KR20170123767A - Method of Preparing Polygammaglutamic Acid-Chitosan Nanoparticles - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticles, and more particularly, to a method for producing the same.
면역보강제(adjuvant)는 다양한 메카니즘을 통해서 항원에 대한 특이적 면역반응을 증가시키는 화합물로서 면역증강제에 따라 다양한 면역 반응을 유도한다. 면역보강제는 항원 단독으로는 감염을 예방하기에 충분한 면역반응을 얻을 수 없을 때 사용하게 된다. 또한 면역보강제는 점막면역능 유도를 증진시기 위한 목적으로 특히 면역적으로 미숙하거나 나이가 든 사람에게서 면역반응을 증강시키는데 사용될 수 있다.An adjuvant is a compound that increases the specific immune response to an antigen through a variety of mechanisms, leading to a variety of immune responses depending on the immunostimulant. The adjuvant is used when the antigen alone can not achieve an immune response sufficient to prevent infection. The adjuvant may also be used to enhance the immune response, particularly in immunocompromised or elderly persons, for the purpose of promoting mucosal immunity induction.
면역보강제 대부분은 수많은 천연물과 많은 시행착오 속에서 발견되었는데 최초의 연구보고는 1925년 프랑스의 라몬(Ramon)이 식품에 사용되는 타피오카(tapioca)라는 카사바(Casaba) 녹말을 디프테리아 및 파상풍 톡소이드와 혼합하였을 때 항원특이성 항체생성이 효과적으로 증가된다고 발표하였다. 이후 알루미늄 복합제의 면역증강효과가 보고되었고, 면역조절제로서 마이코박테리아 사균을 포함하는 에멀젼(emulsion)형태의 효과적인 아쥬반트가 개발되었다. 이는 FCA(Freund's complete adjuvant)라 하여 매우 효과적인 면역조절제로 알려져 있으나 반응성(reactogenic)이 매우 커서 인체에 투여하는 백신에 사용하기는 적합하지 않았다. 이에 마이코박테리아가 포함되지 않은 FIA(Freund's incomplete adjuvant)가 개발되어 영국에서 허가를 받았다. 그람음성균의 엔도톡신이 면역증강효과를 가지는 것이 보고되었고, 1974년 Ellouz 등은 무라밀디펩티드(muramyl dipeptide, MDP)의 효과를 확인하였다(Ellouz F. et al., Biochem . Biophys . Res. Commun. 59:1317-25, 1974). 이후 레시틴 또는 사포닌 등도 면역성을 증강시키는 면역보조제로서의 가능성이 보고되었다.Most of the adjuvants were found in many natural products and many trial and error. The first study reported that in 1925, Ramon in France blended tapioca (tapioca), a Casaba starch, with diphtheria and tetanus toxoid , The production of antigen-specific antibodies is effectively increased. Thereafter, the immune enhancing effect of the aluminum complex was reported, and an effective adjuvant in the form of an emulsion containing mycobacterial bacteria as an immunomodulator was developed. This is known as a highly effective immunomodulator called Freund's complete adjuvant (FCA), but its reactivity is so great that it is not suitable for use in vaccines administered to humans. FIA (Freund's incomplete adjuvant), which does not contain mycobacteria, was developed and approved in the UK. The endotoxins of gram-negative bacteria have been reported to have immune enhancing effect, 1974 Ellouz et al. Confirm the effect of the unevenness mildi peptide (muramyl dipeptide, MDP) (Ellouz F. et al., B iochem. Biophys. Res. Commun. 59: 1317-25, 1974). Lecithin or saponin has also been reported as an adjuvant to enhance immunity.
현재 상용화된 대표적인 아쥬반트는 인산알루미늄. 수산화알루미늄 같은 미네랄을 이용한 알루미늄염(Alum)과 스쿠알렌을 이용한 노바티스의 MF59, GSK의 AS03과 MPL을 이용한 AS04, QS-21 등이 있다. Alum의 경우 현재 접종되고 있는 대부분의 백신에 사용 중이며, 국소 및 전신부작용을 증가시키는 경향이 있고, 장기적으로는 자기면역반응 발생과 같은 부작용에 대한 우려도 있다. MF59의 경우 항원을 광물성 오일에 유화시키는 방법으로 입자화하기 때문에, 항원전달력이 낮다는 단점이 있다. 또한, MPL의 경우 독성부작용을 줄였지만 단독으로 사용할 수 없어 Alum 및 에멀젼(emulsion) 등을 조합해서 사용해야 하는 번거로운 문제가 있다.Representative commercially available adjuvants are aluminum phosphate. Novartis MF59 using aluminum salts (Alum) and squalene using minerals such as aluminum hydroxide, AS03 of GSK and AS04 and QS-21 using MPL. Alum is currently used in most vaccines currently inoculated, tends to increase local and systemic side effects, and in the long run there is also concern about side effects such as the development of autoimmune reactions. In the case of MF59, since antigen is granulated by emulsifying in mineral oil, antigen delivery ability is low. In addition, although MPL has reduced toxic side effects, it can not be used alone, and there is a troublesome problem of using Alum and emulsion in combination.
