KR20170118633A - Monoclonal Antibodies Specific to Claudin 3 and 4, and The Use Thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 예방 또는 치료에 이용될 수 있는 클라우딘(Caludin) 3 및 4에 대한 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 암 세포(특히, 난소암 세포)에서 과발현되는 클라우딘 3 및 4에 특이적으로 결합하는 항체로서, 기존의 클라우딘 3 또는 4 타겟 항체들의 CDR 서열과 비교하여 상동성이 매우 낮아, 그 서열의 독특함이 있다. 본 발명의 항체는 암세포를 살상시켜 암(특히, 난소암)의 예방 또는 치료에 매우 유효하다. The present invention relates to antibodies against caludins 3 and 4 that can be used for the prevention or treatment of cancer. The antibody of the present invention is an antibody that specifically binds to cladins 3 and 4 overexpressed in cancer cells (particularly ovarian cancer cells) and has extremely low homology to CDR sequences of existing Claudin 3 or 4 target antibodies, There is the uniqueness of that sequence. The antibody of the present invention is very effective for preventing or treating cancer (particularly ovarian cancer) by killing cancer cells.

Description

클라우딘 3 및 4에 대한 단일클론항체 및 그의 용도{Monoclonal Antibodies Specific to Claudin 3 and 4, and The Use Thereof}Monoclonal Antibodies Specific to Claudin 3 and 4, and The Use Thereof}

본 발명은 인간 클라우딘 3 또는 4에 대해 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체 및 그의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to human monoclonal antibodies that specifically bind to human claudin 3 or 4 and uses thereof.

클라우딘(claudin)은 세포 간 밀착연접(tight junction)의 주요 필수 막단백질로서 포유류의 경우 24개의 패밀리가 있으며, 사람의 경우 포유류에서 클라우딘 13을 제외한 클라우딘 패밀리를 가지고 있다. 클라우딘 패밀리는 세포벽을 투과하여 박혀 있는 형태의 유사한 구조를 가지며, 대부분 두 개의 세포 외 루프(extracellular loop)를 가지고 있는 구조를 가지고 있다.Claudin is a major and essential membrane protein for tight junctions between cells, and there are 24 families in mammals, and in humans, claudin family except claudin 13 in mammals. The claudin family has a similar structure that penetrates the cell wall and is embedded in it, and most have a structure with two extracellular loops.

클라우딘은 세포 간 분자들의 흐름을 제어하는 역할을 하는 것으로 알려져 있으나, 최근 다양한 연구들을 통하여 결장암, 위암, 유방암, 식도암 및 난소암 등 암의 발생과도 밀접한 관련성이 있다는 연구가 보고되고 있다. 특히, 뚜렷한 증상이 없고 수술과 화학적 요법 이외에는 적절한 치료 방법이 없어 예후가 나쁜 것으로 알려져 있는 난소암에서 클라우딘 패밀리 중 클라우딘 3와 클라우딘 4가 과발현된다는 것이 보고되었다(Claudin Proteins in Human Cancer: Promising New Targets for Diagnosis and Therapy, P.J. Morin, Cancer Res. 65: 9604-9006 (2005)).Claudin is known to play a role in controlling the flow of molecules between cells, but recent studies have reported that it is closely related to the occurrence of cancers such as colon cancer, gastric cancer, breast cancer, esophageal cancer, and ovarian cancer. In particular, it has been reported that claudin 3 and claudin 4 of the claudin family are overexpressed in ovarian cancer, which is known to have a poor prognosis because there is no obvious symptom and there is no appropriate treatment method other than surgery and chemotherapy (Claudin Proteins in Human Cancer: Promising New Targets for Diagnosis and Therapy, PJ Morin, Cancer Res. 65: 9604-9006 (2005)).

또한 84명의 난소 장액성 선암(ovarian serous adenocarcinoma) 환자의 생존율과 클라우딘 3의 발현율을 Kaplan-Meier 기법의 생존커브로 확인한 결과, 클라우딘 3의 발현율이 환자의 수명 단축과 밀접한 관계가 있다는 연구가 보고되었다(Expression profile of tight junction protein claudin 3 and claudin 4 in ovarian serous adenocarcinoma with prognostic, Choi et al., Histol. Histopathol. 22:1185~1195(2005)).In addition, as a result of confirming the survival rate of 84 patients with ovarian serous adenocarcinoma and the expression rate of claudin 3 by the survival curve of the Kaplan-Meier technique, a study was reported that the expression rate of claudin 3 was closely related to the shortening of the patient's lifespan. (Expression profile of tight junction protein claudin 3 and claudin 4 in ovarian serous adenocarcinoma with prognostic, Choi et al., Histol. Histopathol. 22:1185~1195 (2005)).

이와 같이 암 조직에서 특이성이 높은 클라우딘 발현의 증감여부는 암 생성에 대한 예측지시인자로 사용될 수 있으며, 또한 암의 진단과 치료에 있어 클라우딘이 유용한 바이오마커가 되어 다양한 그룹에서 클라우딘을 타겟으로 하는 치료제 개발을 시도 중에 있다. 특히, 미국, 일본 등에서 난소암에서 과발현하는 것으로 알려져 있는 클라우딘 3 및 4를 타겟으로 하는 치료용 항체에 대한 개발을 진행하고 있으며, 클라우딘 3과 4를 동시에 타겟으로 하는 단일클론 항체가 보고되기도 하였다 (Characterization and Evaluation of the Antitumour Activity of a Dual-targeting Monoclonal Antibody against Claudin-3 and Claudin-4. Mariko Kato-Nakano et al., Anticancer Research 30: 4555-4562 (2010)). 이에 본 발명자들은 기존에 본 발명자들이 개발한 클라우딘 3와 4의 항원을 기반으로 클라우딘 3과 4를 동시에 타켓팅하여 난소암 등의 암 치료에 효과를 나타낼 수 있는 치료용 항체를 개발하고자 하였다.As described above, the increase or decrease of the expression of claudin with high specificity in cancer tissues can be used as a predictive indicator for cancer production, and as claudin becomes a useful biomarker in the diagnosis and treatment of cancer, a therapeutic agent targeting claudin in various groups. Trying to develop. In particular, development of therapeutic antibodies targeting claudin 3 and 4, which are known to be overexpressed in ovarian cancer in the United States and Japan, are in progress, and monoclonal antibodies targeting claudin 3 and 4 at the same time have been reported ( Characterization and Evaluation of the Antitumour Activity of a Dual-targeting Monoclonal Antibody against Claudin-3 and Claudin-4.Mariko Kato-Nakano et al., Anticancer Research 30: 4555-4562 (2010)). Accordingly, the present inventors tried to develop a therapeutic antibody capable of showing an effect in the treatment of cancer such as ovarian cancer by simultaneously targeting claudin 3 and 4 based on the antigens of claudin 3 and 4 previously developed by the present inventors.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Throughout this specification, a number of papers and patent documents are referenced and citations are indicated. The disclosure contents of the cited papers and patent documents are incorporated by reference in this specification as a whole, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly described.

본 발명자들은 인간 클라우딘 3 및 4에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 인간 클라우딘 3 및 4에 대한 우수한 결합 능력을 나타내면서도, 암(특히, 난소암)을 현저하게 개선된 효능으로 예방 또는 치료할 수 있는 신규한 항체를 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have tried to develop antibodies that specifically bind to human claudin 3 and 4. As a result, the present inventors completed the present invention by developing a novel antibody capable of preventing or treating cancer (especially ovarian cancer) with remarkably improved efficacy while showing excellent binding ability to human claudin 3 and 4 Was done.

본 발명의 목적은 인간 클라우딘 3 또는 4에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.An object of the present invention is to provide an antibody against human claudin 3 or 4 or an antigen-binding fragment thereof.

본 발명의 다른 목적은 상기 인간 클라우딘 3 또는 4에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising an antibody against human claudin 3 or 4 or an antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 클라우딘(Claudin) 3 및 4에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosis of cancer comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof against Claudin 3 and 4.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent by the following detailed description, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 다음 일반식 1로 표시되는 CDR(complementarity determining region)L1, 다음 일반식 2로 표시되는 CDRL2 및 다음 일반식 3으로 표시되는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 (b) 다음 일반식 4로 표시되는 CDRH1, 다음 일반식 5로 표시되는 CDRH2 및 서열목록 제85서열 내지 제96서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 클라우딘(Claudin) 3 및 4에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편:According to one aspect of the present invention, the present invention provides a light chain comprising (a) a complementarity determining region (CDR) L1 represented by the following general formula 1, CDRL2 represented by the following general formula 2, and a CDRL3 represented by the following general formula 3 Variable region; And (b) CDRH1 represented by the following general formula 4, CDRH2 represented by the following general formula 5, and a heavy chain comprising a CDRH3 comprising any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 85 to 96 Antibodies or antigen-binding fragments thereof against Claudin 3 and 4 comprising a variable region:

일반식 1 General Formula 1

X1-Gly-Ser-Ser-Ser-Asn-Ile-Gly-X2-Asn-X3-Val-X4 X 1 -Gly-Ser-Ser-Ser-Asn-Ile-Gly-X 2 -Asn-X 3 -Val-X 4

상기 일반식에서, X1은 Ser 또는 Thr이고, X2는 Ser 또는 Asn이고, X3는 Ala, Tyr, Ser, Asn 또는 Asp이며, 그리고 X4는 Thr, Ser, Tyr 또는 Asn임.In the general formula, X 1 is Ser or Thr, X 2 is Ser or Asn, X 3 is Ala, Tyr, Ser, Asn or Asp, and X 4 is Thr, Ser, Tyr or Asn.

일반식 2 Formula 2

Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Pro-SerY 1 -Y 2 -Y 3 -Y 4 -Y 5 -Pro-Ser

상기 일반식에서, Y1은 Ala, Ser 또는 His이고, Y2는 Asp 또는 Asn이고, Y3는 Ser 또는 Asn이며, Y4는 His, Gln, Lys 또는 Asn이며, 그리고 Y5는 Arg 또는 Pro임.In the general formula, Y 1 is Ala, Ser or His, Y 2 is Asp or Asn, Y 3 is Ser or Asn, Y 4 is His, Gln, Lys or Asn, and Y 5 is Arg or Pro .

일반식 3Formula 3

Z1-Z2-Trp-Asp-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7 Z 1 -Z 2 -Trp-Asp-Z 3 -Z 4 -Z 5 -Z 6 -Z 7

상기 일반식에서, Z1은 Gly 또는 Ala이고, Z2는 Ala, Thr 또는 Ser이고, Z3는 Asp, Tyr, Ala 또는 Ser이고, Z4는 Ser, Val 또는 Asn이고, Z5는 Leu 또는 Pro이고, Z6는 Ser, Asp, Gly 또는 Asn이며, 그리고 Z7는 Ala, Phe 또는 Gly임.In the general formula, Z 1 is Gly or Ala, Z 2 is Ala, Thr or Ser, Z 3 is Asp, Tyr, Ala or Ser, Z 4 is Ser, Val or Asn, and Z 5 is Leu or Pro And Z 6 is Ser, Asp, Gly or Asn, and Z 7 is Ala, Phe or Gly.

일반식 4 Formula 4

B1-Tyr-B2-Met-SerB 1 -Tyr-B 2 -Met-Ser

상기 일반식에서, B1은 Gly, Ser, Asn 또는 Asp이며, B2는 Tyr, Asp, Ala 또는 Ser임.In the above general formula, B 1 is Gly, Ser, Asn or Asp, and B 2 is Tyr, Asp, Ala or Ser.

일반식 5 Formula 5

J1-Ile-J2-J3-J4-J5-J6-J7-J8-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-GlyJ 1 -Ile-J 2 -J 3 -J 4 -J 5 -J 6 -J 7 -J 8 -Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly

상기 일반식에서, J1은 Val, Gly, Ala 또는 Ser이고, J2는 Ser 또는 Tyr이고, J3는 Ser, Tyr, His 또는 Pro이고, J4는 Asp, Ser 또는 Gly이고, J5는 Gly, Ser, Asn 또는 Asp이고, J6는 Ser 또는 Gly이고, J7는 Ser 또는 Asn이며, 그리고 J8은 Thr, Ile 또는 Lys임.In the general formula, J 1 is Val, Gly, Ala or Ser, J 2 is Ser or Tyr, J 3 is Ser, Tyr, His or Pro, J 4 is Asp, Ser or Gly, and J 5 is Gly , Ser, Asn or Asp, J 6 is Ser or Gly, J 7 is Ser or Asn, and J 8 is Thr, Ile or Lys.

본 발명자들은 인간 클라우딘 3 및 4에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 인간 클라우딘 3 및 4에 대한 우수한 결합 능력을 나타내면서도, 암(특히, 난소암)을 현저하게 개선된 효능으로 예방 또는 치료할 수 있는 신규한 항체를 개발하였다.The present inventors have tried to develop antibodies that specifically bind to human claudin 3 and 4. As a result, the present inventors have developed a novel antibody capable of preventing or treating cancer (especially ovarian cancer) with remarkably improved efficacy while showing excellent binding ability to human claudin 3 and 4.

본 발명의 항체는 클라우딘 3 및 4에 대하여 특이적 결합능력을 갖는다. 특히, 본 발명의 항체는 클라우딘 3 및 4에 있는 에피토프 중에서, CPE(Clostridium perfringens enterotoxin)가 결합하는 에피토프에 경쟁적으로 결합한다. 기존에 보고된 클라우딘 3와 4를 동시에 타겟팅하는 항체의 경우, 항원과 결합하는 부위에 있어 CPE와 경쟁하지 않는다는 점에서(Characterization and Evaluation of the Antitumour Activity of a Dual-targeting Monoclonal Antibody against Claudin-3 and Claudin-4. Mariko Kato-Nakano et al., Anticancer Research 30: 4555-4562 (2010)) 본 발명의 항체는 기존의 항체와는 에피토프가 다른 항체이다.The antibodies of the present invention have specific binding capacity to claudin 3 and 4. In particular, the antibody of the present invention competitively binds to the epitope to which Clostridium perfringens enterotoxin (CPE) binds among the epitopes in claudin 3 and 4. In the case of previously reported antibodies targeting claudin 3 and 4 at the same time, it does not compete with CPE in the antigen-binding site (Characterization and Evaluation of the Antitumour Activity of a Dual-targeting Monoclonal Antibody against Claudin-3 and Claudin-4. Mariko Kato-Nakano et al., Anticancer Research 30: 4555-4562 (2010)) The antibody of the present invention is an antibody having a different epitope from the conventional antibody.

본 발명의 항체는 다양한 클라우딘 3 및 4 발현의 암 세포에 대하여 우수한 살상능력 또는 증식 억제능력을 갖는다. 본 명세서에서, 암 세포를 언급하면서 사용되는 용어 “살상” 또는 “증식 억제”는 동일한 의미로 혼용된다.The antibody of the present invention has excellent killing ability or proliferation inhibitory ability against cancer cells expressing various claudin 3 and 4. In the present specification, the terms "kill" or "proliferation inhibition" used while referring to cancer cells are used interchangeably with the same meaning.

본 명세서에서, 용어 “항체(antibody)”는 클라우딘 3 및 4에 대한 특이 항체로서, 완전한 항체 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.In the present specification, the term "antibody" refers to specific antibodies against claudin 3 and 4, and includes not only the complete antibody form, but also the antigen-binding fragment of the antibody molecule.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).A complete antibody is a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is linked to a heavy chain by a disulfide bond. The heavy chain constant region has gamma (γ), mu (μ), alpha (α), delta (δ) and epsilon (ε) types, and subclasses gamma 1 (γ1), gamma 2 (γ2), and gamma 3 (γ3). ), gamma4(γ4), alpha1(α1) and alpha2(α2). The constant region of the light chain has kappa (κ) and lambda (λ) types (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, MJ, Ed., Chapter 45, pp. 41-50, WB Saunders Co. Philadelphia, PA (1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4, pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).

