화되고 평균화된 fEPSP 기울기를, 6개월 된 야생형 및 (+NSN) 존재 또는 300 nM NSN21778 전처리 부재하의 APPKI 조각에 의한 실험에서 시간의 함수로서 나타낸다. 각 시점에서 상기 평균 표준화된 fEPSP 기울기를 평균±S.E(n≥6 마우스)로서 나타낸다. (도 6E) 파상풍 자극 1시간 후 상기 평균 표준화된 fEPSP 기울기를 6개월 된 야생형 및 APPKI 조각에 대해서 나타낸다. 결과를 처리되지 않은 조각(CON) 및 300 nM NSN21778 전처리된 조각(+NSN)에 대해서 평균±S.E.(각 그룹에서 n≥6 마우스)로서 나타낸다. *p<0.05.
도 7A 내지 G. NSN21778은 생체내에서 AD 마우스의 표현형을 구제한다. (도 7A) 6.5개월 된 WTGFP, PS1KIGFP 및 APPKIGFP 마우스로부터 CA1 해마 조각의 공초점 상. 비히클 용액이 i.p. 주사된 마우스(CON) 및 10주 동안 10 ㎎/㎏ NSN21778이 주사된 마우스(+NSN)에 대한 상들을 나타낸다. 스케일 바는 10 ㎛이다. (도 7B) 6.5개월 된 WTGFP, PS1KIGFP 및 APPKIGFP 마우스로부터의 해마 CA1 뉴런 중 버섯 가시의 분율. 결과를 비히클 용액이 i.p. 주사된 마우스(CON) 및 10주 동안 10 ㎎/㎏ NSN21778이 주사된 마우스(+NSN)에 대해서 나타낸다. 각 그룹 중의 버섯 가시의 평균 분율을 평균±SE(n≥25 뉴런)로서 나타낸다. ***, p<0.001. (도 7C) 6E10 항-Aβ 항체로 염색된 13개월 된 APPKI 마우스로부터의 관상 단면의 상. 상기 상을 비히클 용액이 i.p. 주사된 마우스(CON) 및 8주 동안 10 ㎎/㎏ NSN21778이 주사된 마우스(+NSN)에 대해서 나타낸다. (도 7D 내지 E) 평균 반 면적(도 7D) 및 반 강도(도 7E)를 비히클 용액이 i.p. 주사된 13개월된 APPKI 마우스로부터의 조각(CON) 및 8주 동안 10 ㎎/㎏ NSN21778이 주사된 마우스(+NSN)에 대해서 나타낸다. 데이터를 평균±SE(NSN 그룹의 경우 n=5 마우스, CON 그룹의 경우 n=4 마우스)로서 나타낸다. *, p<0.05. 전후관계상 두려움 조절 패러다임에 따른 프리징(freezing) 상태에서 소비된 시간의 평균 분율을, 비히클 용액이 i.p. 주사된 6.5 개월 된 WTGFP 및 APPKIGFP 마우스(CON) 및 10주 동안 10 ㎎/㎏ NSN21778이 주사된 마우스(+NSN)에 대해서 나타낸다. 데이터를 평균±SE(n=5 마우스)로서 나타낸다. *, p<0.05. (도 7F) 전후관계상 두려움 조절 패러다임에 따른 프리징 상태에서 소비된 시간의 평균 분율을, 비히클 용액이 i.p. 주사된 6.5 개월 된 WTGFP 및 APPKIGFP 마우스(CON) 및 10주 동안 10 ㎎/㎏ NSN21778이 주사된 마우스(+NSN)에 대해서 나타낸다. 데이터를 평균±SE(n=5 마우스)로서 나타낸다. *, p<0.05. (도 7G) STIM2-관문 TRPC6/Orai2 nSOC 패널은 버섯 시냅스 가시의 유지에서 중요한 역할을 한다. 세포외 글루타메이트는 상기 가시에서 mGluR 수용체를 활성화하여, PLC의 활성화, PIP₂의 가수분해 및 InsP₃ 및 DAG의 생성을 유도한다. InsP₃는 상기 가시 중의 ER Ca²⁺ 저장소에서 InsP₃R1의 활성화를 야기하여, Ca²⁺의 방출 및 상기 저장소의 고갈에 이르게 한다. 상기 저장소의 고갈은 STIM2의 올리고머화 및 TRPC6/Orai2 Ca²⁺ 유입 채널의 활성화를 일으킨다. PIP₂ 가수분해에 따라 생성된 DAG는 TRPC6/Orai2 채널의 활성화에서 보조인자로서 작용한다. 생성되는 Ca²⁺ 유입은 상기 가시에서 CaMKII의 활성을 지지하며, 이는 장기간 버섯 가시 유지에 필요하다. NSN21778 화합물(NSN)은 TRPC6/Orai2 채널 활성의 양성 조절제로서 작용하여, AD 마우스 모델에서 상기 가시 중 Ca²⁺ 유입을 촉진하고 버섯 가시, LTP 및 기억력 장애의 구제를 유도한다.
도 8. 마우스 뇌에서 TRPC 및 Orai 채널 발현(도 1A 내지 E와 관련됨). 앨런 브레인 아틀라스(Allen Brain Atlas)로부터의 원위치 하이브리드화 상은 마우스 뇌에서 STIM, TRPC 및 Orai 채널의 발현을 나타낸다.
도 9. 상이한 마우스 뇌 영역에서 TRPC 및 Orai 채널의 유전자 발현 프로파일(도 1A 내지 E와 관련됨). qRT-PCR 결과를 나타낸 바와 같이 각 유전자 전사물 및 뇌 영역에 대한 3회 중복 측정의 평균+SD로서 나타낸다.
도 10. TRPC6 및 Orai2 녹다운 해마 뉴런 중 TRPC6, Orai2, PSD95, pCAMKII 및 CAMKII 단백질 수준의 정량분석(도 2A 내지 J와 관련됨). 데이터의 분석을 콴터티 원(Quantity One) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 각 밴드의 평균 밀도를 동일한 샘플 중의 GAPDH 신호에 표준화하고 평균하였다. n=3 상이한 배치 배양물.
도 11A 내지 B. TRPC6 및 Orai2 녹다운 해마 뉴런 배양물에서 체세포 nSOC 측정(도 2A 내지 J와 관련됨). (도 11A) Fura-2 Ca²⁺ 신호(F340/F380)의 시간 과정을, 대조용 렌티바이러스 및 TRPC6(siT6) 또는 Orai2(O2)에 대한 siRNA를 암호화하는 렌티바이러스로 감염된 WT 해마 배양물에 대해 나타낸다. 30분 저장소-고갈 프로토콜에 이어서, 2 mM Ca⁺² aCSF를 보충하고 상기 체세포 중의 Fura-2 신호를 기록하였다. (도 11B) 렌티-siCon, 렌티-siT6, 또는 렌티-siO2 바이러스로 감염된 WT 해마 뉴런의 체세포 중의 평균 SOC 피크 반응을 평균±SE(n≥59 뉴런)로서 나타낸다.
도 12A 내지 D. NSN21778 시험관내 대사 안정성, 생체내 혈장 약동학, 및 체중에 대한 부작용(도 7A 내지 G와 관련됨). (도 12A) NSN21778의 대사 안정성을 I 단계(NADPH 재생 시스템) 보조인자의 존재하에서 상업적인 간 S9 분획과 배양 후에 시험관내에서 평가하였다. 화합물 수준을 LC-MS/MS에 의해 측정하였다. 추가로, 상업적인 CD-1 마우스 혈장 존재하의 NSN21778의 안정성을 측정하였다. (도 12B) NSN21778을 암컷 CD-1 마우스에게 10 ㎎/㎏으로 i.p. 투여하였다. 혈장 및 뇌 중 NSN21778의 수준을 LC-MS/MS에 의해 평가하였다. (도 12C) 10주 동안 대조용 용액 또는 10 ㎎/㎏ NSN21778 i.p. 투여 후의 WTGFP, PS1KIGFP 및 APPKIGFP 마우스 체중. 데이터를 평균±SE(n=5 마우스)로서 나타내었다. (도 12D) 다양한 처리에 대해 획득된 체중.

본 연구에서, 발명자들은 상기 가시 중 STIM2-관문 nSOC 채널이 TRPC6 및 Orai2의 복합체에 의해 형성됨을 입증하기 위해서 후보 접근법을 사용하였다. 이들은 공지된 TRPC6 활성제 하이퍼포린(Leuner et al., 2007) 및 신규의 nSOC 활성제 NSN21778이 상기 가시에서 STIM2-nSOC 경로를 활성화하고 PS1KI 마우스(Guo et al., 1999) 및 APPKI 마우스(Saito et al. 2014) 해마 뉴런에서 버섯 가시 손실을 구제할 수 있음을 추가로 입증하였다. 더욱 또한, 발명자들은 NSN21778이 APPKI 마우스에서 해마 장기 강화(LTP) 장애를 구제하고, 아밀로이드 부담을 감소시키며, 해마 기억력 결함을 구제함을 입증하였다. 이들은 수상돌기 버섯 가시 중의 STIM2-조절된 TRPC6/Orai2 nSOC 채널 복합체가 노화 및 AD에서 기억력 상실의 치료를 위한 신규의 치료 표적이며 NSN21778이 뇌 노화 및 AD에서 치료학적 중재를 위한 잠재적인 후보 분자라는 결론을 내렸다. 본 명세의 상기 및 다른 태양들을 하기에 보다 상세히 기재한다.

I. 알쯔하이머병

알쯔하이머병(AD)은, 인지 능력의 격렬한 감소를 앓고 보편화된 치매가 있던 환자들 중 한 명을 검사한 후 1907년 알리오스 알쯔하이머(Alios Alzheimer)에 의해 최초로 기재된 뇌의 퇴행성 질환이다. 상기는 노인성 치매의 주된 원인이다. AD 환자는 기억력 상실 및 지적인 기능의 문제가 증가되며 이는 정상적인 개인으로서 기능할 수 없는 지점까지 진행한다. 지적인 기능의 상실과 함께 상기 환자는 인격 변화, 사회적으로 부적합한 행동 및 조현병을 나타낸다. AD는 불가피한 신경퇴행에 대한 효과적인 완화 또는 예방 치료가 없는 한 피해자 및 그 가족 모두에게 참화를 가져온다.

AD는 피질, 해마, 해마이행부, 해마회, 및 편도체에서 직경 200 ㎛ 이하로 측정되는 신경반과 관련된다. 신경반의 주요 구성성분 중 하나는 아밀로이드이며, 이는 콩고 레드에 의해 염색된다(Kelly et al., 1984). 콩고 레드에 의해 염색된 아밀로이드 반은 명시야에서 세포외, 분홍색 또는 녹슨 색이고, 편광하에서 복굴절성이다. 상기 반은 폴리펩티드 피브릴로 구성되며, 종종 혈관 주위에 존재하여, 뇌 중의 다양한 뉴런으로의 혈관 공급을 감소시킨다.

다양한 인자들, 예를 들어 유전적 소인, 감염인자, 독소, 금속 및 두부 외상이 모두 AD 신경병증의 가능한 기전으로서 제시되었다. 입수 가능한 증거는 AD에 대한 독특한 유형의 유전적 소인이 존재함을 강하게 암시한다. 첫 번째, 분자 분석은 몇몇 AD-에 걸린 가족에서 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 유전자의 돌연변이에 대한 증거를 제공하였다(Goate et al., 1991; Murrell et al., 1991; Chartier-Harlin et al., 1991 and Mullan et al., 1992). 조기 발병 AD의 우세한 형태에 대한 추가적인 유전자가 염색체 14 및 염색체 1상에 존재한다(Rogaev et al., 1995; Levy-Lahad et al., 1995 and Sherrington et al., 1995). AD와 관련된 또 다른 유전자좌가 염색체 19상에 존재하며 이는 아포지방단백질 E의 변형 형태를 암호화한다(Corder, 1993).

아밀로이드 반은 AD 환자 및 40세까지 생존해 있는 다운 증후군 개인에서 풍부하게 존재한다. 다운 증후군에서 APP의 과발현은 30세 이상의 다운 환자에서 AD 발생의 가능한 원인으로서 인식된다(Rumble et al., 1989 and Mann et al., 1989). 상기 반은 정상적인 노화 뇌 중에도 또한 존재하지만, 보다 낮은 수이다. 이들 반은 주로 아밀로이드 β 펩티드(Aβ; 때때로 또한 문헌에서 β-아밀로이드 펩티드 또는 β 펩티드라 지칭된다)(Glenner and Wong, 1984)로 구성되며, 이는 또한 뇌혈관 아밀로이드 침착물 중의 주요 단백질 구성성분이다. 상기 아밀로이드는 β-주름 시트로 배열되는 섬유상 물질이다. Aβ는 43개 이하 아미노산을 포함하는 소수성 펩티드이다.

그의 아미노산 서열의 측정은 APP cDNA(Kang et al., 1987; Goldgaber et al., 1987; Robakis et al., 1987 and Tanzi et al., 1988) 및 게놈 APP DNA(Lemaire et al., 1989 and Yoshikai et al., 1990)의 클로닝을 유도하였다. 다수의 APP cDNA 형태들이 동정되었으며, 3개의 가장 풍부한 형태인 APP695, APP751 및 APP770이 포함된다. 이들 형태는 교번 이어맞추기에 의해 단일 전구체 RNA로부터 발생한다. 상기 유전자는 18개 엑손과 함께 175 kb 초과에 걸쳐 있다(Yoshikai et al., 1990). APP는 세포외 도메인, 막관통 영역 및 세포질 도메인을 함유한다. Aβ는 소수성 막관통 도메인 바로 밖의 28개 이하 아미노산 및 상기 막관통 도메인의 15개 이하 잔기로 이루어진다. Aβ는 통상적으로 뇌 및 다른 조직, 예를 들어 심장, 신장 및 비장에서 발견된다. 그러나, Aβ 침착물은 대개 뇌에서만 풍부하게 발견된다.

반 브로크헤이븐(Van Broeckhaven) 등(1990)은 상기 APP 유전자가 2개의 네덜란드 가족에서 아밀로이드증이 있는 유전성 뇌출혈(HCHWA-D)과 밀접하게 관련됨을 입증하였다. 이는 2명의 네덜란드 환자에서 상기 APP 암호화 영역 중의 점 돌연변이의 발견에 의해 확인되었다(Levy et al., 1990). 상기 돌연변이는 상기 Aβ의 22번 위치(APP695의 618번 위치, 또는 APP770의 693번 위치)에서 글루타민이 글루탐산을 치환하였다. 또한, 몇몇 가족이, 완전길이 단백질의 717번 위치에서 아미노산 치환을 생성시키는 돌연변이를 통해 알쯔하이머병에 대한 유전적 소인(가족성 알쯔하이머병(FAD)이라 칭하는 상태)을 갖는다(Goate et al., 1991; Murrell et al., 1991 and Chartier-Harlin et al., 1991). 상기 돌연변이는 상기 가족내에서 상기 질병을 동시-분리시키며 후기-발병 AD가 있는 가족에서는 존재하지 않는다. 아미노산 717에서의 상기 돌연변이는 APP로부터의 Aβ의 Aβ_1-42 형태의 생성을 증가시킨다(Suzuki et al., 1994). 또 다른 돌연변이 형태는 완전길이 단백질의 670 및 671번 위치에서 아미노산 변화를 함유한다(Mullan et al., 1992). 아미노산 670 및 671에 대한 상기 돌연변이는 APP로부터 전체 Aβ의 생성을 증가시킨다(Citron et al., 1992).

APP는 3개의 부위에서 생체내 가공된다. 상기 증거는 막 관련 금속프로테아제에 의한 β-세크레타제에서의 절단이 생리학적 사건임을 암시한다. 상기 부위는 원형질막의 관강 표면으로부터 먼 APP 12 잔기 중에 위치한다. β-세크레타제 부위(상기 원형질막의 관강 표면으로부터 28개 잔기) 및 β-세크레타제 부위(막관통 영역 중의)의 절단은 40/42-잔기 β아밀로이드 펩티드(Aβ)를 생성시키며, 뇌에서 이들의 상승된 생성 및 축적은 알쯔하이머병의 병인에서 중심적인 사건이다(재검토를 위해서, Selkoe, 1999를 참조하시오). 인간 뇌에서 발견되는 또 다른 막 단백질인 프레세닐린 1은 상기 APP(β-세크레타제 부위에서 상기 가수분해를 조절하며 그 책임이 있는 프로테아제 자체인 것으로 가정되었다(Wolfe et al., 1999). 프레세닐린 1은 단일쇄 분자로서 발현되며, 프로테아제, 프레세닐리나제에 의한 그의 가공이 상기를 급속한 분해로부터 방지하는데 요구된다(Thinakaran et al., 1996 and Podlisny et al., 1997). 프레세닐리나제의 정체는 알려져 있지 않다. 상기 β-세크레타제 부위의 생체내 가공은 Aβ 생성에 율속 단계인 것으로 생각되며(Sinha & Lieberburg, 1999) 따라서 상기는 강한 치료 표적이다.

아밀로이드 반 형성의 감소에 유효한 억제제의 설계는, Aβ의 Aβ_1-42 형태인 42 아미노산 펩티드를 생성시키는 APP의 절단에 중요한 효소(들)의 확인에 따라 변한다. 다수의 효소들이 동정되었지만, 활성 효소를 생성시키는 것은 가능하지 않았다. 활성 효소 없이는, 기질 특이성이 하위부위 특이성을 결정함을 확인할 수도, 동역학 또는 임계 활성 부위 잔기를 결정함을 확인할 수도 없으며, 이들은 모두 억제제의 설계에 필수적이다.

II. 정의

화학기와 관련하여 사용될 때: "수소"는 -H를 의미하고; "하이드록시"는 -OH를 의미하고; "옥소"는 =O를 의미하고; "카보닐"은 -C(=O)-를 의미하고; "카복시"는 -C(=O)OH(또한 -COOH 또는 -CO₂H로서 씌여짐)를 의미하고; "할로"는 독립적으로 -F, -Cl, -Br 또는 -I를 의미하고; "아미노"는 -NH₂를 의미하고; "하이드록시아미노"는 -NHOH를 의미하고; "니트로"는 -NO₂를 의미하고; 이미노는 =NH를 의미하고; "시아노"는 -CN을 의미하고; "이소시아네이트"는 -N=C=O를 의미하고; "아지도"는 -N₃을 의미하고; 1가 상황에서 "포스페이트"는 -OP(O)(OH)₂ 또는 그의 탈양성자화된 형태를 의미하고; 2가 상황에서 "포스페이트"는 -OP(O)(OH)O- 또는 그의 탈양성자화된 형태를 의미하고; "머캅토"는 -SH를 의미하고; "티오"는 =S를 의미하고; "설포닐"은 -S(O)₂-를 의미하고; "하이드록실설포닐"은 -SO₂OH를 의미하고; "아미노설포닐"은 -SO₂NH₂를 의미하고 "설피닐"은 -S(O)-를 의미한다.

화학식과 관련하여, 기호 "-"는 단일 결합을 의미하고, "="는 이중 결합을 의미하고, "≡"은 삼중 결합을 의미한다. 기호 "---"는 임의의 결합을 의미하고, 존재하는 경우 단일 또는 이중이다. 기호 "

"는 단일 결합 또는 이중 결합을 의미한다. 따라서, 예를 들어 화학식

은

을 포함한다. 하나의 상기와 같은 고리 원자는 하나 초과의 이중 결합 부분을 형성하지 않는 것으로 생각된다. 더욱 또한, 공유 결합 기호 "-"는 하나 또는 2개의 입체발생 원자를 연결하는 경우 어떠한 바람직한 입체화학도 가리키지 않음에 유의한다. 대신에, 상기는 모든 입체이성질체뿐만 아니라 이들의 혼합물을 포함한다. 기호 "

"는 하나의 결합을 가로질러 수직으로 그려지는 경우(예를 들어 메틸에 대해서

) 상기 기의 부착점을 가리킨다. 상기 부착점은 전형적으로는 독자가 부착점을 명백하게 확인하는 것을 지원하기 위해서 보다 큰 기에 대해서 상기 방식으로 나타낼 뿐임에 유의한다. 기호 "

"는 상기 쐐기의 두꺼운 단부에 부착된 기가 "페이지 밖으로" 있는 단일 결합을 의미한다. 기호 "

"는 상기 쐐기의 두꺼운 단부에 부착된 기가 "페이지 안으로" 있는 단일 결합을 의미한다. 기호 "

"는 이중 결합 부근의 결합 배열(예를 들어 E 또는 Z)이 한정되지 않은 단일 결합을 의미한다. 따라서 상기 두 선택권뿐만 아니라, 이들의 조합이 의도된다. 본 출원에 도시된 구조의 하나의 원자상의 임의의 한정되지 않은 원자가는 상기 원자에 결합된 수소 원자를 암묵적으로 나타낸다. 탄소 원자상의 굵은 점은 상기 탄소에 부착된 수소가 종이면 밖으로 배향됨을 가리킨다.

