KR20170127258A - Cell therapy composition for preventing or treating neurodegenerative disease comprising regulatory T cells as active ingredient - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a cell treatment composition for the prevention or treatment of degenerative brain diseases comprising regulatory T cells (Treg cells) as an active ingredient; a personalized kit for the prevention or treatment of degenerative brain diseases comprising the composition, and a method for preventing or treating degenerative brain diseases including a step of injecting the composition to a patient with a degenerative brain disease.

Description

조절 T 세포를 유효성분으로 하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물{Cell therapy composition for preventing or treating neurodegenerative disease comprising regulatory T cells as active ingredient}[0001] The present invention relates to a cell therapy composition for preventing or treating a degenerative brain disease comprising regulatory T cells as an active ingredient,

본 발명은 조절 T 세포를 유효성분으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a cell therapy composition for preventing or treating degenerative brain diseases comprising regulatory T cells as an active ingredient.

알츠하이머병은 노인에서 치매를 일으키는 퇴행성 뇌질환의 일종으로 진행성 기억력 및 인지력 상실이 주요 증상이다. 알츠하이머병의 정확한 발병원인 및 기전이 밝혀지지는 않았으나 환자의 뇌에서 발견되는 노인반점(Senile plaque)과 신경섬유 덩어리(Neurofibrillary tangle)가 관찰되었고, 아밀로이드-베타와 APP-C 단백질(Anti-amyloid Precursor Protein)과 같은 독성 단백질에 의한 신경세포 사멸, 시냅스 손실 및 Tau 단백질의 변성 및 과인산화에 의한 신경섬유 덩어리의 형성기전이 밝혀졌고, 이상적인 질환모델을 확립이나, 새로운 예방 및 치료방법 개발 등의 많은 연구가 진행되고 있다. 또한, 알츠하이머질환에서 신경염증이 중요하다는 사실이 밝혀지면서 신경염증 제어를 통한 뇌질환 예방 및 치료를 위한 연구가 최근 중요한 분야로 인식되고 있다. Alzheimer's disease is a type of degenerative brain disease that causes dementia in the elderly, with progressive memory and loss of cognition. Although the precise cause and mechanism of Alzheimer's disease was not revealed, senile plaques and neurofibrillary tangles were found in the brain of the patients, and amyloid-beta and APP-C proteins (Anti-amyloid Precursor Protein), synapse loss, and the formation of nerve fiber masses by denaturation and hyperphosphorylation of Tau protein, and establishing an ideal disease model, but many of them, such as the development of new preventive and therapeutic methods Research is underway. In addition, as neural inflammation is found to be important in Alzheimer's disease, researches for prevention and treatment of brain diseases through control of neuroinflammation are recently recognized as important fields.

현재 알츠하이머병 정신 및 행동장애증상을 완화시키는 약물치료가 시행되고 있으며, 질병을 예방하거나 근본적으로 치료할 수 있는 효과적인 치료법 및 치료제가 없는 실정이다. 지난 30년간 알츠하이머병의 발병기전에 관한 활발한 연구가 진행되었고 다양한 치료 기전이 연구되었으며 상당수의 임상 시험도 진행되었다. 특히 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌틴턴병 등의 퇴행성 뇌질환에 대하여 줄기세포에 의한 신경세포 재생 기법이 치료효과가 있음이 동물 모델에서 확인되고 있다. 그 중면역거부 반응, 종양형성, 윤리도덕적 문제가 없는 성체줄기세포 연구가 크게 주목받고 있다. Currently, there are drug treatments that alleviate the symptoms of Alzheimer's disease and behavioral disorders, and there is no effective treatment or treatment to prevent or fundamentally treat the disease. During the last 30 years there has been active research on the pathogenesis of Alzheimer's disease and various therapeutic mechanisms have been studied and a number of clinical trials have been conducted. In particular, it has been confirmed in animal models that neural cell regeneration techniques by stem cells are effective for degenerative brain diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease and Huntington's disease. Among them, research on adult stem cells without adverse reaction, tumor formation, ethical and moral problems has attracted much attention.

21세기 노령화 사회에서 우리 인류를 가장 괴롭히게 될 일명 "21세기 질환"으로 불려지고 있는 알츠하이머병(노인성치매)의 연구가 매우 활발히 이루어지고 있기 때문에 뇌질환 가운데에서는 가장 빠른 시간 내에 원인에 기반을 둔 치료제와 백신개발 및 줄기세포 치료기술이 개발되어 어느 정도 정복이 가능하리라 예견되고 있다. 고령인구 증가에 따라 노인에게서 나타나는 치매, 뇌졸중 등의 뇌질환이 폭발적으로 증가하는 추세이며 이를 극복하기 위한 치료제의 개발은 고령화 사회 국민 건강 증진을 위한 핵심기반기술이다. 또한, 신경과학 특히 뇌질환 연구에서의 성과는 무한경쟁시대에서의 국가적 생존, 더 나아가 선진국 진입의 국가적 목표들을 달성하는데 있어 우리나라 과학기술 발전의 견인차 역할을 할 것이다.In the 21st century, research on Alzheimer's disease (senile dementia), which is called "21st century disease," which is the most annoying of humanity in the aging society in the 21st century, And vaccine development and stem cell treatment technology have been developed, and it is predicted that it will be possible to conquer to some extent. Brain diseases such as dementia and stroke in elderly people are increasing explosively due to the aging population, and the development of therapeutic agents to cope with this is a core technology for promoting the aging society and the public health. In addition, the achievements in neuroscience research, especially brain disease research, will serve as a driving force behind Korea 's technological development in achieving national survival in the age of infinite competition, and furthermore, national goals of entry into advanced countries.

현재 노인성 뇌질환인 뇌졸중, 치매, 파킨슨병 등의 퇴행성 뇌질환의 연간 시장 규모는 미국이 200조원, 한국이 약 10조원에 달하며, 2026년경에는 우리나라도 초고령 국가에 진입하게 되어 시장규모는 최소 2-3배이상 증가하리라 예상되고 있다. 뇌질환 치료제 관련 의약품시장에서 화합물 기반의 고전적 치료약물 이외에, 단백질/백신, 세포치료제 등의 대체 치료제 시장도 확대되고 있는 추세이다.The annual market size of degenerative brain diseases such as stroke, dementia, and Parkinson's disease, which are the oldest brain diseases, is 200 trillion won in the United States and 10 trillion won in Korea. By 2026, Korea will also enter the ultra-old country. It is expected to increase more than 2-3 times. In addition to the compound-based classical therapeutic drugs, the market for alternative drugs such as protein / vaccine, cell therapy, etc. is also expanding in the pharmaceutical market related to the cerebral disease treatment drug.

