KR20170132784A - 글로빈 유전자 클러스터의 조절 요소를 포함하는 진핵생물 발현 벡터 - Google Patents
글로빈 유전자 클러스터의 조절 요소를 포함하는 진핵생물 발현 벡터 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 재조합 단백질 생성 분야에 관한 것이다. 관심 단백질 또는 폴리펩티드의 향상된 발현율을 나타내는 인간 글로빈 유전자 클러스터의 요소를 포함하는 신규한 발현 카세트가 제공된다.
Description
본 발명은 관심 단백질의 생성 수율을 향상시키는데 사용될 수 있는 신규한 발현 카세트에 관한 것이다. 발현 카세트는 인간 글로빈 유전자 클러스터의 발현 조절 요소, 특히 인간 Aγ 글로빈의 프로모터 및 인간 β-글로빈 또는 α-글로빈 유전자 클러스터의 유전자좌 제어 영역을 포함한다. 본 발명은 특히 상기 글로빈 발현 조절 요소를 포함하는 발현 카세트를 제공한다.
재조합 단백질 생성은 오늘날의 생명공학 산업의 주요 측면이다. 이는 시장에서 대량의 고품질의 단백질을 필요로 하는 적용분야의 수가 증가함에 따라 점점 더 중요성이 커지고 있다. 식품 생산 및 특히 약리학은 재조합 단백질의 필요성이 꾸준히 증가하는 2개의 주요 분야이다. 상업적으로 실행 가능한 과정을 얻기 위해서는 높은 생산 효율 및 결과적으로 최종 제품의 낮은 비용이 요구된다.
그러나, 동시에 높은 제품 품질 및 인간 적용과의 양립성이 필수적이다. 점점 더 많은 적용분야가 진핵생물 세포, 특히 고등 진핵생물 세포에서의 단백질의 재조합 생성을 필요로 한다. 특히, 번역후 변형, 예를 들어, 당화를 갖는 단백질(당단백질)은 E. 콜라이와 같은 원핵생물 세포 시스템 또는 특히 인간 세포주와 같은 진핵생물 세포 시스템에서 이들을 발현시키는 경우 유의하게 상이하다. 이러한 차이는 많은 경우에 생성된 단백질의 생물학적 활성뿐만 아니라 면역원성에 현저히 영향을 미친다. 그러나, 고등 진핵생물 세포주를 이용하는 많은 발현 시스템은 원하는 단백질의 다소 낮은 발현율의 문제를 겪으며, 이는 재조합 단백질의 낮은 수율 및 높은 비용을 발생시킨다.
따라서, 특히 진핵생물 발현 세포주를 이용하는 경우 재조합 단백질 생성의 수율을 증가시키기 위한 새로운 수단 및 방법을 제공하는 것이 당 분야에서 필요하다.
본 발명에 의해 입증되는 바와 같이, 인간 글로빈 유전자 클러스터의 특정 요소는 조합되어 진핵생물 세포에서 관심 폴리펩티드의 안정적이고 높은 발현을 가능하게 하는 발현 카세트를 제공할 수 있다. 특히, β-글로빈 유전자 클러스터 또는 α-글로빈 유전자 클러스터의 유전자좌 제어 영역의 특정 부분과 Aγ 글로빈 프로모터 및 선택적으로 또한 Aγ 글로빈 3' 인핸서의 조합은 놀라울 정도로 높고 안정적인 발현율을 갖는 발현 카세트를 형성한다.
따라서, 본 발명은 첫번째 양태에서,
(a) 서로 기능적으로 연결된, (i) 인간 β-글로빈 유전자 클러스터 또는 인간 α-글로빈 유전자 클러스터의 유전자좌 제어 영역의 적어도 기능성 부분을 포함하는 유전자좌 제어 영역; (ii) 인간 Aγ 글로빈 유전자의 프로모터의 적어도 기능성 부분을 포함하는 프로모터 영역; 및 (iii) 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 코딩 영역을 포함하는, 발현 카세트를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
(b) 숙주 세포가 관심 폴리펩티드를 발현하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(c) 관심 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함하는,
관심 폴리펩티드를 재조합적으로 생성시키기 위한 방법을 제공한다.
두번째 양태에서, 본 발명은 서로 기능적으로 연결된,
(i) 인간 β-글로빈 유전자 클러스터 또는 인간 α-글로빈 유전자 클러스터의 유전자좌 제어 영역의 적어도 기능성 부분을 포함하는 유전자좌 제어 영역;
(ii) 인간 Aγ 글로빈 유전자의 프로모터의 적어도 기능성 부분을 포함하는 프로모터 영역;
(iii) 선택적으로, 코딩 영역;
(iv) 전사 종료자 영역; 및
(v) 인간 Aγ 글로빈 유전자의 3' 인핸서의 적어도 기능성 부분을 포함하는 인핸서 영역을 포함하는 발현 카세트를 제공하며,
상기 발현 카세트는 전체 인간 Aγ 글로빈을 코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다.
세번째 양태에서, 본 발명은 두번째 양태에 따른 발현 카세트를 포함하는 벡터 및 상기 발현 카세트 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 장점 및 양태는 하기 설명 및 첨부된 청구항으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 그러나, 본 출원의 바람직한 구체예를 나타내는 하기 설명, 첨부된 청구항, 및 특정 예는 단지 예시로서 제공되는 것이 이해되어야 한다. 개시된 본 발명의 사상 및 범위 내에서의 다양한 변화 및 변형은 하기를 읽음으로써 당업자에게 용이하게 명백해질 것이다.
정의
본원에서 사용되는 하기 표현은 일반적으로 이들이 사용되는 문맥이 달리 기재하는 경우를 제외하고는 바람직하게는 하기 기재되는 의미를 갖는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 표현 "포함하다"는 이의 문자상의 의미 외에도 또한 표현 "~을 필수적으로 포함하는" 및 "~로 구성되는"을 포함하며, 특별히 이들을 나타낸다. 따라서, 표현 "포함하다"는 특별히 나열된 요소를 "포함하는" 주제가 추가의 요소를 포함하지 않는 구체예뿐만 아니라 특별히 나열된 요소를 "포함하는" 주제가 추가의 요소를 포함할 수 있고/있거나 확실히 포함하는 구체예를 나타낸다. 마찬가지로, 표현 "갖는다"는 표현 "포함하다"로 이해되어야 하며, 또한 표현 "~을 필수적으로 포함하는" 및 "~로 구성되는"을 포함하고, 특별히 이들을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산"은 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 중합체를 나타낸다. 핵산은 RNA 또는 DNA일 수 있다. 이는 단일 중합체 가닥으로 구성될 수 있거나, 이는 이중 가닥일 수 있다. 핵산은 천연, 재조합 또는 합성 기원의 핵산일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 핵산은 이중 가닥 DNA이다.
"발현 카세트"는 상기 서열과 양립되는 숙주에서 구조 유전자의 발현을 수행할 수 있는 핵산 요소로 생성되거나 합성된 핵산 작제물이다. 발현 카세트는 적어도 프로모터 및 선택적으로 전사 종료 신호를 포함한다. 통상적으로, 발현 카세트는 전사되는 핵산 및 프로모터를 포함한다. 발현을 수행하는데 도움이 되는 추가 인자가 또한 본원에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 예를 들어, 발현 카세트는 또한 숙주 세포로부터 발현된 단백질의 분비를 유도하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 발현 카세트는 바람직하게는 발현 벡터의 일부이다. 전사되는 핵산의 발현에 사용될 숙주 세포는 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된다. 작제물을 포함하는 형질전환된 세포의 선별을 가능하게 하기 위해, 선별 마커 유전자가 발현 벡터에 편리하게 포함될 수 있다. 당업자는 이러한 벡터 성분이 이의 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않고 변형될 수 있음을 인지할 것이다.
표현 "기능적으로 연결된"은 발현 카세트의 2개 이상의 요소가 이들의 기능이 조화되고, 코딩 서열(예를 들어, 코딩 영역)의 발현을 가능하게 하는 방식으로 서로 연결되는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터는 상기 코딩 서열의 발현을 보장할 수 있는 경우에 코딩 서열에 기능적으로 연결된다. 본 발명에 따른 발현 카세트의 작제 및 이의 다양한 요소의 조립은 당업자에게 널리 공지된 기술, 특히 문헌[Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)]에 기재된 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "업스트림" 및 "다운스트림"은 핵산 분자 상의 다른 핵산 요소 또는 서열에 대한 상기 핵산 분자 상의 한 핵산 요소 또는 서열의 위치를 나타낸다. "업스트림"은 핵산 분자의 5' 말단에 더 가까운 위치를 나타내고, "다운스트림"은 핵산 분자의 3' 말단에 더 가까운 위치를 나타낸다. 이중 가닥 핵산, 특히 DNA의 경우, mRNA와 같은 RNA의 전사를 위한 매트릭스로 사용되는 핵산의 가닥, 즉, 센스 가닥이 핵산의 5' 말단 및 3' 말단을 결정하는데 사용된다. 그러므로, "업스트림"은 센스 가닥의 5' 말단 방향에 존재하는 반면, "다운스트림"은 센스 가닥의 3' 말단 방향에 존재한다.
표적 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 "동족체"는 상기 표적 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 공유한다. 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 "상동성" 또는 "동일성"은 바람직하게는 표적 서열의 전체 길이에 걸쳐 또는 표적 서열의 표시된 부분의 전체 길이에 걸쳐 본 발명에 따라 결정된다. 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 언급하는 경우, 본 발명은 또한 일반적으로 상기 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 동족체를 각각 포함한다. 표적 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 동족체는 특히 이들이 유래되는 표적 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 기능 및 활성을 갖는 기능성 동족체이다.