한편, 본 발명자들은 고분자량 폴리감마글루탐산과 키토산 나노입자의 면역보강제 용도 특허(대한민국 특허등록 제1342641호)를 획득하였으며, 폴리감마글루탐산 키토산 나노입자의 아쥬반트 기능을 밝혔으며, 동물효능(Angew . Chem . Int . Ed., 52, 7684-7689 (2013)), 동물실험을 통한 백신 아쥬반트 효능을 검증하였다(Small(2011) 7:3281-3286; Ho-jin Moon et al., Veterinary Microbiology(2012) 160: 277-289).On the other hand, was present inventors have high molecular weight was obtained a poly-gamma glutamic acid and adjuvant Use of chitosan nanoparticles patent (Republic of Korea Patent No. 1342641 No.), said the adjuvant feature of the poly-gamma-glutamate chitosan nanoparticles animal efficacy (Angew. ... Chem Int Ed, 52 , 7684-7689 (2013)), tested the vaccine adjuvant effect by animal experiments (Small (2011) 7:. 3281-3286; Ho-jin Moon et al, Veterinary Microbiology ( 2012) 160: 277-289).
한편, 고농도의 폴리감마글루탐산과 키토산의 나노입자는 제조하기 어려우며, 제조되었다고 하더라도 안정성을 확보하기가 어렵다는 문제점을 해결하지 못하고 있는 실정이다. 고농도의 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자를 제작하기 위한 기존의 방법은 저농도의 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자를 제조하고, 이 나노입자를 원심분리로 농축하여 농도를 높였다. 그러나 원심분리 농축과정에서 손실과 응집 위험성이 있는 문제점이 있다.On the other hand, it is difficult to produce nanoparticles of high concentration of polygamma glutamic acid and chitosan, and it is difficult to solve the problem that it is difficult to secure stability even if it is manufactured. Conventional methods for producing polygamma-glutamic acid-chitosan nanoparticles at a high concentration produced polygamma-glutamic acid-chitosan nanoparticles at a low concentration and concentrated the nanoparticles by centrifugation. However, there is a risk of loss and flocculation in the centrifugal concentration process.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점을 개선하고자 예의 노력한 결과, 폴리감마글루탐산 용액과 키토산 용액을 혼합하고, 농축 및 건조시키는 간단한 공정에 의하여 폴리감마글루탐산과 키토산을 이온결합시킨 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자의 안정성이 증진되고, 고농도로 제조할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have made intensive efforts to improve the problems of the prior art. As a result, they have found that polygamma-glutamate-chitosan-chitosan, which is obtained by ion-linking polygamma glutamic acid and chitosan by a simple process of mixing a polygamma glutamic acid solution and a chitosan solution, The stability of the nanoparticles was improved, and it was confirmed that the nanoparticles could be produced at a high concentration, and the present invention was completed.
본 발명의 목적은 고농도의 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.It is an object of the present invention to provide a method for producing polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticles at a high concentration.
본 발명의 다른 목적은 안정성이 확보된 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자의 제조방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for producing polygamma-glutamic acid-chitosan nanoparticles having stability.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 폴리감마글루탐산 용액과 키토산 용액을 혼합하여 폴리감마글루탐산-키토산 용액을 수득하는 단계; (b) 상기 폴리감마글루탐산-키토산 용액을 농축하여 폴리감마글루탐산-키토산 농축물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 폴리감마글루탐산-키토산 농축물을 건조하는 단계를 포함하는 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자의 제조방법을 제공한다.In order to attain the above object, the present invention provides a method for producing a polygamma glutamic acid-chitosan solution, comprising: (a) mixing a polygamma glutamic acid solution and a chitosan solution to obtain a polygamma glutamic acid-chitosan solution; (b) concentrating the polygamma glutamic acid-chitosan solution to obtain a polygamma glutamic acid-chitosan concentrate; And (c) drying the polygamma-glutamic acid-chitosan concentrate. The present invention also provides a method for producing polygamma-glutamic acid-chitosan nanoparticles.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자를 제공한다.The present invention also provides polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticles prepared by the above method.