따라서, 본 발명자들은 면역관용 및 면역향상성을 유지하는데 중요한 역할을 하는 조절 T 세포 (Treg)를 분리하여 알츠하이머 질환 동물모델에 세포이식하는 알츠하이머병의 치료를 위한 세포치료제를 개발하였고, 또한, 아밀로이드 베타 펩타이드와 bvPLA2를 투여하여 아밀로이드-베타 특이적인 Treg 세포를 생산하여 이를 알츠하이머 질환 동물모델에 세포이식을 함으로써 알츠하이머병의 질환치료를 위한 세포치료제를 개발하여 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have developed a cell therapy agent for the treatment of Alzheimer's disease, which is a cell transplantation into an animal model of Alzheimer's disease by isolating regulatory T cells (Tregs) that play important roles in maintaining immune tolerance and immune enhancement, Beta-peptide and bvPLA2 to produce an amyloid-beta-specific Treg cell and transplant it into an animal model of Alzheimer's disease to develop a cell therapy agent for treating Alzheimer's disease.

1. 미국공개특허 제2006/0115899호1. U.S. Published Patent Application 2006/0115899 2. 한국공개특허 제20130110283호2. Korean Patent Publication No. 20130110283 3. 한국등록특허 제1578591호3. Korean Patent No. 1578591

1. Nature Communications, 6, Article number: 7967, 18 Aug, 20151. Nature Communications, 6, Article number: 7967, 18 Aug, 2015

본 발명의 목적은 조절 T 세포(Treg 세포)를 유효성분으로 하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a cell therapy composition for preventing or treating degenerative brain diseases comprising regulatory T cells (Treg cells) as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 조절 T 세포(Treg 세포)를 유효성분으로 하는 세포치료제 조성물을 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 개인맞춤형 키트를 제공하는 것이다. It is still another object of the present invention to provide a personalized kit for preventing or treating degenerative brain diseases comprising a cytotoxic agent composition containing regulatory T cells (Treg cells) as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 조절 T 세포(Treg 세포)를 포함하는 조성물을 퇴행성 뇌질환 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다. It is yet another object of the present invention to provide a method for preventing or treating degenerative brain diseases comprising the step of administering a composition comprising regulatory T cells (Treg cells) to a subject suffering from degenerative brain diseases.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 조절 T 세포(Treg 세포)를 유효성분으로 하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a cell therapy composition composition for the prevention or treatment of degenerative brain diseases comprising regulatory T cells (Treg cells) as an active ingredient.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조절 T 세포(Treg 세포)는 아밀로이드 베타 펩타이드 및 bvPLA2(bee venom phospholipase A2)을 투여하여 유도된 아밀로이드 베타 특이적인 조절 T 세포(Treg 세포)일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the regulatory T cells (Treg cells) may be amyloid beta specific peptides and amyloid beta specific regulatory T cells (Treg cells) induced by administration of bvPLA2 (bee venom phospholipase A2).

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 아밀로이드 베타(Aβ) 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the amyloid beta (Aβ) peptide may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 용어, "아밀로이드 베타"는 알츠하이머병 환자의 뇌에서 발견되는아밀로이드 베타 플라크(amyloid beta plaque)의 주요 성분으로서, 36 내지 43의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이고, 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein, APP)로부터 만들어진다고 알려져 있다. 아밀로이드 전구 단백질은 β-와 γ-세크레타아제라에 의해 분해될 수 있다. The term "amyloid beta" of the present invention is a peptide consisting of 36 to 43 amino acids as a major component of an amyloid beta plaque found in the brain of a patient suffering from Alzheimer's disease and is an amyloid precursor protein (APP ). ≪ / RTI > Amyloid precursor proteins can be degraded by? And? -Secretaseases.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 bvPLA2(bee venom phospholipase A2)는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the bvPLA2 (bee venom phospholipase A2) may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

본 발명의 용어, "bvPLA2"은 "bee venom phospholipase A2"으로서, 봉독(bee venom)의 혼합물의 성분 중 PLA2를 말하며, "PLA2"는 글리세롤의 두번째 탄소위치에서 가수분해하여 지방산을 생성하는 기능을 가진 효소로서, 인지질의 sn-2 아실 결합을 특이적으로 인식하여 가수분해 활성을 촉매하여 아라키돈산과 라이소인지질(lysophospholipid)을 방출한다. PLA2는 일반적으로 박테리아, 곤충이나 뱀독뿐만 아니라 포유류의 조직에서도 발견된다. 본 발명의 bvPLA2는 꿀벌(Apis mellifera) 유래일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.The term " bvPLA2 "of the present invention refers to" bee venom phospholipase A2 ", PLA2 among components of a bee venom mixture, and PLA2 functions to hydrolyze fatty acids at the second carbon position of glycerol As an enzyme involved, it specifically recognizes the sn-2 acyl linkage of phospholipids and catalyzes the hydrolytic activity to release arachidonic acid and lysophospholipids. PLA2 is commonly found in tissues of mammals as well as bacteria, insects and snakeheads. The bvPLA2 of the present invention may be derived from bees (Apis mellifera), but is not limited thereto.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병, 헌팅턴병 및 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the degenerative brain disease may be selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Huntington's disease and Parkinson's disease.

본 발명의 용어, "퇴행성 뇌질환"은 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 피크(Pick) 질환 또는 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob) 질환을 포함한다. The term "degenerative brain disease" of the present invention includes stroke, stroke, dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Pick's disease or Creutzfeld-Jakob disease.

본 발명의 용어, "조절 T 세포"는 T 세포의 일종으로서, 비정상적으로 활성화된 면역세포의 염증 반응을 제어하는 특성이 있는 세포이며, Regulatory T cells 또는 Treg 로 표시한다. 이러한 조절 T 세포는 크게 자연성(natural) Treg와 적응성(adaptive) Treg 세포로 나눌 수 있으며, 자연성 Treg인 CD+ CD25+ T세포는 흉선에서 새로이 만들어질 때부터 면역억제기능을 부여받게 되며, 정상개체의 말초 CD4+ T 림프구 중 5~10%의 빈도로 존재한다. 아직까지 자연성 Treg의 면역억제 기전은 정확히 파악되지 못하고 있지만, Foxp3라는 유전자의 발현 제어 인자가 자연성 Treg의 분화와 활성에 중요한 역할을 수행한다는 사실이 최근에 밝혀졌다. 또한, 말초 자연성 T 세포는 특정 환경 하에서 자가 또는 외부항원의 자극을 받으면 면역억제효과를 나타내는 세포로 분화될 수 있는데, 이를 적응성 Treg 또는 유도성(inducible) Treg로 부르며, IL-10을 분비하는 Tr1, TGF-β를 분비하는 Th3 및 CD8 Ts 등이 적응성 Treg에 해당한다.The term "regulatory T cells" of the present invention is a type of T cell, which is a cell that has the property of controlling the inflammatory response of abnormally activated immune cells, and is designated Regulatory T cells or Treg. These regulatory T cells can be divided into natural Treg and adaptive Treg cells, and the natural Treg, CD + CD25 + T cells, are immunosuppressed from the time when they are newly produced in the thymus, It is present in a frequency of 5-10% of CD4 + T lymphocytes. Although the mechanisms of immunosuppression of natural Tregs have not yet been elucidated, it has recently been shown that Foxp3 gene expression control factors play an important role in the differentiation and activation of natural Tregs. In addition, peripheral T cells can be differentiated into cells exhibiting an immunosuppressive effect upon being stimulated by a self or external antigen under a specific environment, which is referred to as an adaptive Treg or an inducible Treg, and Tr1 , And Th3 and CD8 Ts that secrete TGF-beta correspond to adaptive Tregs.

