KR20170097002A

KR20170097002A - Trk 키나아제 매개된 종양 성장 및 질병 진행의 억제

Info

Publication number: KR20170097002A
Application number: KR1020177012965A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 엘. 플린; 마이클 디. 코프먼; 브라이언 디. 스미스
Original assignee: 데시페라 파마슈티칼스, 엘엘씨.
Priority date: 2014-10-14
Filing date: 2015-10-14
Publication date: 2017-08-25
Also published as: CA2971874A1; JP2017532344A; US20160101090A1; EP3206752A1; WO2016061228A1

Abstract

화합물 1은 TRK: NTRK1, NTRK2 및 NTRK3의 세 가지 형태 모두를 포함하는 TRK 키나아제를 예상외로 또한 강력하게 억제함을 보였다. 또한, 화합물 1은 융합 단백질을 포함하는 TRK 키나아제의 발암성 돌연변이형을 강력하게 억제함을 보였다. 예를 들어, 화합물 1은 세포 분석법에서 NTRK1 발암성 융합 단백질 TPM3/NTRK1을 강력히 억제한다. 화합물 1은 생체 내 TPM3/NTRK1 이종 이식 모델에서 TRK 키나아제 매개된 종양 성장을 억제한다.

Description

TRK 키나아제 매개된 종양 성장 및 질병 진행의 억제{INHIBITION OF TRK KINASE MEDIATED TUMOR GROWTH AND DISEASE PROGRESSION}

관련 출원의 연관-참조

본 출원은, 그 전문이 본원에 참조로서 포함되는, 2014년 10월 14일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/063,660호의 우선권을 주장한다.

전자적으로 제출된 서열목록에 대한 참조

이 문서와 함께 전자 문서로 제출되는 텍스트 파일은 그 전문이 참조로서 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능 형식 사본 (파일명: DECP_067_01 WO_SeqList_ST25.txt; 데이터 기록 2015년 10월 13일: 파일 크기 10 KB)

배경기술

키나아제(kinase) 융합 단백질은 다양한 암의 원인이 되는 것으로 알려져 있다(Vaishnavi 2015; Stransky 2014).암의 드라이버 돌연변이인 가장 빈번하게 보고된 키나아제 융합은 수용체 티로신 키나아제 융합이고, 여기서 염색체 전위는 구조적으로 활성인 돌연변이 키나아제를 생성시키고 촉매적 키나아제 도메인 (수용체 티로신 키나아제의 C- 말단 영역)은 다른 유전자로부터 유래된 N-말단 영역과 융합된다. 전형적인 N-말단 영역은 보통 융합 단백질 이합체화를 촉진시킴으로써 상기 키나아제 도메인의 구조적인 활성화를 촉진한다 (Stranksy 2014).

융합 단백질은 다양한 N-말단 융합 파트너와 NTRK1, NTRK2 또는 NTRK3 키나아제 도메인의 염색체 전위의 결과임이 보고되었다. NTRK1 유전자 융합은 폐 선암, 담관암, 결장직장암, 유두상 갑상선암, 스피초이드 (spitzoid) 신생물 및 교모세포종에서 드라이버 돌연변이임이 입증되었다. NTRK2 유전자 융합은 육종, 성상 세포종, 폐 선암 및 두경부암에서 드라이버 돌연변이임이 입증되었다. NTRK3 유전자 융합은 저등급 신경교종, 분비성 유방암, 유두상 갑상선암, 급성 골수성 백혈병, 선천적 중배엽성 신장종, 선천적 섬유육종, 급성 림프구성 백혈병, 결장 선암, 갑상선암, 피부 흑색종, 두경부암 및 소아 신경교종에서 드라이버 돌연변이임이 입증되었다 (Vaishnavi 2015).

보고된 특정 TRK 융합 단백질에는 폐 선암의 MPRIP-NTRK1, CD74-NTRK1, RFWD2-NTRK1 및 SQSTM1-NTRK1 융합 (Vaishnavi 2013, Cuesta 2014, Patel 2015); 결장직장암 및 갑상선암의 TPM3-NTRK1, TFG-NTRK1 및 TPR-NTRK1 (Alberti 2003; Greco 2010, Martin-Zanca 1986); 육종의 TPM3-NTRK1 (Stranksy 2014); 담관암의 RABGAP1L-NTRK1 (Ross 2014); 스피초이드 종양의 LMNA-NTRK1 및 TP53-NTRK1 (Wiesner 2014); 교모세포종의 NFASC-NTRK1 (Kim 2014); 두경부암의 PAN3-NTRK2 융합 (Stransky 2014); 저등급 신경교종의 AFAP1-NTRK2 융합 (Stransky 2014); 폐 선암의 TRIM24-NTRK2 (Stransky 2014); 및 선천성 섬유 육종 및 분비성 유방암의 ETV6-NTRK3 (Knezevich 1998; Ricarte-Filho 2013, Tognon 2002)이 포함된다.

TRK 키나아제 융합 단백질 이외에, 다른 형태의 TRK 키나아제가 암을 일으키는 것이 입증되었다. NTRK1의 결실 돌연변이는 급성 골수성 백혈병의 원인임이 밝혀졌다 (Reuther 2000). NTRK1의 불활성화는 췌장 종양을 젬시타빈에 대해 민감하게 하는 것으로 나타났다 (Liu 2007). NGF/NTRKl의 발현 증가는 인간 췌장암에서 신경 주위 침입 및 통증 증후군의 역할을 하는 것으로 나타났다 (Zhu 1999). 증가된 TRK 키나아제 시그널링은 신경 모세포종에서 입증되었다 (Brodeur 2009).

당업계에 있어서 하나 이상의 TRK 키나아제 돌연변이, TRK 키나아제 과발현 및/또는 하나 이상의 TRK 키나아제 융합 단백질과 연관된 암의 치료 개선이 필요하다.

발명의 요약

하나의 양태에서, 본 발명은 TRK 키나아제의 과발현, TRK 키나아제의 하나 이상의 돌연변이 및/또는 하나 이상의 TRK 키나아제 융합 단백질에 연관된 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 다른 양태에서, 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 암에 걸렸거나 걸렸다고 의심되는 개체에게 투여되고, 여기서 상기 암의 종양 성장, 생존 또는 진행은 TRK 키나아제의 과발현, TRK 키나아제의 돌연변이 또는 TRK 키나아제 융합 단백질에 의해 야기된다.

하나의 실시양태에서, 실시양태에서, 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 NTRK1 융합 단백질에 의해 종양 성장, 생존 또는 진행이 야기되는 암에 걸렸거나 걸렸다고 의심되는 개체에게 투여된다. 추가 실시양태에서, 상기 NTRK1 융합 단백질은 제한 없이, MPRIP-NTRK1, CD74-NTRK1, RFWD2-NTRK1, SQSTM1-NTRK1, TPM3-NTRK1, TFG-NTRK1, TPR-NTRK1, RABGAP1L-NTRK1 LMNA-NTRK1, TP53-NTRK1, NFASC-NTRK1 또는 PEAR1-NTKR1으로부터 선택된다.