본 명세서에서, 용어 “항원 결합 단편”은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 scFv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. F(ab')는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 F(ab')의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. scFv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 scFv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. scFv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인(papain)으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신(pepsin)으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.In the present specification, the term “antigen-binding fragment” refers to a fragment having an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab') 2 and scFv. Among antibody fragments, Fab has a structure having a variable region of a light and heavy chain, a constant region of a light chain, and a first constant region of a heavy chain (C H1 ), and has one antigen-binding site. F(ab') differs from Fab in that it has a hinge region containing one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain C H1 domain. F(ab') 2 antibodies are produced by disulfide bonds between cysteine residues in the hinge region of F(ab'). The scFv is the smallest antibody fragment having only the variable region of the heavy chain and the variable region of the light chain, and the recombinant technology for generating the scFv fragment is PCT International Patent Application WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 and It is disclosed in WO 88/09344. In scFv (single-chain Fv), in general, the variable region of the heavy chain and the variable region of the light chain are covalently linked through a peptide linker or directly linked at the C-terminus. Such antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (e.g., restriction digestion of the entire antibody with papain yields Fab, and digestion with pepsin yields F(ab') 2 fragments. Can be obtained), or can be produced through genetic recombination technology.

본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 불변영역은 감마1(γ1), 감마 3(γ3) 및 감마 4(γ4)이고, 가장 바람직하게는 감마 1(γ1) 이소타입이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있으며, 바람직하게는 카파형이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 항체는 람다(λ) 또는 카파(κ) 경쇄와 감마1(γ1) 중쇄를 가지는 Fab 형태 또는 IgG1 형태이다.In the present invention, the antibody is preferably in the form of Fab or in the form of a complete antibody. In addition, the heavy chain constant region may be selected from any one isotype of gamma (γ), mu (μ), alpha (α), delta (δ), or epsilon (ε). Preferably, the constant region is gamma 1 (γ1), gamma 3 (γ3) and gamma 4 (γ4), most preferably gamma 1 (γ1) isotype. The light chain constant region may be of kappa or lambda type, preferably kappa type. Accordingly, a preferred antibody of the present invention is a Fab form or IgG1 form having a lambda (λ) or kappa (κ) light chain and a gamma 1 (γ1) heavy chain.

본 명세서에서, 용어“중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서 용어“경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.In the present specification, the term “heavy chain” refers to a variable region domain V H comprising an amino acid sequence having a sufficient variable region sequence for conferring specificity to an antigen and a whole including three constant region domains C H1 , C H2 and C H3 It refers to both length heavy chains and fragments thereof. In addition, in the present specification, the term “light chain” refers to both a full-length light chain including a variable region domain V L and a constant region domain C L including an amino acid sequence having a sufficient variable region sequence to impart specificity to an antigen and fragments thereof. do.

본 명세서에서, 용어 “CDR(complementarity determining region)”은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 고가변영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest , 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄 및 경쇄에는 각각 3개의 CDR ((중쇄 (CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 경쇄(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3))이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.As used herein, the term “complementarity determining region (CDR)” refers to the amino acid sequence of the hypervariable region of the heavy and light immunoglobulin chains (Kabat et al., Sequences). of Proteins of Immunological Interest , 4th Ed., US Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). The heavy and light chains each contain three CDRs ((heavy chain (CDRH1, CDRH2 and CDRH3) and light chain (CDRL1, CDRL2 and CDRL3))), which provide the major contact residues for the antibody to bind to an antigen or epitope. do.

본 발명의 항체에서, CDRL1은 일반식 1로 표시된다. In the antibody of the present invention, CDRL1 is represented by general formula 1.

일반식 1에서 X1은 Ser 또는 Thr이고, 보다 더 구체적으로 X1은 Thr이다.In General Formula 1, X 1 is Ser or Thr, and more specifically X 1 is Thr.

일반식 1에서 X2는 Ser 또는 Asn이고, 보다 더 구체적으로 X2는 Ser이다.In General Formula 1, X 2 is Ser or Asn, and more specifically X 2 is Ser.

일반식 1에서 X3는 Ala, Tyr, Ser, Asn 또는 Asp이고, 구체적으로 Ala 또는 Tyr이고, 보다 더 구체적으로 Ala이다.In General Formula 1, X 3 is Ala, Tyr, Ser, Asn or Asp, specifically Ala or Tyr, and more specifically Ala.

일반식 1에서 X4는 Thr, Ser, Tyr 또는 Asn이고, 구체적으로 X4는 Thr 또는 Ser이고, 보다 더 구체적으로 X4는 Thr이다.In General Formula 1, X 4 is Thr, Ser, Tyr or Asn, specifically X 4 is Thr or Ser, and more specifically X 4 is Thr.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CDRL1는 서열목록 제3서열 내지 제20서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 보다 더 구체적으로 CDRL1는 서열목록 제3서열 내지 제9서열의 아미노산 서열을 포함하며, 가장 구체적으로, 상기 CDRL1는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함한다.According to an embodiment of the present invention, the CDRL1 includes an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 3 to 20, and more specifically, CDRL1 is an amino acid sequence of SEQ ID NOs 3 to 9 A sequence, and most specifically, the CDRL1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in Sequence Listing.

본 발명의 항체에서, CDRL2는 일반식 2로 표시된다.In the antibody of the present invention, CDRL2 is represented by general formula 2.

일반식 2에서 Y1은 Ala, Ser 또는 His이고, 보다 더 구체적으로 Y1은 Ala이다.In General Formula 2, Y 1 is Ala, Ser or His, and more specifically, Y 1 is Ala.

일반식 2에서 Y2는 Asp 또는 Asn이고, 보다 더 구체적으로 Y2는 Asp이다.In General Formula 2, Y 2 is Asp or Asn, and more specifically, Y 2 is Asp.

일반식 2에서 Y3는 Ser 또는 Asn이고, 보다 더 구체적으로 Y3는 Ser이다.In General Formula 2, Y 3 is Ser or Asn, and more specifically, Y 3 is Ser.

일반식 2에서 Y4는 His, Gln, Lys 또는 Asn이고, 구체적으로 Y4는 His, Gln, Lys이고, 보다 더 구체적으로 Y4는 His이다.In General Formula 2, Y 4 is His, Gln, Lys or Asn, specifically Y 4 is His, Gln, Lys, and more specifically Y 4 is His.

일반식 2에서 Y5는 Arg 또는 Pro이고, 보다 더 구체적으로 Y5는 Arg이다.In General Formula 2, Y 5 is Arg or Pro, and more specifically, Y 5 is Arg.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CDRL2는 서열목록 제21서열 내지 제38서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 보다 더 구체적으로 CDRL2는 서열목록 제21서열 내지 제27서열의 아미노산 서열을 포함하며, 가장 구체적으로, 상기 CDRL2는 서열목록 제21서열의 아미노산 서열을 포함한다.According to an embodiment of the present invention, the CDRL2 includes an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21 to 38, and more specifically, CDRL2 is an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 21 to 27. A sequence, and most specifically, the CDRL2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.

본 발명의 항체에서, CDRL3는 일반식 3로 표시된다.In the antibody of the present invention, CDRL3 is represented by general formula 3.

일반식 3에서 Z1은 Gly 또는 Ala이고, 보다 더 구체적으로 Z1 Gly이다.In General Formula 3, Z 1 is Gly or Ala, and more specifically, Z 1 is It's Gly.

일반식 3에서 Z2는 Ala, Thr 또는 Ser이고, 보다 더 구체적으로 Z2는 Ala이다.In General Formula 3, Z 2 is Ala, Thr or Ser, and more specifically, Z 2 is Ala.

일반식 3에서 Z3는 Asp, Tyr, Ala 또는 Ser이고, 보다 더 구체적으로 Asp이다.In General Formula 3, Z 3 is Asp, Tyr, Ala or Ser, and more specifically Asp.

일반식 3에서 Z4는 Ser, Val 또는 Asn이고, 보다 더 구체적으로 Ser이다.In General Formula 3, Z 4 is Ser, Val or Asn, and more specifically Ser.

일반식 3에서 Z5는 Leu 또는 Pro이고, 보다 더 구체적으로 Leu이다.In General Formula 3, Z 5 is Leu or Pro, and more specifically Leu.

일반식 3에서 Z6는 Ser, Asp, Gly 또는 Asn이고, 구체적으로 Asp, Gly 또는 Asn이고, 보다 더 구체적으로 Asn이다.In General Formula 3, Z 6 is Ser, Asp, Gly or Asn, specifically Asp, Gly or Asn, and more specifically Asn.

일반식 3에서 Z7는 Ala, Phe 또는 Gly이고, 구체적으로 Ala 또는 Phe이고, 보다 더 구체적으로 Ala이다.In General Formula 3, Z 7 is Ala, Phe or Gly, specifically Ala or Phe, and more specifically Ala.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CDRL3는 서열목록 제39서열 내지 제60서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 보다 더 구체적으로 CDRL1는 서열목록 제39서열 내지 제49서열의 아미노산 서열을 포함하며, 가장 구체적으로, 상기 CDRL3는 서열목록 제39서열의 아미노산 서열을 포함한다.According to an embodiment of the present invention, the CDRL3 comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 39 to 60, and more specifically, CDRL1 is an amino acid of SEQ ID NOs: 39 to 49 A sequence, and most specifically, the CDRL3 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39.

본 발명의 항체에서, CDRH1는 일반식 4로 표시된다.In the antibody of the present invention, CDRH1 is represented by general formula 4.

일반식 4에서 B1은 Gly, Ser, Asn 또는 Asp이고, 보다 더 구체적으로 Gly이다.In General Formula 4, B 1 is Gly, Ser, Asn or Asp, and more specifically Gly.

일반식 4에서 B2는 Tyr, Asp, Ala 또는 Ser이고, 보다 더 구체적으로 Tyr이다.In General Formula 4, B 2 is Tyr, Asp, Ala or Ser, and more specifically Tyr.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CDRH1는 서열목록 제61서열 내지 제72서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 보다 더 구체적으로 CDRH1는 서열목록 제61서열의 아미노산 서열을 포함한다.According to an embodiment of the present invention, the CDRH1 includes an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 61 to 72, and more specifically, CDRH1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61. .

본 발명의 항체에서, CDRH2는 일반식 5로 표시된다.In the antibody of the present invention, CDRH2 is represented by general formula 5.

일반식 5에서 J1은 Val, Gly, Ala 또는 Ser이고, 보다 더 구체적으로 J1은 Val이다.In General Formula 5, J 1 is Val, Gly, Ala or Ser, and more specifically J 1 is Val.

일반식 5에서 J2는 Ser 또는 Tyr이고, 보다 더 구체적으로 J2는 Ser이다.In General Formula 5, J 2 is Ser or Tyr, and more specifically, J 2 is Ser.

일반식 5에서 J3는 Ser, Tyr, His 또는 Pro이고, 보다 더 구체적으로 J3는 His이다.In the general formula 5, J 3 is Ser, Tyr, His or Pro, and more specifically, J 3 is His.

일반식 5에서 J4는 Asp, Ser 또는 Gly이고, 보다 더 구체적으로 J4는 Asp이다.In General Formula 5, J 4 is Asp, Ser or Gly, and more specifically, J 4 is Asp.

일반식 5에서 J5는 Gly, Ser, Asn 또는 Asp이고, 보다 더 구체적으로 J5는 Gly이다.In the general formula 5, J 5 is Gly, Ser, Asn or Asp, and more specifically, J 5 is Gly.

일반식 5에서 J6는 Ser 또는 Gly이고, 보다 더 구체적으로 J6는 Ser이다.In General Formula 5, J 6 is Ser or Gly, and more specifically, J 6 is Ser.

일반식 5에서 J7는 Ser 또는 Asn이고, 보다 더 구체적으로 J7는 Ser이다.In General Formula 5, J 7 is Ser or Asn, and more specifically, J 7 is Ser.

일반식 5에서 J8은 Thr, Ile 또는 Lys이고, 보다 더 구체적으로 J8은 Thr이다.In the general formula 5, J 8 is Thr, Ile or Lys, and more specifically, J 8 is Thr.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CDRH2는 서열목록 제73서열 내지 제84서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 보다 더 구체적으로 CDRH2는 서열목록 제73서열의 아미노산 서열을 포함한다.According to an embodiment of the present invention, the CDRH2 includes an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 73 to SEQ ID NO: 84, and more specifically, CDRH2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73. .

본 발명의 항체에서, CDRH3는 서열목록 제85서열 내지 제96서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되며, 구체적으로 서열목록 제85서열의 아미노산 서열로 표시된다.In the antibody of the present invention, CDRH3 is represented by any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 85 to 96, and specifically represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85.

본 발명의 클라우딘 3 및 4에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 클라우딘 3 및 4를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.The antibody against claudin 3 and 4 of the present invention or an antigen-binding fragment thereof may include variants of the amino acid sequence described in the appended sequence listing within a range capable of specifically recognizing claudin 3 and 4. For example, changes can be made to the amino acid sequence of an antibody to improve its binding affinity and/or other biological properties. Such modifications include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.These amino acid variations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like. By analysis of the size, shape and type of amino acid side chain substituents, arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Thus, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan and tyrosine are biologically functional equivalents.

변이를 도입하는데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).In introducing mutations, the hydropathic index of amino acids can be considered. Each amino acid is assigned a hydrophobicity index according to its hydrophobicity and charge: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); Leucine (+3.8); Phenylalanine (+2.8); Cysteine/cysteine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); Glycine (-0.4); Threonine (-0.7); Serine (-0.8); Tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); Histidine (-3.2); Glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); And arginine (-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.The hydrophobic amino acid index is very important in imparting an interactive biological function of a protein. It is a known fact that a similar biological activity can be retained only by substitution with an amino acid having a similar hydrophobicity index. When introducing a mutation with reference to the hydrophobicity index, substitution is made between amino acids showing a difference in the hydrophobicity index, preferably within ±2, more preferably within ±1, and even more preferably within ±0.5.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).On the other hand, it is also well known that substitutions between amino acids having similar hydrophilicity values result in proteins with equal biological activity. As disclosed in US Pat. No. 4,554,101, the following hydrophilicity values are assigned to each amino acid residue: arginine (+3.0); Lysine (+3.0); Asphaltate (+3.0±1); Glutamate (+3.0±1); Serine (+0.3); Asparagine (+0.2); Glutamine (+0.2); Glycine (0); Threonine (-0.4); Proline (-0.5 ± 1); Alanine (-0.5); Histidine (-0.5); Cysteine (-1.0); Methionine (-1.3); Valine (-1.5); Leucine (-1.8); Isoleucine (-1.8); Tyrosine (-2.3); Phenylalanine (-2.5); Tryptophan (-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.When introducing a mutation with reference to a hydrophilicity value, substitution is made between amino acids showing a difference in hydrophilicity values of preferably within ±2, more preferably within ±1, and even more preferably within ±0.5.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.Amino acid exchanges in proteins that do not totally alter the activity of the molecule are known in the art (H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). The most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/ It is an exchange between Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. Considering the above-described mutation having biologically equivalent activity, the antibody of the present invention or a nucleic acid molecule encoding the same is interpreted as including a sequence that exhibits substantial identity to the sequence listed in the sequence listing. The actual identity is at least 61% when the sequence of the present invention and any other sequence are aligned to correspond as much as possible, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. It means a sequence that exhibits homology, more preferably 70% homology, even more preferably 80% homology, and most preferably 90% homology. Alignment methods for sequence comparison are known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described in Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482 (1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3 (1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90 (1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65 (1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol. 24:307-31 (1994). NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990)) can be accessed from NBCI (National Center for Biological Information), etc. It can be used in conjunction with sequence analysis programs such as blastx, tblastn and tblastx.

본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, scFv, 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 F(ab')2 , 항-이디오타입(항-Id) 항체 및 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.Antibodies of the present invention include monoclonal antibodies, multispecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, scFv, single chain antibodies, Fab fragments, F(ab') fragments, disulfide-binding F(ab') 2 , anti -Idiotype (anti-Id) antibodies and epitope-binding fragments of the antibodies are included, but are not limited thereto.

