KR20180000364A - A novel Bacillus subtilis D12-5 strain with high proteolysis ability and antimicrobial activities - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 전통 발효식품인 된장에서 분리한 신규한 발효 균주에 관한 것으로, 상세하게는 단백질 분해능 및 항균 활성이 우수한 바실러스 서브틸리스 D12-5 균주(기탁번호 KACC 18638)에 관한 것이다.The present invention relates to a novel fermentation strain isolated from soybean paste, which is a traditional fermented food, and more particularly to a strain of Bacillus subtilis D12-5 (accession number KACC 18638) excellent in proteolytic and antibacterial activity.
우리나라의 전통 발효식품의 제조공정은 종균(스타터)을 첨가하지 않고 주원료에 부재료를 첨가, 혼합하여 원료나 공기 중에서 유입된 천연 미생물에 의한 자연발효 과정을 이용하고 있다.Korean traditional fermented food manufacturing process uses natural fermentation process by natural microorganisms introduced in raw materials or air by adding and mixing raw materials to main raw materials without adding seeds (starter).
미생물 종균화 연구에 있어서 외국의 연구 현황을 살펴보면 일본에서는 자국의 술인 청주의 품질 개선을 위해 우수효모를 선별하여 대량생산에 적합하고 활용성이 높은 효모 가공제품에 대한 연구 및 상용화가 진행 중에 있으며, 유효 발효 미생물의 선별 및 유전공학기법을 이용한 균주 개량으로 주질 향상과 국균의 게놈 정보를 발효산업에 적용하는 연구를 수행 중에 있다.In order to improve the quality of sake sake, the best yeast is selected in Japan and research and commercialization of yeast processed products suitable for mass production and high utilization are underway. We are conducting research to apply fermentation technology to the fermentation industry and to improve the quality of the fermentation by sorting the effective fermentation microorganisms and using the genetic engineering technique.
세계 각국은 우수한 종균의 사용과 발효공학 기술의 접목으로 품질 현대화, 고급화로 세계 명주를 개발하여 브랜드 상품(일본의 사케, 중국의 마호타이, 은양주, 유럽의 포도주, 드라이진, 남미의 럼, 데킬라, 보드카 등)으로 수출하고 있다. Through the use of excellent seeds and fermentation engineering technology, the countries of the world have developed world famous sake with quality modernization and high quality, and have developed brand name products such as Japanese sake, mahogany of China, silver wine, wine of Europe, Tequila, vodka, etc.).
현재 국내 발효산업의 기술력은 현장을 바탕으로 한 경험위주의 노하우 축적이 대부분으로, 전문성을 갖춘 기술개발 과정이 체계화되어 있지 않은 실정이므로, 생물산업 소재의 신속한 산업화, 수출증대 등 경제가치 창출에 어려움을 겪는 경우가 많다.At present, most of the domestic fermentation industry's technological power is accumulated experience-oriented know-how based on the field. Since the specialized technology development process has not been systemized, it is difficult to create economic value such as rapid industrialization of the biotechnology industry and export increase. .
우리나라는 아직 우수한 생물자원 및 종균 개발이 부족한 관계로 매년 고액의 로열티가 해외 생물자원의 사용 대가로 지불되고 있으며 심지어 막걸리, 간장, 식초와 같이 우리 유의 발효식품 생산에 있어서도 종균 수입과 관련하여 해외에 막대한 비용을 지불하고 있다.Since Korea still lacks excellent biological resources and seeds development, a large amount of royalties are paid every year for the use of overseas biological resources. Even in the production of fermented foods such as rice wine, soy sauce, and vinegar, I am paying a great deal of money.
발효식품의 체계적인 연구개발과 관리가 미흡하여 대부분의 발효종균 및 식품소재를 수입에 의존하는 실정이며 전통 바이오 식품산업의 현대화를 통하여 우리의 식문화를 계승 및 발전시키는 의미와 토착 유전자원의 생물자원화를 통해 지역 및 국가기술 발전의 필요성이 제기되고 있다. 이러한 관점에서 전통 발효식품에서 신규 미생물을 분리하여 산업적으로 이용하려는 연구가 많이 시행되고 있으며, 메주에서 분리한 신규한 바실러스 서브틸리스 SN7 균주가 항균 활성이 우수하여 안전한 발효식품 제조에 이용될 수 있음이 알려져 있다(선행기술문헌 1).The systematic research and development and management of fermented foods are insufficient to rely on imports of most fermented foodstuffs and foodstuffs. The modernization of traditional bio-food industry means the succession and development of our food culture and the biological resources of indigenous genetic resources. There is a need for regional and national technological development. From this point of view, many studies have been conducted to isolate new microorganisms from traditional fermented foods and use them industrially, and the novel Bacillus subtilis SN7 strain isolated from Meju has excellent antimicrobial activity and can be used for the production of safe fermented food (Prior art document 1).
본 발명의 일 양상은 단백질 분해능 및 항균 활성이 우수한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) D12-5 균주(기탁번호 KACC 18638)를 제공하는 것이다.One aspect of the present invention is to provide a strain of Bacillus subtilis D12-5 (Accession No. KACC 18638) having excellent proteolytic and antibacterial activity.
본 발명의 다른 양상은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 D12-5 균주(기탁번호 KACC 18638), 상기 균주의 배양물, 상기 균주 또는 배양액의 농축물 및 이들의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 식품 발효용 조성물을 제공하는 것이다.Another aspect of the present invention includes one or more selected from the group consisting of the Bacillus subtilis D12-5 strain of the present invention (Accession No. KACC 18638), the culture of the strain, the concentrate of the strain or the culture and the dried product thereof And to provide a composition for food fermentation.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 D12-5 균주(기탁번호 KACC 18638), 상기 균주의 배양물, 상기 균주 또는 배양액의 농축물 및 이들의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 식품 위해 미생물의 저해용 조성물을 제공하는 것이다.Yet another aspect of the present invention relates to a strain of Bacillus subtilis D12-5 of the present invention (Accession No. KACC 18638), a culture of the strain, a concentrate of the strain or the culture solution, and a dried product thereof And to provide a composition for inhibiting microorganisms for food.
본 발명의 일 양상은 단백질 분해능 및 항균 활성이 우수한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) D12-5 균주(기탁번호 KACC 18638)를 제공한다.One aspect of the present invention provides a strain of Bacillus subtilis D12-5 (Accession No. KACC 18638) having excellent proteolytic and antibacterial activity.
