KR20180002361A - Probe for detecting HSP70 and manufacturing method thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 HIF-1 활성을 저해하는 화합물인 IDF-11774의 표적 단백질로서 HSP70을 탐지하는 프로브 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a probe that detects HSP70 as a target protein of IDF-11774, which is a compound that inhibits HIF-1 activity, and a method for producing the same.
열충격 단백질 (HSP, Heat Shock Protein)은 진핵세포가 환경적으로 고열 또는 스트레스를 받게 되면 그 피해를 최소화하기 위해 열충격 반응이라 불리는 방어기작을 발동한다.Heat Shock Protein (HSP) activates a defense mechanism called a thermal shock reaction to minimize the damage of eukaryotic cells when they are environmentally high or stressed.
열충격단백질 중에서 특히 분자량이 70 kDa인 HSP70의 경우, 그 패밀리로 열충격에 의해 발현이 유도되는 HSP70 (HSPA1A, HSPA1B), 열충격에 관계 없이 지속적으로 발현되는 HSC70 (HSPA8), 소포체에 존재하는 BiP (GRP78, HSPA5) 및 미토콘드리아에 존재하는 mortalin (HSPA9) 등이 있다. HSP70 단백질은 진핵세포에 보존되어 있는 열충격단백질로 기관, 조직 특이적인 기능이 있으며 중금속, 바이러스 감염, 열, 저산소증 등과 같은 다양한 유해자극에 스트레스 환경에서 세포를 보호하기 위한 여러 기능을 수행하고 있다.Among the heat shock proteins, HSP70 having a molecular weight of 70 kDa, HSP70 (HSPA1A, HSPA1B), HSP70 (HSPA8) and HSP70 (HSPA8) which are continuously expressed regardless of thermal shock, BiP , HSPA5) and mortalin present in mitochondria (HSPA9). HSP70 protein is a heat shock protein conserved in eukaryotic cells. It has organ and tissue specific functions and performs various functions to protect cells in stress environment against various harmful stimuli such as heavy metals, virus infection, heat, hypoxia and the like.
또한, HSP70은 다양한 기능을 가진 분자샤페론으로서 새롭게 합성된 단백질의 폴딩, 응집된 단백질의 용해, 표적 단백질의 분해 등의 기능을 가진다. 동물세포에 존재하는 HSP70은 인간의 다양한 암종에서 과량 발현되어 있으며, HSP70의 샤페론 활성은 이러한 발현현상을 통해 암의 악성화, 임상적 단계, 예후를 예측할 수 있는 바이오마커 뿐 아니라 암 차료의 표적으로 여겨지고 있다. 이에, HSP70은 HSP90과 함께 중요한 항-종양 물질 개발의 표적으로 부상하고 있다. 최근 HSP70의 작용 기전 조절 및 암에서의 역할에 대해 많은 연구가 이루어지고 있으며 HSP70 저해제 연구가 활발하게 이루어지고 있다.In addition, HSP70 is a multifunctional molecular chaperone that has functions such as folding newly synthesized proteins, dissolving aggregated proteins, and degrading target proteins. HSP70 present in animal cells is overexpressed in various human carcinomas. Chaperone activity of HSP70 is considered to be a target of cancer as well as biomarkers that can predict cancer malignancy, clinical stage and prognosis through such expression have. Thus, HSP70, along with HSP90, is emerging as an important anti-tumor substance development target. Recently, many studies have been conducted on the mechanism of action of HSP70 and its role in cancer, and HSP70 inhibitors have been actively studied.
현재, 다양한 기전의 HSP70 저해제가 개발되고 있으며, i) HSP70의 ATPase 활성 저해, ii) HSP70의 알로스테릭 조절, iii) HSP70과 상호작용하는 J-도메인 단백질 패밀리 또는 nucleotide exchange factors를 표적으로 하는 약물이 있다. 잘 알려진 VER-155008은 HSP70의 NBD (nucleotide binding domain, 핵산 결합도메인)의 ATP-binding 포켓에 결합하여 HSP70 의 ATPase 활성을 저해한다. 한편, 2-phenylethynesulfonamide (PES)는 HSP70의 SBD (substrate binding domain, 기질 결합도메인) 에 결합하여 HSP70의 다른 코샤페론과의 결합을 억제한다.Currently, various mechanisms of HSP70 inhibitors are being developed and include: i) inhibition of ATPase activity of HSP70, ii) allosteric modulation of HSP70, iii) J-domain protein family interacting with HSP70 or drugs targeting nucleotide exchange factors . The well-known VER-155008 binds to the ATP-binding pocket of the NBD (nucleotide binding domain) of HSP70 and inhibits the ATPase activity of HSP70. On the other hand, 2-phenylethynesulfonamide (PES) binds to the SBD (substrate binding domain) of HSP70 and inhibits the binding of HSP70 to other co-chaperones.
HIF-1(Hypoxia Inducible Factor-1)는 저산소증(hypoxia)에서 유도되는 전사인자로서 산소 의존적으로 분해되는 HIF-1α 서브유니트(subunit)와 항시 발현되는 HIF-1β 서브유니트로 구성된 헤테로 다이머(dimer)로서[Cancer Metastasis Rev. 17, 187-195, 1998; Trends Mol. Med. 7, 345-350, 2001], 보통의 산소 농도 조건하에서 HIF-1α 단백질은 산소 의존적으로 402번 및 564번의 프롤린 잔기가 하이드록시화되어 암 억제 유전자인 pVHL(Von Hippel-Lindau)단백질과 결합하여 유비퀴틴(ubiquitin)화되고 프로테아좀에 의해 분해된다. 그러나, 저산소 상태에서는 이러한 일련의 반응이 저해되어 HIF-1α 단백질이 축적되어 이미 존재하고 있는 HIF-1β 단백질과 결합하여 핵으로 이동하게 된다[Science 292, 468-472, 2001]. Hypoxia Inducible Factor-1 (HIF-1) is a hypoxia-inducible transcription factor that is heterodimerized by a HIF-1α subunit and a HIF-1β subunit. [Cancer Metastasis Rev. 17, 187-195, 1998; Trends Mol. Med. 7, 345-350, 2001] Under normal oxygen concentration conditions, the HIF-1α protein is oxygen-dependent and the proline residues 402 and 564 are hydrolyzed to bind to the cancer suppressor gene pVHL (Von Hippel-Lindau) It is converted to ubiquitin and degraded by proteasome. However, in the hypoxic state, this series of reactions is inhibited and HIF-1α protein accumulates and binds to the existing HIF-1β protein and moves to the nucleus (Science 292, 468-472, 2001).
HIF-1β 단백질의 발현은 비교적 일정하므로 HIF-1의 작용은 주로 HIF-1α의 안정성 및 발현 조절에 의존적이다. HIF-1α의 안정성은 산소분압 외에도 산소감지경로(oxygen sensing pathway)에 관여하는 인자들에 의해 영향을 받게 되며, 이러한 인자들로는 전이금속 이온(transition metal ion), 철 킬레이트제(iron chelator) 또는 항산화제(antioxidant) 등을 들 수 있다. 또한, HIF-1α 단백질은 산소 농도에 상관없이 표피 성장 인자(epidermal growth factor), 헤레굴린(heregulin), 인슐린 유사 성장인자-I(insulin-like growth factors-I)과 인슐린 유사 성장인자-II 등과 같은 성장인자(growth factor)나 암유발과 관련된 HER2등의 성장인자 수용체의 활성화에 의해 축적되기도 한다. 이러한 성장인자들이 각자의 수용체에 결합하게 되면 PI3K-AKT, MAPK 신호전달경로가 활성화되고 HIF-1α 단백질의 합성이 증가되어 HIF-1α 단백질이 축적된다.Since the expression of HIF-1? Protein is relatively constant, the action of HIF-1 depends mainly on the stability and expression regulation of HIF-1 ?. In addition to oxygen partial pressure, the stability of HIF-1α is influenced by factors involved in the oxygen sensing pathway, including transition metal ions, iron chelator, Antioxidants and the like. In addition, the HIF-1α protein has no effect on the expression of epidermal growth factor, heregulin, insulin-like growth factors-I and insulin-like growth factor-II And may be accumulated by activating growth factor receptors, such as HER2, which are associated with the same growth factor or cancer induction. When these growth factors bind to their respective receptors, the PI3K-AKT, MAPK signaling pathway is activated and the synthesis of HIF-1α protein is increased to accumulate HIF-1α protein.
핵으로 이동한 HIF-1α/HIF-1β는 표적 유전자의 프로모터(promoter)상의 HRE(Hypoxia Responsive Element, 5′-ACGTG-3′)에 결합하여 표적 유전자의 발현을 유도하게 되는데 HIF-1에 의해 조절되는 유전자로는 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor A, VEGFA)를 포함하여 현재까지 약 100 여종 이상이 알려져 있다(Nat. Rev. Cancer 2, 38-47, 2002; J. Biol. Chem. 278, 19575-19578, 2003; Nat, Med. 9, 677-684, 2003; Biochem. Pharmacol. 64, 993-998, 2002).HIF-1α / HIF-1β transferred to the nucleus binds to the HRE (Hypoxia Responsive Element, 5'-ACGTG-3 ') on the promoter of the target gene and induces the expression of the target gene. More than 100 species have been identified to date, including vascular endothelial growth factor A (VEGFA) (Nat. Rev. Cancer 2, 38-47, 2002; J. Biol. Chem. 278, 19575-19578, 2003, Nat, Med., 9, 677-684, 2003; Biochem. Pharmacol. 64, 993-998, 2002).
암, 특히 고형암에서 저산소증은 일반적으로 나타나는 현상으로서, 고형암세포들은 다양한 유전적인 변화를 거쳐 이러한 저산소 조건에 적응되어 있어 암세포가 더욱 악성화 되고 항암제에 대한 내성을 갖게 되는데, 실제로 저산소증은 인간의 모든 암종의 70% 이상의 암을 악성화 시키는 주요 유발인자로서 알려져 있다 (Nature 386, 403, 1997; Oncol. 28, 36-41, 2001, Nat. Med. 6, 1335, 2000; Cancer 97, 1573-1581, 2003).Hypoxia is a common phenomenon in cancer, especially solid cancer. Solid cancer cells are adapted to these hypoxic conditions through various genetic alterations, making cancer cells more malignant and resistant to anticancer drugs. In fact, (Nature 386, 403, 1997; Oncol. 28, 36-41, 2001, Nat. Med. 6, 1335, 2000; Cancer 97, 1573-1581, 2003) .
HIF-1은 이러한 저산소 상태에 대한 암세포의 적응을 조절하는 가장 중요한 분자로서 알려져 있고, 특히 HIF-1α 단백질의 양과 암 환자의 예후는 밀접한 상관관계를 갖는 것으로 알려져 있다. 암세포가 저산소 조건에 의해 또는 상기에서 언급한 성장 인자의 자극이나 온코진(oncogene)의 활성화, 또는 pVHL과 같은 암 억제유전자의 불활성화에 의해 활성화된 HIF-1α는 헥소키나아제 2(hexokinase 2), 글루코스 전달체 1(glucose transporter 1), 에리쓰로포이에틴(erythropoietin), IGF-2, 엔도글린(endoglin), VEGFA, MMP-2, uPAR, MDR1 등과 같은 유전자의 발현을 유도하여 세포사멸(apoptosis)에 대한 내성, 혈관신생능의 증가, 세포증식능의 증가, 세포 이동(cell migration, metastasis) 및 침윤(invasion)능의 증가 등의 형질을 획득하게 되어 결국 암 세포는 악성화 된다.HIF-1 is known to be the most important molecule that regulates the adaptation of cancer cells to such hypoxic conditions. In particular, it is known that the amount of HIF-1α protein has a close correlation with the prognosis of cancer patients. HIF-1α activated by cancer cells under hypoxic conditions or by inactivation of growth factor stimulation or oncogene as mentioned above or by inactivation of cancer suppressor genes such as pVHL is induced by
또한, HIF-1 단백질의 활발한 활동은 종양의 성장을 촉진시키면서 화학요법이나 방사능 치료의 효과를 방해하여 환자들의 상태를 악화시키는 것으로 알려지고 있다. 이와 같이 HIF-1은 암, 특히 고형암의 성장, 증식 및 악성화에 중요한 역할을 하기 때문에 이를 표적으로 하여 항암제를 개발하려는 연구가 매우 활발히 진행되고 있다(Cancer Res. 62, 4316, 2002; Nat Rev. Drug Discov. 2, 1, 2003; Nat. Rev. Cancer 3, 721-732, 2003).In addition, the active activity of HIF-1 protein is known to promote the growth of tumors and deteriorate the condition of patients by interfering with the effectiveness of chemotherapy or radiation therapy. Since HIF-1 plays an important role in the growth, proliferation and malignancy of cancer, particularly solid cancer, researches to develop an anticancer drug targeting HIF-1 have been actively conducted (Cancer Res. 62, 4316, 2002; Rev. Cancer 3, 721-732, 2003).