한편, 본 발명의 항체 CDR 서열은 종래 항체들의 CDR 서열과 비교하여 상동성(similarity)이 매우 낮아, 그 서열의 독특함이 있다. 따라서, 본 발명의 항체의 아미노산 서열은 그 서열의 신규성 및 독특함이 인정된다.On the other hand, the antibody CDR sequence of the present invention has very low similarity compared to the CDR sequences of conventional antibodies, and the sequence is unique. Therefore, the amino acid sequence of the antibody of the present invention is recognized for its novelty and uniqueness.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 (a) 본 발명의 클라우딘(Claudin) 3 및 4에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical effective amount of an antibody or antigen-binding fragment thereof against (a) claudin 3 and 4 of the present invention; And (b) provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 클라우딘(Claudin) 3 및 4에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 의해 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.Since the pharmaceutical composition of the present invention uses the antibodies or antigen-binding fragments thereof against Claudin 3 and 4 of the present invention as an active ingredient, the content in common between the two is excessive in the present specification by repeated description. In order to avoid complexity, the description is omitted.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 클라우딘(Claudin) 3 및 4에 대한 항체는 기존의 항암제와 병용투여하는 경우, 암 세포(특히, 난소암 세포)를 크게 개선된 세포 살상능력으로 살상시킬 수 있어, 암(특히, 난소암, 보다 구체적으로 클라우딘(Claudin) 3 및 4-발현 난소암)의 치료에 매우 유효하다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기존의 항암제인 카르보플라틴(carboplatin)과 본 발명의 항체를 병용투여하는 경우 효과적으로 난소암 세포의 증식을 억제하였다.As demonstrated in the following examples, when the antibodies against Claudin 3 and 4 of the present invention are co-administered with an existing anticancer agent, cancer cells (especially ovarian cancer cells) are greatly improved in cell killing ability. Since it can kill, it is very effective in the treatment of cancer (especially ovarian cancer, more specifically Claudin 3 and 4-expressing ovarian cancer). According to one embodiment of the present invention, when the conventional anticancer agent carboplatin and the antibody of the present invention are co-administered, the proliferation of ovarian cancer cells is effectively suppressed.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 당업계에 공지된 다양한 암을 포함하며, 예를 들어 유방암, 난소암, 위암, 폐암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암을 포함한다.Cancers that can be prevented or treated by the composition of the present invention include various cancers known in the art, for example breast cancer, ovarian cancer, gastric cancer, lung cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer , Colon cancer, colon cancer, cervical cancer, brain cancer, prostate cancer, bone cancer, head and neck cancer, skin cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer or ureter cancer.

구체적으로, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 클라우딘(Claudin) 3 및 4-발현 암이고, 보다 구체적으로 클라우딘(Claudin) 3 및 4-발현 난소암이다.Specifically, cancers that can be prevented or treated by the composition of the present invention are Claudin 3 and 4-expressing cancers, and more specifically Claudin 3 and 4-expressing ovarian cancers.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used at the time of formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc. It does not become. The pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered parenterally, such as intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and rectal administration.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 암의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.A suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, route of administration, excretion rate and response sensitivity of the patient, Usually the skilled practitioner can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment or prophylaxis. As used herein, the term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to prevent or treat cancer.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person having ordinary knowledge in the art. Or it can be prepared by placing it in a multi-dose container. In this case, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, suppository, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or a stabilizer.

본 발명의 항체는 진단, 예컨대 클라우딘(Claudin) 3 및 4-발현 관련된 질환(disorders), 질병(diseases) 또는 상태(conditions)를 진단하는 데 이용될 수 있다.The antibodies of the invention can be used to diagnose, for example, diagnose claudin 3 and 4-expression related disorders, diseases or conditions.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체를 포함하는 클라우딘(Claudin) 3 및 4-발현 관련 질환, 질병 또는 상태의 진단키트를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a diagnostic kit for claudin 3 and 4-expression related diseases, diseases or conditions comprising the antibody of the present invention described above.

클라우딘(Claudin) 3 및 4-발현 관련 질환, 질병 또는 상태는 구체적으로 암이고, 예를 들어 유방암, 난소암, 위암, 폐암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암을 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 진단키트는 클라우딘(Claudin) 3 및 4-발현 암, 보다 구체적으로 클라우딘(Claudin) 3 및 4-발현 난소암의 진단에 이용된다.Claudin 3 and 4-expression-related diseases, diseases or conditions are specifically cancer, for example breast cancer, ovarian cancer, gastric cancer, lung cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer, Colon cancer, cervical cancer, brain cancer, prostate cancer, bone cancer, head and neck cancer, skin cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, or ureteral cancer. Specifically, the diagnostic kit of the present invention is used for the diagnosis of Claudin 3 and 4-expressing cancer, and more specifically, Claudin 3 and 4-expressing ovarian cancer.

또한, 본 발명의 항체는, 본 발명의 항체 치료제가 환자에게 의약 반응성(drug responsiveness)이 있는지 여부를 분석하는 데 이용될 수 있다.In addition, the antibody of the present invention can be used to analyze whether the antibody therapeutic agent of the present invention has drug responsiveness to a patient.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체를 포함하는 의약 반응성(drug responsiveness) 분석 키트를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a drug responsiveness assay kit comprising the antibody of the present invention described above.

본 발명의 분석 키트는, 특정의 환자가 본 발명의 항체에 대하여 의약 반응성이 있는지 여부를 분석하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 환자의 암 세포에 본 발명의 항체를 처리한 경우, 본 발명의 항체가 결합하는 것으로 결과가 나오면, 이 환자는 본 발명의 항체에 대하여 의약 반응성이 있는 것으로 판정할 수 있다. 상술한 키트는 항체를 포함하기 때문에, 기본적으로 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining)에 적합하게 제작될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.The assay kit of the present invention can be used to analyze whether a particular patient is medicinally responsive to the antibody of the present invention. For example, when a patient's cancer cells are treated with an antibody of the present invention, if a result is found that the antibody of the present invention binds, the patient can be determined to have drug reactivity with the antibody of the present invention. Since the above-described kit contains an antibody, it can be basically made suitable for various immunoassays or immunostaining. The immunoassay or immunostaining includes radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), capture-ELISA, inhibition or competition analysis, sandwich analysis, flow cytometry, immunofluorescence staining, and Including, but not limited to, immunoaffinity purification. The method of immunoassay or immunostaining is Enzyme Immunoassay , ET Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ), in Methods in Molecular Biology , Vol. 1, Walker, JM ed., Humana Press, NJ, 1984; And Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies : A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.

본 발명의 항체는 그 단독으로도 암을 치료하는 데 이용될 수 있지만, 클라우딘(Claudin) 3 및 4 발현 세포를 타겟팅 할 수 있기 때문에 다른 약물을 결합시켜 ADC(antibody drug conjugate) 형태로 제공될 수 있다.The antibody of the present invention can be used alone to treat cancer, but since it can target claudin 3 and 4 expressing cells, it can be provided in the form of an ADC (antibody drug conjugate) by combining other drugs. have.

따라서 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체 및 상기 항체에 결합된 약물을 포함하는 항체 의약 컨쥬게이트(ADC)를 제공한다.Accordingly, according to another aspect of the present invention, the present invention provides an antibody pharmaceutical conjugate (ADC) comprising the antibody of the present invention and a drug bound to the antibody.

본 발명의 항체에 결합되는 약물은 특별하게 제한되지 않으며, 화학물질, 방사성핵종, 면역치료제, 사이토카인, 케모카인, 독소, 생물작용제 및 효소 저해물질을 포함하며, 보다 구체적으로 다음과 같은 항암제이다: 아시바이신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로나이신, 아도젤레신, 알라노신, 알데스루킨, 알로푸리놀 소듐, 알트레타민, 아미노글루테티미드, 아모나파이드, 암플리겐, 암사크린, 안드로겐스, 안구이딘, 아피디콜린 글리시네이트, 아사레이, 아스파라기나아제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 바실러스 칼메테-구에린(BCG), 베이커스 안티폴, 베타-2-디옥시티오구아노신, 비스안트렌 HCl, 블레오마이신 설페이트, 불서판, 부티오닌 설폭시민, BWA773U82, BW 502U83/HCl, BW 7U85 메실레이트, 세라세미드, 카르베티머, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 클로로퀴녹살린-설포나미드, 클로로조토신, 크로모마이신 A3, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티코스테로이드, 코리너박테리움 파르붐, CPT-11, 크리스나톨, 사이클로사이티딘, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 사이템베나, 다비스 말리에이트, 데카르바진, 닥티노마이신, 다우노루바이신 HCl, 디아자유리딘, 덱스라족산, 디언하이드로 갈락티톨, 디아지쿠온, 디브로모둘시톨, 디데민 B, 디에틸디티오카르바메이트, 디클라이코알데하이드, 다이하이드로-5-아자사이틴, 독소루비신, 에치노마이신, 데다트렉세이트, 에델포신, 에플롤니틴, 엘리옷스 용액, 엘사미트루신, 에피루비신, 에소루비신, 에스트라머스틴 포스페이트, 에스트로겐, 에타니다졸, 에티오포스, 에토포사이드, 파드라졸, 파자라빈, 펜레티나이드, 필그라스팀, 피나스테라이드, 플라본 아세트산, 플록스유리딘, 플루다라빈 포스페이트, 5’-플루오로우라실, Fluosol™, 플루타미드, 갈륨 나이트레이트, 겜사이타빈, 고세레린 아세테이트, 헤프설팜, 헥사메틸렌 비스아세트아미드, 호모하링토닌, 하이드라진 설페이트, 4-하이드록시안드로스테네디온, 하이드로지우레아, 이다루비신 HCl, 이포스파미드, 4-이포메아놀, 이프로플라틴, 이소트레티노인, 코보린 칼슘, 류프로라이드 아세테이트, 레바미솔, 리포좀 다우노루비신, 리포좀 포집 독소루비신, 로머스틴, 로니다민, 마이탄신, 메클로레타민 하이드로클로라이드, 멜팔란, 메노가릴, 메르바론, 6-머캅토푸린, 메스나, 바실러스 칼레테-구에린의 메탄올 추출물, 메토트렉세이트, N-메틸포름아미드, 미페프리스톤, 미토구아존, 마이토마이신-C, 미토탄, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 모노사이트/마크로파아지 콜로니-자극 인자, 나빌론, 나폭시딘, 네오카르지노스타틴, 옥트레오타이드 아세테이트, 오르마플라틴, 옥살리플라틴,파크리탁셀, 팔라, 펜토스타틴, 피페라진디온, 피포브로만, 피라루비신, 피리트렉심, 피록산트론 하이드로클로라이드, PIXY-321, 플리카마이신, 포르피머 소듐, 프레드니무스틴, 프로카르바진, 프로게스틴스, 파이라조푸린, 라족산, 사르그라모스팀, 세무스틴, 스피로게르마늄, 스피로무스틴, 스트렙토나이그린, 스트렙토조신, 술로페너르, 수라민 소듐, 타목시펜, 탁소레레, 테가푸르, 테니포사이드, 테레프탈아미딘, 테록시론, 티오구아닌, 티오테파, 티미딘 인젝션, 티아조푸린, 토포테칸, 토레미펜, 트레티노인, 트리플루오페라진 하이드로클로라이드, 트리플루리딘, 트리메트렉세이트, TNF(tumor necrosis factor), 우라실 머스타드, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신, 비노렐빈, 빈졸리딘, Yoshi 864, 조루비신, 사이토신아라비노시드, 에토포시드, 멜파란, 탁소텔 및 탁솔.Drugs bound to the antibodies of the present invention are not particularly limited, and include chemicals, radionuclides, immunotherapeutic agents, cytokines, chemokines, toxins, biological agents and enzyme inhibitors, and more specifically, anticancer agents such as: Acibicin, aclarubicin, acodazole, acronicin, adozelesin, alanosine, aldesleukin, allopurinol sodium, altretamine, aminoglutetimide, amonapide, ampligen, amsaclean , Androgens, Anguidin, Apidicholine Glycinate, Asarei, Asparaginase, 5-Azacytidine, Azathioprine, Bacillus Calmette-Guerine (BCG), Bakers Antipol, Beta-2 -Deoxythioguanosine, bisanthrene HCl, bleomycin sulfate, bullsulfamine, butionine sulfoximine, BWA773U82, BW 502U83/HCl, BW 7U85 mesylate, cerasemide, carbetimer, carboplatin, carboxylate Mustine, chlorambucil, chloroquinoxaline-sulfonamide, chlorozotocin, chromomycin A3, cisplatin, cladribine, corticosteroid, corinerbacterium parvum, CPT-11, cristnatole, cyclocytidine , Cyclophosphamide, Cytarabine, Cytembena, Dabis Maleate, Decarbazine, Dactinomycin, Daunorubicin HCl, Diazauridine, Dexrazoic Acid, Deionhydrogalactitol, Diazicuone, Dibro Modulcitol, didemin B, diethyldithiocarbamate, diclicoaldehyde, dihydro-5-azacytine, doxorubicin, ethinomycin, dedatrexate, edelfosin, eflonitin, ellios solution , Elsamitrusin, Epirubicin, Esorubicin, Estramustine Phosphate, Estrogen, Ethanidazole, Ethiophos, Etoposide, Padrazole, Pazarabine, Penretinide, Pilgrastim, Finasteride, Flavone Acetic Acid , Phloxuridine, fludarabine phosphate, 5'-fluorouracil, Fluosol™, flutamide, gallium nitrate, gemcytabine, gosererin acetate, hefsulfam, hexamethylene bisacetamide, homoharingtonine, Hydrazine sulfate, 4-hydroxyandrostenedione, hydrodiurea, tooth Darubicin HCl, ifosphamide, 4-ifomeanol, iproplatin, isotretinoin, coborin calcium, leuprolide acetate, levamisol, liposome daunorubicin, liposome trapping doxorubicin, romastin, rhonidamine, mytansine, Mechloretamine hydrochloride, melphalan, menogaryl, merbaron, 6-mercaptopurine, mesna, methanol extract of Bacillus calete-guerine, methotrexate, N-methylformamide, mifepristone, mitoguazone, my Tomycin-C, mitotan, mitoxantrone hydrochloride, monosite/macrophage colony-stimulating factor, nablon, napoxidine, neocarginostatin, octreotide acetate, ormaplatin, oxaliplatin, paclitaxel , Pala, pentostatin, piperazindione, pipobroman, pyrarubicin, pyritrexim, pyroxantrone hydrochloride, PIXY-321, plicamycin, porpimer sodium, prednimustine, procarbazine, progestins , Pyrazofurine, Razox acid, Sargramostim, Semustine, Spirogermanium, Spiromustine, Streptonigreen, Streptozosine, Sulopener, Suramine Sodium, Tamoxifen, Taxorere, Tegapur, Teniposide, Terephthalamidine, teroxilone, thioguanine, thiotepa, thymidine injection, thiazopurine, topotecan, toremifene, tretinoin, trifluoroperazine hydrochloride, trifluridine, trimetrexate, TNF (tumor necrosis factor) ), uracil mustard, vinblastine sulfate, vincristine sulfate, vindesine, vinorelbine, vinzolidin, Yoshi 864, zorubicin, cytosine arabinoside, etoposide, melfaran, taxotel and taxol.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 인간 클라우딘 3 및 4에 대하여 특이적인 활성을 갖는 인간 항체로서 표적 항원인 인간 클라우딘 3 및 4의 특정 부위를 에피토프로 하여 이에 대해 친화력을 가지는 인간 항체를 제공한다.(a) The present invention provides a human antibody having specific activity against human claudin 3 and 4, and has an affinity for human claudin 3 and 4 by using a specific site as an epitope as an epitope.

(b) 본 발명의 항체는 암 세포(특히, 난소암 세포)에서 과발현되는 클라우딘 3 또는 4에 특이적으로 결합하는 항체이다.(b) The antibody of the present invention is an antibody that specifically binds to claudin 3 or 4 overexpressed in cancer cells (especially ovarian cancer cells).

(c) 본 발명의 항체는 종래의 클라우딘 3 또는 4 타겟 항체들의 CDR 서열과 비교하여 상동성이 매우 낮아, 그 서열의 독특함이 있다. (c) The antibody of the present invention has very low homology compared to the CDR sequences of conventional claudin 3 or 4 target antibodies, and the sequence is unique.

(d) 본 발명의 항체는 암 세포를 살상시켜 암(특히, 난소암)의 예방 또는 치료에 매우 유효하다.(d) The antibody of the present invention is very effective in preventing or treating cancer (especially, ovarian cancer) by killing cancer cells.

(e) 본 발명의 항체는 암 치료제로서 뿐만 아니라, 암의 진단, 의약 반응성 분석, 이미징 및 ADC(antibody drug conjugate)로도 이용될 수 있다.(e) The antibody of the present invention can be used not only as a cancer therapeutic agent, but also as a diagnosis of cancer, analysis of drug reactivity, imaging, and ADC (antibody drug conjugate).