본 발명의 용어 "바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)"는 자연계에 널리 분포하는 비병원성 및 호기성 간균의 일종으로 잘 마른 지푸라기나 마른 풀에서 잘 자라 고초균(枯草菌)이라고도 불리우며, 40℃ 정도의 온도에서 잘 자라는 내열성 균을 말한다.The term " Bacillus subtilis " of the present invention is a kind of non-pathogenic and aerobic bacterium widely distributed in nature. It grows well in dry straw or dry grass and is called Bacillus subtilis. It refers to heat-resistant bacteria that grow well.
일 구체예에 따르면 상기 바실러스 서브틸리스 D12-5 균주는 발효식품인 된장에서 분리하여 동정하였으며, 상기 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열(서열번호 1)을 분석한 결과 바실러스 서브틸리스에 속하는 신규한 균주임을 확인하였다. 따라서, 상기 균주를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 KACC 18638의 기탁번호를 부여 받았다.According to one embodiment, the Bacillus subtilis D12-5 strain was isolated from a fermented soybean paste, and the 16S rRNA gene sequence (SEQ ID NO: 1) of the strain was analyzed. As a result, a novel Bacillus subtilis strain D12-5 . Therefore, the above strain was deposited with the National Institute of Agricultural Science and Technology, National Institute of Agricultural Science and Technology and received the deposit number of KACC 18638.
일 구체예에 따르면 상기 바실러스 서브틸리스 D12-5 균주는 10 내지 60℃의 온도 범위에서 생장할 수 있으며, 바람직하게는 30 내지 50℃, 더욱 바람직하게는 40 내지 45℃의 온도에서 생장할 수 있다.According to one embodiment, the Bacillus subtilis D12-5 strain can grow at a temperature range of 10 to 60 ° C, preferably at a temperature of 30 to 50 ° C, more preferably at a temperature of 40 to 45 ° C have.
일 구체예에 따르면 상기 바실러스 서브틸리스 D12-5 균주는 4.0 내지 10.0의 pH 범위에서 생장할 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 8, 더욱 바람직하게는 6 내지 7의 pH 범위에서 생장할 수 있다.According to one embodiment, the Bacillus subtilis D12-5 strain can grow in a pH range of 4.0 to 10.0, and can grow in a pH range of preferably 5 to 8, more preferably 6 to 7.
일 구체예에 따르면 상기 바실러스 서브틸리스 D12-5 균주는 0 내지 16%의 염도(salt) 범위에서 생장할 수 있으며, 바람직하게는 0 내지 8%, 더욱 바람직하게는 0 내지 2%의 염도 범위에서 생장할 수 있다. 특히 본 발명의 바실러스 서브틸리스 D12-5 균주는 16%의 높은 염도 범위까지 생장할 수 있으며, 6.5 내지 7.5%의 염도 범위에서 우수한 단백질 분해능 및 항균 활성을 유지할 수 있다.According to one embodiment, the Bacillus subtilis D12-5 strain can grow in a salt range of 0 to 16%, preferably 0 to 8%, more preferably 0 to 2% . ≪ / RTI > In particular, the Bacillus subtilis D12-5 strain of the present invention can grow to a high salinity range of 16%, and can maintain good protein decomposition and antibacterial activity in the range of 6.5 to 7.5% of the salinity.
일 구체예에 따르면 상기 바실러스 서브틸리스 D12-5 균주는 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase), 에스테라아제(esterase; C8), 에스테라아제(C4), 루신 아릴아미다아제(leucine arylamidase), 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤라제(naphthol-AS-BI-phosphohydrolase), 트립신(trypsin), 알파-키모트립신(α-chymotrypsin), 산성 인산가수분해효소(acid phosphatase), N-아세틸-베타-글루코사미니다아제(N-acetyl-β-glucosaminidase), 알파-글루코시다아제(α-glucosidase), 및 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타낼 수 있으며, 상기 효소들은 단백질, 전분, 이소플라빈 등을 분해하여 유용한 영양 성분을 증가시키는 역할을 한다.According to one embodiment, the Bacillus subtilis D12-5 strain is selected from the group consisting of alkaline phosphatase, esterase (C8), esterase (C4), leucine arylamidase, naphthol-AS Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase, trypsin, alpha-chymotrypsin, acid phosphatase, N-acetyl-beta-gluco May exhibit at least one enzyme activity selected from the group consisting of N-acetyl-β-glucosaminidase, α-glucosidase, and β-glucosidase, Enzymes decompose protein, starch, isoflavin, etc. to increase useful nutrients.
또한 본 발명의 다른 양상은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 D12-5 균주(기탁번호 KACC 18638), 상기 균주의 배양물, 상기 균주 또는 배양액의 농축물 및 이들의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 식품 발효용 조성물을 제공한다.In another aspect of the present invention, there is provided a kit for culturing a strain of Bacillus subtilis D12-5 (Accession No. KACC 18638) of the present invention, a culture of the strain, a concentrate of the strain or the culture, Wherein the composition for food fermentation comprises
본 발명의 용어 "배양물"은 배지에서 일정 기간 동안 배양하여 수득한 균주, 그의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 배지 또는 균주를 배양한 후 균주를 제거한 배양액을 포함하는 개념으로 해석된다.The term "culture product" of the present invention is interpreted as a concept including a culture medium obtained by culturing a medium or a strain containing the strain, its metabolites, extra nutrients, etc. obtained by culturing the medium for a certain period of time, and then removing the strain.
일 구체예에 따르면 본 발명의 바실러스 서브틸리스 D12-5 균주의 배양물은 미생물 배양에 사용되는 배지 중에서 당업자가 목적에 따라 용이하게 선택한 배지를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 바실러스균 배양에 사용되는 배지, 보다 바람직하게는 하기 실시예 1에 기재된 염화나트륨이 함유된 TSA 배지를 선택하여 사용할 수 있다.According to one embodiment, the culture of the strain Bacillus subtilis D12-5 of the present invention may be selected from a medium easily used by a person skilled in the art in a culture medium for microbial culture, preferably used for culture of bacillus bacteria Medium, more preferably TSA medium containing sodium chloride as described in the following Example 1 can be selected and used.
