KR20180003879A - Bioreactor system for decellularization of extracted organs and decellularization method through the same - Google Patents

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KR20180003879A
KR20180003879A KR1020160083608A KR20160083608A KR20180003879A KR 20180003879 A KR20180003879 A KR 20180003879A KR 1020160083608 A KR1020160083608 A KR 1020160083608A KR 20160083608 A KR20160083608 A KR 20160083608A KR 20180003879 A KR20180003879 A KR 20180003879A
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박찬미
파달힌 엔드류
배상호
김보람
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순천향대학교 산학협력단
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Abstract

The present invention provides an efficient decellularization of organs and a decellularization bioreactor system used therein. According to an embodiment of the present invention, a user can proceed the decellularization of substantially dense tissues such as kidney in a relatively short time with little damage to the microstructure of the tissues and a vascular network.

Description

탈세포화용 생물반응기 시스템과, 이를 이용한 기관의 탈세포화 방법{BIOREACTOR SYSTEM FOR DECELLULARIZATION OF EXTRACTED ORGANS AND DECELLULARIZATION METHOD THROUGH THE SAME}FIELD OF THE INVENTION [0001] The present invention relates to a bioreactor system for deaeration and a method for deaeration of an organ using the same. BACKGROUND ART [0002]

본 발명은 조직의 탈세포화 진행을 위한 생물반응기 시스템과 탈세포화 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a bioreactor system for degassing progression of tissues and a method for deaeration.

급성 신부전 또는 신부전은 신장 기능의 급격한 손실을 의미하며, 보통 감염이나 외상이 원인이다. 신장의 기능이 정지되면, 신장이 필터 기능을 하지 못하기 때문에 노폐물이 체내에 쌓이게 되고, 인체의 정상적인 체액 균형이 흔들리게 된다. 매년 전 세계에서 수만은 사람들이 이러한 신장 질환으로 생명을 위협받고 있으며, 치료를 위한 여러 노력들에도 불구하고, 신장 기능이 회복되기 전에 대략 반수 이상의 환자들이 사망한다.Acute renal failure or kidney failure means a sudden loss of kidney function, usually caused by infection or trauma. When the function of the kidney stops, the kidney does not function as a filter, so the waste accumulates in the body, and the normal body fluid balance of the body is shaken. Every year, tens of thousands of people around the world are life-threatened with these kidney diseases, and in spite of many efforts for treatment, approximately half or more of the patients die before renal function is restored.

신장의 복잡한 구조적인 형태는, 손상된 조직의 복구나 재생을 매우 어렵게 하는 원인이다. 신장기능 손상에 대한 일반적인 치료는 약물을 통하거나 신장 이식에 의한다.The complex structural form of the kidney is the cause of the difficulty in repairing or regenerating damaged tissue. Common treatments for renal insufficiency are medication or kidney transplantation.

지난 수십 년 동안, 신장 손상의 치료제로써 줄기세포에 대한 관심이 증가되어 왔다. 그러나, 효과적인 전달 시스템이 개발되지 않아서, 손상된 신장의 기능적인 재생 효과를 얻기에는 상당히 부족하다. 신장투석과 복막투석이 일부 체액을 필터할 수 있다는 점에도 불구하고, 이러한 치료법들이 내분비와 면역, 재흡수, 대사 등 중요한 신장의 기능을 대신할 수 없는 실정이다. 이를 위해, 인공 구조체 내의 환자 자신의 세포를 이용한 바이오-인공 신장이 전기투석에 의하여 충분한 기능을 수행할 수 있다.Over the last several decades, interest in stem cells has been increasing as a treatment for kidney damage. However, an effective delivery system has not been developed and is insufficient to obtain the functional regeneration effect of damaged kidneys. Despite the fact that renal dialysis and peritoneal dialysis can filter some fluids, these therapies can not replace important renal functions such as endocrine and immunity, reabsorption, and metabolism. For this purpose, the bio-artificial kidney using the patient's own cells in the artificial structure can perform a sufficient function by electrodialysis.

조직 기능의 재생을 위한 생체 활성 물질의 개발에 대한 늘어나는 관심은, 추출된 조직 샘플 유래 세포외기질을 사용할 수 있는 가능성에 대한 여러 연구에 대한 관심도 이끌고 있다. The growing interest in the development of bioactive materials for the regeneration of tissue function has led to interest in several studies on the possibility of using extracellular matrix derived from extracted tissue samples.

추출된 조직은 세포를 제거하여 "골격" 또는 원래 미세구조를 가지는 틀을 얻는다. 탈세포화된 조직은, 몇몇 생체 활성 분자를 포함할 것이라고 생각되며, 높은 생체적합성 성분으로 구성된다. 이러한 무세포 샘플은 유사한 조직의 재생을 위한 이식용 재료로 활용될 수 있다. 무세포 조직의 이상적인 활용은, 실재 기관을 재건, 재생하는 것이다. 만약, 탈세포화 방법이 복잡한 기관의 적절한 미세구조를 유지하고, 결과적으로 얻어지는 세포외기질이 의도된 수혜자에게 적합한 세포를 증식할 수 있을 것이다.The extracted tissue is removed from the cell to obtain a "skeleton" or a template having the original microstructure. The de-saturated tissue is believed to contain several biologically active molecules and is composed of high biocompatible components. These cell-free samples can be used as implantable materials for regeneration of similar tissues. An ideal use of cell-free tissue is to rebuild and regenerate the actual organ. If the de-saturation method maintains the proper microstructure of the complex organs, the resulting extracellular matrix will be able to multiply cells suitable for the intended recipient.

국내특허공개공보 제 10-2015-0074672 호, 2015.07.02 공개, 세포 배양 및 세포 분화를 위한 탈세포화 기관 매트릭스 동결건조 분쇄물 및 이의 제조 방법Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2015-0074672, published on Jul. 20, 2015, freeze-dried pulverized material of degeneration-induced organs matrix for cell culture and cell differentiation and a method for producing the same 국내특허공개공보 제 10-2016-0005712 호, 2016.01.15 공개, 입자상 탈세포화 조직의 제조방법Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2016-0005712, published on Jan. 15, 2015, a method for producing a granular depleted tissue

본 발명은 효과적이고 비교적 빠른 시간 내에 기관의 탈세포화가 가능하게 하는 방법과, 이에 적용되는 탈세포화용 생물반응기 시스템을 제공한다.The present invention provides a bioreactor system for degassing, which is effective and enables deagglomeration of an organ in a relatively short period of time, and a deodorization bioreactor system applied thereto.

본 발명의 일 실시예에 따른 기관의 탈세포화 방법은, 적출된 기관과 탈세포화 반응기 본체 내부와 연동펌프유닛을 연결하는 제1펌프포트를 연결하는 과정을 포함하여 삽관된 기관을 준비하는 전처리단계; 상기 제1펌프포트를 통해서 상기 삽관된 기관에 탈세포화용액을 주입하고, 상기 삽관된 기관을 통과한 탈세포화용액을 제2펌프포트를 통해서 상기 탈세포화 반응기 본체로부터 제거되는 과정을 포함하여 관류의 방법으로 기관의 탈세포화를 유도하는 탈세포화처리 단계;를 포함한다.The method for detoxifying an engine according to an embodiment of the present invention includes a step of connecting a trapped organs and a first pump port connecting a peritonealization reactor main body and a peristaltic pump unit to a pretreatment step ; Introducing a deaerated solution into the intubated organ through the first pump port and removing the deaerated solution passing through the intubated engine through the second pump port from the deaerated gasification reactor main body, And a deaeration treatment step of inducing deaeration of the organ by the method.

상기 탈세포화용액은, SDS(sodium dodecyl sulfate), 비이온계 계면활성제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 용액으로, 상기 탈세포화처리단계에 각각 또는 동시에 적용될 수 있다.The de-saturated solution is a solution containing a substance selected from the group consisting of sodium dodecyl sulfate (SDS), a non-ionic surfactant, and a combination thereof, and can be applied to the de-ionization treatment step individually or simultaneously.

상기 기관은, 사람 또는 동물의 신장일 수 있다.The organ may be a human or animal kidney.

상기 탈세포화처리 단계는, 0.5 내지 5 중량%의 SDS(sodium dodecyl sulfate)과 상기 SDS를 기준으로 0.5 내지 5의 중량비로 함유되는 비이온성 계면활성제를 포함하는 탈세포화용액을 적용하며, 분당 150 내지 400 μL/minute 유속상승속도로 1000 내지 2000 μL/minute 의 목표유속까지 유속을 상승시키는 과정을 포함하여 진행될 수 있다.Wherein the de-saturatedization treatment step is performed by applying a de-saturated solution containing 0.5 to 5% by weight of sodium dodecyl sulfate (SDS) and a nonionic surfactant in a weight ratio of 0.5 to 5 based on the SDS, And raising the flow rate to a target flow rate of 1000 to 2000 [mu] L / minute at a 400 [mu] L / minute flow rate rise rate.