최근, 이러한 HIF-1 억제제의 증가가 보고되고 있으며, HIF-1 억제제로서의 후보물질은 mTOR C1/C2 억제제, HIF-1 분해 억제제 및 토포아이소머라제 억제제를 포함한다. 현재, 잠재적 후보물질인 PX-487 및 BAY-87-2243의 임상 연구가 발표되었고, 다양한 조합의 치료를 위한 몇 가지 토포아이소머라제 억제제가 현재 임상 연구 단계에 있으며, 다른 작은 분자는 여전히 발견 단계에 남아 있다. Recently, an increase in such HIF-1 inhibitors has been reported, and candidate substances as HIF-1 inhibitors include mTOR C1 / C2 inhibitors, HIF-1 degradation inhibitors and topoisomerase inhibitors. Currently, clinical studies of potential candidates, PX-487 and BAY-87-2243, have been published and several topoisomerase inhibitors for various combinations of treatments are currently in clinical trials, Lt; / RTI >
HIF-1 억제제로, 본 발명자들에 의해 공개(한국등록특허 제10-1380466호 참조)된 IDF-11774(2-(4-(아다만탄-1-일)페녹시)-1-(4-메틸피페라진-1-일)에탄온)는 현재까지 연구 결과, AMPK효소(AMP-activated protein kinase) 활성화를 통해 포도당 의존성 해당 작용 및 산화적 인산화를 모두 억제하여 HIF-1을 저해하고, 결과적으로는 종양을 억제하는 작용을 보였다. 또한 HIF에 의해 촉진되는 상피간엽이행(EMT, Epithelial-Mesenchymal Transition) 등과 같이 암 조직 주위의 미세환경(cancer microevirinment) 변화에 영향을 주는 신호전달계를 조절할 뿐 아니라 암 조직 내에 암의 주요 면역 회피기전인 PD-L1(Programmed death - ligand 1)의 발현을 강력히 억제하여 면역조절 항체와의 병용투여시험에서 높은 시너지 효과를 나타내었다. 11774 (2- (4- (adamantan-1-yl) phenoxy) -1- (4-methoxyphenyl) -1H-pyrazolo [l, -Methylpiperazin-1-yl) ethanone) inhibits HIF-1 by inhibiting both glucose-dependent action and oxidative phosphorylation through activation of AMP-activated protein kinase, Showed tumor suppression. In addition to regulating signal transduction systems that affect the microenvironment (cancer microevirinment) around cancer tissues such as HIF-induced epithelial-mesenchymal transition (EMT) PD-L1 (Programmed death-ligand 1) expression was strongly inhibited and showed synergistic effect in combination administration with immunosuppressive antibody.
또한, IDF-11774는 약제 내성 돌연변이에 관련된 각종 암 모델의 이종 이식 분석에서 유의한 항암 효과를 나타내어, IDF-11774 단독으로 또는 암 치료의 다른 약물과 함께 사용할 수 있음을 시사하고 있으나, 아직 IDF-11774의 표적 분자가 무엇인지는 알려져 있지 않았다.In addition, IDF-11774 showed significant anticancer effects in xenotransplantation analysis of various cancer models related to drug-resistant mutations, suggesting that IDF-11774 can be used alone or in combination with other drugs for cancer treatment. However, IDF- It was not known what the target molecule of 11774 was.
형질 기반 스크리닝으로부터 발견한 신규 화합물의 분자 표적 식별은 그 화합물의 작용 기전을 이해하는 데 중요하며, 현재 친화 크로마토그래피(affinity chromatography), 약물 선호도 응답 대상 안정성(DART), 생물 모델을 이용한 유전 적 상호 작용 및 활성 기반 프로브(ABPs)를 사용한 생화학적 접근 등 다양한 방법이 이용되고 있다. 특히, 광친화 반응을 이용한 생화학적 기술은 새롭게 발견된 화합물의 생물학적 타겟을 확인하는 데 유용하고 믿을 만한 기술로 여겨진다.Molecular target identification of novel compounds found from trait-based screening is important for understanding the mechanism of action of the compounds and is currently used for affinity chromatography, DART for drug preference response, And a biochemical approach using active-based probes (ABPs). In particular, biochemical techniques using photoaffinity reactions are considered useful and reliable techniques for identifying biological targets for newly discovered compounds.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 IDF-11774의 표적 분자를 확인하기 위한 프로브를 연구하던 중, 광친화 반응을 위한 트리플루오로메틸 디아지린, 클릭 반응을 위한 아세틸렌을 부착한 프로브 및 표적 분자 검출을 위한 바이오티닌을 결합하여 제작한 프로브를 통해 IDF-11774의 표적 단백질이 HSP70임을 발견하고, 이의 HSP70 샤페론 억제 활성을 확인하고 본 발명을 완성하였다.DISCLOSURE Technical Problem The present invention has been conceived to solve the above-mentioned problems in the prior art, and the present inventors have studied a probe for identifying a target molecule of IDF-11774, and have found that the use of trifluoromethyl diazyl The inventors discovered that the target protein of IDF-11774 was HSP70 through the acetylene-attached probe for reaction and the probe prepared by combining biotinin for target molecule detection, and confirmed its HSP70 chaperone inhibitory activity and completed the present invention.
이에, 본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a compound represented by the following formula (1).
[화학식 1][Chemical Formula 1]
본 발명의 다른 목적은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a compound represented by the following formula (2).
[화학식 2](2)
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a process for the preparation of the compound of formula (I) or (II).
또한, 본 발명의 다른 목적은 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 포함하는, HSP70(Heat shock protein 70) 탐지용 프로브를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a probe for detecting HSP70 (Heat shock protein 70) comprising a compound of the following formula (1) or (2).
[화학식 1][Chemical Formula 1]
[화학식 2](2)
또한, 본 발명의 다른 목적은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 HSP70(Heat shock protein 70) 억제용 시험관 (in vitro) 내 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition in vitro for inhibiting HSP70 (Heat shock protein 70) comprising a compound represented by the following formula (3) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient .
[화학식 3](3)
상기 화학식 3에서,In Formula 3,
R1은 H 또는 
R2는 H, 
또한, 본 발명의 다른 목적은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 호흡 억제용 시험관 (in vitro) 내 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for in vitro mitochondrial respiratory depression comprising a compound represented by the following formula (3) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
[화학식 3](3)
상기 화학식 3에서,In Formula 3,
R1은 H 또는 
R2는 H, 
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a compound represented by the following general formula (1).
[화학식 1][Chemical Formula 1]
본 발명은 또한, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 제공한다.The present invention also provides a compound represented by the following general formula (2).
[화학식 2](2)
본 발명은 또한, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공한다.The present invention also provides a process for producing a compound represented by the following general formula (1).
[화학식 1][Chemical Formula 1]
(a) 에틸 2-(4-아다만탄-1-일-2-(3-(트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)페녹시)아세테이트를 리튬 하이드록사이드 모노하이드레이트와 반응시켜 제 1 중간체로서 2-(4-아다만탄-1-일-2-(3-트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)페녹시)아세트산 화합물을 생성하는 단계; (b) 상기 제 1 중간체를 1-(프로프-2-인일)피페라진과 반응시켜 프로브 화합물인 2-(4-아다만탄-1-일-2-(3-트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)페녹시)-1-(4-(프로프-2-인일)피페라진-1-일)에탄온을 생성하는 단계를 포함한다.(a) Synthesis of ethyl 2- (4-adamantan-l-yl-2- (3- (trifluoromethyl) -3H-diazirin- 3-yl) phenoxy) acetate with lithium hydroxide monohydrate Reacting to produce 2- (4-adamantan-1-yl-2- (3-trifluoromethyl) -3H-diazirin-3-yl) phenoxy) acetic acid compound as a first intermediate; (b) reacting said first intermediate with 1- (prop-2-ynyl) piperazine to form 2- (4-adamantan-l-yl-2- (3- trifluoromethyl) 3-yl) phenoxy) -1- (4- (prop-2-ynyl) piperazin-1-yl) ethanone.
본 발명은 또한, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공한다.The present invention also provides a process for producing a compound represented by the following general formula (2).
[화학식 2](2)
(a) (4-아다만탄-1-일-페녹시)아세트산과 터트-뷰틸 피페라진-1-카복실레이트를 반응시켜 제 1 중간체로서 터트-뷰틸 4-(2-(4-아다만탄-1-일페녹시)아세틸)피페라진-1-카복실레이트 화합물을 생성하는 단계; (b) 다이클로로메탄 하에서 상기 제 1 중간체 화합물에 트리플로로아세트산을 첨가하여 반응시켜 제 2 중간체인 2-(4-아다만탄-1-일페녹시)-1-(피페라진-1-일)에탄온 화합물을 생성하는 단계; (c) (2-2-[2-(2-클로로-아세틸아미노)-에톡시]-에톡시-에틸)-카르밤산 터트-뷰틸 에스터에 상기 제 2 중간체 화합물을 첨가하여 반응시켜 제 3 중간체 화합물인 터트-뷰틸 2-(2-(2-(2-(4-(2-(4-아다만탄-1-일-페녹시)아세틸)피페라진-1-일)아세트아미노)에톡시)에틸 카바메이트를 생성하는 단계; (d) 상기 제 3 중간체 화합물에서 분리한 프리-아민 화합물에 (+)-바이오틴 N-하이드록시숙신이미드 에스터를 첨가하여 반응시켜 프로브 화합물인 N-(2-(2-(2-(2-(4-(2-(4-아다만탄-1-일-페녹시)아세틸)피페라진-1-일)아세트아미도)에톡시)에톡시)에틸)-5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아마이드를 생성하는 단계를 포함한다.(a) (4-Adamantan-1-yl-phenoxy) acetic acid with tert-butylpiperazine-1-carboxylate to obtain tert-butyl 4- -1-yl phenoxy) acetyl) piperazine-1-carboxylate compound; (b) reacting the first intermediate compound with trifluoroacetic acid under dichloromethane to give the second intermediate, 2- (4-adamantan-1-ylphenoxy) -1- (piperazin- Yl) ethanone compound; (c) adding the second intermediate compound to (2-2- [2- (2-chloro-acetylamino) -ethoxy] -ethoxy-ethyl) -carbamic acid tert- 1-yl) acetamido) ethoxy (2-methyl-2- (2- (2- ); (D) adding (+) - biotin N-hydroxysuccinimide ester to the pre-amine compound separated from the third intermediate compound to react N- - (2- (2- (4- (2- (4-adamantan-1-yl-phenoxy) acetyl) piperazin-1-yl) acetamido) ethoxy) ethoxy) ) -5 - ((3aS, 4S, 6aR) -2-oxohexahydro-1H-thieno [3,4-d] imidazol-4-yl) pentanamide.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 포함하는, HSP70(Heat shock protein 70) 탐지용 프로브를 제공한다.Also, the present invention provides a probe for detecting HSP70 (heat shock protein 70) comprising a compound of the following formula (1) or (2).
[화학식 1][Chemical Formula 1]
[화학식 2](2)
본 발명의 일 구현예로, 상기 프로브는 HSP70(Heat shock protein 70)의 알로스테릭 자리(allosteric site)에 결합할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the probe may bind to an allosteric site of HSP70 (heat shock protein 70).