"R"기를 예를 들어 하기 식에서 고리 시스템상에 "부유기"로서 묘사하는 경우:

, R은 안정한 구조가 형성되는 한, 상기 고리 원자 중 어느 하나에 부착된 임의의 수소 원자, 예를 들어 묘사되거나, 암시되거나, 또는 명백히 한정된 수소를 대체할 수 있다. "R"기를 예를 들어 하기 식에서 축합된 고리 시스템상에 "부유기"로서 묘사하는 경우:

, R은 달리 명시되지 않는 한 상기 축합된 고리 중 어느 하나의 고리 원자 중 어느 하나에 부착된 임의의 수소를 대체할 수 있다. 대체 가능한 수소는 안정한 구조가 형성되는 한, 묘사된 수소(예를 들어 상기 식에서 질소에 부착된 수소), 암시된 수소(예를 들어 도시되지 않았지만 존재하는 것으로 생각되는 상기 식의 수소), 명백히 한정된 수소, 및 고리 원자의 정체 따라 존재가 변하는 임의의 수소(예를 들어 X가 -CH-일 때, X기에 부착된 수소)를 포함한다. 묘사된 예에서, R은 상기 축합된 고리 시스템의 5-원 또는 6-원 고리상에 존재할 수 있다. 상기 식에서, 괄호안에 있는 "R"기에 바로 이어지는 아래첨자 "y"는 수치 변수를 나타낸다. 달리 명시되지 않는 한, 상기 변수는 0, 1, 2 또는 2 초과의 임의의 정수일 수 있으며, 오직 상기 고리 또는 고리 시스템의 대체 가능한 수소 원자의 최대수에 의해서 한정된다.

하기의 기 및 화합물 부류에 대해서, 상기 기 중의 탄소원자의 수를 하기와 같이 나타낸다: "Cn"은 상기 기/부류 중 탄소 원자의 정확한 수(n)를 한정한다. "C≤n"은 상기 기/부류 중에 존재할 수 있는 탄소원자의 최대 수(n)를 한정하며, 이때 최소수는 문제의 기에 가능한 한 작다, 예를 들어 "알케닐_(C≤8)" 기 또는 "알켄_(C≤8)" 부류에서 탄소 원자의 최소수는 2인 것으로 생각된다. 1 내지 10의 탄소 원자를 갖는 알콕시기를 나타내는 "알콕시_(C≤10)"와 비교한다. 또한 0 내지 10의 탄소 원자를 갖는 포스핀기를 나타내는 "포스핀_(C≤10)"과 비교한다. "Cn-n'"는 상기 기 중의 탄소 원자의 최소(n) 및 최대수(n') 모두를 한정한다. 따라서, "알킬_(C2-10)"은 2 내지 10의 탄소 원자를 갖는 알킬기를 나타낸다. 전형적으로 상기 탄소수 지시자는, 상기가 변형시키는 기에 이어지며, 괄호로 둘러싸이고, 전적으로 아래첨자로 씌여지나; 상기 지시자는 또한 의미의 어떠한 변화도 나타내지 않으면서, 상기 기에 선행하거나 또는 괄호 없이 기록될 수도 있다. 따라서, "C5 올레핀", "C5-올레핀", "올레핀_(C5)" 및 "올레핀_C5"는 모두 동의어이다. 하기에서 임의의 기 또는 화합물 부류가 "치환된"이란 용어와 함께 사용되는 경우, 수소 원자를 대체하는 화학기의 임의의 탄소 원자는 상기 기 또는 화합물 부류에 대한 전체 탄소 원자 한계에 대해 카운트되지 않는다.

"포화된"이란 용어는 화합물 또는 원자를 변형시키는데 사용되는 경우 상기 화합물 또는 원자가 하기에 나타내는 경우를 제외하고, 탄소-탄소 이중 및 탄소-탄소 삼중 결합을 갖지 않음을 의미한다. 포화된 기의 치환된 버전의 경우, 하나 이상의 탄소 산소 이중 결합 또는 탄소 질소 이중 결합이 존재할 수 있다. 상기와 같은 결합이 존재하는 경우, 케토-에놀 토오토머화 또는 이민/엔아민 토오토머화의 부분으로서 존재할 수도 있는 탄소-탄소 이중 결합은 제외시키지 않는다. "포화된"이란 용어가 물질의 용액을 변형시키기 위해 사용되는 경우, 상기는 상기 물질이 더 이상 상기 용액에 용해될 수 없음을 의미한다.

"지방족"이란 용어는 "치환된"이란 변경자 없이 사용되는 경우 그렇게 변형된 화합물/기가 비환상 또는 환상이지만, 비-방향족인 탄화수소 화합물 또는 기임을 나타낸다. 지방족 화합물/기에서, 상기 탄소 원자는 직쇄, 분지쇄, 또는 비-방향족 고리(지환족) 중에 함께 결합될 수 있다. 지방족 화합물/기는 포화되거나(상기는 단일 탄소-탄소 결합에 의해 결합된다(알칸/알킬)), 또는 불포화된다(하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합(알켄/알케닐) 또는 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합(알킨/알키닐)을 갖는다).

"알킬"이란 용어는 "치환된"이란 변경자 없이 사용되는 경우 부착점으로서 탄소 원자를 갖고 선형 또는 분지된 비환상 구조로, 탄소 및 수소 이외의 원자는 없는 1가 포화된 지방족 기를 지칭한다. -CH₃ (Me), -CH₂CH₃ (Et), -CH₂CH₂CH₃ (n-Pr 또는 프로필), -CH(CH₃)₂ (i-Pr, ⁱ Pr 또는 이소프로필), -CH₂CH₂CH₂CH₃ (n-Bu), -CH(CH₃)CH₂CH₃ (2급-부틸), -CH₂CH(CH₃)₂ (이소부틸), -C(CH₃)₃ (3급-부틸, t-부틸, t-Bu 또는 ^t Bu), 및 -CH₂C(CH₃)₃ (네오-펜틸) 기가 알킬기의 비제한적인 예이다. "알칸디일"이란 용어는 "치환된"이란 변경자 없이 사용되는 경우 부착점(들)으로서 하나 또는 2개의 포화된 탄소 원자(들)를 갖고 선형 또는 분지된 비환상 구조로, 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합이 없으며 탄소 및 수소 이외의 원자가 없는 2가 포화된 지방족 기를 지칭한다. -CH₂- (메틸렌), -CH₂CH₂-, -CH₂C(CH₃)₂CH₂-, 및 -CH₂CH₂CH₂-가 알칸디일기의 비제한적인 예이다. "알킬리덴"이란 용어는 "치환된"이란 변경자 없이 사용되는 경우 2가 기 =CRR'(여기에서 R 및 R'는 독립적으로 수소 또는 알킬이다)를 지칭한다. 알킬리덴기의 비제한적인 예는 =CH₂, =CH(CH₂CH₃), 및 =C(CH₃)₂를 포함한다. "알칸"은 화합물 H-R을 지칭하며, 여기에서 R은 상기에 정의된 바와 같은 알킬이다. 이들 용어 중 어느 하나를 "치환된"이란 변경자와 함께 사용하는 경우, 하나 이상의 수소 원자가 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH₂, -NO₂, -CO₂H, -CO₂CH₃, -CN, -SH, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -C(O)CH₃, -NHCH₃, -NHCH₂CH₃, -N(CH₃)₂, -C(O)NH₂, -C(O)NHCH₃, -C(O)N(CH₃)₂, -OC(O)CH₃, -NHC(O)CH₃, -S(O)₂OH_, 또는 -S(O)₂NH₂에 의해 독립적으로 치환되었다. 하기의 기들이 치환된 알킬기의 비제한적인 예이다: -CH₂OH, -CH₂Cl, -CF₃, -CH₂CN, -CH₂C(O)OH, -CH₂C(O)OCH₃, -CH₂C(O)NH₂, -CH₂C(O)CH₃, -CH₂OCH₃, -CH₂OC(O)CH₃, -CH₂NH₂, -CH₂N(CH₃)₂, 및 -CH₂CH₂Cl. "할로알킬"이란 용어는 치환된 알킬의 부분집합으로, 여기에서 상기 수소 원자 치환은 탄소, 수소 및 할로겐을 제외하고 다른 원자가 존재하지 않도록 할로(즉 -F, -Cl, -Br 또는 -I)로 제한된다. -CH₂Cl 기는 할로알킬의 비제한적인 예이다. "플루오로알킬"이란 용어는 치환된 알킬의 부분집합으로, 여기에서 상기 수소 원자 치환은 탄소, 수소 및 할로겐을 제외하고 다른 원자가 존재하지 않도록 플루오로로 제한된다. -CH₂F, -CF₃ 및 -CH₂CF₃ 기가 플루오로알킬의 비제한적인 예이다.

"사이클로알킬"이란 용어는 "치환된"이란 변경자 없이 사용되는 경우 부착점으로서 탄소 원자(상기 탄소 원자는 하나 이상의 비-방향족 고리 구조의 부분을 형성한다)를 갖고 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합이 없으며 탄소 및 수소 이외의 원자가 없는 1가 포화된 지방족기를 지칭한다. 비제한적인 예는 -CH(CH₂)₂(사이클로프로필), 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실(Cy)을 포함한다. "사이클로알칸디일"이란 용어는 "치환된"이란 변경자 없이 사용되는 경우 부착점으로서 2개의 탄소 원자를 갖고 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합이 없으며 탄소 및 수소 이외의 원자가 없는 2가 포화된 지방족기를 지칭한다.

기는 사이클로알칸디일 기의 비제한적인 예이다. "사이클로알칸"은 H-R 화합물을 지칭하며, 여기에서 R은 상기에 정의된 바와 같은 사이클로알킬이다. 이들 용어 중 어느 하나를 "치환된"이란 변경자와 함께 사용하는 경우, 하나 이상의 수소 원자가 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH₂, -NO₂, -CO₂H, -CO₂CH₃, -CN, -SH, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -C(O)CH₃, -NHCH₃, -NHCH₂CH₃, -N(CH₃)₂, -C(O)NH₂, -C(O)NHCH₃, -C(O)N(CH₃)₂, -OC(O)CH₃, -NHC(O)CH₃, -S(O)₂OH_, 또는 -S(O)₂NH₂에 의해 독립적으로 치환되었다.

"알케닐"이란 용어는 "치환된"이란 변경자 없이 사용되는 경우 부착점으로서 탄소 원자, 선형 또는 분지된, 비환상 구조, 적어도 하나의 비방향족 탄소-탄소 이중 결합을 갖고 탄소-탄소 삼중 결합이 없으며 탄소 및 수소 이외의 원자는 없는 1가 불포화된 지방족기를 지칭한다. 비제한적인 예는 -CH=CH₂ (비닐), -CH=CHCH₃, -CH=CHCH₂CH₃, -CH₂CH=CH₂ (알릴), -CH₂CH=CHCH₃, 및 -CH=CHCH=CH₂를 포함한다. "알켄디일"이란 용어는 "치환된"이란 변경자 없이 사용되는 경우 부착점으로서 2개의 탄소 원자, 선형 또는 분지된, 선형 또는 분지된 비환상 구조, 적어도 하나의 비방향족 탄소-탄소 이중 결합을 갖고 탄소-탄소 삼중 결합이 없으며 탄소 및 수소 이외의 원자는 없는 2가 불포화된 지방족기를 지칭한다. 알켄디일기의 비제한적인 예는 -CH=CH-, -CH=C(CH₃)CH₂-, -CH=CHCH₂-, 및 -CH₂CH=CHCH₂- 기이다. 상기 알켄디일기는 지방족이지만, 일단 양쪽 단부에서 연결되면 상기 기는 방향족 구조의 부분을 형성함으로부터 제외되지 않는다. "알켄" 또는 "올레핀"이란 용어는 동의어이며 화학식 H-R을 갖는 화합물을 지칭하고, 여기에서 R은 상기에 정의된 바와 같은 알케닐이다. "말단 알켄"은 단지 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 알켄을 지칭하며, 여기에서 상기 결합은 상기 분자의 한쪽 단부에서 비닐기를 형성한다. 이들 용어 중 어느 하나를 "치환된"이란 변경자와 함께 사용하는 경우, 하나 이상의 수소 원자가 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH₂, -NO₂, -CO₂H, -CO₂CH₃, -CN, -SH, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -C(O)CH₃, -NHCH₃, -NHCH₂CH₃, -N(CH₃)₂, -C(O)NH₂, -C(O)NHCH₃, -C(O)N(CH₃)₂, -OC(O)CH₃, -NHC(O)CH₃, -S(O)₂OH_, 또는 -S(O)₂NH₂에 의해 독립적으로 치환되었다. -CH=CHF, -CH=CHCl 및 -CH=CHBr 기는 치환된 알케닐기의 비제한적인 예이다.

"알키닐"이란 용어는 "치환된"이란 변경자 없이 사용되는 경우 부착점으로서 탄소 원자, 선형 또는 분지된 비환상 구조, 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖고 탄소 및 수소 이외의 원자는 없는 1가 불포화된 지방족기를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 상기 알키닐이란 용어는 하나 이상의 비-방향족 탄소-탄소 이중 결합의 존재를 제외하지 않는다. -C=CH, -C≡CCH₃, 및 -CH₂C≡CCH₃ 기는 알키닐기의 비제한적인 예이다. "알킨"은 H-R 화합물을 지칭하며, 여기에서 R은 알키닐이다. 이들 용어 중 어느 하나를 "치환된"이란 변경자와 함께 사용하는 경우, 하나 이상의 수소 원자가 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH₂, -NO₂, -CO₂H, -CO₂CH₃, -CN, -SH, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -C(O)CH₃, -NHCH₃, -NHCH₂CH₃, -N(CH₃)₂, -C(O)NH₂, -C(O)NHCH₃, -C(O)N(CH₃)₂, -OC(O)CH₃, -NHC(O)CH₃, -S(O)₂OH_, 또는 -S(O)₂NH₂에 의해 독립적으로 치환되었다.

"아릴"이란 용어는 "치환된"이란 변경자 없이 사용되는 경우 부착점으로서 방향족 탄소 원자를 갖는 1가 불포화된 방향족 기를 지칭하며, 상기 탄소 원자는 하나 이상의 6-원 방향족 고리 구조의 부분을 형성하고, 여기에서 상기 고리 원자는 모두 탄소이며 상기 기는 탄소 및 수소 이외의 원자는 없다. 하나 초과의 고리가 존재하는 경우, 상기 고리들은 축합되거나 축합되지 않을 수도 있다. 본 명세서에 사용시, 상기 용어는 제1 방향족 고리 또는 존재하는 임의의 추가적인 방향족 고리에 부착된 하나 이상의 알킬 또는 아르알킬기(탄소수 제한 허용됨)의 존재를 제외하지 않는다. 아릴기의 비제한적인 예는 페닐(Ph), 메틸페닐, (디메틸)페닐, -C₆H₄CH₂CH₃ (에틸페닐), 나프틸, 및 비페닐로부터 유도된 1가 기를 포함한다. "아렌디일"이란 용어는 "치환된"이란 변경자 없이 사용되는 경우 부착점으로서 2개의 방향족 탄소 원자를 갖는 2가 방향족 기를 지칭하며, 상기 탄소 원자는 하나 이상의 6-원 방향족 고리 구조(들)의 부분을 형성하고 여기에서 상기 고리 원자는 모두 탄소이며, 상기 1가 기는 탄소 및 수소 이외의 원자는 없다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 제1 방향족 고리 또는 존재하는 임의의 추가적인 방향족 고리에 부착된 하나 이상의 알킬, 아릴 또는 아르알킬기(탄소수 제한 허용됨)의 존재를 제외하지 않는다. 하나 초과의 고리가 존재하는 경우, 상기 고리들은 축합되거나 축합되지 않을 수도 있다. 축합되지 않은 고리들은 하기 중 하나 이상을 통해 연결될 수 있다: 공유 결합, 알칸디일, 또는 알켄디일기(탄소수 제한 허용됨). 아렌디일기의 비제한적인 예는 하기를 포함한다:

"아렌"은 H-R 화합물을 지칭하며, 여기에서 R은 상기 정의된 바와 같은 아릴이다. 벤젠 및 톨루엔이 아렌의 비제한적인 예이다. 이들 용어 중 어느 하나를 "치환된"이란 변경자와 함께 사용하는 경우, 하나 이상의 수소 원자가 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH₂, -NO₂, -CO₂H, -CO₂CH₃, -CN, -SH, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -C(O)CH₃, -NHCH₃, -NHCH₂CH₃, -N(CH₃)₂, -C(O)NH₂, -C(O)NHCH₃, -C(O)N(CH₃)₂, -OC(O)CH₃, -NHC(O)CH₃, -S(O)₂OH_, 또는 -S(O)₂NH₂에 의해 독립적으로 치환되었다.

"아르알킬"이란 용어는 "치환된"이란 변경자 없이 사용되는 경우 1가 기-알칸디일-아릴을 지칭하며, 여기에서 알칸디일 및 아릴이란 용어는 각각 상기 제공된 정의와 일치하는 방식으로 사용된다. 비제한적인 예는 페닐메틸(벤질, Bn) 및 2-페닐-에틸이다. 아르알킬이란 용어가 "치환된"이란 변경자와 함께 사용되는 경우 상기 알칸디일 및/또는 아릴기로부터의 하나 이상의 수소 원자가 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH₂, -NO₂, -CO₂H, -CO₂CH₃, -CN, -SH, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -C(O)CH₃, -NHCH₃, -NHCH₂CH₃, -N(CH₃)₂, -C(O)NH₂, -C(O)NHCH₃, -C(O)N(CH₃)₂, -OC(O)CH₃, -NHC(O)CH₃, -S(O)₂OH_, 또는 -S(O)₂NH₂에 의해 독립적으로 치환되었다. 치환된 아르알킬의 비제한적인 예는 (3-클로로페닐)-메틸, 및 2-클로로-2-페닐-에트-1-일이다.

"헤테로아릴"이란 용어는 "치환된"이란 변경자 없이 사용되는 경우 부착점으로서 방향족 탄소 원자 또는 질소 원자를 갖는 1가 방향족기를 지칭하며, 상기 탄소 원자 또는 질소 원자는 하나 이상의 방향족 고리 구조의 부분을 형성하고, 여기에서 상기 고리 원자 중 적어도 하나는 질소, 산소 또는 황이고, 상기 헤테로아릴기는 탄소, 수소, 방향족 질소, 방향족 산소 및 방향족 황 이외의 원자는 없다. 하나 초과의 고리가 존재하는 경우, 상기 고리들은 축합되거나 축합되지 않을 수도 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 방향족 고리 또는 방향족 고리 시스템에 부착된 하나 이상의 알킬, 아릴, 및/또는 아르알킬기(탄소수 제한 허용됨)의 존재를 제외하지 않는다. 헤테로아릴기의 비제한적인 예는 퓨라닐, 이미다졸릴, 인돌릴, 인다졸릴(Im), 이속사졸릴, 메틸피리디닐, 옥사졸릴, 페닐피리디닐, 피리디닐(피리딜), 피롤릴, 피리미디닐, 피라지닐, 퀴놀릴, 퀴나졸릴, 퀴녹살리닐, 트리아지닐, 테트라졸릴, 티아졸릴, 티에닐 및 트리아졸릴을 포함한다. "N-헤테로아릴"이란 용어는 부착점으로서 질소 원자를 갖는 헤테로아릴기를 지칭한다. "헤테로아렌"은 화합물 H-R을 지칭하며, 여기에서 R은 헤테로아릴이다. 피리딘 및 퀴놀린은 헤테로아렌의 비제한적인 예이다. 이들 용어를 "치환된"이란 변경자와 함께 사용하는 경우 하나 이상의 수소 원자가 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH₂, -NO₂, -CO₂H, -CO₂CH₃, -CN, -SH, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -C(O)CH₃, -NHCH₃, -NHCH₂CH₃, -N(CH₃)₂, -C(O)NH₂, -C(O)NHCH₃, -C(O)N(CH₃)₂, -OC(O)CH₃, -NHC(O)CH₃, -S(O)₂OH_, 또는 -S(O)₂NH₂에 의해 독립적으로 치환되었다.