본 발명의 용어, "세포치료제"란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식ㆍ선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년 부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다. 이러한 세포치료제는 크게 두 분야로 분류할 수 있으며 그 첫 번째는 조직재생 혹은 장기기능 회복을 위한 줄기세포 치료제이며, 두 번째는 생체 내 면역반응의 억제 혹은 면역반응의 항진 등 면역반응 조절을 위한 면역세포 치료제로 분류할 수 있다.The term "cell therapeutic agent" of the present invention refers to an agent capable of regenerating autologous, allogenic, xenogenic cells in vitro or in vitro to restore the functions of cells and tissues, And the like, which are used for the purpose of treatment, diagnosis and prevention. Since 1993, the United States has been administering cell therapy products as medicines since 2002. These cell treatments can be classified into two categories. The first is stem cell therapy for tissue regeneration or restoration of long-term function, the second is immunization for controlling immune response such as inhibition of in vivo immune response or exaggeration of immune response Cell therapy.

본 발명의 세포치료제 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여될수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.The administration route of the cell therapeutic composition of the present invention can be administered through any conventional route as long as it can reach the target tissue. But are not limited to, parenteral administration, for example, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration.

본 발명에서의 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). The composition of the present invention can be formulated into a suitable form together with a pharmaceutical carrier generally used for cell therapy. &Quot; Pharmaceutically acceptable " refers to compositions which are physiologically acceptable and which, when administered to humans, do not normally cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders, dizziness, or the like. Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, water, suitable oils, saline, aqueous carriers for parenteral administration such as aqueous glucose and glycols, etc., and may further contain stabilizers and preservatives. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid. Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol. Other pharmaceutically acceptable carriers can be found in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1995).

또한, 본 발명에서의 조성물은 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.In addition, the composition of the present invention may be administered by any device capable of transferring a cell therapeutic agent to a target cell.

본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. The cell therapeutic composition of the present invention may comprise a therapeutically effective amount of a cell therapy agent for the treatment of diseases.

용어 치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 조절 T 세포를 체중 kg당 1×106 내지 5×107 세포수의 세포치료제가 포함될 수 있다.The term therapeutically effective amount refers to the amount of active ingredient or pharmaceutical composition that induces a biological or medical response in a tissue system, animal or human, as contemplated by a researcher, veterinarian, physician or other clinician, This includes an amount that induces relief of the symptoms of the disease or disorder being treated. It will be apparent to those skilled in the art that the cell therapy agent contained in the composition of the present invention will vary depending on the desired effect. The optimal cell therapy agent content can therefore be readily determined by those skilled in the art and will depend upon a variety of factors including the nature of the disease, the severity of the disease, the amount of other ingredients contained in the composition, the type of formulation, and the age, weight, , The time of administration, the route of administration and the fraction of the composition, the duration of the treatment, the co-administered drug, and the like. It is important to include the amount by which all of the above factors are taken into account so as to obtain the maximum effect in a minimal amount without side effects. For example, a cell therapy agent of the present invention can be included in the amount of 1 × 10 6 to 5 × 10 7 cells per kg body weight of the regulatory T cells.

또한, 본 발명은 조절 T 세포(Treg 세포)를 유효성분으로 하는 세포치료제 조성물을 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 개인맞춤형 키트를 제공한다. The present invention also provides a personalized kit for preventing or treating a degenerative brain disease comprising a cytotoxic agent composition comprising regulatory T cells (Treg cells) as an active ingredient.

또한, 본 발명은 조절 T 세포(Treg 세포)를 포함하는 조성물을 퇴행성 뇌질환 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다. The present invention also provides a method for preventing or treating degenerative brain diseases comprising administering a composition comprising regulatory T cells (Treg cells) to a subject suffering from degenerative brain diseases.

본 발명에서의 용어, 개체는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.In the present invention, the term individual refers to a mammal that is the subject of treatment, observation or experiment, preferably a human.

본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 세포치료제 조성물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 조성물에 포함되는 세포치료제는 체중 kg당 1×104 내지 1×108 세포수를 포함하는 것이 바람직하다.In the treatment method of the present invention, in the case of an adult, when the cell therapeutic composition of the present invention is administered once to several times a day, the cell therapeutic agent contained in the composition is administered at a dose of 1 × 10 4 to 1 × 10 8 cells / .

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 세포치료제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 직장, 정맥내(intravenous therapy, i.v), 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.In the therapeutic method of the present invention, the composition comprising the cell treatment agent of the present invention as an active ingredient can be administered orally, rectally, intravenously, intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, intrasternally, transdermally, topically, Lt; RTI ID = 0.0 > route. ≪ / RTI >

본 발명에 따른 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물은 퇴행성 퇴질환, 특히 알츠하이머병에 대한 근본적인 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. The cell therapeutic composition for the prevention or treatment of degenerative brain diseases according to the present invention can be usefully used for preventing or treating degenerative degenerative diseases, particularly Alzheimer's disease.