또한, 본 발명은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 HSP70(Heat shock protein 70) 억제용 시험관 (in vitro) 내 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for inhibiting HSP70 (Heat shock protein 70) in vitro comprising a compound represented by the following formula (3) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
[화학식 3](3)
상기 화학식 3에서,In
R1은 H 또는 
R2는 H, 
또한, 본 발명은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 호흡 억제용 시험관 (in vitro) 내 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for in vitro mitochondrial respiratory depression comprising a compound represented by the following general formula (3) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
[화학식 3](3)
상기 화학식 3에서,In
R1은 H 또는 
R2는 H, 
본 발명은 HIF-1 활성을 저해하는 화합물인 IDF-11774의 표적 단백질로서 HSP70을 탐지하는 프로브 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 프로브를 통해, IDF-11774가 HSP70의 알로스테릭 자리에 결합하고, 리폴딩을 감소시켜 HSP70의 샤페론 활성을 억제함으로써 HIF-1 활성을 저해하는 효과를 나타내는 것을 알 수 있는 바, IDF-11774의 표적 단백질에 대한 연구에 사용하여 암 증식 및 전이 억제 약물 개발 등의 용도로 이용할 수 있는 장점이 있다.The present invention relates to a probe for detecting HSP70 as a target protein of IDF-11774 which is a compound inhibiting HIF-1 activity and a method for producing the same, wherein IDF-11774 is bound to the allosteric site of HSP70 HIF-1 activity is inhibited by inhibiting the chaperone activity of HSP70 by reducing the refolding. Thus, the present invention can be used to study the target protein of IDF-11774 to develop cancer proliferation and metastasis inhibiting drugs And the like.
도 1은 IDF-11774이다.
도 2는 IDF-11774에 트리플루오로메틸 디아지린 및 아세틸렌을 도입한 프로브(프로브 2) 및 이의 비활성 프로브(프로브 1)와 IDF-11774에 바이오틴을 도입한 프로브(프로브 4) 및 이의 비활성 프로브(프로브 3)이다.
도 3은 IDF-11774, 본 발명인 활성 프로브(프로브 2) 및 비활성 프로브(프로브 1)의 활성을 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명인 활성 프로브(프로브 2)에 특이적으로 결합하는 약 70 kDa 단백질을 확인한 것을 보여주는 도이다.
도 5는 본 발명인 활성 프로브(프로브 2)에 특이적으로 결합된 단백질의 동정을 위해, 2차원 전기영동을 통해 단백질을 분리 후, 질량 분석을 통하여 HSP70 단백질을 동정한 것을 보여주는 도이다.
도 6은 본 발명인 활성 프로브(프로브 4)에 특이적으로 HSP70이 결합하는 것을 확인하였으며, 이 결합이 IDF-11774에 의해 방해됨을 보여주는 도이다.
도 7은 recombinant HSP70 단백질의 정제를 나타내는 도이다.
도 8은 recombinant HSP70 단백질과 본 발명인 활성 프로브(프로브 2)와의 결합을 보여주는 도이다.
도 9은 VER-155008는 농도-의존적으로 HSP70의 ATPase 활성을 억제하지만, IDF-11774는 억제 활성이 없음을 보여주는 도이다.
도 10은 IDF-11774가 농도-의존적으로 HSP70의 리폴딩 활성을 억제하는 것을 보여주는 도이다.
도 11는 비활성 프로브(프로브 1)는 HSP70의 refolding 활성을 억제하지 않으나, 본 발명인 활성 프로브(프로브 2)는 농도-의존적인 억제 활성을 나타내는 것을 보여주는 도이다.
도 12는 IDF-11774에 의한 산소 소비율 감소를 나타내는 도이다.
도 13은 IDF-11774에 의해 세포 내 용존 산소의 증가를 나타내는 도이다.1 is IDF-11774.
Fig. 2 is a schematic diagram showing a probe (probe 2) in which trifluoromethyldiazirine and acetylene are introduced into IDF-11774 and its inactive probe (probe 1), a probe (probe 4) into which IDF-11774 is introduced and its inactive probe Probe 3).
3 is a diagram showing the activity of IDF-11774, the active probe (probe 2) and the inactive probe (probe 1) of the present invention.
Fig. 4 is a diagram showing identification of an about 70 kDa protein specifically binding to the active probe (probe 2) of the present invention. Fig.
FIG. 5 is a diagram showing the identification of HSP70 protein by mass spectrometry after protein separation through two-dimensional electrophoresis in order to identify a protein specifically bound to the active probe (probe 2) of the present invention.
Fig. 6 shows that HSP70 specifically binds to the active probe (probe 4) of the present invention, and shows that the binding is interrupted by IDF-11774.
Figure 7 is a diagram showing the purification of the recombinant HSP70 protein.
Fig. 8 shows the binding between the recombinant HSP70 protein and the active probe (probe 2) of the present invention.
Figure 9 shows that VER-155008 inhibits ATPase activity of HSP70 in a concentration-dependent manner, while IDF-11774 has no inhibitory activity.
Figure 10 shows that IDF-11774 inhibits refolding activity of HSP70 in a concentration-dependent manner.
Figure 11 shows that the inactive probe (probe 1) does not inhibit refolding activity of HSP70, but the active probe of the present invention (probe 2) exhibits a concentration-dependent inhibitory activity.
12 is a graph showing the reduction of the oxygen consumption rate by IDF-11774.
Fig. 13 is a graph showing an increase in intracellular dissolved oxygen by IDF-11774. Fig.
본 발명자들은, 실시예에서 제조한 프로브를 이용하는 경우, IDF-11774의 표적 분자인 HSP70을 탐지할 수 있다는 점에 기반하여 상기 프로브의 제조 방법 및 HSP70 동정 과정, IDF-11774의 HSP70 활성 억제 및 HSP70 리폴딩 활성 억제 효과 등을 구체적으로 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.Based on the fact that the probes prepared in the examples can be used to detect HSP70, which is a target molecule of IDF-11774, the present inventors have found that the method for identifying the HSP70, the inhibition of HSP70 activity of IDF-11774, The effect of inhibiting refolding activity, and the like were specifically confirmed, and the present invention was completed on the basis thereof.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.The present invention provides a compound represented by the following formula (1).
[화학식 1][Chemical Formula 1]
본 발명은 또한, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 제공한다.The present invention also provides a compound represented by the following general formula (2).
[화학식 2](2)
본 발명의 일실시예에서는, 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 제조(실시예 1 내지 4 참조)하고, 이를 이용하여 IDF-11774의 표적 분자를 동정한 결과, 상기 화합물이 모두 HSP70과 결합하는 것을 확인하였다(실시예 6 참조). In one embodiment of the present invention, the compounds of formula (1) or (2) were prepared (see Examples 1 to 4) and the target molecules of IDF-11774 were identified using the compounds. As a result, (See Example 6).
따라서, 본 발명에 따른 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 IDF-11774의 표적 분자인 HSP70을 탐지하는 용도로 사용될 수 있다.Therefore, the compound of formula (1) or (2) according to the present invention can be used for detecting HSP70 which is a target molecule of IDF-11774.
이에, 본 발명은 상기 화학식 1, 화학식 2의 화합물을 포함하는 HSP70 탐지용 프로브 또는 이를 포함하는 HSP70 탐지용 조성물을 제공한다. Accordingly, the present invention provides a probe for detecting HSP70 comprising the compound of
본 발명에서 사용되는 “프로브”라는 용어는 특정물질, 부위, 상태 등을 특이적으로 검출하는 물질을 총칭하는 것으로, 예를 들면 전기영동에 의해 전개된 DNA나 RNA 단편에서 특정한 단편을 검출하는 올리고뉴클레오티드 DNA나 RNA 프로브나, 항원, 항체 반응의 특이적 결합을 이용하여 특정한 항원을 검출하는 항체 프로브 등이 있다.The term " probe " used in the present invention collectively refers to a substance that specifically detects a specific substance, site, state, and the like. For example, the term " probe " Nucleotide DNA or RNA probes, or antibody probes that detect specific antigens using specific binding of an antigen or an antibody reaction.
본 발명의 프로브는 HSP70(Heat shock protein 70)을 탐지하는 것일 수 있다.The probe of the present invention may be one that detects HSP70 (heat shock protein 70).
상기에서 “Heat shock protein”이란, 세포나 조직 또는 개체가 생리적 온도보다 높은 온도에 노출될 때 합성되는 단백질로, HSP60, HSP70, HSP90 등과 같이 분자량의 1,000 단위 숫자를 붙여서 표기하며, 분자량에 따라 그 특성이 다양하여 분자 샤페론이나 변성 단백질을 선택적으로 분해하는 효소 등으로 작용한다. 특히, HSP70 단백질은 세포의 정상적 기능을 수행하는 데 있어 필수적이며, 세포내의 여러 세포소기관에 존재하면서 단백질의 폴딩(folding)과 언폴딩(unfolding), 조립, 해체 등 단백질 상호 작용에 참여하는 ATP 의존성 분자 샤페론이다. The term "heat shock protein" refers to a protein synthesized when a cell, tissue or individual is exposed to a temperature higher than the physiological temperature. The protein is represented by 1,000 units of molecular weight, such as HSP60, HSP70, HSP90, These enzymes act as enzymes that selectively degrade molecular chaperons or denatured proteins. In particular, the HSP70 protein is essential for the normal functioning of the cell, and it is necessary for the ATP dependence of proteins involved in protein interactions such as protein folding, unfolding, It is a molecular chaperone.
또한, 본 발명의 프로브는 HSP70(Heat shock protein 70)의 알로스테릭 자리(allosteric site)에 결합하는 것일 수 있다.In addition, the probe of the present invention may bind to the allosteric site of HSP70 (heat shock protein 70).
상기에서 “알로스테릭 자리”란, 효소의 활성을 증가 또는 억제시키기 위하여 조절 분자가 결합하는(활성자리와 다른 위치의) 알로스테릭 효소상의 자리로, 여기서 “알로스테릭 효소”란, 조절 인자(modulator)의 결합에 따라 그 모양이나 구조가 바뀌는 효소를 말한다. 즉, 활성 부위 이외의 부위에 특이적인 대사물질이 비공유 결합하면서 촉매활성이 조절된다. As used herein, the term " allosteric site " refers to a site on the allosteric enzyme (at a position other than the active site) to which the regulatory molecule binds to increase or inhibit the activity of the enzyme, An enzyme whose shape or structure changes depending on the combination of modulators. That is, the catalytic activity is regulated while non-covalent binding of specific metabolites to sites other than active sites.
따라서, 본 발명에 따른 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 HSP70의 알로스테릭 자리에 결합하고, 리폴딩을 감소시켜 HSP70의 샤페론 활성을 억제함으로써 HIF-1 활성을 저해하는 효과를 갖는 바, 상기 세포의 활성 효과가 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있다.Therefore, the compound represented by the following
본 발명은 또한, 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 HSP70(Heat shock protein 70) 억제용 시험관 (in vitro) 내 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for inhibiting HSP70 (Heat shock protein 70) in vitro comprising a compound represented by the following formula (3) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
[화학식 3](3)
상기 화학식 3에서,In
R1은 H 또는 
R2는 H, 
본 발명은 또한, 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 호흡 억제용 시험관 (in vitro) 내 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for in vitro mitochondrial respiratory depression comprising a compound represented by the following formula (3), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as an active ingredient.
[화학식 3](3)
상기 화학식 3에서,In
R1은 H 또는 
R2는 H, 
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.
[실시예][Example]
실시예Example 1: 21: 2 -(4--(4- 아다만탄Adamantan -1-일-2-(3--1-yl-2- (3- 트리플루오로메틸Trifluoromethyl )-3H-) -3H- 다이아지린Diazirine -3-일)-3 days) 페녹시Phenoxy )-1-(4-() -1- (4- ( 프로프Professional -2-인일)피페라진-1-일)에탄온 (프로브 2)의 제조2-ynyl) piperazin-1-yl) ethanone (Probe 2)
IDF-11774의 표적 분자 규명을 위하여 IDF-11774에 광친화 반응용 치환기로 트리플루오로메틸 디아지린 및 클릭 반응용 치환기로 아세틸렌을 도입한 프로브를 합성하였다.For identification of the target molecule of IDF-11774, a probe in which trifluoromethyldiazirine as a substituent for photo-affinity reaction and acetylene as a substituent for a click reaction were introduced into IDF-11774 was synthesized.