"프로모터"는 이에 기능적으로 연결된 핵산 서열, 특히 코딩 서열의 전사를 가능하게 하고 이를 제어하는 핵산 서열이다. 프로모터는 RNA 중합효소를 결합시키기 위한 인지 서열을 함유하며, 전사 개시 부위를 포함하거나 이에 기능적으로 연결된다. 프로모터는 특정 신호의 존재(또는 부재)하에서만 활성인 유도성 프로모터일 수 있거나, 이는 항시적으로 활성일 수 있다. 프로모터의 활성은 조절 요소, 예를 들어, 유전자좌 제어 영역 및 인핸서 요소에 의해 추가로 조절될 수 있다.
"코딩 서열"은 유전자 생성물, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 RNA를 인코딩하는 핵산 서열이다.
핵산 요소의 "일부"는 특히 상기 핵산 요소의 적어도 5개의 핵산, 바람직하게는 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개 또는 적어도 50개의 핵산을 포함한다. 핵산 요소의 "일부"는 특히 상기 핵산 요소의 적어도 5개의 연속적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개 또는 적어도 50개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다. 특히, 이는 상기 핵산 요소의 적어도 1%, 바람직하게는 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 5%, 적어도 7.5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20% 또는 적어도 25%를 포함한다. 핵산 요소의 "기능성 부분"은 상기 요소의 의도된 기능을 수행할 수 있는 상기 요소의 부분이다. 예를 들어, 유전자좌 제어 영역, 프로모터 또는 3' 인핸서의 기능성 부분은 이들이 기능적으로 연결된 코딩 영역의 발현을 조절, 특히 향상시킬 수 있다. 핵산 요소의 일부는 특히 상기 핵산 요소의 기능성 부분을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "펩티드" 또는 "폴리펩티드"는 적어도 5개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 나타낸다. 펩티드 또는 폴리펩티드는 바람직하게는 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개 또는 적어도 35개의 아미노산을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "펩티드" 또는 "폴리펩티드"는 또한 번역후 변형된 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 포함하는 단백질을 나타낸다. 특히, 용어 펩티드 또는 폴리펩티드는 당화된 펩티드 및 당단백질을 포함한다. 용어 "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 일부는 바람직하게는 상기 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 적어도 3개의 연속적인 아미노산, 바람직하게는 상기 단백질의 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개 또는 적어도 20개의 연속적인 아미노산을 포함한다.
용어 "약학적 조성물" 및 유사한 용어는 특히 인간에게 투여하기에 적합한 조성물, 즉, 약학적으로 허용되는 성분을 함유하는 조성물을 나타낸다. 바람직하게는, 약학적 조성물은 활성 화합물 또는 이의 염 또는 프로드러그와 함께 담체, 희석제 또는 약학적 부형제, 예를 들어, 완충제, 보존제 및 긴장성 조절제를 포함한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 인간 글로빈 유전자 클러스터의 유전자좌 제어 영역의 적어도 일부 및 인간 Aγ 글로빈 프로모터를 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다.
헤모글로빈은 산소 및 이산화탄소의 수송을 가능하게 하는 인간 및 동물의 혈액 내의 금속단백질이다. 헤모글로빈은 각각이 철 이온을 갖는 헴 그룹과 밀접하게 회합된 폴리펩티드 사슬로 구성되는 4개의 서브유닛(글로빈)으로 구성된 다중-서브유닛 구상 단백질이다. 여러 상이한 유형의 글로빈 서브유닛이 있으며, 헤모글로빈의 서브유닛 구성은 평생 동안 변한다. 예를 들어, 인간 태아는 2개의 글로빈 α 및 2개의 글로빈 γ로 구성된 헤모글로빈 F(α2γ2)를 갖는 반면, 성인에서 2개의 글로빈 α 및 2개의 글로빈 β를 갖는 헤모글로빈 A(α2β2)가 우세하다. 상이한 글로빈 폴리펩티드는 인간의 상이한 발달 상태에서 상이한 서브유닛의 발현을 담당하는 인간 글로빈 유전자 클러스터에 의해 발현된다. 인간 β-글로빈 유전자 클러스터는 유전자좌 제어 영역 및 5개의 상이한 글로빈 유전자, 즉, ε-, Gγ-, Aγ-, δ- 및 β-글로빈 유전자를 포함한다. 마찬가지로, α-글로빈 유전자 클러스터는 또한 유전자좌 제어 영역 및 ζ-, α2-, α1- 및 θ-글로빈 유전자를 포함한다. 도 1은 인간 α- 및 β-글로빈 유전자 클러스터의 구조를 제시한다. 유전자 클러스터 내의 각각의 별개의 글로빈 유전자는 각각의 글로빈 서브유닛의 코딩 서열의 발현을 제어하는 자체의 특이적 프로모터 및 인핸서 서열을 갖는다. 그러나, 이들 프로모터는 그 자체가 유전자좌 제어 영역에 의해 조절된다. 특히, 유전자좌 제어 영역은 프로모터를 활성화시키거나 비활성화시킬 수 있고, 이러한 활성화 패턴은 생애 전체에 걸쳐 변한다. 그러므로, 둘 모두의 유전자좌 제어 영역(α-글로빈 유전자 클러스터에 하나 및 β-글로빈 유전자 클러스터에 하나)은 발달 동안 상이한 글로빈 유전자의 발현을 조율하여 상이한 헤모글로빈 단백질의 특정 서브유닛 구성을 발생시킨다.
유전자좌 제어 영역은 프로모터의 활성화 및 비활성화를 담당하는 여러 DNase I 과민성 부위(HS)를 포함한다. 예를 들어, β-글로빈 유전자 클러스터의 HS2는 Aγ 글로빈 프로모터의 활성을 제어한다는 것이 밝혀졌다. β-글로빈 유전자 클러스터의 HS2는 코어 영역 및 조절성 서브도메인으로 추가로 세분될 수 있다. 코어 영역은 주로 글로빈 프로모터의 활성화를 담당하는 HS2의 부분이다. 조절성 서브도메인 M1 내지 M5는 코어 도메인의 효과를 양성적 또는 음성적으로 조절한다. 코어 영역은 조절성 서브도메인 M1과 M2 사이에 위치되며, 그 이후에 M3 내지 M5가 후속된다. 특히, M1 및 M2는 Aγ 글로빈 프로모터에 대한 코어 영역의 활성화 효과를 추가로 향상시킨다.
인간 글로빈 유전자 클러스터의 발현 요소의 사용이 진핵생물 세포, 특히 인간 혈액 세포 또는 이들로부터 유래된 세포에서 관심 폴리펩티드와 같은 표적 생성물의 안정적이고 높은 발현을 제공하는 것이 이제 밝혀졌다. 본 발명은 인간 Aγ 글로빈 프로모터의 적어도 기능성 부분 및 인간 α-글로빈 또는 β-글로빈 유전자 클러스터의 유전자좌 제어 영역의 적어도 기능성 부분을 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 발현 카세트는 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 코딩 영역 및/또는 상기 코딩 영역의 도입을 위한 클로닝 부위를 추가로 포함한다. 발현 카세트는 인간 Aγ 글로빈 유전자의 3' 인핸서의 적어도 기능성 부분을 포함하는 인핸서 영역을 추가로 포함할 수 있다. 유전자좌 제어 영역, 프로모터 및 3' 인핸서는 모두 이들이 코딩 영역의 발현을 조절할 수 있고, 특히 코딩 영역의 발현을 가능하게 하고 이를 향상시키도록 발현 카세트에 위치된다. 발현 카세트는 또한 코딩 영역의 전사가 종료되는 전사 종료자 영역을 포함할 수 있다. 발현 카세트의 요소는 특히 서로 기능적으로 연결된다.
발현 카세트의 특정 예는 SEQ ID NO: 1 내지 5 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하거나, 이로 구성된다. 각각의 발현 요소가 또한 도 2에 제시되며, 여기서 발현 카세트의 다양한 요소가 표시된다. 특히, HS4, HS3, HS2, 및 HS40은 인간 α-글로빈 또는 β-글로빈 유전자 클러스터의 유전자좌 제어 영역의 부분이다. 이러한 유전자좌 제어 영역 다음에, 인간 Aγ 글로빈 프로모터(Aγ-Prom)의 기능성 부분이 표시된다. 이후, 코딩 서열 또는 코딩 서열(CS)의 도입을 위한 클로닝 부위 및 아데닐중합체형성 신호(γpA)를 포함하는 전사 종료자 영역이 후속된다. 발현 카세트의 말단에서, 인간 Aγ 글로빈 유전자의 3' 인핸서(Aγ-Enh)의 기능성 부분이 위치된다.
특정 구체예에서, 발현 카세트는 β-글로빈 인트론 2, 특히 β-글로빈 유전자 또는 임의의 다른 글로빈 유전자의 임의의 인트론을 포함하지 않는다.