또한, 본 발명은 상기 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자를 포함하는 면역보강제 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for immunoconjugation comprising the polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticles.
또한, 본 발명은 상기 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자와 항원을 포함하는 백신용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a vaccine composition comprising the polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticle and an antigen.
본 발명에 의하면, 고농도의 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자와 항원과 혼합하였을 때 백신의 투여량을 줄일 수 있으며, 건조 분말 공정을 통해 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자의 안정성을 높임으로써 유통을 간편화하고 보존기간을 증대시킬 수 있다.According to the present invention, it is possible to reduce the dosage of the vaccine when it is mixed with the polygamma-glutamic acid-chitosan nanoparticles at a high concentration and the antigen, and the stability of the polygamma-glutamic acid-chitosan nanoparticles is increased through the dry powder process, The storage period can be increased.
도 1은 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자의 농축 전(a)과 농축 후(b)의 성상을 나타낸 사진이다.
도 2는 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자의 건조분말 성상이다.
도 3은 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자의 주사전자현미경 사진이다.
도 4는 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자의 크기분포 및 Zeta 전위(DLS 측정)를 도시한 그래프이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a photograph showing the characteristics before (a) and after (b) concentration of polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticles. FIG.
2 is a dried powder form of polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticles.
3 is a scanning electron micrograph of polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticles.
4 is a graph showing the size distribution and Zeta potential (DLS measurement) of polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticles.
본 발명에서는 기존 원심분리 농축 공정으로 인한 문제점을 해결하여 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자의 손실량을 줄이고 응집의 위험성을 감소시키기 위한 방법으로서, 폴리감마글루탐산 용액과 키토산 용액을 혼합하고, 농축 및 건조시키는 간단한 공정에 의하여 폴리감마글루탐산과 키토산을 이온결합시킨 고농도의 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자를 제조하였다.In the present invention, a method for reducing the loss of polygamma-glutamic acid-chitosan nanoparticles and reducing the risk of aggregation by solving the problems caused by the conventional centrifugal concentration process is proposed. The polygamma glutamic acid solution and the chitosan solution are mixed, concentrated and dried A high concentration of polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticles was prepared by ion-binding polygamma glutamic acid and chitosan by a simple process.
그 결과 나노입자 농축액을 고농도로 농축할 수 있어 건조비용을 절감할 수 있으며, 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자를 동결건조하여 분말로 보존시 장기보존이 가능하고 냉장보존이 불필요하여 비용을 절감할 수 있고, 나노입자와 항원과 혼합하였을 때 백신의 투여량을 줄일 수 있으며, 안정성 또한 증진된 것을 확인하였다.As a result, it is possible to concentrate the concentrate of nanoparticles at a high concentration to reduce the drying cost, and it is possible to preserve the polygamma-glutamic acid-chitosan nanoparticles by freeze-drying to preserve them in powder form, , And it was confirmed that when mixed with nanoparticles and antigens, the dose of vaccine can be reduced and stability is improved.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 폴리감마글루탐산 용액과 키토산 용액을 혼합하여 폴리감마글루탐산-키토산 용액을 수득하는 단계; (b) 상기 폴리감마글루탐산-키토산 용액을 농축하여 폴리감마글루탐산-키토산 농축물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 폴리감마글루탐산-키토산 농축물을 건조하는 단계를 포함하는 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자의 제조방법에 관한 것이다.Accordingly, in one aspect, the present invention provides a method for preparing a polygamma glutamic acid-chitosan solution, comprising: (a) mixing a solution of a polygamma glutamic acid and a chitosan solution to obtain a solution of polygamma glutamic acid-chitosan; (b) concentrating the polygamma glutamic acid-chitosan solution to obtain a polygamma glutamic acid-chitosan concentrate; And (c) drying the polygamma-glutamic acid-chitosan concentrate. The present invention also relates to a method for preparing polygamma-glutamic acid-chitosan nanoparticles.
이하, 본 발명에 의한 제조방법을 각 단계를 상세하게 설명한다.Hereinafter, each step of the manufacturing method according to the present invention will be described in detail.
