KR20170094186A - 즉시 사용가능한 pcv2/m.hyo 혼합 백신에 대한 방법 - Google Patents
즉시 사용가능한 pcv2/m.hyo 혼합 백신에 대한 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 M.hyo 또는 PCV2에 의한 감염 및 관련된 질병의 징후의 예방 또는 감소를 위한, 돼지에 즉시 사용가능한 백신을 준비하는 데 사용할 수 있는 항원 조성물의 제조 방법을 설명한다. 이 방법은 수산화알루미늄 아주반트에 흡착된 M.hyo 항원의 미리 형성된 항원/아주반트 복합체에 PCV2 항원을 혼합하는 단계를 포함한다는 것을 특징으로 한다. 이 방법을 통해, 단일 또는 복합 감염시에 M.hyo 및 PCV2에 의한 감염 및 질병에 대해 단일 투여 후에 이미 매우 효과적인 PCV2/M.hyo 혼합 백신이 제조될 수 있다. 또한, 백신은 투여시에 안전성이 매우 우수하고, 즉시 사용가능하고, 경제적으로 실행가능하다.
Description
본 발명은 수의학 분야, 즉 미코플라스마 히오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae) 및 돼지 써코바이러스(circovirus) 2형에 대한 돼지용 백신에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 백신 항원을 함유하는 조성물을 제조하기 위한 새로운 방법에 관한 것이다. 이 조성물은 돼지를 위한 효과적인 즉시 사용가능한 혼합 백신의 생산을 가능하게 한다. 또한, 본 발명은 신규 방법에 의해 수득가능한 항원 조성물의 용도, 상기 항원 조성물로부터 제조된 백신, 및 상기 항원 조성물 및 백신의 다양한 방법 및 용도에 관한 것이다.
미코플라스마 히오뉴모니애 (M.hyo)는 전세계적으로 발생하는 돼지의 만성 호흡기 질병인 (돼지) 유행성 폐렴 (EP)를 유발하는 1차 원인물질이다. 이전 문헌에서, 객관적인 동의어로 동일한 박테리아를 지칭하는 엠. 수이뉴모니애(M. suipneumoniae)가 사용되었다. 이 박테리아는 상대적으로 작고, 세포벽이 없고, 몰리쿠테스(Mollicutes) 클래스에 속한다. 특히, 어린 새끼 돼지는 상기 고전염성 질병에 취약하고, 전염은 대개 공기 또는 직접 접촉에 의해 이루어진다.
M.hyo로 인한 폐 질병은 주로 면역 매개 병상으로서, 경화된 (consolidated) 폐렴을 일으킨다. 특별한 독소를 배출하지는 않지만, 박테리아는 폐 섬모 상피에 증식하고 손상시켜 섬모 활동의 상실을 유발한다. 주거 환경 및 환경 스트레스에 따라, 이 질병의 가장 심각한 결과는 이것이 다른 박테리아 및 바이러스 병원체에 의한 돼지 호흡기 시스템의 상이한 2차 감염에 취약하게 만든다는 것이다. 이것은 소위 심각한 폐 병변을 보이는 돼지 호흡기 복합 증후군 (PRDC)을 발생시킨다. 동물에게 고통을 주는 것 이외에, EP 및 PRDC는 성장률 및 사료 전환율의 감소뿐만 아니라 수의 치료 및 항생제 사용 비용으로 인해 돼지 산업에 중요한 경제적 손실을 초래한다 (Thacker & Minion, 2012, Mycoplasmosis, in: Disease of swine, 10th ed., J. Wiley & Sons, p. 779 - 797).
PRDC와 관련된 다른 돼지 병원체는 다음과 같다: 돼지 써코바이러스 2형, 돼지 인플루엔자 바이러스 및 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스와 같은 바이러스; 및 해모필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 스트렙토코쿠스 수이스(Streptococcus suis) 및 악티노바실루스 플레우로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)와 같은 박테리아.
항생제는 부분적으로만 효과적이기 때문에, M.hyo 관련 질병 및 생산 손실에 대한 주요 치료법은 바람직하게는 돼지가 어릴 때 시행하는 백신 접종에 의한 것이다. 검토를 위해 문헌 [Maes et al. (2008, Vet. Microbiol., vol. 126, p. 297-309)]을 참조한다. 일반적으로, 새끼 돼지는 4주령까지 백신 접종을 실시하고, 선택적으로 수주 후에 추가 접종을 받는다.