다른 실시양태에서, 실시양태에서, 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 NTRK2 융합 단백질에 의해 종양 성장, 생존 또는 진행이 야기되는 암에 걸렸거나 걸렸다고 의심되는 개체에게 투여된다. 추가 실시양태에서, 상기 NTRK2 융합 단백질은 제한 없이, PAN3-NTRK2, AFAP1-NTRK2, TRIM24-NTRK2, QK1-NTRK2, NACC2-NTRK2, VCL-NTRK2 또는 AGBL4-NTRK2로부터 선택된다.

다른 실시양태에서, 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 NTRK3 융합 단백질에 의해 종양 성장, 생존 또는 진행이 야기되는 암에 걸렸거나 걸렸다고 의심되는 개체에게 투여된다. 추가 실시양태에서, 상기 NTRK3 융합 단백질은 제한 없이, ETV6-NTRK3 및 BTBD1-NTRK3으로부터 선택된다.

다른 실시양태에서, 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 TRK 키나아제의 돌연변이에 의해 종양 성장, 생존 또는 진행이 야기되는 암에 걸렸거나 걸렸다고 의심되는 개체에게 투여된다. 추가 실시양태에서, 상기 돌연변이는 급성 골수성 백혈병의 NTRK1 결실 돌연변이를 포함할 수 있다.

다른 실시양태에서, 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 야생형 TRK 키나아제의 과발현에 의해 종양 성장, 생존 또는 진행이 야기되는 암에 걸렸거나 걸렸다고 의심되는 개체에게 투여된다. 추가 실시양태에서, 상기 TRK 키나아제는 췌장암 또는 신경모세포종에서 과발현된다.

다른 실시양태에서, 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 TRK 융합 단백질에 의해 종양 성장, 생존 또는 진행이 야기되는 암에 걸렸거나 걸렸다고 의심되는 개체에게 투여되고, 상기 암은 폐 선암, 담관암, 결장직장암, 결장 선암, 유두상 갑상선암, 스피초이드(spitzoid) 신생물, 교모세포종, 육종, 선천적 섬유육종, 성상 세포종, 두경부암, 저등급 신경교종, 분비성 유방암, 급성 골수성 백혈병, 선천적 중배엽성 신장종, 급성 림프구성 백혈병, 갑상선암, 피부 흑생종, 소아 신경교종, 신경모세포종 또는 췌장암이다.

다른 실시양태에서, 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 암에 걸렸거나 걸렸다고 의심되는 개체에게 단일 제제로서 또는 다른 암 표적화 치료제, 암-표적화 생물학적 제제 또는 화학치료제와 조합하여 투여된다.

일부 실시양태에서, N-(4-(2-(사이클로프로판카르복사미도)피리딘-4-일옥시)-2,5-디플루오로페닐)-N'-(4-플루오로페닐)사이클로프로판-1,1-디카르복사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량은 개체에게 경구 투여된다.

도 1A는 화합물 1을 처리한 결과, KM-12 TPM3-NTRK1 이종 이식 모델에서 종양 성장이 지연되는 것을 나타내는 선 그래프이다. 15 mg/kg, 7.5 mg/kg 및 3.75 mg/kg 용량의 화합물 1 (PO, BID)을 비히클 대조군과 비교하여 시험하였다. 종양 성장의 지연은 15 mg/kg, 7.5 mg/kg의 용량에서 통계적으로 유의하였다.
도 1B는 15 mg/kg, 7.5 mg/kg에서 화합물 1의 단일 경구 투여 후 NTRK1 인산화 활성의 억제율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 2A는 화합물 1을 처리한 결과, NIH-3T3 ETV6-NTRK3 이종 이식 모델에서 종양 성장이 지연되는 것을 나타내는 선 그래프이다.
도 2B는 15 mg/kg에서 화합물 1의 단일 경구 투여 후 ETV6-NTRK3 인산화 활성의 억제율을 나타내는 막대 그래프이다.

N-(4-(2-(사이클로프로판카르복사미도)피리딘-4-일옥시)-2,5-디플루오로페닐)-N'-(4-플루오로페닐)사이클로프로판-1,1-디카르복사미드가 NTRK1, NTRK2, NTRK3 키나아제의 야생형 및 발암성 융합 단백질 형태를 예상치 못하게 억제하는 것을 발견하였다. 본 발명은 N-(4-(2-(사이클로프로판카르복사미도)피리딘-4-일옥시)-2,5-디플루오로페닐)-N'-(4-플루오로페닐)사이클로프로판-1,1-디카르복사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, TRK 키나아제 매개된 종양 성장 및 질병 진행을 억제함으로써 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

따라서, 하나의 양태에서 본 발명은 TRK 키나아제의 과발현, TRK 키나아제의 하나 이상의 돌연변이 및/또는 하나 이상의 TRK 키나아제 융합 단백질과 연관된 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에서 제공되는 상기 조성물 및 방법은 종양 성장, 생존 또는 진행을 억제하거나 예방한다.

본원에서 사용된 화합물 1은 화합물 N-(4-(2-(사이클로프로판카르복사미도)피리딘-4-일옥시)-2,5-디플루오로페닐)-N'-(4-플루오로페닐)사이클로프로판-1,1-디카르복사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 지칭하며, 구조는 다음과 같다.

(화합물 1)

화합물 1의 제조 방법은 참조로서 본원에 포함되는 미국특허 제8,637,672호에 개시되어 있다. 상기 발명의 상세한 설명은 이하의 첨부된 설명에서 설명한다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 재료를 다음에 설명한다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 청구 범위로부터 명백할 것이다. 명세서 및 첨부된 청구 범위에서, 단수 형태는 또한 그 문맥이 명확하게 다른 것을 지시하지 않는 한, 복수형을 포함한다. 반대로, 본 발명에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진자가 통상적으로 생각하는 것과 동일한 의미를 갖는다.

일부 실시양태에서, 암은 폐 선암, 담관암, 결장직장암, 결장 선암, 유두상 갑상선암, 스피초이드 신생물, 교모세포종, 육종, 선천적 섬유육종, 성상 세포종, 두경부암, 저등급 신경교종, 분비성 유방암, 급성 골수성 백혈병, 선천적 중배엽성 신장종, 급성 림프구성 백혈병, 갑상선암, 피부 흑생종, 소아 신경교종, 신경모세포종, 췌장암, 위장관 기질종양, 난소암, 신세포암, 간장암, 자궁 경부암, 비소세포폐암, 중피종, 결장암, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관 육종, 내피 육종, 림프관 육종, 림프관 내피 육종, 활막종, 중피중, 유윙종양 (Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근육종, 유방암, 전립선암, 편평상피암, 기저세포암, 선암, 한선 암종 (sweat gland carcinoma), 피지선 암종 (sebaceous gland carcinoma), 유두모양 암종, 유두 선암, 낭생 암종 (cystadenocarcinoma), 속질 암종 (medullary carcinoma), 기관지원성암종 (bronchogenic carcinoma), 간세포암, 담관 암종 (bile duct carcinoma), 융모암 (choriocarcinoma), 정상피종 (seminoma), 태성성 암종 (embryonal carcinoma), 빌름스 종양 (Wilms's tumor), 고환암, 폐 암종, 방광 암종, 상피 암, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종 (acoustic neuroma), 핍지교종 (oligodendroglioma), 뇌수막종, 망막모세포종 및 신경내분비 종양 (neuroendocrine tumor)으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 다양한 N-말단 융합 파트너와 NTRK1, NTRK2 또는 NTRK3의 키나아제 도메인의 염색체 전위 결과이다. TRK 융합 단백질은, 제한 없이 MPRIP-NTRK1, CD74-NTRK1, RFWD2-NTRK1, SQSTM1-NTRK1, TPM3-NTRK1, TFG-NTRK1, TPR-NTRK1, TPM3-NTRKl, RABGAP1L-NTRK1, LMNA-NTRK1, TP53-NTRK1, NFASC-NTRK1, PAN3-NTRK2, AFAP1-NTRK2, TRIM24-NTRK2 및 ETV6-NTRK3를 포함한다. 융합 단백질 이외에 TRK 키나아제의 다른 형태가 암을 야기한다는 것이 입증되었다. 예를 들어, TRK 키나아제의 과발현 및/또는 TRK 키나아제의 하나 이상의 돌연변이가 암을 야기한다는 것이 입증되었다. 돌연변이는 TRK의 치환, 삽입 및/또는 결실 변이체를 포함할 수 있다.