도 1은 각 마우스 모델에서 모리스 수중미로(morris water maze) 실험을 통해 인지능력을 살펴본 것이다. (A)는 각 마우스모델이 4일간 훈련과정에서 hidden platform에 찾아가는데 걸리는 시간(latency)을 측정한 것이고, (B)는 각 마우스모델이 platform 위치에 머무르는 시간(Retention)를 측정한 것이며, (C)는 각 마우스모델이 platform이 있던 사분면 안에 머무르는 시간(Time in quadrant)을 측정한 것이며, (D)는 각 마우스모델이 platform이 있던 위치를 지나가는 회수(Number of crossing)를 측정한 것이다. WT: 정상 마우스 군; 3xTg: 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Teff: Teff 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg: Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군.
도 2는 각 마우스 모델의 비장에서 Treg 세포(Foxp3+CD4+)의 분포를 확인한 것이다. WT: 정상 마우스 군; 3xTg: 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Teff: Teff 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg: Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군.
도 3은 각 마우스 모델의 염증관련 싸이토카인의 발현정도를 확인한 것이다. (A)는 IL-2, (B)는 IL-6, (C)는 IFN-γ, (D)는 IL-17A, (F)는 IL-10, (F)는 IL-4, 및 (G)는 TNF-α을 나타낸 것이다. WT: 정상 마우스 군; 3xTg: 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Teff: Teff 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg: Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군.
도 4는 각 마우스 모델의 뇌 해마부위에서 아밀로이드-베타 플라크를 살펴본 것이다. WT: 정상 마우스 군; 3xTg: 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Teff: Teff 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg: Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군.
도 5는 각 마우스 모델의 뇌 해마부위에서 아밀로이드-베타 플라크와 microglia를 살펴본 것이다. WT: 정상 마우스 군; 3xTg: 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Teff: Teff 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg: Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군.
도 6은 아밀로이드-베타 특이적 Treg 세포를 이식한 실험 스케줄을 나타낸 것이다.
도 7은 각 마우스 모델에서 모리스 수중미로(morris water maze) 실험을 통해 인지능력을 살펴본 것이다. (A)는 각 마우스모델이 4일간 훈련과정에서 hidden platform에 찾아가는데 걸리는 시간(latency)을 측정한 것이고, (B)는 각 마우스모델이 platform 위치에 머무르는 시간(Retention)를 측정한 것이며, (C)는 각 마우스모델이 platform이 있던 사분면 안에 머무르는 시간(Time in quadrant)을 측정한 것이며, (D)는 각 마우스모델이 platform이 있던 위치를 지나가는 회수(Number of crossing)를 측정한 것이다. WT: 정상 마우스 군; 3xTg: 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-PBS: negative control로 PBS를 처리한 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-Ab: Aβ 백신 후 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-Ab+PLA2: Aβ 백신과 PLA2 처리한 후 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-PLA2: PLA2 처리한 후 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-KLH: KLH 백신(negative control)을 진행한 후 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군.
도 8은 각 마우스 모델에서 헬퍼 T 세포의 분포 정도를 FACS 분석법을 통하여 확인한 것이다. (A)는 CD4+ T 세포군에서 IFN-γ+ 의 발현정도, (B)는 CD4+ T 세포군에서 IL-4+ 의 발현정도, 및 (C)는 CD4+ T 세포군에서 IL-17A+의 발현정도를 나타낸 것이다. WT: 정상 마우스 군; 3xTg: 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-PBS: negative control로 PBS를 처리한 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-Ab: Aβ 백신 후 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-Ab+PLA2: Aβ 백신과 PLA2 처리한 후 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-PLA2: PLA2 처리한 후 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-KLH: KLH 백신(negative control)을 진행한 후 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군.
도 9은 각 마우스 모델에서 염증관련 싸이토카인의 발현정도를 확인한 것이다. (A)는 IL-2, (B)는 IL-6, (C)는 IFN-γ, (D)는 IL-17A, (F)는 IL-10, (F)는 IL-4, 및 (G)는 TNF-α을 나타낸 것이다. WT: 정상 마우스 군; 3xTg: 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-PBS: negative control로 PBS를 처리한 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-Ab: Aβ 백신 후 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-Ab+PLA2: Aβ 백신과 PLA2 처리한 후 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-PLA2: PLA2 처리한 후 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-KLH: KLH 백신(negative control)을 진행한 후 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군.
도 10는 각 마우스 모델의 뇌 해마부위에서 아밀로이드-베타 플라크를 살펴본 것이다. WT: 정상 마우스 군; 3xTg: 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-PBS: negative control로 PBS를 처리한 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-Ab: Aβ 백신 후 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-Ab+PLA2: Aβ 백신과 PLA2 처리한 후 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-PLA2: PLA2 처리한 후 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군; 3xTg/Treg-KLH: KLH 백신(negative control)을 진행한 후 Treg 세포를 이식한 알츠하이머 모델 마우스 군.Figure 1 shows the cognitive abilities of each mouse model through a morris water maze experiment. (A) is a measurement of latency for each mouse model to travel to a hidden platform during a training period of 4 days, (B) is a measurement of the retention time of each mouse model in a platform position, ) Measures the time in quadrant in which each mouse model stays in the quadrant where the platform is located, and (D) measures the number of crossings that each mouse model traverses the platform. WT: normal mouse group; 3xTg: Alzheimer model mouse group; 3xTg / Teff: Alzheimer model mouse group implanted with Teff cells; 3xTg / Treg: Alzheimer's model mouse group transplanted with Treg cells.
Figure 2 shows the distribution of Treg cells (Foxp3 + CD4 +) in the spleen of each mouse model. WT: normal mouse group; 3xTg: Alzheimer model mouse group; 3xTg / Teff: Alzheimer model mouse group implanted with Teff cells; 3xTg / Treg: Alzheimer's model mouse group transplanted with Treg cells.
FIG. 3 shows the degree of expression of an inflammation-related cytokine in each mouse model. (A) is IL-2, (B) is IL-6, (C) is IFN-γ, (D) is IL-17A, G) represents TNF- ?. WT: normal mouse group; 3xTg: Alzheimer model mouse group; 3xTg / Teff: Alzheimer model mouse group implanted with Teff cells; 3xTg / Treg: Alzheimer's model mouse group transplanted with Treg cells.
Figure 4 shows amyloid-beta plaques in the brain hippocampal region of each mouse model. WT: normal mouse group; 3xTg: Alzheimer model mouse group; 3xTg / Teff: Alzheimer model mouse group implanted with Teff cells; 3xTg / Treg: Alzheimer's model mouse group transplanted with Treg cells.
Figure 5 shows amyloid-beta plaques and microglia in the brain hippocampal region of each mouse model. WT: normal mouse group; 3xTg: Alzheimer model mouse group; 3xTg / Teff: Alzheimer model mouse group implanted with Teff cells; 3xTg / Treg: Alzheimer's model mouse group transplanted with Treg cells.
Figure 6 shows the experimental schedule of transplanting amyloid-beta specific Treg cells.
Figure 7 shows the cognitive abilities of each mouse model through a morris water maze experiment. (A) is a measurement of latency for each mouse model to travel to a hidden platform during a training period of 4 days, (B) is a measurement of the retention time of each mouse model in a platform position, ) Measures the time in quadrant in which each mouse model stays in the quadrant where the platform is located, and (D) measures the number of crossings that each mouse model traverses the platform. WT: normal mouse group; 3xTg: Alzheimer model mouse group; 3xTg / Treg-PBS: Alzheimer's model mouse group transplanted with PBS-treated Treg cells with negative control; 3xTg / Treg-Ab: Alzheimer model mouse group transplanted with Treg cells after A [beta] vaccination; 3xTg / Treg-Ab + PLA2: Alzheimer model mouse group transplanted with Treg cells after treatment with A [beta] vaccine and PLA2; 3xTg / Treg-PLA2: an Alzheimer's model mouse group transplanted with Treg cells after PLA2 treatment; 3xTg / Treg-KLH: Alzheimer's model mouse group transplanted with Treg cells after KLH vaccine (negative control).
FIG. 8 shows the distribution of helper T cells in each mouse model through FACS analysis. (A) shows the expression level of IFN-γ + in the CD4 + T cell group, (B) shows the expression level of IL-4 + in the CD4 + T cell group and (C) shows the expression level of IL-17A + in the CD4 + T cell group . WT: normal mouse group; 3xTg: Alzheimer model mouse group; 3xTg / Treg-PBS: Alzheimer's model mouse group transplanted with PBS-treated Treg cells with negative control; 3xTg / Treg-Ab: Alzheimer model mouse group transplanted with Treg cells after A [beta] vaccination; 3xTg / Treg-Ab + PLA2: Alzheimer model mouse group transplanted with Treg cells after treatment with A [beta] vaccine and PLA2; 3xTg / Treg-PLA2: an Alzheimer's model mouse group transplanted with Treg cells after PLA2 treatment; 3xTg / Treg-KLH: Alzheimer's model mouse group transplanted with Treg cells after KLH vaccine (negative control).
FIG. 9 shows the degree of expression of an inflammation-related cytokine in each mouse model. (A) is IL-2, (B) is IL-6, (C) is IFN-γ, (D) is IL-17A, G) represents TNF- ?. WT: normal mouse group; 3xTg: Alzheimer model mouse group; 3xTg / Treg-PBS: Alzheimer's model mouse group transplanted with PBS-treated Treg cells with negative control; 3xTg / Treg-Ab: Alzheimer model mouse group transplanted with Treg cells after A [beta] vaccination; 3xTg / Treg-Ab + PLA2: Alzheimer model mouse group transplanted with Treg cells after treatment with A [beta] vaccine and PLA2; 3xTg / Treg-PLA2: an Alzheimer's model mouse group transplanted with Treg cells after PLA2 treatment; 3xTg / Treg-KLH: Alzheimer's model mouse group transplanted with Treg cells after KLH vaccine (negative control).
Figure 10 shows amyloid-beta plaques in the brain hippocampal region of each mouse model. WT: normal mouse group; 3xTg: Alzheimer model mouse group; 3xTg / Treg-PBS: Alzheimer's model mouse group transplanted with PBS-treated Treg cells with negative control; 3xTg / Treg-Ab: Alzheimer model mouse group transplanted with Treg cells after A [beta] vaccination; 3xTg / Treg-Ab + PLA2: Alzheimer model mouse group transplanted with Treg cells after treatment with A [beta] vaccine and PLA2; 3xTg / Treg-PLA2: an Alzheimer's model mouse group transplanted with Treg cells after PLA2 treatment; 3xTg / Treg-KLH: Alzheimer's model mouse group transplanted with Treg cells after KLH vaccine (negative control).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are for further illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.