일 구체예에 따르면 본 발명의 바실러스 서브틸리스 D12-5 균주의 배양물은 상기 미생물 배양 배지에 본 발명의 균주를 접종하고, 당업계에 공지된 미생물 배양 방법(예를 들어, 정치배양, 교반배양)에 따라 제조할 수 있다. According to one embodiment, the culture of the strain Bacillus subtilis D12-5 of the present invention can be prepared by inoculating the strain of the present invention into the microorganism culture medium and culturing the microorganism in a microorganism culture method (for example, stationary culture, stirring Culture).
상기 바실러스 서브틸리스 D12-5 균주 또는 배양액의 농축물 및 이들의 건조물은 당업계에 공지된 미생물 또는 배양액의 농축 또는 건조 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있으며, 바실러스 서브틸리스 D12-5 균주, 균주의 배양물, 균주 또는 배양액의 농축물 및 이들의 건조물은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 본 발명의 식품 발효용 조성물에 1 내지 15 중량%로 함유될 수 있다.The Bacillus subtilis D12-5 strain or the concentrate of the culture broth and the dried product thereof can be easily prepared according to the method of concentrating or drying the microorganism or the culture medium known in the art, and the Bacillus subtilis D12-5 strain, The culture of the strain, the strain or the concentrate of the culture solution and the dried product thereof are not limited thereto, but may be contained in the food fermentation composition of the present invention in an amount of 1 to 15% by weight.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 D12-5 균주(기탁번호 KACC 18638), 상기 균주의 배양물, 상기 균주 또는 배양액의 농축물 및 이들의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 식품 위해 미생물의 저해용 조성물을 제공한다.Yet another aspect of the present invention relates to a strain of Bacillus subtilis D12-5 of the present invention (Accession No. KACC 18638), a culture of the strain, a concentrate of the strain or the culture solution, and a dried product thereof And a method for inhibiting microorganisms in food.
본 발명의 용어 "식품 위해 미생물"이란 식품 원료 또는 식품 자체에서 번식하여 사람에게 식중독을 유발하거나 식품의 부패 등을 유발하는 미생물을 말하며, 일 구체예에 따르면 상기 식품 위해 미생물은 대장균(Escherichia coli), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 및 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나 이에 한정하지 아니한다.The term "food-harmful microorganism " in the present invention refers to a microorganism that propagates in a foodstuff or a food itself to induce food poisoning in a person or cause food spoilage. According to one embodiment, the food microorganism is Escherichia coli), Bacillus cereus (Bacillus cereus), Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus), L. monocytogenes to Ness (Listeria monocytogenes , and Aspergillus flavus . However, the present invention is not limited thereto.
본 발명의 신규한 바실러스 서브틸리스 D12-5 균주는 단백질 분해능 및 항균 활성이 우수하기 때문에 영양이 풍부하고 위생적으로 안전한 발효식품 제조 및 식품 위해 미생물 억제에 유용하게 이용될 수 있다.The novel strain of Bacillus subtilis D12-5 of the present invention is excellent in protein degradation ability and antimicrobial activity, and thus can be useful for manufacturing fermented foods rich in nutrition and hygienic safety and for inhibiting food microorganisms.
도 1은 1차 선별한 10개 균주에서 단백질 분해능 및 항균 스펙트럼 조사 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 1차 선별한 10개 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용한 계통수 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 1차 선별한 10개 균주의 혈전 용해능을 피브린 플레이트에서 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 1차 선별한 10개 균주의 전분질 분해능을 전분 고체배지에서 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 1차 선별한 10개 균주의 섬유소 분해능을 CMC 고체배지에서 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6a 및 6b는 2차 선별한 3개 균주에서 내독소 생성 여부를 PCR로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 2차 선별한 3개 균주에서 용혈 현상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 최종 선별한 D12-5 균주가 가지고 있는 효소 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.FIG. 1 is a graph showing the results of protein degradation and antimicrobial spectroscopy in 10 primary strains selected.
FIG. 2 is a diagram showing the results of a phylogenetic analysis using 16S rRNA gene sequences of 10 strains selected first.
FIG. 3 is a graph showing the results of determination of the fibrinolytic activity of ten primary strains selected on a fibrin plate.
FIG. 4 shows the results of determination of the starch resolving ability of 10 strains sorted on a starch solid medium.
FIG. 5 is a graph showing the results of confirming the fibrinolytic ability of 10 strains sorted first in CMC solid medium. FIG.
FIGS. 6A and 6B are graphs showing the results of PCR for the endotoxin production in three secondary strains. FIG.
FIG. 7 is a diagram showing the result of checking the hemolysis phenomenon in the three strains sorted by the second selection.
FIG. 8 is a graph showing the result of confirming the enzyme activity of the D12-5 strain selected at the last selection.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, one or more embodiments will be described in more detail by way of examples. However, these embodiments are intended to illustrate one or more embodiments, and the scope of the present invention is not limited to these embodiments.
실시예Example 1: 단백질 분해능 및 항균 활성을 나타내는 균주의 선별 1: Selection of strains showing proteolytic and antibacterial activity
1-1: 단백질 분해능(1-1: Protein resolution ( proteolyticproteolytic activity)을 갖는 균주의 선별 activity)
된장 샘플 3 g을 PBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 및 2 mM KH2PO4; pH 7.0)에 현탁 시킨 후, 10진 희석법(serial dilution)으로 희석하였다. 이후 7.5%(w/v) 염화나트륨(NaCl) 및 1%(w/v) 스킴 밀크가 함유된 TSA(tryptone soy agar, Becton Dickinson, 미국) 배지에 균을 도말하여 37℃ 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 이후 군락 주변에 생긴 투명환의 크기에 따라 단백질 분해능을 측정하여, 군락 주변에 1 mm 이상의 투명환이 생긴 균주를 단백질 분해능이 있는 것으로 판단하였다.3 g of doenjang samples were suspended in PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 and 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.0) and then diluted by serial dilution. The cells were then plated on TSA (tryptone soy agar, Becton Dickinson, USA) medium containing 7.5% (w / v) sodium chloride (NaCl) and 1% (w / v) skim milk and cultured in a 37 ° C incubator for 48 hours Respectively. Protein resolution was measured according to the size of the transparent ring around the community, and the strain with a transparent ring of 1 mm or more around the community was judged to be protein degrading.