인간
A
γ
글로빈 프로모터
발현 카세트는 코딩 영역, 특히 관심 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하고 제어하기 위한 인간 Aγ 글로빈 프로모터의 기능성 부분을 이용한다. 인간 Aγ 글로빈 프로모터의 기능성 부분은 특히 코딩 영역의 업스트림에 위치된다. 이는 코딩 영역에 기능적으로 연결되고, 이의 전사를 가능하게 하고 제어한다. 특정 구체예에서, 인간 Aγ 글로빈 프로모터의 기능성 부분은 조기 mRNA의 전사가 시작되는 전사 개시 부위를 포함한다. 또한, 인간 Aγ 글로빈 프로모터의 기능성 부분은 또한 5' 비번역 영역(5' UTR)의 적어도 일부, 특히 인간 Aγ 글로빈 유전자의 5' UTR의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 인간 Aγ 글로빈 프로모터의 기능성 부분은 인간 Aγ 글로빈 mRNA의 전사를 가능하게 하는 인간 Aγ 글로빈 유전자의 적어도 일부를 포함한다. 특정 구체예에서, 인간 Aγ 글로빈 프로모터의 기능성 부분은 CCAAT 박스를 포함한다. 특히, 인간 Aγ 글로빈 프로모터의 기능성 부분은 전사 개시 부위와 관련하여 인간 Aγ 글로빈 유전자의 뉴클레오티드 -299 내지 -26, 특히 뉴클레오티드 -299 내지 +36, 뉴클레오티드 -384 내지 -26, 또는 뉴클레오티드 -384 내지 +36을 포함하거나 이들로 구성된다. 특히, 인간 Aγ 글로빈 프로모터의 기능성 부분은 SEQ ID NO: 1의 위치 1123 내지 1542의 핵산 서열을 포함하거나, 특히 이로 구성된다. 여전히 기능성인 인간 Aγ 글로빈 프로모터의 더 짧은 단편을 사용하는 것이 또한 가능하다. 당업자는 인간 Aγ 글로빈 프로모터의 적합한 기능성 부분을 결정할 수 있다. 특히, 프로모터 서열의 활성을 결정하기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있고, 하기 실시예에 기재되어 있다.
대안적으로, 인간 Aγ 글로빈 프로모터의 상기 기능성 부분의 동족체가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 상기 동족체는 바람직하게는 이의 전체 길이에 걸쳐 상기 정의된 핵산 서열 중 하나와 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 특정 구체예에서, 동족체는 이들이 유래되는 Aγ 글로빈 프로모터의 기능성 부분과 동일하거나 실질적으로 동일한 기능 및/또는 활성을 가지며, 특히 동일 조건하에서 이들이 유래되는 Aγ 글로빈 프로모터의 기능성 부분을 이용함으로써 도달된 발현율의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 85% 또는 적어도 90%에 도달하는 코딩 영역의 발현율을 제공한다.
유전자좌
제어 영역
유전자좌 제어 영역은 프로모터 영역에 기능적으로 연결되고, 인간 Aγ 글로빈 프로모터의 기능성 부분의 활성을 조절할 수 있고, 특히 향상시킬 수 있다. 유전자좌 제어 영역은 특히 프로모터 영역의 업스트림에 위치된다.
특정한 바람직한 구체예에서, 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 유전자좌 제어 영역 또는 이의 기능성 부분이 사용된다. 당 분야에 따르면, 인간 β-글로빈 유전자좌 제어 영역은 상기 유전자 클러스터의 첫번째 글로빈 유전자, 즉, ε-글로빈 유전자의 6 내지 20 kbp 업스트림에 위치된 HS1 내지 HS4로 명명된 4개의 적혈구 특이적 DNase I 과민성 부위를 포함한다. 특히, HS2는 글로빈 유전자의 발현을 제어하는 담당을 하며, 유전자좌 제어 영역의 주요 기능성 성분을 구성하는 것으로 간주된다. 인간 β-글로빈 유전자좌 제어 영역의 HS2는 코어 요소 및 추가 조절성 서브도메인으로 세분되고, 상기 코어 요소는 조절성 서브도메인 M1과 M2 사이에 위치된다. 코어 요소는 인간 Aγ 글로빈 프로모터의 프로모터 활성을 향상시킬 수 있는 β-글로빈 유전자좌 제어 영역의 최소 영역이다.
바람직한 구체예에서, 유전자좌 제어 영역은 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 DNAse I 과민성 부위 2(HS2)의 코어 요소를 포함한다. 특히, 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 HS2의 코어 요소는 SEQ ID NO: 1의 위치 906 내지 939의 핵산 서열을 갖는다. 특정 구체예에서, 유전자좌 제어 영역은 HS2의 코어 요소 및 2개의 인접한 조절성 서브도메인 M1 및 M2, 즉, 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 HS2의 M1-코어-M2 요소를 포함하거나 이로 구성된다. 상기 M1-코어-M2 요소는 SEQ ID NO: 1의 위치 742 내지 995의 핵산 서열을 가질 수 있다. 그러므로, 이는 SEQ ID NO: 1의 위치 906 내지 939의 핵산 서열을 갖는 HS2의 코어 영역을 포함한다.
추가 구체예에서, 유전자좌 제어 영역은 SEQ ID NO: 1의 위치 741 내지 1109의 핵산 서열을 포함하는 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 과민성 부위 2(HS2)의 적어도 기능성 부분을 포함한다. HS2의 이러한 기능성 부분은 M1-코어-M2 요소 및 이의 바로 다운스트림에 추가의 핵산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 HS2의 적어도 기능성 부분을 포함하는 유전자좌 제어 영역은 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 과민성 부위 3(HS3)의 적어도 일부를 추가로 포함한다. 특히, HS3 또는 이의 일부는 발현 카세트의 유전자좌 제어 영역에서 HS2 또는 이의 일부의 업스트림에 위치된다. HS3 또는 이의 일부는 특히 SEQ ID NO: 1의 위치 310 내지 735의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 또한, 유전자좌 제어 영역은 특히 존재시 HS2 및 HS3의 업스트림에 위치하는 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 과민성 부위 4(HS4) 또는 이의 일부를 또한 포함할 수 있으며, 특정 구체예에서, HS4 또는 이의 일부는 SEQ ID NO: 1의 위치 13 내지 294의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 그러므로, 본 발명에 따른 발현 카세트의 유전자좌 제어 영역은 다운스트림 방향으로 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 선택적으로 HS4의 적어도 일부, 선택적으로 HS3의 적어도 일부, 및 HS2의 적어도 기능성 부분을 포함할 수 있다. 대안적 구체예에서, 유전자좌 제어 영역은 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 과민성 부위 3(HS3)을 포함하지 않는다.
특정 구체예에서, 유전자좌 제어 영역은 SEQ ID NO: 1의 위치 13 내지 1109, SEQ ID NO: 2의 위치 20 내지 819, SEQ ID NO: 3의 위치 18 내지 386 및 SEQ ID NO: 4의 위치 13 내지 266으로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는다.
또 다른 구체예에서, 유전자좌 제어 영역은 인간 α-글로빈 유전자 클러스터의 과민성 부위 40(HS40)의 적어도 기능성 부분을 포함한다. HS40의 일부는 특히 SEQ ID NO: 5의 위치 24 내지 278의 핵산 서열을 가질 수 있는 HS40의 코어 요소를 포함하거나 이로 구성된다. 특히, HS40 또는 이의 일부는 SEQ ID NO: 5의 위치 7 내지 372의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
또한, 특정 구체예에서, 상기 유전자좌 제어 영역 중 하나의 동족체인 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 유전자좌 제어 영역이 사용될 수 있다. 특히, 상기 동족체는 전체 길이에 걸쳐 상기 유전자좌 제어 영역 중 하나와 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고/갖거나, 이들이 유래되는 유전자좌 제어 영역과 동일하거나 실질적으로 동일한 기능을 갖는다. 바람직한 구체예에서, 동족체 유전자좌 제어 영역은 동일 조건하에서 이들이 유래되는 유전자좌 제어 영역을 이용하여 도달된 발현율의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 85% 또는 적어도 90%에 도달하는 코딩 영역의 발현율을 제공한다.
코딩 영역
발현 카세트의 코딩 영역은 발현 카세트에 의해 발현되는 관심 생성물, 특히 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 코딩 영역의 핵산 서열의 발현은 프로모터 영역에 의해 조절되고, 그에 따라 이에 기능적으로 연결된다. 벡터에 선택적으로 존재하는 발현 카세트가 적합한 숙주 세포로 도입되는 경우, 상기 숙주 세포는 코딩 영역의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 생성물, 특히 폴리펩티드를 생성한다.
발현 카세트의 코딩 영역은 특히 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 함유하거나 이로 구성된다.