상기 탈세포화처리 단계는, 0.5 내지 5 중량%의 SDS(sodium dodecyl sulfate) 용액으로 관류를 진행하는 제1과정; 및 0.5 내지 20 중량%의 비이이온성 계면활성제 용액으로 관류를 진행하는 제2과정;을 포함하여 진행될 수 있다.The deaeration treatment step may include: a first step of performing perfusion with 0.5 to 5 wt% sodium dodecyl sulfate (SDS) solution; And 0.5 to 20% by weight of a non-ionic surfactant solution.

상기 제1과정은, 분당 150 내지 400 μL/minute 유속상승속도로 1000 내지 2000 μL/minute 의 목표유속까지 유속을 상승시켜 진행될 수 있다.The first step may be carried out by increasing the flow rate to a target flow rate of 1000 to 2000 μL / minute at a rate of 150 to 400 μL / minute flow rate per minute.

상기 제2과정은, 1000 내지 2000 μL/minute의 유속으로 진행될 수 있다.The second step may be carried out at a flow rate of 1000 to 2000 [mu] L / minute.

상기 제2과정 이후에는, 완충용액으로 관류를 진행하는 제3과정;을 더 포함할 수 있다.After the second step, the third step of perfusion with the buffer solution may be further included.

상기 제3과정은, 1000 내지 2000 μL/minute의 유속으로 진행할 수 있다.The third step may proceed at a flow rate of 1000 to 2000 [mu] L / minute.

상기 탈세포화처리단계는, 상기 삽관된 기관에, 항생제를 주입한 용액을 폐쇄순환 관류시키는 항생제처리과정을 더 포함할 수 있다.The de-saturatedization treatment step may further include an antibiotic treatment step of circulating perfused solution in which the antibiotic is injected into the intubated organ.

본 발명의 다른 일 실시예에 다른 탈세포화 생물반응기 시스템은, 내부에 삽관된 기관을 수용하는 수용공간이 형성되어 있고 상기 수용공간과 연결된 개방홀을 가지는 본체; 연동펌프유닛과 상기 수용공간 내부 또는 상기 수용공간 내부에 위치하는 삽관된 기관과 연결되는 제1 펌프포트와 상기 수용공간 내부와 연결된 제2 펌프포트를 포함하는 포트; 상기 포트를 가지며 상기 본체에 분리할 수 있게 결합되어 상기 개방홀을 열고 닫는 마개; 상기 포트를 통해 상기 수용공간 내부 또는 상기 수용공간 내부에 위치하는 삽관된 기관과 연결되는 연동펌프유닛; 및 상기 연동펌프유닛을 통해 상기 제1펌프포트로 제1용액을 공급하는 제1수용부를 포함하는 수용부유닛을 포함한다.Another biodegradable bioreactor system according to another embodiment of the present invention includes: a body having an accommodation space for accommodating an intubated organ therein and having an opening hole connected to the accommodation space; A port including a peristaltic pump unit and a first pump port connected to an intubated organs located inside or within the containing space and a second pump port connected to the inside of the containing space; A cap having the port and releasably coupled to the body to open and close the opening; A peristaltic pump unit connected to an intubated organs located in the interior space or inside the interior space through the port; And a first accommodating portion including a first accommodating portion for supplying a first solution to the first pump port through the peristaltic pump unit.

상기 연동펌프유닛과 상기 포트 사이에 위치하여 연동펌프유닛에 의하여 구동되는 용액의 흐름을 제어하는 밸브;를 더 포함할 수 있다.And a valve disposed between the peristaltic pump unit and the port for controlling the flow of the solution driven by the peristaltic pump unit.

본 발명의 실시예에 따르면, 유해한 약품에의 노출을 최소화하면서 동시에 수 개의 기관의 탈세포화를 하나의 탈세포화 챔버 내에서 진행할 수 있어서 효율성을 높이고, 비교적 빠른 시간 내(약 12시간 이내)에 소동물의 신장을 탈세포화할 수 있는 방법을 제공한다. 또한, 조직의 날세포화, 세척 및 항균을 하나의 시스템 내에서 진행할 수 있는 탈세포화 생물반응기 시스템도 제공하여, 효과적으로 탈세포화 과정을 진행할 수 있도록 한다.According to the embodiment of the present invention, deaeration of several organs can be carried out in one degasification chamber while minimizing exposure to harmful chemicals, thereby increasing the efficiency and improving the efficiency in a relatively short time (within about 12 hours) And provides a method for degenerating the animal's kidney. Also provided is a de-saturated bioreactor system capable of progressing tissue celling, washing, and antimicrobial activity in a single system, thereby enabling a de-saturation process to proceed effectively.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장의 탈세포화를 위한 생물반응기 시스템과 탈세포화 과정을 보여주는 개념도.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 적용한 탈세포화 생물반응기 시스템의 각 부분을 보여주는 사진.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 본체(탈세포화 챔버 본체)의 구체적인 모습(좌)과 적출된 신장에 카테터를 삽입한 결과(우)를 보여주는 사진.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 적용한 탈세포화 과정을 설명하는 개념도.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 적용한 탈세포화 과정을 거친 후의 신장 샘플을 관찰한 사진.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 제조한 소동물 신장의 탈세포 처리를 진행 후 내부 혈관의 손상 여부를 확인한 형태학적 실험 결과를 보여주는 사진.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 제조한 소동물 신장의 탈세포 처리 후에도 미세구조가 잘 유지되어 있음을 H&E 염색과 메이슨 트리크롬 염색으로 확인한 결과를 보여주는 사진.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 제조한 소동물 신장의 탈세포 처리 후 샘플을 이용하여 처리 전 후의 샘플 내에 유전물질을 정량화하여 평가한 결과를 보여주는 DNA 정량시험 결과를 보여주는 그래프.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 제조한 탈세포화된 신장 샘플을 이용하여 세포 접종을 실시하고 7일 동안 관류를 실시한 후에 형광염색을 진행하여 살아있는 세포의 모습을 보여주는 사진.
도 10는 도 2의 탈세포화 챔버 본체와 캡을 나타낸 확대도.
도 11은 도 10의 분해 사시도.
도 12는 도 10을 Ⅳ-Ⅳ 선을 따라 자른 단면도.1 is a conceptual diagram showing a bioreactor system and a de-aeration process for deaeration of a kidney according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a photograph showing each part of a degasification bioreactor system applied to an embodiment of the present invention. FIG.
FIG. 3 is a photograph showing a specific shape (left) of the body (de-fatating chamber body) and a result of inserting the catheter into the extracted kidney (right) in an embodiment of the present invention.
4 is a conceptual diagram illustrating a de-saturation process applied in an embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a photograph of a kidney sample observed after a de-saturating process applied in an embodiment of the present invention. FIG.
FIG. 6 is a photograph showing a result of a morphological experiment to confirm the damage of inner blood vessels after the decellularization treatment of the small animal's kidney prepared in one embodiment of the present invention. FIG.
FIG. 7 is a photograph showing the results of H & E staining and mason trichrome staining showing that microstructure is well maintained even after decellularization of small animal kidney prepared in one embodiment of the present invention.
FIG. 8 is a graph showing a result of DNA quantitation test showing the result of quantitatively evaluating a genetic material in a sample before and after treatment using a sample after decellularization of a small animal's kidney prepared in an embodiment of the present invention.
FIG. 9 is a photograph showing the appearance of living cells by performing fluorescence staining after performing cell inoculation using the de-fatified kidney sample prepared in one embodiment of the present invention and perfusing for 7 days.
10 is an enlarged view of the degasification chamber body and cap of FIG. 2;
11 is an exploded perspective view of Fig.
12 is a cross-sectional view taken along line IV-IV of FIG. 10;

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 동일한 도면 부호를 붙였다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings so that those skilled in the art can easily carry out the present invention. The present invention may, however, be embodied in many different forms and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein. Like parts are designated with like reference numerals throughout the specification.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.The terms "about "," substantially ", etc. used to the extent that they are used herein are intended to be taken to mean an approximation of, or approximation to, the numerical values of manufacturing and material tolerances inherent in the meanings mentioned, Accurate or absolute numbers are used to help prevent unauthorized exploitation by unauthorized intruders of the referenced disclosure.

또한, 본 명세서 전체에서, "~ 하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.Further, throughout this specification, the word " step "or" step "does not mean" step for.

본 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.Throughout this specification, the term "combination thereof " included in the expression of the machine form means a combination or combination of at least one element selected from the group consisting of the constituents described in the expression of the form of a marker, And the like.

본 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.Throughout this specification, the description of "A and / or B" means "A, B, or A and B".

본 명세서 전체에서, "제1", "제2" 또는 "A", "B"와 같은 용어는 동일한 용어를 서로 구별하기 위하여 사용된다.Throughout this specification, terms such as "first", "second" or "A", "B" are used to distinguish the same terms from each other.