"아실"이란 용어는 "치환된"이란 변경자와 함께 사용시 -C(O)R 기를 지칭하며, 여기에서 R은 수소, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 아릴, 아르알킬 또는 헤테로아릴이며, 이들 용어는 상기에 정의된 바와 같다. -CHO, -C(O)CH₃ (아세틸, Ac), -C(O)CH₂CH₃, -C(O)CH₂CH₂CH₃, -C(O)CH(CH₃)₂, -C(O)CH(CH₂)₂, -C(O)C₆H₅, -C(O)C₆H₄CH₃, -C(O)CH₂C₆H₅, -C(O)(이미다졸릴) 기가 아실기의 비제한적인 예이다. "티오아실"은, -C(O)R 기의 산소 원자가 황 원자로 치환된, -C(S)R을 제외하고, 유사한 방식으로 정의된다. "알데히드"란 용어는 상기 정의한 바와 같은 알칸에 상응하며, 여기에서 상기 수소 원자 중 적어도 하나는 -CHO 기로 치환되었다. 이들 용어 중 어느 하나를 "치환된"이란 변경자와 함께 사용하는 경우 하나 이상의 수소 원자(카보닐 또는 티오카보닐기(존재하는 경우)의 탄소 원자에 직접 부착된 수소 원자 포함)가 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH₂, -NO₂, -CO₂H, -CO₂CH₃, -CN, -SH, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -C(O)CH₃, -NHCH₃, -NHCH₂CH₃, -N(CH₃)₂, -C(O)NH₂, -C(O)NHCH₃, -C(O)N(CH₃)₂, -OC(O)CH₃, -NHC(O)CH₃, -S(O)₂OH_, 또는 -S(O)₂NH₂에 의해 독립적으로 치환되었다. -C(O)CH₂CF₃, -CO₂H (카복실), -CO₂CH₃ (메틸카복실), -CO₂CH₂CH₃, -C(O)NH₂ (카바모일), 및 -CON(CH₃)₂ 가 치환된 아실기의 비제한적인 예이다.

"알킬아미노"란 용어는 "치환된"이란 변경자 없이 사용되는 경우 -NHR 기를 지칭하며, 여기에서 R은 상기 정의된 바와 같은 알킬이다. 비제한적인 예는 -NHCH₃ 및 -NHCH₂CH₃를 포함한다. "디알킬아미노"란 용어는 "치환된"이란 변경자 없이 사용되는 경우 -NRR' 기를 지칭하며, 여기에서 R 및 R'는 동일하거나 상이한 알킬기이거나, 또는 R 및 R'는 함께 알칸디일을 나타낼 수 있다. 디알킬아미노기의 비제한적인 예는 -N(CH₃)₂ 및 -N(CH₃)(CH₂CH₃)를 포함한다. "사이클로알킬아미노", "알케닐아미노", "알키닐아미노", "아릴아미노", "아르알킬아미노", "헤테로아릴아미노", "헤테로사이클로알킬아미노", "알콕시아미노" 및 "알킬설포닐아미노"란 용어들은 "치환된"이란 변경자 없이 사용되는 경우 -NHR로서 정의된 기를 지칭하며, 여기에서 R은 각각 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로사이클로알킬, 알콕시 및 알킬설포닐이다. 아릴아미노기의 비제한적인 예는 -NHC₆H₅이다. "아미도"(아실아미노)란 용어는 "치환된"이란 변경자 없이 사용될 때 -NHR 기를 지칭하며, 여기에서 R은 상기 정의된 바와 같은 아실이다. 아미도기의 비제한적인 예는 -NHC(O)CH₃이다. "알킬이미노"란 용어는 "치환된"이란 변경자 없이 사용될 때 =NR 2가 기를 지칭하며, 여기에서 R은 상기 정의된 바와 같은 알킬이다. 이들 용어 중 어느 하나를 "치환된"이란 변경자와 함께 사용하는 경우 탄소 원자에 부착된 하나 이상의 수소 원자가 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH₂, -NO₂, -CO₂H, -CO₂CH₃, -CN, -SH, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -C(O)CH₃, -NHCH₃, -NHCH₂CH₃, -N(CH₃)₂, -C(O)NH₂, -C(O)NHCH₃, -C(O)N(CH₃)₂, -OC(O)CH₃, -NHC(O)CH₃, -S(O)₂OH_, 또는 -S(O)₂NH₂에 의해 독립적으로 치환되었다. -NHC(O)OCH₃ 및 -NHC(O)NHCH₃ 기가 치환된 아미도기의 비제한적인 예이다.

"포함하다", "갖다" 및 "내포하다"란 용어들은 개방형 연결 동사이다. 이들 동사 중 하나 이상의 임의의 형태 또는 시제, 예를 들어 "포함하는", "포함하고 있는", "갖는", "갖고 있는", "내포하는" 및 "내포하고 있는"도 또한 개방형이다. 예를 들어 하나 이상의 단계를 "포함하거나", "갖거나" 또는 "내포하는" 임의의 방법은 오직 상기 하나 이상의 단계들을 갖는 것만으로 제한되지 않으며 다른 나열되지 않은 단계들도 또한 포함한다.

본 명세서 및/또는 청구범위에 사용되는 바와 같은 "유효한"이란 용어는 목적하는, 예상되는 또는 의도한 결과를 수행하기에 적합함을 의미한다. "유효량", "치료 유효량" 또는 "약학적으로 유효한 양"은 환자 또는 대상체를 화합물로 치료함과 관련하여 사용될 때, 질병을 치료하기 위해 대상체 또는 환자에게 투여될 때 상기 질병의 상기와 같은 치료를 수행하기에 충분한 화합물의 양을 의미한다.

"수화물"이란 용어는 화합물에 대한 변경자로서 사용될 때 상기 화합물이, 예를 들어 상기 화합물의 고체 형태 중에 각 화합물 분자와 결합된 하나 미만(예를 들어 헤미수화물), 하나(예를 들어 일수화물), 또는 하나 초과(예를 들어 이수화물)의 물 분자를 가짐을 의미한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "IC₅₀"이란 용어는 획득되는 최대 반응의 50%인 억제 용량을 지칭한다. 상기 정량적인 크기는 주어진 생물학적, 생화학적 또는 화학적 과정(또는 과정의 성분, 즉 효소, 세포, 세포 수용체 또는 미생물)을 절반까지 억제하는데 특정 약물 또는 다른 물질(억제제)이 얼마나 많이 필요한 지를 가리킨다.

제1 화합물의 "이성질체"는 각 분자가 상기 제1 화합물과 동일한 구성 원자를 함유하지만 상기 원자들의 3차원 배열이 상이한 별도의 화합물이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "환자" 또는 "대상체"란 용어는 살아있는 포유동물 유기체, 예를 들어 인간, 원숭이, 소, 양, 염소, 개, 고양이, 마우스, 래트, 기니 피그, 또는 이들의 트랜스제닉 종을 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 환자 또는 대상체는 영장류이다. 인간 대상체의 비제한적인 예는 성인, 청소년, 유아 및 태아이다.

본 명세서에 일반적으로 사용되는 바와 같이 "약학적으로 허용 가능한"은 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 합리적인 이익/위험 비에 상응하는 다른 문제 또는 합병증 없이 건전한 의학적 판단의 범위내에서 인간 및 동물의 조직, 기관 및/또는 체액과 접촉하여 사용하기에 적합한 상기 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여형을 지칭한다.

"약학적으로 허용 가능한 염"은 상기 정의된 바와 같이, 약학적으로 허용 가능하고 목적하는 약물학적 활성을 갖는 본 명세의 화합물의 염을 의미한다. 상기와 같은 염은 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화 수소산, 황산, 질산, 인산 등; 또는 유기산, 예를 들어 1,2-에탄디설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 3-페닐프로피온산, 4,4'-메틸렌비스(3-하이드록시-2-엔-1-카복실산), 4-메틸비사이클로[2.2.2]옥트-2-엔-1-카복실산, 아세트산, 지방족 모노- 및 디카복실산, 지방족 황산, 방향족 황산, 벤젠설폰산, 벤조산, 캄포르설폰산, 카본산, 신남산, 시트르산, 사이클로펜탄프로피온산, 에탄설폰산, 퓨마르산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 헵탄산, 헥산산, 하이드록시나프토산, 락트산, 라우릴황산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄설폰산, 뮤콘산, o-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 옥살산, p-클로로벤젠설폰산, 페닐-치환된 알칸산, 프로피온산, p-톨루엔설폰산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 숙신산, 타타르산, 3급부틸아세트산, 트리메틸아세트산 등과 형성된 산 부가염을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 염은 또한 존재하는 산성 양성자가 무기 또는 유기 염기와 반응할 수 있을 때 형성될 수 있는 염기 부가염을 포함한다. 허용 가능한 무기 염기는 수산화 나트륨, 탄산 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 알루미늄 및 수산화 칼슘을 포함한다. 허용 가능한 유기 염기는 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민 등을 포함한다. 본 명세의 임의의 염의 일부를 형성하는 특정 음이온 또는 양이온은 상기 염이 전체로서 약물학적으로 허용 가능한 한, 중요하지 않음을 알아야 한다. 약학적으로 허용 가능한 염의 추가적인 예 및 그의 제조 및 사용 방법은 문헌[Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (P. H. Stahl & C. G. Wermuth eds., Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002)]에 제공된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 용어는 화학 작용제의 운반 또는 수송에 관련된, 약학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다.

"예방" 또는 "예방하는"은 (1) 질병의 위험이 있고/있거나 상기 질병에 소인이 있을 수 있지만 아직 상기 질병의 병리 또는 징후학 중 어느 하나 또는 전부를 경험하거나 나타내지 않은 대상체 또는 환자에서 상기 질병의 발병을 억제하고/하거나, (2) 질병의 위험이 있고/있거나 상기 질병에 소인이 있을 수 있지만 아직 상기 질병의 병리 또는 징후학 중 어느 하나 또는 전부를 경험하거나 나타내지 않은 대상체 또는 환자에서 상기 질병의 병리학 또는 징후학의 개시를 늦춤을 포함한다.

"전구약물"은 생체내에서 대사적으로 본 명세에 따른 억제제로 전환될 수 있는 화합물을 의미한다. 상기 전구약물 자체는 또한 주어진 표적 단백질에 대해서 활성을 가질 수도 갖지 않을 수도 있다. 예를 들어, 하이드록시기를 포함하는 화합물을, 생체내에서 가수분해에 의해 하이드록시 화합물로 전환되는 에스테르로서 투여할 수 있다. 생체내에서 하이드록시 화합물로 전환될 수 있는 적합한 에스테르는 아세테이트, 시트레이트, 락테이트, 포스페이트, 타르트레이트, 말로네이트, 옥살레이트, 살리실레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 퓨마레이트, 말리에이트, 메틸렌-비스-β-하이드록시나프토에이트, 젠티세이트, 이세티오네이트, 디-p-톨루오일타르트레이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 사이클로헥실설파메이트, 퀴네이트, 아미노산의 에스테르 등을 포함한다. 유사하게, 아민기를 포함하는 화합물을, 생체내에서 가수분해에 의해 아민 화합물로 전환되는 아미드로서 투여할 수 있다.

"입체이성질체" 또는 "광학 이성질체"는 동일한 원자가 동일한 다른 원자에 결합하지만, 상기 원자들의 3차원 배열이 상이한 주어진 화합물의 이성질체이다. "거울상 이성질체"는 왼손과 오른손처럼, 서로 거울상인 주어진 화합물의 입체이성질체이다. "부분입체이성질체"는 거울상 이성질체가 아닌 주어진 화합물의 입체이성질체이다. 키랄 분자는 임의의 2개의 기의 상호교환이 입체이성질체를 유도하도록하는 기를 갖는 분자 중의 임의의 지점(반드시 원자는 아니지만)인 키랄 중심(또한 입체중심 또는 입체발생 중심으로서 지칭된다)을 함유한다. 유기 화합물에서, 상기 키랄 중심은 전형적으로는 탄소, 인 또는 황 원자이지만, 유기 및 무기 화합물 중에서 다른 원자가 입체중심인 것도 또한 가능하다. 하나의 분자는 다수의 입체중심을 가질 수 있으며, 이는 다수의 입체이성질체를 제공할 수 있다. 입체이성질화가 4면체 입체발생 중심(예를 들어 4면체 탄소)에 기인한 화합물에서, 가설적으로 가능한 입체이성질체의 총수는 2ⁿ(여기에서 n은 4면체 입체중심의 수이다)을 초과하지 않을 것이다. 대칭을 갖는 분자는 흔히 최대로 가능한 입체이성질체의 수보다 적다. 거울상 이성질체의 50:50 혼합물을 라세미 혼합물이라 칭한다. 한편으로, 거울상 이성질체의 혼합물은 하나의 거울상 이성질체가 50% 초과량으로 존재하도록 거울상 이성질체 풍부일 수 있다. 전형적으로, 거울상 이성질체 및/또는 부분입체이성질체를 당해 분야에 공지된 기법을 사용하여 분해하거나 분리할 수 있다. 입체화학이 규명되지 않은 키랄성의 임의의 입체중심 또는 축에 대해서, 상기 키랄성의 입체중심 또는 축은 R 형, S 형 또는 상기 R 및 S 형의 혼합물(라세미 및 비-라세미 혼합물 포함)로서 존재할 수 있는 것으로 생각된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "다른 입체이성질체가 실질적으로 없는"이란 어구는 상기 조성물이 ≤15%, 보다 바람직하게는 ≤10%, 훨씬 더 바람직하게는 ≤5%, 또는 가장 바람직하게는 ≤1%의 또 다른 입체이성질체(들)를 함유함을 의미한다.

"치료" 또는 "치료하는"은 (1) 질병의 병리 또는 징후학을 경험하거나 나타내는 대상체 또는 환자에서 상기 질병을 억제함(예를 들어 상기 병리 및/또는 징후학의 추가적인 발생을 저지함), (2) 상기 질병의 병리 또는 징후학을 경험하거나 나타내는 대상체 또는 환자에서 상기 질병을 개선시킴(예를 들어 상기 병리 및/또는 징후학을 역전시킴), 및/또는 (3) 상기 질병의 병리 또는 징후학을 경험하거나 나타내는 대상체 또는 환자에서 상기 질병의 임의의 측정 가능한 감소를 수행함을 포함한다.

상기 정의들은 본 명세서에 참고로 인용된 참고문헌 중 임의의 문헌에서 충돌되는 임의의 정의를 대체한다. 그러나, 몇몇 용어를 정의하는 사실이, 정의되지 않은 임의의 용어가 불명확함을 암시하는 것으로서 간주되어서는 안 된다. 오히려, 사용되는 모든 용어는 상기 명세를 통상적인 숙련가가 본 명세의 범위를 인식하고 이를 실행할 수 있도록 하는 용어들로 기재하는 것으로 여긴다.

본 명세에 의해 제공되는 화합물을 예를 들어 상기 본 발명의 요약 섹션 및 하기 청구범위에 나타낸다. 이들은 실시예 섹션에 개략된 방법들을 사용하여 제조될 수도 있다. 이들 방법을 당해 분야의 숙련가에 의해 적용되는 바와 같은 유기 화학의 원리 및 기법을 사용하여 추가로 변형시키고 최적화할 수 있다. 상기와 같은 원리 및 기법은 예를 들어 문헌[March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure (2007)](본 발명에 참고로 인용된다)에 교시된다.

본 발명의 화합물은 하나 이상의 비대칭적으로 치환된 탄소 또는 질소 원자를 함유할 수 있으며, 광학 활성 또는 라세미 형태로 단리될 수 있다. 따라서, 특정한 입체 화학 또는 이성질체 형태를 구체적으로 나타내지 않는 한, 화학식의 모든 키랄, 부분입체이성체, 라세미 형태, 에피머 형태, 및 모든 기하학적 이성질체 형태들이 의도된다. 화합물은 라세메이트 및 라세미 혼합물, 단일 거울상 이성질체, 부분입체이성질체 혼합물 및 개별적인 부분입체이성질체로서 존재할 수 있다. 일부 실시태양에서, 단일 부분입체이성질체가 수득된다. 본 발명의 화합물의 키랄 중심은 S 또는 R 배열을 가질 수 있다.

본 발명의 화합물을 나타내는데 사용되는 화학식들은 전형적으로는 단지 가능한 다수의 상이한 토오토머 중 하나만을 나타낼 것이다. 예를 들어, 다수 유형의 케톤기는 상응하는 에놀기와 평형으로 존재하는 것으로 공지되어 있다. 유사하게, 다수 유형의 이민기는 엔아민기와 평형으로 존재한다. 주어진 화합물에 대해 묘사되는 토오토머와 관계없이, 및 가장 우세한 것에 관계없이, 주어진 화학식의 모든 토오토머가 의도된다.

본 발명의 화합물은 또한 본 명세서에 서술된 적응증에 사용하기 위한 것이든 그렇지 않는 경우든, 종래 기술에 공지된 화합물보다 더 유효하고, 덜 독성이고, 더 오래 작용하고, 더 효능있고, 더 적은 부작용을 생성시키고, 더 용이하게 흡수되고, 및/또는 더 양호한 약동학적 프로파일(예를 들어 더 높은 경구 생체이용률 및/또는 더 낮은 청소율)을 갖고, 및/또는 상기 공지된 화합물과 다른 유용한 약물학적, 물리적 또는 화학적 성질들을 가질 수 있다는 장점을 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물을 구성하는 원자들은 상기와 같은 원자들의 모든 동위원소 형태를 포함하고자 한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 동위원소는 동일한 원자 번호를 갖지만 상이한 질량수를 갖는 원자들을 포함한다. 일반적인 예로서, 비제한적으로, 수소의 동위원소는 삼중수소 및 중수소를 포함하고, 탄소의 동위원소는 ¹³C 및 ¹⁴C를 포함한다.

본 발명의 화합물은 또한 전구약물 형태로 존재할 수 있다. 전구약물은 약제의 다수의 바람직한 성질(예를 들어 용해도, 생체이용률, 제조 등)을 증대시키는 것으로 공지되어 있기 때문에, 본 발명의 일부 방법에 사용되는 화합물은 경우에 따라 전구약물 형태로 전달될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 화합물의 전구약물뿐만 아니라 전구약물의 전달 방법을 고려한다. 본 발명에 사용되는 화합물의 전구약물을, 통상적인 조작으로 또는 생체내에서 모 화합물로 변형이 절단되도록 상기 화합물 중에 존재하는 작용기를 변형시킴으로써 제조할 수 있다. 상응하게, 전구약물은 예를 들어 하이드록시, 아미노 또는 카복시기가, 상기 전구약물이 대상체에게 투여될 때 각각 하이드록시, 아미노 또는 카복실산을 형성하도록 절단하는 임의의 기에 결합하는, 본 명세서에 기재된 화합물을 포함한다.

본 명세서에 제공된 화합물의 임의의 염 형태의 일부를 형성하는 특정한 음이온 또는 양이온은, 상기 염이 전체로서 약물학적으로 허용 가능한 한, 중요하지 않음을 알아야 한다. 약학적으로 허용 가능한 염의 추가적인 예 및 그의 제조 및 사용 방법이 문헌[Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (2002)](본 명세서에 참고로 인용된다)에 제공된다.

다수의 유기 화합물이, 상기가 반응하거나 상기가 침전되거나 결정화되는 용매와 복합체를 형성할 수 있음을 알 것이다. 이러한 복합체는 "용매화물"로서 공지된다. 상기 용매가 물인 경우, 상기 복합체는 "수화물"로서 공지된다. 또한, 다수의 유기 화합물이 하나 초과의 고체 형태, 예를 들어 결정성 및 비결정성 형태로 존재할 수 있음을 알 것이다. 본 명세서에 제공된 화합물의 모든 고체 형태(그의 임의의 용매화물을 포함하여)는 본 발명의 범위내에 있다.