관심 폴리펩티드는 단백질을 포함하는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 폴리펩티드는 포유동물-유래 및 인간-유래 폴리펩티드를 포함하는 임의의 기원의 폴리펩티드뿐만 아니라 인공 폴리펩티드일 수 있다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 당화 부위를 포함하고, 특히 이는 당화된 폴리펩티드, 예를 들어, 당단백질 또는 이의 일부, 항체 또는 이의 유도체 또는 일부; 펩티드 호르몬, 생식샘자극호르몬, 예를 들어, FSH(난포-자극 호르몬), CG(융모생식샘 자극 호르몬), LH(황체형성 호르몬) 및 TSH(갑상샘-자극 호르몬), 예를 들어, 이들의 모든 아이소형(isoform) 및 변이체; 에리트로포이에틴; 혈액 응고 인자, 예를 들어, 인자 VII, VIII, IX 또는 폰 빌레브란트 인자; 리소좀 효소 및 사이토카인이다. 또한, 관심 폴리펩티드는 사이토카인 및 이의 수용체, 예를 들어, 종양 괴사 인자 TNF-알파 및 TNF-베타; 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상샘 호르몬; 갑상샘 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-사슬 및 B-사슬; 생식샘자극호르몬, 예를 들어, 난포 자극 호르몬(FSH), 황체형성 호르몬(LH), 갑상샘자극호르몬, 및 인간 융모성 생식샘자극호르몬(hCG); 칼시토닌; 글루카곤; 응고 인자, 예를 들어, 인자 VIIIC, 인자 IX, 인자 VII, 조직 인자 및 폰 빌레브란트 인자; 항-응고 인자, 예를 들어, 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성인자, 예를 들어, 우로키나제, 인간 소변 및 조직-유형 플라스미노겐 활성인자; 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 엔케팔리나제(enkephalinase); 인간 대식세포 염증성 단백질; 혈청 알부민, 예를 들어, 인간 혈청 알부민; 뮐러관-억제 물질; 릴랙신(relaxin) A-사슬 및 B-사슬; 프로릴랙신(prorelaxin); 마우스 생식샘자극호르몬-관련 펩티드; 혈관 내피 성장 인자; 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 인테그린; 단백질 A 및 D; 류마티스 인자; 신경영양인자, 예를 들어, 골-유래 신경영양인자, 뉴로트로핀(neurotrophin)-3, -4, -5, -6 및 신경 성장 인자-베타; 혈소판-유래 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 표피 성장 인자; 전환 성장 인자, 예를 들어, TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예를 들어, CD-3, CD-4, CD-8 및 CD-19; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질; 인터페론, 예를 들어, 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 집락 자극 인자(CSF), 예를 들어, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터류킨(IL), 예를 들어, IL-1 내지 IL-12; 수퍼옥사이드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 항체 및 면역부착소(immunoadhesin); 글리코포린 A; 및 뮤신 단백질, 예를 들어, MUC1의 군의 단백질 분자 중 임의의 단백질 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 구체예에서, 관심 폴리펩티드는 항체 또는 이의 일부 또는 유도체이다. 특히, 관심 폴리펩티드는 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 일부일 수 있다. 또한, 관심 폴리펩티드는 (i) 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 영역 및 첫번째 불변 도메인으로 구성되는 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; (iii) 중쇄의 가변 영역 및 첫번째 불변 도메인 CH1으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 구성된 Fv 단편; (v) 단일 폴리펩티드의 사슬로 구성된 Fv 단편인 scFv 단편; (vi) 함께 공유적으로 연결된 2개의 Fv 단편으로 구성된 (Fv)2 단편; (vii) 중쇄 가변 도메인; 및 (viii) 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 회합이 분자내가 아니라 분자간에서만 발생할 수 있도록 하는 방식으로 함께 공유적으로 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로 구성된 멀티바디(multibody)로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 일부 또는 유도체일 수 있다. 발현 카세트가 항체 또는 이의 일부 또는 유도체를 코딩하는 코딩 영역을 포함하는 구체예에서, 유전자좌 제어 영역은 특히 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 HS2의 적어도 일부, 바람직하게는 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 HS2의 적어도 일부 및 HS3의 적어도 일부 또는 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 HS2의 적어도 일부 및 HS4의 적어도 일부, 특히 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 HS2의 적어도 일부 및 HS3의 적어도 일부 및 HS4의 적어도 일부를 포함한다.
특정 구체예에서, 코딩 영역은 1개 초과의 폴리펩티드, 특히 2개의 폴리펩티드를 인코딩한다. 이들 구체예에서, 코딩 영역은 각각 자체의 전사 개시 부위, 전사 종료 부위 및 아데닐중합체형성 신호를 갖는 별도의 mRNA로 전사되는 2개 이상의 별도의 핵산 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 코딩 영역은 각각 별도의 폴리펩티드를 인코딩하는 2개 이상의 별도의 코딩 핵산 서열을 포함하는 mRNA로 전사되는 핵산 서열을 함유할 수 있다. 이들 구체예에서, 코딩 영역은 첫번째 것에 더하여 각각의 코딩 핵산 서열에 대한 것인 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위를 포함할 수 있다. 이들 내부 리보솜 진입 부위는 단일 전사물로부터 하나 초과의 폴리펩티드의 번역을 가능하게 한다. 특정 구체예에서, 코딩 영역은 2개의 폴리펩티드, 특히 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩한다.
특정 구체예에서, 코딩 영역은 세포외 국소화 신호를 특히 포함하는 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 코딩 영역의 유일한 코딩 서열일 수 있거나, 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열과 같은 추가적인 코딩 서열에 더하여 존재할 수 있다. 신호 펩티드는 특히 코딩 영역에 의해 인코딩되는 관심 폴리펩티드의 분비성 발현을 유도한다. 신호 펩티드는 발현 동안 나머지 폴리펩티드로부터 절단될 수 있다. 신호 펩티드는 특히 코딩 영역에 포함된 다른 코딩 핵산 서열의 업스트림 또는 클로닝 부위의 업스트림, 특히 코딩 영역의 시작부에 위치된다. 또한, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 코딩 영역에 포함된 다른 코딩 핵산 서열과 프레임 내에 위치된다.
특정 구체예에서, 코딩 영역은 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 코딩 영역은 리포터 유전자 또는 선별 마커 유전자를 포함하지 않는다. 추가 구체예에서, 코딩 영역은 글로빈 단백질 또는 글로빈 단백질의 적어도 20개의 연속적인 아미노산을 포함하는 글로빈 단백질의 일부를 코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다.
클로닝
부위
특정 구체예에서, 발현 카세트는 핵산 서열을 통합시키기 위한 클로닝 부위를 포함한다. 클로닝 부위는 코딩 영역 대신에 발현 카세트에 존재할 수 있고, 발현 카세트 내로 상기 핵산 서열을 도입시키는 역할을 할 수 있다. 또한, 클로닝 부위는 특히 코딩 영역이 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열만 포함하는 구체예에서 코딩 영역에 더하여 발현 카세트에 제공될 수 있다.
발현 카세트에 존재하는 클로닝 부위는 발현 카세트 내로 코딩 영역, 특히 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 도입시키기에 적합하다. 다른 핵산 분자, 예를 들어, 발현 카세트 또는 벡터로 핵산 단편을 도입시키기에 적합한 클로닝 부위 및 방법은 당 분야에 일반적으로 공지되어 있다. 특정 구체예에서, 클로닝 부위는 적어도 1개, 특히 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 제한 효소의 인지 서열을 포함한다. 적합한 제한 효소 및 이들의 인지 서열은 당 분야에 공지되어 있다. 예시적 제한 효소는 EcoRI, EcoRV, HindIII, BamHI, XbaI, PvuI, KpnI, BstXI, XmaI, SmaI, NotI, XhoI 및 ClaI이다. 다중 클로닝 부위의 예시적 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 위치 1559 내지 1664의 핵산 서열에 의해 표시된다.
전사 종료자 영역
특정 구체예에서, 발현 카세트는 전사 종료자 영역을 포함한다. 전사 종료자 영역은 프로모터 영역과 기능적으로 연결되고, 코딩 영역의 전사를 종료시킨다. 이는 코딩 영역 및/또는 클로닝 부위의 다운스트림에 위치된다.
특정 구체예에서, 전사 종료자 영역은 전사 종료 부위 및/또는 아데닐중합체형성 신호를 포함한다. 아데닐중합체형성 신호는 진핵생물 세포, 특히 인간 세포에서 조기 mRNA의 아데닐중합체형성을 유도할 수 있는 임의의 아데닐중합체형성 신호일 수 있다. 이는 SEQ ID NO: 1의 위치 1725 내지 1730의 핵산 서열 또는 이의 동족체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
인핸서
영역
특정 구체예에서, 발현 카세트는 인핸서 영역, 특히 3' 인핸서 영역을 포함한다. 3' 인핸서 영역은 존재시 코딩 영역 및/또는 클로닝 부위의 다운스트림 및 전사 종료자 영역의 다운스트림에 위치된다. 이는 프로모터 영역과 기능적으로 연결되고, 코딩 영역의 발현을 향상시킨다. 인핸서 영역은 특히 인간 Aγ 글로빈 유전자의 3' 인핸서의 적어도 기능성 부분을 포함하거나 이로 구성된다. 특정 구체예에서, 인핸서 영역은 SEQ ID NO: 1의 위치 2136 내지 2881의 핵산 서열 또는 이의 동족체를 포함하거나 이로 구성된다. 특정 구체예에서, 동족체 인핸서 영역은 동일 조건하에서 이들이 유래되는 인핸서 영역을 이용하여 도달된 발현율의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 85% 또는 적어도 90%에 도달하는 코딩 영역의 발현율을 제공한다.
발현 카세트를 포함하는 벡터
한 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 벡터는 숙주 세포로 발현 카세트를 전달하기에 적합한 임의의 벡터일 수 있다. 각각의 벡터는 당 분야에 공지되어 있다. 특히, 벡터는 진핵생물 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 특히 인간 세포로의 전달에 적합화된다.
발현 카세트에 더하여, 벡터는 추가 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 선별 마커 중 적어도 하나는 벡터를 포함하지 않는 숙주 세포에 비해 벡터를 포함하는 숙주 세포, 특히 진핵생물 숙주 세포, 예를 들어, 포유동물 숙주 세포, 특히 인간 숙주 세포를 선별하기에 적합하다. 선별 마커의 적합한 예는 항생제 화합물에 대한 내성을 제공하는 유전자이다. 또한, 벡터는 원핵생물 숙주 세포, 예를 들어, E. 콜라이 세포에서 이를 증폭시키기에 적합한 요소를 포함할 수 있다. 상기 요소는, 예를 들어, 복제 기점, 예를 들어, Col E1 Ori 및 원핵생물 선별 마커, 예를 들어, 살균제, 예를 들어, 앰피실린에 대한 내성을 제공하는 유전자를 포함한다.