그 결과, 단백질 분해능을 나타내는 213 개의 균주를 선별하였다. As a result, 213 strains showing proteolytic activity were selected.
1-2: 항균 활성을 갖는 균주의 선별1-2: Screening of strains with antimicrobial activity
된장은 발효 과정에서 무균 처리를 거치지 않기 때문에 병원성 미생물이 오염될 수 있으며, 따라서 위생적으로 안전한 발효식품을 제조할 수 있는 균주를 선별하기 위하여 항균 활성을 비교하였다.The antimicrobial activity of soybean paste was compared to select strains which can contaminate pathogenic microorganisms because they do not undergo aseptic treatment during fermentation and thus can produce hygienically safe fermented foods.
구체적으로, 병원성균(Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus ATCC 27348, Staphylococcus aureus KCTC 3881, Listeria monocytogenes KCTC 13064 및 Aspergillus flavus subsp . flavus KACC 41809)을 TSB(Becton Dickinson, 미국) 배지에서 밤샘 배양하였다. 다음날 6.5%(w/v) 염화나트륨이 포함된 low-melt TSA(TSB with 2.0% low melting agar, Bio-Rad, 미국) 배지 5 ㎖에 상기 병원성균 배양액 5 ㎕를 각각 첨가하여 최종 농도가 106 cfu/㎖가 되도록 맞추었다. 이후 이미 고체화시킨 TSA-NaCl 배지 위에 상기 low-melt TSA 배지를 부어 추가로 고체화시켰다. 배지가 완전히 굳은 후 상기 실시예 1-1에서 선별한 균주의 전배양액 1 ㎕를 점적하고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 군락 주변에 생긴 투명환의 크기에 따라 항균 활성을 평가하여 균주를 선별하였다.Specifically, Escherichia coli O157: H7, Bacillus cereus ATCC 27348, Staphylococcus aureus KCTC 3881, Listeria monocytogenes KCTC 13064 and Aspergillus flavus subsp . flavus KACC 41809) were cultured overnight in TSB (Becton Dickinson, USA). The next day 6.5% (w / v) of sodium chloride containing low-melt TSA (TSB with 2.0 % low melting agar, Bio-Rad, USA) to each addition of the pathogen culture solution 5 ㎕ the medium 5 ㎖ final concentration of 10 6 cfu / ml. The low-melt TSA medium was then poured onto the already solidified TSA-NaCl medium to further solidify. After the medium was completely hardened, 1 占 퐇 of the pre-culture of the strain selected in Example 1-1 was dropped and cultured at 37 占 폚 for 24 hours. The antimicrobial activity was evaluated according to the size of the transparent circle formed around the community, Respectively.
그 결과, 상기 실시예 1-1에서 선별한 213개의 균주 중에서 43개의 균주를 선별하였으며, 하기 표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이 단백질 분해능(투명환의 직경 > 1 ㎜) 및 항균 활성(투명환의 직경 > 2 ㎜)이 뛰어난 10개의 균주를 1차로 선별하였다(도 1에서 (A) 단백질 분해능; (B) Escherichia coli O157:H7; (C) Bacillus cereus ATCC 27348; (D) Staphylococcus aureus KCTC 3881; (E) Listeria monocytogenes KCTC 13064; 및 (F) Aspergillus flavus subsp. flavus KACC 41809).As a result, 43 strains were selected from the 213 strains selected in Example 1-1, and the strains were screened for their protein degradation ability (transparent ring diameter > 1 mm) and antibacterial activity > 2 ㎜) (Fig. 1 (A) Protein Resolution; (B) Escherichia coli O157: H7; (C) Bacillus cereus ATCC 27348; (D) Staphylococcus aureus KCTC 3881; (E) Listeria monocytogenes KCTC 13064; And (F) Aspergillus flavus subsp. flavus KACC 41809).
분해능* protein
Resolution *
O157:H7† E. coli
O157: H7 †
ATCC 27348† B. cereus
ATCC 27348 †
KCTC 3881† S. aureus
KCTC 3881 †
KCTC 13064¶ L. monocytogenes
KCTC 13064 ¶
flavus KACC
41809† A. flavus subsp.
flavus KACC
41809 †
* 군락 주변의 투명환의 직경(㎜)이 단백질 분해능을 나타냄(+, 1.0 내지 1.5; ++, 1.5 내지 2.0; +++, 2.0 내지 2.5; ++++, >2.5) * Transparent ring diameter (㎜) of the community surrounding the resolution refers to the protein (+, 1.0 to 1.5; ++, from 1.5 to 2.0; +++, 2.0 to 2.5; ++++,> 2.5)
† 군락 주변의 투명환의 직경(㎜)이 항균 활성을 나타냄(-, negative; +, 0.01 내지 1.0; ++, 1.0 내지 2.0; +++, 2.0 내지 3.0; ++++, 3.0 내지 4.0; +++++, >4.0) † The diameter (mm) of the transparent circle around the community indicates antimicrobial activity (-, negative; +, 0.01 to 1.0; ++, 1.0 to 2.0; +++, 2.0 to 3.0; ++++, 3.0 to 4.0; +++++, > 4.0)
¶ 군락 주변의 투명환의 직경(㎜)이 항균 활성을 나타냄(-, negative; +, 0.01 내지 2.0; ++, 2.0 내지 4.0; +++, 4.0 내지 6.0; ++++, 6.0 내지 8.0; +++++, >8.0) ¶ transparent ring diameter (㎜) around the colonies indicating the antimicrobial activity (-, negative; +, 0.01 to 2.0; ++, from 2.0 to 4.0; +++, 4.0 to 6.0; ++++, 6.0 to 8.0; +++++, > 8.0)
실시예Example 2: 1차2: Primary 선별된 균주의 유전적 특징 분석 Genetic characterization of selected strains
상기 실시예 1-3에서 선별한 10개 균주의 특징을 분석하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.In order to analyze the characteristics of the 10 strains selected in Example 1-3, experiments were conducted as follows.