본 명세서 전체에서 단수와 복수를 구별하여 사용하지 않으며, 문맥이나 필요에 따라 단수는 단소 또는 복수로 해석될 수 있으며, 특별히 구성을 한정하는 표면으로 사용되지 않는 한 단수 또는 복수의 표현에 의하여 권리범위가 제한되도록 해석되지 않는다.The singular and plural are not to be distinguished from each other throughout the present specification, and the singular number may be interpreted singly or plurally according to the context or need, and the singular or plurality of expressions, Are not construed to be limiting.

많은 연구자들이, 신장의 적절한 대체품을 제조고자 시도하고 있으며, 합성 신장, 하이브리드 투석 시스템 등에 대한 연구도 지속되고 있다. 이 분야의 문제점은, 장기 기증이나 기능 기관의 실재 기능을 되살리는 방법으로 해결할 수 있다. 다만, 현재의 기술로는 신장의 미세 복잡한 기관을 시험관 조간에서 합성하여 재현할 수 없으며, 실재 신장으로부터 추출된 조직에서 유래하는 적절한 플랫홈을 구축할 필요학 있다. 소동물의 탈세포화된 신장은, 신장의 재생에 대한 연구를 위해 중요하다.Many researchers are attempting to manufacture an appropriate replacement for kidneys, and studies on synthetic kidneys, hybrid dialysis systems, and the like are continuing. The problems in this field can be solved by reviving the organ function of organ donation or functional organ. However, current technology does not allow the synthesis of small intricate organs of the kidneys in vitro, and it is necessary to construct an appropriate platform derived from tissues extracted from the actual kidney. The degenerated kidney of small animals is important for the study of kidney regeneration.

소동물의 신장을 이용하여 미세포 매트릭스를 제조하기 위해, 비교적 단시간 내에 탈세포화된 신장을 얻을 수 있는 활성 관류 시스템이 적용될 필요가 있다. 이에, 본 발명의 발명자들은, 상대적으로 짧은 시간에 무균 조건 하에서 추출 된 신장의 탈세 포화를 허용하는 방법을 사용한다 활성 관류 시스템에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하였다.In order to prepare a microemulsion matrix using the kidney of a small animal, it is necessary to apply an active perfusion system capable of obtaining a decompressed elongation in a relatively short time. Thus, the inventors of the present invention use a method that permits the depletion of the kidneys extracted under sterile conditions in a relatively short time. The present inventors have completed the present invention by studying an active perfusion system.

본 발명은, 인간 또는 동물의 적출된 장기(기관) 조직으로부터 탈세포화하는 생물반응기 시스템과 탈세포화 방법에 대한 것이다. 비교적 짧은 시간 내에 신장과 같은 복잡한 기관의 탈세포화를 진행할 수 있고, 탈세포화된 기관은 항생제 처리 등을 진행한 후 보관 처리될 수 있다. 본 발명의 탈세포화 방법을 적용하면, 유전물질의 함량은 상당히 감소하면서도 신장과 같은 기능 조직의 미세 조직과 혈관 조직은 잘 남아있도록 할 수 있다.The present invention relates to a bioreactor system and a defatting method for de-saturating human or animal organs from extracted organs (organ) tissues. Degasification of complex organs such as kidneys can be progressed within a relatively short time, and degummed organs can be stored after proceeding with antibiotic treatment or the like. By applying the deaerating method of the present invention, the content of the genetic material is considerably reduced, but the microstructure and vascular tissue of the functional tissue such as the kidney can remain well.

본 발명의 일 실시예에 따른 기관의 탈세포화 방법은, 적출된 기관과 탈세포화 챔버 본체 내부와 연동펌프유닛을 연결하는 제1펌프포트를 연결하는 과정을 포함하여 삽관된 기관을 준비하는 전처리단계; 상기 제1펌프포트를 통해서 상기 삽관된 기관에 탈세포화용액을 주입하고, 상기 삽관된 기관을 통과한 탈세포화용액을 제2펌프포트를 통해서 상기 탈세포화 챔버 본체로부터 제거되는 과정을 포함하여 관류의 방법으로 기관의 탈세포화를 유도하는 탈세포화처리 단계;를 포함한다.The method of deagglomeration of an organ according to an embodiment of the present invention includes a step of connecting an extracted organs and a first pump port connecting a perforated chamber body with a peristaltic pump unit, ; Introducing the de-saturated solution into the intubated organ through the first pump port and removing the de-saturated solution passed through the intubated organ from the de-saturatedization chamber main body through the second pump port; And a deaeration treatment step of inducing deaeration of the organ by the method.

상기 기관은, 조밀실질조직(신장, 간, 췌장 등)과 손상 혈관 조직일 수 있고, 특히 사람 또는 동물의 신장 기관에 유리하게 적용될 수 있다. 상기 조직은 이후 관류를 위한 삽관 등을 위해 혈관 조직 등을 카테터 등 연결부 형성을 위해 충분히 확보하여 적출된 것일 수 있고, 헤파린 처리 등 조직 손상을 막기 위한 처리가 진행된 것일 수 있다.The organs may be dense parenchymal tissues (kidney, liver, pancreas, etc.) and injured vascular tissues, and may be advantageously applied particularly to human or animal renal organs. The tissue may be one obtained by sufficiently securing vascular tissue or the like for formation of a connection part such as a catheter for the purpose of intubation for perfusion, or may be a treatment for preventing tissue damage such as heparin treatment.

상기 탈세포화용액은, SDS(sodium dodecyl sulfate), 비이온계 계면활성제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 용액을 각각 또는 동시에 상기 탈세포화처리단계에 적용할 수 있다.The de-saturated solution may be applied to the de-saturatedization treatment step individually or simultaneously with a solution containing a substance selected from the group consisting of sodium dodecyl sulfate (SDS), a non-ionic surfactant, and a combination thereof.

상기 탈세포화용액을 적용하면, 복잡한 미세구조를 갖는 조밀실질조직에서 탈세포화를 효과적으로 진행할 수 있고, 특히 탈세포화에 걸리는 시간을 단축하며, 동시에 잔존 유전물질의 함량을 최소화하고, 기관의 미세조직구조나 혈관의 손상을 최소화하면서 탈세포화과정을 진행할 수 있다. By applying the de-saturated solution, de-saturation can be effectively promoted in a dense parenchyma having a complicated microstructure, in particular, the time required for de-saturation can be shortened, at the same time, the content of the remaining genetic material can be minimized, It is possible to proceed with the process of de-saturation while minimizing damage to the blood vessels.

상기 탈세포화용액은, 아래에서 설명하는 두 가지 방법으로 적용할 수 있다.The de-saturated solution can be applied by the following two methods.

첫 번째 방법은, 0.5 내지 5 중량%의 SDS(sodium dodecyl sulfate)과 상기 SDS를 기준으로 0.5 내지 5의 중량비로 함유되는 비이온성 계면활성제를 포함하는 탈세포화용액(제1탈세포화용액)을 적용하는 방법으로, 필요에 따라서 적정한 양의 헤파린을 추가적으로 더 포함할 수 있다.The first method involves applying a de-saturated solution (first de-saturating solution) comprising 0.5 to 5% by weight of sodium dodecyl sulfate (SDS) and a non-ionic surfactant in a weight ratio of 0.5 to 5 based on the SDS , It may further include an appropriate amount of heparin, if necessary.

상기 SDS의 함량은 상기 탈세포화용액 기준 0.5 내지 3 중량%일 수 있고, 0.5 내지 1.5 중량%일 수 있다. 이러한 농도의 SDS를 적용하는 경우, 기관의 조밀실질조직의 손상을 최소화하면서 탈세포화를 더욱 촉진할 수 있고, 탈세포화에 걸리는 시간을 최소화할 수 있다.The content of the SDS may be 0.5 to 3% by weight, and may be 0.5 to 1.5% by weight based on the de-saturated solution. When this concentration of SDS is applied, it is possible to further promote the de-saturation while minimizing damage to the dense parenchyma of the organ, and to minimize the time required for de-saturation.

상기 비이온성 계면활성제는 상기 SDS 함량의 0.5 내지 5 중량비로 상기 탈세포화용액에 포함될 수 있고, 구체적으로 상기 탈세포화용액 기준 0.5 내지 10 중량%, 더 구체적으로 0.5 내지 5 중량%가 적용될 수 있다. 상기 비이온성 계면활성제는 상기 탈세포화용액으로 적용되면서 기관 내에 잔류하는 세포의 탈락과 외부로의 배출을 도울 수 있다.The nonionic surfactant may be contained in the de-saturated solution at a ratio of 0.5 to 5 wt% of the SDS content. Specifically, 0.5 to 10 wt%, more specifically, 0.5 to 5 wt% may be applied based on the de-saturated solution. The non-ionic surfactant may be applied to the de-saturated solution to assist in the removal of the cells remaining in the organs and the release thereof to the outside.