도 1은 결합력이 우수한 scFv를 선별하기 위하여 각각 클라우딘 3 및 클라우딘 4 항원에 대하여 ELISA 분석을 수행한 사진이다.
도 2a 및 b는 선별된 scFv와 클라우딘 3 및 4를 과발현하는 세포와의 결합능력을 확인하기 위하여 유세포 분석기(Flow cytometry)를 이용하여 분석한 도면이다.
도 3은 B12 항체 발현 세포주를 만드는 과정에서 발현량이 높은 클론을 선별하기 위하여 닷 블랏(dot blot)을 수행한 사진이다.
도 4는 정제된 항체에서 HCP (Host Cell Protein) 분석을 한 결과를 보여주는 도면이다.
도 5는 정제된 항체에서 잔여 Protein A 분석을 한 결과를 보여주는 도면이다.
도 6은 1차 정제(a), 2차 정제(b), 3차 정제(c) 후 B12 항체에 대하여 HPLC 분석을 한 결과를 보여주는 도면이다.
도 7은 B12 항체의 결합 친화성을 확인하기 위하여 OVCAR-3 세포 및 TOV-112D 세포와 클라우딘 항체 및 B12 항체를 이용하여 유세포분석을 수행하여 분석한 결과를 보여주는 도면이다.
도 8은 B12 항체의 결합 친화성을 확인하기 위하여 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR)을 분석한 결과를 보여주는 도면이다.
도 9는 B12 항체의 결합 친화성을 확인하기 위하여 면역침강법(Immunoprecipitation)을 수행한 결과를 보여주는 도면이다.
도 10은 B12 항체에 대해 Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity(ADCC)를 분석한 결과를 보여주는 도면이다.
도 11은 B12 항체에 대해 Complement dependent cytotoxicity (CDC)를 분석한 결과를 보여주는 도면이다.
도 12은 마우스 모델에서 난소암 세포주를 이형이식 시킨 것을 보여주는 사진이다.
도 13는 종양(난소암 세포주)을 유발한 마우스 모델에 B12 항체를 투여한 효과를 보여주는 도면이다.
도 14는 종양(난소암 세포주)을 유발한 마우스 모델에 B12 항체와 카르보플라틴을 병용 투여한 효과를 보여주는 도면이다.
도 15는 B12 항체와 CPE(Clostridium perfringens enterotoxin)가 결합부위에 있어 경쟁하는지를 확인하기 위하여 유세포 분석방법(Flow cytometry)을 이용하여 분석한 결과를 보여주는 도면이다.
도 16은 B12 항체의 친화도를 증진시키기 위해 사용한 2 슬라이드 방법의 개요를 보여주는 도면이다.
도 17은 B12 항체의 친화도를 증진시킨 항체들의 결합능력을 비교하기 위하여 유세포 분석방법(Flow cytometry)을 이용하여 분석한 결과를 보여주는 도면이다.
1 is a photograph of an ELISA analysis of claudin 3 and claudin 4 antigens, respectively, in order to select scFvs having excellent binding ability.
Figures 2a and b are diagrams analyzed using flow cytometry to confirm the binding ability of the selected scFv and cells overexpressing claudin 3 and 4;
3 is a photograph of performing a dot blot in order to select a clone with a high expression level in the process of making a B12 antibody-expressing cell line.
4 is a diagram showing the results of HCP (Host Cell Protein) analysis on the purified antibody.
5 is a diagram showing the result of analyzing the residual Protein A in the purified antibody.
6 is a diagram showing the results of HPLC analysis on B12 antibody after the first purification (a), the second purification (b), and the third purification (c).
7 is a diagram showing the results of flow cytometric analysis using OVCAR-3 cells and TOV-112D cells, claudin antibody and B12 antibody to confirm the binding affinity of the B12 antibody.
FIG. 8 is a diagram showing the results of analysis of Surface Plasmon Resonance (SPR) in order to confirm the binding affinity of the B12 antibody.
9 is a view showing the result of performing immunoprecipitation (Immunoprecipitation) to confirm the binding affinity of the B12 antibody.
10 is a diagram showing the results of analysis of Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) for B12 antibody.
11 is a diagram showing the results of analysis of Complement dependent cytotoxicity (CDC) for B12 antibody.
Figure 12 is a photograph showing that the ovarian cancer cell line is transplanted in a mouse model.
13 is a diagram showing the effect of administering the B12 antibody to a mouse model that caused a tumor (ovarian cancer cell line).
14 is a diagram showing the effect of co-administration of a B12 antibody and carboplatin to a mouse model that induces a tumor (ovarian cancer cell line).
15 is a view showing the results of analysis using flow cytometry to determine whether B12 antibody and Clostridium perfringens enterotoxin (CPE) compete in the binding site.
16 is a diagram showing an outline of a two-slide method used to enhance the affinity of the B12 antibody.
FIG. 17 is a diagram showing the results of analysis using flow cytometry to compare the binding capacity of antibodies that have improved the affinity of the B12 antibody.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for describing the present invention in more detail, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .

실시예Example

실시예 1: 클라우딘 3 또는 4에 대한 항체 개발Example 1: Development of antibodies against claudin 3 or 4

항체 개발을 위해 클라우딘 3 및 4 단백질의 루프 2 부위를 대장균을 이용하여 생산한 후 항원으로 사용하였다. 클라우딘 3 항원의 아미노산 서열은 SANTIIRDFYNPVVPEAQKREMGA(서열목록 제1서열)이며, 클라우딘 4 항원의 아미노산 서열은 TAHNIIQDFYNPLASGQKREMGAS(서열목록 제2서열)이다. 구체적인 항원의 제작방법은 대한민국 등록특허 10-1334207호에 개시되어 있다.For antibody development, loop 2 sites of claudin 3 and 4 proteins were produced using E. coli and used as antigens. The amino acid sequence of the claudin 3 antigen is SANTIIRDFYNPVVPEAQKREMGA (SEQ ID NO: 1), and the amino acid sequence of the claudin 4 antigen is TAHNIIQDFYNPLASGQKREMGAS (SEQ ID NO: 2). A specific method of preparing an antigen is disclosed in Korean Patent Registration No. 10-1334207.

정제된 클라우딘 3 및 4의 항원과 특이적 결합을 하는 항체를 스크리닝하기 위하여 파지 라이브러리 디스플레이법(phage library display)을 이용하였다. 라이브러리는 합성한 인간 scFv 라이브러리를 이용하였으며, 라이브러리에 대한 구체적인 정보는 Construction of a Large Synthetic Human scFv Library with Six Diversified CDRs and High Functional Diversity (H. Y. Yang et al., Mol. Cells., 27:225-235 (2009))에 개시되어 있다. 요약하면, 상기 논문의 표 1에 기재된 오버랩핑 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 PCR을 수행하여 VH 및 JH-링커-VL 서열을 어셈블링 함으로써, V 유전자 레퍼토리(repertoires)를 어셈블링 하였다. 먼저 VH-CDR-H3를 PCR하여 얻어낸 다음, 다시 PCR을 이용하여 JH-링커-VL에 연결시켜서 scFv PCR 생성물(-750bp)을 얻어내었다. 이렇게 얻어진 scFv 단편을 pComb3X vector(Scott, J.K. and C.F. Barbas, III, Phage Display Vectors. In phage display: A Laboratory Manual, C.F. Barbas, III, D.R. Burton, J.K. Scott, and G.J. Silverman, eds. (Cold Spring Harbor, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press), pp. 2.1-2.19. (2001))에 클로닝하였고, 시퀀싱을 통해 정확한 프레임워크( framework)를 가진 클론들을 선별하였다. 선별된 클론들을 템플레이트(template)로 하여 PCR을 수행하였고, 결과적으로 상기 논문의 표 2에 기재된 scFv 레퍼토리(repertoires)를 만들었다.In order to screen for antibodies that specifically bind to the purified claudin 3 and 4 antigens, a phage library display method was used. The library was a synthesized human scFv library, and for specific information on the library, see Construction of a Large Synthetic Human scFv Library with Six Diversified CDRs and High Functional Diversity (HY Yang et al., Mol. Cells., 27:225-235 (2009)). In summary, the V gene repertoires were assembled by assembling the V H and J H -linker-V L sequences by performing PCR using the overlapping oligonucleotides described in Table 1 of the above paper. First eoteonaen by PCR the following V H -CDR-H3, J H by a PCR re-connected by the linker L -V served takes the scFv PCR product (-750bp). The scFv fragment thus obtained was used in pComb3X vector (Scott, JK and CF Barbas, III, Phage Display Vectors.In phage display: A Laboratory Manual, CF Barbas, III, DR Burton, JK Scott, and GJ Silverman, eds. (Cold Spring Harbor) , USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press), pp. 2.1-2.19. (2001)), and the clones having the correct framework were selected through sequencing. PCR was performed using the selected clones as a template, and as a result, scFv repertoires described in Table 2 of the paper were created.

상기 scFv 라이브러리를 사용하여 파지 라이브러리 디스플레이법을 이용한 스크리닝을 위해 다음과 같이 바이오패닝(Biopanning)을 진행하였다.Biopanning was performed as follows for screening using the phage library display method using the scFv library.

상기 scFv 라이브러리 스톡과 고체 비드에 연결된 항원(solid bead conjugated antigen)을 각각 5% 탈지유(skim milk)로 상온에서 1시간 동안 블로킹을 진행하였다. 블로킹이 끝난 항원에서 탈지유를 제거하고 scFv 라이브러리 스톡과 혼합하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 멤브래인 필터(Corning costar Spin-X 0.45um, Cat. No. CLS8126)를 이용하여 scFv-항원 컨쥬게이트(conjugate) 형태로 100 mM TEA 버퍼에 준비하였다. 준비된 scFv-항원 컨쥬게이트(conjugate)를 E.coli TG1 세포에 첨가한 다음, LB/앰피실린(ampicillin)/글루코스(glucose) 아가 배지에서 37℃로 하룻밤 배양하였다. 상기 E.coli TG1 세포를 LB/앰피실린 배지로 옮겨 OD 600 값이 0.5가 될 때까지 배양한 다음, 1 X 1011 - 1 X 1012의 헬퍼 파지(helper phage)를 첨가하고 다시 1시간 동안 37℃에서 배양한 후, 카나마이신(kanamycin)을 첨가하여 다시 하룻밤 배양하였다. 하룻밤 배양한 배양액을 원심분리한 다음, 상층액을 PEG 용액과 4℃에서 반응시킨 후 다시 원심분리하여 펠렛을 분리하였다. 펠렛을 PBS에 녹인 다음, 원심분리하여 상층액을 scFv 라이브러리 용액으로 확보하였다. 이와 같은 과정을 4차례 반복하여 클라우딘 3 및 4의 항원과 특이적 결합을 하는 scFv 후보군을 확보하였다.The scFv library stock and the solid bead conjugated antigen were each blocked with 5% skim milk for 1 hour at room temperature. After removing skim milk from the blocked antigen, mixing it with scFv library stock and reacting at room temperature for 1 hour, then using a membrane filter (Corning costar Spin-X 0.45um, Cat. No. CLS8126) to scFv-antigen conjugate. It was prepared in 100 mM TEA buffer in the form of (conjugate). The prepared scFv-antigen conjugate was added to E.coli TG1 cells, and then incubated overnight at 37°C in LB/ampicillin/glucose agar medium. The E.coli TG1 cells were transferred to LB/ampicillin medium and cultured until the OD 600 value became 0.5, and then 1 X 10 11- 1 X 10 12 helper phage was added and incubated again at 37°C for 1 hour, followed by addition of kanamycin, followed by overnight incubation. After centrifuging the culture medium cultured overnight, the supernatant was reacted with the PEG solution at 4° C. and then centrifuged again to separate the pellet. The pellet was dissolved in PBS and then centrifuged to obtain a supernatant as an scFv library solution. This process was repeated four times to obtain scFv candidates that specifically bind to the antigens of claudin 3 and 4.

확보된 scFv 후보군에서 결합력이 우수한 scFv를 선별하기 위하여 각각 클라우딘 3 및 클라우딘 4 항원에 대하여 ELISA 분석을 수행하였다. 4차 패닝이 끝난 라이브러리 스톡을 LB/앰피실린(ampicillin)/글루코스(glucose) 아가 배지에서 하룻밤 배양한 다음, 각각의 단일 콜로니(single colony)를 LB/앰피실린 배지 200 ㎕에 접종하여 37℃에서 3시간 동안 배양한 다음, IPTG 농도가 1 mM이 되도록 섞어준 후 다시 30℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양이 진행되는 동안 클라우딘 3 또는 클라우딘 4 항원을 플레이트에 25 - 250 ng/well이 되도록 코팅하였다. 배양이 완료되면 배양액을 원심분리하여 세포만을 분리한 다음, TES 버퍼를 이용하여 세포를 용해시켜서 scFv를 확보하였다. 확보한 scFv를 항원이 코팅된 플레이트에 상온에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 이차 항체(anti-HA HRP, santacruz, Cat. No.sc-7392)를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 이차 항체반응이 완료되면 TMB를 첨가하여 발색반응을 시키고 ELISA 리더기(450 nm)를 이용하여 분석하였다(도 1). ELISA 분석값을 상대적으로 비교하여 상위 12개의 우수한 scFv를 1차적으로 선별하였다. 선별한 scFv들의 아미노산 서열을 분석한 결과, 다음과 같았다(표 1).ELISA analysis was performed on claudin 3 and claudin 4 antigens, respectively, in order to select scFvs having excellent binding ability from the secured scFv candidate group. After the fourth panning, the library stock was incubated overnight in LB/ampicillin/glucose agar medium, and then each single colony was inoculated in 200 µl of LB/ampicillin medium at 37°C. After incubation for 3 hours, the mixture was mixed so that the IPTG concentration was 1 mM, and then incubated overnight at 30°C. During the incubation, the claudin 3 or claudin 4 antigen was coated on the plate at a concentration of 25-250 ng/well. When the culture was completed, the culture medium was centrifuged to separate only the cells, and then the cells were lysed using a TES buffer to obtain scFv. The obtained scFv was reacted on an antigen-coated plate at room temperature for 1 hour, and then a secondary antibody (anti-HA HRP, santacruz, Cat. No. sc-7392) was added and reacted for 1 hour. When the secondary antibody reaction was completed, TMB was added to perform a color reaction and analyzed using an ELISA reader (450 nm) (FIG. 1). By comparing the ELISA analysis values relatively, the top 12 excellent scFvs were primarily selected. As a result of analyzing the amino acid sequence of the selected scFvs, it was as follows (Table 1).