실시예Example 1. 실험방법 1. Experimental Method

1.1. 세포분리 및 세포배양1.1. Cell Isolation and Cell Culture

본 발명에서 사용된 조절 T 세포는 C57BL/6n 마우스의 췌장에서 분리하였다. 마우스의 췌장을 떼어 PBS (Phosphate buffered saline)에 넣고 갈아준 후 RBC 라이시스 버퍼(lysis buffer)로 적혈구를 제거하였다. 분리한 splenocytes는 MACS CE4CD25 조절 T 세포 분리 키트를 이용하여 조절 T 세포 (CD4+CD25+ 세포군)와 작용 T 세포 (CD4+CD25- 세포군)로 분리하였다.Regulatory T cells used in the present invention were isolated from the pancreas of C57BL / 6n mice. The mouse pancreas was removed and replaced with PBS (phosphate buffered saline), and the red blood cells were removed with RBC lysis buffer. Separated splenocytes were separated into conditioned T cells (CD4 + CD25 + cell group) and functional T cells (CD4 + CD25- cell group) using a MACS CE4CD25 regulatory T cell isolation kit.

1.2. 동물모델1.2. Animal model

본 발명에서 사용된 모델은 알츠하이머 질환 동물 모델로서 3xTg-AD 마우스를 사용하였다. 본 마우스는 Jackson laboratory(미국)에서 구입하였으며, 이 마우스는 알츠하이머 유발과 관련된 3개의 유전자인 스웨덴 돌연변이 아밀로이드 베타 전구체(APPSwe KM670/671NL), 돌연변이 프레스넬린1(PS1 M146V)과 돌연변이 타우(tau P301L)를 동시에 함유한 동물이다. The model used in the present invention was a 3xTg-AD mouse as an animal model of Alzheimer's disease. The mouse was purchased from the Jackson laboratory (USA), which has three genes associated with Alzheimer's disease, the Swedish mutated amyloid beta precursor (APPSwe KM670 / 671NL), the mutant pressnellin 1 (PS1 M146V) and the mutant tau (tau P301L) .

1.3. 세포이식 방법1.3. Cell transplantation method

본 발명에서 사용된 조절 T 세포와 작용 T 세포는 알츠하이머 질환 동물모델인 3xTg-AD 마우스의 꼬리혈관내로 정맥주사하여 이식하였다. The regulatory T cells and effector T cells used in the present invention were implanted intravenously into the tail vein of 3xTg-AD mice, an animal model of Alzheimer's disease.

또한, 아밀로이드-베타 특이적 Treg 세포를 이식하기 위하여 Foxp3-DTR 마우스(Foxp3 유전자 뒤에 DTR(diphtheria toxin receptor)가 달려 있는 형질전환 마우스를 사용하였고, DT(Dhphtheria toxin, 투여하는 경우 Foxp3가 제거됨)의 주입은 면역반응 유도 2일전에 실시하였으며, DT을 투여하여 Treg 세포를 제거한 후 Aβ, Aβ+PLA2, PLA2 또는 KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin, 대조군)를 처리하여 Aβ-반응성의 Treg 세포의 생성을 유도하였다. PLA2는 1일 및 5일에 2회 주사하였다. 10일간 면역반응 유도 후에 마우스의 췌장을 각 Aβ, Aβ+PLA2, PLA2 또는 KLH를 처리하여 in vitro에서 4일간 배양하였고, 14일 후 알츠하이머 모델인 3xTg 마우스의 혈관 내로 세포를 이식(adoptive transfer)하였다(도 6). Foxp3-DTR mouse (transgenic mouse with diphtheria toxin receptor (DTR) followed by Foxp3 gene was used, and DT (dhphtheria toxin, when administered Foxp3 was removed) was used to transplant amyloid-beta specific Treg cells Injection was performed two days before the induction of immune response, and T reg cells were removed by DT, followed by treatment with Aβ, Aβ + PLA2, PLA2 or KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin, control group) to induce the production of Aβ-reactive Treg cells . PLA2 was injected twice on days 1 and 5. After induction of the immune response for 10 days, the mouse pancreas was treated with each Aβ, Aβ + PLA2, PLA2 or KLH for 4 days in vitro, and after 14 days the Alzheimer's model Lt; RTI ID = 0.0 > 3xTg < / RTI > mice (Figure 6).