상기 제1탈세포화용액을 적용하는 경우, 삽관된 기관에 직접 상기 제1탈세포화용액을 주입하고 기관의 다른 부분으로 주입된 용액이 잘 빠져나오는지를 확인하면서 탈세포화 과정을 적용하며, 관류 시 유속은 1000 내지 2000 μL/minute 의 목표유속을, 구체적으로 1250 내지 1750 μL/minute의 유속을, 더 구체적으로 1400 내지 1600 μL/minute의 유속을 유지하며 진행한다. 다만, 최초 시스템 구동 시에는 150 내지 400 μL/minute의 유속을 부여하고 분당 150 내지 400 μL/minute의 단위로 유속을 상승하여 상기 목표유속에 다다르도록 할 수 있다. 이러한 목표유속과 유속 상승 속도를 적용하는 것이, 기관 조직 손상을 방지하고 효과적인 탈세포화과정을 진행하기에 좋다. When the first de-saturated solution is applied, the first de-saturated solution is directly injected into the intubated organ and the de-saturation process is applied while confirming whether the solution injected into the other part of the organ is well- Proceeds at a target flow rate of 1000 to 2000 μL / minute, specifically at a flow rate of 1250 to 1750 μL / minute, more specifically at a flow rate of 1400 to 1600 μL / minute. However, when the initial system is operated, a flow rate of 150 to 400 μL / minute may be applied and the flow rate may be increased in units of 150 to 400 μL / minute per minute to reach the target flow rate. Applying such a target flow rate and a flow rate rise rate is preferable to prevent damage to the organ tissue and to carry out an effective degassing process.

상기 제1탈세포화용액을 적용한 탈세포화과정은, 기관의 색이 전체적으로 고르게 투명해졌는지를 확인하고 완료하며, 대략 3 내지 24 시간 동안 진행될 수 있으며, 12시간 이내에 상기 과정이 완료될 수 있다. 특히 소동물의 신장기관의 경우에는, 7시간 이내에 탈세포화 과정이 완료될 수 있으며, 이는 본 발명의 탈세포화용액을 적용하여 얻어지는 현저하게 단축된 시간이다.The deaerating process using the first deaerated solution may be completed and completed for about 3 to 24 hours, and the process may be completed within 12 hours. In particular, in the case of a small animal's renal organ, the de-saturation process can be completed within 7 hours, which is a remarkably shortened time obtained by applying the de-saturated solution of the present invention.

이렇게 제1탈세포화용액을 이용하여 1차탈세포화과정이 진행된 기관은, 이후 수세과정을 거칠 수 있으며, 상기 수세과정은 상기 제1탈세포화용액 대신에 물을 적용하여 1000 내지 2000 μL/minute 의 목표유속을 유지하며 관류를 수행하여, 기관 내부에 잔류하는 세포를 제거하는 과정으로, 대략 0.5 내지 2 시간 동안 진행될 수 있다.The first degasification solution may be used to wash the first degasification solution. The first degasification solution may be washed with water, and then the water may be applied to the first degasification solution. Maintaining the target flow rate, performing perfusion, and removing the cells remaining in the organs, and can be performed for about 0.5 to 2 hours.

수세 과정 진행 후에는, 버퍼 용액을 이용하여 1000 내지 2000 μL/minute 의 목표유속을 유지하며 추가적인 관류를 수행하여 탈세포화된 기관의 안정화와 보관을 위한 전처리를 진행할 수 있고, 예를 들어 상기 버퍼 용액은 PBS(phosphate buffer saline)가, 상기 추가적인 관류는 0.5 내지 3 시간 동안 진행될 수 있다.After the flushing process, the buffer solution is used to maintain the target flow rate of 1000 to 2000 μL / minute, and further perfusion can be performed to carry out the pretreatment for stabilization and storage of the deteriorated organs. For example, (Phosphate buffered saline), and the additional perfusion may be carried out for 0.5 to 3 hours.

이 과정에서 추가적으로 항생제(필요시 항진균제를 포함한다) 처리가 진행될 수 있으며, 이 항생제 처리는 관류하는 버퍼 용액에 항생제를 주입하고 폐쇄순환관류를 진행하는 방법으로 진행될 수 있다. 이 때 적용하는 관류의 유속도 1000 내지 2000 μL/minute 의 목표유속을 유지하며 진행될 수 있으며, 항생제 주입 후 폐쇄순환관류는 5 내지 1시간 동안 진행될 수 있다.In this process, antibiotics (including antifungal agents if necessary) may be further processed. This antibiotic treatment may be carried out by injecting antibiotics into the perfusion buffer solution and performing closed circulation perfusion. The flow rate of the applied perfusion may be maintained at a target flow rate of 1000 to 2000 μL / minute, and the closed circulation perfusion after the infusion of the antibiotic may proceed for 5 to 1 hour.

두 번째 방법은, 0.5 내지 5 중량%의 SDS(sodium dodecyl sulfate) 용액으로 관류를 진행하는 제1과정; 0.5 내지 20 중량%의 비이이온성 계면활성제 용액으로 관류를 진행하는 제2과정; 및 완충용액으로 관류를 진행하는 제3과정;을 포함하는 순차 진행 과정이다. 상기 제1과정과 제2과정의 사이와 제2과정 이후에는 수세과정이 더 포함될 수 있고 상기 수세과정은 상기 첫 번째 방법에서의 수세 과정과 유사하게 적용될 수 있다.The second method comprises: a first step of performing perfusion with 0.5 to 5% by weight of SDS (sodium dodecyl sulfate) solution; A second step of carrying out perfusion with a nonionic liquid surfactant solution of 0.5 to 20% by weight; And a third step of performing perfusion with a buffer solution. The washing process may be further included between the first process and the second process and after the second process, and the washing process may be applied similarly to the washing process in the first process.

상기 SDS의 함량은 상기 탈세포화용액 기준 0.5 내지 3 중량%일 수 있고, 0.5 내지 1.5 중량%일 수 있다. 이러한 농도의 SDS를 적용하는 경우, 기관의 조밀실질조직의 손상을 최소화하면서 탈세포화를 더욱 촉진할 수 있고, 탈세포화에 걸리는 시간을 최소화할 수 있다.The content of the SDS may be 0.5 to 3% by weight, and may be 0.5 to 1.5% by weight based on the de-saturated solution. When this concentration of SDS is applied, it is possible to further promote the de-saturation while minimizing damage to the dense parenchyma of the organ, and to minimize the time required for de-saturation.

상기 비이온성 계면활성제는 상기 SDS 함량의 0.5 내지 5 중량비로 상기 탈세포화용액에 포함될 수 있고, 구체적으로 상기 탈세포화용액 기준 0.5 내지 10 중량%, 더 구체적으로 0.5 내지 5 중량%가 적용될 수 있다. 상기 비이온성 계면활성제는 상기 탈세포화용액으로 적용되면서 기관 내에 잔류하는 세포의 탈락과 외부로의 배출을 도울 수 있다.The nonionic surfactant may be contained in the de-saturated solution at a ratio of 0.5 to 5 wt% of the SDS content. Specifically, 0.5 to 10 wt%, more specifically, 0.5 to 5 wt% may be applied based on the de-saturated solution. The non-ionic surfactant may be applied to the de-saturated solution to assist in the removal of the cells remaining in the organs and the release thereof to the outside.

상기 제1과정은, 분당 150 내지 400 μL/minute 유속상승속도로 1000 내지 2000 μL/minute 의 목표유속 구체적으로 1250 내지 1750 μL/minute의 유속을, 더 구체적으로 1400 내지 1600 μL/minute의 목표유속까지 유속을 상승시켜 진행될 수 있고, 이렇게 진행하는 것이 탈세포화를 효과적으로 진행할 수 있다. 상기 과정은 3 내지 24시간 동안 지속하여 실시될 수 있고, 기관이 균일하게 투명해질 때까지 수행되는 것이 좋다.The first step is to increase the flow rate of the target flow rate of from 1000 to 2000 μL / minute, specifically from 1250 to 1750 μL / minute, at a flow rate of 150 to 400 μL / minute, more specifically, to a target flow rate of 1400 to 1600 μL / The flow velocity can be increased and the process can proceed effectively. The process may be carried out continuously for 3 to 24 hours, preferably until the organ is evenly transparent.

상기 제2과정은, 1000 내지 2000 μL/minute의 유속으로 진행될 수 있고, 잔류하는 세포를 제거하도록 유도하는 과정이다.The second step may be performed at a flow rate of 1000 to 2000 μL / minute, and is a process for inducing removal of residual cells.

상기 제2과정 이후에는, 완충용액으로 관류를 진행하는 제3과정;을 더 포함할 수 있으며, 상기 제3과정은, 1000 내지 2000 μL/minute의 유속으로 진행되는 것이 효율적이다.And a third step of performing perfusion with the buffer solution after the second step. In the third step, it is effective to proceed at a flow rate of 1000 to 2000 μL / minute.