특정 구체예에서, 벡터는 원형 또는 선형 이중 가닥 DNA, 특히 원형 이중 가닥 DNA이다.
특정 구체예에서, 벡터는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 코딩 영역을 갖는 발현 카세트를 포함한다.
선별
마커
유전자
특정 구체예에서, 벡터는 선별 마커 유전자를 추가로 포함한다. 선별 마커 유전자는 발현 카세트의 요소와 기능적으로 연결될 필요는 없다. 선별 마커 유전자는 벡터를 포함하는 숙주 세포의 선별을 가능하게 한다. 벡터를 함유하는 세포는 바람직하게는 선별 마커 유전자를 포함하지 않는 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 적합한 선별 제제의 존재하에서 배양된다.
특정 구체예에서, 선별 마커 유전자는 마커 유전자의 증폭 및 동일 벡터 상에 존재하는 발현 카세트의 공동증폭을 가능하게 하는 증폭 가능한 선별 마커 유전자이다. 증폭 가능한 선별 마커 유전자를 이용하는 경우, 형질감염된 세포에서의 발현 카세트의 증폭은 특히 증가하는 농도의 선별 제제의 존재하에서 세포의 단계적 배양에 의해 달성된다. 특정 구체예에서, 선별 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 예를 들어, 항폴레이트 내성 DHFR 변이체를 인코딩하고, 상응하는 선별 제제는 항폴레이트, 예를 들어, 메토트렉세이트이다.
적합한 증폭 가능한 선별 마커 유전자 및 이의 상응하는 선별 제제의 추가 예는 네오마이신(neomycin) 내성 유전자(예를 들어, 아미노글리코시드 포스포트랜스페라제) 및 제네티신(geneticin)(G418); 퓨로마이신(puromycin) N-아세틸-트랜스페라제 및 퓨로마이신; 메탈로티오네인 및 카드뮴; CAD(카르바모일-포스페이트 신세타제(synthetase):아스파테이트 트랜스카르바밀라제:디하이드로오로타제) 및 N-포스포아세틸-L-아스파테이트; 아데노신-데아미나제 및 Xyl-A- 또는 아데노신, 2'데옥시코포르마이신; AMP(아데닐레이트)-데아미나제 및 아데닌, 아자세린, 코포르마이신(coformycin); UMP-신타제(synthase) 및 6-아자우리딘, 피라조푸란; IMP 5'-데하이드로게나제 및 미코페놀산; 잔틴-구아닌-포스포리보실 트랜스페라제 및 제한된 잔틴을 갖는 미코페놀산; 돌연변이체 HGPRTase 또는 돌연변이체 티미딘 키나제 및 하이포잔틴, 아미놉테린 및 티미딘(HAT); 티미딜레이트 신세타제 및 5-플루오로데옥시우리딘; P-당단백질 170(MDR1) 및 아드리아마이신(adriamycin), 빈크리스틴(vincristin), 콜히친; 리보뉴클레오티드 환원효소 및 아피디콜린(aphidicoline); 글루타민 신세타제 및 메티오닌 설폭시민(MSX); 아스파라긴 신세타제 및 β-아스파틸하이드록사메이트, 알비지인(albizziin), 5'아자사이티딘; 아르기니노숙시네이트 신세타제 및 카나바닌(canavanin); 오르니틴 데카르복실라제 및 α-디플루오로메틸-오르니틴; HMG-CoA-환원효소 및 컴팩틴(compactin); N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라제 및 튜니카마이신(tunicamycin); 트레오닐-tRNA 신세타제 및 보렐리딘(borrelidin); 및 Na+K+-ATPase 및 오우아바인(ouabain)이다.
발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 발현 카세트 또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 발현 카세트 또는 벡터를 이용한 형질감염 및 특히 관심 폴리펩티드의 생성에 적합한 임의의 세포일 수 있다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 확립된 발현 세포주로부터 유래된다. 숙주 세포는 특히 진핵생물 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 특히 인간 세포, 또는 이들로부터 유래된 세포이다. 특히, 숙주 세포는 혈액 세포, 예를 들어, 백혈구, 혈액 전구체 세포 또는 백혈병 세포, 또는 이들로부터 유래된 세포이다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 백혈구 기원의 세포이다.
특정 구체예에서, 숙주 세포는 인간 골수성 백혈병 세포로부터 유래된다. 숙주 세포의 특정 예는 K562, NM-F9, NM-D4, NM-H9D8, NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X, GT-5s 및 상기 숙주 세포 중 임의의 것으로부터 유래된 세포이다. K562는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)에 존재하는 인간 골수성 백혈병 세포주(ATCC CCL-243)이다. 나머지 세포주는 K562 세포로부터 유래되고, 특정 당화 특징에 대해 선택되었다. K562로부터 유래된 세포주는 K562에 대해 적합한 널리 공지된 조건하에서 배양되고 유지될 수 있다. K562 세포를 제외한 이들 모든 세포주는 부다페스트 조약에 따라 기탁되었다. 기탁에 대한 정보는 명세서 말미에서 발견될 수 있다.
예시적 숙주 세포는 또한, 예를 들어, WO 2008/028686호에 기재되어 있다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 특정한 당화 패턴을 갖는 당단백질의 발현에 최적화된다. 특히, 발현 카세트 또는 벡터의 코딩 영역 및/또는 프로모터 및 추가 요소에서의 코돈 사용은 사용된 숙주 세포 유형과 양립되고, 특히 이에 대해 적합화된다.
특정 구체예에서, 숙주 세포는 분리된 숙주 세포이다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 인간 또는 동물 신체에 존재하지 않는다.
숙주 세포는 본 발명에 따른 발현 카세트 또는 벡터로 일시적 또는 안정적으로 형질감염될 수 있다. 특히 숙주 세포의 유전체로의 발현 카세트의 통합에 의한 안정적 형질감염이 바람직하다. 안정적 또는 일시적 형질감염을 위한 형질감염 방법은 당 분야에 일반적으로 공지되어 있다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 코딩 영역을 갖는 발현 카세트를 포함하는 벡터로 형질감염된다.
생성 방법
추가 양태에 따르면, 본 발명은,
(a) 서로 기능적으로 연결된, (i) 인간 β-글로빈 유전자 클러스터 또는 인간 α-글로빈 유전자 클러스터의 유전자좌 제어 영역의 적어도 기능성 부분을 포함하는 유전자좌 제어 영역; (ii) 인간 Aγ 글로빈 유전자의 프로모터의 적어도 기능성 부분을 포함하는 프로모터 영역; 및 (iii) 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 코딩 영역을 포함하는, 발현 카세트를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
(b) 숙주 세포가 관심 폴리펩티드를 발현하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(c) 관심 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함하는,
관심 폴리펩티드를 재조합적으로 생성시키기 위한 방법을 제공한다.
숙주 세포는 특히 본원에 정의된 요소 중 하나 이상을 갖는 본원에 정의된 발현 카세트를 포함한다.
숙주 세포를 배양하고, 관심 폴리펩티드를 발현시키기에 적합한 조건은 방법에서 사용되는 특정 숙주 세포, 벡터 및 발현 카세트에 좌우된다. 당업자는 적합한 조건을 용이하게 결정할 수 있고, 이는 또한 복수의 숙주 세포에 대해 당 분야에 이미 공지되어 있다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 발현 카세트를 포함하고, 선별 마커 유전자를 추가로 포함하는 벡터로 형질감염된다. 이들 구체예에서, 단계 (b)의 배양 조건은 세포 배양 배지 내의 상응하는 선별 제제의 존재를 포함할 수 있다.
관심 폴리펩티드의 분리는 특히 세포 배양물의 나머지 성분으로부터의 관심 폴리펩티드의 분리를 나타낸다. 특정 구체예에서, 발현 카세트의 코딩 영역은 분비 발현을 위한 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하고, 단계 (b)에서, 관심 폴리펩티드는 숙주 세포에 의해 분비된다. 이들 구체예에서, 단계 (c)는 특히, 예를 들어, 원심분리에 의해 숙주 세포로부터 관심 폴리펩티드를 포함하는 세포 배양 배지를 분리시키고, 예를 들어, 크로마토그래피 방법에 의해 세포 배양 배지의 성분의 일부 또는 대부분으로부터 관심 폴리펩티드를 분리시키는 것을 포함한다. 관심 폴리펩티드를 분리시키기 위한 적합한 방법 및 수단은 당 분야에 공지되어 있고, 당업자에 의해 용이하게 적용될 수 있다.
특정 구체예에서, 관심 폴리펩티드를 생성시키기 위한 방법은 단계 (c) 후에 관심 폴리펩티드를 약학적 조성물로 제형화시키는 단계 (d)를 추가로 포함한다.
관심 폴리펩티드를 약학적 조성물로 제형화시키는 것은 특히 관심 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 완충액 또는 완충액 성분을 교환하는 것을 포함한다. 또한, 제형화 단계는 관심 폴리펩티드의 동결건조를 포함할 수 있다. 특히, 관심 폴리펩티드는 약학적으로 허용되는 성분만을 포함하는 조성물로 전달된다.