1.4. 모리스 1.4. Morris 수중미로Underwater maze 실험 Experiment

각 실험군의 기억 및 인지능력 향상 효과를 확인하기 위하여 모리스 수중 미로 실험을 실시하였다. 모리스 수중미로 실험은 원통안에 물을 채우고 사분면으로 나눈후 그 중 한분면 안에 hidden platform을 설치한 후, 처음 4일 동안 쥐를 hidden platform이 위치하지 않은 다른 분면에서 출발하여 hidden platform을 찾아가도록 훈련하는 것이다. 5일 째에 hidden platform을 제거 한 후 쥐가 platform이 있던 위치에 머무르는 시간 (Retention), platform이 있던 분면 안에 머무르는 시간(Time in quadrant), platform이 있던 위치를 지나가는 회수(Number of crossing)을 측정하였다.Morris water maze experiment was carried out to confirm memory and cognitive improvement of each experimental group. The Morris water maze experiment was performed by filling the cylinder with water, dividing it into quadrants, installing a hidden platform on one side of the cylinder, and training the mice for the first 4 days to start from the other side where the hidden platform was not located and to find the hidden platform will be. On the 5th day, after removing the hidden platform, we measured the retention time of the mouse at the position of the platform, the time in quadrant in which the platform was located, and the number of crossing times at which the platform was located Respectively.

1.5. 1.5. FACSFACS 분석 analysis

Treg 세포의 분포 정도를 확인하기 위하여, 각 마우스 모델에서 비장과 림프절을 분리하여 FACS(Fluorescence-activated cell sorting)로 분석하였다. 비장과 림프절을 마우스로부터 분리하여 갈아준 후 항-CD4-FITC와 항-CD25-PE 항체로 세포표면 마커를 염색하였다. Fix/Perm buffer로 세포막을 뚫어 준 후 항-Foxp3-PE-cy5 항체로 염색한 후 Treg 세포의 분포를 확인하였다. In order to confirm the distribution of Treg cells, spleen and lymph node were separated from each mouse model and analyzed by fluorescence-activated cell sorting (FACS). The spleen and lymph node were separated from the mice and were stained with anti-CD4-FITC and anti-CD25-PE antibody. Cells were stained with Fix / Perm buffer and stained with anti-Foxp3-PE-cy5 antibody to confirm the distribution of Treg cells.

또한, 헬퍼 T 세포의 분포를 확인하기 위하여, 각 마우스 모델의 비장세포를 분리한 후 ionomycin과 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) 및 golgi-stop을 처리하고 5시간 후에 항-CD4-FITC, 항-IFNγ-PE, 항-IL4-PE, 항-IL17A-APC 항체로 세포표면 마커를 염색하였다. 각 Th1, Th2, Th17 세포의 분포를 FACS(Fluorescence-activated cell sorting)로 분석하였다.In order to confirm the distribution of helper T cells, spleen cells of each mouse model were separated and treated with ionomycin, PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) and golgi-stop, and 5 hours later, anti-CD4- Cell surface markers were stained with anti-IFN gamma-PE, anti-IL4-PE and anti-IL17A-APC antibodies. The distribution of Th1, Th2, and Th17 cells was analyzed by fluorescence-activated cell sorting (FACS).

1.6. 1.6. 싸이토카인Cytokine (( cytokinecytokine ) ) 발현정도Degree of expression 확인 Confirm

각 마우스 모델의 비장세포를 72시간 항-CD3/CD-28 항체의 존재하여 배양한 후 Th1/2/17 싸이토카인 CBA 키트를 이용하여 염증관련 싸이토카인의 발현정도를 측정하였다. Th1/2/17 싸이토카인은 IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-10 및 IL-17A 항체가 바인딩 되어있는 비드(bead)에 배양액에 존재하는 싸이토카인을 반응 시킨 후 FACS(Fluorescence-activated cell sorting)로 분석하였다.The spleen cells of each mouse model were cultured in the presence of anti-CD3 / CD-28 antibody for 72 hours, and the degree of inflammation-associated cytokine expression was measured using a Th1 / 2/17 cytokine CBA kit. Th1 / 2/17 cytokine is a cytokine present in the culture medium to beads to which IL-2, IL-4, IL-6, IFN- ?, TNF- ?, IL-10 and IL- And analyzed by fluorescence-activated cell sorting (FACS).

1.7. 면역조직염색법1.7. Immunohistochemistry

마우스의 뇌를 고정과 탈수의 과정을 거친 후 냉동시킨 후 냉동절단(cryosection) 기를 이용하여 30 μm의 크기로 절편하였다. 절편한 뇌절편을 citrate buffer (pH 6.0)에 넣어 고온에서 처리하여 antigen retrieval 한 후 내재적 퍼옥시다제 활성을 제거하기 위해 3% 과산화수소를 10분간 처리하였다. 1.5% BSA(bovine serum albumin)/PBS를 넣고 1시간 블러킹한 후 항-아밀로이드 베타 항체 (1:500 희석)를 4℃에서 오버나잇 처리하였다. Vectastatin ABC 키트를 이용하여 2차 항체와 ABC reagent를 처리한 후 DAB substrate 넣어 발색하였다.The mouse brain was frozen after being fixed and dehydrated, and then cut into a size of 30 μm using a cryosection machine. The sectioned brain slices were treated with high-temperature citrate buffer (pH 6.0) for antigen retrieval and treated with 3% hydrogen peroxide for 10 min to remove intrinsic peroxidase activity. Anti-amyloid beta antibody (1: 500 dilution) was over-treated at 4 ° C after blocking with 1.5% BSA (bovine serum albumin) / PBS for 1 hour. Secondary antibody and ABC reagent were treated with Vectastatin ABC kit, and DAB substrate was developed.

실시예Example 2.  2. 세포이식된Cell-implanted 동물모델의 인지능력 회복 효과 Cognitive restorative effect of animal model

조절 T 세포(Treg)와 작용 T 세포(Teff)를 알츠하이머 질환 동물 모델인 3xTg-AD 마우스에 세포이식을 한 후 모리스 수중미로(morris water maze) 실험을 통해 인지능력을 실험하였다. 모리스 수중미로 실험에서는 각 마우스모델이 4일간 훈련과정에서 hidden platform에 찾아가는데 걸리는 시간(latency), platform 위치에 머무르는 시간(Retention), platform이 있던 사분면 안에 머무르는 시간(Time in quadrant) 및 platform이 있던 위치를 지나가는 회수(Number of crossing)를 측정하였고, 그 결과 Treg 세포를 마우스에 이식한 경우에는 대조군(WT, wild-type)의 수준으로 인지능력이 향상되었음을 확인하였다 (도 1). Regulatory T cells (Treg) and functional T cells (Teff) were transplanted into 3xTg-AD mouse model of Alzheimer's disease and morris water maze experiment was performed to test cognitive ability. In the Morris Underwater Maze experiment, the latency of each mouse model to visit the hidden platform during 4 days of training, the retention time at the platform position, the time in quadrant in which the platform was located, The number of crossings was measured. As a result, it was confirmed that when Treg cells were transplanted into mice, the cognitive ability was improved to the level of the control (WT, wild-type) (Fig. 1).