III. 뉴런 저장소-작동된 칼슘 진입 경로

A. SOCE 경로

저장소-작동된 Ca²⁺ 진입(SOCE) 또는 전류형 Ca²⁺ 진입의 존재가, 작용물질에 의해 생성된 Ca²⁺ 신호에 의해서라기 보다는 세포내 풀의 Ca²⁺ 함량에 의해 조절되는 Ca²⁺ 유입 기전으로서 최초로 제안되었다. 세포가 후속 자극에 대해 준비될 수 있게 하는 Ca²⁺ 저장소 재충전에서 SOCE의 연루 외에, SOCE는 다수의 세포 기능, 예를 들어 세포외배출, 혈소판 기능, 근육 수축, 아데닐릴 사이클라제 활성화, 5-리폭시게나제 활성화, 내피 투과성, 유전자 전사 및 배란 및 출산능력에 중요한 것으로 보고되었다.

래트 대뇌피질 성상세포에서, SOCE는 대사성 글루타메이트 수용체의 자극에 의해 유도된 세포내 Ca²⁺ 진동을 유지시킨다. [Ca²⁺]_c에서 반복적인 진동은 생리학적 과정으로서 인식되고 다양한 세포 기능을 조절하는 Ca²⁺ 신호의 시공 패턴이다. Ca²⁺ 진동에서 SOCE의 역할은 래트 간세포에서 관찰되었으며, 여기에서 2-아미노에틸 디페닐보레이트(2-APB), Gd³⁺ 또는 SK&F 96365에 의한 처리는 바소프레신- 및 아드레날린-유발된 Ca²⁺ 진동을 억제하였다. 고농도의 Gd³⁺는 Ca²⁺ 진입 및 분출(Ca²⁺ 진동이 발생되게 하는 상태)을 방지한다. SOCE는 지속되지만, Ca²⁺ 진동을 개시시키고 재생시키는 기전은 세포내 매질에 고유하므로, Ca²⁺ 진동에 필수적이지는 않다.

SOCE는 또한 상이한 세포 유형, 예를 들어 래트 호염기성 백혈병(RBL) 세포 및 부신 크롬친화 세포에서 세포외배출에 중요함이 입증되었다. SOCE는 또한 혈소판 기능에 중요한 것으로 제시되었으며, 살-소포체 Ca²⁺-ATPase 억제제, 예를 들어 탑시가르긴(TG)의 사용을 토대로 SOCE는 근육 수축에 관여하는 것으로 입증되었지만, TG는 Ca²⁺-의존성 Cl^- 채널의 개방을 유도하여 탈분극 및 전압-활성화된 Ca²⁺ 채널의 후속적인 통문(gating)을 생성시킬 수 있기 때문에 SOCE에 대한 명백한 증거를 제공하지는 않는다.

SOCE는 또한 몇몇 효소의 활성화에 필요하다. 저장소-작동된 Ca²⁺ 채널을 통한 Ca²⁺ 진입은 효소, 예를 들어 C6-2B 신경교종 세포에서 I형 아데닐릴 사이클라제 또는 RBL-1 세포에서 5-리폭시게나제의 활성들을 변경시킬 수 있다. 또한, 저장소-작동된 채널을 통한 Ca²⁺ 진입은 내피세포 투과성을 조절한다. SOCE는 또한 유전자 전사 조절을 포함한 다수의 장기적인 반응에 중요하다. SOCE의 생리학적 중요성은 또한 T-림프구에서 SOCE의 손실 또는 결함성 비만세포 탈과립 및 사이토킨 분비에 관련된 중증 복합 면역결핍(SCID)을 포함한, 상기 기전의 실패 또는 부전에 기인하는 몇몇 병리의 확인에 의해 지지된다.

신경아교세포는 항상성 신경 세포이다. 일반적으로, 상기는 전기적으로 비-흥분성이며 그의 활성화는 신경교의 "Ca²⁺ 흥분성"을 한정하는 복합 세포내 Ca²⁺ 신호의 발생과 관련된다. 포유동물 신경교 세포에서, 상기 흥분성에 대한 Ca²⁺의 주요 공급원은 소포체(ER)의 관강으로, 이는 세포외 공간으로부터 최종적으로 (재)충전된다. 이는 저장소-작동된 Ca²⁺ 진입(SOCE)을 통해 발생하며, 이는 상기 ER을 원형질막 Ca²⁺ 진입과 연결시키는 특이적인 신호전달 시스템에 의해 지지된다. 여기에서, 상기 ER Ca²⁺ 저장소의 비우기가 SOCE의 활성화에 필요 충분하며, SOCE를 통한 Ca²⁺ 유입 없이 상기 ER 저장소는 재충전될 수 없다. SOCE에 근원하는 분자 재배열은 비교적 복잡하며 원형질막 채널, ER Ca²⁺ 센서, 예를 들어 기질 상호작용 분자, 및 가능하게는 ER Ca²⁺ 펌프(SERCA 유형의)를 포함한다.

SOCE를 매개하는 원형질막 채널의 적어도 2개의 세트, Ca²⁺ - 방출 활성화된 채널, Orai, 및 일시적인 수용체 전위(TRP) 채널이 존재한다. 신경교 SOCE의 분자 정체는 아직 명백히 확인되지 않았다. 그러나, Orai는 미세아교에서 우세하게 발현되는 반면, 성상세포 및 올리고수지상세포는 SOCE를 생성시키는데 TRP 채널에 보다 의존하는 것으로 보인다. 생리학적 조건에서 상기 SOCE 경로는 신경교세포상의 대사성 수용체의 자극에 이어서 관찰되는 Ca²⁺ 신호의 지속되는 단계에 유효하다. 이들 채널 중 2개, TRPC6 및 Orai2를 하기에 논의한다.

B. TRPC6

일시적인 수용체 전위 양이온 채널, 하위부류 C, 구성원 6(또한 TRPC6로서 공지됨)은 동일한 이름의 단백질을 암호화하는 인간 유전자이다. TRPC6은 일시적인 수용체 전위 이온 채널이다. 상기는 우울 및 불안증(하기 참조)뿐만 아니라 국소성 분절성 사구체경화증(FSGS)과 관련되었다.

하이페리쿰 페르포라툼(Hypericum perforatum)(세인트 존스 워트로서 또한 알려짐)의 항우울 및 항불안 이점을 담당하는 주요 활성 구성성분 중 2개가 하이퍼포린 및 애드하이퍼포린이다. 이들 화합물은 세로토닌, 노르에피네프린 및 에피네프린, 도파민, γ-아미노부티르산 및 글루타메이트의 재흡수의 억제제이며, 이들은 TRPC6에 결합하여 이를 활성화시킴으로써 상기 효과를 발휘한다. TRPC6의 활성화는 Ca²⁺ 및 Na⁺의 세포내로의 진입을 유도하며, 이는 상기 재흡수의 억제를 생성시킨다. TRPC6는 일부 연구에서 SOC에 관련되었지만, 상기 채널은 주로 수용체-작동된 채널(ROC)(디아실 글리세롤(DAG)에 의해 직접 활성화될 수 있다)인 것으로 여겨진다(Estacion et al. 2004).

TRPC6는 FYN, TRPC2 및 TRPC3와 상호작용하는 것으로 나타났다. 수납 번호는 NM_004621(mRNA) 및 NP_004612(단백질)이다.

C. Orai2

Oria2는 인간에서 ORAI2 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. Orai 단백질, Orai1, Orai2 및 Orai3은 상기 채널의 구멍을 형성하는 STIM 결합짝들이다. Orai 단백질은 원형질막 중에 균일하게 분포하며 휴지 상태에서 이량체로서 존재한다. STIM 활성화는 Orai 단백질의 사량체화 및 후속의 STIM-Orai 동시-국소화(상기 활성 저장소-작동된 칼슘 채널을 형성한다)를 유도한다. Orai2는 Ca²⁺ 방출-활성화된 Ca²⁺-유사(CRAC-유사) 채널 서브유닛(Ca²⁺ 유입을 매개하고 Ca²⁺ 센서, STIM1과의 상승작용에 의해 Ca²⁺-선택성 전류를 증가시킨다)의 부분으로서 기능한다.

Orai2는 COPS6, GDF9, MED31, SETDB1 및 UNC119와 상호작용한다. 수납 번호는 NM_001126340(mRNA) 및 NP_001119812(단백질)이다.

IV. 알쯔하이머병의 치료

A. 제형 및 투여 경로

본 명세에 따라, 알쯔하이머병 환자를 본 명세서에 기재된 화합물로 치료한다. 대상체에게 투여하기에 적합한 형태의 약학 조성물을 제조하는 것이 필요할 것이다. 상기 조성물은 일반적으로 발열원뿐만 아니라, 인간 또는 동물에게 유해할 수 있는 다른 불순물이 필수적으로 없이 제조될 것이다. 일반적으로, 안정한 세포를 환자에게 도입시키기에 적합하게 만들기에 적합한 염 및 완충제를 사용하는 것이 바람직할 것이다. 본 명세의 수성 조성물은 유효량의, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 수성 매질 중에 분산되고, 바람직하게는 캡슐화된 안정한 세포를 포함한다.

"약학적으로 또는 약물학적으로 허용 가능한"이란 어구는 동물 또는 인간에게 투여될 때 불리하거나, 알러지성이거나, 또는 다른 부적합한 반응을 생성시키지 않는 조성물을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 모든 용매, 분산 매질, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 특히 생체적합성 이식가능한 장치 및 캡슐화된 세포 집단을 포함하고자 한다. 약학적으로 활성인 물질을 위한 상기와 같은 매질 및 작용제의 사용은 당해 분야에 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 본 명세의 조성물과 상용성이지 않은 한을 제외하고, 치료 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 보충적인 활성 성분을 또한 상기 조성물에 혼입시킬 수 있다.

통상적인 보관 및 사용 조건하에서, 상기 세포 제제는 미생물의 생육을 방지하기 위한 보존제를 추가로 함유할 수 있다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충물을 포함한다. 보존제는 항균제, 산화방지제, 킬레이트화제 및 불활성 기체를 포함한다. 상기 약제 중 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도를 주지된 매개변수에 따라 조절한다.

상기 조성물을 유리하게는 경구로 또는 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 두개내, 관절내, 전립선내, 흉막내, 근육내, 피하를 포함한 주사에 의해, 또는 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 공지된 바와 같은 다른 방법 또는 상기의 임의의 조합에 의해 투여할 것이다.

당해 분야의 숙련가에 의해 인지되는 바와 같이, "치료 유효량"은 개시되고 특허청구된 방법에 따라 대상체에게 제공될 때 알쯔하이머병으로 진단되거나 또는 달리 상기 질병을 갖는 대상체에서 하기의 생물 활성 중 하나를 수행하기 위한 양을 지칭한다: 알쯔하이머병의 임의의 태양 또는 증상의 치료, 예를 들어 기억력, 인지력 또는 학습의 개선, 증상 또는 징후학의 진행의 늦춤, 삶의 질의 개선, 또는 수명의 증가.

당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 상기와 같은 치료 유효량은 다수의 인자들, 예를 들어 환자의 연령 및 체중, 환자의 신체 조건, 치료되는 상태, 및 다른 인자들에 따라 변할 것이다. 상기 개시된 화합물의 유효량은 또한 투여되는 특정 조합에 따라 변할 것이다. 그러나, 전형적인 용량은 하루에 약 1 ㎍, 5 ㎍, 10 ㎍, 50 ㎍ 내지 100 ㎍의 하한 내지 약 100 ㎍, 500 ㎍, 1 ㎎, 5 ㎎, 10 ㎎, 50 ㎎ 또는 100 ㎎의 상한의 상기 약학 화합물을 함유할 수 있다. 또한 용량당 0.1 ㎍ 내지 1 ㎎의 상기 화합물과 같은 다른 용량 범위가 고려된다. 상기 하루당 용량을 24시간 기간 동안 또는 상기 24시간의 임의의 부분 동안 연속해서 제공되는 별도의 단위 용량으로 전달할 수 있다. 상기 하루당 용량의 회수는 하루에 1 내지 약 4회일 수 있지만, 더 많을 수도 있다. 연속적인 전달은 연속적인 주입의 형태로 있을 수 있다. "QID", "TID", "BID" 및 "QD"란 용어들은 각각 하루에 4, 3, 2 및 1회 투여를 지칭한다. 예시적인 용량 및 주입속도는 별도의 용량당 0.005 nmol/㎏ 내지 약 20 nmol/㎏ 또는 연속적인 주입으로 약 0.01/pmol/㎏/분 내지 약 10 pmol/㎏/분을 포함한다. 이들 용량 및 주입을 정맥내 투여(i.v.) 또는 피하 투여(s.c.)에 의해 전달할 수 있다. i.v.로 제공되는 상기 약학 조성물의 예시적인 총 용량/전달은 약 2 ㎍ 내지 약 8 ㎎/일일 수 있는 반면, s.c.로 제공되는 상기 약학 조성물의 총 용량/전달은 약 6 ㎍ 내지 약 6 ㎎/일일 수 있다.

상기 개시된 화합물을 예를 들어 하기의 1일 투여량으로 투여할 수도 있다: 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏; 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 80 ㎎/㎏; 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 70 ㎎/㎏; 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 60 ㎎/㎏; 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 50 ㎎/㎏; 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 40 ㎎/㎏; 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏; 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 25 ㎎/㎏; 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 20 ㎎/㎏; 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 15 ㎎/㎏; 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏; 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 5 ㎎/㎏; 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 3 ㎎/㎏; 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 1 ㎎/㎏; 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 0.3 ㎎/㎏ from 약 100 ㎎/㎏ 내지 약 90 ㎎/㎏; 약 100 ㎎/㎏ 내지 약 80 ㎎/㎏; 약 100 ㎎/㎏ 내지 약 70 ㎎/㎏; 약 100 ㎎/㎏ 내지 약 60 ㎎/㎏; 약 100 ㎎/㎏ 내지 약 50 ㎎/㎏; 약 100 ㎎/㎏ 내지 약 40 ㎎/㎏; 약 85 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏; 약 75 ㎎/㎏ 내지 약 20 ㎎/㎏; 약 65 ㎎/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏; 약 55 ㎎/㎏ 내지 약 35 ㎎/㎏; 또는 약 55 ㎎/㎏ 내지 약 45 ㎎/㎏. 투여는 단일 용량 또는 분할 용량의 주사에 의할 수 있다.

"단위 용량"이란 용어는 대상체에게 사용하기에 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각 단위는 투여와 관련하여, 즉 적합한 경로 및 치료 섭생과 관련하여 목적하는 반응을 생성시키도록 계산된 소정량의 조성물을 함유한다. 치료 회수 및 단위 용량 모두에 따라 투여되는 양은 치료되는 대상체, 대상체의 상태, 및 목적하는 보호에 따라 변한다. 상기 치료 조성물의 정확한 양은 또한 의사의 판단에 따라 변하며 각 개인에 특유하다.

B. 복합 치료법

또 다른 실시태양에서, 본 명세의 억제제를 다른 작용제와 함께 어느 하나의 치료 효과를 개선 또는 증대시키기 위해 사용할 수 있다. 상기 과정은 상기 두 작용제를 모두 환자에게 동시에, 상기 두 작용제를 모두 포함하는 단일 조성물 또는 약물학적 제형으로서 투여하거나, 또는 2개의 별개의 조성물 또는 제형(여기에서 하나의 조성물은 본 명세의 억제제를 포함하고 다른 것은 제2 작용제(들)를 포함한다)을 투여함을 포함할 수 있다.

본 명세의 치료법은 또한 수분 내지 수주 범위의 간격으로 제2 작용제 치료에 선행하거나 후행할 수 있다. 다른 작용제 및 본 명세의 억제제를 별도로 투여하는 실시태양에서, 상기 작용제 및 본 억제제가 여전히 유리한 복합 효과를 발휘할 수 있도록, 각각의 전달시간 사이에 상당한 시간이 만료되지 않는 것이 바람직할 수 있다. 상기와 같은 상황에서, 서로 약 12 내지 24시간 이내에, 보다 바람직하게는 서로 약 6 내지 12시간 이내에 상기 두 양상을 모두 투여할 수 있음이 고려된다. 일부 상황에서, 상기 치료 기간을 현저하게 연장시키는 것이 바람직할 수 있으나, 이때 수일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7) 내지 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)가 각각의 투여 사이에 경과한다. 다른 실시태양에서, 대상체가 허용하지 못하는 조성물은 교체하는 것이 바람직할 수 있다.

다양한 추가적인 조합들을 사용할 수 있으며, 여기에서 본 명세의 화합물/작용물질은 "A"이고 2차 작용제는 "B"이다:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

상기 치료 주기를 필요에 따라 반복할 수 있을 것으로 예상된다.

다양한 AD 치료용 약물은 현재 입수할 수 있을 뿐만 아니라 연구 및 규제 고려하에 있다. 상기 약물들은 일반적으로 콜린에스테라제 억제제, 무스카린 작용물질, 산화방지제 또는 소염제의 광범위한 범주에 들어있다. 갈란타민(레미닐), 타크린(코그넥스), 셀레질린, 피소스티그민, 레비스티그민, 도네페질, (아리셉트), 리바스티그민(엑셀론), 메트리포네이트, 밀라멜린, 자노멜린, 사에루졸, 아세틸-L-카르니틴, 이데베논, ENA-713, 멤릭, 쿠에티아핀, 뉴레스트롤 및 뉴로미달은 AD 치료제로서 제안된 약물들 중 단지 일부이다.

V. 실시예

하기의 실시예들을 본 명세의 바람직한 실시태양을 입증하기 위해서 포함한다. 당해 분야의 숙련가들은, 하기의 실시예들에 개시된 기법들이 본 명세의 실행에 잘 기능하도록 본 발명자들에 의해 발견된 기법을 나타내며, 따라서 본 발명의 실행에 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 알 것이다. 그러나, 당해 분야의 숙련가들은 본 명세에 비추어, 개시되는 특정한 실시태양들에서 다수의 변화를 수행할 수 있고 본 명세의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 여전히 유사한 결과를 획득할 수 있음을 알 것이다.

실시예 1 - 물질 및 방법

화학물질.

NSN21778 (N-{4-[2-(6-아미노-퀴나졸린-4-일아미노)-에틸]-페닐}-아세트아미드)를 나노신 인코포레이티드(Nanosyn Inc.)(Santa Clara, CA)에 의해 합성하고 정제하였다.

동물.

PS1-M146V 녹-인 마우스(PS1KI)[Guo, 1999 #3782]는 후이 젱(Hui Zheng)(배일러 대학(Baylor University))에 의해 친절히 제공되었다. APP^NL-F 녹-인 마우스(APPKI)는 타카오미 사이도(Takaomi Saido)(Riken, Japan)에 의해 친절히 제공되었다[Saito, 2014 #6473]. 동일 계통의 WT 마우스(C57BL/6)가 대조용 실험에 사용되었다. PS1KIGFP 및 APPKIGFP 마우스를, PS1KI 또는 APPKI 마우스와 계통 M GFP 마우스를 교배하여 생성시켰다(C57BL/6 계통)[Feng, 2000 #6019]. 모든 마우스 콜로니를 확립시키고 UT 사우스웨스턴 의료 센터 장벽 시설에서 12시간 명/암 주기로 동물사육장(우리당 4마리)에 수용하였다. 마우스를 수반하는 모든 시술은 실험 동물 보호 및 사용에 관한 국립보건원 지침에 따라, 달라스에 있는 텍사스 사우스웨스턴 대학 의료 센터의 연구 동물 보호 및 사용 위원회에 의해 승인되었다.

1차 해마 신경 배양물에서 수상돌기 가시 분석.