경쇄Light chain 가변영역 Variable area 중쇄Heavy chain 가변영역 Variable area CDRL1CDRL1 CDRL2CDRL2 CDRL3CDRL3 CDRH1CDRH1 CDRH2CDRH2 CDRH3CDRH3 B12B12 TGSSSNIGSNAVTTGSSSNIGSNAVT ADSHRPSADSHRPS GAWDDSLNA GAWDDSLNA GYYMSGYYMS VISHDGSSTYYADSVKG VISHDGSSTYYADSVKG DARVCTPKRCYSYDAMDVDARVCTPKRCYSYDAMDV B9B9 SGSSSNIGSNAVSSGSSSNIGSNAVS ADSQRPS ADSQRPS GTWDYSLSGGTWDYSLSG SYDMSSYDMS GISYSGGSTYYADSVKG GISYSGGSTYYADSVKG APLICSNLICYSYNAMDVAPLICSNLICYSYNAMDV C10C10 TGSSSNIGSNSVSTGSSSNIGSNSVS ANSNRPSANSNRPS GTWDASLSAGTWDASLSA NYAMSNYAMS VISSSSGNTYYADSVKG VISSSSGNTYYADSVKG ALGHTHKKHFYSAYGMDVALGHTHKKHFYSAYGMDV D12D12 TGSSSNIGSNYVYTGSSSNIGSNYVY SDSKRPSSDSKRPS ASWDDSLSA ASWDDSLSA GYAMSGYAMS AISPGSGSIYYADSVKGAISPGSGSIYYADSVKG GVHDGDRRPFDYGVHDGDRRPFDY E6E6 TGSSSNIGSNAVTTGSSSNIGSNAVT ADSHRPSADSHRPS GAWDDSLNAGAWDDSLNA NYAMSNYAMS GISSDNGSTYYADSVKGGISSDNGSTYYADSVKG DAPAITVTRFDYDAPAITVTRFDY H12H12 SGSSSNIGSNNVTSGSSSNIGSNNVT SNSKRPSSNSKRPS GTWDSSLSGGTWDSSLSG NYDMSNYDMS SIYYGNSNTYYADSVKG SIYYGNSNTYYADSVKG GTSTCRHSQCYYDDAMDVGTSTCRHSQCYYDDAMDV BC4A9BC4A9 SGSSSNIGNNSVNSGSSSNIGNNSVN ADSNRPSADSNRPS GSWDDSLNG GSWDDSLNG NYSMSNYSMS AISSDGGSTYYADSVKG AISSDGGSTYYADSVKG VRSNCYSSHCSSSDAMDVVRSNCYSSHCSSSDAMDV BC4D1BC4D1 SGSSSNIGNNSVYSGSSSNIGNNSVY SDSQRPSSDSQRPS GTWDYSLNG GTWDYSLNG DYSMSDYSMS VIYSGDGSTYYADSVKG VIYSGDGSTYYADSVKG QLPWFDY QLPWFDY BC4D4BC4D4 SGSSSNIGNNDVYSGSSSNIGNNDVY SDSKRPSSDSKRPS ASWDDSLNGASWDDSLNG DYDMSDYDMS AISSSDGSIYYADSVKG AISSSDGSIYYADSVKG FTPFDYFTPFDY RC3F9RC3F9 TGSSSNIGNYYVYTGSSSNIGNYYVY ANSHRPSANSHRPS GAWDSSLSGGAWDSSLSG GYAMSGYAMS AISHGGSSKYYADSVKG AISHGGSSKYYADSVKG TRPGFDY TRPGFDY BC4H3BC4H3 TGSSSNIGNNYVNTGSSSNIGNNYVN HDSHPPSHDSHPPS GAWDYSLSAGAWDYSLSA DYYMSDYYMS AISHGGSSKYYADSVKGAISHGGSSKYYADSVKG DPTQERARLFDYDPTQERARLFDY BC4H12BC4H12 SGSSSNIGNNYVSSGSSSNIGNNYVS SDNNRPSSDNNRPS GTWDSSLSGGTWDSSLSG SYDMSSYDMS AISHSSGNTYYADSVKGAISHSSGNTYYADSVKG GRVGTPSRPSYYDAMDVGRVGTPSRPSYYDAMDV

ELISA를 통하여 선별한 scFv 후보들에 대하여 유세포 분석기(Flow cytometry)를 이용하여 scFv 후보들과 클라우딘 3 및 4를 과발현하는 세포와의 결합여부를 확인하였다(도 2). 우선, 선별한 scFv에 HA tag을 태깅(tagging)하여 anti-HA FITC 항체(Genscript, A01621)에 의해 검출이 될 수 있도록 하였다. 세포는 인간 난소암 세포주인 OVCAR-3(구입처?), CAOV-3 및 SNU8을 사용하였다. 계대배양 중인 3가지 세포를 세포 분리용 버퍼(cell dissociation buffer, Gibco, 13151-014)를 이용하여 단일 세포단위로 분리하여 PBS에 준비하였다. 세포를 대조군과 실험군으로 나누어 각 그룹마다 각각 3 × 105 세포가 들어가도록 PBS에 준비한 다음, 대조군에는 PBS, 실험군에는 선별한 scFv를 1 - 5 ug/100 ㎕(항체에 따라 다양한 농도로 사용)로 4℃에서 1시간 배양하였다. 배양이 완료되면 PBS로 세척 후 대조군에는 PBS 100 ㎕, 실험군에는 anti-HA taq FITC 항체 1 ug/100 ㎕를 처리하고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후 세척을 하고 BD FACSCalibur로 분석하였다. 대조군에 비하여 선별한 scFv 후보군에서 피크의 이동이 일어나는 것을 확인하였으며, 분석 결과 결합력이 가장 우수한 B12 scFv를 선별하게 되었다.With respect to the scFv candidates selected through ELISA, it was confirmed whether the scFv candidates and cells overexpressing claudin 3 and 4 were bound to each other using flow cytometry (FIG. 2). First, the selected scFv was tagged with an HA tag so that it could be detected by an anti-HA FITC antibody (Genscript, A01621). Cells were used as human ovarian cancer cell lines OVCAR-3 (where to buy?), CAOV-3, and SNU8. Three cells being subcultured were separated into a single cell unit using a cell dissociation buffer (Gibco, 13151-014) and prepared in PBS. Divide the cells into a control group and an experimental group, and prepare them in PBS so that each group contains 3 × 10 5 cells, and then use PBS for the control group and 1-5 ug/100 µl of the selected scFv for the experimental group (use at various concentrations depending on the antibody). It was incubated at 4°C for 1 hour. When the culture was completed, the cells were washed with PBS and treated with 100 µl of PBS and 1 ug/100 µl of anti-HA taq FITC antibody in the experimental group, followed by incubation at 4°C for 1 hour. After the culture was completed, the cells were washed and analyzed with BD FACSCalibur. Compared to the control group, it was confirmed that the peak shift occurred in the selected scFv candidate group, and as a result of the analysis, the B12 scFv having the best binding power was selected.

실시예Example 2: 전체 2: all IgGIgG 발현벡터 제작 Expression vector construction

B12 scFv의 CDR 부위를 기반으로 전체 IgG 형태를 발현할 수 있는 발현벡터를 제작하였다. B12 scFv의 경쇄 가변영역(light chain variable region)과 중쇄 가변영역(heavy chain variable region)을 각각 PCR을 통해 얻어낸 다음, 각각을 하나의 벡터에서 경쇄와 중쇄를 동시에 발현할 수 있도록 만들어진 발현벡터인 pYAB(에이비온, 대한민국)에 클로닝하였다.An expression vector capable of expressing the entire IgG form was constructed based on the CDR regions of B12 scFv. The light chain variable region and the heavy chain variable region of B12 scFv were obtained through PCR, respectively, and then pYAB, an expression vector made to simultaneously express the light and heavy chains in a single vector. (Abion, Korea) was cloned.

B12 scFv의 경쇄와 중쇄의 가변영역을 얻기 위해 사용한 프라이머는 다음과 같다:The primers used to obtain the variable regions of the light and heavy chains of B12 scFv are as follows:

경쇄F 5`-gatatcatggaaacc-3`Light chain F 5`-gatatcatggaaacc-3`

경쇄R 5`-ttaattaatcaggag-3`Light chain R 5`-ttaattaatcaggag-3`

중쇄F 5`-cctaggatggaaacc-3`Heavy chain F 5`-cctaggatggaaacc-3`

중쇄R 5`-gtatactcatttgcc-3` Heavy chain R 5`-gtatactcatttgcc-3`

발현벡터에는 경쇄 일정영역(light chain constant region, 서열목록 제97서열)과 중쇄 일정영역(heavy chain constant region, 서열목록 제98서열)이 포함되어 있다. 따라서 발현 벡터로부터 클로닝한 B12 scFv의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역과 함께 경쇄 및 중쇄 일정영역이 발현되어, 결과적으로 B12 scFv의 CDR 영역을 포함하는 전체 IgG, 즉 B12 항체가 만들어지게 된다.The expression vector includes a light chain constant region (SEQ ID NO: 97) and a heavy chain constant region (SEQ ID NO: 98). Accordingly, constant light and heavy chain regions are expressed along with the light and heavy chain variable regions of B12 scFv cloned from the expression vector, resulting in the creation of a whole IgG including the CDR regions of B12 scFv, that is, B12 antibody.

실시예Example 3: 항체 발현 세포주 제작 3: antibody-expressing cell line construction

CHO 세포주(ATCC)를 이용하여 IgG 발현 세포주를 제작하였다. 트랜스펙션 시약(freestyle MAX; Life Technologies Inc. )을 이용하여 IgG 발현 벡터를 CHO 세포주에 트랜스펙션한 다음, 발현량이 높은 세포주를 선별하기 위하여 퓨로마이신(puromycin)과 MTX(methotrexate)를 이용하여 선별 과정을 진행하였다.An IgG-expressing cell line was constructed using the CHO cell line (ATCC). After transfection of an IgG expression vector into a CHO cell line using a transfection reagent (freestyle MAX; Life Technologies Inc.), puromycin and MTX (methotrexate) were used to select a cell line with a high expression level. The screening process proceeded.

1차 과정에서는 퓨로마이신 10 ug/㎖ 및 MTX 100 nM 또는 퓨로마이신 20 ug/㎖ 및 MTX 200 nM 조건에서 선별 과정을 진행하였다. 2차 과정에서는 퓨로마이신 30 ug/㎖ 및 MTX 500 nM 또는 퓨로마이신 50 ug/㎖ 및 MTX 1000 nM 조건에서 선별 과정을 진행하였다. 2차 선별이 종료된 후, SFB(Simple Fed Batch)를 진행하여 그 중 발현양이 높은 것을 선택하였다. 선택된 배치에 대해 96 well 플레이트에서 Single cell limited dilution을 진행하였고 dot blot 방법으로 각각의 개별 세포의 발현양을 확인 하였다(도 3). 이 가운데 5개의 클론(12, 14, 16, 17, 53번)을 선별하였고, 각각에 대해 125 ㎖ 플라스크까지 scale up을 진행하면서 IgG 발현양이 가장 높은 클론(16번)을 선택하였다.In the first process, the selection process was performed under the conditions of 10 ug/ml of puromycin and 100 nM of MTX or 20 ug/ml of puromycin and 200 nM of MTX. In the second process, the selection process was performed under the conditions of 30 ug/ml of puromycin and 500 nM of MTX or 50 ug/ml of puromycin and 1000 nM of MTX. After the secondary screening was completed, SFB (Simple Fed Batch) was performed to select the ones with high expression levels. Single cell limited dilution was performed in a 96 well plate for the selected batch, and the expression level of each individual cell was confirmed by dot blot method (FIG. 3). Among these, five clones (No. 12, 14, 16, 17, and 53) were selected, and the clone with the highest IgG expression level (No. 16) was selected while scaling up to a 125 ml flask for each.

실시예Example 4: 항체의 생산 및 정제 4: Production and purification of antibodies

항체 생산 세포주를 20 L culture bag(Zacros, Cat. CBC20-1)을 이용하여 CO2 8%, 37℃, 35-40 rpm 조건으로 배양하였으며, 최종적으로 1g/L 이상 수준의 항체를 생산하였다.The antibody-producing cell line was cultured using a 20 L culture bag (Zacros, Cat. CBC20-1) under CO 2 8%, 37° C., 35-40 rpm conditions, and finally an antibody at a level of 1 g/L or more was produced.

대량 생산한 항체를 세포주와 분리하기 위하여 8000 rpm으로 원심분리하여 항체가 포함되어 있는 상층액만을 얻은 다음, ultra-filtration (LAPTOP)을 이용하여 농축을 하면서 동시에 PBS 버퍼로 변경시켜주었고, 이후 항체를 정제하기 위해 다음의 공정을 진행하였다.In order to separate the mass-produced antibody from the cell line, centrifugation was performed at 8000 rpm to obtain only the supernatant containing the antibody, and then concentrated using ultra-filtration (LAPTOP) and changed to PBS buffer at the same time. In order to purify, the following process was carried out.

(1) Protein A 정제(1) Protein A purification

Protein A 정제를 위해 레진(Mabselect SuRe), 결합/세척버퍼(Sodium phosphate, pH 7.0 및 pH 5.0) 및 용출버퍼(Sodium citrate, pH 3.6)를 사용하였다. 결합/세척버퍼는 패킹(packing)된 컬럼 부피의 5배, 용출버퍼는 10 ㎖씩 100% step gradient로 15 ㎖ 코니칼 튜브에 흘려주었다. 이 때, 15 ㎖ 튜브에 중화 반응을 위해 pH 8.0 Tris-HCl 용액을 1/10 부피만큼 미리 넣어 두었다.For Protein A purification, resin (Mabselect SuRe), binding/washing buffer (Sodium phosphate, pH 7.0 and pH 5.0) and elution buffer (Sodium citrate, pH 3.6) were used. The binding/washing buffer was 5 times the volume of the packed column, and the elution buffer was flowed into a 15 ml conical tube with a 100% step gradient of 10 ml each. At this time, 1/10 volume of a pH 8.0 Tris-HCl solution was previously put in a 15 ml tube for neutralization reaction.

(2) 이온교환 크로마토그래피(Ion exchange chromatography)(2) Ion exchange chromatography

이온 교환 크로마토그래피의 진행을 위해 B12의 pI값인 8.1 을 기반으로 하여 버퍼를 선택하고 정제를 수행하였다. Cation exchange resin인 SP sepharose(GE healthcare)를 이용하였으며, 결합버퍼(Sodium citrate, pH 5.2), 용출버퍼(Sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH 7.0)를 사용하였다. 결합버퍼는 패킹된 컬럼 부피의 5배, 용출버퍼는 10 ㎖씩 linear gradient로 15 ㎖ 코니칼 튜브에 흘려주었다.For the progress of ion exchange chromatography, a buffer was selected based on the pI value of B12, 8.1, and purification was performed. SP sepharose (GE healthcare), a cation exchange resin, was used, and a binding buffer (Sodium citrate, pH 5.2) and an elution buffer (Sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH 7.0) were used. The binding buffer was 5 times the volume of the packed column, and the elution buffer was flowed into a 15 ml conical tube with a linear gradient of 10 ml each.

(3) 소수성 상호작용 크로마토그래피 (Hydrophobic Interaction Chromatography)(3) Hydrophobic Interaction Chromatography

레진(Butyl HP sepharose, GE healthcare), 결합버퍼(Sodium phosphate, 1.5 M NaCl, pH 7.0) 및 용출버퍼(Sodium phosphate, pH 7.0)을 이용하였다. 결합버퍼는 패킹된 컬럼 부피의 5배, 용출버퍼는 10 ㎖씩 linear gradient로 15 ㎖ 코니칼 튜브에 흘려주었다.Resin (Butyl HP sepharose, GE healthcare), binding buffer (Sodium phosphate, 1.5 M NaCl, pH 7.0) and elution buffer (Sodium phosphate, pH 7.0) were used. The binding buffer was 5 times the volume of the packed column, and the elution buffer was flowed into a 15 ml conical tube with a linear gradient of 10 ml each.

(4) 사이즈 배제 크로마토그래피 (Size Exclusion Chromatography)(4) Size Exclusion Chromatography

세 번의 정제공정을 거친 항체를 크기별로 분리하기 위해 사이즈 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 우선 70-80 cm 길이의 컬럼에 레진(Sephacryl S-300 HR)을 패킹하고, PBS 용액으로 equilibration을 진행한 다음, 컬럼 부피 2배의 양을 로딩하여 분리를 진행하였다.Size exclusion chromatography was performed in order to separate the antibodies that had undergone three purification steps by size. First, resin (Sephacryl S-300 HR) was packed in a 70-80 cm long column, followed by equilibration with a PBS solution, and then separated by loading twice the volume of the column.

실시예Example 5: 정제된 항체의 순도 확인 5: Confirmation of the purity of the purified antibody

정제된 항체의 순도를 확인하기 위하여 HCP 분석, HCD 분석 및 Protein A 분석을 수행하였다.In order to confirm the purity of the purified antibody, HCP analysis, HCD analysis, and Protein A analysis were performed.

(1) HCP (Host Cell Protein) 분석(1) HCP (Host Cell Protein) analysis

HCP 분석은 정제된 항체에 생산세포의 단백질이 어느 정도 남아있는지를 검출하는 방법으로서 분석을 위해 CHO HCP 분석 키트(CHO HCP assay kit, F015, Cygnus Tech.)를 제작자의 매뉴얼에 따라 사용하였다. 분석결과, 정제된 B12 항체에서의 흡광도가 0.0012이하로 나왔으며 이는 정제된 항체에 HCP의 혼입이 없다는 것을 보여주는 것이다(도 4).HCP analysis is a method of detecting how much protein of producing cells remains in the purified antibody. For analysis, a CHO HCP assay kit (F015, Cygnus Tech.) was used according to the manufacturer's manual. As a result of the analysis, the absorbance in the purified B12 antibody was 0.0012 or less, which indicates that there is no incorporation of HCP in the purified antibody (FIG. 4).