용어, "환자" 및 "개체"는 본원에서 호환하여 사용된다. 일 실시양태에서, 개체는 예를 들어, 설치류, 고양이과, 개과 및 영장류와 같은 포유동물일 수 있다. 구체적으로, 개체는 인간이다. 일 실시양태에서 본원에서 제공되는 화합물 및 부가적인 치료제는 경구, 비경구, 피하, 근육 내, 정맥 내, 관절 내, 기관지 내, 복강 내 (intraabdominal), 피막 내, 연골 내, 강 내 (intracavitary), 복 내 (intracelial), 소뇌 내 (intracerebellar), 뇌실 내 (intracerebroventricular), 결장 내, 자궁경관 내, 위 내, 간 내, 심근 내, 골 내, 골반 내, 심막 내, 복강 내 (intraperitoneal), 흉강 내, 전립선 내, 폐 내, 직장 내, 신장 내, 망막 내, 척수 내, 활액 내 (intrasynovial), 흉곽 내, 고막 내, 자궁 내, 방광 내, 유리체 내, 볼루스 (bolus), 결막하, 질 (vaginal), 직장, 구강적 (buccal), 혀 밑, 비강 내, 종양 내 및 경피로부터 독립적으로 선택된 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 추가의 실시양태에서, N-(4-(2-(사이클로프로판카르복사미도)피리딘-4-일옥시)-2,5-디플루오로페닐)-N'-(4-플루오로페닐)사이클로프로판-1,1-디카르복사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 개체에게 경구 투여된다.

용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 유리 염기의 염을 형성하는데 흔히 사용되는 염을 포함한다. 염의 성질은 약학적으로 허용가능한 것이라면 중요하지 않다. 본 명세서에서 사용된 "약학적으로 허용가능한"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 다른 문제나 합병증이 없는, 인간 및 동물의 조직과의 접촉에 적합한 그러한 화합물, 재료, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다. 적합한 약학적으로 허용가능한 산 부가염은 무기산 또는 유기산으로부터 제조될 수 있다. 그러한 무기산의 예로는, 염화수소산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 질산, 탄산, 황산 및 인산이다. 적절한 유기산은 지방산, 고리지방족, 방향족, 아릴지방족 및 카르복실산 및 술폰산을 포함하는 헤테로사이클일로부터 선택될 수 있으며, 이들의 예는 포름산, 초산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 글루콘산, 젖산, 사과산, 주석산, 구연산, 아스코르브산, 글루쿠론산, 말레산, 푸마르산, 피르부산, 아스파르트산, 글루탐산, 벤조산, 안트라닐산, 메실산, 스테아르산, 살리실산, p-하이드록시벤조산, 페닐아세트산, 만델산, 엠본산 (팜산), 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, 판토텐산, 톨루엔술폰산, 2-하이드록시에탄술폰산, 술파닐산, 사이클로헥실아미노술폰산, 알긴산, 2-하이드록시부티르산, 갈락타릭산 및 갈락투론산이다.

개체에 관련하는 용어 "치료"는 개체의 장애의 한 가지 이상의 증상을 개선하는 것을 지칭한다. 치료는 예방, 치유, 개선 또는 적어도 부분적으로 장애를 경감시킬 수 있다.

용어 "유효량" 및 "치료적으로 유효한 양"은 본 명세서에서 호환하여 사용할 수 있으며, 개체에게 투여할 시 개체의 장애 증상을 경감시킬 수 있는 화합물의 양을 지칭한다. "유효량" 또는 "치료적으로 유효한 양"을 포함하는 실제적 양은 이에 제한되지는 않지만, 치료될 특정 장애, 장애의 중증도, 환자의 크기 및 건강 및 투여 경로를 포함하는 조건의 수에 따라 달라질 수 있다. 숙련된 의료인은 용이하게 의학 분야에 공지된 방법을 이용하여 적절한 양을 결정할 수 있다.

일부 실시양태에서, N-(4-(2-(사이클로프로판카르복사미도)피리딘-4-일옥시)-2,5-디플루오로페닐)-N'-(4-플루오로페닐)사이클로프로판-1,1-디카르복사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 단일 제제로서 개체에 투여된다. 다른 실시양태에서, N-(4-(2-(사이클로프로판카르복사미도)피리딘-4-일옥시)-2,5-디플루오로페닐)-N'-(4-플루오로페닐)사이클로프로판-1,1-디카르복사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 추가적인 치료제와 조합하여 개체에 투여된다. 추가적인 치료제는 다른 암 표적화 치료제, 암-표적화 생물학적 제제, 면역치료제 및/또는 화학치료제를 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 추가적인 화학치료제는 항-튜불린제이다. 추가의 실시양태에서, 상기 항-튜불린제는 파클리탁셀, 도세탁셀, 아브락산 및 에리불린으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 면역치료제는 항-CTLA-4 제, 항-PD 제 항-PDL 제 또는 IDO 억제제이다. 일부 실시양태에서, 상기 면역치료제는 이필리무맙 (ipilimumab), 펨브롤리주맙 (pembrolizumab), 니볼루맙 (nivolumab), 아테졸리주맙 (atezolizumab), 아벨루맙 (avelumab), MEDI4736, 인독시모드 (indoximod), INCB024360 및 에파카도스타트 (epacadostat)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 암-표적화 생물학적 제제는 단일항체, 키나아제 억제제 및 성장인자 억제제 및 이들의 수용체, 유전자 치료제, 세포 치료법 예를 들어, 줄기 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 특허, 특허 출원 및 출판물이 참조된다. 이들 특허, 특허 출원 및 출판물의 개시는, 본 명세서의 개시 시점에 당업자에게 공지 된 기술을 보다 완전하게 설명하기 위해 본원에 참고로 포함된다. 특허, 특허 출원 및 출판물 및 이 명세서 사이에 모순이 있는 경우에 이 명세서가 우선한다.

편의상, 명세서, 실시예 및 청구 범위에서 사용된 특정 용어가 여기에 수집된다. 다르게 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 제공된 그룹 또는 용어를 위해 제공된 초기 정의는 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 전반에 걸쳐 개별 공개 또는 다른 그룹의 일부로서 그룹 또는 용어에 적용된다.