실시예Example 3.  3. 세포이식된Cell-implanted 동물모델의  Animal model 비장세포에서In splenocytes TregTreg 세포의 증가 및  The increase of cells and 싸이토Cyto 카인의 발현 확인Confirmation of expression of cine

Treg 세포와 Teff 세포를 이식한 경우 면역세포가 비장에서 증가하여 면역반응에 직접적으로 관련되는지를 조사하기 위하여 각 세포가 이식된 동물모델의 비장에서 Treg 세포의 분포를 조사하였고, 그 결과 Treg 세포를 이식한 경우에는 마우스의 비장에서 Treg 세포(Foxp3+CD4+)가 현저히 증가되었음을 확인하였다 (도 2).In order to investigate whether immune cells are directly related to immune responses in the case of transplantation of Treg cells and Teff cells, the distribution of Treg cells in the spleen of each animal model was examined. As a result, Treg cells Treg cells (Foxp3 + CD4 +) were significantly increased in the mouse spleen when transplanted (FIG. 2).

또한, Treg 세포와 Teff 세포를 이식한 경우 염증과 관련된 싸이토카인의 발현정도를 확인하기 위하여, IL-2, IL-6, IFN-γ, IL-17A, IL-10, IL-4 및 TNF-α의 발현량을 조사하였다. 그 결과 Teff 세포를 이식한 경우에는 3xTg-AD 마우스에 비해 IL-2 IL-6, TNF-α 발현이 증가한 반면, Treg 세포를 이식한 경우에는 IL-6, IFN-γ, IL-17A 발현이 감소하였다. 특히, Treg 세포의 주요 싸이토카인인 IL-10은 Treg 세포를 이식한 마우스에서 현저히 증가되었음을 확인하였다 (도 3). IL-10, IL-4, and TNF-α were measured in order to examine the degree of inflammation-associated cytokine expression in Treg cells and Teff cells. Were investigated. As a result, the expression of IL-2, IL-6, and TNF-α was increased in the case of Teff cell transplantation compared with that of 3xTg-AD mouse, while the expression of IL-6, IFN- Respectively. In particular, IL-10, a major cytokine of Treg cells, was found to be significantly increased in mice transplanted with Treg cells (FIG. 3).

실시예Example 4.  4. 세포이식된Cell-implanted 동물모델에서 아밀로이드 베타 플라크와  In animal models, amyloid beta plaques microglia의microglia 감소 효과 Reduction effect

Treg 세포와 Teff 세포를 이식한 3xTg-AD 마우스의 뇌 해마부위에서 아밀로이드-베타 플라크를 살펴보았고, WT와 비교할 때, Teff 세포를 이식한 마우스의 해마에서는 3xTg-AD 마우스와 비슷한 수준의 아밀로이드 베타 플라크가 형성되어 있는 반면, Treg 세포를 이식한 경우의 마우스의 해마에서는 아밀로이드 베타 플라크와 microglia가 현저히 감소되었음을 확인하였다 (도 4 및 도 5). We examined amyloid-beta plaques in the brain hippocampal region of 3xTg-AD mice transplanted with Treg cells and Teff cells. Compared with WT, the hippocampus of Teff cell transplanted mice showed similar levels of amyloid beta plaques as 3xTg- Whereas in the hippocampus of mouse when Treg cells were transplanted, amyloid beta plaques and microglia were significantly reduced (FIGS. 4 and 5).

실시예Example 5. 아밀로이드-베타 특이적  5. Amyloid-beta specific TregTreg 세포가 이식된 동물모델의 인지능력 회복 효과 Cognitive restorative effect of animal model transplanted with cells

아밀로이드-베타 특이적 Treg 세포를 알츠하이머 질환 동물 모델인 3xTg-AD 마우스에 세포이식을 한 후 모리스 수중미로(morris water maze) 실험을 통해 인지능력을 실험하였다. 모리스 수중미로 실험에서는 각 마우스모델이 4일간 훈련과정에서 hidden platform에 찾아가는데 걸리는 시간(latency), platform 위치에 머무르는 시간(Retention), platform이 있던 사분면 안에 머무르는 시간(Time in quadrant) 및 platform이 있던 위치를 지나가는 회수(Number of crossing)를 측정하였고, 그 결과 아밀로이드-베타 특이적 Treg 세포를 마우스에 이식한 동시에 bvPLA2(bee venom phospholipase A2)를 투여한 경우에는 대조군(WT, wild-type)의 수준으로 인지능력이 향상되었음을 확인하였다(도 7).Amyloid-beta-specific Treg cells were transplanted into 3xTg-AD mice, an animal model of Alzheimer's disease, and then subjected to morris water maze to test their cognitive ability. In the Morris Underwater Maze experiment, the latency of each mouse model to visit the hidden platform during 4 days of training, the retention time at the platform position, the time in quadrant in which the platform was located, The number of crossing was measured. As a result, when bvPLA2 (bee venom phospholipase A2) was administered at the same time as transplantation of amyloid-beta-specific Treg cells into the mouse, the level of WT, wild-type Cognitive ability was improved (Fig. 7).

실시예Example 6. 아밀로이드-베타 특이적  6. Amyloid-beta specific TregTreg 세포가 이식된 동물모델의  Of the animal model in which the cells were transplanted 비장세포Splenocyte 에서 헬퍼 T 세포의 증가 및 The increase in helper T cells and 싸이토카인의Cytocine 발현 확인 Confirmation of expression

아밀로이드-베타 특이적 Treg 세포를 이식한 3xTg-AD 마우스에 Treg 조절물질을 투여한 경우 헬퍼 T 세포의 분포를 조사하였고, 그 결과 아밀로이드-베타 특이적 Treg 세포를 이식하고 Treg 조절물질을 투여한 경우에는 대조군(WT)과 유사하게 CD4+ T 세포군에서 IFN-γ 및 IL-17A는 감소되었고, IL-4는 증가되었음을 확인하였다 (도 8).The distribution of helper T cells in 3xTg-AD mice transplanted with amyloid-beta-specific Treg cells was investigated. As a result, when amyloid-beta specific Treg cells were transplanted and Treg regulatory substance was administered , IL-4 and IL-17 were decreased in the CD4 + T cell group similarly to the control (WT) (Fig. 8).