(2) HCD (Host Cell DNA) 분석(2) HCD (Host Cell DNA) analysis

HCD 분석은 정제된 항체에 생산세포의 DNA가 어느 정도 남아있는지를 검출하는 방법으로서 분석을 위해 CHO HCD 분석 키트(CHO HCD assay kit, Cygnus Tech.)를 제작자의 매뉴얼에 따라 사용하였다. 분석결과, 정제된 B12 항체에서의 형광값이 2.69이하로 나왔는데, 이는 스탠다드의 0 ng/㎖ 의 값에 근접한 수치로서 HCD의 혼입이 없다는 것을 보여주는 것이다.HCD analysis is a method of detecting how much DNA of producing cells remains in the purified antibody, and for analysis, a CHO HCD assay kit (Cygnus Tech.) was used according to the manufacturer's manual. As a result of the analysis, the fluorescence value of the purified B12 antibody was 2.69 or less, which is a value close to the value of 0 ng/ml of the standard, indicating that there is no incorporation of HCD.

(3) Protein A 분석(3) Protein A analysis

정제된 항체에 정제될 때 사용되었던 Protein A가 얼마나 있는지를 검출하기 위하여 Protein A 분석키트(Protein A assay kit, F400Z, Cygnus Tech.)를 제작자의 메뉴얼에 따라 사용하였다. 분석결과 흡광도가 0.121이하로 나왔으며 이는 정제된 항체에 Protein A의 혼입이 없다는 것을 보여주는 것이다(도 5).Protein A assay kit (F400Z, Cygnus Tech.) was used according to the manufacturer's manual in order to detect how much Protein A was used when the purified antibody was purified. As a result of the analysis, the absorbance was 0.121 or less, which indicates that there is no incorporation of Protein A into the purified antibody (FIG. 5).

실시예Example 6: 개발된 항체의 결합 친화성( 6: Binding affinity of the developed antibody ( bindingbinding affinityaffinity ) 확인) Confirm

B12 항체의 클라우딘 3 및 클라우딘 4에 대한 결합 친화성을 확인하기 위하여 유세포계수법(Flow cytometry), 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 분석 및 면역침강법(Immunoprecipitation)을 수행하였다.To confirm the binding affinity of the B12 antibody to claudin 3 and claudin 4, flow cytometry, surface plasmon resonance (SPR) analysis, and immunoprecipitation were performed.

(1) 유세포계수법(Flow cytometry)(1) Flow cytometry

양성 대조군 항체(positive antibody)로 상업적으로 구입이 가능한 인간 클라우딘 3 항체(human claudin-3 flourescein Mab, FAB4620F, R&D)와 인간 클라우딘 4 항체(human claudin-4 flourescein Mab, FAB4219F, R&D)를 사용하였다. 이차 항체로 goat anti-human IgG-FITC(SantaCruz biotechnology, sc-2456)를 사용하였다. 세포는 양성 대조군으로 클라우딘 3와 4를 과발현하는 것으로 알려져 있는 인간 난소암 세포인 OVCAR-3(ATCC), 음성대조군으로 클라우딘 3와 4의 발현이 매우 낮은 것으로 알려져 있는 TOV-112D(ATCC)를 사용하였다. 각각의 세포를 세포 분리 버퍼(cell dissociation buffer, Gibco, 13151-014)를 이용하여 단일 세포 단위로 준비한 다음, 각각 3 × 105 세포에 대조군에는 PBS를, 실험군에는 B12 항체(1 ug/100 ㎕ 또는 2 ug/100 ㎕)를 처리한 후 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양이 완료되면 PBS로 세척한 후 대조군에는 구입한 인간 클라우딘 3 또는 4에 대한 항체를 1 ug/100 ㎕ 처리하거나 PBS만을 100 ㎕ 처리하였고, 실험군에는 이차 항체인 goat anti-human IgG-FITC를 처리하고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후 PBS로 세척한 다음, BD FACSCalibur를 이용하여 분석하였다. 분석결과, B12 항체는 대조군 항체 중 인간 클라우딘 3 또는 4 항체와 유사하게 양성대조군 세포인 OVCAR-3에서는 피크의 이동(peak shift)을 나타내었으며, 음성대조군 세포인 TOV-112D에서는 피크의 이동(peak shift)을 나타내지 않았다(도 7). 이러한 결과는 B12 항체가 상업적으로 구입 가능한 인간 클라우딘 3 또는 4에 대한 항체와 유사하게 난소암 세포에 대해 결합 친화성이 있다는 것을 보여주는 것이다.As positive control antibodies, commercially available human claudin-3 flourescein Mab (FAB4620F, R&D) and human claudin-4 antibody (human claudin-4 flourescein Mab, FAB4219F, R&D) were used. As a secondary antibody, goat anti-human IgG-FITC (SantaCruz biotechnology, sc-2456) was used. The cells used OVCAR-3 (ATCC), a human ovarian cancer cell known to overexpress claudin 3 and 4 as a positive control, and TOV-112D (ATCC), which is known to have very low expression of claudin 3 and 4 as a negative control. I did. Each cell was prepared in a single cell unit using a cell dissociation buffer (Gibco, 13151-014), and then PBS was used for the control group and B12 antibody (1 ug/100 µl ) was used in the experimental group for each 3 × 10 5 cells. Alternatively, 2 ug/100 µl) was treated and incubated at 4°C for 1 hour. After cultivation was completed, washed with PBS and treated with 1 ug/100 µl of the purchased antibody against human claudin 3 or 4 in the control group, or 100 µl of PBS alone, and the experimental group was treated with goat anti-human IgG-FITC, a secondary antibody. And incubated at 4° C. for 1 hour. After the culture was completed, it was washed with PBS, and then analyzed using BD FACSCalibur. As a result of analysis, B12 antibody showed a peak shift in OVCAR-3, a positive control cell, similar to human claudin 3 or 4 antibody among control antibodies, and a peak shift in TOV-112D, a negative control cell. shift) was not shown (Fig. 7). These results show that the B12 antibody has a binding affinity for ovarian cancer cells similar to those of commercially available antibodies against human claudin 3 or 4.

(2) 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 분석(2) Surface Plasmon Resonance (SPR) analysis

SPR kinetics 분석은 항원만 존재할 때와 항원-항체 복합체가 존재할 때의 공명각이 다른 것을 이용하여 항원-항체 복합체가 얼마나 형성되었는지를 알아볼 수 있는 방법이다. 리간드로 B12 항체 제작에 사용한 항원인 클라우딘 3 또는 4 펩타이드를, analyte로 B12 항체를 사용하였으며 SR7000 Gold sensor slide (Reichert Inc, 13206061)를 이용하여 SPR 분석을 진행하였다. SPR system(Reichert Inc, SR7500DC)에 gold sensor slide를 장착한 다음, PBS(sonication)로 센서안정화를 진행하였다. 센서가 안정화된 그래프를 형성하면 0.2 M EDC와 0.05 M NHS를 1:1 비율로 혼합한 시약으로 센서를 활성화 시킨 다음, 준비한 리간드를 고정용 버퍼(Immobilization buffer)에 용해시켜 센서의 검출 채널(detection chanel) 에 흘리면서 붙여주었다. 리간드가 충분히 센서에 붙으면 1 M ethanolamine으로 블록킹을 해준 다음, B12 항체를 흘려 보내면서 kinetic를 분석하였다(도 8). 분석결과, B12 항체의 kinetic value는 1.92(2) nM로 나타났으며, 이는 B12 항체가 클라우딘 3 및 4에 대해 높은 결합 친화성을 지고 있다는 것을 보여주는 것이다.SPR kinetics analysis is a method that can determine how much antigen-antibody complexes are formed by using different resonance angles when only antigen is present and when antigen-antibody complex is present. As a ligand, claudin 3 or 4 peptide, which is an antigen used to prepare a B12 antibody, was used as an analyte, and a B12 antibody was used, and SPR analysis was performed using an SR7000 Gold sensor slide (Reichert Inc, 13206061). After mounting the gold sensor slide on the SPR system (Reichert Inc, SR7500DC), sensor stabilization was performed with PBS (sonication). When the sensor is stabilized, the sensor is activated with a reagent in which 0.2 M EDC and 0.05 M NHS are mixed in a 1:1 ratio, and then the prepared ligand is dissolved in an immobilization buffer to detect the detection channel of the sensor. chanel) and pasted. When the ligand was sufficiently attached to the sensor, blocking was performed with 1 M ethanolamine, and then the kinetic was analyzed while flowing the B12 antibody (FIG. 8). As a result of the analysis, the kinetic value of the B12 antibody was 1.92(2) nM, which indicates that the B12 antibody has high binding affinity to claudin 3 and 4.

(3) 면역침강법(Immunoprecipitation)(3) Immunoprecipitation

대조군 항체(positive antibody)로 상업적으로 구입이 가능한 인간 클라우딘 3 항체(human claudin-3 flourescein Mab, FAB4620F, R&D)를 사용하였다. 세포는 양성 대조군으로 클라우딘 3와 4를 과발현하는 것으로 알려져 있는 인간 난소암 세포인 OVCAR-3(ATCC)를 사용하였다. OVCAR-3 세포를 배양하여 수집한 다음 원심분리하여 세포만을 분리하고 프로테아제 차단제(Protease inhibitor)가 첨가된 PBS에 풀어주었다. 1 ㎖ 주사기를 활용하여 세포를 10번 정도 펌핑하여 세포를 파쇄시켰다. 4℃ 5000 rpm에서 5분동안 원심분리한 다음, 상층액만을 새로운 튜브에 수거하여 다시 한 번 4℃ 10000 g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액만을 분리하였다.As a control antibody (positive antibody), a commercially available human claudin-3 antibody (human claudin-3 flourescein Mab, FAB4620F, R&D) was used. As a positive control, OVCAR-3 (ATCC), a human ovarian cancer cell known to overexpress claudin 3 and 4, was used as a positive control. OVCAR-3 cells were cultured and collected, then centrifuged to separate only the cells, and released in PBS to which a protease inhibitor was added. The cells were disrupted by pumping the cells about 10 times using a 1 ml syringe. After centrifugation at 4°C for 5 minutes at 5000 rpm, only the supernatant was collected in a new tube and once again centrifuged at 4°C for 10 minutes at 10000 g to separate only the supernatant.

상층액에서 단백질을 일반적인 방법에 따라 정량한 다음, 각 샘플당 1 mg의 단백질이 들어가도록 튜브에 분주하고, 각 튜브에 항체(인간 전체 IgG, 클라우딘 3항체, B12 항체)를 넣어준 후 4℃에서 30분에서 1시간 동안 회전시키면서 항체와 단백질간 결합반응이 일어나도록 하였다. 항체가 결합반응을 하는 동안, Protein A bead (Roche)를 준비하였다. 비드를 튜브로 옮겨 프로테아제 차단제(Protease inhibitor)가 첨가된 PBS에 3번 세척하여 평형화(equilibration) 시켜주었다. 비드를 샘플 당 50 ㎕씩 들어가도록 프로테아제 차단제(Protease inhibitor)가 첨가된 PBS에 풀어주었다. 항체 결합반응이 끝난 샘플에 각각 50 ㎕씩 비드를 첨가한 다음, 다시 4℃에서 1시간 동안 회전시키면서 비드 결합반응을 진행하였다. 비드 결합반응이 완료되면, 프로테아제 차단제(Protease inhibitor)가 첨가된 PBS로 3번 세척한 다음, 2x 샘플 버퍼 30 ㎕씩을 넣어주고 볼텍싱을 하였다. 100℃에서 5분 동안 끓여준 다음, 스핀 다운(spin down) 하여 통해 비드를 침강시켰다. 상층액만을 분리하여 12% SDS gel에서 전기영동을 수행한 다음, 일반적인 방법에 따라 웨스턴 블랏팅을 수행하였다(도 9). 분석결과, B12항체에 의해 항체 농도 의존적으로 클라우딘 3가 면역침강되는 것을 확인하였다. After quantifying the protein in the supernatant according to the general method, dispense into tubes so that 1 mg of protein per sample is contained, and antibody (human whole IgG, claudin 3 antibody, B12 antibody) is added to each tube, and then 4℃ Rotating for 30 minutes to 1 hour was allowed to cause a binding reaction between the antibody and the protein. During the binding reaction of the antibody, Protein A bead (Roche) was prepared. The beads were transferred to a tube and washed three times in PBS to which a protease inhibitor was added to equilibrate. Beads were released in PBS to which a protease inhibitor was added so that 50 µl per sample was added. Each 50 µl of beads was added to the sample after the antibody-binding reaction was completed, and the bead-binding reaction was performed while rotating at 4°C for 1 hour. When the bead binding reaction was completed, the mixture was washed 3 times with PBS to which a protease inhibitor was added, and then 30 µl of 2x sample buffer was added and vortexed. After boiling at 100° C. for 5 minutes, the beads were settled through spin down. After separating only the supernatant, electrophoresis was performed on a 12% SDS gel, and then Western blotting was performed according to a general method (FIG. 9). As a result of the analysis, it was confirmed that claudin 3 was immunoprecipitated by antibody concentration-dependently by the B12 antibody.

실시예Example 7: 개발된 항체의 세포독성 확인 7: Confirmation of cytotoxicity of the developed antibody

B12 항체의 세포독성을 확인하기 위하여 Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity(ADCC)와 Complement dependent cytotoxicity(CDC)를 수행하였다. Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and Complement dependent cytotoxicity (CDC) were performed to confirm the cytotoxicity of the B12 antibody.

(1) Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity(ADCC)(1) Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC)

ADCC를 확인하기 위해 ADCC Reporter Bioassay Kit(Promega, G7014)를 사용하였다. 분석키트에 포함되어 있는 RPMI 1640 배지 33.6 ㎖에 IgG 혈청 1.4 ㎖을 넣어 ADCC 분석용 버퍼를 만들어 37 ℃에 놓아두었다. 키트에 포함되어 있는 대조군 항체인 anti-CD20 및 B12 항체의 연속적 희석(serial dilution)을 수행하였으며, 항체의 희석은 v-bottom 96-well 플레이트에 전체 부피가 150 ㎕가 되도록 하였다. 키트에 들어 있는 타겟 세포인 WIL2-S를 녹인 다음, 플레이트에 분주하였다. 타겟 세포의 분주는 75 ㎕ ADCC 분석용 버퍼(assay buffer) 당 약 10,000개의 세포가 분주될 수 있도록 하였다. 세포를 분주한 다음, 미리 희석하여 준비해 두었던 항체를 25 ㎕씩 처리하였다. 키트에 포함되어 있는 이펙터(effector) 세포 630 ㎕를 3.6 ㎖의 분석용 버퍼에 녹인 다음, 각 well 당 25 ㎕씩 넣어주고 37 ℃ CO2 배양기에서 12시간 동안 배양하였다. 배양이 완료되면 플레이트를 15분 동안 상온에 보관한 뒤, Bio-Glo 루시퍼라제(luciferase) 분석용 버퍼와 기질(substrate)을 섞어 미리 준비한 루시퍼라제 분석용 시약을 75 ㎕씩 넣어주었다. 5-30분 후, 루미네선스(luminescence)를 측정하였다(도 10). 분석 결과, 대조군인 IgG의 EC50 값과 상응하는 B12의 EC50 값이 16.0 ng/㎖ 라는 것을 확인하였다.To check ADCC, ADCC Reporter Bioassay Kit (Promega, G7014) was used. Into 33.6 ml of RPMI 1640 medium included in the assay kit, 1.4 ml of IgG serum was added to prepare a buffer for ADCC analysis and placed at 37°C. Serial dilution of the anti-CD20 and B12 antibodies, which are control antibodies included in the kit, was performed, and the dilution of the antibodies was performed so that the total volume was 150 µl in a v-bottom 96-well plate. The target cell WIL2-S contained in the kit was dissolved and then dispensed onto a plate. The target cells were dispensed so that about 10,000 cells per 75 μl ADCC assay buffer could be dispensed. After dispensing the cells, 25 µl of the antibodies prepared by diluting in advance were treated. 630 µl of effector cells included in the kit was dissolved in 3.6 ㎖ of analysis buffer, and then 25 µl of each well was added and incubated in a 37°C CO 2 incubator for 12 hours. When the incubation was completed, the plate was stored at room temperature for 15 minutes, and 75 µl of a luciferase assay reagent prepared in advance was added by mixing a Bio-Glo luciferase assay buffer and a substrate. After 5-30 minutes, luminescence was measured (FIG. 10). Analysis to result in finding that the EC 50 value of B12 and the corresponding EC 50 values of the IgG control group of 16.0 ng / ㎖.