본원에 기재된 숫자 범위는 범위를 규정하는 숫자를 포함한다. 본원에 제공된 제목은 본 발명의 다양한 양태 또는 구체예의 제한이 아니며, 전체로서의 명세서에 대한 언급으로 해석될 수 있다. 한 구체예에 따르면, 방법의 경우 특정 단계를 포함하거나, 조성물의 경우 특정 성분을 포함하는 것으로 본원에 기재된 주제는 각각의 단계 또는 성분으로 구성된 주제를 나타낸다. 본원에 기재된 특정 양태 및 구체예를 선택하고 조합하는 것이 바람직하며, 특정 구체예의 각각의 조합으로부터 발생하는 특정 주제는 또한 본 발명의 개시에 속한다.
도 1은 다양한 DNase 과민성 부위(HS) 및 다양한 글로빈 유전자를 갖는 유전자좌 제어 영역(LCR)을 포함하는 인간 글로빈 유전자 클러스터의 구조를 제시한다. A: 염색체 11 상의 인간 β-글로빈 유전자 클러스터; B: 염색체 16 상의 인간 α-글로빈 유전자 클러스터.
도 2는 벡터 pHBG1 A-E에서 사용되는 바와 같은 예시적 발현 카세트의 요소를 제시한다. HS: DNase 과민성 부위; Aγ-Prom: Aγ 글로빈 유전자의 프로모터; CS: 코딩 서열 / 클로닝 부위; γpA: Aγ 글로빈 유전자의 아데닐중합체형성 신호; Aγ-ENh: Aγ 글로빈 유전자의 3' 인핸서.
도 3은 인자 VII의 코딩 서열을 포함하는 다양한 벡터의 일시적 형질감염 후에 획득된 인자 VII 단백질 수율을 제시한다. 클로닝 부위로 도입된 인자 VII의 코딩 서열 및 증폭 가능한 선별 마커로서 DHFR을 인코딩하는 유전자를 갖는 도 2에 제시된 발현 카세트를 포함하는 벡터를 NM-H9D8 세포로 일시적으로 형질감염시켰다. 인자 VII의 전체 수율이 배양 후에 결정되었다. pEFdhfrmut(-): 인자 VII 코딩 서열을 갖는 대조군 벡터. 3개의 독립적 실험의 결과가 제시된다.
도 4는 본 발명에 따른 벡터 및 항체를 인코딩하는 대조군 벡터의 안정적인 형질감염의 비교를 제시한다. NM-H9D8-E6Q12 세포는 대조군 벡터 pEF 또는 본 발명에 따른 벡터 pHB로 안정적으로 형질감염되었다. 둘 모두의 벡터는 항체에 대한 코딩 서열 및 증폭 가능한 선별 마커로서 DHFR을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 세포에서의 벡터의 증폭을 위해, 선별압, 즉, 배양 배지 중에서의 선별 제제 메토트렉세이트의 농도가 단계적으로 증가되었다. 그래프는 제공된 배양 시간 후에 각각의 벡터에 대해 가능했던 최대 선별압을 제시한다. 더 높은 가능한 선별압(메토트렉세이트 농도)은 형질감염된 세포에서의 벡터의 더 강한 증폭을 나타내며, 이는 관심 단백질의 더 높은 생성을 발생시킨다.
도 5는 도 4의 안정적으로 형질감염된 세포의 풀(pool) 생산성을 제시한다. 하루에 세포 당 피코그램 단위의 항체 생성이 본 발명에 따른 벡터 및 대조군 벡터에 대한 다양한 선별압에 대해 제시된다.
도 6은 선별압으로 인해 벡터의 증폭에 의한 도 4의 안정적으로 형질감염된 세포의 생산성에서의 증가를 제시한다. 하루에 세포 당 피코그램 단위의 항체 생성이 시작 세포 풀, 증폭 후의 세포 풀 및 증폭 후의 단일 세포 클론에 대해 다양한 선별압에 대해 제시된다. A: 대조군 벡터 pEF; B: 본 발명에 따른 벡터 pHB.
도 2는 벡터 pHBG1 A-E에서 사용되는 바와 같은 예시적 발현 카세트의 요소를 제시한다. HS: DNase 과민성 부위; Aγ-Prom: Aγ 글로빈 유전자의 프로모터; CS: 코딩 서열 / 클로닝 부위; γpA: Aγ 글로빈 유전자의 아데닐중합체형성 신호; Aγ-ENh: Aγ 글로빈 유전자의 3' 인핸서.
도 3은 인자 VII의 코딩 서열을 포함하는 다양한 벡터의 일시적 형질감염 후에 획득된 인자 VII 단백질 수율을 제시한다. 클로닝 부위로 도입된 인자 VII의 코딩 서열 및 증폭 가능한 선별 마커로서 DHFR을 인코딩하는 유전자를 갖는 도 2에 제시된 발현 카세트를 포함하는 벡터를 NM-H9D8 세포로 일시적으로 형질감염시켰다. 인자 VII의 전체 수율이 배양 후에 결정되었다. pEFdhfrmut(-): 인자 VII 코딩 서열을 갖는 대조군 벡터. 3개의 독립적 실험의 결과가 제시된다.
도 4는 본 발명에 따른 벡터 및 항체를 인코딩하는 대조군 벡터의 안정적인 형질감염의 비교를 제시한다. NM-H9D8-E6Q12 세포는 대조군 벡터 pEF 또는 본 발명에 따른 벡터 pHB로 안정적으로 형질감염되었다. 둘 모두의 벡터는 항체에 대한 코딩 서열 및 증폭 가능한 선별 마커로서 DHFR을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 세포에서의 벡터의 증폭을 위해, 선별압, 즉, 배양 배지 중에서의 선별 제제 메토트렉세이트의 농도가 단계적으로 증가되었다. 그래프는 제공된 배양 시간 후에 각각의 벡터에 대해 가능했던 최대 선별압을 제시한다. 더 높은 가능한 선별압(메토트렉세이트 농도)은 형질감염된 세포에서의 벡터의 더 강한 증폭을 나타내며, 이는 관심 단백질의 더 높은 생성을 발생시킨다.
도 5는 도 4의 안정적으로 형질감염된 세포의 풀(pool) 생산성을 제시한다. 하루에 세포 당 피코그램 단위의 항체 생성이 본 발명에 따른 벡터 및 대조군 벡터에 대한 다양한 선별압에 대해 제시된다.
도 6은 선별압으로 인해 벡터의 증폭에 의한 도 4의 안정적으로 형질감염된 세포의 생산성에서의 증가를 제시한다. 하루에 세포 당 피코그램 단위의 항체 생성이 시작 세포 풀, 증폭 후의 세포 풀 및 증폭 후의 단일 세포 클론에 대해 다양한 선별압에 대해 제시된다. A: 대조군 벡터 pEF; B: 본 발명에 따른 벡터 pHB.
실시예
실시예
1:
인간
A
γ
글로빈 프로모터 및 인간 글로빈 유전자 클러스터의
유
전자좌 제어 영역의 요소를 포함하는 벡터의 작제
글로빈 벡터의 작제를 위해, 모(parent) 벡터(예를 들어, 퓨로마이신 또는 네오마이신 내성 유전자 또는 선별 마커로서 dhfr 유전자를 갖는 pEF)의 인핸서 및 프로모터를 제거하였다. 인간 Aγ 글로빈 프로모터, 아데닐중합체형성 신호 및 3' 인핸서 영역 및 인간 글로빈 유전자 클러스터의 유전자좌 제어 영역의 다양한 작제물을 합성하고, 적절한 부위에서 벡터로 클로닝하였다. 도 2는 작제된 벡터의 발현 카세트의 예시적 작제물을 제시한다. 이후, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 클로닝 부위로 도입시켰다.
실시예
2:
글로빈 벡터의 일시적 형질감염
일시적 형질감염을 제조업체의 설명서에 따라 Lipofectamine® LTX 및 Plus™ Reagent으로 수행하였다. 간략하게, 2 x 105개의 세포를 이들의 대수 성장기 동안 6-웰 플레이트에 시딩하였다. 플라스미드 DNA를 Opti-MEM I Reduced Serum Medium 및 Plus™-Reagent에 희석시켰다. 인큐베이션 시간(15분) 후, Lipofectamine® LTX를 용액에 첨가하였다. 추가 인큐베이션(30분) 후, 혼합물을 세포 현탁액에 적가하였다. 발현을 ELISA에 의해 72시간 후에 분석하였다. 벡터 pEFdhfrmut(-)에 비해 벡터 pHBG1Cdhfr, pHBG1Ddhfr 및 pHBG1Edhfr에 의해 더 높은 단백질 역가가 달성되었다(도 3).
실시예
3:
글로빈 벡터의 안정적 형질감염
세포주 NM-H9D8의 형질감염을 제조업체의 설명서에 따라 항체 중쇄 및 경쇄(둘 모두 선형화됨)를 각각 코딩하는 2개의 발현 플라스미드의 플라스미드 DNA를 이용한 뉴클레오펙션(Nucleofector™ Technology, Amaxa)에 의해 수행하였다. 항체 생성 풀의 선택 및 증폭을 위해, 메토트렉세이트 및 퓨로마이신을 증가하는 농도로 첨가하고, 풀을 활성 항체 분자의 분비에 대해 스크리닝하였다.
pHB 플라스미드로 형질감염된 풀은 더 짧은 기간 내에 증폭될 수 있었고(도 4), 더 높은 단백질 수준을 발생시켰고(도 5), 이는 생성된 단일 세포 클론 각각에 대해 확인될 수 있다(도 6).