단계 1: 2-(4-아다만탄-1-일-2-(3-(트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)페녹시)아세트산 제조 Step 1: Preparation of 2- (4-adamantan-l-yl-2- (3- (trifluoromethyl) -3H-diazyrin-3- yl) phenoxy) acetic acid
THF/H2O (3:1 2 mL) 하에서, 에틸 2-(4-아다만탄-1-일-2-(3-(트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)페녹시)아세테이트 (0.2 g, 0.47 mmol) 혼합물을 리튬 하이드록사이드 모노하이드레이트 (0.07 g, 1.89 mmol)와 반응시키고, TLC에 의해 완료된 것으로 판단 될 때까지 실온에서 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 10% 염화수소를 이용하여 pH 4까지 산성화시키고, 이를 에틸 아세테이트와 brine으로 분리하였다. 유기상을 분리하여 무수황산마그네슘으로 건조시키고, 여과시킨 후, 진공에서 농축하여 2-(4-아다만탄-1-일-2-(3-트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)페녹시)아세트산 화합물을 하얀색 고체로 얻었다(0.1 g, 55.5%). THF / H 2 O (3: 1 2 mL) under, ethyl 2- (4-adamantan-l-yl-2- (3- (trifluoromethyl) -3H- diamond rings 3-yl) phenoxy (0.2 g, 0.47 mmol) was reacted with lithium hydroxide monohydrate (0.07 g, 1.89 mmol) and stirred at room temperature until it was judged complete by TLC. The reaction mixture was acidified to
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.81 (s, 1H), 7.66 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.75 (s, 2H), 2.12 (brs, 3H), 1.911.88 (m, 6H), 1.791.76 (m, 6H); MS (ESI) m/z 395 (M+H). 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.81 (s, 1H), 7.66 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.75 (s, 2H), 2.12 (br s, 3H), 1.911.88 (m, 6H), 1.791.76 (m, 6H); MS (ESI) m / z 395 (M + H).
단계 2: 2 -(4- 아다만탄 -1-일-2-(3- 트리플루오로메틸 )-3H- 다이아지린 -3-일) 페녹시 )-1-(4-( 프로프 -2-인일)피페라진-1-일)에탄온 제조 Step 2: 2- (4-adamantan-l-yl-2- (3-trifluoromethyl) -3H- diamond rings 3-yl) phenoxy) -1- (4- (prop -2 Yl) -piperazin-1-yl) ethanone
DMF (2 mL) 하에서, 2-(4-아다만탄-1-일-2-(3-트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)페녹시)아세트산 (단계 1, 0.08 g, 0.20 mmol) 및 1-(프로프-2-인일)피페라진 (0.025 g, 0.20 mmol) 혼합물에 EDC·HCl (0.046 g, 0.24 mmol), HOBt (0.032 g, 0.24 mmol), 및 DIPEA (0.09 mL, 0.5 mmol)을 첨가하여 반응시켰다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 이를 에틸 아세테이트와 brine으로 분리하였다. 유기상을 분리하여 무수황산마그네슘으로 건조시키고, 여과시킨 후, 진공에서 농축하였다. 생성된 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (hexane:EtOAc = 2:8)로 정제하여 2-(4-아다만탄-1-일-2-(3-트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)페녹시)-1-(4-(프로프-2-인일)피페라진-1-일)에탄온 화합물을 하얀색 고체로 얻었다(0.03 g, 30.0%).3-yl) phenoxy) acetic acid (
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.72 (s, 1H), 7.33 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.89 (s, 2H), 4.89 (s, 2H), 3.673.66 (m, 2H), 3.443.43 (m, 2H), 3.38 (s, 2H), 2.602.55 (m, 4H), 2.28 (t, J = 4.0 Hz, 1H), 2.09 (brs, 3H), 1.881.87 (m, 6H), 1.741.71 (m, 6H); 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.72 (s, 1H), 7.33 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.89 (s, 2H), 4.89 (s, 2H), 3.673.66 ( m, 2H), 3.443.43 (m, 2H), 3.38 (s, 2H), 2.602.55 (m, 4H), 2.28 (t, J = 4.0 Hz, 1H ), 2.09 (br s, 3H), 1.881.87 (m, 6H), 1.741.71 (m, 6H);
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 165.8, 156.0, 144.9, 132.9, 128.0, 127.9, 121.2, 113.2, 78.0, 73.7, 68.7, 51.9, 51.4, 46.8, 45.3, 43.1, 42.0, 36.6, 35.8, 31.6, 28.8; 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3) δ 165.8, 156.0, 144.9, 132.9, 128.0, 127.9, 121.2, 113.2, 78.0, 73.7, 68.7, 51.9, 51.4, 46.8, 45.3, 43.1, 42.0, 36.6, 35.8, 31.6 , 28.8;
HRMS [M+H] calcd. [C27H32F3N4O2]: 501.2477, found: 501.2477; purity 100.0% (as determined by RP-HPLC: method A, t R = 17.67 min; method B, t R = 18.60 min). HRMS [M + H] calcd. [C 27 H 32 F 3 N 4 O 2 ]: 501.2477, found: 501.2477; purity 100.0% (as determined by RP -HPLC: method A, t R = 17.67 min; method B, t R = 18.60 min).
실시예Example 2: 12: 1 -(4-(-(4-( 프로프Professional -2-인일)피페라진-1-일)-2-(2-(3-(Yl) piperazin-1-yl) -2- (2- (3- ( 트리플루오로메틸Trifluoromethyl )-3H-) -3H- 다이아지린Diazirine -3-일)페녹시)에탄온 (프로브 1)의 제조3-yl) phenoxy) ethanone (Probe 1)
프로브 2의 활성을 평가하기 위한 컨트롤 프로브를 합성하였다.A control probe for evaluating the activity of
단계 1: 2-(2-(3-(트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)페녹시)아세트산 제조 Step 1: Preparation of 2- (2- (3- (trifluoromethyl) -3H-diazirin-3-yl) phenoxy) acetic acid
THF/H2O (3:1 2 mL) 하에서, 에틸 2-(2-(3-(트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)페녹시)아세테이트 (0.12 g, 0.17 mmol) 혼합물을 리튬 하이드록사이드 모노하이드레이트 (0.07 g, 1.66 mmol)와 반응시키고, TLC에 의해 완료된 것으로 판단 될 때까지 실온에서 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 10% 염화수소를 이용하여 pH 4까지 산성화시키고, 이를 에틸 아세테이트와 brine으로 분리하였다. 유기상을 분리하여 무수황산마그네슘으로 건조시키고, 여과시킨 후, 진공에서 농축하여 2-(2-(3-(트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)페녹시)아세트산 화합물을 하얀색 고체로 얻었다(0.1 g, 55.5%). THF / H 2 O (3: 1 2 mL) under, ethyl 2- (2- (3- (trifluoromethyl) -3H- diamond rings 3-yl) phenoxy) acetate (0.12 g, 0.17 mmol) The mixture was reacted with lithium hydroxide monohydrate (0.07 g, 1.66 mmol) and stirred at room temperature until it was judged complete by TLC. The reaction mixture was acidified to
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.35 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.12 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.66 (s, 2H); MS (ESI) m/z 261 (M+H). 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.35 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.12 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.96 (d , ≪ / RTI > J = 8.0 Hz, 1H), 4.66 (s, 2H); MS (ESI) m / z 261 (M + H).
단계 2: 2 -(4- 아다만탄 -1-일-2-(3- 트리플루오로메틸 )-3H- 다이아지린 -3-일) 페녹시 )-1-(4-( 프로프 -2-인일)피페라진-1-일)에탄온 제조 Step 2: 2- (4-adamantan-l-yl-2- (3-trifluoromethyl) -3H- diamond rings 3-yl) phenoxy) -1- (4- (prop -2 Yl) -piperazin-1-yl) ethanone
DMF (2 mL) 하에서, 2-(4-아다만탄-1-일-2-(3-트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)페녹시)아세트산 (단계 1, 0.08 g, 0.20 mmol) 및 1-(프로프-2-인일)피페라진 (0.025 g, 0.20 mmol) 혼합물에 EDC·HCl (0.046 g, 0.24 mmol), HOBt (0.032 g, 0.24 mmol), 및 DIPEA (0.09 mL, 0.5 mmol)을 첨가하여 반응시켰다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 이를 에틸 아세테이트와 brine으로 분리하였다. 유기상을 분리하여 무수황산마그네슘으로 건조시키고, 여과시킨 후, 진공에서 농축하였다. 생성된 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (hexane:EtOAc = 2:8)로 정제하여 2-(4-아다만탄-1-일-2-(3-트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)페녹시)-1-(4-(프로프-2-인일)피페라진-1-일)에탄온 화합물을 하얀색 고체로 얻었다(0.03 g, 30.0%).3-yl) phenoxy) acetic acid (
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.72 (s, 1H), 7.33 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.89 (s, 2H), 4.89 (s, 2H), 3.673.66 (m, 2H), 3.443.43 (m, 2H), 3.38 (s, 2H), 2.602.55 (m, 4H), 2.28 (t, J = 4.0 Hz, 1H), 2.09 (brs, 3H), 1.881.87 (m, 6H), 1.741.71 (m, 6H); 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.72 (s, 1H), 7.33 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.89 (s, 2H), 4.89 (s, 2H), 3.673.66 ( m, 2H), 3.443.43 (m, 2H), 3.38 (s, 2H), 2.602.55 (m, 4H), 2.28 (t, J = 4.0 Hz, 1H ), 2.09 (br s, 3H), 1.881.87 (m, 6H), 1.741.71 (m, 6H);
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 165.8, 156.0, 144.9, 132.9, 128.0, 127.9, 121.2, 113.2, 78.0, 73.7, 68.7, 51.9, 51.4, 46.8, 45.3, 43.1, 42.0, 36.6, 35.8, 31.6, 28.8; 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3) δ 165.8, 156.0, 144.9, 132.9, 128.0, 127.9, 121.2, 113.2, 78.0, 73.7, 68.7, 51.9, 51.4, 46.8, 45.3, 43.1, 42.0, 36.6, 35.8, 31.6 , 28.8;
HRMS [M+H] calcd. [C27H32F3N4O2]: 501.2477, found: 501.2477; purity 100.0% (as determined by RP-HPLC: method A, t R = 17.67 min; method B, t R = 18.60 min). HRMS [M + H] calcd. [C 27 H 32 F 3 N 4 O 2 ]: 501.2477, found: 501.2477; purity 100.0% (as determined by RP -HPLC: method A, t R = 17.67 min; method B, t R = 18.60 min).
실시예Example 3: N-(2-(2-(2-(2-(4-(2-(4- 3: N- (2- (2- (2- (4- (2- (4- 아다만탄Adamantan -1-일--1 day- 페녹시Phenoxy )아세틸)피페라진-1-일)) Acetyl) piperazin-1-yl) 아세트아미도Acetamido )) 에톡시Ethoxy )에톡시)에틸)-5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아마이드 (Thieno [3,4-d] imidazol-4-yl) pentanamide (prepared from 프로브Probe 4)의 제조 4)
IDF-11774의 표적 분자와의 결합을 확인하기 위하여 IDF-11774에 바이오틴을 도입한 프로브를 합성하였다.To confirm the binding of IDF-11774 to the target molecule, a probe having biotin introduced into IDF-11774 was synthesized.
단계 1: 터트-뷰틸 4-(2-(4-아다만탄-1-일페녹시)아세틸)피페라진-1-카복실레이트 제조 Step 1: Preparation of tert-butyl 4- (2- (4-adamantan-1-ylphenoxy) acetyl) piperazine-1-carboxylate
DMF (5.0 mL) 하에서, (4-아다만탄-1-일-페녹시)아세트산 (0.5 g, 1.74 mmol) 및 터트-뷰틸 피페라진-1-카복실레이트 (0.32 g, 1.74 mmol) 혼합물에 EDC·HCl (0.4 g, 2.09 mmol), HOBt (0.28 g, 2.09 mmol), 및 DIPEA (0.78 mL, 4.36 mmol)을 첨가하여 반응시켰다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 이를 에틸 아세테이트와 brine으로 분리하였다. 유기상을 분리하여 무수황산마그네슘으로 건조시키고, 여과시킨 후, 진공에서 농축하였다. 생성된 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (hexane:EtOAc = 2:8)로 정제하여 터트-뷰틸 4-(2-(4-아다만탄-1-일페녹시)아세틸)피페라진-1-카복실레이트 화합물을 하얀색 고체로 얻었다(0.03 g, 30.0%).To a mixture of (4-adamantan-1-yl-phenoxy) acetic acid (0.5 g, 1.74 mmol) and tert- butylpiperazine- 1-carboxylate (0.32 g, 1.74 mmol) in DMF (5.0 mL) HCl (0.4 g, 2.09 mmol), HOBt (0.28 g, 2.09 mmol), and DIPEA (0.78 mL, 4.36 mmol). The reaction mixture was stirred at room temperature overnight, which was separated into ethyl acetate and brine. The organic phase was separated, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated in vacuo. The resulting residue was purified by silica gel column chromatography (hexane: EtOAc = 2: 8) to obtain tert-butyl 4- (2- (4-adamantan- 1 -ylphenoxy) acetyl) piperazine- The rate compound was obtained as a white solid (0.03 g, 30.0%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.27 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.67 (s, 2H), 3.593.56 (m, 4H), 3.433.40 (m, 4H), 2.08 (brs, 3H), 1.87 1.86 (m, 6H), 1.761.71 (m, 6H), 1.46 (s, 9H); 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.27 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.67 (s, 2H), 3.593.56 (m, 4H ), 3.433.40 (m, 4H), 2.08 (br s, 3H), 1.87 1.86 (m, 6H), 1.761.71 (m, 6H), 1.46 (s, 9H);
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 166.9, 155.4, 154.5, 144.9, 126.0, 114.0, 80.3, 67.9, 45.4, 43.3, 42.0, 36.7, 35.6, 28.9, 28.4; 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3) δ 166.9, 155.4, 154.5, 144.9, 126.0, 114.0, 80.3, 67.9, 45.4, 43.3, 42.0, 36.7, 35.6, 28.9, 28.4;
HRMS [M+H] calcd. [C27H39N2O4]: 455.2910, found: 455.2910; purity 100.0% (as determined by RP-HPLC: method C, t R = 26.4 min; method D, t R = 27.2 min).HRMS [M + H] calcd. [C 27 H 39 N 2 O 4 ]: 455.2910, found: 455.2910; purity 100.0% (as determined by RP -HPLC: method C, t R = 26.4 min; method D, t R = 27.2 min).