(2) Complement dependent cytotoxicity (CDC)(2) Complement dependent cytotoxicity (CDC)

CDC 분석을 위해 CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay Kit(Promega)를 사용하였다. 키트에 들어있는 타겟 세포를 각 well 25 ㎕ 당 5,000개 세포가 들어가도록 분주하여 배양하였다. 배양한 타겟세포를 각 well 당 25 ㎕씩 넣어준 다음 항체(25 ㎕/well)를 처리하고 37 ℃에서 30분 동안 배양하였다. 각 well 당 인간 혈청(Sigma)을 50 ㎕씩 첨가한 후, 37 ℃에서 6시간 동안 배양하였다. 배양이 완료되면 각 well 당 Cytotox-Glo mixture를 50 ㎕씩 넣어준 후, 상온에서 15분 동안 배양하였다. 플레이트 리더기를 이용하여 RLU 값을 측정하였다. 다시 용해 버퍼(Lysis buffer)를 50 ㎕씩 첨가한 후, 상온에서 30분 동안 배양하였다. 플레이트 리더기를 이용하여 RLU 값을 측정하였다. 세포의 용해 전후의 RLU 값을 비교하여 세포 독성(cytotoxicity)을 분석하였다(도 11).CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay Kit (Promega) was used for CDC analysis. The target cells contained in the kit were dispensed and cultured to contain 5,000 cells per 25 μl of each well. The cultured target cells were added at a rate of 25 μl per well, and then treated with an antibody (25 μl/well) and incubated at 37° C. for 30 minutes. 50 µl of human serum (Sigma) was added to each well, and then incubated at 37° C. for 6 hours. When the cultivation was completed, 50 µl of the Cytotox-Glo mixture was added to each well, followed by incubation at room temperature for 15 minutes. The RLU value was measured using a plate reader. After 50 µl of Lysis buffer was added again, it was incubated at room temperature for 30 minutes. The RLU value was measured using a plate reader. Cytotoxicity was analyzed by comparing RLU values before and after lysis of cells (FIG. 11).

실시예Example 8: 개발된 항체의 난소암 성장 억제 효능 8: ovarian cancer growth inhibitory effect of the developed antibody

개발된 B12 항체의 농도에 따른 항암 효과를 확인하기 위하여 마우스 모델을 이용하였다. 우선 난소암이 유발된 마우스 모델을 확립하기 위해 6-8주령이 된 흉선이 없는 누드 마우스(athymic nude mouse, AthymicNude - Foxn1nu, Harlan Laboratories, Italy)를 사용하였으며, 이종 이식 모델(xenograft model)을 만들 세포주로 난소암 세포주인 OVCAR-3(ATCC)를 사용하였다. OVCAR-3 세포주를 2 × 106 cells/㎖ 되도록 PBS에 준비한 다음, matrigel(Corning, Cat.No 354248)를 세포와 100 ㎕: 100 ㎕로 섞어서 얼음에 보관하였다. 마우스를 마취한 다음, 준비한 matrigel과 섞여있는 세포를 주사기를 이용하여 피하로 투여하였다. 일정기간 동안 종양 덩어리(tumor mass)의 생성 여부를 관찰하였으며(도 12), 종양이 약 65 - 100 mm3의 크기로 성장한 시점에 마우스들을 각각의 실험그룹으로 나누어 약물처리를 시작하였다.A mouse model was used to confirm the anticancer effect according to the concentration of the developed B12 antibody. First, to establish a mouse model in which ovarian cancer is induced, a nude mouse (athymic nude mouse, AthymicNude - Foxn1nu , Harlan Laboratories, Italy) aged 6-8 weeks was used, and a xenograft model was created. OVCAR-3 (ATCC), an ovarian cancer cell line, was used as the cell line. The OVCAR-3 cell line was prepared in PBS so as to be 2 × 10 6 cells/ml, and then matrigel (Corning, Cat.No 354248) was mixed with the cells in 100 µl: 100 µl and stored on ice. After anesthetizing the mouse, cells mixed with the prepared matrigel were administered subcutaneously using a syringe. It was observed whether a tumor mass was generated for a certain period of time (FIG. 12 ), and when the tumor grew to a size of about 65-100 mm 3 , the mice were divided into each experimental group and drug treatment was started.

그룹은 다섯 개로 나누어 실험을 진행하였다. 첫 번째 그룹은 대조군으로 hIgG만을 투여하였으며, 두 번째 그룹은 다른 대조군으로 난소암의 주요 항암제인 카르보플라틴(carboplatin, 8 mg/kg)을 투여하였다. 세 번째 그룹은 저용량의 B12 항체(20 mg/kg)를 투여하였으며, 네 번째 그룹은 고용량의 B12 항체(50 mg/kg)를 투여하였다. 다섯 번째 그룹은 카르보플라틴과 B12 항체의 시너지 효과를 확인하기위하여 B12 항체(20 mg/kg)와 카르보플라틴 (8 mg/kg)를 병용투여하였다. B12 항체와 카르보플라틴 투여는 복강내 주사방법으로 3일 간격으로 일주일에 2회씩 총 4주간 투여하였다.The group was divided into five and the experiment was conducted. The first group was administered only hIgG as a control group, and the second group was administered carboplatin (8 mg/kg), a major anticancer drug for ovarian cancer, as another control group. The third group was administered a low dose of B12 antibody (20 mg/kg), and the fourth group was administered a high dose of B12 antibody (50 mg/kg). The fifth group was co-administered with B12 antibody (20 mg/kg) and carboplatin (8 mg/kg) to confirm the synergistic effect of carboplatin and B12 antibody. B12 antibody and carboplatin were administered by intraperitoneal injection, twice a week, for a total of 4 weeks.

실험결과, 고용량의 B12 항체(1 mg)를 투여한 경우, 대조군과 비교하여 종양의 부피가 40 % 정도 줄어든 것을 확인하였다(도 13, p value < 0.05). 또한 B12 항체와 카르보플라틴을 병용 투여하는 경우, 카르보플라틴 단독 투여와 비교하여 종양의 부피가 30 % 정도 줄어든 것을 확인하였다(도 14, p value < 0.01).As a result of the experiment, when a high dose of B12 antibody (1 mg) was administered, it was confirmed that the tumor volume was reduced by about 40% compared to the control group (Fig. 13, p value <0.05). In addition, when the B12 antibody and carboplatin were administered in combination, it was confirmed that the tumor volume was reduced by about 30% compared to the administration of carboplatin alone (FIG. 14, p value <0.01).

이러한 결과는 B12 항체가 난소암 치료에 효과적이며, 또한 기존의 난소암 치료제인 carboplatin과 병용 투여시 시너지 효과를 나타낼 수 있다는 것을 보여주는 것이다.These results show that the B12 antibody is effective in the treatment of ovarian cancer, and can exhibit a synergistic effect when administered in combination with carboplatin, a conventional ovarian cancer treatment.

실시예Example 9: 개발된 항체와 기존 항체의 9: The developed antibody and the existing antibody 에피토프Epitope 비교 compare

CPE(Clostridium perfringens enterotoxin)는 클라우딘 3 또는 4의 두 번째 루프에 결합하는 것으로 알려져 있으며, 기존에 보고된 클라우딘 항체의 경우 클라우딘과의 결합부위에 있어 CPE(Clostridium perfringens enterotoxin)와는 경쟁하지 않는 것으로 알려져 있다(Characterization and Evaluation of the Antitumour Activity of a Dual-targeting Monoclonal Antibody against Claudin-3 and Claudin-4. Mariko Kato-Nakano et al., Anticancer Research 30: 4555-4562 (2010)).CPE (Clostridium perfringens enterotoxin) is known to bind to the second loop of claudin 3 or 4, and the previously reported claudin antibody does not compete with CPE (Clostridium perfringens enterotoxin) in the binding site to claudin. (Characterization and Evaluation of the Antitumour Activity of a Dual-targeting Monoclonal Antibody against Claudin-3 and Claudin-4.Mariko Kato-Nakano et al., Anticancer Research 30: 4555-4562 (2010)).

본 발명에서 개발한 B12 항체의 경우 클라우딘과의 결합부위에 있어 CPE와 경쟁하는지를 확인하기 위하여 유세포 분석방법(Flow cytometry)을 이용하여 분석하였다. 항체는 goat anti-human IgG-FITC(SantaCruz biotechnology, sc-2456)와 strepavidin-FITC(eBioscience, 11-4317-87)를 사용하였으며, CPE는 바이오티닐래이션 컨쥬게이션(biotinylation conjugation)으로 제작하여 DMSO에 준비하였다.In the case of the B12 antibody developed in the present invention, it was analyzed using flow cytometry to determine whether it competes with CPE in the binding site with claudin. Antibodies were goat anti-human IgG-FITC (SantaCruz biotechnology, sc-2456) and strepavidin-FITC (eBioscience, 11-4317-87), and CPE was prepared by biotinylation conjugation and DMSO I prepared it.

세포는 양성 대조군으로 클라우딘 3/4를 과발현하는 것으로 알려진 OVCAR-3(ATCC) 세포를 사용하였고, 음성 대조군으로 클라우딘 3/4를 거의 발현하지 않는 것으로 알려져 있는 TOV-112D(ATCC) 세포와 HT-1080(ATCC) 세포를 사용하였다.As a positive control, OVCAR-3 (ATCC) cells known to overexpress claudin 3/4 were used, and as a negative control, TOV-112D (ATCC) cells known to hardly express claudin 3/4 and HT- 1080 (ATCC) cells were used.

세포를 세포 분리 버퍼(cell dissociation buffer, Gibco, 13151-014)를 이용하여 단일 세포 단위로 준비한 후, 3 × 105 개의 세포가 들어가도록 분주하였다. 대조군에는 PBS를 처리하였고, 실험군에는 CPE를 농도별(20,40, 80 ug)로 처리한 후 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 배양이 완료되면 PBS로 세척한 후 대조군에는 PBS, 실험군에는 B12 항체를 1ug/100ul로 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양이 완료되면 PBS로 세척한 후 대조군에는 PBS, 실험군은 goat anti-human IgG-FITC 1 ug/100 ㎕를 처리하고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후 PBS로 세척한 후 BD FACSCalibur로 분석하였다. 분석 결과, CPE의 농도를 높일수록 B12 항체의 결합 피크의 이동(binding peak shift)이 감소하는 것을 확인하였다(도 15). 이와 같은 결과는 B12항체가 CPE와 경쟁적으로 클라우딘 3 또는 4의 두 번째 루프에 결합하는 것을 보여주는 것이며, 본 발명의 개발된 항체가 기존에 보고된 항체와는 결합부위가 다르다는 것을 보여주는 것이다.Cells were prepared in a single cell unit using a cell dissociation buffer (Gibco, 13151-014), and then 3 × 10 5 cells were dispensed. The control group was treated with PBS, and the experimental group was treated with CPE at different concentrations (20, 40, 80 ug) and incubated at room temperature for 1 hour. After cultivation was completed, the cells were washed with PBS and incubated with PBS for the control group and 1 ug/100ul of B12 antibody for the experimental group at 4°C for 1 hour. After cultivation was completed, it was washed with PBS, and the control group was treated with PBS, and the experimental group was treated with 1 ug/100 µl of goat anti-human IgG-FITC and incubated at 4° C. for 1 hour. After the culture was completed, washed with PBS and analyzed with BD FACSCalibur. As a result of the analysis, it was confirmed that as the concentration of CPE increased, the binding peak shift of the B12 antibody decreased (FIG. 15). These results show that the B12 antibody binds to the second loop of claudin 3 or 4 competitively with CPE, and shows that the developed antibody of the present invention has a different binding site from the previously reported antibody.

실시예Example 10: 개발된 항체의 친화도 증진 10: enhancing the affinity of the developed antibody

개발된 B12 항체의 친화도를 증진시키기 위하여 경쇄 셔플링(Light chain shuffling)과 2 슬라이드 방식을 병행하여 이용하였다.In order to enhance the affinity of the developed B12 antibody, light chain shuffling and a two-slide method were used in parallel.

경쇄 셔플링을 위해 B12 항체의 중쇄 가변영역을 유지하면서, 경쇄 가변영역의 CDR 부분이 무작위로 서로 다른 PCR 생성물을 만들었다. 이를 위해 상기 실시예 1에서 사용한 라이브러리에서 표 2의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.While maintaining the heavy chain variable region of the B12 antibody for light chain shuffling, PCR products having different CDR portions of the light chain variable region were made at random. To this end, PCR was performed using the primers in Table 2 in the library used in Example 1.

PCR 생성물을 상기 실시예 2의 전체 IgG 발현 벡터의 제작과 동일한 방식으로 발현 벡터에 클로닝하였다The PCR product was cloned into an expression vector in the same manner as in the preparation of the whole IgG expression vector of Example 2.

PrimerPrimer 5` -> 3`5` -> 3` LshLsh -F-F CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCC CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCC LshLsh -R -R GGGTGGCTGAGTCAGCACAGACTGGGGTGGCTGAGTCAGCACAGACTG

2 슬라이드 방식은 B12 항체의 중쇄서열을 유지하면서, 경쇄 가변영역 중 CDR3 부분만을 변경하기 위한 방법으로서, CDR3 전제 서열 중 일부분을 NNKNNK sequence(N : A + C + G + T, K : T + G)가 포함된 프라이머로 PCR을 수행하여 CDR3 부분만을 무작위로 변경하는 방법이다. 이를 위해 상기 실시예 1에서 사용한 라이브러리에서 1차적으로 경쇄부분의 CDR3를 제외한 부분(프라이머: pC3X-F, H-R)과 CDR3 부분(프라이머: 2SLIDE-F, pC3X-B)만이 생성되도록 PCR을 수행하고 다시 2차적으로 변경된 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역 전체가 생성되도록(프라이머: pC3X-F, pC3X-B) PCR을 수행하였다(표 3, 도 16). 이렇게 얻어진 PCR 생성물을 실시예 2의 전체 IgG 발현 벡터의 제작과 동일한 방식으로 발현벡터에 클로닝하였다.2 The slide method is a method for changing only the CDR3 portion of the light chain variable region while maintaining the heavy chain sequence of the B12 antibody.Part of the entire CDR3 sequence is NNKNNK sequence (N: A + C + G + T, K: T + G. This is a method of randomly changing only the CDR3 portion by performing PCR with a primer containing ). To this end, PCR was performed so that only portions (primers: pC3X-F, HR) and CDR3 portions (primers: 2SLIDE-F, pC3X-B) excluding CDR3 of the light chain portion were first generated in the library used in Example 1, and PCR was performed to generate the entire light chain variable region including the secondly modified CDR3 (primers: pC3X-F, pC3X-B) (Table 3, Fig. 16). The PCR product thus obtained was cloned into an expression vector in the same manner as in the preparation of the whole IgG expression vector of Example 2.

PrimerPrimer 5` -> 3`5` -> 3` pC3XpC3X -F-F GCACGACAGGTTTCCCGACGCACGACAGGTTTCCCGAC H-RH-R ACAGTAATAATCAGCCTCATCCTC(GAGGATGAGGCTGATTATTACTGT)ACAGTAATAATCAGCCTCATCCTC(GAGGATGAGGCTGATTATTACTGT) 22 SLIDESLIDE - 1 - One GAGGCTGATTATTACTGTNNKNNKTGGGATGATAGCCTGAATGAGGCTGATTATTACTGTNNKNNKTGGGATGATAGCCTGAAT 22 SLIDESLIDE - 2 - 2 GAGGCTGATTATTACTGTGGTNNKNNKGATGATAGCCTGAATGCTGAGGCTGATTATTACTGTGGTNNKNNKGATGATAGCCTGAATGCT 22 SLIDESLIDE - 3 -3 GAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTNNKNNKGATAGCCTGAATGCTTATGAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTNNKNNKGATAGCCTGAATGCTTAT 22 SLIDESLIDE - 4 - 4 GAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGNNKNNKAGCCTGAATGCTTATGTCGAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGNNKNNKAGCCTGAATGCTTATGTC 22 SLIDESLIDE - 5 -5 GAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGGATNNKNNKCTGAATGCTTATGTCTTCGAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGGATNNKNNKCTGAATGCTTATGTCTTC 22 SLIDESLIDE - 6 -6 GAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGGATGATNNKNNKAATGCTTATGTCTTCGGCGAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGGATGATNNKNNKAATGCTTATGTCTTCGGC 22 SLIDESLIDE - 7 -7 GAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGGATGATAGCNNKNNKGCTTATGTCTTCGGCGGAGAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGGATGATAGCNNKNNKGCTTATGTCTTCGGCGGA 22 SLIDESLIDE - 8 - 8 GAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGGATGATAGCCTGNNKNNKTATGTCTTCGGCGGAGGCGAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGGATGATAGCCTGNNKNNKTATGTCTTCGGCGGAGGC pC3XpC3X -B-B AACCATCGATAGCAGCACCGAACCATCGATAGCAGCACCG

상기 두 가지 방법을 통하여 친화도가 증진된 항체 10개를 선별하였다. 선별된 항체들의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 분석한 결과, 다음과 같았다(표 4).Ten antibodies with improved affinity were selected through the above two methods. As a result of analyzing the amino acid sequence of the light chain variable region of the selected antibodies, it was as follows (Table 4).