PS1KI, APPKI 및 WT 마우스의 해마 배양물을 앞서 발명자들이 기재한 바와 같이 생후 0-1일 강아지로부터 확립시키고 배양물 중에서 유지시켰다[Zhang, 2010 #5733]. 시냅스 형태의 평가를 위해서, 해마 배양물을 칼슘 포스페이트 방법을 사용하여 DIV7에서 TD-토마토 플라스미드로 형질감염시키고 DIV15-16에서 고정시켰다(PBS 중 4% 포름알데히드, 4% 슈크로스, pH 7.4). 광학 절편의 Z-스택을 공초점 현미경(LSM510을 갖는 칼 자이스 액시오버트(Carl Zeiss Axiovert) 100 M)으로 100X 대물렌즈를 사용하여 포착하였다. 3개의 배양물 배치로부터 18 내지 20개의 배양된 뉴런을 유전자형에 따른 정량 분석을 위해 사용하였다. 수상돌기 가시에 대한 정량 분석을 뉴런스튜디오(NeuronStudio) 소프트웨어 패키지[Rodriguez, 2008 #6276]를 사용하여 수행하였다. 배양물 중 뉴런 가시의 모양을 분류하기 위해서, 발명자들은 공개된 방법[Rodriguez, 2008 #6276]으로부터의 연산을 맞추었다. 가시 모양의 분류에서 발명자들은 하기의 컷오프 값을 사용하였다: 얇은 가시에 대한 종횡비(AR_thin_(crit)) = 2.5, 머리 대 목 비(HNR_(crit)) = 1.4, 및 머리 직경(HD(crit)) = 0.5 ㎛. 이들 값을 [Rodriguez, 2008 #6276]에 기재된 바와 같이 한정하고 정확히 계산하였다.

GCamp5.3 Ca²⁺ 영상화 실험.

GCamp5.3 영상화 실험을 발명자가 앞서 보고한 바와 같이[Sun, 2014 #6478] 수행하였다. 간단히, 배양된 해마 뉴런을 DIV7에서 칼슘 포스페이트 형질감염 방법을 사용하여 GCamp5.3 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 상기 GCamp5.3 형광 상을 60X 렌즈, 캐스케이드 650 디지털 카메라(로퍼 사이언티픽(Roper Scientific)) 및 프라이어 루멘(Prior Lumen) 200 조명기가 구비된 올림푸스(Olympus) IX70 도립 에피형광 현미경을 사용하여 수집하였다. 상기 실험을 메타플루오르(MetaFluor) 상 포착 소프트웨어 패키지(유니버셜 이미징(Universal Imaging))에 의해 조절하였다. 시냅스 nSOC를 측정하기 위해서, 상기 뉴런을 인공 CSF(aCSF)로부터 30분 동안 0.4 mM EGTA 및 1 μM TG(탑시가르긴)이 있는 무칼슘 배지로 이동시키고, 기본 30초 기록 후에, 무칼슘 aCSF 중에 100 μM DHPG를 가하고, 50초 후에 Ca²⁺ 채널 억제제 칵테일(1 μM TTX, 50 μM AP5, 10 μM CNQX 및 50 μM 니페디핀)이 첨가된 aCSF로 복귀시켰다. 상기 데이터의 분석을 NIH 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 상기 상 분석에 사용된 관심 영역(ROI)을 가시에 상응하게 선택하였다. 모든 Ca²⁺ 영상화 실험은 실온에서 수행되었다.

해마 조각 장 기록.

해마 조각 현장 기록을 최근에 기재된 바와 같이 수행하였다[Zhang, 2015 #6714]. 간단히, 해마 조각(400 ㎛)을 어느 성별이든 6개월된 동물로부터 제조하였다. 마우스를 마취시키고, 참수시키기 전에 해부 완충제를 경심관류시켰다. 뇌를 제거하고, 절제하고, 2.6 KCl, 1.25 NaH₂PO₄, 26 NaHCO₃, 0.5 CaCl₂, 5 MgCl₂, 212 슈크로스, 및 10 덱스트로스(mM)를 함유하는 빙냉 해부 완충제 중에서 비브라톰(레이카(Leica) VT 1000S)을 사용하여 조각내었다. CA3을 절단하여 간질유발 활성을 피하였다. 상기 조각을 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.25 mM NaH₂PO₄, 26 mM NaHCO₃, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 및 10 mM 덱스트로스를 함유하는 ACSF로 충전된 수용조 챔버로 옮겼다. 조각을 30 ℃에서 2 내지 5시간 동안 회복되게 하였다. ACSF 및 해부 완충제를 95% O₂-5% CO₂로 평형화하였다. 기록을 위해서, 조각을 물속에 잠긴 기록 챔버로 옮기고, 30 ℃에서 유지시키고, 2 내지 3 ㎖/분의 속도로 ASCF로 연속적으로 관류시켰다. 장 전위(FP)를, ACSF가 충전되고 영역 CA1의 방사상층에 놓인 세포외 기록 전극(1 MΩ)으로 기록하였다. FP는 동심성 양극 텅스텐 자극 전극(FHC, Bowdoinham, ME)에 의한 샤퍼 측부/접합부 구심의 단상 자극(100-μs)에 의해 발생되었다. 안정한 기준선 반응을 자극 강도(15 내지 30 μA)를 사용하여 30초마다 수집하여 최대 반응의 50%를 제공하였다. 상기 FP의 초기 기울기를 사용하여 시냅스 반응의 안정성을 측정하고 LTP의 크기를 정량분석하였다. 상기 LTP는 1초 동안 2열의 100 Hz 주파수 자극에 의해 유도되었으며, 이때 각 열은 20초 간격으로 분리되었다. 14812 치료 실험을 위해서, 해마 조각을 ACSF에서의 기록 개시에 앞서 2 내지 3시간 동안 300 nM 14812와 함께 예비-배양하였다.

해마 조각에서 수상돌기 가시 분석.

해마 조각에서 가시의 모양을 분석하기 위해서, 발명자들은 WTGFP, PS1KIGFP 및 APPKIGFP 마우스를 사용하였다. 해마 조각을 상기와 같이 제조하고, 조각을 30 ℃에서 1시간 동안 회복되게 하고, 절반 조각을 30 ℃에서 3.5시간 동안 300 nM 14812로 처리하고, 다른 절반 조각은 대조용으로서 상기 ACSF 중에 두고, 조각들을 PBS 중의 4% 포름알데히드, 0.125% 글루타르알데히드로 고정시켰다. GFP 상을 40X 렌즈 및 5X 줌으로 2-광자 영상화(자이스 LSM780)에 의해 포착하였다. Z 간격은 0.5 ㎛였다. 해마 CA1 피라미드 뉴런의 2차 첨단 수상돌기를 상 촬영을 위해 선택하였다. 5마리의 마우스로부터 대략 25개의 뉴런을 각 유전자형에 대해 분석하였다. 조각 중 뉴런 가시의 모양을 분류하기 위해서 발명자들은 또한 뉴런스튜디오 소프트웨어 패키지 및 [Rodriguez, 2008 #6276]으로부터의 연산을 사용하였으며, 하기의 컷오프 값을 사용하였다: AR_thin_(crit) = 2.5, HNR_(crit) = 1.4, 및 HD(crit) = 0.5 ㎛.

NSN21778 생체내 연구.

버섯 가시 구제 및 행동 연구를 위해서, 각 그룹(WTGFP, PS1KIGFP 및 APPKIGFP)에 대해 5마리의 암컷 마우스를 4월령에 시작하여 10 ㎎/㎏의 NSN21778로 3회/주 i.p. 주사하였다. 대조용 마우스 그룹을 동일한 용매 용액으로 주사하였다. 6주 후에, 주사 루틴을 주당 2회로 변화시켰다. 9주 후에, 마우스를 두려움 조절 실험에 의해 시험하였다. 10주 후에, 모든 마우스를 생체내 가시 분석을 위해 죽였다. 아밀로이드 반 연구를 위해서, APPKI 마우스를 11월령에 시작하여 3회 i.p. 주사/주를 통해 10 ㎎/㎏ NSN21778을 주사하였다. 대조용 마우스 그룹을 동일한 용매 용액으로 주사하였다. 8주의 주사 후에, 마우스를 Aβ 면역조직화학 염색을 위해 죽였다.

통계 분석.

결과를 평균±SEM으로서 나타낸다. 실험에서 획득된 결과의 통계학적 비교를, 2-그룹 비교를 위한 스튜던츠 t 검정 및 일원 또는 이원 ANOVA에 이어서 2개 초과 그룹간의 다중 비교를 위한 터키(Tukey) 검정에 의해 수행하였다. p 값을 적합한 대로 본문 및 도면 범례에 나타낸다.

플라스미드 및 바이러스.

YFP-STIM2는 젠 리우(Jen Liou) 박사에 의해 친절히 제공되었으며, 인간 TRPC6 cDNA 및 마우스 Orai2 cDNA 클론은 오픈 바이오시스템스(Open Biosystems)로부터 구입하였고 PCR에 의한 TRPC6 및 Orai2 렌티바이러스 발현 구조물의 생성에 사용하였다. HA 태그는 PCR에 의해 5' 단부로 유도되었으며, YFP-TRPC6는 크레이그 몬텔(Craig Montell) 박사에 의해 친절히 제공되었고, FLAG-TRPC6/pCMV는 조셉 유안(Joseph Yuan) 박사에 의해 친절히 제공되었으며, GST-S2-SOAR(aa 348-450) 및 GST-S2-CT(aa248-C 말단)는 PCR에 의해 생성되었고 PGEX-KG 벡터내로 클로닝되었다. STIM2-LASS(L377S, A380S) 돌연변이는 Q5 돌연변이유발 키트(시그마)에 의해 생성되었고, 대조용-짧은-헤어핀 RNA 간섭(Ctrl-shRNAi)(SHC002), 마우스 TRPC6-shRNAi(SHCLNG-NM_013838, TRCN0000068394), 및 마우스 Orai2-shRNAi(SHCLNG-NM_178751, TRCN0000126314) 렌티바이러스 셔틀 구조물은 시그마로부터 수득되었다. 렌티바이러스는 앞서 발명자들에 의해 기재된 바와 같이(Zhang et al., 2010) 2개의 헬퍼 플라스미드(pVSVg 및 pCMVΔ8.9)의 패키징 세포주 HEK293T내로의 동시-형질감염에 의해 생성되었다.

항체.

항-TRPC6 pAb(1:500, 시그마, SAB4300572), 항-Orai2 pAb(1:200 산타 크루즈(Santa Cruz), sc-292103), 항-GFP mAb(1:2000, 피어스(Pierce), MA5-15256), 항-FLAG(1:1000, 시그마, F3165), 항-HA(1:3000, 코밴스(Covance), MMS-101R), 항-STIM2 pAb(1:500, 셀 시그널링(Cell Signaling), 4917s), 항-포스포(Phospho)-CaMKII(1:1000, 셀 시그널링, 3361s), 항-CaMKII(1:1000, 케미콘(Chemicon), MAB8699), 항-PSD95(1:1000, 셀 시그널링, 3450s), 항-GAPDH(1:1000, 밀리포어(Millipore), MAB374), 및 항-Aβ 6E10 mAb(1:1000, 코밴스, SIG-39300)를 사용하였다. HRP-접합된 항-토끼 및 항-마우스 2차 항체(115-035-146 및 111-035-144)를 잭슨 임뮤노리써치(Jackson ImmunoReseach)로부터 수득하였다.

정량적인 역전사 PCR 분석(qRT-PCR).

마우스 유전자 발현 프로파일링을 위해서, 상이한 뇌 영역 조직을 7 내지 8주된 수컷 C57BL/6 마우스(n=6)로부터 얻었다. RNA를 제조사의 지시에 따라 RNAStat60(텔테스트(TelTest), Friendwood, TX)을 사용하여 추출하였다. 전체 RNA를 각 조직에 대해서 동량으로 모았다(n=6). 게놈 DNA 오염을 DNase I(롯슈)에 의해 제거하였다. qPCR 분석을 위한 cDNA를 고용량 cDNA 역전사 키트(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))를 사용하여 제조하였다. 유전자 발현 수준을, 프라이머를 사용하여 SYBR 그린 화학으로 어플라이드 바이오시스템스 7900HT상에서 측정하였다(하기 표 참조). 표준화된 mRNA 수준을 임의의 단위로서 나타내며 이를, mRNA 발현에 대해 평균화한, 효율 보정된 값을 18s rRNA(마우스 18s rRNA 순방향: accgcagctaggaataatgga; 서열번호 1, 및 마우스 18s rRNA 역방향: gcctcagttccgaaaacca; 서열번호 2)에 대한 값으로 나누어 획득하였다. 생성되는 값에, 그래프 표현을 위해 10⁵을 곱하였다. 오차 막대는 실험 오차를 나타내며 3회 중복 샘플 웰로부터의 평균 값의 표준 편차를 근거로 계산되었다.

해마 시냅토솜 분획(P2) 및 공-면역침전.

해마 영역을 1개월 된 마우스로부터 추출하고, 0.32 M 슈크로스 및 25 mM HEPES, pH 7.2 중에서 균질화하고, 800 g에서 10분 동안 원심분리시켜 핵을 제거하였다. 이어서 저속 상등액을 12,000 g에서 20분 동안 원심분리시켜 시냅토솜 상등액 및 시냅토솜 막 분획(P2 펠릿)을 분리시켰다. P2 펠릿을 1% CHAPS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na₂HPO₄, 1.4 mM KH₂PO₄, pH 7.2, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 및 프로테아제 억제제를 함유하는 용해 완충제 중에 4 ℃에서 2시간 동안 용해시켰다. 불용성 물질을 16300 g에서 20분 동안 샘플의 원심분리에 의해 제거하였다. 시냅토솜 분획 중의 단백질 농도를 나노드롭(Nanodrop) OD280에 의해 측정하였다. 각각의 공-면역침전 반응을 위해서, 500 ㎍의 전체 단백질 용해물을 먼저 정규 토끼 IgG 및 단백질 A/G 비드와 4 ℃에서 1시간 동안 예비-세정하고, 이어서 4 ℃에서 1시간 동안 2 ㎍의 1차 항체와 함께 배양하고, 이어서 4 ℃에서 밤새 흔들리는 단상에서 20 ㎕ 단백질 A/G 아가로스 비드와 함께 배양하고, 이어서 침전된 샘플을 용해 완충제로 3회 세척하고, 1xSDS 로딩 완충제 중에 최종 비드 펠릿을 재현탁시키고 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다.

GST 풀-다운 분석.

GST-융합 단백질을 앞서 기재된 바와 같이 BL21 이 콜라이 균주에서 발현시키고 정제하고(Zhang et al., 2005), YFP-TRPC6 또는 HA-Orai2 단백질을 HEK293 세포에서 발현시키고 1% CHAPS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na₂HPO₄, 1.4 mM KH₂PO₄, pH 7.2, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 및 프로테아제 억제제를 함유하는 용해 완충제 중에서 4 ℃에서 1시간 동안 추출하였다. 추출물을 원심분리에 의해 등명화하고 상응하는 GST 융합 단백질과 함께 4 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 비드를 추출 완충제로 4회 세척하고, 부착된 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동상에서 분리시키고 항-GFP 또는 항-HA 항체로 탐침조사하였다.

Fura-2 Ca²⁺ 영상화 실험.

배양된 DIV15-16 해마 뉴런을 사용하는 Fura-2 Ca²⁺ 영상화 실험을 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다(Zhang et al., 2010). Fura-2 340/380 비 상을 DeltaRAM-X 조명기, 이볼브(Evolve) 카메라 및 IMAGEMASTER PRO(등록상표) 소프트웨어(모두 포톤 테크놀로지 인터내셔널 인코포레이티드(Photon Technology International, Inc.)로부터)를 사용하여 수집하였다. 전체 세포체를 상 분석을 위해 관심 영역(ROI)으로서 지정하였다. 뉴런 저장소-작동된 Ca²⁺ 진입(nSOC) 실험에서, 상기 뉴런을 인공 CSF(aCSF, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, and 10 mM HEPES, pH 7.3)로부터 30분 동안 0.4 mM EGTA 및 1 μM Tg(탑시가르긴)가 있는 무칼슘 aCSF로 이동시키고, 이어서 1 μM TTX, 50 μM AP5, 10 μM CNQX 및 50 μM 니페디핀이 있는 aCSF로 복귀시켰다. nSOC-매개된 Ca²⁺ 증가의 최대 진폭(피크)을 Fura-2 340 ㎚/380 ㎚ 비로부터 측정하였다. 모든 Ca²⁺ 영상화 실험을 실온에서 수행하였다.

시험관내 대사 분석.

암컷 ICR/CD-1 마우스 S9 분획을 셀시스/인 비트로 테크놀로지스(Celsis/In Vitro Technologies)(Baltimore, MD)로부터 구입하였다. 25 ㎕(0.5 ㎎)의 S9 단백질을 15 ㎖ 유리 스크류 캡 튜브에 가하였다. 관심 화합물을 함유하는, 350 ㎕의 50 mM 트리스, pH 7.5 용액을 얼음상에 가하였다. 모든 시약의 첨가 후 NSN21778 화합물의 최종 농도는 2 μM이었다. 125 ㎕의 NADPH-재생 시스템(2% w/v NaHCO₃/10 mm MgCl₂ 중의 1.7 ㎎/㎖ NADP, 7.8 ㎎/㎖ 글루코스-6-포스페이트, 6 U/㎖ 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제)을 I 단계 대사의 분석을 위해 첨가하였다. 이어서 상기 튜브를 37 ℃ 진탕 수욕에 넣었다. I 단계 보조인자 첨가 후 다양한 시점들에서, 포름산 및 n-벤질벤즈아미드 내부 표준(IS)을 함유하는 메탄올 0.5 ㎖을 가하여 상기 반응을 정지시켰다. 상기 샘플을 RT에서 10' 배양하고 이어서 16,100xg에서 5분 동안 회전시켰다. 상등액을 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 상업적인 마우스 CD-1 혈장(바이오리클라메이션(Bioreclamation), Westbury, NY)에서의 안정성을 유사한 방식으로 측정하였다. NSN21778(2 μM)을 0-1440 분 동안 쥐 혈장과 함께 배양하였다. 반응을 상기와 같이 메탄올로 급냉시키고 상등액을 LC-MS/MS에 의해 평가하였다. 화합물 반감기를 기재된 바와 같이 기질 고갈 방법에 의해 측정하였다(McNaney et al., 2008).

생체내 약동학.

6주된 암컷 CD-1 마우스에게, 10% 에탄올/10% 크레모포어 EL/80% 50 mM 시트레이트 완충제, pH 5.0 중에서 제형화된 10 ㎎/㎏ NSN21778을 IP(0.2 ㎖) 투여하였다. 전혈 및 뇌를 수확하였다. 산성화된 시트레이트 덱스트로스(ACD)를 응고방지제로서 사용하였다. 혈장을 전혈로부터 표준 원심분리기에서 10,000 rpm에서 10' 동안 원심분리에 의해 가공하였다. 뇌를 칭량하고 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 뇌 균질물을, 뇌 조직을 3배 부피의 PBS(균질물의 전체 부피 ㎖ = 4x 중량 g) 중에서 균질화함으로써 제조하였다. 전체 뇌 균질물 부피를, 첨가된 PBS의 부피 + 뇌의 부피(㎖)로서 산정하였다. 100 ㎕의 혈장 또는 뇌를 포름산을 함유하는 아세토니트릴 200 ㎕와 혼합하여 혈장 또는 조직 단백질을 침전시키고 결합된 약물을 방출시켰다. 상기 샘플을 15초 와동시키고, 실온에서 10' 동안 배양하고 2x16,100 g에서 회전시켰다. 이어서 상등액을 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 표준 곡선을, 혈장 또는 뇌 균질물에 NSN21778의 첨가에 의해 작성하였다. 블랭크 혈장 또는 뇌 균질물 중에서 획득된 신호 x3 이상의 값을 검출 한계(LOD)로 지정하였다. 정량화 한계(LOQ)는 역산이 이론치의 20% 이내 및 상기 LOD 신호 이상의 농도를 제공하는 최저 농도로서 정의되었다. 혈장 및 뇌에 대한 NSN21778의 LOQ는 5 ng/㎖이었다. 값이 LOD 초과 LOQ 미만인 경우, 상기를 ½LOQ 또는 실제 측정(어느 것이든 가장 높은 것)으로 정하였다. 동물은 조직 단리에 앞서 관류되지 않았으므로, NSN21778의 최종 뇌 농도를 측정하기 위해서, 뇌 혈관구조에 기인한 뇌 중 화합물의 양을 먼저 NSN21778의 계산된 혈장 농도 및 30 ㎕의 혈액/뇌 조직 g의 값을 사용하여 공제하였다(Kwon, 2001).

두려움 조절 시험.