본원은 이하의 실시예에 의해 추가로 설명되는데, 이는 본 명세서의 특정 절차에 대한 범위 또는 정신에서 본 개시 내용을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 실시예는 특정 양태를 설명하기 위해 제공되며, 본원의 범위를 제한하려는 의도는 아니라는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 취지 및/또는 첨부된 청구 범위의 범위를 벗어나지 않으면서 당업자에게 제안할 수 있는 다양한 다른 실시양태, 변형 및 등가물이 있을 수 있음을 이해해야 한다.

실시예

실시예 1. NTRK1 (서열번호 1), NTRK2 (서열번호 2) 및 NTRK3 (서열번호 3) 재조합 키나아제 억제제로서 화합물 1의 평가

NTRK1, NTRK2 및 NTRK3 키나아제의 활성은 피루브산 키나아제/락테이트 디하이드로게나제 시스템과의 커플링을 통한 키나아제 반응으로부터 ADP의 생성에 따라 결정되었다 [Schindler 2000]. 이 분석법에서, NADH의 산화 (따라서 A_340nm에서 감소함)를 분광 광도계를 지속적으로 모니터링하였다. 반응 혼합물 (100 ul)은 0.2% 옥틸-글루코사이드 및 1% DMSO, pH 7.5를 포함하는 90 mM 트리스 버퍼 중에 키나아제 [NTRK1 (Invitrogen) (4.7 nM), NTRK2 (Invitrogen) (4 nM) 또는 NTRK3 (Invitrogen) (1.8 nM)], polyEY (1 mg/ml), MgCl₂ (18 mM), DTT (0.5 mM), 피루베이트 키나아제 (4 unit), 락테이트 디하이드로게나제 (7 unit), 포스포에놀 피루베이트 (1 mM) 및 NADH (0.28 mM) 및 ATP (NTRK1 및 NTRK2의 경우 1 mM 및 NTRK3의 경우 0.25 mM)를 포함한다. 억제 반응은 상기 반응 혼합물과 연속 희석한 시험 화합물 1과 혼합함으로써 시작하였다. 340nm에서의 흡광도를 플레이트 리더기 (BioTek)상에서 30℃에서 4시간 동안 지속적으로 모니터링하였다. 반응 속도는 2 내지 4시간 프레임을 사용하여 계산하였다. 억제율은 대조군 (즉, 시험하지 않은 화합물과)과의 반응 속도 비교를 통해 얻었다. 화합물 1에 대한 IC₅₀ 값은 GraphPad Prism 소프트웨어 패키지에 구현된 소프트웨어 루틴을 사용하여 억제 농도 범위에서 결정하였다.

화합물 1은 0.71 nM의 IC₅₀ 값으로 재조합 NTRK1 키나아제 활성을 억제하고, 4.6 nM의 IC₅₀ 값으로 NTRK1 키나아제를 억제하고, 또한 0.83 nM의 IC₅₀ 값으로 NTRK3 키나아제를 억제하였다 (표 1).

화합물 1은 TRK 키나아제를 생화학적으로 강력히 억제하고, 발암성 TRK 세포 분석법에서 증식을 차단한다 (IC50 값, nM).

TRK 키나아제	TRK 세포
NTRKl 0.71 ± 0.33 nM	TPM3-NTRKl KM-12/CRC 3.8 ± 1.8 nM
NTRK2 4.6 ± O.4 nM
NTRK3 0.83 ± 0.39 nM	ETV6-NTRK3 형질전환된 NIH-3T3 0.44 ± 0.26 nM

스크리닝을 위해 사용한 NTRK1 단백질 서열 (서열번호 1)

MKCGRRNKFGINRPAVLAPEDGLAMSLHFMTLGGSSLSPTEGKGSGLQGHIIENPQYFSDACVHHIKRRDIVLKWELGEGAFGKVFLAECHNLLPEQDKMLVAVKALKEASESARQDFQREAELLTMLQHQHIVRFFGVCTEGRPLLMVFEYMRHGDLNRFLRSHGPDAKLLAGGEDVAPGPLGLGQLLAVASQVAAGMVYLAGLHFVHRDLATRNCLVGQGLVVKIGDFGMSRDIYSTDYYRVGGRTMLPIRWMPPESILYRKFTTESDVWSFGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNTEAIDCITQGRELERPRACPPEVYAIMRGCWQREPQQRHSIKDVHARLQALAQAPPVYLDVLGKGVEACQLGTDDYDIPTTHHHHHH

스크리닝을 위해 사용한 NTRK2 단백질 서열 (서열번호 2)

MVIENPQYFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQlAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVYLDILGKGGRADPAFLYKVVRMNEDLGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHH

스크리닝을 위해 사용한 NTRK3 단백질 서열 (서열번호 3)

MVIENPQYFRQGHNCHKPDTYVQHIKRRDIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLSPTKDKMLVAVKALKDPTLAARKDFQREAELLTNLQHEHIVKFYGVCGDGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAMILVDGQPRQAKGELGLSQMLHIASQIASGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGANLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSFGVILWEIFTYGKQPWFQLSNTEVIECITQGRVLERPRVCPKEVYDVMLGCWQREPQQRLNIKEIYKILHALGKATPIYLDILGKGGRADPAFLYKVVRMNEDLGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHH

실시예 2. TPM3 - NTRK1 융합 단백질을 함유하고 있는 KM-12 결장직장암 세포주 내 세포 증식 억제제로서의 화합물 1의 평가

KM-12 세포 배양

KM-12 세포는 국립 암 연구소 (Division of Cancer Treatment and Diagnosis Tumor Repository, Frederick, MD)로부터 제공받았다. 요약하면, 세포는 10% 특성화된 소태아혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민 용액 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 공급된 RPMI 1640 배지에서 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 성장시켰다. 세포를 70-95% 컨플루언시 (confluency) 에 도달할 때까지 증식시켰으며, 이때 세포를 분석에 사용하기 위해 서브배양 또는 수거하였다.

KM-12 세포 증식 분석법

시험 화합물의 연속 희석물을 384-웰 검은색 투명한 바닥 플레이트 (Corning, Corning, NY)에 분주하였다. 50 ul 완전 성장 배지 내에 웰 당 1,250개의 세포를 첨가하였다. 플레이트는 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 60시간 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 기간의 마지막에 PBS 중 440 uM 레자주린 용액 (Sigma, St. Louis, MO)의 10 ul를 각 웰에 첨가하고 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 5시간 동안 추가 인큐베이팅하였다. 플레이트는 540 nM의 여기 및 600 nM의 발광을 사용하여 Synergy2 리더기 (Biotek, Winooski, VT)로 읽었다. 데이터는 IC₅₀값을 계산하기 위하여 프리즘 소프트웨어 (Graphpad, San Diego, CA)를 사용하여 분석하였다.

화합물 1은 TPM3/NTRK1 발암성 융합 단백질을 발현하는 KM-12 결장직장암 세포의 증식 억제에 대해 3.8 nM의 IC₅₀값을 나타냈다 (표 1).

실시예 3. ETV6 - NTRK3 융합 키나아제 에 의해 유도된 형질전환된 NIH3T3 세포 증식 억제제로서 화합물 1의 평가

형질전환된 NIH-3T3 ETV6-NTRK3 세포 배양

형질전환된 NIH-3T3 ETV6-NTRK3 세포를 제임스 파긴, 메릴랜드 (메모리얼 슬로안 케터링 암 센터)로부터 제공받았다. 요약하면, 세포는 10% 특성화된 소태아혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민 용액 (Life Technologies, Carlsbad, CA) 및 1 ug/ml 퓨로마이신 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 공급된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 성장시켰다. 세포를 대략 75% 컨플루언시 에 도달할 때까지 증식시켰으며, 이때 세포를 분석에 사용하기 위해 서브배양 또는 수거하였다.