M.hyo에 대한 백신 유도 면역에 의한 질병 통제의 정확한 메커니즘은 완전히 이해되지는 않은 상태이다. 백신 접종으로 폐의 콜로니화 (pulmonary colonisation) 또는 박테리아 전염을 완전히 막을 수는 없지만, 백신 접종은 폐의 콜로니화, 폐 병변, 및 폐렴과 같은 임상 증상을 실질적으로 감소시키고, 배출 (shedding)을 감소시키고, 1일 평균 체중 증가와 같은 경제적 생산성을 회복시키는 데 효과적이다. 백신 효능을 모니터링하기 위해, 이환율, 폐렴, 늑막염과 같은 상이한 임상 질병 파라미터를 재단리된 M.hyo의 검출 또는 정량에 의해, 예컨대 혈청학, 조직학 또는 PCR에 의해 평가하고 모니터링할 수 있다.
M.hyo 백신의 효능 및 보호를 결정하는 일반적인 방법은 폐 병변의 중증도 감소를 평가하는 것이다. 상기 병변은 전형적으로 예를 들어 굿윈 (Goodwin) 척도 (Goodwin et al., 1969, J. Hyg. Camb., vol. 67, p. 465-476)에 기초한 폐 경화의 육안 평가에 의해 부검 동안 채점되고, 상기 척도는 0점 내지 완전히 침범된 폐에 대한 최대 55점까지의 범위이다. 효과적인 백신의 경우, 백신 접종을 실시한 동물과 실시하지 않은 동물의 챌린지 감염 (challenge infection) 효과를 비교할 때 폐 병변 점수의 50% 초과의 감소가 관찰될 수 있다. 이러한 폐 병변 점수의 감소는 효과적인 면역 보호를 나타내고, 사료 전환율 및 평균 1일 체중 증가로 측정되는 돼지의 건강뿐만 아니라 돼지 생산성을 유의하게 회복시키는 것과 밀접하게 관련된다 (Maes et al., 2008, Vet. Microbiol., vol. 126, p. 297-309).
M.hyo는 시험관 내에서 배양될 수 있지만, 필수 영양소 자체를 전환하는 능력이 결여된 그의 작은 게놈을 보완하기 위해 매우 풍부한 배양 배지를 필요로 한다. 그 예는 문헌 [Friis (1975, Nord Vet. Med., vol. 27, p. 337-339)에 기재된 배지로서, 효모 추출물, 동물 혈청 및 돼지 및 소 기원의 다양한 추출물을 함유하는 복합 배지이다. 완전히 자랄 때, 전체 M.hyo 배양물은 대체로 화학적 또는 물리적 수단에 의해, 예를 들어 포르말린을 사용하여 불활성화되어 '박테린 (bacterin)' 유형의 항원인 M.hyo의 사멸된 전체 세포-배양 항원을 생산한다. 이어서, 불활성화된 배양물을 예를 들어 여과에 의해 농축하고 (예를 들어, 10-20배), 백신 제제화를 위해 사용할 수 있다. 이러한 M.hyo 박테린 항원은 영양이 풍부한 배지 및 농축물의 사용으로 인해 백신으로의 추가 가공에 영향을 줄 수 있는 많은 배지-유래 단백질, 지방산 등을 포함한다.
M.hyo에 대한 많은 상업용 백신이 존재하고, 이들은 대부분의 상업용 돼지 사육 사업에서 일상적으로 사용된다. 일반적으로, 이들은 비경구 주사에 의해 투여되는 아주반트 보강된 (adjuvated) 박테린으로 제조된 불활성화된 백신이다. 몇몇 예는 다음과 같다: 레스피슈어(RespiSure)™ (조에티스 (Zoetis)), 인겔박(Ingelvac)™ M.hyo 및 미코플렉스(MycoFLEX)™ (베링거 인겔하임 (Boehringer Ingelheim)), 효레스프(Hyoresp)™ (메리알 (Merial)), 스텔라뮨(Stellamune)™ 미코플라스마 (Mycoplasma) (엘란코 애니멀 헬쓰 (Elanco Animal Health)) 및 M+Pac™ (머크 애니멀 헬쓰 (Merck Animal Health)).