(a) (a) 폴리감마글루탐산Polygamma glutamic acid -키토산 용액의 Of chitosan solution 수득단계Step of obtaining
본 발명에 있어서, 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자는 폴리감마글루탐산의 카르복실기와 키토산의 아미노기가 이온결합하여 형성될 수 있다. 폴리감마글루탐산 용액과 키토산 용액을 혼합하여 폴리감마글루탐산-키토산 용액을 수득할 수 있다. 폴리감마글루탐산 용액과 키토산 용액의 몰비는 1:1~2, 바람직하게는 1:1.5 ~2, 더욱 바람직하게는 1:1.9~2일 수 있다. 폴리감마글루탐산 용애과 키토산 용액의 몰비가 1:1 미만일 경우 나노입자가 생성되지 않으며, 1:2을 초과할 경우 응집현상이 발생하는 문제점이 있다.In the present invention, the poly (gamma glutamic acid-chitosan nanoparticles) can be formed by ion-binding the carboxyl group of poly (gamma glutamic acid) and the amino group of chitosan. A polygamma glutamic acid-chitosan solution can be obtained by mixing a polygamma glutamic acid solution and a chitosan solution. The molar ratio of the poly (gamma) glutamic acid solution to the chitosan solution may be 1: 1 to 2, preferably 1: 1.5 to 2, more preferably 1: 1.9 to 2. When the molar ratio of polygamaric acid to chitosan solution is less than 1: 1, nanoparticles are not produced. When the molar ratio exceeds 1: 2, coagulation phenomenon occurs.
상기 본 발명에 따른 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자 제조에 사용된 폴리감마글루탐산은 1~15,000kDa일 수 있다. 본 발명에 따른 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자 제조에 사용된 키토산은 1~50kDa일 수 있다.The polygamma glutamic acid used in the preparation of the polygamma-glutamic acid-chitosan nanoparticles according to the present invention may be 1 to 15,000 kDa. The chitosan used in the preparation of the polygamma-glutamic acid-chitosan nanoparticles according to the present invention may be 1 to 50 kDa.
본 발명에 따른 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자 제조에 사용되는 상기 폴리감마글루탐산의 분자량은 바람직하게 1~15,000kDa로, 폴리감마글루탐산의 분자량이 1kDa 미만인 경우, 면역증강 기능이 낮아지는 문제점이 발생되고, 폴리감마글루탐산의 분자량이 15,000kDa 초과한 경우에는 효능에는 차이가 없으나 점도가 증가되어 문제점이 발생될 수 있다.The molecular weight of the poly-gamma-glutamic acid used in the preparation of the poly-gamma-glutamic acid-chitosan nanoparticles according to the present invention is preferably 1 to 15,000 kDa, and when the molecular weight of poly-gamma glutamic acid is less than 1 kDa, , And when the molecular weight of poly (gamma glutamic acid) exceeds 15,000 kDa, there is no difference in efficacy but the viscosity may increase, which may cause problems.
본 발명에 있어서, 키토산의 분자량은 바람직하게 1~50kDa로, 키토산의 분자량이 1kDa 미만인 경우, 나노입자 제조가 어려운 문제점이 발생되고, 키토산의 분자량이 50kDa 초과인 경우에는 중성 수용액 상태에서 용해도가 떨어지는 단점이 발생할 수 있다.In the present invention, the molecular weight of chitosan is preferably 1 to 50 kDa. When the molecular weight of the chitosan is less than 1 kDa, the nanoparticles are difficult to produce. When the molecular weight of the chitosan is more than 50 kDa, Disadvantages may arise.
본 발명에서 상기 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자는 폴리감마글루탐산의 여분의 카르복실(carboxyl) 반응기의 음전하와 키토산의 아미노(amino) 반응기가 프로톤화 되면서 생긴 양전하 간의 정전기적 인력(electrostatic interaction)에 의해 나노입자를 형성할 수 있다. In the present invention, the poly (gamma glutamic acid-chitosan nanoparticles) are formed by electrostatic interaction between positive charges of an extra carboxyl group of poly (gamma glutamic acid) and positive charges formed by protonation of an amino group reactant of chitosan Nanoparticles can be formed.
본 발명에 따른 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자는 인체에 유해한 단백질 간의 가교물질 없이 단순한 정전기적 인력으로 제조되어 나노입자 안전성 및 유효성이 매우 높아 면역보강제로 사용하기에 적합하다.The polygamma-glutamate-chitosan nanoparticles according to the present invention are manufactured by simple electrostatic attraction without cross-linking substances between proteins harmful to human body, and are highly safe and effective in nanoparticles, and thus are suitable for use as adjuvants.