형질전환된 NIH-3T3 ETV6-NTRK3 세포 증식 분석법

시험 화합물의 연속 희석물을 96-웰 검은색 투명한 바닥 플레이트 (Corning, Corning, NY)에 분주하였다. 200 ul 배지(0.5% 특성화된 소태아혈청 (Life Technologies, Carlsbad, CA) 이 공급된 DMEM 배지) 내에 웰 당 15,000개의 세포를 첨가하였다. 플레이트는 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 6일간 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 기간의 마지막에 PBS 중 440 uM의 레자주린 (Sigma, St. Louis, MO) 용액의 10 ul를 각 웰에 첨가하고, 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 5시간 동안 추가 인큐베이팅하였다. 플레이트를 540 nM의 여기 및 600 nM의 발광을 사용하여 Synergy2 리더기 (Biotek, Winooski, VT)로 읽었다. 데이터는 IC₅₀값을 계산하기 위하여 프리즘 소프트웨어 (Graphpad, San Diego, CA)를 사용하여 분석하였다.

화합물 1은 ETV6-NTRK3 키나아제 융합 단백질에 의해 유도되는 형질전환된 NIH-3T3 ETV6-NTRK3 세포 증식 억제에 대해 0.44 nM의 IC₅₀값을 나타냈다 (표 1).

실시예 4. K562 만성 골수성 백혈병 세포에서 NTRK1 키나아제 의 세포 인산화 활성화의 억제제로서 화합물 1의 평가

K562 세포 배양

K562 세포 (카탈로그 #CCL-243)을 미국 미생물보존센터 (ATCC; Manassas, VA)로부터 제공받았다. 요약하면, K562 세포는 10% 특성화된 소태아혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신-L-글루타민 용액 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 공급된 IMDM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 현탁 성장시켰다. 세포를 1.0 x 10⁶ ~ 3.0 x 10⁶/ml에 도달할 때까지 증식시켰으며, 이때 세포를 분석에 사용하기 위해 서브배양 또는 수거하였다.

K562 포스포-NTRK1 웨스턴 블랏

24-웰 조직-배양 처리된 플레이트에 웰 당 혈청-프리 IMDM 배지 중의 1.0 x 10⁶ 세포를 첨가하였다. 시험 화합물의 연속 희석물을 세포에 첨가하고 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 4시간 동안 인큐베이팅하였다. 세포를 이후 100 ng/mL NGF (R&D Systems, Minneapolis, MN)으로 10분간 자극시켰다. 세포 용해물을 SDS-PAGE로 분리하고, PVDF에 옮겼다. 세포 시그널링 테크놀러지 (Beverly, MA)의 항체, ECL Plus 검출 시약 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) 및 분자 장치 스톰 840 phosphorimager 형광 모드를 사용하여 포스포-NTRK1 (Tyr674/675)을 검출하였다. 블랏을 스트립핑하고 산타크루즈 바이테크 (Santa Cruz, CA)의 항체를 사용하여 총 NTRK1에 대해 탐침하였다. IC₅₀값은 프리즘 소프트웨어 (Graphpad, San Diego, CA)를 사용하여 분석하였다.

화합물 1은 0.69 nM의 IC₅₀ 값으로 K562 세포에서 NTRK1 인산화를 억제하였다 (표 2).

화합물 1에 의한 세포 TRK 키나아제의 인산화 억제

키나아제	세포주	IC₅₀nM	n
NTRK1	K562	0.69	2
NTRK1	SK-N-SH	1.0±0.5	4
TPM3-NTRK1	KM-12	1.5	2
ETV6-NTRK3	NIH 3T3	0.47±0.42	3
NTRK2	SK-N-SH*	0.24±0.14	3

실시예 5. SK-N- SH 신경모세포종 세포에서 NTRK1 키나아제 의 세포 인산화 활성화의 억제제로서의 화합물 1의 평가

SK-N-SH 세포 배양

SK-N-SH 세포 (카탈로그 #HTB-11)을 미국 미생물보존센터 (ATCC; Manassas, VA)로부터 제공받았다. 요약하면, SK-N-SH 세포는 10% 특성화된 소태아혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신-L-글루타민 용액 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 공급된 MEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 성장시켰다. 세포를 70-95% 컨플루언시에 도달할 때까지 증식시켰으며, 이때 세포를 분석에 사용하기 위해 서브배양 또는 수거하였다.

SK-N-SH 포스포-NTRK1 웨스턴 블랏

24-웰 조직-배양 처리된 플레이트에 웰 당 성장 배지 내에 2.5 x 10⁶의 세포를 첨가하였다. 상기 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 밤새 인큐베이팅하였다. 다음날, 성장 배지를 흡입하고, 세포를 혈청-프리 MEM 배지로 세척한 후, 웰 당 혈청-프리 MEM 배지를 1 ml 첨가하였다. 시험 화합물의 연속 희석물을 상기 세포에 첨가하고, 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 4시간 동안 인큐베이팅하였다. 세포를 이후 100 ng/mL NGF (R&D Systems, Minneapolis, MN)로 10분간 자극시켰다. 배지는 이후 흡입하고, 세포를 PBS로 세척한 다음 용해시켰다. 세포 용해물을 SDS-PAGE로 분리하고, PVDF에 옮겼다. 세포 시그널링 테크놀러지 (Beverly, MA)의 항체, ECL 플러스 검출 시약 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) 및 분자 장치 스톰 840 phosphorimager 형광 모드를 사용하여 포스포-NTRK1 (Tyr674/675) 검출하였다. 블랏을 스트립핑하고 산타크루즈 바이테크 (Santa Cruz, CA)의 항체를 사용하여 총 NTRK1에 대해 탐침하였다. IC₅₀값은 프리즘 소프트웨어 (Graphpad, San Diego, CA)를 사용하여 분석하였다.

화합물 1은 1.0 nM의 IC₅₀ 값으로 SK-N-SH 세포에서 NTRK1 인산화를 억제하였다 (표 2).

실시예 6. KM-12 세포에서 TPM3 - NTRK1 융합 키나아제 의 세포 인산화 활성화의 억제제로서의 화합물 1의 평가

KM-12 세포 배양

KM-12 세포를 국립 암 연구소 (Division of Cancer Treatment and Diagnosis Tumor Repository, Frederick, MD)로부터 제공받았다. 요약하면, 세포는 10% 특성화된 소태아혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민 용액 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 공급된 RPMI 1640 배지에서 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 성장시켰다. 세포를 70-95% 컨플루언시에 도달할 때까지 증식시켰으며, 이때 세포를 분석에 사용하기 위해 서브배양 또는 수거하였다.