백신 생산 또는 개발에 사용되는 잘 알려진 M.hyo 균주는 다음과 같다: J 균주 (ATCC 기탁 nr. 25934), 균주 11 또는 균주 232이다.
이러한 백신에는 예를 들어 사용된 아주반트의 종류 (광유, 비-광유, 알루미늄 염, 합성 중합체 등), 적용되는 용량 (1 또는 2 ml), 백신 접종 연령 (1일, 7일령 이상, 3주령, 6주령 이상 등) 또는 투여 경로 (근육내, 피하 또는 피내)에서 몇몇 변형 및 개량이 사용되었다.
M+Pac 백신은 수성 담체에 분산된 광유의 수중유 에멀젼인 이중 아주반트, 에무나데(Emunade)™를 포함하고, 여기서 수성 담체는 수산화알루미늄 아주반트 (Aluminium-hydroxide adjuvant)를 포함한다. M+Pac 백신은 1996년부터 상업적으로 이용가능하다.
최근의 M.hyo 백신 개발은 부스터 (booster) 백신 접종을 필요로 하지 않는 백신, 소위 '원샷 (one-shot)'또는 '단일샷 (single-shot)' 백신을 제공함으로써 투여 요법에 맞춰 조정되고 있다. 대안으로, 투여량이 탄력적인 백신이 개발되었다: 원샷 또는 이중 투여, 즉 소위 '탄력적 용량 (flex-dose)', 예를 들어 1 ml 2회 또는 2 ml 1회.
유성 에멀젼 아주반트 다음으로, 알루미늄 염이 M.hyo 백신의 아주반트로 사용되었다. 알루미늄 염은 잘 알려진 아주반트이고, 인간 백신에서 사용되는 아주반트의 주요 유형이다. 상이한 염이 사용되고 있다: 결정질 알루미늄 옥시수산화물 (AlO(OH))인 '수산화알루미늄 아주반트'; 비정질 알루미늄 히드록시포스페이트 (Al(OH)m(PO4)n인 '황산알루미늄 아주반트'; 및 비정질 알루미늄 히드록시술페이트 (AlK(SO4)2)인 '황산알루미늄 아주반트' 또는 '명반'. 마지막 두 종류는 히드록실기를 각각 포스페이트 또는 술페이트기로 대체함으로써 형성된 알루미늄 옥시수산화물의 유도체이다. 검토를 위해, 문헌 [Hem & HogenEsch (2007, Expert Rev. Vaccines, vol. 6, p. 685-698)]를 참조한다.
알루미늄-염 아주반트의 작용 메카니즘은 아직 완전히 이해되지 않고 있고, 알루미늄 염에 대한 항원의 흡착 및 그의 백신 접종 표적의 신체 내부로의 방출이 기초를 이룬다. 항원의 알루미늄 염에 대한 결합은 물리적인 포착 (entrapment)과 같은 상이한 유형의 회합의 결과이지만, 또한 반대로 대전된 분자들 간의 정전기적인 상호작용도 관련된다. 또한, 공유 결합은 음이온 리간드 교환을 통해 생성될 수 있고, 이에 의해 항원으로부터의 포스페이트 기가 알루미늄 염의 히드록실 기를 대체한다. 이들 상이한 유형의 회합을 통해, 항원 및 알루미늄 염 아주반트는 결합된 항원이 변형된 구조를 가질 수 있지만 또한 안정화될 수 있는 복합체를 형성한다.
표적의 신체 내부에서, 아주반트-항원 복합체는 간질액의 상태 및 효소에 의해 분해되고, 항원은 해리되어 면역계에서 이용가능하다. 이에 의해, 알루미늄 염은 항원 제시 세포에 의한 항원의 흡수를 촉진한다. 또한, 알루미늄 염은 강력한 Th2 반응을 유도하여 항체 생산을 유도한다 (Exley et al. 2010, Trends in Immunol., vol. 31, p. 103 - 109).