상기 탈세포화처리단계는, 상기 삽관된 기관에, 항생제를 주입한 용액을 폐쇄순환관류시키는 항생제처리과정을 더 포함할 수 있고, 항생제(필요시 항진균제를 포함한다) 처리는 이 항생제 처리는 관류하는 버퍼 용액에 항생제를 주입하고 폐쇄순환관류를 진행하는 방법으로 진행될 수 있다. 이 때 적용하는 관류의 유속도 1000 내지 2000 μL/minute 의 목표유속을 유지하며 진행될 수 있으며, 항생제 주입 후 폐쇄순환관류는 5 내지 1시간 동안 진행될 수 있다.The antiseptic treatment step may further include an antibiotic treatment step of circulating perfused solution in which the antibiotic is injected to the intubated organ, and the antibiotic treatment (including the antifungal agent if necessary) A method of injecting antibiotics into the buffer solution and performing closed circulation perfusion can be performed. The flow rate of the applied perfusion may be maintained at a target flow rate of 1000 to 2000 μL / minute, and the closed circulation perfusion after the infusion of the antibiotic may proceed for 5 to 1 hour.

상기 탈세포화처리단계를 거처 탈세포화된 기관은, 이후 동결 건조하는 방법으로 보관될 수 있다.The organs degummed through the de-saturating treatment step can then be stored by a method of freeze-drying.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 탈세포화 생물반응기 시스템에 대하여 도 2, 도 10 내지 도 12를 참고하여 설명한다.A deaerated bioreactor system according to another embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. 2, FIG. 10 to FIG.

도 2은 본 발명의 한 실시예에 따른 탈세포화 생물반응기 시스템을 나타낸 개략도이고, 도 10는 도 2의 탈세포화 챔버 본체와 캡을 나타낸 확대도이며, 도 11은 도 10의 분해 사시도이고, 도 12는 도 10을 Ⅳ-Ⅳ 선을 따라 자른 단면도이다.FIG. 2 is a schematic view of a degasification bioreactor system according to an embodiment of the present invention, FIG. 10 is an enlarged view of a degasification chamber body and a cap of FIG. 2, FIG. 11 is an exploded perspective view of FIG. 10, 12 is a cross-sectional view taken along line IV-IV of FIG.

본 실시예에 따른 탈세포화 생물반응기 시스템(1)는 탈세포화 챔버 본체(본체, 10), 마개(20), 연동펌프유닛(30), 밸브(40) 및 수용부(521, 52)를 포함하며 탈세포화 챔버 본체(10)에 수용되는 기관(심장, 폐, 신장 등)의 탈세포화과정을 진행한다.The deaerated bioreactor system 1 according to the present embodiment includes a degasification chamber body (body 10), a stopper 20, a peristaltic pump unit 30, a valve 40 and accommodating portions 521 and 52 And the degassing process of the organs (heart, lung, kidney, etc.) accommodated in the degassing chamber body 10 proceeds.

탈세포화 챔버 본체(10)에는 적절한 용액 및/또는 탈세포화과정을 진행할 기관이 수용되는 수용공간(11)이 형성되어 있다. 탈세포화 챔버 본체(10)에는 수용공간(11)으로 기관을 넣거나 뺄 수 있는 개방홀(12)이 형성되어 있다. 도면에는 도시하지 않았지만 개방홀(12)의 직경은 기관의 크기에 따라 조절될 수 있다. 탈세포화 챔버 본체(10)는 기관과 상기 용액이 보일 수 있도록 투명하고 살균처리를 할 수 있는 재질(예를 들어, 유리 등)로 이루어질 수 있다.The deaerating chamber main body 10 is formed with a receiving space 11 in which an appropriate solution and / or an organ for performing the deaerating process are accommodated. The degassing chamber body 10 is formed with an opening 12 through which the orifice can be inserted into or withdrawn from the accommodation space 11. Although not shown in the drawings, the diameter of the opening hole 12 can be adjusted according to the size of the engine. The degassing chamber body 10 may be made of a material (e.g., glass or the like) that is transparent and sterilizable so that the tube and the solution can be seen.

마개(20)는 하나 이상의 포트(21)를 가지며, 탈세포화 챔버 본체(10)와 결합 또는 분리될 수 있으며, 구체적으로 나사 방식으로 분리 또는 결합될 수 있다. 이에 마개(20)는 개방홀(12)을 열고 닫는다. 마개(20)의 결합으로 탈세포화 챔버 본체(10) 내부는 밀폐될 수 있고, 이를 위해서 상기 마개(20)와 상게 탈세포화 챔버 본체(10)를 결합하는 부분을 실리콘 필름 등으로 추가적인 밀봉 처리를 할 수 있다.The closure 20 has one or more ports 21 and may be engaged or disengaged with the degasification chamber body 10 and may be specifically separated or coupled in a threaded manner. The closure 20 thus opens and closes the opening 12. The inside of the degasification chamber body 10 can be sealed by the engagement of the stopper 20 and the portion joining the stopper 20 and the upper deasphalating chamber body 10 is subjected to additional sealing treatment with a silicon film or the like can do.

포트(21)는 마개(20)의 상면에 형성되어 있으며 제1 펌프포트(211), 제2 펌프포트(212)를 포함할 수 있다.The port 21 is formed on the upper surface of the cap 20 and may include a first pump port 211 and a second pump port 212.

제1 펌프포트(211)에는 제1 순환배관(311)이 관통하는 관통홀(211a)이 형성되어 있다. 제1 순환배관(311)의 단부는 수용공간(11)에 위치한다. 제1 순환배관(311) 외부 둘레와 제1 펌프포트(211) 내부 둘레 사이에 틈새가 발생하지 않도록 제1 순환배관(311)은 관통홀(211a)에 탄력적으로 결합되어 있고, 밀봉을 위한 추가 실리콘 필름 처리 등이 진행될 수 있다.The first pump port 211 is formed with a through hole 211a through which the first circulation pipe 311 passes. The end of the first circulation pipe 311 is located in the accommodation space 11. The first circulation pipe 311 is resiliently coupled to the through hole 211a so as to prevent a gap between the outer circumference of the first circulation pipe 311 and the inner circumference of the first pump port 211, Silicon film processing and the like can be performed.

제1 순환배관(311)과 제1 펌프포트(211) 사이에 기밀 유지를 위한 실링부재(미도시)가 배치될 수 있다. 제1 순환배관(311)은 살균될 수 있으며 내부가 보이도록 투명한 재질로 만들어질 수 있다.A sealing member (not shown) for maintaining airtightness may be disposed between the first circulation pipe 311 and the first pump port 211. The first circulation pipe 311 can be sterilized and made of a transparent material so that the inside can be seen.

제2 펌프포트(212)는 제1 펌프포트(211)와 이웃하게 배치되어 있다. 제2 펌프포트(212)에는 제2 순환배관(312)이 관통하는 관통홀(212a)이 형성되어 있다. 제2 순환배관(312)의 단부는 수용공간(11)에 위치한다. 제2 펌프포트(212)는 제1 펌프포트(211)와 동일하므로 중복된 설명은 생략한다.The second pump port 212 is disposed adjacent to the first pump port 211. The second pump port 212 is formed with a through hole 212a through which the second circulation pipe 312 passes. The end of the second circulation pipe (312) is located in the receiving space (11). Since the second pump port 212 is the same as the first pump port 211, a duplicate description will be omitted.

포트(21)는 적어도 하나의 기관포트(213) 및 적어도 하나의 예비포트(214)를 더 포함할 수 있다. 기관포트(213)에는 수용공간(11)에 위치하여 기관과 연결될 수 있는 적어도 하나의 카테터(213a)가 결합될 수 있다. 예비포트(214)는 수용공간(11) 또는 압력조절부(미도시)와 연결될 수 있다.The port 21 may further include at least one engine port 213 and at least one spare port 214. At the engine port 213, at least one catheter 213a, which is located in the receiving space 11 and can be connected to the engine, can be coupled. The reserve port 214 may be connected to the accommodation space 11 or a pressure regulator (not shown).

기관포트(213) 및 예비포트(214)는 제1 펌프포트(211)와 동일하므로 중복된 설명은 생략한다. 한편, 기관포트(213)와 예비포트(214)는 생략될 수 있고, 기관포트(213)와 예비포트(214) 중 선택된 어느 하나만 생략될 수 있다.Since the engine port 213 and the spare port 214 are the same as the first pump port 211, redundant description is omitted. On the other hand, the engine port 213 and the spare port 214 may be omitted, and only one selected from the engine port 213 and the spare port 214 may be omitted.

위 설명과 도면에서 각 포트에 배관이 결합된 것으로 설명하였으나, 하나의 포트에 복수의 배관이 동시에 결합될 수도 있다. 포트(21)의 구조, 개수는 마개(20) 및 탈세포화 챔버 본체(10)의 설계에 따라 달라질 수 있다.In the above description and drawings, the piping is described as being connected to each port, but a plurality of piping may be simultaneously connected to one port. The structure and the number of the ports 21 may vary depending on the design of the plug 20 and the degasification chamber body 10.

연동펌프유닛(30)는 카트리지(미도시), 제1 용액을 순환시키는 펌프(미도시), 펌프와 전기적으로 연결되어 있어 있는 제어부(미도시)을 포함한다.The peristaltic pump unit 30 includes a cartridge (not shown), a pump (not shown) circulating the first solution, and a control unit (not shown) electrically connected to the pump.