두려움 조절을 급경사의 충격 발생기(메드 어쏘시에이츠 인코포레이티드(Med Associates Inc.), St. Albans)에 연결된 금속 격자 바닥이 구비된 상자에서 측정하였다. 훈련을 위해, 마우스를 개별적으로 상기 챔버에 넣었다. 2분 후에, 상기 마우스는 3 소리-충격 쌍(30초 백색 소음, 2초로 동시-종료된 80 dB 소리, 0.5 mA 사지충격, 1분 시도간 간격)을 받았다. 다음날, 상기 상황의 기억을, 상기 마우스를 동일한 챔버에 넣어 측정하였으며 상기 메드 어쏘시에이츠 소프트웨어에 의해 프리징을 자동적으로 측정하였다. 훈련 후 48시간째에, 상기 백색 소음 단서에 대한 기억을, 상기 마우스를 변경된 바닥과 벽, 상이한 조명 및 바닐라 냄새가 있는 상자에 넣어 측정하였다. 프리징이 3분 동안 측정되었고, 이어서 상기 소음 단서를 추가로 3분 동안 켰으며 프리징이 측정되었다.

마우스 해마에서 수상돌기 가시 분석.

생체내에서 해마 중 가시의 모양을 분석하기 위해서, 발명자들은 GFP-M 계통 마우스를 사용하였다(Feng et al., 2000)(WTGFP). 상기 분석을 간단히 하기 위해서, 발명자들은 계통 M GFP 마우스를 PS1KI 및 APPKI 마우스와 교배시켜 PS1KIGFP 및 APPKIGFP 마우스를 제공하였다. 마우스를 3분 동안 포스페이트 완충제(pH 7.4) 중의 빙냉 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액으로 경심관류시켰다. 뇌를 추출하고 절단 전에 16시간 동안 4% PFA 용액 중에 후-고정시켰다. 상기 고정된 뇌로부터 50 ㎛ 해마 절편을 비브라톰(레이카 1200S)을 사용하여 수득하였다. 광학 절편의 Z-스택을 공초점 현미경(LSM510을 갖는 칼 자이스 액시오버트 100 M)으로 100X 대물렌즈를 사용하여 포착하였다. Z 간격은 0.5 ㎛였다. 해마 CA1 피라미드 뉴런의 첨단 수상돌기를 상 촬영을 위해 선택하였다. 5마리의 마우스로부터 대략 25개의 뉴런을 각 마우스 그룹에 대해 분석하였다. 조각 중 뉴런 가시의 모양을 분류하기 위해서 발명자들은 또한 뉴런스튜디오 소프트웨어 패키지 및 (Rodriguez, 2008)로부터의 연산을 사용하였으며, 하기의 컷오프 값을 사용하였다: AR_thin_(crit) = 2.5, HNR_(crit) = 1.4, HD(crit) = 0.5 ㎛.

Aβ 면역조직화학 염색.

β-아밀로이드 반 분석을 위해서, 마우스를 말단 마취시키고 30 ㎖의 빙냉 PBS로 경심관류시킨 다음 50 ㎖의 고정액(0.1 M PBS 중 4% 파라포름알데히드, pH 7.4)을 관류시켰다. 모든 뇌를 두개골로부터 제거하고, 4% 파라포름알데히드 중에서 4 ℃에서 밤새 후고정시키고, PBS 중에서 20 내지 30%(w/v) 슈크로스로 평형화시켰다. 상기 뇌를 SM2000R 활주 마이크로톰(레이카)을 사용하여 30-㎛-두께 관상 절편으로 조각내었다. 전뇌 전체를 통해 이격된 APPPS1 마우스로부터의 30 ㎛ 관상 절편을 6E10 항-Aβ mAb(1:1000 희석)로 염색한 다음 알렉사 플루오르-488 2차 항-마우스 IgG(1:1000 희석)로 염색하였다. 상기 아밀로이드 반의 평균 면적 및 상기 반 중 형광 신호의 평균 강도를 앞서 기재된 바와 같이(Zhang et al., 2010) 아이소사이트(Isocyte) 레이저 스캐너 및 상 분석 소프트웨어를 사용하여 각 조각으로부터 자동적으로 계산하였다. 각 마우스로부터 20개의 관상 절편을 상기 분석을 위해 정량분석하고, 데이터를 NSN21778 처리된(n=5) 및 대조용 그룹(n=4) 내에서 평균하였다.

실시예 2 - 결과

TRPC6 및 Orai2는 해마 시냅스에서 STIM2와 복합체를 형성한다.

가시 중 STIM2-관문 nSOC 채널의 분자 성분을 확인하기 위해서, 발명자들은 후보 접근법을 취하였다. 선행 연구들은 2개의 주요 단백질 계열, 일시적인 수용체 전위 표준(TRPC) 및 Orai 채널이 다양한 세포에서 SOC의 지지에 핵심적인 역할을 함을 제시하였다[Majewski, 2015 #6717; Sun, 2014 #6718]. 인간에는 6개의 TRPC 단백질(TRPC1, TRPC3-TRPC7)이 존재하며, 이들은 생화학적 및 기능적 유사성을 기준으로 2개의 하위계열, TRPC1/TRPC4/TRPC5 및 TRPC3/TRPC6/TRPC7로 나뉘어졌다. 남은 구성원, TRPC2는 인간에서 위유전자이나, 다른 종에서는 제한된 발현 패턴으로 발현된다[Cheng, 2013 #6719]. 3개의 Orai 채널(Orai1 - Orai3)이 존재하나, 지금까지 대부분의 연구는 Orai1에 집중하여 왔다. 발명자들은 TRPC 및/또는 Orai 채널 계열의 구성원들이 상기 가시 중 STIM2-관문 nSOC 채널을 암호화하기에 가장 그럴듯한 후보인 것으로 판단하였다. STIM2의 발현은 해마에서 고도로 농축된다[Sun, 2014 #6478](도 8). 발명자들은 STIM2-관문 nSOC 채널의 다른 성분들이 유사한 발현 패턴을 가질 것으로 판단하였다. 앨런 브레인 아틀라스로부터의 데이터의 분석은 TRPC6 및 Orai2 단백질이 유사한 발현 패턴을 가짐을 밝혀내었다(도 8). STIM1 및 TRPC 및 Orai 계열의 다른 구성원들은 뇌의 해마 영역에서 현저한 농축을 입증하지 못한다(도 8). 이러한 결과를 확인하기 위해서, 발명자들은 상이한 뇌 영역으로부터 제조된 cDNA 샘플을 사용하여 일련의 q-RTPCR 실험을 수행하였다. 앨런 브레인 아틀라스 데이터와 일관되게, 발명자들은 STIM2, TRPC6 및 Orai2를 해마-농축된 유전자로서 확인하였다(도 9). 유전자 발현 데이터(도 8 내지 9)를 근거로, 발명자들은 해마 가시 중 STIM2-관문 nSOC 채널을 암호화하는 후보 분자로서 TRPC6 및 Orai2에 집중하였다.

STIM2-관문 채널 복합체의 성분들을 확인하기 위해서, 발명자들은 해마 시냅토솜을 제조하고 일련의 면역침전 실험을 수행하였다. 이들은 TRPC6 또는 Orai2에 대한 항체들이 실제로 STIM2를 시냅토솜 용해물로부터 허물 수 있음을 발견하였다(도 1A). 면역침전된 STIM2의 겉보기 분자량은 투입 레인에서 STIM2의 분자량보다 더 높았다(도 1A). TRPC6 및 Orai2가 번역후 변형, 예를 들어 인산화를 겪은 STIM2와 복합체를 형성하는 듯하다[Smyth, 2012 #6763]. 상기 관찰과 일관되게, 피질 용해물로부터의 Orai1과 공-면역침전된 STIM2는 또한 젤상에서 보다 높은 분자량을 나타낸다[Gruszczynska-Biegala, 2013 #6722].

STIM2는 TRPC6 및/또는 Orai2에 직접 결합하는가?

STIM1 및 STIM2 단백질은 유사한 도메인 구조 및 76% 서열 유사성을 공유한다[Stathopulos, 2013 #6729]. STIM2 단백질은 광범위하게 연구되지 않았으나, STIM1 단백질의 구조-기능 분석은 앞서 다수의 노력들에 의해 수행되었다. STIM1 단백질은 시토솔 SOAR 도메인을 통해 Orai1과 상호작용하고 상기를 통문함이 확립되었다[Park, 2009 #6730; Yuan, 2009 #6731]. STIM1 SOAR 도메인 서열에서의 이중 돌연변이(L373S, A376S)는 STIM1과 Orai간의 회합을 파괴한다[Frischauf, 2009 #6716]. STIM1과 STIM2간의 서열 상동성에 의해 유도되는 바와 같이, 발명자들은 야생형 STIM2-SOAR 도메인의 GST-융합 구조물(S2-SOAR) 및 상기 STIM2-SOAR 서열(S2-LASS) 중 상응하는 돌연변이체(L377S, A380S)를 생성시켰다. 이들은 상기 구조를 YFP-태그된 TRPC6 또는 HA-태그된 Orai2로 형질감염된 HKE293 세포로부터의 용해물과 함께 풀-다운 실험에 사용하였다. 이들은 STIM2-SOAR 도메인이 Orai2 단백질과 강하게 회합되며 상기 회합은 LASS 돌연변이에 의해 파괴됨을 발견하였다(도 1B). 대조적으로, STIM2-SOAR 도메인과 TRPC6과의 회합은 약하며 LASS 돌연변이에 의해 영향을 받지 않았다(도 1B). 유사한 결과가, STIM2의 전체 시토솔 꼬리가 SOAR 도메인 대신 풀-다운 실험에 사용된 경우 관찰되었다(데이터 도시 안 됨). 이러한 결과는 STIM2가 SOAR 도메인을 통해 Orai2와 강하고 직접적으로 회합되나, TRPC6과는 매우 약하게 회합됨을 암시한다. 이는, SOAR 도메인을 통해 Orai1 및 TRPC1/2/4와 상호작용하지만 ERM 도메인을 통해 TRPC3/6/7과는 상호작용하지 않음을 입증하는 STIM1의 선행 분석과 일치한다[Huang, 2006 #6732]. STIM2를 침전시키는 TRPC6 항체의 능력을 설명하기 위해서(도 1A), 발명자들은 Orai2 및 TRPC6이 막 중에 복합체를 형성할 수 있음을 판단하였다. 유사한 복합체가 앞서 비-흥분성 세포에서 TRPC6/3 및 Orai1에 대해 제안되었다[Liao, 2007 #6733; Jardin, 2009 #6738]. 상기 가설을 시험하기 위해서, 이들은 FLAG-태그된 TRPC6 및 HA-태그된 Orai2를 HEK293 세포에 동시-형질감염시키고 공-면역침전 실험에서 TRPC6/Orai2 복합체의 형성을 확인하였다(도 1C).

STIM2-Orai2-TRPC6 복합체의 기능을 추가로 조사하기 위해서, 발명자들은 HEK293 세포를 HA-태그된 TRPC6 및 Orai2 구조물 및 YFP-태그된 STIM2 구조물 또는 YFP-태그된 STIM2-LASS 돌연변이체 구조물로 동시-형질감염시켰다. 문헌의 결과는 STIM1, Orai 및 TRPC 채널간의 회합이 ER Ca²⁺ 저장소의 고갈 상태에 의해 조절될 수 있음을 제시한다[Cheng, 2013 #6719; Liao, 2007 #6733; Liao, 2008 #6734; Liao, 2009 #6735; Cheng, 2008 #6736; Cheng, 2011 #6737; Jardin, 2009 #6738; Ong, 2007 #6739; Zeng, 2008 #6740]. 상기 가능성을 설명하기 위해서, 발명자들은 저장소 고갈을 야기하는 무-Ca²⁺ 배지에서의 배양에 이어서 표준 배양 조건(2 mM 세포외 Ca²⁺)에서 형질감염된 HEK239 세포로부터의 용해물을 제조하였다. 상기 용해물을 항-TRPC6 항체로 침전시켰으며 YFP-STIM2의 존재를 항-EGFP 항체에 의한 웨스턴 블럿팅에 의해 분석하였다. 이들 실험에서, 발명자들은 통상적인 Ca²⁺ 조건(2 mM Ca²⁺)하에서, STIM2는 TRPC6과 약하게 회합하고(도 1D, 레인 1) 상기 회합은 저장소 고갈에 의해 촉진됨을 발견하였다(도 1D, 레인 2). 흥미롭게, STIM2-SOAR 도메인 서열 중 LASS 돌연변이는 STIM2와 TRPC6과의 회합을 파괴하지 않았으나, 상기 상호작용은 더 이상 ER Ca²⁺ 수준에 의해 조절되지 않았다(도 1D, 레인 3 및 4). 상기 결과를 설명하기 위해서, 발명자들은 도 1E에 묘사된 모델을 제안하였다. 발명자들은 통상적인 ER Ca²⁺ 저장소의 조건하에서, SOAR 도메인을 통해 Orai2와 강하게 상호작용하는 일부 STIM2 단백질 및 상이한 영역을 통해 TRPC6과 약하게 상호작용하는 일부 STIM2 단백질이 존재함을 제안한다(도 1E, 패널 1). ER 저장소 고갈 및 STIM2의 올리고머화에 이어서, 보다 많은 Orai2 및 TRPC6 단백질이 모이고 TRPC6, Orai2 및 STIM2의 기능성 복합체가 조립된다(도 1E, 패널 2). 상기 복합체에서, TRPC6은 Ca²⁺-전도 채널로서 작용하며 Orai2는 STIM2와의 회합에 의해 ER Ca²⁺ 수준의 감지에 수반된다. 유사한 생각이 STIM1-TRPC3/6-Orai1 복합체의 기능을 설명하기 이전에 제안되었다[Liao, 2007 #6733; Jardin, 2009 #6738]. 발명자들은 STIM2-SOAR 도메인 중의 LASS 돌연변이가 Orai2와의 회합을 파괴하며 Orai2와의 경쟁의 상실로 인해 TRPC6와의 비-생산적인 회합을 증대시킴을 추가로 주장한다(도 1E, 패널 3). Orai2와 결합할 수 없음으로 인해, TRPC6과의 STIM2-LASS 회합은 더 이상 ER Ca²⁺ 저장소 고갈에 의해 조절되지 않는다(도 1E, 패널 4). 상기 논의의 나머지는 해마 시냅스 가시 중 TRPC6/Orai2-STIM2 복합체의 기능을 설명하기 위해 상기 모델(도 1E)에 의해 안내될 것이다.

TRPC6 및 Orai2는 해마 버섯 가시 중 STIM2-관문 nSOC 채널의 성분들이다.

TRPC6 및 Orai2가 실제로 가시 중의 STIM2-관문 nSOC 채널의 성분으로서 작용하는지를 판정하기 위해서, 발명자들은 렌티바이러스-매개된 shRNAi 전달을 사용함으로써 마우스 해마 뉴런 배양물에서 TRPC6 및 Orai2의 녹다운을 수행하였다. 선행 연구에서, 발명자들은 시냅스 CaMKII의 활성이 nSOC 경로에 의해 조절되고 자동인산화된 pCaMKII의 수준을 상기 가시 중의 정상상태 CaMKII 활성에 대한 생화학적 정보로서 사용할 수 있음을 입증하였다(Sun et al., 2014). 발명자들은 또한 앞서 nSOC의 억제가 상기 가시 중의 PSD95 발현의 상실을 생성시킴을 입증하였다(Sun et al., 2014). 이들 실험에서, 발명자들은 TRPC6 또는 Orai2의 RNAi-매개된 녹다운이 PSD95 발현의 감소 및 pCaMKII의 감소된 수준을 생성시킴을 발견하였다(도 2A 내지 B 및 10). CaMKII의 전체 수준은 영향을 받지 않은 채로 있었다(도 2A 내지 B 및 10). TRPC6 또는 Orai2 녹다운에 따른 pCAMKII 및 PSD95 수준의 감소는 선행 연구에서 nSOC 억제제의 적용 또는 STIM2 감소에 의해 유도된 변화와 일치한다(Sun et al., 2014).

nSOC 활성을 보다 직접적으로 평가하기 위해서, 발명자들은 일련의 Ca²⁺ 영상화 실험을 수행하였다. Fura-2 영상화 실험에서, 발명자들은 TRPC6 또는 Oria2의 녹다운이 체세포에서 nSOC 피크를 감소시킴을 발견하였다(도 11A 내지 B). 상기 가시 중의 Ca²⁺ 영상화를 수행하기 위해서, 발명자들은 해마 뉴런을 GCamp5.3 플라스미드로 형질감염시켜 우리로 하여금 동시에 수상돌기 가시를 가시화하고 국소 Ca²⁺ 신호를 측정할 수 있게 하였다(Sun et al., 2014). 이들 실험에서, 발명자들은 TRPC6 또는 Orai2의 녹다운이 시냅스 nSOC의 극적인 감소를 생성시킴을 발견하였다(도 2C 내지 D). 중요하게, STIM2의 과발현은 TRPC6 또는 Orai2의 녹다운에 따른 시냅스 nSOC의 구제에 실패하였다(도 2C 내지 D). 이러한 데이터는 상기 가시 중의 STIM2-관문 nSOC 채널의 기능이 TRPC6 및 Orai2 단백질 모두의 존재를 필요로 한다는 가설을 지지하였다(도 1E, 패널 2).

선행 연구에서, 발명자들은 해마 버섯 가시의 유지가 시냅스 nSOC 활성을 요구함을 입증하였다(Sun et al., 2014). TRPC6 및 Orai2의 녹다운에 따른 시냅스 가시의 형태를 평가하기 위해서, 발명자들은 해마 배양물을 TD-토마토 플라스미드로 형질감염시키고, 상기 세포를 고정시키고 각 실험 그룹에 대한 공초점 영상화 실험을 수행하였다(도 2E). 가시 모양의 자동화된 분석은 버섯 가시의 분획이 TRPC6 또는 Orai2 단백질의 녹다운에 따라 현저하게 감소함을 밝혀내었다(도 2E 내지 F). nSOC Ca²⁺ 영상화 실험과 유사하게, STIM2의 과발현은 TRPC6 또는 Orai2 녹다운에 따른 버섯 가시의 안정화에 실패하였다(도 2E 내지 F). 이들 데이터는 STIM2-TRPC6/Orai2 채널 복합체가 해마 버섯 시냅스 가시의 유지에 필요하다는 가설을 지지한다.

선행 간행물(Sun et al., 2014)에서, 발명자들은 STIM2의 과발현이 가족성 AD의 PS1KI 마우스 모델로부터의 해마 뉴런 중의 시냅스 nSOC 및 버섯 가시 결함을 구제할 수 있음을 입증하였다. 이들은 현행 실험에서 상기 결과를 복제할 수 있었다(도 2G 내지 J). 그러나, STIM2의 발현은 TRPC6 또는 Orai2의 녹다운에 따른 PS1-KI 뉴런 중의 시냅스 nSOC 또는 버섯 가시의 구제에 실패하였다(도 2G 내지 J). 이들 결과는 해마 버섯 가시에서 STIM2-관문 nSOC를 매개함에 있어서 TRPC6 및 Orai2 채널의 핵심적인 역할을 추가로 지지하였다.

해마 가시 nSOC의 성분으로서 TRPC6 및 Orai2의 독특한 기능적 역할.

선행 연구에서, 발명자들은 STIM2 과발현이 가족성 AD의 PS1KI 및 APPKI 마우스 모델에서 nSOC 및 버섯 가시 결함을 구제함을 입증하였다(Sun et al., 2014 and Zhang et al., 2015). 발명자들은 TRPC6 및 Orai2 과발현의 효과를 평가하기 위해서 유사한 접근법을 사용하였다. 이들은 TRPC6의 과발현이 또한 PS1KI 및 APPKI 해마 뉴런 중의 가시 nSOC(도 3A 내지 B) 및 버섯 가시 손실(도 3C 내지 D)을 구제함을 판정하였다. 대조적으로, Orai2의 과발현은 PS1KI 및 APPKI 해마 뉴런에서 가시 nSOC를 구제하지 못했다(도 3A 내지 B). 실제로, Orai2의 과발현은 야생형 뉴런에서조차 가시 nSOC 반응을 현저하게 손상시켰다(도 3A 내지 B). Orai2-형질감염된 뉴런 중의 가시 형태의 분석은, 상기 그룹의 뉴런의 약 30%가 이상 수상돌기 형태를 나타내고 시냅스 가시를 상기 세포에서 명확하게 확인할 수 없기 때문에 수행되지 않았다(데이터 도시 안 됨). 이들 결과로부터, 발명자들은 과발현된 Orai2가 STIM2와 높은 친화성으로 결합하지만 화학량론적 양의 TRPC6 및/또는 STIM2의 부재하에서 기능성 Ca²⁺ 유입 채널을 제공하지 못한다는 결론을 내렸다. 이러한 발견과 일관되게, Orai1 또는 Orai2의 과발현은 HEK293 세포에서 STIM1을 포집함으로써 SOCE를 억제함이 보고되었다(Mercer et al., 2006 and Hoover et al., 2011). 대조적으로, TRPC6의 과발현은 STIM2의 과발현과 유사한 결과를 생성시켜, PS1KI 및 APPKI 해마 뉴런에서 nSOC 및 버섯 가시의 구제를 도출하였다(도 3A 내지 D). 이들 결과는 TRPC6이 nSOC 경로에 대한 주요 C²⁺ 유입 공급원임을 암시한다. 이러한 결과는 모두 상기 가시 중의 적합하게 조절된 nSOC 채널이 정확한 화학량론으로 조립된 STIM2-Orai2/TRPC6 복합체에 의해 형성된다는 모델(도 1E, 패널 2)과 일치한다.