기탁된 생물학적 물질의 확인
세포주 DSM ACC 2606 및 DSM ACC 2605가 2003년 8월 14일에 Nemod Biotherapeutics GmbH & Co. KG(Robert-Roessle-Str. 10, 13125 Berlin (DE))에 의해 독일생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ)(Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (DE))에 기탁되었다. 상기 생물학적 물질이 Nemod Biotherapeutics GmbH & Co. KG로부터 Glycotope GmbH로 그 동안 양도되었으므로 Glycotope는 상기 생물학적 물질을 언급할 권리가 있다.
세포주 DSM ACC 2806, DSM ACC 2807, DSM ACC 2856, DSM ACC 2858 및 DSM ACC 3078이 하기 표에 표시된 날짜에 Glycotope GmbH(Robert-Roessle-Str. 10, 13125 Berlin (DE))에 의해 독일생물자원센터(DSMZ)(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig (DE))에 기탁되었다.
SEQUENCE LISTING
<110> Glycotope GmbH
<120> Eukaryotic expression vectors comprising regulatory elements of the globin gene clusters
<130> 56 981 K
<150> LU92686
<151> 2015-03-31
<150> EP15161922.8
<151> 2015-03-31
<160> 5
<170> BiSSAP 1.0
<210> 1
<211> 2899
<212> DNA
<213> artificial sequences
<220>
<221> source
<222> 1..2899
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/note="expression cassette HBG1A"
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<400> 1
tcgcgatgat caacttttag agagctcttg gggaccccag tacacaagag gggacgcagg 60
gtatatgtag acatctcatt ctttttctta gtgtgagaat aagaatagcc atgacctgag 120
tttatagaca atgagccctt ttctctctcc cactcagcag ctatgagatg gcttgccctg 180
cctctctact aggctgactc actccaaggc ccagcaatgg gcagggctct gtcagggctt 240
tgatagcact atctgcagag ccagggccga gaaggggtgg actccagaga ctctcctgat 300
cattaattaa gctactgctc atgggccctg tgctgcactg atgaggagga tcagatggat 360
ggggcaatga agcaaaggaa tcattctgtg gataaaggag acagccatga agaagtctat 420
gactgtaaat ttgggagcag gagtctctaa ggacttggat ttcaaggaat tttgactcag 480
caaacacaag accctcacgg tgactttgcg agctggtgtg ccagatgtgt ctatcagagg 540
ttccagggag ggtggggtgg ggtcagggct ggccaccagc tatcagggcc cagatgggtt 600
ataggctggc aggctcagat aggtggttag gtcaggttgg tggtgctggg tggagtccat 660
gactcccagg agccaggaga gatagaccat gagtagaggg cagacatggg aaaggtgggg 720
gaggcacagc atagcttaat taagccagtt tttccttagt tcctgttaca tttctgtgtg 780
tctccattag tgacctccca tagtccaagc atgagcagtt ctggccaggc ccctgtcggg 840
gtcagtgccc cacccccgcc ttctggttct gtgtaacctt ctaagcaaac cttctggctc 900
aagcacagca atgctgagtc atgatgagtc atgctgaggc ttagggtgtg tgcccagatg 960
ttctcagcct agagtgatga ctcctatctg ggtccccagc aggatgctta cagggcagat 1020
ggcaaaaaaa aggagaagct gaccacctga ctaaaactcc acctcaaacg gcatcataaa 1080
gaaaatggat gcctgagaca gaatgtgacg catttaaatg atcctcactg gagctacaga 1140
caagaaggta aaaaacggct gacaaaagaa gtcctggtat cctctatgat gggagaagga 1200
aactagctaa agggaagaat aaattagaga aaaactggaa tgactgaatc ggaacaaggc 1260
aaaggctata aaaaaaatta agcagcagta tcctcttggg ggccccttcc ccacactatc 1320
tcaatgcaaa tatctgtctg aaacggtccc tggctaaact ccacccatgg gttggccagc 1380
cttgccttga ccaatagcct tgacaaggca aacttgacca atagtcttag agtatccagt 1440
gaggccaggg gccggcggct ggctagggat gaagaataaa aggaagcacc cttcagcagt 1500
tccacacact cgcttctgga acgtctgaga ttatcaataa gctcctagtc cagacgccaa 1560
gcttggtacc gagctcggat ccactagtaa cggccggcca gtgtgctgga attctgcaga 1620
tatccatcac actgcccggg cggccgctcg agcatcgatc tagagcctct tgcccatgat 1680
tcagagcttt caaggatagg ctttattctg caagcaatac aaataataaa tctattctgc 1740
tgagagatca cacatgattt tcttcagctc ttttttttac atctttttaa atatatgagc 1800
cacaaagggt ttatattgag ggaagtgtgt atgtgtattt ctgcatgcct gtttgtgttt 1860
gtggtgtgtg catgctcctc atttattttt atatgagatg tgcattttga tgagcaaata 1920
aaagcagtaa agacacttgt acacgggagt tctgcaagtg ggagtaaatg gtgttggaga 1980
aatccggtgg gaagaaagac ctctatagga caggacttct cagaaacaga tgttttggaa 2040
gagatgggaa aaggttcagt gaagacctgg gggctggatt gattgcagct gagtagcaag 2100
gatggttctt aatgaaggga aagtgttcca agctggaatt caaggtttag tcaggtgtag 2160
caattctatt ttattaggag gaatactatt tctaatggca cttagctttt cacagccctt 2220
gtggatgcct aagaaagtga aattaatccc atgccctcaa gtgtgcagat tggtcacagc 2280
atttcaaggg agagacctca ttgtaagact ctgggggagg tggggactta ggtgtaagaa 2340
atgaatcagc agaggctcac aagtcagcat gagcatgtta tgtctgagaa acagaccagc 2400
actgtgagat caaaatgtag tgggaagaat ttgtacaaca ttaattggaa ggtttactta 2460
atggaatttt tgtatagttg gatgttagtg catctctata agtaagagtt taatatgatg 2520
gtgttacgga cctggtgttt gtgtctcctc aaaattcaca tgctgaatcc ccaactccca 2580
actgacctta tctgtggggg aggcttttga aaagtaatta ggtttagctg agctcataag 2640
agcagatccc catcataaaa ttattttcct tatcagaagc agagagacaa gccatttctc 2700
tttcctcccg gtgaggacac agtgagaagt ccgccatctg caatccagga agagaaccct 2760
gaccacgagt cagccttcag aaatgtgaga aaaaactctg ttgttgaagc cacccagtct 2820
tttgtatttt gttatagcac cttacactga gtaaggcaga tgaagaagga gaaaaaaata 2880
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<210> 2
<211> 2609
<212> DNA
<213> artificial sequences
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<222> 1..2609
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<222> 1..2176
<223> /mol_type="DNA"
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<400> 3
tcgcgatgat cattaattaa gccagttttt ccttagttcc tgttacattt ctgtgtgtct 60
ccattagtga cctcccatag tccaagcatg agcagttctg gccaggcccc tgtcggggtc 120
agtgccccac ccccgccttc tggttctgtg taaccttcta agcaaacctt ctggctcaag 180
cacagcaatg ctgagtcatg atgagtcatg ctgaggctta gggtgtgtgc ccagatgttc 240
tcagcctaga gtgatgactc ctatctgggt ccccagcagg atgcttacag ggcagatggc 300
aaaaaaaagg agaagctgac cacctgacta aaactccacc tcaaacggca tcataaagaa 360
aatggatgcc tgagacagaa tgtgacgcat ttaaatgatc ctcactggag ctacagacaa 420
gaaggtaaaa aacggctgac aaaagaagtc ctggtatcct ctatgatggg agaaggaaac 480
tagctaaagg gaagaataaa ttagagaaaa actggaatga ctgaatcgga acaaggcaaa 540
ggctataaaa aaaattaagc agcagtatcc tcttgggggc cccttcccca cactatctca 600
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cttgaccaat agccttgaca aggcaaactt gaccaatagt cttagagtat ccagtgaggc 600
caggggccgg cggctggcta gggatgaaga ataaaaggaa gcacccttca gcagttccac 660
acactcgctt ctggaacgtc tgagattatc aataagctcc tagtccagac gccaagcttg 720
gtaccgagct cggatccact agtaacggcc ggccagtgtg ctggaattct gcagatatcc 780
atcacactgc ccgggcggcc gctcgagcat cgatctagag cctcttgccc atgattcaga 840
gctttcaagg ataggcttta ttctgcaagc aatacaaata ataaatctat tctgctgaga 900
gatcacacat gattttcttc agctcttttt tttacatctt tttaaatata tgagccacaa 960
agggtttata ttgagggaag tgtgtatgtg tatttctgca tgcctgtttg tgtttgtggt 1020
gtgtgcatgc tcctcattta tttttatatg agatgtgcat tttgatgagc aaataaaagc 1080
agtaaagaca cttgtacacg ggagttctgc aagtgggagt aaatggtgtt ggagaaatcc 1140
ggtgggaaga aagacctcta taggacagga cttctcagaa acagatgttt tggaagagat 1200
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ttcttaatga agggaaagtg ttccaagctg gaattcaagg tttagtcagg tgtagcaatt 1320
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ccttacactg agtaaggcag atgaagaagg agaaaaaaat aacagctggt taactacgta 2160
Claims (46)
- (a) 서로 기능적으로 연결된, (i) 인간 β-글로빈 유전자 클러스터 또는 인간 α-글로빈 유전자 클러스터의 유전자좌 제어 영역의 적어도 기능성 부분을 포함하는 유전자좌 제어 영역; (ii) 인간 Aγ 글로빈 유전자의 프로모터의 적어도 기능성 부분 또는 이의 동족체를 포함하는 프로모터 영역; 및 (iii) 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 코딩 영역을 포함하는, 발현 카세트를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
(b) 숙주 세포가 관심 폴리펩티드를 발현하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(c) 관심 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함하는,
관심 폴리펩티드를 재조합적으로 생성시키기 위한 방법. - 제1항에 있어서, 발현 카세트의 코딩 영역이 분비 발현을 위한 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하고, 단계 (b)에서 관심 폴리펩티드가 숙주 세포에 의해 분비되는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (c) 후에 관심 폴리펩티드를 약학적 조성물로 제형화시키는 단계 (d)를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트의 유전자좌 제어 영역이 바람직하게는 SEQ ID NO: 1의 위치 906 내지 939의 핵산 서열을 갖는 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 DNAse I 과민성 부위 2(HS2)의 코어 요소를 포함하는 방법.