경쇄Light chain 가변영역 Variable area CDRL1CDRL1 CDRL2CDRL2 CDRL3CDRL3 B12B12 TGSSSNIGSNAVTTGSSSNIGSNAVT ADSHRPSADSHRPS GAWDDSLNA GAWDDSLNA B1B1 TGSSSNIGSNAVTTGSSSNIGSNAVT ADSHRPSADSHRPS GAWDDVPNA GAWDDVPNA B2B2 TGSSSNIGSNAVTTGSSSNIGSNAVT ADSHRPSADSHRPS GAWDDNPNAGAWDDNPNA D7D7 TGSSSNIGSNAVTTGSSSNIGSNAVT ADSHRPSADSHRPS GAWDDSPDAGAWDDSPDA D9D9 TGSSSNIGSNAVTTGSSSNIGSNAVT ADSHRPSADSHRPS GAWDDSLGFGAWDDSLGF D10D10 TGSSSNIGSNYVSTGSSSNIGSNYVS ANSQRPS ANSQRPS AAWDDSLSGAAWDDSLSG D11D11 TGSSSNIGNNYVS TGSSSNIGNNYVS ADSQRPS ADSQRPS ATWDDSLNGATWDDSLNG G2G2 TGSSFNIGSNYVSTGSSFNIGSNYVS ADSQRPS ADSQRPS ATWDDSLNGATWDDSLNG G7G7 TGSSSNIGSNYVTTGSSSNIGSNYVT ADNHRPSADNHRPS GAWDDSLNGGAWDDSLNG G8G8 SGSSSNIGSNYVT SGSSSNIGSNYVT ANSKRPSANSKRPS GSWDDSLNG GSWDDSLNG H5H5 TGSSSNIGSNYVSTGSSSNIGSNYVS ADSQRPSADSQRPS ATWDDSLNG ATWDDSLNG

친화도를 증진시킨 항체들의 결합 친화성을 확인하기 위하여 상기 서술한 유세포분석기(flow cytometry)를 이용하는 방법을 사용하여 OVCAR-3 세포에서 항체들의 결합 친화성을 분석하였다. 분석결과, 상업적으로 구입한 클라우딘 3/4 항체의 결합 피크의 이동(binding peak shift)과 비교하였을때 친화도를 증진시킨 항체들이 B12 항체보다 더 많은 피크 이동(peak shift)을 나타내었다(도 17). 이와 같은 결과는 선별된 항체들이 B12 항체에 비해 결합 친화도가 증진되었다는 것을 보여주는 것이다.In order to confirm the binding affinity of the antibodies with enhanced affinity, the binding affinity of the antibodies in OVCAR-3 cells was analyzed using the method using the flow cytometry described above. As a result of the analysis, when compared with the binding peak shift of the commercially purchased claudin 3/4 antibody, the antibodies with improved affinity showed more peak shift than the B12 antibody (FIG. 17 ). ). These results show that the selected antibodies have improved binding affinity compared to the B12 antibody.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above, a specific part of the present invention has been described in detail, and it is obvious that this specific technology is only a preferred embodiment for those of ordinary skill in the art, and the scope of the present invention is not limited thereto. Therefore, it will be said that the practical scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.

<110> Abion <120> Monoclonal Antibodies Specific to Claudin 3 and 4, and The Use Thereof <130> PN130728 <160> 98 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Human Claudin 3 <400> 1 Ser Ala Asn Thr Ile Ile Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu 1 5 10 15 Ala Gln Lys Arg Glu Met Gly Ala 20 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Human Claudin 4 <400> 2 Thr Ala His Asn Ile Ile Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Ala Ser Gly 1 5 10 15 Gln Lys Arg Glu Met Gly Ala Ser 20 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_B12 <400> 3 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_D10 <400> 4 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_D11 <400> 5 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_G2 <400> 6 Thr Gly Ser Ser Phe Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_G7 <400> 7 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Thr 1 5 10 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_G8 <400> 8 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Thr 1 5 10 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_H5 <400> 9 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_B9 <400> 10 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_C10 <400> 11 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ser Val Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_D12 <400> 12 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_E6 <400> 13 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Thr 1 5 10 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_H12 <400> 14 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Asn Val Thr 1 5 10 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_BC4A9 <400> 15 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ser Val Asn 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_BC4D1 <400> 16 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ser Val Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_BC4D4 <400> 17 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Asp Val Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_RC4F9 <400> 18 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Tyr Tyr Val Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_BC4H3 <400> 19 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Asn 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> CDRL1_BC4H12 <400> 20 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_B12 <400> 21 Ala Asp Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_D10 <400> 22 Ala Asn Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_D11 <400> 23 Ala Asp Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_G2 <400> 24 Ala Asp Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_G7 <400> 25 Ala Asp Asn His Arg Pro Ser 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_G8 <400> 26 Ala Asn Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_H5 <400> 27 Ala Asp Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_B9 <400> 28 Ala Asp Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_C10 <400> 29 Ala Asn Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_D12 <400> 30 Ser Asp Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_E6 <400> 31 Ala Asp Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_H12 <400> 32 Ser Asn Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_BC4A9 <400> 33 Ala Asp Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_BC4D1 <400> 34 Ser Asp Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_BC4D4 <400> 35 Ser Asp Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_RC4F9 <400> 36 Ala Asn Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_BC4H3 <400> 37 His Asp Ser His Pro Pro Ser 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> CDRL2_BC4H12 <400> 38 Ser Asp Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_B12 <400> 39 Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_B1 <400> 40 Gly Ala Trp Asp Asp Val Pro Asn Ala 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_B2 <400> 41 Gly Ala Trp Asp Asp Asn Pro Asn Ala 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_D7 <400> 42 Gly Ala Trp Asp Asp Ser Pro Asp Ala 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_D9 <400> 43 Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Gly Phe 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_D10 <400> 44 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_D11 <400> 45 Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_G2 <400> 46 Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_G7 <400> 47 Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_G8 <400> 48 Gly Ser Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_H5 <400> 49 Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_B9 <400> 50 Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Gly 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_C10 <400> 51 Gly Thr Trp Asp Ala Ser Leu Ser Ala 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_D12 <400> 52 Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_E6 <400> 53 Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_H12 <400> 54 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_BC4A9 <400> 55 Gly Ser Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_BC4D1 <400> 56 Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Asn Gly 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_BC4D4 <400> 57 Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_RC4F9 <400> 58 Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_BC4H3 <400> 59 Gly Ala Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Ala 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_BC4H12 <400> 60 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly 1 5 <210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_B12 <400> 61 Gly Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 62 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_B9 <400> 62 Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_C10 <400> 63 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 64 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_D12 <400> 64 Gly Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 65 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_E6 <400> 65 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_H12 <400> 66 Asn Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 67 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_BC4A9 <400> 67 Asn Tyr Ser Met Ser 1 5 <210> 68 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_BC4D1 <400> 68 Asp Tyr Ser Met Ser 1 5 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_BC4D4 <400> 69 Asp Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_RC4F9 <400> 70 Gly Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 71 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_BC4H3 <400> 71 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_BC4H12 <400> 72 Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 73 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_B12 <400> 73 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CDRL3_BC4H3 <400> 59 Gly Ala Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Ala 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> CDRL3_BC4H12 <400> 60 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly 1 5 <210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_B12 <400> 61 Gly Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 62 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_B9 <400> 62 Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_C10 <400> 63 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 64 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_D12 <400> 64 Gly Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 65 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_E6 <400> 65 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_H12 <400> 66 Asn Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 67 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_BC4A9 <400> 67 Asn Tyr Ser Met Ser 1 5 <210> 68 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_BC4D1 <400> 68 Asp Tyr Ser Met Ser 1 5 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_BC4D4 <400> 69 Asp Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_RC4F9 <400> 70 Gly Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 71 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_BC4H3 <400> 71 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> CDRH1_BC4H12 <400> 72 Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 73 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_B12 <400> 73 Val Ile Ser His Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_B9 <400> 74 Gly Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 75 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_C10 <400> 75 Val Ile Ser Ser Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 76 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_D12 <400> 76 Ala Ile Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_E6 <400> 77 Gly Ile Ser Ser Asp Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 78 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_H12 <400> 78 Ser Ile Tyr Tyr Gly Asn Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 79 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_BC4A9 <400> 79 Ala Ile Ser Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 80 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_BC4D1 <400> 80 Val Ile Tyr Ser Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 81 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_BC4D4 <400> 81 Ala Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 82 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_RC4F9 <400> 82 Ala Ile Ser His Gly Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_BC4H3 <400> 83 Ala Ile Ser His Gly Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 84 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH2_BC4H12 <400> 84 Ala Ile Ser His Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 85 <211> 18 <212> PRT <213> CDRH3_B12 <400> 85 Asp Ala Arg Val Cys Thr Pro Lys Arg Cys Tyr Ser Tyr Asp Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 86 <211> 18 <212> PRT <213> CDRH3_B9 <400> 86 Ala Pro Leu Ile Cys Ser Asn Leu Ile Cys Tyr Ser Tyr Asn Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 87 <211> 18 <212> PRT <213> CDRH3_C10 <400> 87 Ala Leu Gly His Thr His Lys Lys His Phe Tyr Ser Ala Tyr Gly Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 88 <211> 12 <212> PRT <213> CDRH3_D12 <400> 88 Gly Val His Asp Gly Asp Arg Arg Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 89 <211> 12 <212> PRT <213> CDRH3_E6 <400> 89 Asp Ala Pro Ala Ile Thr Val Thr Arg Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 90 <211> 18 <212> PRT <213> CDRH3_H12 <400> 90 Gly Thr Ser Thr Cys Arg His Ser Gln Cys Tyr Tyr Asp Asp Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 91 <211> 18 <212> PRT <213> CDRH3_BC4A9 <400> 91 Val Arg Ser Asn Cys Tyr Ser Ser His Cys Ser Ser Ser Asp Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> CDRH3_BC4D1 <400> 92 Gln Leu Pro Trp Phe Asp Tyr 1 5 <210> 93 <211> 6 <212> PRT <213> CDRH3_BC4D4 <400> 93 Phe Thr Pro Phe Asp Tyr 1 5 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> CDRH3_RC4F9 <400> 94 Thr Arg Pro Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 95 <211> 12 <212> PRT <213> CDRH3_BC4H3 <400> 95 Asp Pro Thr Gln Glu Arg Ala Arg Leu Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 96 <211> 17 <212> PRT <213> CDRH3_BC4H12 <400> 96 Gly Arg Val Gly Thr Pro Ser Arg Pro Ser Tyr Tyr Asp Ala Met Asp 1 5 10 15 Val <210> 97 <211> 105 <212> PRT <213> Light chain constant region <400> 97 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105 <210> 98 <211> 330 <212> PRT <213> Heavy chain constant regioin <400> 98 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

Claims (7)

(a) 다음 일반식 1로 표시되는 CDR(complementarity determining region)L1, 다음 일반식 2로 표시되는 CDRL2 및 다음 일반식 3으로 표시되는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 (b) 다음 일반식 4로 표시되는 CDRH1, 다음 일반식 5로 표시되는 CDRH2 및 서열목록 제85서열로 표시되는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 클라우딘(Claudin) 3 및 4를 동시에 인식하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
일반식 1
X1-Gly-Ser-Ser-Ser-Asn-Ile-Gly-X2-Asn-X3-Val-X4
상기 일반식에서, X1은 Thr이고, X2는 Ser이고, X3는 Ala이며, 그리고 X4는 Thr임.
일반식 2
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Pro-Ser
상기 일반식에서, Y1은 Ala이고, Y2는 Asp이고, Y3는 Ser이며, Y4는 His이며, 그리고 Y5는 Arg임.
일반식 3
Z1-Z2-Trp-Asp-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7
상기 일반식에서, Z1은 Gly이고, Z2는 Ala이고, Z3는 Asp이고, Z4는 Ser이고, Z5는 Leu이고, Z6는 Asn이며, 그리고 Z7는 Ala임.
일반식 4
B1-Tyr-B2-Met-Ser
상기 일반식에서, B1은 Gly이며, B2는 Tyr임.
일반식 5
J1-Ile-J2-J3-J4-J5-J6-J7-J8-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly
상기 일반식에서, J1은 Val이고, J2는 Ser이고, J3는 His이고, J4는 Asp이고, J5는 Gly이고, J6는 Ser이고, J7는 Ser이며, 그리고 J8은 Thr임.
(a) a light chain variable region comprising CDR (complementarity determining region) L1 represented by the following general formula 1, CDRL2 represented by the following general formula 2 and CDRL3 represented by the following general formula 3; And (b) Claudin 3 and 4 comprising a heavy chain variable region comprising CDRH1 represented by the following general formula 4, CDRH2 represented by the following general formula 5 and CDRH3 represented by the sequence listing 85: Or antigen-binding fragment thereof:
1
X 1 -Gly-Ser-Ser-Ser-Asn-Ile-Gly-X 2 -Asn-X 3 -Val-X 4
In the above general formula, X 1 is Thr, X 2 is Ser, X 3 is Ala, and X 4 is Thr.
Formula 2
Y 1 -Y 2 -Y 3 -Y 4 -Y 5 -Pro-Ser
Wherein Y 1 is Ala, Y 2 is Asp, Y 3 is Ser, Y 4 is His, and Y 5 is Arg.
Formula 3
Z 1 -Z 2 -Trp-Asp-Z 3 -Z 4 -Z 5 -Z 6 -Z 7
Wherein Z 1 is Gly, Z 2 is Ala, Z 3 is Asp, Z 4 is Ser, Z 5 is Leu, Z 6 is Asn, and Z 7 is Ala.
Formula 4
B 1 -Tyr-B 2 -Met-Ser
In the above general formula, B 1 is Gly and B 2 is Tyr.
Formula 5
J 1 -Ile-J 2 -J 3 -J 4 -J 5 -J 6 -J 7 -J 8 -Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly
Wherein J 1 is Val, J 2 is Ser, J 3 is His, J 4 is Asp, J 5 is Gly, J 6 is Ser, J 7 is Ser, and J 8 is Thr.
제 1 항의 클라우딘(Claudin) 3 및 4를 동시에 인식하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.A pharmaceutically effective amount of an antibody or antigen-binding fragment thereof that simultaneously recognizes Claudin 3 and 4 of claim 1; A pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising a pharmaceutically acceptable carrier. 제 2 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 난소암, 위암, 폐암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암인 것을 특징으로 하는 조성물. The method of claim 2, wherein the cancer is selected from the group consisting of breast cancer, ovarian cancer, stomach cancer, lung cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer, colon cancer, cervical cancer, brain cancer, prostate cancer, Skin cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer or urethral cancer. 제 2 항에 있어서, 상기 암은 난소암인 것을 특징으로 하는 조성물. 3. The composition of claim 2, wherein the cancer is an ovarian cancer. 제 2 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 다른 항암제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물. 3. The composition of claim 2, wherein said pharmaceutical composition further comprises another anti-cancer agent. 제 5 항에 있어서, 상기 다른 항암제는 카르보플라틴(carboplatin)인 것을 특징으로 하는 조성물.6. The composition according to claim 5, wherein the other anticancer agent is carboplatin. 제 1 항의 클라우딘(Claudin) 3 및 4를 동시에 인식하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 키트.A cancer diagnostic kit comprising an antibody or an antigen-binding fragment thereof that simultaneously recognizes Claudin 3 and 4 of claim 1.
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WO2021060914A1 (en) * 2019-09-26 2021-04-01 (재)록원바이오융합연구재단 Anti-claudin-3 chimeric antigen receptor

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019190206A1 (en) * 2018-03-28 2019-10-03 서울대학교산학협력단 Antibody binding specifically to ecl-2 of claudin 3, fragment thereof, and use thereof
RU2768002C1 (en) * 2018-03-28 2022-03-22 Абион Инк. Antibody specifically binding to ecl-2 claudin 3, its fragment and its use
WO2021060914A1 (en) * 2019-09-26 2021-04-01 (재)록원바이오융합연구재단 Anti-claudin-3 chimeric antigen receptor

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