구체적으로, 각 균주의 군락을 선별하여 5%(w/v) Chelex-100 용액(Bio-Rad) 100 ㎕에 현탁시킨 후, 5분 동안 가열하여 crude genomic DNA를 추출하였다. 이후 Int. J. Syst. Evol . Microbiol . 65: 1015-1021 에 공지된 방법에 따라 16S rRNA 유전자를 증폭시키고, 서열분석을 실시하였다. D12-5 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열(서열번호 1) 및 다른 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 Ez-taxon server(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)를 통해 기존에 알려진 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열과 유사도(similarity)를 분석하였고, 상동성이 높은 상위 18개의 균주를 선정하여 SINA(the SILVA web aligner, http://www.arb-silva.de/aligner/) 프로그램을 사용하여 서열 비교정렬(alignment)을 수행하였다. 계통수(phylogenetic tree)는 PHYLIP 소프트웨어(version 3.695)의 neighbor-joining(NJ) 알고리즘을 사용하여 구성하였고, 기존에 알려진 염기서열과의 비교 및 계통수 분석을 통해 선별한 10개 균주의 계통학적 위치를 분석하였다.Specifically, the strains of each strain were selected, suspended in 100 μl of 5% (w / v) Chelex-100 solution (Bio-Rad) and heated for 5 minutes to extract crude genomic DNA. Since Int. J. Syst. Evol . Microbiol . The 16S rRNA gene was amplified and sequenced according to the method known in the art, 65: 1015-1021. The 16S rRNA gene sequence (SEQ ID NO: 1) of the D12-5 strain and the 16S rRNA gene sequence of the other strains were identified through the Ez-taxon server (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/) The 16S rRNA gene sequences were analyzed for similarity, and the top 18 strains with high homology were selected and used with SINA (the SILVA web aligner, http://www.arb-silva.de/aligner/) program Sequence comparison alignment was performed. The phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining (NJ) algorithm of PHYLIP software (version 3.695), and the phylogenetic location of the 10 strains selected by comparison with existing sequences and phylogenetic analysis Respectively.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 D12-5 균주를 포함한 10개 균주 모두 바실러스 속에 속하는 것을 확인하였다(균주 이름 옆의 KT 또는 KR로 시작되는 숫자는 GenBank accession number를 의미한다).As a result, as shown in FIG. 2, all of the 10 strains including D12-5 strains were found to belong to the genus Bacillus (the numbers starting with KT or KR next to the strain name means GenBank accession number).
실시예Example 3: 균주의 기능성 시험을 통한 2차 선별 3: Secondary selection by functional test of strain
3-1: 혈전 3-1: Thrombosis 용해능Solubility (( fibrionolytic피브리올ytic activity) 확인 activity
상기 실시예 1-3에서 선별한 10개의 균주들을 7%(w/v) 염화나트륨이 함유된 TSB 배지(최종 NaCl 농도: 7.5%)에서 24시간 이상 배양한 뒤, 피브린 플레이트 [0.5%(w/v) low melting agarose, 10 NIH U 트롬빈(Sigma-Aldrich, 미국)으로 응고시킨 0.4%(w/v) 피브리노겐(0.01 M PBS, pH 7.4)]에 놓인 종이 디스크 위에 세포를 제거한 배양 상등액 10 ㎕를 점적하였다. 37℃에서 24시간 동안 반응시킨 후 디스크 주변의 투명환 생성유무로 혈전 용해능의 존재 여부를 파악하였다.Ten strains selected in Example 1-3 were cultured in TSB medium (final NaCl concentration: 7.5%) containing 7% (w / v) sodium chloride for more than 24 hours, and then fibrin plates [0.5% v / v) fibrinogen (0.01 M PBS, pH 7.4) coagulated with 10 [mu] l low melting agarose, 10 NIH U thrombin (Sigma-Aldrich, USA) Respectively. After incubation at 37 ° C for 24 hours, the presence or absence of fibrinolytic activity was determined by the presence or absence of transparent rings around the disk.
그 결과, 하기 표 2 및 도 3에 나타난 바와 같이 대부분의 균주들이 혈전 용해능이 우수하였으나, YJ12-3 균주는 혈전 용해 능력이 없는 것을 확인하였다.As a result, as shown in Table 2 and FIG. 3, most of the strains had excellent thrombolytic activity, but the YJ12-3 strain had no thrombolytic ability.
3-2: 전분질 분해능(amylase activity) 확인3-2: Identification of amylase activity
1% 전분 고체배지(1% 수용성 전분, 0.2% 이스트 추출물, 0.1% K2HPO4, 0.15% MgSO4?7H2O, 1.5% agar 및 7.5% NaCl)에 상기 실시예 1에서 선별한 10개 균주의 배양액(OD600=1) 1 ㎕를 점적한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에 그람 요오드 용액(Gram's Iodine solution)을 고체배지 위에 부어 군락 주변의 투명환의 생성 유무로 전분질 분해능을 파악하였다.The cells were suspended in 1% starch solid medium (1% water-soluble starch, 0.2% yeast extract, 0.1% K 2 HPO 4 , 0.15% MgSO 4 ? 7H 2 O, 1.5% agar and 7.5% NaCl) 1 μl of the culture solution of the strain (OD 600 = 1) was added thereto, followed by incubation at 37 ° C for 24 hours. After 24 hours, the Gram's Iodine solution was poured onto a solid medium to determine the starch resolution with or without the formation of transparent rings around the community.
그 결과, 상기 표 2 및 도 4에 나타난 바와 같이 D11-21 균주를 제외한 9개의 균주가 전분질 분해능이 우수한 것을 확인하였다.As a result, as shown in Table 2 and FIG. 4, it was confirmed that nine strains except the D11-21 strain had excellent starch resolution.
3-3: 섬유소 분해능(3-3: Fibrin resolution ( cellulasecellulase activity) 확인 activity
7.5% 염화나트륨(NaCl)을 함유한 카르복시메틸 셀룰로오스 고체배지(KH2PO4 1.0, MgSO47H2O 0.5, FeSO47H2O 0.01, MnSO4H2O 0.01, NH4NO3 0.3, carboxymethyl cellulose 10.0 및 Agar 12.0 (g/L))에 선별한 10개 균주의 배양액(OD600=1) 1 ㎕를 점적한 후 37℃에서 약 5일 동안 배양하였다. 배양 후에 1%(w/v) 콩고 레드(Congo red) 용액을 고체배지 위에 부어 15분 동안 방치한 뒤 제거하고, 1 M 염화나트륨 용액으로 15분 동안 콩고 레드 용액을 세척하였다. 군락 주변의 투명환 생성 유무로 섬유소 분해능을 평가하였다.Carboxymethylcellulose solid medium (KH 2 PO 4 1.0, MgSO 4 7H 2 O 0.5, FeSO 4 7H 2 O 0.01, MnSO 4 H 2 O 0.01, NH 4 NO 3 0.3, carboxymethyl cellulose containing 7.5% NaCl) and 10.0 Agar 12.0 (g / L)) 10 gae culture medium of the strains selected in (after instillation of OD 600 = 1) 1 ㎕ and incubated for about 5 days at 37 ℃. After incubation, a 1% (w / v) Congo red solution was poured onto the solid medium to allow it to stand for 15 minutes, then remove and wash the Congo red solution with 1 M sodium chloride solution for 15 minutes. The fibrinolytic activity was evaluated by the presence or absence of transparent rings around the community.