폴리감마글루탐산은 D-, L-글루탐산(D-, L-glutamic acid)이 감마 결합을 통하여 연결된 점액성의 아미노산 고분자이며 바실러스 속 균주로부터 만들어지는 천연 아미노산 고분자 소재로, 본 발명의 일 양태에서, 상기 폴리감마글루탐산은 바실러스 서브틸리스 청국장 균주(Bacillus substilis chungkookjang, KCTC 0697BP)를 발효시켜 제조하였으며, 상기 바실러스 서브틸리스 청국장(Bacillus subtilis chungkookjang, KCTC 0697BP)에 의해 생산된 폴리감마글루탐산의 평균 분자량은 1~15,000kDa이다.BACKGROUND ART Polymygous glutamic acid is a mucilage amino acid polymer having D-, L-glutamic acid (D-, L-glutamic acid) linked through gamma binding, and is a natural amino acid polymer material produced from a strain of Bacillus. In one embodiment of the present invention, Polygamma glutamic acid was prepared by fermenting Bacillus subtilis chungkookjang (KCTC 0697BP), and the average molecular weight of poly (gamma glutamic acid) produced by Bacillus subtilis chungkookjang (KCTC 0697BP) was 1 To 15,000 kDa.
본 발명에 있어서, 상기 폴리감마글루탐산은 용도에 따라 필요한 경우, 생산된 폴리감마글루탐산을 적절한 방법으로 절단하여 일정한 분자량으로 제조하여 사용하거나, 적절한 방법으로 분리하여 일정한 분자량 별로 회수하여 사용할 수 있다.In the present invention, the polygamma glutamic acid may be prepared by cutting the produced poly (gamma glutamic acid) by a suitable method to produce a certain molecular weight, if necessary, depending on the use, or may be separated and recovered according to a predetermined molecular weight.
(b) (b) 폴리감마글루탐산Polygamma glutamic acid -키토산 - Chitosan 농축물Concentrate 수득단계Step of obtaining
상기 (a) 단계에서 수득한 폴리감마글루탐산-키토산 용액을 농축하여 폴리감마글루탐산-키토산 농축물을 수득할 수 있다.The polygamma glutamic acid-chitosan solution obtained in the step (a) may be concentrated to obtain a polygamma glutamic acid-chitosan concentrate.
상기 (b) 단계는 한외여과법(ultra filtration)을 수행할 수 있으며, (b) 단계 이후에 부형제를 혼합하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. The step (b) may be performed by ultrafiltration, and the step (b) may further include mixing the excipient.
(c) (c) 폴리감마글루탐산Polygamma glutamic acid -키토산 - Chitosan 농축물의Concentrate 건조단계 Drying step
상기 (b) 단계에서 수득한 폴리감마글루탐산-키토산 농축물을 건조할 수 있다. 상기 (c) 단계는 동결건조를 수행할 수 있다. 농축 후의 농도는 0.1~10중량%, 일 수 있다.The polygamma glutamic acid-chitosan concentrate obtained in the step (b) may be dried. The step (c) may be performed by lyophilization. The concentration after concentration may be 0.1 to 10% by weight.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법에 의해 제조된 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자에 관한 것이다. 상기 나노입자는 150~250nm의 입자 크기 및 -30~-50mV의 표면전하, 바람직하게는 150~200nm 입자 크기 및 -30 ~ -50mV를 가질 수 있다. 상기 범위의 표면전하일 때, 나노입자의 분산성이 높아질 수 있다.In another aspect, the present invention relates to polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticles prepared by the above method. The nanoparticles may have a particle size of 150 to 250 nm and a surface charge of -30 to -50 mV, preferably 150 to 200 nm and a particle size of -30 to -50 mV. When the surface charge is in the above range, the dispersibility of the nanoparticles may be increased.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자를 포함하는 면역보강제 조성물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to an adjuvant composition comprising the polygamma-glutamic acid-chitosan nanoparticles.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자와 항원을 포함하는 백신용 조성물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a composition for vaccine containing the polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticle and an antigen.
본 발명에 따른 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자를 함유하는 면역보강제는 바실러스 서브틸리스 청국장이 발효생산하는 바이오폴리머인 폴리감마글루탐산 및 키토산을 이용하여 화학적 결합이 아닌 단순 이온 결합에 의해 제조되어 안전성 및 생체적합성, 항체생성률이 우수한 특징을 가지는 면역보강제 소재이다.The immunoconjugate containing polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticles according to the present invention is prepared by simple ionic bonding rather than chemical bonding using polygamma glutamic acid and chitosan, which are biopolymers fermented and produced by Bacillus subtilis Chungkookjang, Biocompatibility, and antibody production rate.