단계 2: 2-(4-아다만탄-1-일페녹시)-1-(피페라진-1-일)에탄온 제조 Step 2: Preparation of 2- (4-adamantan-1 -ylphenoxy) -1- (piperazin-1-yl) ethanone
터트-뷰틸 4-(2-(4-아다만탄-1-일페녹시)아세틸)피페라진-1-카복실레이트 (0.45 g, 0.98 mmol) 현탁액 (단계 1)에 다이클로로메탄 (4.5 mL) 하의 트리플루오로아세트산 (0.3 mL, 3.95 mmol)을 첨가하고 실온에서 밤새 교반하였다. 상기 혼합액을 감압하에서 증발시켜 생성된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:MeOH = 9:1)로 정제하여 2-(4-아다만탄-1-일페녹시)-1-(피페라진-1-일)에탄온 화합물을 하얀색 고체로 얻었다(0.31 g, 88.6%).Dichloromethane (4.5 mL) was added to a suspension of tert-butyl 4- (2- (4-adamantan-l -ylphenoxy) acetyl) piperazine-1-carboxylate (0.45 g, 0.98 mmol) Was added trifluoroacetic acid (0.3 mL, 3.95 mmol) and stirred overnight at room temperature. The mixture was evaporated under reduced pressure and the resulting crude product was purified by silica gel column chromatography (CH 2 Cl 2 : MeOH = 9: 1) to give 2- (4-adamantan- 1 -ylphenoxy) Piperazin-1-yl) ethanone as a white solid (0.31 g, 88.6%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.75 (s, 1H), 7.27 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.83 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.65 (s, 2H), 3.863.84 (m, 4H), 3.203.13 (m, 4H), 2.07 (brs, 3H), 1.851.84 (m, 6H), 1.781.70 (m, 6H); 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 9.75 (s, 1H), 7.27 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.83 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.65 (s, 2H), 3.863.84 (m, 4H), 3.203.13 (m, 4H), 2.07 (brs, 3H), 1.851.84 (m, 6H), 1.781.70 (m, 6H);
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 167.2, 155.0, 145.4, 126.2, 114.0, 67.5, 43.4, 43.3, 43.2, 42.2, 38.8, 36.7, 35.6, 28.9; 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3) δ 167.2, 155.0, 145.4, 126.2, 114.0, 67.5, 43.4, 43.3, 43.2, 42.2, 38.8, 36.7, 35.6, 28.9;
HRMS [M+H] calcd. [C22H31N2O2]: 355.2386, found: 355.2386; purity 100.0% (as determined by RP-HPLC: method C, t R = 9.7 min; method D, t R = 11.3 min). HRMS [M + H] calcd. [C 22 H 31 N 2 O 2]: 355.2386, found: 355.2386; purity 100.0% (as determined by RP -HPLC: method C, t R = 9.7 min; method D, t R = 11.3 min).
단계 3: 터트 - 뷰틸 2-(2-(2-(2-(4-(2-(4- 아다만탄 -1-일- 페녹시 )아세틸)피페라진-1-일) 아세트아미도 )에톡시)에톡시)에틸 카바메이트 제조 Step 3: tert-butyl 2- (2- (2- (2- (4- (2- (4-adamantan-1-yl-phenoxy) acetyl) piperazin-1-yl) also acetamido) Ethoxy) ethoxy) ethyl carbamate < / RTI >
무수아세톤 (10 mL) 및 DMF (4 mL) 하에서 (2-2-[2-(2-클로로-아세틸아미노)-에톡시]-에톡시-에틸)-카르밤산 터트-뷰틸 에스터 (0.18 g, 0.56 mmol)에 2-(4-아다만탄-1-일페녹시)-1-(피페라진-1-일)에탄온 (단계 2, 0.1 g, 0.28 mmol), K2CO3 (0.078 g, 0.56 mmol), Cs2CO3 (0.045 g, 0.14 mmol) 및 KI (0.023 g, 0.14 mmol)를 첨가하여 반응시켰다. 상기 반응 혼합물을 60 °C에서 36시간 동안 가열한 후 실온으로 냉각시키고, 감압하에서 증발시켜 잔여물을 물로 세척하였다. 상기 용액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 결합된 유기상을 분리하여 무수황산마그네슘으로 건조시키고, 여과시킨 후, 진공에서 농축하였다. 생성된 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:MeOH = 9:1)로 정제하여 터트-뷰틸 2-(2-(2-(2-(4-(2-(4-아다만탄-1-일-페녹시)아세틸)피페라진-1-일)아세트아미도)에톡시)에톡시)에틸 카바메이트 화합물을 노란색 오일로 얻었다(0.12 g, 66.6%).-Ethoxy] -ethyl} -carbamic acid tert-butyl ester (0.18 g, 0.15 mmol) in dry acetone (10 mL) and DMF (4 mL) 0.56 mmol) in 2- (4-adamantan-1-yl-phenoxy) -1- (piperazin-1-yl) ethanone (
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.36 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.86 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.07 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 4.66 (s, 2H), 3.65-3.63 (m, 4H), 3.603.48 (m, 10H), 3.323.30 (m, 2H), 3.03 (s, 2H), 2.532.50 (m, 4H), 2.08 (brs, 3H), 1.881.86 (m, 6H), 1.761.74 (m, 6H), 1.44 (s, 9H); MS (ESI) m/z 643 (M+H). 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.36 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.86 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.07 (t 2H, J = 8.0 Hz, 1H), 4.66 (s, 2H), 3.65-3.63 (m, 4H), 3.603.48 2.532.50 (m, 4H), 2.08 (br s, 3H), 1.881.86 (m, 6H), 1.761.74 (m, 6H), 1.44 (s, 9H); MS (ESI) m / z 643 (M + H).
단계 4: N-(2-(2-(2-(2-(4-(2-(4- 아다만탄 -1-일- 페녹시 )아세틸)피페라진-1-일) 아세트아미도 ) 에톡시 )에톡시)에틸)-5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아마이드 제조 Step 4: N- (2- (2- ( 2- (2- (4- (2- (4- adamantan-1-yl-phenoxy) acetyl) piperazin-1-yl) also acetamido) Ethoxy ) ethoxy) ethyl) -5 - ((3aS, 4S, 6aR) -2-oxohexahydro-1H- thieno [3,4- d] imidazol-
TFA 및 CH2Cl2를 1:3 비율로 혼합한 용액 (4 mL)에 터트-뷰틸 2-(2-(2-(2-(4-(2-(4-아다만탄-1-일-페녹시)아세틸)피페라진-1-일)아세트아미노)에톡시)에틸 카바메이트 (단계 3, 0.1 g, 0.15 mmol)를 용해시키고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 그 후, 용매를 제거하고 톨루엔으로 3회 동시-증발시켜 프리-아민 조생성물을 얻었다. 정제 없이 상기 조생성물을 TEA (0.5 mL)가 첨가된 DMF (2 mL)에 용해시키고, 이에 (+)-바이오틴 N-하이드록시숙신이미드 에스터 (0.06 g, 0.18 mmol)를 첨가하여 반응시키고 밤새 실온에서 교반하였다. 반응물을 물로 급냉시키고 10%의 MeOH/DCM으로 추출하였다. 유기상을 분리하여 무수황산마그네슘으로 건조시키고, 여과시킨 후, 진공에서 농축하였다. 생성된 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:MeOH = 8.5:1.5)로 정제하여 N-(2-(2-(2-(2-(4-(2-(4-아다만탄-1-일-페녹시)아세틸)피페라진-1-일)아세트아미도)에톡시)에톡시)에틸)-5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아마이드 화합물을 하얀색 고체로 얻었다(0.07 g, 58.8%).The TFA and CH 2 Cl 2 1: A solution mixed at a ratio of 3 tert to (4 mL) - Butyl 2- (2- (2- (2- (4- (2- (4-adamantan-1-yl Yl) acetamino) ethoxy) ethylcarbamate (
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.40 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.57 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 6.33 (s, 1H), 5.34 (s, 1H), 4.67 (s, 2H), 4.504.47 (m, 1H), 4.314.28 (m, 1H), 3.733.57 (m, 12H), 3.533.49 (m, 2H), 3.443.40 (m, 2H), 3.163.13 (m, 1H), 3.04 (s, 2H), 2.912.87 (m, 1H), 2.73 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 2.542.51 (m, 4H), 2.23 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.08 (brs, 3H), 1.871.85 (m, 6H), 1.751.70 (m, 6H), 1.681.64 (m, 4H), 1.451.41 (m, 2H); 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.40 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.57 (t 1H, J = 12.0 Hz, 1H), 6.33 (s, 1H), 5.34 (s, 1H), 4.67 (s, 2H), 4.504.47 (m, 1H), 4.314.28 2H), 3.94 (m, 2H), 3.163 (m, 1H), 3.04 (s, 2H), 2.912.87 2.73 (d, J = 12.0 Hz , 1H), 2.542.51 (m, 4H), 2.23 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.08 (brs, 3H), 1.871.85 (m, 6H), 1.751 .70 (m, 6H), 1.681.64 (m, 4H), 1.451.41 (m, 2H);
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 173.3, 169.8, 166.8, 163.7, 155.5, 144.9, 126.0, 114.1, 70.2, 70.1, 69.9, 69.8, 67.8, 61.7, 61.4, 60.1, 55.5, 53.5, 53.0, 45.4, 43.3, 42.1, 40.5, 39.1, 38.7, 36.7, 35.9, 35.6, 28.9, 28.2, 28.1, 25.6; 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3) δ 173.3, 169.8, 166.8, 163.7, 155.5, 144.9, 126.0, 114.1, 70.2, 70.1, 69.9, 69.8, 67.8, 61.7, 61.4, 60.1, 55.5, 53.5, 53.0, 45.4 , 43.3, 42.1, 40.5, 39.1, 38.7, 36.7, 35.9, 35.6, 28.9, 28.2, 28.1, 25.6;
HRMS [M+H] calcd. [C40H61N6O7S]: 769.4322, found: 769.4322; purity 100.0% (as determined by RP-HPLC: method A, t R = 13.69 min; method B, t R = 15.22 min). HRMS [M + H] calcd. [C 40 H 61 N 6 O 7 S]: 769.4322, found: 769.4322; purity 100.0% (as determined by RP -HPLC: method A, t R = 13.69 min; method B, t R = 15.22 min).