그 결과, 상기 표 2 및 도 5에 나타난 바와 같이 D11-1, JJ-D34 및 D18-8 균주를 제외한 7개의 균주가 섬유소 분해능력이 우수한 것을 확인하였다.As a result, as shown in Table 2 and FIG. 5, it was confirmed that seven strains except D11-1, JJ-D34 and D18-8 were excellent in the decomposing ability of cellulose.
상기 실시예 3-1 내지 3-3의 결과에 기초하여, D2-2, JJ-D34 및 D12-5 균주를 추가 선별에 이용하였다.On the basis of the results of Examples 3-1 to 3-3, strains D2-2, JJ-D34 and D12-5 were used for further screening.
실시예Example 4: 안정성 시험을 통한 최종 4: final through stability test 발효균주Fermentation strain 선별 Selection
4-1: 내독소(4-1: endotoxin ( endotoxinendotoxin ) 생산 여부 확인) Confirm production
내독소 생산 유전자인 nheA , nheB , nheC , hblA , hblB , hblC , hblD , bceT , entFM, cytK 및 ces를 표적으로 하는 프라이머(primer)로 PCR을 수행하여 내독소 생산 여부를 확인하였다. 양성 대조군으로 B. cereus ATCC 27348 균주를 이용하였으며, PCR 조건 및 사용한 프라이머의 서열은 하기 표 3 및 4에 기재하였다.Endotoxin producing genes nheA , nheB , nheC , hblA , hblB , hblC , hblD , bceT , entFM, cytK And PCR was performed with a primer targeting ces to confirm endotoxin production. B. cereus ATCC 27348 strain was used as a positive control, and PCR conditions and sequences of the primers used were shown in Tables 3 and 4 below.
(denaturation)denaturalization
(denaturation)
(final extension)Last kidney
(final extension)
68℃-2분)x 10회(94 ° C.-10 seconds, 58 ° C.-30 seconds, and
68 ° C - 2 minutes) x 10 times
68℃-2분(매회 20초씩 증가시킴))x 20회(94 ° C.-10 seconds, 58 ° C.-30 seconds, and
68 캜 - 2 min (increased by 20 seconds each time) x 20 times
94℃-2분
94 ° C - 2 min
72℃-5분
72 ° C - 5 minutes
그 결과, 도 6a 및 6b에 나타난 바와 같이 양성 대조군인 B. cereus ATCC 27348 균주에서는 ces 유전자를 제외한 다른 독소 유전자의 PCR 밴드가 형성된 것을 확인할 수 있었으나, 선별한 3개 균주에서는 PCR 밴드가 형성되지 않아 내독소를 생산하지 않는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIGS. 6A and 6B, it was confirmed that PCR bands of other toxin genes except for ces gene were formed in B. cereus ATCC 27348 positive control group, but PCR bands were not formed in the selected three strains It was confirmed that it did not produce endotoxin.
4-2: 용혈현상(4-2: Hemolysis ( hemolysishemolysis ) 확인) Confirm
5% sheep blood(Thermo scientific, 미국)가 첨가된 TSA 배지에 균을 선조접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양한 뒤 군락 주변에 투명환 생성여부로 확인하였다. 양성 대조군으로 B. cereus ATCC 27348 균주를 사용하였으며, 음성 대조군으로는 E. coli O157:H7 균주를 사용하였다.5% sheep blood (Thermo scientific, USA) was added to the TSA medium and incubated at 37 ° C for 16 hours. B. cereus ATCC 27348 strain was used as a positive control, and E. coli O157: H7 strain was used as a negative control.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 D2-2, JJ-D34 및 D12-5 균주 모두 투명환이 형성되지 않아 용혈현상을 유발하지 않는 것을 확인하였다.As a result, as shown in Fig. 7, it was confirmed that neither D2-2, JJ-D34 nor D12-5 strains formed a transparent ring and did not cause hemolysis.
4-3: 항생제 내성(antibiotic susceptibility) 시험4-3: Antibiotic susceptibility test
선별한 3개 균주를 TSB 배지에서 OD600=1이 되도록 배양한 뒤 Top agar method를 이용하여 TSA 배지에 얇게 중층하고 배지를 30분 동안 고체화시켰다. 항생제가 함유된 필터-페이퍼 디스크(filter-paper discs; 6 mm, GE Healthcare of Life Sciences, 미국)를 배지 위에 올려놓고 37℃에서 24시간 동안 배양하여 군락 주변의 투명환을 관찰하였다. 항생제는 필터-페이퍼 디스크 마다 다음과 같은 농도로 사용하였다: 암피실린(ampicillin; 10 ㎎), 폴리믹신 B(polymyxin B; 100 U), 스트렙토마이신(streptomycin; 50 ㎎), 페니실린 G(penicillin G; 20 U), 젠타마이신(gentamicin; 30 ㎎), 클로람페니콜(chloramphenicol; 100 ㎎), 테트라사이클린(tetracycline; 30 ㎎), 카나마이신(kanamycin; 30 ㎎), 린코마이신(lincomycin; 15 ㎎), 올레안도마이신(oleandomycin; 15 ㎎), 카베니실린(carbenicillin; 100 ㎎), 네오마이신(neomycin; 30 ㎎), 및 노보바이오신(novobiocin; 5 ㎎).Three selected strains were cultured on TSB medium to OD 600 = 1, and then thinly layered on TSA medium using Top agar method and the medium was solidified for 30 minutes. Filter-paper discs (6 mm, GE Healthcare of Life Sciences, USA) containing antibiotics were placed on the medium and cultured at 37 ° C for 24 hours to observe the transparent rings around the colonies. Antibiotics were used at the following concentrations for each filter-paper disc: ampicillin (10 mg), polymyxin B (100 U), streptomycin (50 mg), penicillin G U), gentamicin (30 mg), chloramphenicol (100 mg), tetracycline (30 mg), kanamycin (30 mg), lincomycin (15 mg), oleandomycin oleomycin (15 mg), carbenicillin (100 mg), neomycin (30 mg), and novobiocin (5 mg).