본 발명에 있어서, 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자의 제조에 있어 폴리감마글루탐산의 비율을 높여 제조되는 나노입자의 표면전하가 음전하를 가지는 나노입자를 제조할 수 있다.In the present invention, in the production of polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticles, the ratio of polygamma glutamic acid can be increased to produce nanoparticles having a negative charge on the surface of the nanoparticles.
본 발명에 있어서, 상기 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자의 표면전하는 음전하인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the surface charge of the poly (gamma glutamic acid-chitosan nanoparticles) may be characterized by a negative charge.
본 발명에 따른 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자는 화학적 방법이 아닌 단순 이온 반응에 의해 제조되는 나노입자로써 독성 및 안전성 또한 우수하다. The polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticles according to the present invention are nanoparticles prepared by a simple ion reaction, not a chemical method, and are also excellent in toxicity and safety.
본 발명에 따른 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자를 함유하는 면역보강제 조성물에 있어서, 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자는 백신 조성물 건조중량 100중량부에 대하여, 건조중량 0.001~5중량부로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 건조중량 0.01~3중량부로 함유할 수 있다. 만약, 백신 조성물 건조중량 100중량부에 대하여, 건조 중량 0.001중량부 미만으로 함유시킬 경우 항체생상 기능을 기대할 수 없고, 건조 중량 5중량부를 초과 시에는 작용에는 차이가 없으며, 점성이 과도하게 증가할 수 있는 문제가 발생된다.In the immunoconjugator composition containing the polygamma-glutamic acid-chitosan nanoparticles according to the present invention, the polygamma-glutamic acid-chitosan nanoparticles are contained in a dry weight of 0.001 to 5 parts by weight based on 100 parts by weight of the vaccine composition , And preferably 0.01 to 3 parts by weight of dry weight. If the dry weight of the vaccine composition is less than 0.001 part by weight based on 100 parts by weight of the dry weight of the vaccine composition, the antibody function is not expected. If the dry weight exceeds 5 parts by weight, there is no difference in the action and the viscosity is excessively increased There is a problem that can occur.
본 발명에 있어서, 백신용 조성물에 포함되는 항원은 단백질, 펩타이드, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 바이러스, 항바이러스제, 항종양제, 항생물질 및 항염증제로부터 선택된 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the antigen contained in the vaccine composition may be selected from proteins, peptides, nucleosides, nucleotides, viruses, antiviral agents, antitumor agents, antibiotics and anti-inflammatory agents.
본 발명에 있어서, 상기 백신용 조성물은 조류 인플루엔자 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스 및 신종 인플루엔자 바이러스로 선택된 군에서 어느 하나 이상의 바이러스에 의한 질병의 예방용 또는 치료용인 것을 특징으로 할 수 있고, 자궁경부암, 피부흑색종암, 전립선암, 결장암, 폐암, 유방암, 난소암, 두경부암, 외음부암, 방광암, 뇌암 및 신경교종으로 선택된 군에서 어느 하나 이상의 질병의 예방용 또는 치료용인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the vaccine composition may be used for the prevention or treatment of diseases caused by any one or more viruses selected from the group consisting of avian influenza virus, swine influenza virus and swine influenza virus. The vaccine composition may be cervical cancer, The present invention can be used for the prevention or treatment of any one or more diseases selected from the group consisting of stomach cancer, prostate cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, head and neck cancer, vulvar cancer, bladder cancer, brain cancer and glioma.
본 발명은 인간을 제외한 동물에 상기 면역보강제 조성물을 항원과 함께 투여하거나, 상기 백신용 조성물을 투여하여 항원에 대한 항체 생성률을 증가시키는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for increasing the antibody production rate to an antigen by administering the immunoconjunctive composition with an antigen to an animal other than a human, or administering the vaccine composition.
본 발명에 있어서, 상기 투여는 피하주사, 근육내 주사, 피하내 주사, 복막내 주사, 비강투여, 구강투여, 경피투여 및 경구투여로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the administration is carried out by any one method selected from the group consisting of subcutaneous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, nasal administration, oral administration, transdermal administration and oral administration .