실시예Example 4: 54: 5 -((- (( 3aS,4S,6aR3aS, 4S, 6aR )-2-)-2- 옥소헥사하이드로Oxohexahydro -1H--1H- 티에노[3,4-d]이미다졸Thieno [3,4-d] imidazole -4-일)-N-(2-(2-(2-(2-(4-(2-페녹시아세틸)피페라진-1-일)아세트아미도)에톡시)에톡시)에틸)펜탄아마이드 (프로브 3)의 제조Yl) acetamido) ethoxy) ethoxy) ethyl) pentane < EMI ID = Preparation of amide (probe 3)
프로브 4의 활성을 평가하기 위한 컨트롤 프로브를 합성하였다.A control probe for evaluating the activity of
단계 1: 터트-뷰틸 4-(2-페녹시아세틸)피페라진-1-카복실레이트 제조 Step 1: Preparation of tert-butyl 4- (2-phenoxyacetyl) piperazine-1-carboxylate
DMF (5.0 mL) 하에서, 2-페녹시아세트산 (0.5 g, 3.28 mmol) 및 터트-뷰틸 피페라진-1-카복실레이트 (0.61 g, 3.28 mmol) 혼합물에 EDC·HCl (0.75 g, 3.94 mmol), HOBt (0.53 g, 3.94 mmol), 및 DIPEA (1.46 mL, 8.21 mmol)을 첨가하여 반응시켰다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 이를 에틸 아세테이트와 brine으로 분리하였다. 유기상을 분리하여 무수황산마그네슘으로 건조시키고, 여과시킨 후, 진공에서 농축하였다. 생성된 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (hexane:EtOAc = 3:7)로 정제하여 터트-뷰틸 4-(2-페녹시아세틸)피페라진-1-카복실레이트 화합물을 하얀색 고체로 얻었다(0.56 g, 65.1%).To a mixture of 2-phenoxyacetic acid (0.5 g, 3.28 mmol) and tert-butylpiperazine-1-carboxylate (0.61 g, 3.28 mmol) in DMF (5.0 mL) was added EDC.HCl (0.75 g, 3.94 mmol) HOBt (0.53 g, 3.94 mmol), and DIPEA (1.46 mL, 8.21 mmol). The reaction mixture was stirred at room temperature overnight, which was separated into ethyl acetate and brine. The organic phase was separated, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated in vacuo. The resulting residue was purified by silica gel column chromatography (hexane: EtOAc = 3: 7) to obtain the tert-butyl 4- (2-phenoxyacetyl) piperazine-1-carboxylate compound as a white solid (0.56 g, 65.1%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.31 (t, J = 12.0 Hz, 2H), 6.99 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.70 (s, 2H), 3.583.56 (m, 4H), 3.443.40 (m, 4H), 1.46 (s, 9H); MS (ESI) m/z 321 (M+H). 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.31 (t, J = 12.0 Hz, 2H), 6.99 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.70 ( s, 2H), 3.583.56 (m, 4H), 3.443.40 (m, 4H), 1.46 (s, 9H); MS (ESI) m / z 321 (M + H).
단계 2: 2-페녹시-1-(피페라진-1-일)에탄온 제조 Step 2: Preparation of 2 -phenoxy-1- (piperazin-1-yl) ethanone
터트-뷰틸 4-(2-페녹시아세틸)피페라진-1-카복실레이트 (0.5 g, 1.56 mmol) 현탁액 (단계 1)에 다이클로로메탄 (5.0 mL) 하의 트리플루오로아세트산 (0.48 mL, 6.24 mmol)을 첨가하고 실온에서 밤새 교반하였다. 상기 혼합액을 감압하에서 증발시켜 생성된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:MeOH = 9:1)로 정제하여 2-페녹시-1-(피페라진-1-일)에탄온 화합물을 하얀색 고체로 얻었다(0.31 g, 91.2%).A solution of trifluoroacetic acid (0.48 mL, 6.24 mmol) in dichloromethane (5.0 mL) was added to a suspension of tert-butyl 4- (2-phenoxyacetyl) piperazine-1-carboxylate (0.5 g, 1.56 mmol) ) And the mixture was stirred overnight at room temperature. The resulting mixture was evaporated under reduced pressure and the resulting crude product was purified by silica gel column chromatography (CH 2 Cl 2 : MeOH = 9: 1) to give 2-phenoxy-1- (piperazin- Obtained as a white solid (0.31 g, 91.2%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.93 (brs, 1H), 7.31 (t, J = 12.0 Hz, 2H), 7.03 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.70 (s, 2H), 3.893.88 (m, 4H), 3.123.10 (m, 4H); MS (ESI) m/z 221 (M+H). 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 9.93 (brs, 1H), 7.31 (t, J = 12.0 Hz, 2H), 7.03 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.70 (s, 2H), 3.893. 88 (m, 4H), 3.123.10 (m, 4H); MS (ESI) m / z 221 (M + H).
단계 3: 터트 - 뷰틸 2-(2-(2-(2-(4-(2- 페녹시아세틸 )피페라진-1-일) 아세트아미도 ) 에톡시 ) 에톡시 )에틸 카바메이트 제조 Step 3: Preparation of tert - butyl 2- (2- (2- (4- (2- phenoxyacetyl ) piperazin-1-yl) acetamido ) ethoxy ) ethoxy ) ethyl carbamate
무수아세톤 (10 mL) 하에서 (2-2-[2-(2-클로로-아세틸아미노)-에톡시]-에톡시-에틸)-카르밤산 터트-뷰틸 에스터 (0.29 g, 0.90 mmol)에 2-페녹시-1-(피페라진-1-일)에탄온 (단계 2, 0.1 g, 0.45 mmol), K2CO3 (0.069 g, 0.90 mmol), Cs2CO3 (0.07 g, 0.22 mmol) 및 KI (0.04 g, 0.22 mmol)를 첨가하여 반응시켰다. 상기 반응 혼합물을 60 °C에서 36시간 동안 가열한 후 실온으로 냉각시키고, 감압하에서 증발시켜 잔여물을 물로 세척하였다. 상기 용액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 결합된 유기상을 분리하여 무수황산마그네슘으로 건조시키고, 여과시킨 후, 진공에서 농축하였다. 생성된 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2: MeOH = 9:1)로 정제하여 터트-뷰틸 2-(2-(2-(2-(4-(2-페녹시아세틸)피페라진-1-일)아세트아미도)에톡시)에톡시)에틸 카바메이트 화합물을 노란색 오일로 얻었다(0.14 g, 60.8%).To a solution of 2- (2- (2- chloro-acetylamino) -ethoxy] -ethoxy-ethyl) -carbamic acid tert-butyl ester (0.29 g, 0.90 mmol) in anhydrous acetone (10 mL) (
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.35 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 7.31 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.00 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.98 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 4.69 (s, 2H), 3.64-3.62 (m, 4H), 3.603.47 (m, 10H), 3.313.29 (m, 2H), 3.02 (s, 2H), 2.532.49 (m, 4H), 1.44 (s, 9H); MS (ESI) m/z 509 (M+H). 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.35 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 7.31 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.00 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.94 (d , J = 8.0 Hz, 1H) , 4.98 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 4.69 (s, 2H), 3.64-3.62 (m, 4H), 3.603.47 (m, 10H), 3.313.29 ( m, 2H), 3.02 (s, 2H), 2.532. 49 (m, 4H), 1.44 (s, 9H); MS (ESI) m / z 509 (M + H).
단계 4: 5 -(( 3aS,4S,6aR )-2- 옥소헥사하이드로 -1H- 티에노[3,4-d]이미다졸 -4-일)-N-(2-(2-(2-(2-(4-(2-페녹시아세틸)피페라진-1-일)아세트아미도)에톡시)에톡시)에틸)펜탄아마이드 제조 Step 4: 5 - ((3aS, 4S, 6aR) -2- oxo-hexahydro--1H- thieno [3,4-d] imidazol -4-) -N- (2- (2- ( 2- (2- (4- (2-phenoxyacetyl) piperazin-1-yl) acetamido) ethoxy) ethoxy) ethyl) pentanamide
TFA 및 CH2Cl2를 1:3 비율로 혼합한 용액 (4 mL)에 터트-뷰틸 2-(2-(2-(2-(4-(2-페녹시아세틸)피페라진-1-일)아세트아미도)에톡시)에톡시)에틸 카바메이트 (단계 3, 0.1 g, 0.19 mmol)를 용해시키고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 그 후, 용매를 제거하고 톨루엔으로 3회 동시-증발시켜 프리-아민 조생성물을 얻었다. 정제 없이 상기 조생성물을 TEA (0.5 mL)가 첨가된 DMF (2 mL)에 용해시키고, 이에 (+)-바이오틴 N-하이드록시숙신이미드 에스터 (0.08 g, 0.23 mmol)를 첨가하여 반응시키고 밤새 실온에서 교반하였다. 반응물을 물로 급냉시키고 10%의 MeOH/DCM으로 추출하였다. 유기상을 분리하여 무수황산마그네슘으로 건조시키고, 여과시킨 후, 진공에서 농축하였다. 생성된 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:MeOH = 8.5:1.5)로 정제하여 5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)-N-(2-(2-(2-(2-(4-(2-페녹시아세틸)피페라진-1-일)아세트아미도)에톡시)에톡시)에틸)펜탄아마이드 화합물을 하얀색 고체로 얻었다(0.06 g, 48.4%).The TFA and CH 2 Cl 2 1: tert one To a solution (4 mL) mixed in a ratio of 3-butyl 2- (2- (2- (2- (4- (2-phenoxy-acetyl) piperazin-1-yl ) Acetamido) ethoxy) ethoxy) ethyl carbamate (
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.41 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 7.30(t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.01 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.63 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 5.42 (s, 1H), 4.70 (s, 2H), 4.504.47 (m, 1H), 4.314.28 (m, 1H), 3.653.53 (m, 12H), 3.513.47 (m, 2H), 3.433.39 (m, 2H), 3.153.12 (m, 1H), 3.04 (s, 2H), 2.912.88 (m, 1H), 2.73 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 2.542.49 (m, 4H), 2.23 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 1.741.62 (m, 4H), 1.471.43 (m, 2H); 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.41 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 7.30 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.01 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.94 (d 1H, J = 8.0 Hz, 1H), 6.63 (t, J = 8.0 Hz, IH), 6.42 (s, IH), 5.42 (s, IH), 4.70 (s, 2H), 4.504.47 2H), 3.143 (m, 2H), 3.153 (m, 1H), 3.04 (s, 2H), 2.912.88 (m, 1H ), 2.73 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 2.542.49 (m, 4H), 2.23 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 1.741.62 (m , ≪ / RTI > 4H), 1.471.43 (m, 2H);
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 173.4, 169.9, 166.7, 163.8, 157.7, 129.7, 121.8, 114.6, 70.2, 69.9, 69.8, 67.7, 61.8, 61.4, 60.1, 55.6, 53.5, 53.0, 45.3, 42.1, 40.5, 39.1, 38.7, 35.9, 31.6, 28.2, 28.1, 25.6; 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3) δ 173.4, 169.9, 166.7, 163.8, 157.7, 129.7, 121.8, 114.6, 70.2, 69.9, 69.8, 67.7, 61.8, 61.4, 60.1, 55.6, 53.5, 53.0, 45.3, 42.1 , 40.5, 39.1, 38.7, 35.9, 31.6, 28.2, 28.1, 25.6;
HRMS [M+H] calcd. [C30H47N6O7S]: 635.3227, found: 635.3227; purity 100.0% (as determined by RP-HPLC: method A, t R = 7.31 min; method B, t R = 22.76 min). HRMS [M + H] calcd. [C 30 H 47 N 6 O 7 S]: 635.3227, found: 635.3227; purity 100.0% (as determined by RP -HPLC: method A, t R = 7.31 min; method B, t R = 22.76 min).