그 결과, 하기 표 5에 나타난 바와 같이 노보바이오신을 제외하고 3개의 균주 모두 항생제에 민감한 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 노보바이오신의 경우 JJ-D34 균주는 내성이 있었으며, D2-2 및 D12-5 균주는 민감한 것을 확인하였다.As a result, as shown in Table 5 below, all three strains except novobiocin were susceptible to antibiotics. However, in the case of novobiocin, the JJ-D34 strain was resistant and the D2-2 and D12-5 strains were susceptible.
실시예Example 5: 5: 바실러스Bacillus 서브틸리스Subtilis (( Bacillus Bacillus subtilissubtilis ) D12-5 균주의 특징 분석) Characterization of D12-5 strain
최종 선별한 바실러스 서브틸리스 D12-5 균주를 TSA 배지에 도말한 후 염도(salt), 온도, pH, 혐기 조건에서의 성장 특징을 분석하고, 효소 활성을 확인하였다.The final selection of Bacillus subtilis D12-5 strain was applied to TSA medium and the growth characteristics at salt, temperature, pH and anaerobic condition were analyzed and enzyme activity was confirmed.
5-1: 생장 조건 확인5-1: Confirmation of growth condition
염도 조건은 0 내지 20%까지 1% 간격으로 염화나트륨 농도를 달리한 배지를 이용하여 37℃에서 3일 동안 배양하여 확인하였으며, 온도 조건은 5℃ 간격으로 5 내지 60℃에서 4일 동안 배양하면서 관찰하였다. 생육 pH 범위는 0.5 간격으로 pH 4.0 내지 10.0까지 37℃에서 4일 동안 배양하여 확인하였다. 혐기 조건에서의 생장을 확인하기 위하여 GasPak Plus system(BBL, 미국)을 이용하여 이산화탄소 농도 4 내지 10%의 혐기 조건으로 균주를 37에서 20일 동안 배양하였다.Salinity conditions were determined by incubating the medium at 37 ° C for 3 days using a medium containing sodium chloride at 0% to 20% intervals of 1%. Temperature conditions were observed at 5 ° C intervals for 4 days at 5 to 60 ° C Respectively. The growth pH range was confirmed by culturing at pH 4.0 to 10.0 at intervals of 0.5 for 4 days at 37 ° C. To confirm the growth under anaerobic conditions, the strains were cultivated at 37 to 20 days in an anaerobic condition with a carbon dioxide concentration of 4 to 10% using GasPak Plus system (BBL, USA).
그 결과 표 6에 나타난 바와 같이 본 발명의 D12-5 균주가 넓은 생육 온도 및 염도 범위에서 생존할 수 있음을 확인하였다. 특히 D12-5 균주는 16%의 높은 염도 범위까지 생장할 수 있으며, 6.5 내지 7.5%의 염도 범위에서 단백질 분해능 및 항균 활성이 우수하여 다른 바실러스 균주와 차이를 보이고 있다.As a result, as shown in Table 6, it was confirmed that the D12-5 strain of the present invention can survive in a wide range of growth temperature and salinity. In particular, the D12-5 strain can grow to a high salinity range of 16%, and has excellent protein resolution and antimicrobial activity in the range of 6.5 to 7.5% of salinity, showing a difference from other Bacillus strains.
* 20일 후에 생장이 둔화됨 * Growth slowed after 20 days
5-2: 생체 아민 생산 여부 및 효소 활성 분석5-2: Biological amine production and enzyme activity analysis
생체 아민(biogenic amines, BA)은 단백질의 대사과정에서 발생하는 질소화합물로, 발효 조건에 따라 된장에서 자주 발견되는 물질이다. 과량 섭취할 경우 식중독 유사증상, 고혈압을 유발할 수 있고, 발암물질의 전구물질로 전환될수 있다. 따라서, 생산 여부를 조사한 결과 본 발명의 D12-5 균주는 BA를 생산하지 않는 것을 확인하였다.Biogenic amines (BA) are nitrogen compounds that are produced in the metabolism of proteins and are frequently found in soybean paste depending on fermentation conditions. Excessive intake can lead to food poisoning-like symptoms, hypertension, and can be converted to precursors to carcinogens. As a result, it was confirmed that D12-5 strain of the present invention does not produce BA.
또한, 생체에 유용한 물질인 γ-PGA(poly-γ-glutamic acid)의 생산 여부를 확인한 결과, D12-5 균주가 γ-PGA를 생산하여 외부로 배출하는 것을 확인하였다.In addition, the production of γ-PGA (poly-γ-glutamic acid), which is a useful substance in living body, was confirmed, and it was confirmed that D12-5 strain produced γ-PGA and excreted it to the outside.
또한, API-ZYM kit(bioMerieux, 프랑스)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 D125 균주가 가지고 있는 효소의 활성을 측정하였다.In addition, the enzyme activity of the D125 strain was measured using the API-ZYM kit (bioMerieux, France) according to the manufacturer's instructions.
그 결과 도 8에 나타난 바와 같이 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase), 에스테라아제(esterase; C8), 에스테라아제(C4), 루신 아릴아미다아제(leucine arylamidase), 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤라제(naphthol-AS-BI-phosphohydrolase), 트립신(trypsin), 알파-키모트립신(α-chymotrypsin), 산성 인산가수분해효소(acid phosphatase), N-아세틸-베타-글루코사미니다아제(N-acetyl-β-glucosaminidase), 알파-글루코시다아제(α-glucosidase), 및 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 활성이 있는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Fig. 8, it was confirmed that the alkaline phosphatase, esterase (C8), esterase (C4), leucine arylamidase, naphthol-AS-BI-phosphohydrolase Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase, trypsin, alpha-chymotrypsin, acid phosphatase, N-acetyl-beta-glucosaminidase, beta-glucosaminidase, alpha-glucosidase, and beta-glucosidase, respectively.