또한, 아밀로이드-베타 특이적 Treg 세포를 이식한 3xTg-AD 마우스에 Treg 조절물질을 투여한 경우 염증과 관련된 싸이토카인의 발현정도를 확인하기 위하여, IL-2, IL-6, IFN-γ, IL-17A, IL-10, IL-4 및 TNF-α의 발현량을 조사하였다. 그 결과 IL-2 IL-6, IFN-γ, IL-17A 및 TNF-α 발현은 대조군(WT)와 유사한 수준으로 감소된 반면, IL-10 및 IL-4 발현은 증가되었음을 확인하였다 (도 9). In addition, IL-2, IL-6, IFN-γ, IL-6, and IL-6 were examined in order to examine the degree of inflammation-related cytokine expression in the Treg regulatory substance administered to 3xTg-AD mice transplanted with amyloid- 17A, IL-10, IL-4 and TNF-α were examined. As a result, IL-10 and IL-4 expression was increased while IL-2 IL-6, IFN-y, IL-17A and TNF-a expression was reduced to a level similar to that of the control (WT) ).

실시예Example 7. 아밀로이드-베타 특이적  7. Amyloid-beta specific TregTreg 세포가 이식된 동물모델에서 아밀로이드 베타 플라크의 감소 효과 Reduction of amyloid beta plaques in animal models transplanted with cells

아밀로이드-베타 특이적 Treg 세포를 이식한 3xTg-AD 마우스에 Treg 조절물질을 투여한 경우 마우스의 뇌 해마부위에서 아밀로이드-베타 플라크를 살펴보았고, 그 결과 아밀로이드-베타 특이적 Treg 세포를 이식하고 동시에 Treg 조절물질을 투여한 경우에는 대조군(WT)과 유사한 수준으로 아밀로이드 베타 플라크가 현저히 감소되었음을 확인하였다 (도 10).When amyloid-beta-specific Treg cells were transplanted into 3xTg-AD mice, amyloid-beta plaques were observed in the brain hippocampus of the mouse. As a result, amyloid-beta-specific Treg cells were transplanted and Treg When the control substance was administered, it was confirmed that the amyloid beta plaque was significantly reduced to a level similar to that of the control (WT) (FIG. 10).

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation of Kyunghee Unversity <120> Cell therapy composition for preventing or treating neurodegenerative disease comprising regulatory T cells as active ingredient <130> PN1604-134 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 2 <211> 134 <212> PRT <213> Apis mellifera <400> 2 Ile Ile Tyr Pro Gly Thr Leu Trp Cys Gly His Gly Asn Lys Ser Ser 1 5 10 15 Gly Pro Asn Glu Leu Gly Arg Phe Lys His Thr Asp Ala Cys Cys Arg 20 25 30 Thr His Asp Met Cys Pro Asp Val Met Ser Ala Gly Glu Ser Lys His 35 40 45 Gly Leu Thr Asn Thr Ala Ser His Thr Arg Leu Ser Cys Asp Cys Asp 50 55 60 Asp Lys Phe Tyr Asp Cys Leu Lys Asn Ser Ala Asp Thr Ile Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Phe Val Gly Lys Met Tyr Phe Asn Leu Ile Asp Thr Lys Cys Tyr 85 90 95 Lys Leu Glu His Pro Val Thr Gly Cys Gly Glu Arg Thr Glu Gly Arg 100 105 110 Cys Leu His Tyr Thr Val Asp Lys Ser Lys Pro Lys Val Tyr Gln Trp 115 120 125 Phe Asp Leu Arg Lys Tyr 130 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation of Kyunghee Unversity <120> Cell therapy composition for prevention or treating          neurodegenerative disease          ingredient <130> PN1604-134 <160> 2 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys   1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile              20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala          35 40 <210> 2 <211> 134 <212> PRT <213> Apis mellifera <400> 2 Ile Ile Tyr Pro Gly Thr Leu Trp Cys Gly His Gly Asn Lys Ser Ser   1 5 10 15 Gly Pro Asn Glu Leu Gly Arg Phe Lys His Thr Asp Ala Cys Cys Arg              20 25 30 Thr His Asp Met Cys Pro Asp Val Met Ser Ala Gly Glu Ser Lys His          35 40 45 Gly Leu Thr Asn Thr Ala Ser His Thr Arg Leu Ser Cys Asp Cys Asp      50 55 60 Asp Lys Phe Tyr Asp Cys Leu Lys Asn Ser Ala Asp Thr Ile Ser Ser  65 70 75 80 Tyr Phe Val Gly Lys Met Tyr Phe Asn Leu Ile Asp Thr Lys Cys Tyr                  85 90 95 Lys Leu Glu His Pro Thr Gly Cys Gly Glu Arg Thr Glu Gly Arg             100 105 110 Cys Leu His Tyr Thr Val Asp Lys Ser Lys Pro Lys Val Tyr Gln Trp         115 120 125 Phe Asp Leu Arg Lys Tyr     130

Claims (7)

조절 T 세포(Treg 세포)를 유효성분으로 하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.A cell therapy composition for the prevention or treatment of degenerative brain diseases comprising regulatory T cells (Treg cells) as an active ingredient. 제 1 항에 있어서,
상기 조절 T 세포(Treg 세포)는 아밀로이드 베타(Aβ) 펩타이드 및 bvPLA2(bee venom phospholipase A2)을 투여하여 유도된 아밀로이드 베타 특이적인 조절 T 세포(Treg 세포)인 것을 특징으로 하는 조성물.The method according to claim 1,
Wherein the regulatory T cells (Treg cells) are amyloid beta-specific regulatory T cells (Treg cells) induced by administration of an amyloid beta (Aβ) peptide and bvPLA2 (bee venom phospholipase A2). 제 2 항에 있어서,
상기 아밀로이드 베타(Aβ) 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.3. The method of claim 2,
Wherein the amyloid beta (Ap) peptide is comprised of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 제 2 항에 있어서,
상기 bvPLA2(bee venom phospholipase A2)는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.3. The method of claim 2,
Wherein the bvPLA2 (bee venom phospholipase A2) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 제 1 항에 있어서,
상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병, 헌팅턴병 및 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.The method according to claim 1,
Wherein said degenerative brain disease is any one selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Huntington's disease and Parkinson's disease. 제 1 항 내지 제 5 항의 조성물을 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 개인맞춤형 키트.A personalized kit for the prevention or treatment of degenerative brain diseases comprising the composition of claims 1 to 5. 제 1 항 내지 제 5 항의 조성물을 퇴행성 뇌질환 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 방법.
A method for preventing or treating a degenerative brain disease comprising administering the composition of any one of claims 1 to 5 to a subject with degenerative brain disease.
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