실시예 5: 제조된 프로브의 HIF-1α 억제 활성 확인Example 5: Confirmation of HIF-1 alpha inhibitory activity of the prepared probe
상기 실시예 1 및 2에 따라 제조한 프로브 (프로브 2 및 프로브 1)의 HIF-1α 억제 활성을 확인하였다.The HIF-1 alpha inhibitory activity of the probes (
구체적으로, HCT116 암세포주를 5% 우태아혈청 (FBS)를 포함하는 DMEM 배지에 현탁시킨 후 6 well 플레이트 (5 x 105 cell)에 옮겨 5% 이산화탄소를 유지하는 37°C 항온 배양기에서 24 시간 배양하였다. HIF-1α의 축적을 유도하기 위하여 1% 산소, 94% 질소 및 5% 이산화탄소의 저산소 조건에서 6시간 배양하였다. 방사선면역 침전 분석 완충용액 (radioimmuno precipitation assay buffer, RIPA buffer, 밀리포어 사)을 이용해 HCT116 세포를 파쇄하여 세포 추출물을 수득하였다. 세포 추출물 각 20 μg을 SDS-PAGE에 전개하여 분리한 다음, PVDF 막 (polyvinylidene fluoride membrane)에 옮겨 HIF-1α 항체 (BD사이언스 사) 및 horseradish peroxidase (HRP) 표지 2차 항체 (산타크루즈 사)를 순차적으로 결합시켜 단백질 발현을 확인하였다.Specifically, HCT116 cancer cell lines were suspended in DMEM medium containing 5% fetal bovine serum (FBS), transferred to 6-well plates (5 x 10 5 cells), incubated in a 37 ° C incubator maintained at 5% Lt; / RTI > To induce accumulation of HIF-1α, cells were cultured under hypoxic condition of 1% oxygen, 94% nitrogen and 5% carbon dioxide for 6 hours. HCT116 cells were disrupted using radioimmuno precipitation assay buffer (RIPA buffer, Millipore) to obtain cell extracts. 20 μg of each cell extract was separated on SDS-PAGE, transferred to a PVDF membrane (polyvinylidene fluoride membrane), and incubated with HIF-1α antibody (BD Science) and horseradish peroxidase (HRP) secondary antibody (Santa Cruz) Sequential binding confirmed protein expression.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 프로브 1은 HIF-1α의 축적을 억제하는 활성이 없으나, 프로브 2는 강한 억제 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.As a result, as shown in Fig. 3, it was found that
이러한 결과는, 프로브 1은 비활성 프로브, 프로브 2는 활성 프로브로써 활용 가능함을 시사하고 있다.These results suggest that
실시예 6: IDF-11774의 표적 분자 동정Example 6: Identification of the target molecule of IDF-11774
6-1: 프로브를 활용한 표적 분자 가시화 6-1: Target molecule visualization using probes
상기 프로브 (프로브 2 및 프로브 1)를 활용하여 IDF-11774의 표적 분자의 가시화 및 동정에 활용하였다.The probe (
구체적으로, HCT116 세포에 프로브를 처리 후 1시간 배양하였다. 그 뒤, 세포를 트립신/EDTA로 회수 후, 360 nm의 자외선 램프를 이용하여 10분간 광친화 반응을 하였다. 세포를 RIPA 버퍼로 가용화 후, Click-iT Protein Buffer Kit (Invitrogen)을 이용하여 프로브와 형광제 (Cy3 아자이드 또는 Cy5 아자이드)의 동촉매 클릭반응을 하였다. 단백질을 전기영동한 뒤, 형광 스캐너를 이용하여 형광 결합된 단백질을 검출하였다. Specifically, HCT116 cells were incubated for 1 hour after treatment with probes. Thereafter, the cells were recovered with trypsin / EDTA and subjected to light-affinity reaction for 10 minutes using an ultraviolet lamp of 360 nm. Cells were solubilized with RIPA buffer, and then a copper-catalyzed reaction was performed between the probe and the fluorescent agent (Cy3 azide or Cy5 azide) using the Click-iT Protein Buffer Kit (Invitrogen). Proteins were electrophoresed and fluorescently coupled proteins were detected using a fluorescent scanner.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 활성 프로브인 프로브 2에 특이적으로 결합하는 약 70 kDa 단백질을 확인하였다.As a result, as shown in Fig. 4, an about 70 kDa protein that specifically binds to the active probe,
6-2: IDF-11774 표적 분자 동정 6-2: Identification of IDF-11774 target molecule
상기 활성 프로브 (프로브 2)에 특이적으로 결합된 단백질의 동정을 위해, 2차원 전기영동을 통해 단백질을 분리 후 질량분석을 진행하였다.In order to identify the protein specifically bound to the active probe (probe 2), the protein was separated through two-dimensional electrophoresis and mass analysis was performed.
구체적으로, 재수화 (rehydration) 반응은 단백질을 재수화 버퍼 (8 M urea, 2% CHAPS, 18 mM DTT, 2% IPG buffer, 50 mg/ml bromophenol blue)에 녹여 IPG스트립 (Immobiline DryStrip, pH 3-11, 7 cm, GE Healthcare)에서 12시간 동안 실온에서 반응하였다. IEF (등전점 전기영동)은 500볼트 1시간, 1000볼트 1시간, 8000볼트 2시간 30분, 8000볼트 30분 동안 Ettan IPGphor system (GE Healthcare)를 이용하여 수행하였다. SDS-PAGE로 단백질을 분리한 뒤 특정 스팟을 선정하여 LC/ESI-Q-TOF MS로 질량분석을 진행하였다.Specifically, the rehydration reaction was carried out by immersing the protein in rehydration buffer (8 M urea, 2% CHAPS, 18 mM DTT, 2% IPG buffer, 50 mg / ml bromophenol blue) -11, 7 cm, GE Healthcare) at room temperature for 12 hours. IEF (isoelectric point electrophoresis) was performed using an Ettan IPGphor system (GE Healthcare) for 500 volts for 1 hour, 1000 volts for 1 hour, 8000 volts for 2 hours and 30 minutes, 8000 volts for 30 minutes. Proteins were separated by SDS-PAGE, and specific spots were selected and analyzed by LC / ESI-Q-TOF MS.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, HSP70 단백질을 동정하였다.As a result, as shown in Fig. 5, the HSP70 protein was identified.
6-3: Pull-down assay를 통한 HSP70 결합 확인 6-3: Confirmation of HSP70 binding by pull-down assay
표적 단백질 HSP70의 결합을 확인하기 위하여 IDF-11774에 바이오틴을 결합한 프로브 (상기 실시예 3 및 4에 따라 제조한 프로브 4 및 프로브 3)를 세포 추출물과 반응하였다.In order to confirm the binding of the target protein HSP70, probes binding to IDF-11774 with biotin (probes 4 and 3 prepared according to Examples 3 and 4 above) were reacted with the cell extracts.
구체적으로, 방사선면역 침전 분석 완충용액 (radioimmuno precipitation assay buffer, RIPA buffer, 밀리포어 사)를 이용해 HCT116 세포를 파쇄하여 세포 추출물을 수득하였다. 500 μg의 세포추출물과 프로브 3 또는 4 (125 nmol) 및 200 μl의 NeutrAvidin UltraLink resin (Thermo 사)과 실온에서 결합시켰다. 원심분리 (13,000 rpm)로 프로브에 결합하지 않은 단백질을 제거 후, 침전물을 세정완충용액 (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2M urea, pH 7.5)로 세 번 세정 후, 침전물에 추출완충용액 (1.2% SDS in PPB) 50 μl를 넣고 가열 후 프로브 결합단백질을 추출하였고, 전기영동을 통하여 분리 후, HSP70 항체 (산타크루즈 사)를 이용하여 검출하였다.Specifically, HCT116 cells were disrupted using radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA buffer, Millipore) to obtain a cell extract. 500 μg of cell extract was combined with
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 활성 프로브 (프로브 4)에 특이적으로 HSP70이 결합하는 것을 확인하였으며, 이 결합은 IDF-11774에 의해 방해됨을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 6, it was confirmed that HSP70 specifically bound to the active probe (probe 4) was confirmed to be interrupted by IDF-11774.
이러한 결과는, IDF-11774의 표적 분자가 약 70 kDa의 HSP70라는 사실을 시사하고 있다.These results suggest that the target molecule of IDF-11774 is about 70 kDa HSP70.
실시예 7: 제조된 프로브(프로브 2)의 HSP70와의 결합 활성 확인Example 7: Confirmation of binding activity of the prepared probe (probe 2) to HSP70
7-1: HSP70의 유전자 클로닝 및 재조합 단백질 분리 및 정제 7-1: Cloning Gene of HSP70 and Separation and Purification of Recombinant Protein
IDF-11774와 HSP70의 결합을 확인하기 위하여, HSP70 재조합(recombinant) 단백질을 제작하였다.To confirm the binding of IDF-11774 and HSP70, HSP70 recombinant protein was prepared.
HSP70 유전자는 한국생명공학연구원 인간유전자 뱅크 (Korean Human Gene Bank, KUGI, NM_005345)에서 구입하였고, HSP70 전장을 포함하는 DNA 단편 (HSP70-FL, 아미노산 서열 1~613), 핵산결합 도메인 (nucleotide-binding domain)을 포함하는 DNA 단편 (HSP70-NBD, 아미노산 서열 1~388) 및 기질 결합 도메인 (substrate-binding domain)을 포함하는 DNA 단편 (HSP70-SBD, 아미노산 서열번호 386-613)을 PCR로 증폭한 후, pHis vector (Merck, Germany)에 클로닝 하였다. 이 플라스미드벡터를 E. coli Rosetta 2 (DE3)에 도입한 후 IPTG 처리한 후 HSP70 recombinant 단백질을 과발현하였다. 과발현된 recombinant HSP70 단백질은 Ni-NTA affinity chromatography, TEV 효소 cleavage, 및 size-exclusion chromatography 과정을 통해 분리 정제하였다(도 7). The HSP70 gene was purchased from the Korean Human Gene Bank (KUGI, NM_005345) at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology. The DNA fragment containing the HSP70 full length (HSP70-FL,
7-2: 제조된 프로브의 HSP70 recombinant 단백질과의 결합 활성 7-2: Binding activity of prepared probe with HSP70 recombinant protein
상기 실시예 7-1에서 제작한 HSP70 재조합 단백질과 IDF-11774의 결합 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 실험하였다.In order to confirm the binding of IDF-11774 with the HSP70 recombinant protein prepared in Example 7-1, the following experiment was conducted.
실시예 7-1에서 제조된 recombinant human HSP70 단백질 HSP70-FL (2 μg)에 HSP70 프로브 1 및 프로브 2 (10 μM)를 넣고 IDF-11774 (100 μM)를 넣거나 또는 넣지 않은 상황에서 10 분간 배양한 후 광친화 라벨화 (photoaffinity labeling) 및 클릭반응 (click reaction)을 수행하고, 클릭반응 후 용매 (methanol:chloroform:water=60:15:40 v/v)를 넣고 단백질 침전을 수확하였다. 단백질 SDS-PAGE 후 Typhoon 9410 이미지 시스템으로 형광을 탐지하였다.
그 결과, 도 8A에 나타낸 바와 같이, 프로브 2와 HSP70의 결합을 확인하였으며, 나아가, IDF-11774 (10배)를 넣어 프로브 2와 HSP70-FL 경쟁실험 수행 시, 프로브 2와 HSP70-FL 결합이 없어지는 것을 확인하였고, 이를 통해 프로브 2와 HSP70-FL 결합이 특이적인 결합임을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 8A, the binding between
또한, 프로브 2가 결합하는 HSP70 부위를 확인하기 위해 프로브 2와 HSP70-NBD 또는 HSP70-SBD 단백질을 넣은 후 동일한 광친화 라벨화 (photoaffinity labeling) 및 클릭반응 (click reaction)을 수행하였다.In order to confirm the HSP70 site to which the
그 결과, 도 8B에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE 및 이미지 분석을 통해 프로브 2가 특이적으로 HSP70-NBD에 결합함을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 8B, it was confirmed through SDS-PAGE and image analysis that probe 2 specifically bound to HSP70-NBD.
실시예 8: IDF-11774의 HSP70 억제 활성 확인Example 8 Identification of HSP70 Inhibitory Activity of IDF-11774
8-1: IDF-11774의 HSP70 ATPase 활성에 대한 작용 8-1: Effect of IDF-11774 on HSP70 ATPase activity
HSP70의 ATPase 활성에 대한 IDF-11774의 작용을 HSP70 및 결합 단백질 HSP40을 사용하여 확인하였다.The action of IDF-11774 on the ATPase activity of HSP70 was confirmed using HSP70 and the binding protein HSP40.
구체적으로, HSP70 (1 μg)과 HSP40 (0.14 g)를 반응버퍼 (20 mM Tris, pH 7.5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1μ MATP)에 혼합시킨 후, IDF-11774 또는 HSP70 저해제 VER-155008를 넣고 30분간 반응시켰다. 그 후, 반응액 내 ATP의 농도변화를 ENLITEN rLuciferase/ Luciferin kit (프로메가 사)를 사용하여 발광도를 측정하였다. Specifically, HSP70 (1 μg) and HSP40 (0.14 g) were mixed in a reaction buffer (20 mM Tris, pH 7.5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 1 μM MATP), and then IDF-11774 or HSP70 inhibitor VER- 155008 was added and reacted for 30 minutes. Thereafter, the change in the concentration of ATP in the reaction solution was measured using ENLITEN rLuciferase / Luciferin kit (Promega).
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, VER-155008는 농도-의존적으로 HSP70의 ATPase 활성을 억제하지만, IDF-11774는 억제 활성이 없음을 확인하였다.As a result, as shown in Fig. 7, VER-155008 inhibited the ATPase activity of HSP70 in a concentration-dependent manner, while IDF-11774 showed no inhibitory activity.