상기 가설을 추가로 시험하기 위해서, 발명자들은 STIM2 및 STIM2-LASS 돌연변이체 과발현의 효과를 비교하였다. 선행 연구(Sun et al., 2014 and Zhang et al., 2015)와 일치하게, STIM2의 발현은 PS1KI 및 APPKI 해마 뉴런에서 가시 nSOC(도 3A 내지 B) 및 버섯 가시 손실(도 3C 내지 D)을 구제하였다. 대조적으로, STIM2-LASS 돌연변이체의 발현은 PS1KI 및 APPKI 해마 뉴런에서 가시 nSOC(도 3A 내지 B) 및 버섯 가시 손실(도 3C 내지 D)을 구제하지 못하였다. 실제로, STIM2-LASS 돌연변이체의 발현은 야생형 뉴런에서 가시 nSOC에 대해 우성-음성 효과를 발휘하였으며(도 3A 내지 B) 이들 뉴런에서 버섯 가시 손실을 생성시켰다(도 3C 내지 D). 이러한 결과를 설명하기 위해서, 발명자들은 STIM2-LASS 돌연변이체가 Orai2에 결합하지 않고 대신에 비-기능성 복합체 중의 TRPC6을 포집함을 판정하였다(도 1E, 패널 4). 이러한 결과로부터, 발명자들은 TRPC6가 시냅스 가시에서 주요 Ca²⁺ 유입 채널이고 Orai2는 저장소 고갈-의존적인 방식으로 STIM2에 의해 통문되는 복합체의 조절 서브유닛이라는 결론을 내렸다. 유사한 모델이 앞서 비-흥분성 세포에서 STIM1-TRPC3/6-Orai1 복합체에 대해 제안되었다(Liao et al., 2007 and Jardin et al., 2009).

NSN21778 및 하이퍼포린은 가시 nSOC 채널을 활성화한다.

유전적 구제 실험(Sun et al., 2014 and Zhang et al., 2015)(도 3A 내지 B)은 상기 가시 중 TRCP6/Orai2 nSOC 채널의 약물학적 활성화제가 버섯 가시 손실을 방지하는데 일조할 수 있으며 AD에 대한 치료학적 가능성을 가짐을 암시한다. 하이퍼포린(Hyp)은 TRPC6의 공지된 활성화제이다(Leuner et al., 2007)(도 4A). 발명자의 실험은 최근에 신규의 nSOC 활성화제 NSN21778(NSN, 분자량 321)을 동정하였다(도 4A). 상기 화합물은 선행 연구(Wu et al., 2011)에서 신규의 nSOC 억제제 분석 과정에서 우연히 발견되었다. Ca²⁺ 영상화 실험에서, 발명자들은 Ca²⁺ 재-첨가 전에 300 nM Hyp 또는 NSN의 적용이 PS1KI 및 APPKI 해마 뉴런 중 가시 nSOC를 구제함을 발견하였다(도 4B 내지 C). 흥미롭게, 상기 두 화합물은 모두 야생형 가시 중 nSOC에 대해 그다지 영향을 미치지 않았으며(도 4A 내지 B), 이는 상기 가시 nSOC 경로가 통상적인 조건하에서 이미 최대로 활성화됨을 암시한다. 추가의 실험에서, 발명자들은 TD 토마토-형질감염된 해마 뉴런 배양물을 16시간 동안 30 nM 농도의 Hyp 또는 NSN과 배양하였으며 공초점 영상화에 의한 가시 모양의 분석을 수행하였다(도 4D). 발명자들은 Hyp 또는 NSN과의 배양이 PS1KI 및 APPKI 뉴런 모두에서 버섯 가시의 완전한 구제를 생성시킴을 발견하였다(도 4D 내지 E). 상기 두 화합물은 모두 야생형 뉴런 중의 버섯 가시의 분획에 대해서 그다지 영향을 미치지 않았다(도 4D 내지 E). 추가적인 실험에서, 발명자들은 300 nM의 Hyp 또는 NSN에 의한 4시간 처리가 PS1KI 및 APPKI 해마 뉴런에서 버섯 가시에 대해 유사한 구제 효과를 발휘함을 입증하였다(데이터 도시 안 됨).

Hyp 및 NSN 화합물에 대한 표적을 확인하기 위해서, 발명자들은 HEK293 세포에서 TRPC6을 과발현시키고 일련의 Fura-2 Ca²⁺ 영상화 실험을 수행하였다. 공개된 보고서와 일관되게(Leuner et al., 2007), 1 μM Hyp의 적용은 TRPC6-형질감염된 HEK293 세포에서 Ca²⁺ 유입을 활성화시켰지만 EGFP 플라스미드로 형질감염된 대조용 세포에서는 그렇지 않았다(도 5A 및 5C). Hyp와 대조적으로, 1 μM NSN의 적용은 TRPC6-형질감염된 세포에서 Ca²⁺ 유입을 촉발하지 않았다(도 5A 및 5C). 추가적인 실험에서, 발명자들은 다른 TRPC(TRPC1-7), Orai(Orai1-3), 또는 TRPC6와 Orai2의 조합으로 형질감염된 HEK293 세포에 의한 실험에서 1 μM NSN 화합물의 효과를 평가하였다. 그러나, NSN 화합물은 이들 실험 중 어느 실험에서도 Ca²⁺ 유입을 유도하지 못했다(데이터 도시 안 됨). 이들 실험으로부터, 발명자들은 Hyp가 TRPC6 채널의 직접적인 활성제로서 작용하지만 NSN 화합물의 작용은 보다 복잡하다는 결론을 내렸다. 추가의 실험에서, 발명자들은 저장소 고갈 조건에서 SOC를 측정하였다. 이를 성취하기 위해서, HEK239 세포를 1 μM Tg를 함유하는 무-Ca²⁺ 배지에서 예비배양하였다. 이들 실험에서, 발명자들은 EGFP-형질감염된 세포에서 내인성 SOC 반응을 관찰하였으며, 이는 TRPC6-형질감염된 세포에서 더욱 증대되었다. 그러나, NSN 화합물의 적용은 이러한 조건에서 GFP 또는 TRPC6 세포에서 SOC에 대한 추가적인 영향을 미치지 않았다(데이터 도시 안 됨). TRPC6 채널은 DAG에 의해 활성화되는 것으로 공지되어 있다(Estacion et al., 2004). 가시 nSOC 측정에서, 확고한 Ca²⁺ 반응을 생성시키기 위해서 100 μM DHPG의 첨가가 요구되었다. 따라서, 다음 일련의 실험에서, 발명자들은 DAG의 안정한 합성 유사체, OAG의 효과를 평가하였다. 표준 기록 조건에서, TRPC6-형질감염된 세포에 대한 100 μM OAG의 적용은 매우 가변적인 반응을 생성시켰으며, 이때 상기 세포의 일부 배치는 강한 Ca²⁺ 유입을 나타내었고 일부 배치는 무응답성이었다(데이터 도시 안 됨). 그러나, 발명자들은 100 μM OAG가, 저장소가 0.1 mM Ca²⁺를 함유하는 세포외 배지에서 세포의 예비배양에 의해 부분적으로 고갈될 때 더 일치하는 반응을 생성시킬 수 있음을 발견하였다(도 5B 내지 C). 상기 OAG의 효과는 TRPC6-형질감염된 세포에서 관찰되었으나, 대조용 EGFP-형질감염된 세포에서는 관찰되지 않았다(도 5B 내지 C). 흥미롭게, 유사한 부분 저장소-고갈 프로토콜이 STIM2의 클로닝을 보고하는 논문에서 사용되었으며(Brandman et al., 2007), 이는 STIM2-의존성 Ca²⁺ 유입 경로가 상기와 같은 조건에서 중요함을 암시한다. 1 μM NSN과의 예비배양은 TRPC6-형질감염된 세포에서 상기 조건에서의 OAG-유발된 반응의 현저한 강화를 생성시켰지만, 대조용 GFP 세포에서는 그렇지 않았다(도 5B 내지 C). 이러한 결과로부터, 발명자들은 NSN 화합물이 뉴런 중 TRPC6 채널에 대한 내인성 DAG의 효과를 강화시킴으로써 작용하는 듯하다는 결론을 내렸다.

상기 가시 중 Hyp 및 NSN 화합물에 대한 표적을 확인하기 위해서, 발명자들은 야생형 및 TRPC6 또는 Orai2에 대한 렌티-RNAi로 감염된 PS1KI 해마 뉴런으로 실험을 수행하였다. 이들 배양물을 TD 토마토로 형질감염시키고, 16시간 동안 30 nM의 Hyp 또는 NSN과 배양하고 공초점 현미경검사에 의해 분석하였다(도 5A 내지 B). TRPC6 또는 Orai2의 녹다운은 이들 실험에서 야생형 뉴런 중의 버섯 가시의 손실을 생성시켰다(도 2E 내지 F 및 5A 내지 B). 30 nM Hyp 또는 NSN과의 배양은 상기 표현형을 구제하지 못했다(도 5A 내지 B). 30 nM Hyp 또는 NSN과의 배양은 대조용 RNAi 렌티바이러스로 감염된 PS1KI 배양물에서 버섯 가시 손실을 구제하였으나, TRPC6 또는 Orai2의 녹다운에 이은 PS1KI 해마 뉴런 중 버섯 가시 손실은 구제하지 못했다(도 5A 내지 B). 상기 획득된 결과는 하이퍼포린 및 NSN이 상기 가시 중의 TRPC6/Orai2 채널 복합체를 활성화시킴으로써 AD 뉴런 중의 시냅스 nSOC 및 버섯 가시를 구제한다는 가설과 일치한다. AD 마우스 모델에서 하이퍼포린 및 그의 유도체의 효과는 앞서 기재되었으며(논의 참조), 발명자들은 연구의 나머지로 NSN 화합물의 분석에 집중하였다.

NSN21778은 AD 마우스 모델로부터의 해마 조각에서 시냅스 가시 및 가소성 결함을 구제한다.

NSN 화합물의 시냅스 효과를 추가로 평가하기 위해서, 발명자들은 해마 조각으로 일련의 실험을 수행하였다. 상기 분석을 간단히 하기 위해서, 발명자들은 M 계통 GFP 마우스(Feng et al., 2000)를 PS1KI 및 APPKI 마우스와 교배시켜 PS1KIGFP 및 APPKIGFP 마우스를 제공하였다. 해마 조각을 6개월 된 M 계통 GFP 마우스(WTGFP), PS1KIGFP 및 APPKIGFP 마우스로부터 제조하였다. 상기 조각을 3.5시간 동안 300 nM NSN으로 처리하고, 고정시키고 2-광자 영상화에 의해 분석하였다(도 6A). 선행 연구(Sun et al., 2014 and Zhang et al., 2015)와 일관되게, 가시 모양 분석은 WTGFP 마우스에 비해 6개월 된 PS1KIGFP 및 APPKIGFP 마우스의 버섯 가시의 현저한 손실을 밝혀내었다(도 6A 내지 B). 300 nM NSN 처리는 WTGFP 마우스에서 버섯 가시에 대해 영향이 없었으나, PS1KIGFP 및 APPKIGFP 해마 조각 중의 버섯 가시의 완전한 구제를 생성시켰다(도 6A 내지 B). PS1KI 마우스는 E-LTP 결함을 나타내지 않으며(Chakroborty et al., 2009 and Oddo et al., 2003), 오직 L-LTP 표현형만이 상기 마우스에 대해 보고되었다(Auffret et al., 2010 and Zhang et al., 2015). APPKI 마우스는 최근에 생성되었으며(Saito et al., 2014) 지금까지 이들 마우스에 의한 LTP 연구는 수행되지 않았다. 이들 연구에서, 발명자들은 2열의 고주파 자극(HFS)이 6개월 된 야생형 및 APPKI 해마 조각에서 유사한 시냅스 강화를 유발할 수 있음을 발견하였다(도 6C 내지 D). 그러나, 상기 강화는 APPKI 해마조각에서 지속되지 않았다(도 6C 내지 D). 평균적으로, APPKI 조각의 경우 fEPSP의 기울기가 60분 이내에 자극-전 수준으로 다시 떨어졌다(도 6C 내지 6E). 대조적으로, 상기 fEPSP의 기울기는 야생형 조각의 경우 상승된 채로 머물렀으며, 이때 60분 시점에서 175%의 평균 증가를 갖는다(도 6C 내지 6E). 이러한 결과는 APPKI 마우스가 6월령에서 확고한 LTP 결함을 나타냄을 암시하였으며, 이는 앞서 기재된 해마 LTP에 대한 Aβ42 효과로부터 예상될 수 있었다(Chapman et al., 1999; Shankar et al., 2007; Shankar et al., 2008 and Walsh et al., 2002). 2 내지 3시간 동안 300 nM NSN 화합물에 의한 해마 조각의 전-처리는 야생형 조각에서 LTP에 대해 그다지 영향을 미치지 않았지만, APPKI 조각에서는 LTP 결함을 완전히 구제하였다(도 6C 내지 6E). 이들 실험으로부터, 발명자들은 상기 NSN 화합물에 의한 가시 nSOC 경로의 활성화가 APPKI 해마 뉴런에서 시냅스 가소성 결함을 구제할 수 있다는 결론을 내렸다.

NSN21778은 생체내에서 AD 마우스 모델 중의 버섯 가시 및 기억력 결함을 구제한다.

NSN 화합물이 생체내에서 이로운 효과를 발휘할 수 있는지를 판정하기 위해서, 발명자들은 상기 화합물의 파일럿 대사 안정성 연구를 수행하였다. 이들은 NSN 화합물이 일반적으로 I 단계 보조인자(NADPH 재생 시스템을 포함하며 상업적인 CD-1 마우스 혈장 중에서 안정하다)의 존재하에서 상업적인 간 S9 분획 중에서 안정함을 발견하였다(도 12A 내지 B). NSN21778 10 ㎎/㎏의 i.p. 주사에 이어서, 상기 화합물은 혈장 중에서 알맞은 수준에 도달하였지만 뇌 침투는 불충분하였다(도 12C). 그럼에도 불구하고 NSN 화합물은 가시 구제 실험에서 나노몰 농도로 유효하였기 때문에(도 4A 내지 D 및 5A 내지 B), 발명자들은 전체 동물 연구를 개시하였다. 이들 실험에서 NSN 화합물을 4월령에 시작하여 WTGFP, PS1KIGFP 및 APPKIGFP 마우스에서 10 ㎎/㎏ 농도로 주당 3회 i.p. 주사하였다. 발명자들은 주사된 마우스에서 어떠한 명백한 독성도 관찰하지 못하였으나, 10주 처리에 이어서 NSN-주사된 마우스에서 약간의 체중 손실이 있었다(데이터 도시 안 됨). 상기 체중 손실은 장 운동을 촉진할 수 있는 장 평활근 중 TRPC6 채널의 활성화로부터 생성될 수 있다(Tsvilovskyy et al., 2009). 상기 마우스를 6.5월령에서 죽이고 가시 모양 분석을 해마 절편의 공초점 영상화에 의해 수행하였다(도 7A). 선행 연구(Sun et al., 2014 and Zhang et al., 2015)와 일관되게, 발명자들은 WTGFP 마우스에 비해 대조용 PS1KIGFP 및 APPKIGFP 마우스의 버섯 가시의 현저한 손실을 관찰하였다(도 7A 내지 B). NSN 화합물의 주사는 WTGFP 마우스에서 버섯 가시에 대해 영향이 없었으나, PS1KIGFP 및 APPKIGFP 마우스에서 버섯 가시 결함의 구제를 생성시켰다(도 7A 내지 B). 이러한 결과는 AAV1-STIM2 바이러스의 해마 주사에 이은 PS1KI 및 APPKI 마우스에서의 버섯 가시의 생체내 구제에 필적한다(Sun et al., 2014 and Zhang et al., 2015). 따라서, 발명자들은 시냅스 nSOC를 활성화시키고 버섯 가시를 안정화시키기에 충분한 i.p. 주사에 따른 상기 마우스 뇌에의 NSN 침투가 존재한다는 결론을 내렸다. 한편으로, NSN의 약간 변형되었지만 여전히 활성인 대사산물(LC-MS/MS 분석에 의해 검출되지 않았다)은 보다 고 농도로 상기 뇌에 침투할 수 있으며 상기 활성에 기여할 수 있다.

아밀로이드 반의 축적은 AD 병리의 특징이다.

상기 APPKI 마우스는 12월령 부근에서 아밀로이드 반을 축적하기 시작한다(Saito et al., 2014). 아밀로이드 축적에 대한 NSN 화합물의 효과를 연구하기 위해서, 발명자들은 11개월 된 APPKI 마우스에게 NSN 화합물 10 ㎎/㎏을 주사하였다. 상기 i.p. 주사를 8주 동안 주당 3회 수행하였으며, 상기 마우스를 13월령째에 죽였다. 공개된 관찰(Saito et al., 2014)과 일관되게, 면역염색은 APPKI 마우스의 피질 중 아밀로이드 반의 축적을 밝혀내었다(도 7C). 상기 반은 NSN 화합물이 주사된 마우스의 그룹에서 감소되었다(도 7C). 상기 반 로드의 정량분석은 NSN-처리된 마우스 중의 전체 반 면적 및 반 강도의 현저한 감소를 밝혀내었다(도 7D 내지 E).

PS1KI 마우스의 행동상 표현형은 매우 미묘하다(Wang et al., 2004 and Sun et al., 2005). APPKI 마우스는 18월령째에 Y-미로 분석에서 단지 약간의 손상만을 나타내는 것으로 보고되었다(Saito et al., 2014]. 그러나, 마우스를 주사를 위해 다루는 동안, 발명자들은 4주 주사 후에 모든 마우스가 APPKIGFP 마우스의 대조용 그룹을 제외하고, 고통스러운 주사에 앞서 두려움 기억-관련된 불안한 행동을 나타내기 시작함을 알아챘다. 상기 마우스 그룹에서 기억 기능을 정식으로 시험하기 위해서, 발명자들은 일련의 전후관계상 두려움 조절 실험을 수행하였다. 이들은 실제로 6.5개월 된 APPKIGFP 마우스가 나이-합치된 WTGFP 마우스에 비해 전후관계상 두려움 조절 반응에서 상당한 장애를 가짐을 발견하였다(도 7F). 상기 APPKIGFP 마우스의 두려움 조절 표현형은 NSN 화합물에 의한 i.p. 주사에 의해 완전히 구제되었다(도 7F). WTGFP 마우스의 경우, NSN 화합물에 의한 주사는 다소 손상된 반응을 생성시켰지만, 대조용 그룹과 통계학적 유의수준 차이에는 도달하지 못했다(도 7F). 전후관계상 두려움 조절 외에, 발명자들은 또한 인지 검사 실험을 수행하였다. 상기 전후관계상 두려움 조절 시험에서와 유사한 행동 패턴이 4개의 마우스 그룹 전부에 대해 관찰되었으나, 각 그룹내 데이터의 큰 가변성으로 인해 상기 그룹들간의 차이는 유의수준에 도달하지 못했다(데이터 도시 안 됨).

실시예 3 - 논의

TRPC6 및 Orai2는 해마 버섯 가시 중에 STIM2-조절된 nSOC 채널을 형성시킨다.