KM-12 포스포-NTRK1 웨스턴 블랏

24-웰 조직-배양 처리 플레이트의 웰 당 성장 배지 내 2.5 x 10⁶의 세포를 첨가하였다. 상기 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 밤새 인큐베이팅하였다. 다음 날, 시험 화합물의 연속 희석물을 상기 세포에 첨가하고, 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 4시간 동안 인큐베이팅하였다. 배지는 이후 흡입하고, 세포를 PBS로 세척한 다음 용해시켰다. 세포 용해물을 SDS-PAGE로 분리하고, PVDF에 옮겼다. 세포 시그널링 테크놀러지 (Beverly, MA)의 항체, ECL 플러스 검출 시약 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) 및 분자 장치 스톰 840 phosphorimager 형광 모드를 사용하여 포스포-NTRK1 (Tyr674/675)을 검출하였다. 블랏을 스트립핑하고 산타크루즈 바이테크 (Santa Cruz, CA)의 항체를 사용하여 총 NTRK1에 대해 탐침하였다. IC₅₀값은 프리즘 소프트웨어 (Graphpad, San Diego, CA)를 사용하여 분석하였다.

화합물 1은 1.4 nM의 IC₅₀ 값으로 KM-12 세포에서 NTRK1 인산화를 억제하였다 (표 2).

실시예 7. 형질전환된 NIH-3T3 세포에서 ETV6 - NTRK3 융합 키나아제 의 세포 인산화 활성화의 억제제로서의 화합물 1의 평가

형질전환된 NIH-3T3 ETV6-NTRK3 세포 배양

형질전환된 NIH-3T3 ETV6-NTRK3 세포를 제임스 파긴, 메릴랜드 (메모리얼 슬로안 케터링 암 센터)로부터 제공받았다. 요약하면, 세포는 10% 특성화된 소태아혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민 용액 (Life Technologies, Carlsbad, CA) 및 1 ug/ml 퓨로마이신 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 공급된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 성장시켰다. 세포를 대략 75% 컨플루언시에 도달할 때까지 증식시켰으며, 이때 세포를 분석에 사용하기 위해 서브배양 또는 수거하였다.

형질전환된 NIH-3T3 ETV6-NTRK3 포스포-NTRK3 웨스턴 블랏

12-웰 조직-배양 처리 플레이트에 웰 당 배지 (0.5% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민 용액이 공급된 DMEM 배지) 내 0.8 x 10⁵의 세포를 첨가하였다. 상기 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 3일간 인큐베이팅하였다. 다음 날, 성장 배지를 흡입하고, 혈청-프리 DMEM 배지를 2 ml 첨가하였다. 시험 화합물의 연속 희석물을 상기 세포에 첨가하고, 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 4시간 동안 인큐베이팅하였다. 배지를 이후 흡입하고, 세포를 PBS로 세척한 다음 용해시켰다. 세포 용해물을 SDS-PAGE로 분리하고, PVDF에 옮겼다. 세포 시그널링 테크놀러지 (Beverly, MA)의 항체, ECL 플러스 검출 시약 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) 및 분자 장치 스톰 840 phosphorimager 형광 모드를 사용하여 포스포-NTRK3 (Tyr516) 검출하였다. 블랏을 스트립핑하고 산타크루즈 바이테크 (Santa Cruz, CA)의 항체를 사용하여 총 NTRK1에 대해 탐침하였다. IC₅₀값은 프리즘 소프트웨어 (Graphpad, San Diego, CA)를 사용하여 분석하였다.

화합물 1은 0.47 nM의 IC₅₀ 값으로 형질전환된 NIH-3T3 세포에서 ETV6-NTRK3 인산화를 억제하였다 (표 2).

실시예 8. SK-N- SH 세포에서 NTRK2의 세포 인산화 활성화의 억제제로서의 화합물 1의 평가

SK-N-SH 세포 배양

SK-N-SH 세포 (카탈로그 #HTB-11)을 미국 미생물보존센터 (ATCC; Manassas, VA)로부터 제공받았다. 요약하면, SK-N-SH 세포는 10% 특성화된 소태아혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신-L-글루타민 용액 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 공급된 MEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 성장시켰다. 세포를 70-95% 컨플루언시에 도달할 때까지 증식시키고 서브배양하였다. NTRK2의 발현을 유도하기 위해 세포를 10 uM 올트랜스레티놀산을 포함하는 성장배지에서 10 내지 14일간 성장시키고 분석에 사용하기 위해 세포를 수거하였다.

SK-N-SH 포스포-NTRK1 웨스턴 블랏

12-웰 조직-배양 처리 플레이트에 웰 당 성장 배지 내 10 uM 올트랜스레티놀산으로 분리한 2.5 x 10⁶의 세포를 첨가하였다. 상기 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 밤새 인큐베이팅하였다. 다음날, 성장 배지를 흡입하고, 세포를 혈청-프리 MEM 배지로 세척한 후, 웰 당 혈청-프리 MEM 배지를 1 ml 첨가하였다. 시험 화합물의 연속 희석물을 상기 세포에 첨가하고, 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 4시간 동안 인큐베이팅하였다. 세포를 이후 100 ng/mL BDGF (R&D Systems, Minneapolis, MN)으로 5분간 자극시켰다. 배지는 이후 흡입하고, 세포를 PBS로 세척한 다음 용해시켰다. 세포 용해물을 SDS-PAGE로 분리하고, PVDF에 옮겼다. 세포 시그널링 테크놀러지 (Beverly, MA)의 항체, ECL 플러스 검출 시약 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) 및 분자 장치 스톰 840 phosphorimager 형광 모드를 사용하여 포스포-NTRK2 (Tyr706/707)를 검출하였다. 블랏을 스트립핑하고 산타크루즈 바이테크 (Santa Cruz, CA)의 항체를 사용하여 총 NTRK2에 대해 탐침하였다. IC₅₀값은 프리즘 소프트웨어 (Graphpad, San Diego, CA)를 사용하여 분석하였다.

화합물 1은 0.24 nM의 IC₅₀ 값으로 SK-N-SH 세포에서 NTRK2 인산화를 억제하였다 (표 2).

실시예 9. TPM3 - NTRK1 형질전환된 KM-12 이종 이식 모델에서 화합물 1의 평가

화합물 1을 KM-12 TPM3-NTRK1 이종 이식 모델에서 단일 제제 효능에 대해 평가하였다 (도 1A). 마우스에 피하 이식하여 5일째에 처리를 시작하였다. 처리 3주 후인 25일째에 처리를 마쳤다. 화합물 1 (15 mg/kg, PO, BID)의 처리는 17.8일의 통계학적으로 유의한 종양 성장 지연 (p<0.05) 및 11일 16%의 %T/C (p<0.05)를 보였다. 화합물 1 (7.5 mg/kg, PO, BID)의 처리는 11.4일의 통계학적으로 유의한 종양 성장 지연 (p<0.05) 및 11일 22%의 %T/C (p<0.05)를 보였다. 화합물 1 (3.75 mg/kg, PO, BID)의 처리는 4.5일의 통계학적으로 유의한 종양 성장 지연 (p<0.05) 및 11일 39%의 %T/C (p<0.05)를 보였다.