수산화알루미늄 아주반트에서, 알루미늄 염은 뵈마이트 (boehmite) 결정의 형태이다. 이것은 염을 물 내에서 수성 콜로이드 겔을 형성하는 섬유상 구조로 만든다. 이는 또한 예를 들어 알히드로겔(Alhydrogel)™ (브렌탁 바이오섹터 (Brenntag Biosector)), 리히드라겔(Rehydragel)™ (레헤이스 (Reheis)) 및 레솝타르(Rehsorptar)™ (아모르 파마슈티칼 (Armour Pharmaceutical))와 같은 제품이 상업적으로 판매되는 방식이기도 하다. 이들 제품은 상이한 농도 및 품질로 이용가능하고, 결정의 크기도 다를 수 있고, 크기가 작은 결정일수록 더 많은 항원 결합능을 갖는다. 수산화알루미늄 아주반트는 약 11의 0 전하점을 갖고, 이것은 11 미만의 pH에서 양으로 하전된다는 것을 의미한다. 따라서, 6 내지 8의 생리적 pH에서, 아주반트는 음으로 하전된 항원 단백질을 흡착할 수 있다 (Al-Shakshir et al., 1994, Vaccine, vol. 12, p. 472 - 474).
흡착 및 복합체 형성은 빠르게 시작하지만, 완전한 흡착에는 몇 시간이 걸릴 수 있다. 흡착 수준은 또한 사용된 알루미늄 염의 결합 능력에 의해 결정된다. 그의 단백질 결합 능력을 정량하기 위해, 알려진 양의 표준 단백질을 사용하는 결합 검정이 사용될 수 있고; 수산화알루미늄 아주반트에 대하여 표준 결합 검정은 유럽 약전 논문 (European Pharmacopoeia monograph) 1664에 규정되어 있다. 상업용 수산화알루미늄 아주반트는 일반적으로 생리학적 pH에서 알루미늄 1 mg당 2.5 mg 이하의 알부민에 결합할 수 있다.
경제적으로 큰 영향을 미치는 매우 관련된 또 다른 돼지 병원체는 돼지 써코바이러스 2형 (PCV2)이다. 검토를 위해, 문헌 [Gillespie et al. (2009, J. Vet. Intern. Med., vol. 23, p. 1151-1163)]을 참고한다. PCV2는 원래 어린 돼지에서 관찰된 "이유후 전신 소모성 증후군" (PMWS)의 원인 물질로 확인되었다. 임상 징후 및 병상은 점진적 쇠약, 호흡 곤란, 빈호흡, 및 때때로 황달을 포함한다. 돼지 써코바이러스는 써코비리대(Circoviridae)의 과에 속하고, 약 1760개 뉴클레오티드의 원형, 단일 가닥 DNA 게놈을 포함하는 캡시드와 함께 작은 (17 nm) 20면체의 외피가 없는 바이러스를 포함한다. 게놈은 그의 ORF2가 약 28 kDa의 바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 몇 개의 개방 해독 프레임만을 포함한다. 여기에는 주요 바이러스 중화 에피토프가 포함되어 있다.
PCV2는 비교적 안정하고, 감염성이 높다. 이것은 상이한 종류의 신체 분비물을 통해 흘러나오고, 돼지 무리에서 수평 및 수직으로 전파된다. PCV2가 림프친화성 (lymphotropic)이기 때문에, PCV2 감염으로 인한 주요 병변은 림프계 고갈이다. 이것은 면역억제를 일으켜 PCV2에 감염된 동물이 2차 감염에 취약하게 된다. 따라서, PMWS 다음으로, PCV2는 돼지 써코바이러스 (관련) 질병 (PCVD 또는 PCVAD)으로 집합적으로 명명된 많은 다른 돼지 질병 증후군에도 관여한다. 가장 두드러진 PCVD는 돼지 호흡기 복합 증후군, 돼지 피부염 및 신병증 증후군, 생식 부전, 육아종성 장염, 선천성 진전 및 삼출성 표피염이다.
그러나, 2차 감염의 명백한 징후가 없다면, PCV2로 감염된 돼지의 대다수는 질병의 명백한 임상 증상을 나타내지 않는다. PCV2에 의한 상기 무증상 감염은 단지 외관상 건강한 돼지에서의 불량한 성장 및 생산성을 나타낸다.