콩에 들어있는 이소플라본(isoflavones)은 글루코시드 구조 때문에 위에서 잘 흡수되지 않지만, 본 발명의 균주를 이용한 발효식품의 경우 D12-5 균주가 베타-글루코시다아제 활성을 가지고 있으므로 이소플라본의 생체 이용을 증가시킬 수 있다.The isoflavones contained in the soybeans are not well absorbed from the top due to the glucosidic structure. However, in the case of the fermented food using the strain of the present invention, the D12-5 strain has a beta-glucosidase activity, .
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.
<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> A novel Bacillus subtilis D12-5 strain with high proteolysis ability and antimicrobial activities <130> PN160129 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1414 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 atgcagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60 acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120 atggttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180 ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag 240 ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300 ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360 gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtac cgttcgaata 420 gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480 ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540 tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600 aacttgagtg cagaagagga 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<223> synthetic nucleotides <400> 2 gttaggatca caatcaccgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 3 acgaatgtaa tttgagtcgc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 4 tttagtagtg gatctgtacg c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 5 ttaatgttcg ttaatcctgc 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 6 tggattccaa gatgtaacg 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 7 attacgactt ctgcttgtgc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 8 aagcaatgga atacaatggg 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 9 agaatctaaa tcatgccact gc 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 10 aagcaatgga atacaatggg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 11 aatatgtccc agtacacccg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 12 gatacyaatg tggcaactgc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 13 ttgagactgc tcgytagttg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 14 accggtaaca ctattcatgc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 15 gagtccatat gcttagatgc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 16 cgtatcggtc gttcactcgg 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 17 gttgattttc cgtagcctgg g 21 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 18 agaatctaaa tcatgccact gc 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 19 gtatgtagct gggcctgtac gt 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 20 gtaactttca ttgatgatcc 20 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 21 gaatactaaa taattggttt cc 22 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 22 ggtgacacat tatcatataa ggtg 24 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 23 gtaagcgaac ctgtctgtaa caaca 25 <110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> A novel Bacillus subtilis D12-5 strain with high proteolysis ability and antimicrobial activities <130> PN160129 <160> 23 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 1414 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 atgcagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60 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aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960 tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020 gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080 ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140 tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa 1200 caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260 gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320 cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380 cccgaagtcg gtgaggtaac ctttaggagc cagc 1414 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 2 gttaggatca caatcaccgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 3 acgaatgtaa tttgagtcgc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 4 tttagtagtg gatctgtacg c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> 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nucleotides <400> 21 gaatactaaa taattggttt cc 22 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 22 ggtgacacat tatcatataa ggtg 24 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotides <400> 23 gtaagcgaac ctgtctgtaa caaca 25
Claims (8)
Bacillus subtilis D12-5 strain (Accession No. KACC 18638) which is excellent in proteolytic and antibacterial activity.
상기 균주는 10 내지 60℃에서 생장하는 것을 특징으로 하는 균주.
The method according to claim 1,
Wherein said strain grows at 10 to < RTI ID = 0.0 > 60 C. < / RTI >
상기 균주는 pH 4.0 내지 10.0에서 생장하는 것을 특징으로 하는 균주.
The method according to claim 1,
Wherein the strain grows at a pH of 4.0 to 10.0.
상기 균주는 염도 0 내지 16%에서 생장하는 것을 특징으로 하는 균주.
The method according to claim 1,
Wherein the strain grows at a salinity of 0 to 16%.
상기 균주는 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase), 에스테라아제(esterase; C8), 에스테라아제(C4), 루신 아릴아미다아제(leucine arylamidase), 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤라제(naphthol-AS-BI-phosphohydrolase), 트립신(trypsin), 알파-키모트립신(α-chymotrypsin), 산성 인산가수분해효소(acid phosphatase), N-아세틸-베타-글루코사미니다아제(N-acetyl-β-glucosaminidase), 알파-글루코시다아제(α-glucosidase), 및 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 균주.
The method according to claim 1,
The strain may be selected from the group consisting of alkaline phosphatase, esterase (C8), esterase (C4), leucine arylamidase, naphthol-AS -BI-phosphohydrolase, trypsin, alpha -chymotrypsin, acid phosphatase, N-acetyl-beta-glucosaminidase, Wherein the strain exhibits at least one enzyme activity selected from the group consisting of alpha-glucosidase and beta-glucosidase.
A composition for food fermentation comprising the Bacillus subtilis D12-5 strain (Accession No. KACC 18638) of claim 1, a culture of the strain, a concentrate of the strain or the culture, and a dried product thereof.
A method for producing a food product comprising at least one selected from the group consisting of the Bacillus subtilis D12-5 strain (accession number KACC 18638) of claim 1, a culture of the strain, a concentrate of the strain or the culture, A composition for inhibiting microorganisms.
상기 식품 위해 미생물은 대장균(Escherichia coli), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 및 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 식품 위해 미생물의 저해용 조성물.
8. The method of claim 7,
The food- borne microorganism is Escherichia coli), Bacillus cereus (Bacillus cereus), Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus), L. monocytogenes to Ness (Listeria monocytogenes , and Aspergillus flavus . The composition for inhibiting food-borne microorganisms according to claim 1, wherein the microorganism is selected from the group consisting of monocytogenes and Aspergillus flavus .
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200044366A (en) * | 2018-10-19 | 2020-04-29 | 중앙대학교 산학협력단 | Novel Bacillus velezensis KD1 Strain having High Proteolysis Ability and Antimicrobial Activity |
| KR20200087383A (en) | 2019-01-10 | 2020-07-21 | 신라대학교 산학협력단 | A antimicrobial peptide and a antimicrobial composition containing the same |
| KR20200087382A (en) | 2019-01-10 | 2020-07-21 | 신라대학교 산학협력단 | A antimicrobial peptide and a antimicrobial composition containing the same |
| KR102159379B1 (en) * | 2019-07-04 | 2020-09-24 | 재단법인 발효미생물산업진흥원 | Bacillus subtilis SRCM101371 strain having improved mucosal adhesive capacity and extracellular enzyme secretion activity and probiotics property and uses thereof |
-
2016
- 2016-06-22 KR KR1020160077798A patent/KR20180000364A/en not_active Application Discontinuation
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