수용부유닛은, 상기 연동펌프유닛을 통해 상기 제1펌프포트로 제1용액을 공급하는 제1수용부(51)를 포함한다. 또한 본체(10)를 거처 제2펌프포트를 통해 본체(10) 외부로 배출되는 용액을 수용하는 제2수용부(52)를 더 포함할 수 있다.The accommodation unit includes a first accommodation portion (51) for supplying the first solution to the first pump port through the peristaltic pump unit. And a second accommodating portion 52 for accommodating the solution discharged through the main body 10 to the outside of the main body 10 through the second pump port.

제1수용부(51)에 위치하는 제1용액은 연동펌프유닛(30)의 펌프를 이용하여 제1펌프포트를 통해서 본체(10) 내부의 수용공간(11) 또는 상기 수용공간(11)에 위치하는 기관에 주입될 수 있다. 상기 제1 용액으로는 위에서 설명한 탈세포화용액 또는 물 등이 적용될 수 있다.The first solution located in the first accommodating portion 51 is introduced into the accommodating space 11 or the accommodating space 11 inside the main body 10 through the first pump port by using the pump of the peristaltic pump unit 30 Can be injected into the locating organ. As the first solution, deaeration solution or water described above may be applied.

또한, 상기 제1용액은 본체(10)를 거처 제2펌프포트를 통해 본체(10) 외부로 배출될 수 있고, 이때 배출된 용액은 제2수용부(52)에 수용될 수 있다.Also, the first solution can be discharged to the outside of the main body 10 through the second pump port through the main body 10, and the discharged solution can be accommodated in the second accommodating portion 52.

필요에 따라, 상기 제1수용부(51)와 제2수용부(52)는 상기 연동펌프유닛(30)을 본체(10)와 연결이 분리되고, 연동펌프유닛(30)의 카트리지(미도시)를 통해서 직접 연동펌프유닛(30)과 본체(10)가 순환연결되어 폐쇄순환관류 시스템을 구성할 수 있으며, 이때는 밸브를 통해서 용액 순환과 항생제 등 물질 유입을 제어할 수 있다.The first housing portion 51 and the second housing portion 52 are separated from the main body 10 by the peristaltic pump unit 30 so that the cartridge of the peristaltic pump unit 30 The peristaltic pump unit 30 and the main body 10 are directly connected to each other through the circulation pump unit 30 to form a closed circulating perfusion system. In this case, the circulation of the solution and the inflow of antibiotics can be controlled through the valve.

연동펌프유닛(30)의 작동으로 탈세포화 챔버 본체(10) 내의 제1 용액은 주입될 수 있다. 제1 용액 순환 속도는 제어부의 설정에 따라 달라질 수 있다.The operation of the peristaltic pump unit 30 allows the first solution in the degasification chamber body 10 to be injected. The first solution circulation rate may vary depending on the setting of the control unit.

순환 배관(311, 또는 312)는 상기 기관의 혈관 유사 연결구조의 일 단부와 연결되어 제1 용액이 기관의 혈관 유사 연결구조를 통해 기관 내부까지 용액이 순환될 수 있도록 한다.The circulation tubing 311 or 312 is connected to one end of the blood vessel-like connection structure of the organ so that the first solution can circulate the solution through the blood vessel-like connection structure of the organ to the inside of the organ.

밸브(40)는 3-Way 구조로 형성될 수 있으며 제1 순환배관(311) 상에 설치될 수 있다. 밸브(40)는 제1 순환배관(311)을 이동하는 제1 용액의 흐름을 단속할 수 있다. 밸브(40)는 공지의 3-Way 밸브가 적용될 수 있는바 이하 밸브(40)에 대한 자세한 설명은 생략한다.The valve 40 may be formed in a 3-way structure and may be installed on the first circulation pipe 311. The valve 40 can interrupt the flow of the first solution moving through the first circulation pipe 311. [ A detailed description of the valve 40 will be omitted since the valve 40 can be a known 3-way valve.

압력 조절부(50)는 진공펌프(도시하지 않음), 제어부(도시하지 않음)를 포함한다. 진공펌프는 적어도 하나의 예비포트(214)와 연결되어 있으며 제어부의 제어로 수용공간(11)의 압력을 제어할 수 있다. 상기 진공펌프는 필요에 따라 수용공간(11)의 압력을 부압의 상태로 유도할 수 있다.The pressure regulating unit 50 includes a vacuum pump (not shown) and a control unit (not shown). The vacuum pump is connected to at least one spare port 214 and can control the pressure of the accommodation space 11 under the control of the control unit. The vacuum pump can induce the pressure of the accommodation space 11 to a negative pressure state if necessary.

압력 조절부(50)의 세부적인 구성은 공지된 구성의 진공장치(압력 조절장치)와 동일하므로, 자세한 설명은 생략한다. 한편, 적어도 하나의 예비포트(214)에는 압력 조절부(50) 이외에도 기체 배출부(도시하지 않음) 등이 결합될 수 있다.The detailed configuration of the pressure regulating unit 50 is the same as that of the known vacuum apparatus (pressure regulating apparatus), and thus a detailed description thereof will be omitted. In addition, a gas discharge unit (not shown) may be coupled to at least one spare port 214 in addition to the pressure regulating unit 50.

상기 탈세포화 생물반응기 시스템은 위에서 설명한 기관의 탈세포화 방법을 적용하여 기관의 효율적인 탈세포화 과정 진행에 작용할 수 있다.The deagglomerated bioreactor system can operate in an efficient degassing process of the organ by applying the degassing method of the organ as described above.

본 발명은, 생체 내(in vivo)와 시험관 내(in vitro) 연구를 위해 활성 탈세포화 신장을 제조하는 방법과 이를 위한 생물반응기 시스템에 대한 것이다. 이 생물반응기 시스템은, 도 1에 나타낸 것처럼, 신장의 탈세포화를 진행할 수 있다.The present invention relates to a method for producing active de-saturated elongation for in vivo and in vitro studies and a bioreactor system therefor. This bioreactor system can proceed with de-saturation of the kidney, as shown in Fig.

상기 생물반응기 시스템은, 아래와 같이 분해 소독 후 재사용이 가능하도록 디자인되었다. 상기 생물반응기 시스템의 조립을 위한 구성요소들은 아래와 같다.The bioreactor system is designed to be reusable after disassembling and disinfection as described below. The components for assembling the bioreactor system are as follows.

1. 탈세포화 챔버 본체: 탈세포화 챔버로 유리병을 적용했다. 추출된 신장의 크기에 따라 유리병 탈세포화 챔버 본체의 개방홀의 크기는 선택하여 적용하였다.1. Degassing chamber body: A glass bottle was applied to the degassing chamber. Depending on the size of the extracted elongation, the size of the opening hole of the glass bottle degasification chamber body was selected and applied.

2. 제1수용부 및 제2수용부: 고용량 병을 충분한 량의 탈세포화용액과 세척용액을 수용할 수 있는 공간을 제공하기 위해 수용부로 적용하였다.2. First receptacle and second receptacle: A high capacity bottle was applied as a receptacle to provide sufficient space for deaeration and cleaning solution.

3. 포트와 마개: 멀티 포트 병 뚜껑을 포트를 포함하는 마개로 적용하였다. 실리콘 튜빙을 매칭하였다.3. Port and stopper: The multi-port bottle cap was applied with a stopper containing the port. Silicone tubing was matched.

4. 연결부(카테터): 추출된 신장의 크기에 맞는 다양한 크기의 카테터를 준비하였다.4. Connections (Catheters): Catheters of various sizes were prepared according to the size of the extracted kidneys.

5. 연결부: 실리콘 튜브를 적용하였다.5. Connection: Silicone tube was applied.

6. 접합부: 멀티 포트 캡, 실리콘 투브 그리고 카테터의 연결에 적용하였다.6. Connections: Applied to the connection of multi-port caps, silicone tubing and catheters.

7. 밸브: 의학용 3 포트 스탑콕을 준비하여 접합부를 이용해 접합하여 적용하였다.7. Valve: A medical three-port stopcock was prepared and joined with the joint.

8. 연동펌프유닛: 펌프 헤드와 카트리지를 갖는 펌프를 적용했다. 8. Peristaltic pump unit: A pump with a pump head and cartridge is applied.

9. 클린 벤치: 시스템 구성요소들의 조립 도는 탈세포화 과정이 수행되는 장소로 적용하였다.9. Clean Bench: The assembly of the system components was applied as the place where the de-saturation process was performed.

10. 탈세포화 용액: 멸균된 증류수에 헤파린, SDS(sodium dodecyl sulfate), 비이온계 계면활성제(Triton X-100)를 포함한 용액으로, 1 중량% 탈세포화 용액은 상기 비이온성 계면활성제와 SDS를 각각 1:1, 1:2, 1:3, 및 1:4의 중량비로 포함하며, 조직 단위 중량(mg)당 10 단위의 헤파린을 혼합하거나 혼합하지 않고 제조하였다.10. De-saturated solution: A solution containing heparin, sodium dodecyl sulfate (SDS) and nonionic surfactant (Triton X-100) in sterilized distilled water and a 1 wt% deaerated solution containing the nonionic surfactant and SDS Were prepared in a weight ratio of 1: 1, 1: 2, 1: 3, and 1: 4, respectively, with or without mixing 10 units of heparin per unit tissue weight (mg).