화합물 1을 KM-12 TPM3-NTRK1 이종 이식 모델에서 단일 투여 후 NTRK1 인산화 활성화의 억제에 대해 평가하였다 (도 1B). 마우스에 피하 이식하여 8일째에 단일 처리를 실시하였다. 단일 경구 투여 후의 시점에 종양을 절제하고 동결시키고 분쇄한 다음 용해시켰다. 용해물을 SDS-PAGE로 분리하고 단백질을 PVDF에 옮겼다. 세포 시그널링 테크놀러지 (Beverly, MA)의 항체, ECL 플러스 검출 시약 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) 및 분자 장치 스톰 840 phosphorimager 형광 모드를 사용하여 포스포-NTRK1 (Tyr674/675)을 검출하였다. 블랏을 스트립핑하고 산타크루즈 바이테크 (Santa Cruz, CA)의 항체를 사용하여 총 NTRK1에 대해 탐침하였다. 화합물 1 (15 mg/kg, PO)의 단일 용량의 경구 투여는 투여 후 18 시간 동안 생체 내에서 NTRK1 키나아제 인산화의 ~ 95% 억제를 제공하였다. 화합물 1은 투여 후 24 시간에 NTRK1 인산화의 79% 억제를 보였다. 7.5 mg/kg의 싱글 경구 투여는 화합물 1이 8시간 동안 NTRK1 인산화의 >95%를 억제하였다. 투여 후 12, 18 및 24시간에 화합물 1은 NTRK1 인산화를 각각 66%, 74% 및 59% 억제하였다.

실시예 10. ETV6 - NTRK3 형질전환된 NIH-3T3 이종 이식 모델에서 화합물 1의 평가 (도 2)

화합물 1을 형질전환된 NIH-3T3 ETV6-NTRK3 이종 이식 모델에서 단일 제제 효능에 대해 평가하였다 (도 2A). 마우스에 피하 이식하여 4일째에 처리를 시작하였다. 처리 3주 후의 24일째에 처리를 완료하였다. 화합물 1의 (15 mg/kg, PO, BID)의 처리는 26.5일 (p<0.05)의 통계학적으로 유의한 종양 성장 지연 및 11일 6%의 %T/C (p<0.05)를 보였다.

화합물 1을 형질전환된 NIH-3T3 ETV6-NTRK3 이종 이식 모델에서 단일 투여 후 NTRK3 인산화 활성화의 억제에 대해 평가하였다 (도 2B). 마우스에 피하 이식하여 6일째에 단일 처리를 실시하였다. 단일 경구 투여 후의 시점에 종양을 절제하고 동결시키고 분쇄한 다음 용해시켰다. 용해물을 SDS-PAGE로 분리하고 단백질을 PVDF에 옮겼다. 세포 시그널링 테크놀러지 (Beverly, MA)의 항체, ECL 플러스 검출 시약 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) 및 분자 장치 스톰 840 phosphorimager 형광 모드를 사용하여 포스포-NTRK3 (Tyr516)을 검출하였다. 화합물 1 (15 mg/kg, PO)의 단일 용량의 경구 투여는 투여 후 12 시간 동안 생체 내에서 NTRK3 키나아제 인산화의 ~ 95% 억제를 제공하였다. 화합물 1은 투여 후 18시간에 NTRK3 인산화의 63% 억제 및 24시간에 NTRK3 인산화의 23% 억제를 보였다.

당업자는 통상의 실험을 사용하여, 본 명세서에서 구체적으로 설명된 특정 실시예에 대한 다수의 등가물로 인식하거나, 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구 범위에 포함되는 것으로 의도된다.

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Leu Asn Arg 145 150 155 160 Phe Leu Arg Ser His Gly Pro Asp Ala Lys Leu Leu Ala Gly Gly Glu 165 170 175 Asp Val Ala Pro Gly Pro Leu Gly Leu Gly Gln Leu Leu Ala Val Ala 180 185 190 Ser Gln Val Ala Ala Gly Met Val Tyr Leu Ala Gly Leu His Phe Val 195 200 205 His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Gln Gly Leu Val 210 215 220 Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Ile Tyr Ser Thr Asp 225 230 235 240 Tyr Tyr Arg Val Gly Gly Arg Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met Pro 245 250 255 Pro Glu Ser Ile Leu Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val Trp 260 265 270 Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln Pro 275 280 285 Trp Tyr Gln Leu Ser Asn Thr Glu Ala Ile Asp Cys Ile Thr Gln Gly 290 295 300 Arg Glu Leu Glu Arg Pro Arg Ala Cys Pro Pro Glu Val Tyr Ala Ile 305 310 315 320 Met Arg Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro Gln Gln Arg His Ser Ile Lys 325 330 335 Asp Val His Ala Arg Leu Gln Ala Leu Ala Gln Ala Pro Pro Val Tyr 340 345 350 Leu Asp Val Leu Gly Lys Gly Val Glu Ala Cys Gln Leu Gly Thr Asp 355 360 365 Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr His His His His His His 370 375 380 <210> 2 <211> 357 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Val Ile Glu Asn Pro Gln Tyr Phe Gly Ile Thr Asn Ser Gln Leu 1 5 10 15 Lys Pro Asp Thr Phe Val Gln His Ile Lys Arg His Asn Ile Val Leu 20 25 30 Lys Arg Glu Leu Gly Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu 35 40 45 Cys Tyr Asn Leu Cys Pro Glu Gln Asp Lys Ile Leu Val Ala Val Lys 50 55 60 Thr Leu Lys Asp Ala Ser Asp Asn Ala Arg Lys Asp Phe His Arg Glu 65 70 75 80 Ala Glu Leu Leu Thr Asn Leu Gln His Glu His Ile Val Lys Phe Tyr 85 90 95 Gly Val Cys Val Glu Gly Asp Pro Leu Ile Met Val Phe Glu Tyr Met 100 105 110 Lys His Gly Asp Leu Asn Lys Phe Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala 115 120 125 Val Leu Met Ala Glu Gly Asn Pro Pro Thr Glu Leu Thr Gln Ser Gln 130 135 140 Met Leu His Ile Ala Gln Gln Ile Ala Ala Gly Met Val Tyr Leu Ala 145 150 155 160 Ser Gln His Phe Val His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val 165 170 175 Gly Glu Asn Leu Leu Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp 180 185 190 Val Tyr Ser Thr Asp Tyr Tyr Arg Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro 195 200 205 Ile Arg Trp Met Pro Pro Glu Ser Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr 210 215 220 Glu Ser Asp Val Trp Ser Leu Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Thr 225 230 235 240 Tyr Gly Lys Gln Pro Trp Tyr Gln Leu Ser Asn Asn Glu Val Ile Glu 245 250 255 Cys Ile Thr Gln Gly Arg Val Leu Gln Arg Pro Arg Thr Cys Pro Gln 260 265 270 Glu Val Tyr Glu Leu Met Leu Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro His Met 275 280 285 Arg Lys Asn Ile Lys Gly Ile His Thr Leu Leu Gln Asn Leu Ala Lys 290 295 300 Ala Ser Pro Val Tyr Leu Asp Ile Leu Gly Lys Gly Gly Arg Ala Asp 305 310 315 320 Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Val Val Arg Met Asn Glu Asp Leu Gly Lys 325 330 335 Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His 340 345 350 His His His His His 355 <210> 3 <211> 360 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Val Ile Glu Asn Pro Gln Tyr Phe Arg Gln Gly His Asn Cys His 1 5 10 15 Lys Pro Asp Thr Tyr Val Gln His Ile Lys Arg Arg Asp Ile Val Leu 20 25 30 Lys Arg Glu Leu Gly Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu 35 40 45 Cys Tyr Asn Leu Ser Pro Thr Lys Asp Lys Met Leu Val Ala Val Lys 50 55 60 Ala Leu Lys Asp Pro Thr Leu Ala Ala Arg Lys Asp Phe Gln Arg Glu 65 70 75 80 Ala Glu Leu Leu Thr Asn Leu Gln His Glu His Ile Val Lys Phe Tyr 85 90 95 Gly Val Cys Gly Asp Gly Asp Pro Leu Ile Met Val Phe Glu Tyr Met 100 105 110 Lys His Gly Asp Leu Asn Lys Phe Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala 115 120 125 Met Ile Leu Val Asp Gly Gln Pro Arg Gln Ala Lys Gly Glu Leu Gly 130 135 140 Leu Ser Gln Met Leu His Ile Ala Ser Gln Ile Ala Ser Gly Met Val 145 150 155 160 Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe Val His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn 165 170 175 Cys Leu Val Gly Ala Asn Leu Leu Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met 180 185 190 Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr Asp Tyr Tyr Arg Val Gly Gly His Thr 195 200 205 Met Leu Pro Ile Arg Trp Met Pro Pro Glu Ser Ile Met Tyr Arg Lys 210 215 220 Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Ile Leu 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Claims