8-2: IDF-11774의 HSP70 refolding 활성에 대한 작용 8-2: Action on IDF-11774 HSP70 refolding activity
HSP70의 refolding 활성에 대한 IDF-11774의 작용을 검토하기 위하여 luciferase 리폴딩 실험을 진행하였다.To investigate the effect of IDF-11774 on the refolding activity of HSP70, luciferase refolding experiments were carried out.
구체적으로, 500 μg/ml 농도의 luciferase를 변성완충용액 (30 mM Tris-HCl, pH 7.4, 6 M guanidine, 5 mM DTT)에 희석하여 실온에서 1 시간 반응하였다. 리폴딩 반응은 50 μl의 리폴딩 버퍼 (20 mM Tris, pH 7.5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10mM DTT, 1mM ATP)에 HSP70 (0.5 μg) 및 HSP40 (0.3 μg)과 변성 luciferase (125 ng)를 넣고 실온에서 30분간 반응하였다. 그 뒤, 리폴딩된 luciferase의 활성을 luciferase assay kit (프로메가 사)를 사용하여 측정하였다. Specifically, 500 μg / ml luciferase was diluted in denaturing buffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.4, 6 M guanidine, 5 mM DTT) and reacted at room temperature for 1 hour. The refolding reaction was performed by adding HSP70 (0.5 μg), HSP40 (0.3 μg) and denaturing luciferase (125 μM) to 50 μl of refolding buffer (20 mM Tris, pH 7.5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 1 mM ATP) ng) and incubated at room temperature for 30 min. The activity of the refolded luciferase was then measured using the luciferase assay kit (Promega).
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, IDF-11774가 VER-155008와 유사하게 HSP70의 리폴딩 억제 활성을 나타냄을 확인하였다.As a result, as shown in Fig. 8, it was confirmed that IDF-11774 exhibited refolding inhibitory activity of HSP70 similar to VER-155008.
8-3: 프로브의 HSP70 refolding 활성 억제 8-3: inhibition of HSP70 refolding activity of probe
상기 표적 단백질 동정에 활용한 프로브 (프로브 1 및 프로브 2)의 활성을 확인하기 위하여 실시예 7-2의 방법으로 HSP70 refolding 실험을 진행하였다. In order to confirm the activity of the probes (
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 비활성 프로브 (프로브 1)는 HSP70의 refolding 활성을 억제하지 않으나, 활성 프로브 (프로브 2)는 농도-의존적인 억제 활성을 나타내었으며, IDF-11774와 동일하게 HSP70의 refolding 활성을 저해하여 HIF-1α의 축적을 억제하는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 9, the inactive probe (probe 1) did not inhibit the refolding activity of HSP70, but the active probe (probe 2) showed a concentration-dependent inhibitory activity and the same as IDF- Inhibited the refolding activity of HIF-1α and inhibited accumulation of HIF-1α.
이러한 결과는, IDF-11774가 그 ATPase 활성에 영향을 주지 않고, 알로스테릭 포켓에 결합하여 HSP70의 샤페론 활동을 억제한다는 사실을 시사하고 있다.These results suggest that IDF-11774 binds to allosteric pockets without affecting its ATPase activity and inhibits the chaperone activity of HSP70.
실시예 9: IDF-11774의 미토콘드리아 호흡 억제 확인Example 9 Mitochondrial Respiratory Inhibition of IDF-11774
9-1: IDF-11774의 산소 소비율 억제 확인 9-1: Confirmation of inhibition of oxygen consumption rate of IDF-11774
IDF-11774의 미토콘드리아 호흡에 대한 작용을 검토하기 위하여 산소 소비율 변화 측정 실험을 진행하였다.To investigate the effect of IDF-11774 on mitochondrial respiration, experiments were conducted to measure changes in oxygen consumption rate.
구체적으로, 세포내 미토콘드리아의 산소소비율 (OCR)은 XF24 extracellular flux analyzer (씨홀스 사)를 이용하여 측정하였다. HCT116 세포 (1 x 105 cell)를 측정 전용 플레이트 (XF24 cell culture plate)에서 24 시간 배양한 뒤, 측정 1 시간 전에 XF 측정 전용 배지로 교환하고 이산화탄소가 없는 세포 배양기에서 배양하였다. 약물을 투여하지 않은 정상 상태세포에서 미토콘드리아의 산소 소비율을 3회 측정한 뒤, ATP합성 저해제 oligomycin (1 μM)을 투여 후 3회, 화학적 짝풀림제 carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (0.5 μM)을 투여 후 3회, 전자전달계 저해제 rotenone (1 μM) 및 antimycin A (1 μM)를 각각 투여 후 2회 산소 소비율을 측정하였다.Specifically, the oxygen consumption rate (OCR) of intracellular mitochondria was measured using an XF24 extracellular flux analyzer (Seahorse). HCT116 cells (1 × 10 5 cells) were cultured in an XF24 cell culture plate for 24 hours, and then exchanged with a culture medium for
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, IDF-11774가 세포내 미토콘드리아의 산소 소비율을 억제함을 확인하였다.As a result, as shown in Fig. 12, it was confirmed that IDF-11774 suppressed the oxygen consumption rate of intracellular mitochondria.
9-2: IDF-11774에 의한 세포 내 산소 증가 확인 9-2: Identification of intracellular oxygen increase by IDF-11774
IDF-11774의 산소 소비율 억제에 따른 세포 내 산소 농도 증가를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 실험을 진행하였다.In order to confirm the intracellular oxygen concentration increase due to inhibition of the oxygen consumption rate of IDF-11774, experiments were conducted as follows.
HCT116 세포 (1 x 105 cell)에 IDF-11774와 0.5 μM 농도의 저산소 특이적 프로브 MAR (고료 사)를 함께 처리한 후, 저산소 조건 세포 배양기에서 6 시간 배양하였다. 그 후, 세포 내 저산소에 의한 형광의 증가를 실시간 세포관찰 분석 시스템 (인큐사이트, 에센 사)로 측정하였다.HCT116 cells (1 × 10 5 cells) were treated with IDF-11774 and 0.5 μM hypoxic specific probe MAR (Gojosha), and then cultured in a hypoxic conditioned cell incubator for 6 hours. Thereafter, the increase in fluorescence due to hypoxia in the cells was measured by a real-time cell observation and analysis system (Incisite, Essen).
그 결과, 도 13에서 나타낸 바와 같이, IDF-11774에 의하여 세포 내 산소 농도가 증가됨을 확인하였다. As a result, it was confirmed that the intracellular oxygen concentration was increased by IDF-11774 as shown in Fig.
이러한 결과는, IDF-11774가 미토콘드리아의 호흡 억제를 통하여 세포 내 산소 소비량을 감소시켜 용존 산소량이 증가됨으로써 HIF-1α의 분해를 촉진시킬 수 있음을 시사하고 있다. These results suggest that IDF-11774 may promote the degradation of HIF-1α by decreasing intracellular oxygen consumption through respiration suppression of mitochondria and increasing dissolved oxygen.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.
Claims (8)
[화학식 1]
A compound represented by the following formula (1).
[Chemical Formula 1]
[화학식 2]
A compound represented by the following formula (2).
(2)
[화학식 1]
(a) 에틸 2-(4-아다만탄-1-일-2-(3-(트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)페녹시)아세테이트를 리튬 하이드록사이드 모노하이드레이트와 반응시켜 제 1 중간체로서 2-(4-아다만탄-1-일-2-(3-트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)페녹시)아세트산 화합물을 생성하는 단계; 및
(b) 상기 제 1 중간체를 1-(프로프-2-인일)피페라진과 반응시켜 프로브 화합물인 2-(4-아다만탄-1-일-2-(3-트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)페녹시)-1-(4-(프로프-2-인일)피페라진-1-일)에탄온을 생성하는 단계.
A process for preparing a compound represented by the following formula (1), comprising the steps of:
[Chemical Formula 1]
(a) Synthesis of ethyl 2- (4-adamantan-l-yl-2- (3- (trifluoromethyl) -3H-diazirin- 3-yl) phenoxy) acetate with lithium hydroxide monohydrate Reacting to produce 2- (4-adamantan-1-yl-2- (3-trifluoromethyl) -3H-diazirin-3-yl) phenoxy) acetic acid compound as a first intermediate; And
(b) reacting said first intermediate with 1- (prop-2-ynyl) piperazine to form 2- (4-adamantan-l-yl-2- (3- trifluoromethyl) 3-yl) phenoxy) -1- (4- (prop-2-ynyl) piperazin-1-yl) ethanone.
[화학식 2]
(a) (4-아다만탄-1-일-페녹시)아세트산과 터트-뷰틸 피페라진-1-카복실레이트를 반응시켜 제 1 중간체로서 터트-뷰틸 4-(2-(4-아다만탄-1-일페녹시)아세틸)피페라진-1-카복실레이트 화합물을 생성하는 단계;
(b) 다이클로로메탄 하에서 상기 제 1 중간체 화합물에 트리플로로아세트산을 첨가하여 반응시켜 제 2 중간체인 2-(4-아다만탄-1-일페녹시)-1-(피페라진-1-일)에탄온 화합물을 생성하는 단계;
(c) (2-2-[2-(2-클로로-아세틸아미노)-에톡시]-에톡시-에틸)-카르밤산 터트-뷰틸 에스터에 상기 제 2 중간체 화합물을 첨가하여 반응시켜 제 3 중간체 화합물인 터트-뷰틸 2-(2-(2-(2-(4-(2-(4-아다만탄-1-일-페녹시)아세틸)피페라진-1-일)아세트아미노)에톡시)에틸 카바메이트를 생성하는 단계; 및
(d) 상기 제 3 중간체 화합물에서 분리한 프리-아민 화합물에 (+)-바이오틴 N-하이드록시숙신이미드 에스터를 첨가하여 반응시켜 프로브 화합물인 N-(2-(2-(2-(2-(4-(2-(4-아다만탄-1-일-페녹시)아세틸)피페라진-1-일)아세트아미도)에톡시)에톡시)에틸)-5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아마이드를 생성하는 단계.
A process for preparing a compound represented by the following formula (2), comprising the steps of:
(2)
(a) (4-Adamantan-1-yl-phenoxy) acetic acid with tert-butylpiperazine-1-carboxylate to obtain tert-butyl 4- -1-yl phenoxy) acetyl) piperazine-1-carboxylate compound;
(b) reacting the first intermediate compound with trifluoroacetic acid under dichloromethane to give the second intermediate, 2- (4-adamantan-1-ylphenoxy) -1- (piperazin- Yl) ethanone compound;
(c) adding the second intermediate compound to (2-2- [2- (2-chloro-acetylamino) -ethoxy] -ethoxy-ethyl) -carbamic acid tert- 1-yl) acetamido) ethoxy (2-methyl-2- (2- (2- ) Ethyl carbamate; and
(d) adding (+) - biotin N-hydroxysuccinimide ester to the pre-amine compound isolated from the third intermediate compound to react with the probe compound N- (2- (2- (2- - (4- (2- (4-adamantan-l-yl-phenoxy) acetyl) piperazin-1-yl) acetamido) ethoxy) , 6aR) -2-oxohexahydro-1H-thieno [3,4-d] imidazol-4-yl) pentanamide.
A probe for detecting HSP70 (Heat shock protein 70) comprising the compound of claim 1 or 2.
상기 프로브는 HSP70 (Heat shock protein 70)의 알로스테릭 자리 (allosteric site)에 결합하는 것을 특징으로 하는, 프로브.
6. The method of claim 5,
Wherein the probe binds to an allosteric site of HSP70 (Heat shock protein 70).
[화학식 3]
상기 화학식 3에서,
R1은 H 또는
R2는 H,
A composition for inhibiting heat shock protein 70 (HSP70) in vitro comprising a compound represented by the following formula (3) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
(3)
In Formula 3,
R1 is H or
R2 is H,
[화학식 3]
상기 화학식 3에서,
R1은 H 또는
R2는 H,
A composition for in vitro mitochondrial respiratory depression comprising a compound represented by the following formula (3), or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
(3)
In Formula 3,
R1 is H or
R2 is H,
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|---|---|---|---|---|
| WO2023075062A1 (en) * | 2021-10-29 | 2023-05-04 | 동국대학교 산학협력단 | Composition for preventing or treating melanoma, comprising ac_774 |
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|---|---|---|---|---|
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2016
- 2016-06-29 KR KR1020160081792A patent/KR101930131B1/en active IP Right Grant
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