11. 세척액: 멸균된 증류수를 적용하였다.11. Washing solution: Sterile distilled water was applied.

12. 항생제: 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신 B를 항생제와 항진균제로 탈세포화된 신장에 적용하였다.12. Antibiotics: Penicillin, streptomycin, amphotericin B were applied to degenerated kidneys with antibiotics and antifungal agents.

13. 저장액: PBS(Phosphate buffered saline)을 탈세포화된 신장의 저장용 배양액으로 적용하였다.13. Stock solution: Phosphate buffered saline (PBS) was applied as a storage medium for depleted kidney.

14. 클램프: 톱니 모양의 중간 크기 곡선 지혈 클램프를 튜브를 부착하고 신장 조직을 부착 및 탈착 시 사용하였다.14. Clamp: Serrated mid-size curved hemostatic clamp was attached to the tube and used to attach and detach kidney tissue.

위의 모든 구성요소들은, 도 2에 나타낸 것과 같이 조립된 후 실험에 적용되었다.All the above components were assembled as shown in FIG. 2 and then applied to the experiment.

이렇게 조립된 탈세포화 생물반응기 시스템을 이용하여 아래 과정으로 탈세포화 과정을 진행했다.The degasification process was carried out using the degassed bioreactor system thus assembled as follows.

1. 신장의 적출: 적정량의 마취제와 항응고제가 투입되어 충분히 마취된 동물으로부터 신장을 적출하였다. 신장에 연결된 주요 혈관과 요관은 삽관할 수 있을 정도로 충분한 길이로 절단하였다. 1. Extraction of kidneys: Anesthetics and anticoagulants were injected in appropriate amounts and kidneys were extracted from anesthetized animals. The major vessels and ureters connected to the kidney were cut to length sufficient to allow intubation.

2. 카테토 삽입: 추출된 신장은 매듭 봉합으로 카테터 삽입 지점을 단단하게 고정했고, 주입포트와 연결되는 부분과 허브 지점은 신장 동맥과 요관에 적용하여 카테터를 삽입해 삽관된 신장을 준비했다(도 3 참고).2. Insertion of catheter: Extracted kidney was tightly fixed with knot suture, and the part connected to the injection port and the hub point were applied to the kidney artery and ureter, and the catheter was inserted to prepare the intubated kidney 3).

3. 탈세포화 용액의 준비: 삽관된 신장을 반응기 내로 이동시키기 전에, 상기 조립된 탈세포화 반응기 시스템의 제1수용부에 멸균된 1 중량%의 탈세포화 용액을 주입하였다. 포트 중 주입포트에 연결된 튜브를 이용하여, 탈세포화 챔버 본체로 선행성 관류로 용액이 주입될 수 있도록 하였다. 포트 중 드레인포트에 연결된 튜브를 이용하여, 챔버 본체로부터 용액이 배출될 수 있도록 하였으며, 주입 튜브쪽으로부터 공기가 제거될 수 있도록 탈세포화용액을 챔버 본체에 미리 채워놓았다(도 3 참고).3. Preparation of de-saturated solution: Prior to transferring the intubated kidney into the reactor, 1% by weight de-saturated solution of sterilized sterilized solution was injected into the first container of the assembled degasification reactor system. A tube connected to the injection port of the port was used to allow the solution to be injected into the de-saturatedization chamber body by the prior art perfusion. A tube connected to the drain port of the port was used to allow the solution to be drained from the chamber body and the degassed solution was pre-filled in the chamber body so that air could be removed from the injection tube side (see FIG. 3).

4. 챔버 내에 신장의 배치: 삽관된 신장은 실리콘 튜브에 연결되어 탈세포화 챔버 내에 위치하게 되며, 부착 과정은 기포의 유입을 방지하게 위해 세심한 주의 하에 수행되었다(도 3 참고).4. Arrangement of the kidney in the chamber: The intubated kidney was connected to the silicone tube and placed in the de-saturating chamber, and the attachment process was carried out with care to prevent inflow of air bubbles (see FIG. 3).

5. 탈세포화 1: 1 중량%의 탈세포화 용액의 관류를 250?L/minute의 속도로 시작하였고, 최초 속도 이후 매분 250?L의 유속을 상승시켜 유속이 1500?L/minute이 될때까지 상승시켰다. 신장혈관과 요로를 통해서 유출되는 초기 용액은 적절한 흐름으로 진행되고 신장으로부터 잘 배출되는지 주의 깊게 관찰되었다. 눈에 보이는 용액 색의 감소가 보일 때까지 상기 용액을 이용한 탈세포화과정이 4 내지 10 시간 동안 계속되었다(도 4 참고). 5. Decellitization: The perfusion of 1: 1 wt% de-saturated solution was started at a rate of 250 L / minute, and then increased to 250 L / min after the initial velocity and then increased until the flow rate reached 1500 L / . Initial solutions flowing through the renal vessels and the urinary tract proceeded with proper flow and carefully observed to be well discharged from the kidneys. The de-saturation process with the solution continued for 4 to 10 hours until a visible reduction in solution color was seen (see FIG. 4).

6. 탈세포화 2: 신장이 전체적으로 균일하게 투명한 형태가 되면, 탈세포화 챔버와 제1수용부에서 완전히 상기 탈세포화 용액을 드레인 포트를 통해서 배출시키고, 제1수용부를 멸균된 물로 채운 후, 다시 1500 ?L/minute의 유속으로 1 시간 동안 남아있는 탈세포화 용액을 제거하였다(도 4 참고).6. Deaeration 2: When the elongation becomes uniform as a whole, the deaerating chamber and the first receiving portion completely discharge the deaerated solution through the drain port, the first receiving portion is filled with sterilized water, The deaerated solution remained for 1 hour at a flow rate of? L / minute was removed (see FIG. 4).

7. 탈세포화 3: 탈세포화 챔버 본체와 제1수용부의 용액을 제거하고 멸균된 PBS를 채워 넣었다. 관류는 1 시간 동안 1750?L/minute의 유속으로 진행되었다. 관류는 순간적으로 항생제 등을 주입할 수 있도록 중단되고, 주입 튜브와 드레인 튜브의 서로 연결하여 완전한 패쇄 시스템이 구성되도록 하였다. 항생제 등이 순환될 수 있도록 추가적으로 15분 동안 관류를 동일한 속도로 진행했다. 관류과 완료된 후의 탈세포화 챔버 본체와 탈세포화 처리가 완료된 신장 조직의 사진을 도 5에 나타내었다.7. De-saturating 3: The solution of the deaeration chamber main body and the first accommodation portion was removed and filled with sterilized PBS. The perfusion was carried out at a flow rate of 1750? L / minute for 1 hour. The perfusion was stopped so that the antibiotics and the like could be instantaneously injected, and the injection tube and the drain tube were connected to each other to form a complete containment system. The perfusion was run at the same rate for an additional 15 minutes so that the antibiotics could circulate. FIG. 5 shows photographs of perfusion, deaeration chamber body after completion, and kidney tissue having undergone de-saturatedization treatment.

8. 분리 및 보관: 항행제 등의 투여가 완료된 후, 탈세포화된 신장은 탈세포화 챔버 본체로부터 분리되어 PBS 용액 내에 보관되고 사용 전까지 동결시켜 보관하였다.8. Separation and Storage: After the administration of the agonist, the de-saturated kidney was separated from the de-saturatedization chamber body and stored in PBS solution and stored frozen until use.

이렇게 제조된 탈세포화된 신장 조직의 화학적, 형태적 특징을 관찰하여 도 6 내지 9에 나타내었다. The chemical and morphological characteristics of the degenerated renal tissue thus prepared are shown in Figs. 6 to 9.

도 6은 위의 실험으로 소동물 신장의 탈세포 처리를 진행 후 내부 혈관의 손상 여부를 확인한 형태학적 실험 결과를 보여주는 사진이다. 우측 사진으로, 붉은색 염료의 관류를 통해 탈세포화된 신장 기관의 혈관이 잘 보전되어 있다는 점을 시각화하였다. 도 7은 위의 방법으로 제조한 소동물 신장의 탈세포 처리 후에도 미세구조가 잘 유지되어 있음을 H&E 염색과 메이슨 트리크롬 염색으로 확인한 결과를 보여주는 사진이다. 또한, 도 8은 위의 방법으로 제조한 소동물 신장의 탈세포 처리 후 샘플을 이용하여 샘플 내에 유전물질이 얼마나 감소하였는지를 보여주는 DNA 정량시험 결과를 보여주는 그래프이다. FIG. 6 is a photograph showing the result of morphological experiment confirming the damage of inner blood vessels after decellularization of small animal kidneys by the above experiment. On the right side, we visualized that blood vessels of the renal vein that were depleted through the perfusion of red dye were well preserved. FIG. 7 is a photograph showing the results of H & E staining and mason trichrome staining showing that the microstructure is well maintained even after decellularization of small animal kidney prepared by the above method. FIG. 8 is a graph showing a DNA quantitation test result showing how much the genetic material is reduced in the sample using the sample after decellularization of a small animal's kidney prepared by the above method.