PCV2에 의해 야기되는 PCVD의 임상 증상 (또는 무증상)은 돼지에서 대체로 새끼 돼지가 젖을 떼고 모체 유래 보호 항체가 감소하기 시작하는 시기인 3 또는 4주령 이후에 관찰될 수 있다.
PCV2에 대해 보호하기 위해, 상업용 백신이 개발되어 전 세계적으로 사용되고 있다. 백신의 상이한 종류는 다음과 같다: 불활성화된 전체 PCV2 바이러스 (써코박(Circovac)™, 메리알) 또는 불활성화된 키메라 PCV1/PCV2 바이러스 (수박신(Suvaxyn)™ PCV/포스테라(Fostera)™ PCV, 조에티스)를 기반으로 하는 백신; 재조합 발현 캡시드 단백질을 기반으로 하는 서브유닛 백신 (인겔박™ 써코플렉스(CircoFLEX), 베링거 인겔하임; 포실리스(Porcilis)™ PCV/써컴벤트(Circumvent)™ PCV, 머크(Merck)/MSD AH). 상기 마지막 유형의 백신은 배큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에서 PCV2 ORF2의 재조합 발현에 의해 생산된다. 발현된 캡시드는 바이러스-유사 입자 (VLP)로 자가-조립된다. 이것은 바이러스 게놈이 결여되고 따라서 복제가 불가능하다는 점을 제외하고는 천연 PCV2 비리온과 유사하다. 상기 PCV2 VLP에 기초한 백신은 이미 수중유 에멀젼으로서 아주반트 보강되어 동물 투여당 약 20 마이크로그램의 PCV2 VLP에서 안전하고 효과적임이 입증되었다 (WO 07/028.823 참조).
사용된 아주반트의 종류에 따라, PCV2 백신의 효능은 체액성 또는 세포성 면역에 더 많이 기초할 수 있다. 역가는 시판되는 Elisa: 신바이오틱스 (Synbiotics) 세렐리사(SERELISA)™ PCV2 Ab 모노 블로킹 (Mono Blocking) ELISA를 사용하여 측정할 수 있다. 별법으로, 문헌 [Haake et al. (2014, Vet. Microbiol., vol. 168, p. 272-280)]에 기재된 바와 같이 사내 (in-house) 간접 Elisa가 사용될 수 있다.
PCV2 백신은 PCV2 바이러스 복제 및 전파를 감소시킨다. 이것은 폐 및 림프 조직 내의 PCV2 바이러스 부하를 감소시키고, 림프계 고갈, PCVD 및 감염의 수평 전파로부터 보호한다. 따라서, 이것은 사망률 감소, 보다 양호한 평균 1일 체중 증가 및 사료 전환 개선과 같은 백신 접종 돼지 집단의 전반적인 건강 및 생산성을 회복시킨다.
백신 효능 및 보호는 PCV2 특이적 항체 수준을 결정하거나, 혈청 또는 분비물 (구강, 비강, 대변, 소변)에서 PCV2 바이러스 부하를 검출하거나, PCR, (면역)조직학, 혼성화 또는 혈청학적 검사를 통해 PCVD와 관련된 다른 병원체를 검출함으로써 측정할 수 있다.
백신 개발에 사용되는 PCV2 균주는 일반적으로 PCV2a 유전자형이고, 이들은 또한 PCV2b 유전자형의 균주에 대해 교차 보호한다.
포실리스 PCV와 같은 PCV2에 대한 오일-아주반트 보강된 백신은 주사 부위에서 중등도 내지 고도의 국소 반응을 유도하는 것으로 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [Astrup & Larsen (2010, Poster no. P.049, in: Proceedings 21st IPVS Congress, Canada, 18-21 July)]을 참고한다. 접종 후 며칠 동안, 국소 팽윤이 수 센티미터까지의 크기로 관찰되었다. 그러나, 이러한 주사 부위 반응은 통증이 없고 일시적이므로, 허용가능한 한도 내이다. 또한, 이들은 일관된 전신 반응과 관련이 없고, 백신 접종 효능에 영향을 미치지 않았다. 그럼에도 불구하고, 상기 유형의 백신의 안전성을 개선할 여지가 있다.