- 제4항에 있어서, 발현 카세트의 유전자좌 제어 영역이 바람직하게는 SEQ ID NO: 1의 위치 742 내지 995의 핵산 서열을 갖는 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 DNAse I 과민성 부위 2(HS2)의 M1-코어-M2 요소를 포함하는 방법.
- 제5항에 있어서, 발현 카세트의 유전자좌 제어 영역이 SEQ ID NO: 1의 위치 741 내지 1109의 핵산 서열을 포함하는 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 과민성 부위 2(HS2)의 적어도 일부를 포함하는 방법.
- 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트의 유전자좌 제어 영역이 바람직하게는 SEQ ID NO: 1의 위치 310 내지 735의 핵산 서열을 갖는 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 과민성 부위 3(HS3) 또는 이의 일부, 및/또는 바람직하게는 SEQ ID NO: 1의 위치 13 내지 294의 핵산 서열을 갖는 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 과민성 부위 4(HS4) 또는 이의 일부를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트의 유전자좌 제어 영역이 바람직하게는 SEQ ID NO: 5의 위치 24 내지 278의 핵산 서열을 갖는 인간 α-글로빈 유전자 클러스터의 과민성 부위 40(HS40) 또는 이의 일부를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트의 프로모터 영역이 전사 개시 부위 및 선택적으로 인간 Aγ 글로빈 유전자의 5' 비번역 영역의 적어도 일부를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트의 프로모터 영역이 전사 개시 부위와 관련하여 인간 Aγ 글로빈 유전자의 뉴클레오티드 -384 내지 +36, 및/또는 SEQ ID NO: 1의 위치 1123 내지 1542의 핵산 서열을 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트가 전사 종료자 영역을 추가로 포함하는 방법.
- 제11항에 있어서, 전사 종료자 영역이 바람직하게는 SEQ ID NO: 1의 위치 1725 내지 1730의 핵산 서열을 포함하는 아데닐중합체형성 신호, 및 전사 종료 부위를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트가 발현 카세트의 다른 요소에 기능적으로 연결된 인간 Aγ 글로빈 유전자의 3' 인핸서의 적어도 기능성 부분을 포함하는 인핸서 영역을 추가로 포함하는 방법.
- 제13항에 있어서, 발현 카세트의 인핸서 영역이 SEQ ID NO: 1의 위치 2136 내지 2881의 핵산 서열을 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 폴리펩티드가 당단백질 또는 이의 일부인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 폴리펩티드가 항체 또는 이의 유도체 또는 일부, 예를 들어, 항체의 중쇄 또는 경쇄; 생식샘자극호르몬, 예를 들어, FSH(난포-자극 호르몬), CG(융모생식샘 자극 호르몬), LH(황체형성 호르몬) 및 TSH(갑상샘-자극 호르몬); 에리트로포이에틴; 및 혈액 응고 인자, 예를 들어, 인자 VII, VIII, IX 또는 폰 빌레브란트 인자로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트가 숙주 세포로 안정적으로 형질감염되는 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 발현 카세트 및 선별 마커 유전자, 바람직하게는 증폭 가능한 선별 마커 유전자를 포함하는 벡터로 형질감염되고, 단계 (b)에서의 배양 조건이 세포 배양 배지 내에 상응하는 선별 제제의 존재를 포함하는 방법.
- 제18항에 있어서, 선별 마커 유전자가 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 바람직하게는 항폴레이트 내성 DHFR 변이체를 인코딩하고, 상응하는 선별 제제가 항폴레이트, 바람직하게는 메토트렉세이트인 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 진핵생물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 더욱 바람직하게는 인간 세포, 또는 이들로부터 유래된 세포인 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 혈액 세포, 바람직하게는 백혈구, 혈액 전구체 세포 또는 백혈병 세포, 또는 이들로부터 유래된 세포인 방법.
- 서로 기능적으로 연결된,
(i) 인간 β-글로빈 유전자 클러스터 또는 인간 α-글로빈 유전자 클러스터의 유전자좌 제어 영역의 적어도 기능성 부분을 포함하는 유전자좌 제어 영역;
(ii) 인간 Aγ 글로빈 유전자의 프로모터의 적어도 기능성 부분을 포함하는 프로모터 영역;
(iii) 선택적으로, 코딩 영역;
(iv) 전사 종료자 영역; 및
(v) 인간 Aγ 글로빈 유전자의 3' 인핸서의 적어도 기능성 부분을 포함하는 인핸서 영역을 포함하는 발현 카세트로서,
발현 카세트가 전체 인간 Aγ 글로빈을 코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는, 발현 카세트. - 제22항에 있어서, 유전자좌 제어 영역이 바람직하게는 SEQ ID NO: 1의 위치 906 내지 939의 핵산 서열을 갖는 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 DNAse I 과민성 부위 2(HS2)의 코어 요소를 포함하는 발현 카세트.
- 제23항에 있어서, 유전자좌 제어 영역이 바람직하게는 SEQ ID NO: 1의 위치 742 내지 995의 핵산 서열을 갖는 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 DNAse I 과민성 부위 2(HS2)의 M1-코어-M2 요소를 포함하는 발현 카세트.
- 제24항에 있어서, 유전자좌 제어 영역이 SEQ ID NO: 1의 위치 741 내지 1109의 핵산 서열을 포함하는 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 과민성 부위 2(HS2)의 적어도 일부를 포함하는 발현 카세트.
- 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자좌 제어 영역이 바람직하게는 SEQ ID NO: 1의 위치 310 내지 735의 핵산 서열을 갖는 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 과민성 부위 3(HS3) 또는 이의 일부, 및/또는 바람직하게는 SEQ ID NO: 1의 위치 13 내지 294의 핵산 서열을 갖는 인간 β-글로빈 유전자 클러스터의 과민성 부위 4(HS4) 또는 이의 일부를 추가로 포함하는 발현 카세트.
- 제22항에 있어서, 유전자좌 제어 영역이 바람직하게는 SEQ ID NO: 5의 위치 24 내지 278의 핵산 서열을 갖는 인간 α-글로빈 유전자 클러스터의 과민성 부위 40(HS40) 또는 이의 일부를 포함하는 발현 카세트.
- 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터 영역이 전사 개시 부위 및 선택적으로 인간 Aγ 글로빈 유전자의 5' 비번역 영역의 적어도 일부를 포함하는 발현 카세트.
- 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터 영역이 전사 개시 부위와 관련하여 인간 Aγ 글로빈 유전자의 뉴클레오티드 -384 내지 +36, 및/또는 SEQ ID NO: 1의 위치 1123 내지 1542의 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트.
- 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 종료자 영역이 바람직하게는 SEQ ID NO: 1의 위치 1725 내지 1730의 핵산 서열을 포함하는 아데닐중합체형성 신호, 및 전사 종료 부위를 포함하는 발현 카세트.
- 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 인핸서 영역이 SEQ ID NO: 1의 위치 2136 내지 2881의 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트.
- 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 제한 효소의 적어도 하나의 인지 서열을 포함하는 클로닝 부위를 추가로 포함하는 발현 카세트.
- 제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩 영역이 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트.
- 제33항에 있어서, 관심 폴리펩티드가 당단백질 또는 이의 일부인 발현 카세트.
- 제33항 또는 제34항에 있어서, 관심 폴리펩티드가 항체, 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이들의 일부인 발현 카세트.
- 제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩 영역이 분비 발현을 위한 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트.
- 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 서로 기능적으로 연결된 (i) 유전자좌 제어 영역, (ii) 프로모터 영역, (iii) 코딩 영역 및/또는 클로닝 부위, (iv) 전사 종료자 영역, (v) 인핸서 영역을 전사 방향으로 포함하는 발현 카세트.
- 제22항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵생물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 더욱 바람직하게는 인간 세포에서의 발현에 적합화된 발현 카세트.
- 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트를 포함하는 벡터.
- 제39항에 있어서, 하나 이상의 선별 마커 유전자를 추가로 포함하는 벡터.
- 제39항 또는 제40항에 있어서, 진핵생물 세포의 안정적인 형질감염을 위해 적합화된 벡터.
- 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트 또는 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제42항에 있어서, 진핵생물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 더욱 바람직하게는 인간 세포, 또는 이들로부터 유래된 세포인 숙주 세포.
- 제42항 또는 제43항에 있어서, 혈액 세포, 바람직하게는 백혈구, 혈액 전구체 세포 또는 백혈병 세포, 또는 이들로부터 유래된 세포인 숙주 세포.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법에서의 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트 또는 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포의 용도.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트가 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트이고/이거나, 숙주 세포가 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포인 방법.
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