선행 연구에서, 발명자들은 버섯 가시 중 STIM2-매개된 nSOC가 이들 가시의 안정성에 중요함을 입증하였다(Sun et al., 2014). 이들은 추가로 nSOC-매개된 Ca²⁺ 유입이 시냅스 CaMKII의 구성적 활성화(버섯 가시의 안정화에 필요하다)를 일으킨다는 결론을 내렸다(Sun et al., 2014). 중요하게, 발명자들은 STIM2-nSOC-CaMKII 경로가 PS1KI 뉴런, APPKI 뉴런, 노화 뉴런 및 산발성 AD 뇌에서 STIM2 단백질의 하향조절로 인해 손상됨을 입증하였다(Sun et al., 2014 and Zhang et al., 2015). 본 연구에서, 발명자들은 해마 가시 중 STIM2-관문 nSOC 채널의 분자 정체를 측정하였다. 후보 접근법으로 출발하여, 발명자들은 TRPC6 및 Orai2 채널을 STIM2-관문 nSOC의 핵심 성분으로서 확인하였다. 발명자들은 TRPC6 및 Orai2가 해마 중에 농축되어 있고(도 8 내지 9) 서로 및 STIM2와 생화학적으로 회합함을 입증하였다(도 1A 내지 E). 더욱이, TRPC6 또는 Orai2의 RNAi-매개된 녹다운은 시냅스 nSOC를 억제하고 해마 뉴런 중 버섯 가시의 손실을 야기하엿다(도 2A 내지 J). 이러한 결과는 TRPC6/Orai2가 상기 버섯 시냅스 가시에서 기능성 복합체를 형성한다는 가설과 일치한다(도 7G). 앞서 공개된 보고서는 nSOC의 지지에서 TRPC6 및 Orai2 채널의 잠재적인 역할을 지지한다. 뉴런 발현 패턴을 근거로, 앞서 Orai2가 nSOC의 지지에 중요한 역할을 할 수 있음이 가정되었지만(Hoth et al., 2013 and Majewski et al., 2015), 이러한 결과가 있기까지 상기 주장을 지지하는 직접적인 실험적 증거는 없었다. TRPC6은 앞서 가시 형태 및 신경돌기 성장에 중요한 것으로 제시되었다(Zhou et al., 2008 and Heiser et al., 2013). TRPC6 트랜스제닉 마우스는 모리스 수 미로에서 공간적 학습 및 기억, 및 가시 형성의 증대를 보였다(Zhou et al., 2008). TRPC6은 일부 연구에서 SOC에 관련되었지만, 상기 채널은 주로 디아실 글리세롤(DAG)에 의해 직접 활성화될 수 있는 수용체-작동된 채널(ROC)인 것으로 여겨진다(Sun et al., 2014 and Cheng et al., 2013). 이러한 실험에서, 발명자들은 확고한 가시 nSOC 측정이 C²⁺ 보충에 앞서 100 μM DHPG의 적용을 필요로 함을 발견하였다. 흥미롭게, DHPG의 효과는 합성 DAG 유사체 OAG에 의해 모방되지 않았으며 해마 뉴런 배양물에 대한 OAG의 직접적인 적용은 단지 몇 개의 가시에서 Ca²⁺ 반응을 유발하였다(데이터 도시 안 됨). 이러한 결과로부터, 발명자들은 상기 가시 중 TRPC6 채널의 활성화가 국소 Ca²⁺ 저장소의 고갈을 필요로 하며 이는 DAG 단독에 의해서는 성취될 수 없다는 결론을 내렸다. 유사한 결론이 STIM2-LASS 돌연변이체에 의한 실험을 근거로 도달된다. 상기 돌연변이체(Orai2와 상호작용할 수 없다)의 발현은 야생형 뉴런에서 가시 nSOC에 대해 우성 음성 효과를 발휘하였다(도 3A 내지 B). 뉴런 시냅스 활성 동안, 상기 가시 중 mGluR 수용체의 활성화는 PLC의 활성화, PIP₂의 붕괴, DAG 및 InsP₃의 생성 및 상기 가시 중 ER 저장소로부터 InsP₃R1-매개된 Ca²⁺ 방출과 결부된다. 이러한 결과는 상기 가시 중 TRPC6/Orai2 채널 복합체의 활성화가 주로 국소 ER Ca²⁺ 저장소 고갈의 결과로서 발생하고 STIM2에 의해 매개됨을 암시한다(도 7G). DAG의 국소 생성은 또한 상기 가시 중 TRPC6/Orai2 채널의 활성화에 기여할 수 있지만, 상기 결과를 근거로 저장소 고갈 없이 상기를 활성화시키기에 충분하지 않다. 획득된 결과를 근거로, 발명자들은 TRPC6 채널이 상기 가시 중 Ca²⁺ 유입을 매개하고 Orai2가 STIM2와의 직접적인 상호작용에 의해 ER Ca²⁺ 민감성을 부여한다는 결론을 내렸다(도 7G). 따라서, TRPC6 및 Orai2가 모두 시냅스 가시 중 nSOC의 저장소 고갈-매개된 활성화에 필요하다. 앞서 비-흥분성 세포에서 STIM1-TRPC3/6-Orai1 복합체에 대해 유사한 모델이 제안되었다(Liao et al., 2007 and Jardin et al., 2009).

TRPC6/Orai2 nSOC 채널 복합체는 AD에 대한 신규의 치료 표적이다.

이러한 결과는 상기 가시 중 STIM2-관문 TRPC6/Orai2 nSOC 채널이 AD 및 나이-관련된 기억력 상실에 유망한 치료 표적임을 추가로 암시한다. 선행 연구에서, 발명자들은 STIM2 과발현이 가족성 AD의 PS1KI 및 APPKI 마우스 모델에서 nSOC 및 버섯 가시 결함을 구제함을 입증하였다(Sun et al., 2014 and Zhang et al., 2015). 본 원고에서, 발명자들은 TRPC6의 과발현이 또한 PS1KI 및 APPKI 마우스 모델에서 nSOC 및 버섯 가시 결함을 구제함을 입증하였다(도 3A 내지 B). 더욱이, 발명자들은 공지된 TRPC6 활성제 하이퍼포린 및 신규의 nSOC 활성제 NSN21778이 또한 PS1KI 및 APPKI 마우스 모델에서 nSOC 및 버섯 가시 결함을 구제함을 입증하였다(도 4A 내지 D). 선행 연구에서 하이퍼포린 및 그의 유도체는 AβPPSwe/PSEN1ΔE9(AβPP/PS1) 트랜스제닉 마우스에서 베타-아밀로이드 신경독성 및 공간 기억력 장애를 방지할 수 있음이 입증되었다(Inestrosa et al., 2011; Cerpa et al., 2010 and Dinamarca et al., 2006). 이들 실험에서 하이퍼포린 작용의 기전은 명확하지 않았다. 하이퍼포린은 이들 실험에서 아세틸콜린에스테라제 활성에 영향을 미치고, Aβ 침착물을 감소시키고, 미토콘드리아 기능 및 신경발생을 촉진함으로써 그의 이로운 효과를 발휘하는 것으로 제시되었다(Zolezzi et al., 2013; Carvajal et al., 2013; Abbott et al., 2013; Inestrosa et al., 2011; Cerpa et al., 2010 and Dinamarca et al., 2006). 그러나, 최근의 연구에서, 하이퍼포린 유도체 테트라하이드로하이퍼포린(IDN5706)은 뉴런 중 TRPC3/6/7 채널을 활성화시킴으로써 Aβ-유발된 시냅스 가소성 결함을 구제하는 것으로 제시되었다(Montecinos-Oliva et al., 2014). 또한 최근에 하이퍼포린은 TRPC6 채널의 활성화를 통해 해마 조각 배양물 중의 수상돌기 가시 형태를 조절할 수 있음이 보고되었다(Leuner et al., 2013). 하이퍼포린에 대한 발명자들의 결과(도 4A 내지 D)는 하이퍼포린 및 그의 유도체가 버섯 시냅스 가시 중 TRPC6-매개된 nSOC 자극에 의해 AD 모델에서 이로운 효과를 발휘한다는 결론과 일치한다.

발명자들은 하이퍼포린 및 NSN 화합물이, TRPC6 또는 Orai2의 녹다운이 가시 구제 분석에서 상기 화합물을 무효로 만들기 때문에, Trpc6/Orai2 채널 복합체상에서 작용함을 확립시켰다(도 5A 내지 E). 그러나, 이들 두 화합물에 대한 작용 기전은 상이하다. 하이퍼포린은 HEK293 세포에서 발현된 TRPC6 채널을 표준 기록 조건에서 직접 활성화시킬 수 있었다(도 5A 내지 E). 대조적으로, 상기 NSN 화합물은 이들 실험에서 효과가 없지만, 부분적으로 고갈된 세포내 저장소의 조건에서 TRPC6 채널을 통해 OAG-유도된 Ca²⁺ 유입을 촉진할 수 있었다(도 5A 내지 E). 이러한 결과는 하이퍼포린이 TRPC6의 직접적인 활성제로서 작용하지만 NSN 화합물은 TRPC6의 양성 조절제로서 작용함을 암시하였다(도 5A 내지 E 및 도 7G). NSN 화합물에 대한 정확한 작용 기전은 추가의 조사를 필요로 할 것이나, 생리학적 조건에서 내인성 가시 nSOC 채널의 양성 조절제로서 작용하는 상기 화합물의 능력은 AD에서 치료 용도에 대한 추가적인 이점을 제공할 수 있다. 실제로, 1차 해마 배양 실험에서, 발명자들은 10 μM 하이퍼포린에 의한 처리에 따른 매우 큰 Ca²⁺ 상승 및 독성을 관찰하였으며, 이는 nSOC 경로의 과도한 활성화를 암시한다. 이들은 또한 300 nM의 하이퍼포린으로 밤새 처리된 해마 배양물의 일부 배치에서 뉴런 독성을 관찰하였다(데이터 도시 안 됨). 대조적으로, 발명자들은 10 μM의 NSN 화합물에 의한 실제 실험에서 또는 300 nM의 NSN 화합물과의 밤새 배양에 이어서 임의의 독성을 관찰하지 못했다. 이러한 결과는 NSN 화합물이 TRPC6의 직접적인 활성제, 예를 들어 하이퍼포린 및 그의 유도체보다 더 넓은 치료창을 가질 수 있음을 암시한다. 발명자들은 그들의 실험에서 NSN 화합물이 PS1KI 및 APPKI 마우스 모델로부터의 해마 배양물 및 조각에서 버섯 가시 손실을 구제할 수 있고(도 4D 내지 E 및 6A 내지 B) APPKI 마우스에서 해마 LTP 결함을 구제할 수 있음(도 6C 내지 E)을 입증하였다. 더욱이, NSN 화합물은 i.p. 주사에 의해 전달시 PS1KI 및 APPKI 마우스에서 버섯 가시 손실을 구제하였다(도 7A 내지 B). NSN 화합물은 또한 i.p. 주사에 의해 전달시 노화 APPKI 마우스에서 아밀로이드 로드를 감소시켰다(도 7C 내지 E). nSOC는 Aβ 생성의 음성 조절제로서 작용하는 것으로 보고되었으며(Zeiger et al., 2013), 이는 APPKI 마우스에서 아밀로이드 로드를 감소시키는 NSN 화합물의 능력을 설명할 수 있다. 중요하게, 발명자들은 NSN 화합물의 i.p. 주사가 전후관계상 두려움 조절 시험에서 APPKI 마우스 기억력 결함을 구제할 수 있음을 입증하였다(도 7F). 획득된 결과를 근거로(도 4A 내지 7G), 발명자들은 NSN21778이 뇌 노화 및 AD에서 치료학적 중재에 유망한 후보 분자라는 결론을 내렸다.

본 명세서에 개시되고 청구된 조성물 및 방법은 모두 본 명세에 비추어 과도한 실험 없이 제조되고 실행될 수 있다. 상기 명세의 조성물 및 방법을 바람직한 실시태양에 관하여 기재하였지만, 상기 명세의 개념, 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법 및 단계들 또는 단계들의 순서에 변화를 적용할 수 있음은 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 관련된 몇몇 작용제들이 동일하거나 유사한 결과를 성취하면서 본 명세서에 기재된 작용제들을 대체할 수 있음은 자명할 것이다. 당해 분야의 숙련가들에게 자명한 모든 상기와 같은 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 한정되는 바와 같은 상기 명세의 진의, 범위 및 개념내에 있는 것으로 여겨진다.

VI. 참고문헌

하기의 참고문헌들은, 예시적인 과정 또는 본 명세서에 제시된 것들에 보충적인 다른 세부사항들을 제공하는 정도로, 본 명세서에 특별히 참고로 인용된다.

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SEQUENCE LISTING <110> The Board of Regents of The University of Texas System <120> ACTIVATION OF NEURONAL STORE-OPERATED CALCIUM ENTRY PATHWAY FOR THE TREATMENT OF ALZHEIMER'S DISEASE <130> IPA171301-US <140> PCT/US2016/030704 <141> 2016-05-04 <150> US 62/159,083 <151> 2015-05-08 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 1 accgcagcta ggaataatgg a 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 2 gcctcagttc cgaaaacca 19 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 3 tgaacttagt gctgacttaa aggaac 26 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 4 acgaaaggag cctgagttta ag 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 5 ttaattatgg tctgggttct tgg 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 6 aaggaagcca gaaagcttcg 20 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 7 gcctgataca aaatcaacat tatca 25 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 8 gcagctgttc aggatgaaaa c 21 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 9 cctgcgtatt ctactctcga tg 22 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 10 tacttaagcc gcgccaag 18 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 11 gggaggagaa gatgacctct g 21 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 12 cacatctgct ctgctgtcg 19 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 13 cgggctagct cttcataatc a 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 14 ccagcaactc gaagccatag 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 15 tccacaactg cacgatgtac t 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 16 ccaggttcct catcacctct 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 17 gcccctcatt tgttttgga 19 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 18 ttcagcccat atcatgccta 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 19 cgttgaacat gtaggcagga 20 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 20 acttccacca tcgctacca 19 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 21 gccttgaacc cctgatcc 18 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 22 ggtgggtatt catgatcgtt ct 22

Claims

알쯔하이머병이 있는 포유동물 대상체에게 하기 화학식 I으로 정의되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 투여함을 포함하는, 상기 대상체의 치료 방법:
[화학식 I]

상기 식에서,
각각의 R₁은 아미노, 시아노, 카복실, 할로, 하이드록시 또는 니트로; 또는 알킬아미노_(C≤8), 디알킬아미노_(C≤8), 사이클로알킬아미노_(C≤8), 디사이클로알킬아미노_(C≤8) 또는 이들 기 중 어느 하나의 치환된 버전 중에서 독립적으로 선택되고;
x는 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
R₂는 수소, 알킬_(C≤8), 또는 치환된 알킬_(C≤8)이고;
n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
각각의 R₃은 아미노, 카복실, 시아노, 할로, 하이드록시 또는 니트로; 또는 알킬_(C≤8), 사이클로알킬_(C≤8), 알케닐_(C≤8), 알키닐_(C≤8), 아실_(C≤8), 아미도_(C≤8) 또는 이들 기 중 어느 하나의 치환된 버전 중에서 독립적으로 선택되고;
y는 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
제1항에 있어서,
상기 화합물이 하기 화학식 II 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염으로 추가로 정의되는 방법:
[화학식 II]

상기 식에서,
R₁, x, R₂, n 및 R₃은 상기에 정의된 바와 같다.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 화합물이 하기 화학식 III 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염으로 추가로 정의되는 방법:
[화학식 III]

상기 식에서,
R₁, x, n 및 R₃은 상기에 정의된 바와 같다.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화합물이 하기 화학식 IV 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염으로 추가로 정의되는 방법:
[화학식 IV]

상기 식에서,
R₁, n 및 R₃은 상기에 정의된 바와 같다.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
R₁이 니트로인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
R₁이 아미노, 알킬아미노_(C≤8), 치환된 알킬아미노_(C≤8), 디알킬아미노_(C≤8), 또는 치환된 디알킬아미노_(C≤8)인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
n이 2 또는 3인 방법.
제7항에 있어서,
n이 2인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
R₃이 할로인 방법.
제9항에 있어서,
R₃이 클로로인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
R₃이 아미도_(C≤8), 또는 치환된 아미도_(C≤8)인 방법.
제11항에 있어서,
R₃이 -NHC(O)CH₃인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화합물이 하기 화학식 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염으로 추가로 정의되는 방법:
알쯔하이머병이 있는 포유동물 대상체에게 작용물질 또는 TRPC6 또는 Orai2를 투여함을 포함하는 상기 대상체의 치료 방법으로서, 상기 작용물질이 하이퍼포린 또는 하이퍼포린 유도체가 아닌 방법.
알쯔하이머병이 있는 포유동물 대상체에게 nSOC 경로의 작용물질을 투여함을 포함하는 상기 대상체의 치료 방법으로서, 상기 작용물질이 하이퍼포린 또는 하이퍼포린 유도체 또는 유사체가 아닌 방법.
알쯔하이머병이 있는 포유동물 대상체에게 디아실글리세롤(DAG)-유도된 TRPC6 활성화의 강화제를 투여함을 포함하는 상기 대상체의 치료 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대상체를 적어도 제2 알쯔하이머병 치료제로 추가로 치료하는 방법.
제17항에 있어서,
상기 제2 알쯔하이머병 치료제가 콜린에스테라제 억제제, 무스카린 작용물질, 산화방지제, 소염제, 갈란타민(레미닐), 타크린(코그넥스), 셀레질린, 피소스티그민, 레비스티그민, 도네페질, (아리셉트), 리바스티그민(엑셀론), 메트리포네이트, 밀라멜린, 자노멜린, 사에루졸, 아세틸-L-카르니틴, 이데베논, ENA-713, 멤릭, 쿠에티아핀, 뉴레스트롤 또는 뉴로미달인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
치료가 기역력, 인지력 또는 학습의 개선, 증상 또는 병태생리학의 진행의 늦춤, 삶의 질의 개선, 또는 수명의 증가 중 하나 이상을 포함하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화합물 또는 작용물질을 경구로, 또는 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 두개내, 관절내, 전립선내, 흉막내, 근육내 또는 피하를 포함한 주사에 의해 투여하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화합물 또는 작용물질을 하루에 1, 2, 3 또는 4회 투여하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화합물 또는 작용물질을 만성적으로 투여하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대상체에서 상기 화합물 또는 작용물질 투여 전 및/또는 투여 후 인지력 또는 기억력을 측정함을 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 포유동물 대상체가 인간인 방법.
제24항에 있어서,
상기 인간이 조기 발병 알쯔하이머병을 앓고 있는 방법.
제24항에 있어서,
상기 인간이 후기 발병 알쯔하이머병을 앓고 있는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 포유동물 대상체가 비-인간 동물 대상체인 방법.
약학적 완충제, 희석제 또는 부형제 중에 제형화된 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학 조성물:
[화학식 I]

상기 식에서,
각각의 R₁은 아미노, 시아노, 카복실, 할로, 하이드록시 또는 니트로; 또는 알킬아미노_(C≤8), 디알킬아미노_(C≤8), 사이클로알킬아미노_(C≤8), 디사이클로알킬아미노_(C≤8) 또는 이들 기 중 어느 하나의 치환된 버전 중에서 독립적으로 선택되고;
x는 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
R₂는 수소, 알킬_(C≤8), 또는 치환된 알킬_(C≤8)이고;
n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
각각의 R₃은 아미노, 카복실, 시아노, 할로, 하이드록시 또는 니트로; 또는 알킬_(C≤8), 사이클로알킬_(C≤8), 알케닐_(C≤8), 알키닐_(C≤8), 아실_(C≤8), 아미도_(C≤8) 또는 이들 기 중 어느 하나의 치환된 버전 중에서 독립적으로 선택되고;
y는 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
제28항에 있어서,
하기 화학식으로 추가로 정의되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 추가로 포함하는 약학 조성물:
제28항에 있어서,
정제, 캡슐 또는 분말과 같은 고체 투여형으로 존재하는 약학 조성물.
제28항에 있어서,
경구 액체 투여형으로 존재하는 약학 조성물.
제28항에 있어서,
주사가능한 액체 투여형으로 존재하는 약학 조성물.
제28항에 있어서,
1 내지 100 ㎎/㎏의 상기 화합물을 포함하는 약학 조성물.