본 발명에 있어 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자를 포함하는 면역보강제 조성물 또는 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.In the present invention, carriers, excipients and diluents that may be contained in the adjuvant composition or the vaccine composition containing the polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticles include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, maltitol, starch But are not limited to, glycerin, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium Stearate and mineral oil. In the case of formulation, it may be prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants and the like which are usually used. Formulations for non-oral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous agents, suspensions, emulsions, and freeze-drying agents. As the non-aqueous preparation and suspension, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
본 발명의 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자 함유 면역보강제는 투여대상의 나이, 성별, 체중 등에 따라 투여량이 달라질 수 있고, 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서도 백신의 투여량이 증감될 수 있다.The dose of the adjuvant containing polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticles according to the present invention may vary depending on the age, sex, body weight, etc. of the subject to be administered, and the dose of the vaccine may be increased or decreased depending on the administration route, degree of disease, sex, .
또한 본 발명의 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자는 암, 특히 피부흑색종암, 전립선암, 결장암, 폐암, 유방암, 난소암, 두경부암, 외음부암, 방광암, 뇌암 및 신경교종 등 뿐만 아니라 비전염성 만성 질병을 예방하고 치료하는 데에 사용되는 예방용 혹은 치료용 백신을 포함하는 의약 조성물에 첨가하여 사용될 수 있다.The polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticles of the present invention can be used for the treatment and prophylaxis of cancer, in particular, skin cancer, prostate cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, head and neck cancer, vulvar cancer, To a pharmaceutical composition comprising a prophylactic or therapeutic vaccine for use in the prevention and treatment of < RTI ID = 0.0 > HCV < / RTI >
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.
[실시예][Example]
제조예Manufacturing example 1-1: 1-1: 폴리감마글루탐산Polygamma glutamic acid 용액 및 키토산 용액의 제조 Preparation of solution and chitosan solution
폴리감마글루탐산은 산 타입(acid type) 분말을 사용하였다. 3차 증류수에 폴리감마글루탐산을 혼합 후, KOH를 이용하여 용해한 후 0.22um 필터로 여과하였다. 키토산은 Amicogen사의 키토산 분말을 사용하였으며, 3차 증류수에 키토산 분말 용해한 후, 0.22um 필터로 여과하였다.Polygamma glutamic acid was an acid type powder. Polygamma glutamic acid was mixed with the third distilled water, dissolved with KOH, and filtered through a 0.22-μm filter. Chitosan powder from Amicogen Co. was used, and chitosan powder was dissolved in the third distilled water and filtered with 0.22um filter.
제조예Manufacturing example 1-2: 1-2: 폴리감마글루탐산Polygamma glutamic acid -키토산 나노입자의 제조- Preparation of chitosan nanoparticles
폴리감마글루탐산과 키토산을 이용하여 면역보강제로 사용할 나노입자를 제조하였다. 폴리감마글루탐산 용액과 키토산 용액의 혼합비를 1:2의 몰비율로 키토산 용액에 폴리감마글루탐산 용액을 혼합하여 표면전하가 음전하를 가지는 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자를 제조하였다. 제조된 나노입자는 DLS를 이용하여 입도 크기 및 표면전하를 측정하였다. 그 결과 150~200nm 크기, -30 ~ -50mV로 측정되었다(도 4의 빨간선).Nanoparticles to be used as adjuvant were prepared by using poly (gamma glutamic acid) and chitosan. Polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticles were prepared by mixing a solution of polygamma glutamic acid and a chitosan solution in a chitosan solution at a molar ratio of 1: 2 by mixing a polygamma glutamic acid solution. The particle size and surface charge of the prepared nanoparticles were measured using DLS. As a result, a size of 150 to 200 nm was measured at -30 to -50 mV (red line in FIG. 4).
제조예Manufacturing example 1-3: 1-3: 폴리감마글루탐산Polygamma glutamic acid -키토산 나노입자의 농축- Concentration of chitosan nanoparticles
제조된 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자 용액을 Ultra filtration 공법으로 농축을 실시하였다. U/F filter는 500 kDa 크기의 필터를 사용하였고, 40mg/ml의 농도로 농축을 하였다. 농축한 나노입자는 DLS를 이용하여 입도 크기 및 표면전하를 측정하였다. 그 결과 150 - 200 nm 크기, 표면전하는 -30 ~ -50mV로 측정되었다. 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자의 농축 전(a)과 농축 후(b)의 성상을 도 1에 나타내었다. 농축 전(a)에는 0.12중량%이고, 농축 후(b)에는 4중량%의 농도를 나타내었다((도 4의 초록선).The prepared poly (gamma glutamic acid-chitosan nanoparticle solution) was concentrated by an ultrafiltration method. The U / F filter used a 500 kDa filter and was concentrated at a concentration of 40 mg / ml. The size and surface charge of the concentrated nanoparticles were measured using DLS. As a result, the surface charge was measured at a size of 150 - 200 nm and a surface charge of -30 to -50 mV. Fig. 1 shows the characteristics of (a) before and after (b) concentration of poly (gamma glutamic acid-chitosan nanoparticles). The concentration was 0.12 wt% in the case of (a) and 4 wt% in (b) after concentration (green line in Fig. 4).