N-(4-(2-(사이클로프로판카르복사미도)피리딘-4-일옥시)-2,5-디플루오로페닐)-N'-(4-플루오로페닐)사이클로프로판-1,1-디카르복사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, TRK 키나아제 매개된 종양 성장, 생존 또는 질병 진행을 억제하는 방법.
제1항에 있어서, 종양 성장, 생존 또는 진행이 TRK 키나아제의 과발현, TRK 키나아제의 돌연변이 또는 TRK 키나아제 융합 단백질에 의해 야기되는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 종양 성장, 생존 또는 진행이 NTRK1 융합 단백질에 의해 야기되는 것인, 방법.
제3항에 있어서, 상기 NTRK1 융합 단백질이 MPRIP-NTRK1, CD74-NTRK1, RFWD2-NTRK1, SQSTM1-NTRK1, TPM3-NTRK1, TFG-NTRK1, TPR-NTRK1, RABGAP1L-NTRK1 LMNA-NTRK1, TP53-NTRK1, NFASC-NTRK1 또는 PEAR1-NTKR1으로부터 선택되는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 종양 성장, 생존 또는 진행이 NTRK2 융합 단백질에 의해 야기되는 것인, 방법.
제5항에 있어서, 상기 NTRK2 융합 단백질이 PAN3-NTRK2, AFAP1-NTRK2, TRIM24-NTRK2, QK1-NTRK2, NACC2-NTRK2, VCL-NTRK2 또는 AGBL4-NTRK2로부터 선택되는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 종양 성장, 생존 또는 진행이 NTRK3 융합 단백질에 의해 야기되는 것인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 NTRK3 융합 단백질이 ETV6-NTRK3 또는 BTBD1-NTRK3으로부터 선택되는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 종양 성장, 생존 또는 진행이 TRK 키나아제의 돌연변이에 의해 야기되는 것인, 방법.
제9항에 있어서, 상기 TRK 키나아제의 돌연변이가 급성 골수성 백혈병의 NTRK1 결실 돌연변이인 것인, 방법.
제1항에 있어서, 종양 성장, 생존 또는 진행이 야생형 TRK 키나아제의 과발현에 의해 야기되는 것인, 방법.
제11항에 있어서, NTRK1이 췌장암 또는 신경모세포종에서 과발현되는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 종양이 폐 선암, 담관암, 결장직장암, 결장 선암, 유두상 갑상선암, 스피초이드(spitzoid) 신생물, 교모세포종, 육종, 선천적 섬유육종, 성상 세포종, 두경부암, 저등급 신경교종, 분비성 유방암, 급성 골수성 백혈병, 선천적 중배엽성 신장종, 급성 림프구성 백혈병, 갑상선암, 피부 흑생종, 소아 신경교종, 신경모세포종 또는 췌장암인 것인, 방법.
N-(4-(2-(사이클로프로판카르복사미도)피리딘-4-일옥시)-2,5-디플루오로페닐)-N'-(4-플루오로페닐)사이클로프로판-1,1-디카르복사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 단일 제제로서 또는 다른 암 표적화 치료제, 암-표적화 생물학적 제제 또는 화학치료제와 조합하여 투여되는 것인, 방법.
N-(4-(2-(사이클로프로판카르복사미도)피리딘-4-일옥시)-2,5-디플루오로페닐)-N'-(4-플루오로페닐)사이클로프로판-1,1-디카르복사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 TRK 키나아제의 과발현, TRK 키나아제의 돌연변이 및/또는 TRK 키나아제 융합 단백질과 연관된 암을 치료하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 암이 NTRK1 융합 단백질에 의해 야기되는 것인, 방법.
제16항에 있어서, 상기 NTRK1 융합 단백질이 MPRIP-NTRK1, CD74-NTRK1, RFWD2-NTRK1, SQSTM1-NTRK1, TPM3-NTRK1, TFG-NTRK1, TPR-NTRK1, RABGAP1L-NTRK1 LMNA-NTRK1, TP53-NTRK1, NFASC-NTRK1 또는 PEAR1-NTKR1으로부터 선택되는 것인, 방법.
제15항에 있어서, 상기 암이 NTRK2 융합 단백질에 의해 야기되는 것인, 방법.
제18항에 있어서, 상기 NTRK2 융합 단백질이 PAN3-NTRK2, AFAP1-NTRK2, TRIM24-NTRK2, QK1-NTRK2, NACC2-NTRK2, VCL-NTRK2 또는 AGBL4-NTRK2로부터 선택되는 것인, 방법.
제15항에 있어서, 상기 암이 NTRK3 융합 단백질에 의해 야기되는 것인, 방법.
제20항에 있어서, 상기 NTRK3 융합 단백질이 ETV6-NTRK3 또는 BTBD1-NTRK3으로부터 선택되는 것인, 방법.
제15항에 있어서, 상기 암이 TRK 키나아제의 돌연변이에 의해 야기되는 것인, 방법.
제22항에 있어서, 상기 돌연변이가 급성 골수성 백혈병의 NTRK1 결실 돌연변이인 것인, 방법.
제15항에 있어서, 상기 암이 야생형 TRK 키나아제의 과발현에 의해 야기되는 것인, 방법.
제24항에 있어서, NTKR1이 췌장암 또는 신경모세포종에서 과발현되는 것인, 방법.
제15항에 있어서, 상기 종양이 폐 선암, 담관암, 결장직장암, 결장 선암, 유두상 갑상선암, 스피초이드 신생물, 교모세포종, 육종, 선천적 섬유육종, 성상 세포종, 두경부암, 저등급 신경교종, 분비성 유방암, 급성 골수성 백혈병, 선천적 중배엽성 신장종, 급성 림프구성 백혈병, 갑상선암, 피부 흑생종, 소아 신경교종, 신경모세포종 또는 췌장암인 것인, 방법.
제15항에 있어서, N-(4-(2-(사이클로프로판카르복사미도)피리딘-4-일옥시)-2,5-디플루오로페닐)-N'-(4-플루오로페닐)사이클로프로판-1,1-디카르복사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 단일 제제로서 또는 다른 암 표적화 치료제, 암-표적화 생물학적 제제 또는 화학치료제와 조합하여 투여되는 것인, 방법.