위의 도 6 내지 도 8의 결과를 참고하면, 실험에 적용한 신장 조직은, 탈세포화 과정을 통해서 내부의 유전물질은 현저하게 감소하였으나, 미세구조나 혈관조직 등은 그 형태와 구조가 잘 유지되고 있다는 점을 확인할 수 있었다. Referring to the results of FIGS. 6 to 8, in the kidney tissues applied to the experiment, the degeneration of the internal genetic material was remarkably reduced through the decarburization process, but the microstructure and vascular tissues were well maintained in shape and structure .

도 9는 본 발명의 일 실시예에서 제조한 탈세포화된 신장 샘플을 이용하여 세포 접종을 실시하고(A-CPAE와 B-Podocytes) 7일 동안 관류를 실시한 후에 살아있는 세포의 모습을 보여주는 사진이다. 본 발명의 방법으로 탈세포화를 진행한 신장 조직은, 포 시딩과 관류의 방법으로 미세구조 내에 세포가 잘 잔류하여 부착하고 배양될 수 있다는 점을 보여주는 결과이다.FIG. 9 is a photograph showing the appearance of living cells after performing cell inoculation (A-CPAE and B-Podocytes) using the de-fatified kidney sample prepared in one embodiment of the present invention and perfusing for 7 days. The kidney tissue that has undergone de-saturation by the method of the present invention shows that cells can be well adhered and cultured in the microstructure by the method of forcing and perfusion.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments, Of the right.

1: 탈세포화 생물반응기 시스템 10: 탈세포화 챔버 본체
11: 수용공간 12: 개방홀
20: 마개 21: 포트
211: 제1 펌프포트 212: 제2 펌프포트
211a, 212a: 관통홀 213: 기관포트
213a: 카테터 214: 예비포트
30: 연동펌프유닛 311: 제1 순환배관
312: 제2 순환배관 40: 밸브
50: 압력조절부 51: 제1수용부
52: 제2수용부1: de-saturated bioreactor system 10: deaeration chamber body
11: accommodation space 12: open hole
20: plug 21: port
211: first pump port 212: second pump port
211a, 212a: through hole 213: engine port
213a: catheter 214: spare port
30: peristaltic pump unit 311: first circulation pipe
312: second circulation pipe 40: valve
50: pressure regulating portion 51: first accommodating portion
52:

Claims (9)

적출된 기관과 탈세포화 반응기 본체 내부와 연동펌프유닛을 연결하는 제1펌프포트를 연결하는 과정을 포함하여 삽관된 기관을 준비하는 전처리단계;
상기 제1펌프포트를 통해서 상기 삽관된 기관에 탈세포화용액을 주입하고, 상기 삽관된 기관을 통과한 탈세포화용액을 제2펌프포트를 통해서 상기 탈세포화 반응기 본체로부터 제거되는 과정을 포함하여 관류의 방법으로 기관의 탈세포화를 유도하는 탈세포화처리 단계;를 포함하고,
상기 탈세포화용액은, SDS(sodium dodecyl sulfate), 비이온계 계면활성제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 용액을 각각 또는 동시에 상기 탈세포화처리단계에 적용하는, 기관의 탈세포화 방법.A pre-treatment step of preparing an intubated engine including a step of connecting the extracted organs and a first pump port connecting the peritolization reactor main body and the peristaltic pump unit;
Introducing a deaerated solution into the intubated organ through the first pump port and removing the deaerated solution passing through the intubated engine through the second pump port from the deaerated gasification reactor main body, And a deaeration treatment step of inducing deaeration of the organ by the method,
Wherein the de-saturated solution is applied to the de-saturation treatment step, separately or simultaneously, with a solution comprising a material selected from the group consisting of sodium dodecyl sulfate (SDS), a non-ionic surfactant, . 제1항에 있어서, 상기 기관은,
사람 또는 동물의 신장인, 기관의 탈세포화 방법.The apparatus of claim 1,
A method for de-saturation of an organ, the kidney of a human or animal. 제1항에 있어서, 상기 탈세포화처리 단계는,
0.5 내지 5 중량%의 SDS(sodium dodecyl sulfate)과 상기 SDS를 기준으로 0.5 내지 5의 중량비로 함유되는 비이온성 계면활성제를 포함하는 탈세포화용액을 적용하며, 분당 150 내지 400 μL/minute 유속상승속도로 1000 내지 2000 μL/minute 의 목표유속까지 유속을 상승시키는 과정을 포함하여 진행되는, 기관의 탈세포화 방법.The method according to claim 1, wherein the de-
A deodorizing solution containing 0.5 to 5% by weight of sodium dodecyl sulfate (SDS) and a nonionic surfactant in a weight ratio of 0.5 to 5 based on the SDS is applied, and a flow rate rise rate of 150 to 400 μL / And increasing the flow rate to a target flow rate of from 1000 to 2000 [mu] L / minute. 제1항에 있어서, 상기 탈세포화처리 단계는,
0.5 내지 5 중량%의 SDS(sodium dodecyl sulfate) 용액으로 관류를 진행하는 제1과정; 및 0.5 내지 20 중량%의 비이이온성 계면활성제 용액으로 관류를 진행하는 제2과정;을 포함하여 진행되는, 기관의 탈세포화 방법.The method according to claim 1, wherein the de-
0.5 to 5% by weight of SDS (sodium dodecyl sulfate) solution; And 0.5 to 20% by weight of a non-ionic surfactant solution. 제4항에 있어서,
상기 제1과정은, 분당 150 내지 400 μL/minute 유속상승속도로 1000 내지 2000 μL/minute 의 목표유속까지 유속을 상승시켜 진행하는 것인, 기관의 탈세포화 방법.5. The method of claim 4,
Wherein the first step proceeds by increasing the flow rate to a target flow rate of 1000 to 2000 L / minute at a flow rate ramp rate of 150 to 400 [mu] L / minute per minute. 제4항에 있어서,
상기 제2과정은, 1000 내지 2000 μL/minute의 유속으로 진행되고,
상기 제2과정 이후에는, 완충용액으로 관류를 진행하는 제3과정;을 더 포함하며, 상기 제3과정은, 1000 내지 2000 μL/minute의 유속으로 진행되는, 기관의 탈세포화 방법.5. The method of claim 4,
The second process is performed at a flow rate of 1000 to 2000 L / minute,
And a third step of performing perfusion with the buffer solution after the second step, wherein the third step is performed at a flow rate of 1000 to 2000 L / minute. 제1항에 있어서, 상기 탈세포화처리단계는,
상기 삽관된 기관에, 항생제를 주입한 용액을 폐쇄순환 관류시키는 항생제처리과정을 더 포함하는, 기관의 탈세포화 방법.The method according to claim 1, wherein the de-
Further comprising an antibiotic treatment step of subjecting the intubated organ to a closed circulation perfusion of a solution into which the antibiotic is injected. 내부에 삽관된 기관을 수용하는 수용공간이 형성되어 있고 상기 수용공간과 연결된 개방홀을 가지는 본체;
연동펌프유닛과 상기 수용공간 내부 또는 상기 수용공간 내부에 위치하는 삽관된 기관과 연결되는 제1 펌프포트와 상기 수용공간 내부와 연결된 제2 펌프포트를 포함하는 포트;
상기 포트를 가지며 상기 본체에 분리할 수 있게 결합되어 상기 개방홀을 열고 닫는 마개;
상기 포트를 통해 상기 수용공간 내부 또는 상기 수용공간 내부에 위치하는 삽관된 기관과 연결되는 연동펌프유닛; 및
상기 연동펌프유닛을 통해 상기 제1펌프포트로 제1용액을 공급하는 제1수용부를 포함하는 수용부유닛을 포함하는, 탈세포화 생물반응기 시스템.A main body having an accommodating space for accommodating an intubation engine therein and having an opening hole connected to the accommodating space;
A port including a peristaltic pump unit and a first pump port connected to an intubated organs located inside or within the containing space and a second pump port connected to the inside of the containing space;
A cap having the port and releasably coupled to the body to open and close the opening;
A peristaltic pump unit connected to an intubated organs located in the interior space or inside the interior space through the port; And
And a first accommodating portion for supplying a first solution to the first pump port through the peristaltic pump unit. 제8항에 있어서,
상기 연동펌프유닛과 상기 포트 사이에 위치하여 연동펌프유닛에 의하여 구동되는 용액의 흐름을 제어하는 밸브;를 더 포함하는, 탈세포화 생물반응기 시스템.9. The method of claim 8,
And a valve located between the peristaltic pump unit and the port to control the flow of solution driven by the peristaltic pump unit.
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