제조예Manufacturing example 1-4: 1-4: 폴리감마글루탐산Polygamma glutamic acid -키토산 나노입자의 동결건조- Lyophilization of chitosan nanoparticles
40mg/ml의 농도로 농축된 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자 용액에 트레할로오스(trehalose)를 부형제로 혼합하여 동결건조하였다. 트레할로오스의 최적의 농도는 150mg/ml이였으며, 동결건조한 나노입자는 DLS를 이용하여 입도 크기 및 표면전하를 측정하였다. 그 결과 200~250nm 크기, 표면전하는 -30 ~ -50mV로 측정되었다(도 4의 파란선). 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자의 건조분말 성상을 도 2에 나타내었다. 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자의 주사전자현미경 사진을 도 3에 나타내었다.Trehalose was mixed with an excipient into a solution of concentrated polygamma-glutamic acid-chitosan nanoparticles at a concentration of 40 mg / ml and lyophilized. The optimal concentration of trehalose was 150mg / ml. The freeze - dried nanoparticles were measured for particle size and surface charge using DLS. As a result, the surface charge was measured at a size of 200 to 250 nm and a surface charge of -30 to -50 mV (blue line in FIG. 4). The dried powder form of poly (gamma glutamic acid-chitosan nanoparticles) is shown in Fig. A scanning electron micrograph of polygamma-glutamic acid-chitosan nanoparticles is shown in Fig.
폴리감마글루탐산-키토산 나노입자의 크기분포 및 Zeta 전위(DLS 3반복 측정)를 도 4에 도시하였다.The size distribution of the poly-gamma-glutamic acid-chitosan nanoparticles and the Zeta potential (DLS 3 repeat measurement) are shown in FIG.
실시예Example 1: One: 폴리감마글루탐산Polygamma glutamic acid -키토산 나노입자의 안정성- Stability of chitosan nanoparticles
폴리감마글루탐산-키토산 나노입자 건조분말의 안정성을 확인하기 위하여 동결건조 분말을 4와 25에서 보관 시험을 진행하였으며, 2개월까지 안정적으로 유지하고 있는 것을 확인하였다.In order to confirm the stability of the dry powder of poly (gamma glutamic acid) - chitosan nanoparticles, the lyophilized powder was stored at 4 and 25, and it was confirmed that it was stably maintained for up to 2 months.
Suspension
Suspension
Suspension
Suspension
Suspension
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.
Claims (8)
(a) 폴리감마글루탐산 용액과 키토산 용액을 혼합하여 폴리감마글루탐산-키토산 용액을 수득하는 단계;
(b) 상기 폴리감마글루탐산-키토산 용액을 농축하여 폴리감마글루탐산-키토산 농축물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 폴리감마글루탐산-키토산 농축물을 건조하는 단계.
A method for producing poly (gamma glutamic acid-chitosan nanoparticles) comprising the steps of:
(a) mixing a polygamma glutamic acid solution and a chitosan solution to obtain a polygamma glutamic acid-chitosan solution;
(b) concentrating the polygamma glutamic acid-chitosan solution to obtain a polygamma glutamic acid-chitosan concentrate; And
(c) drying the polygamma glutamic acid-chitosan concentrate.
The method according to claim 1, wherein the molar ratio of the polygamma glutamic acid solution to the chitosan solution in step (a) is 1: 1 to 2.
The method of claim 1, wherein the step (b) is performed by ultrafiltration.
The method according to claim 1, further comprising the step of mixing the excipient after step (b) with the polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticles.
The method according to claim 1, wherein the step (c) is performed by lyophilization.
A polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticle prepared by the method of claim 1.
A composition for enhancing immunity comprising the polygamma-glutamic acid-chitosan nanoparticles of claim 5.
A composition for vaccine delivery comprising the polygamma glutamic acid-chitosan nanoparticles of claim 5 and an antigen.
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