PCV2 감염으로 인한 질병 증상은 M.hyo 감염으로 악화될 수 있고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 따라서, 효과적인 돼지 보호를 위해, 우수한 돼지 건강 및 경제적 수익성을 유지하기 위해 PCV2와 M.hyo 둘 모두에 대한 백신 접종이 필요하다. 따라서, 이중 백신 접종은 PCV2 및 M.hyo에 대한 별도의 단일 항원 백신을 사용하여 적용할 수 있다. 그러나, 투여가 쉽고 노동 비용을 절약하기 위해서는 혼합 백신을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 어린 돼지는 환경 스트레스 요인에 매우 민감하기 때문에, 처리 횟수를 줄이면 건강 및 생산성에 직접적으로 도움이 된다. 혼합 백신이 부스터 백신 접종을 필요로 하지 않아서 단일 투여가 모든 비육기 동안 여러 질병에 대한 보호를 제공하는 것이 훨씬 더 좋다.
1회 투여로 두 병원체 모두에 대한 백신 접종을 가능하게 하는, PCV2 및 M.hyo에 대한 상업적 혼합 백신이 이용가능하다 (Kim et al. (2011, Vaccine, vol. 29, p. 3206-3212). 그 예는 다음과 같다: 써컴벤트™ PCV-M (MSD AH) 및 포스테라™ PCV MH (조에티스)는 모두 탄력적 용량 투여를 위한 즉시 사용가능한 혼합 백신이고, 유성 아주반트를 함유하는 수중유 에멀젼이다. 포스테라 PCV MH의 제품 팜플렛에서, 조에티스는 PCV2 항원과 결합하기 전에 단백질 A 컬럼 크로마토그래피로 M.hyo 항원을 정제함으로써 M.hyo와 PCV 항원 사이의 간섭을 극복하였다고 설명하였다. 그러나, 통상의 기술자는 이러한 정교한 정제가 힘들고 비용이 많이 들고, 백신 제품의 경제적 타당성을 감소시킨다는 것을 이해할 것이다.
또한, 수성 중합체 아주반트를 사용하는 인겔박™ 써코플렉스/미코플렉스™ (베링거 인겔하임)가 관련된다. 그러나, 이 마지막 백신은 즉시 사용할 수 없고, 투여 직전에 별도의 병에서 2개의 백신 성분을 현장에서 혼합해야 하고, 이것은 실용적이지 않다.
따라서, 상기 모든 백신은 효과적이지만, 안전성, 효능 또는 사용 편의성에 대한 추가의 조정 및 개선은 수의학 분야에 더 많은 이익을 가져다줄 것이다.
에무나데 아주반트의 실험적 PCV2/M.hyo 백신은 이전에 설명되었다 (Eggen et al., 2010, Oral presentation no. O.072, in: Proceedings 21st IPVS Congress, Canada, 18-21 July). 이 백신은 M.hyo에 의해 유도된 폐 병변 (NB: n=8, 이상치 (outlier) 교정)을 상당히 감소시킴을 입증하였고, 이 유형의 백신에 효과적이라고 여겨지는 항-PCV2 항체의 수준을 유도하였다. 이 백신은 M.hyo 및 PCV2 항원을 빈 (empty) 에무나데 수중유 에멀젼과 혼합하여 제조되었다. 저자들은 원칙적으로 PCV2 및 M.hyo 항원을 표적에서 면역학적 간섭없이 즉시 사용가능한 백신으로 조합할 수 있다고 결론내렸다.
그러나, 이 백신은 사용된 PCV2 VLP 항원이 CsCl-구배에 걸친 초원심분리에 의해 90% 초과의 순도로 정제되었기 때문에 대규모 상업화에 적합하지 않았다. 이것은 안전성을 높이고 국소 부위 반응을 방지하기 위해 시도되었다. 이러한 유형의 항원 하류 처리는 매우 노동 집약적이고 비용이 극히 많이 들기 때문에, 경제적인 측면에서 볼 때 대규모로 적용할 수 없고, 특히 비용이 많이 드는 수의용 백신 분야에서 적용될 수 없다.
최근 공개된 국제 특허 출원 WO 2014/182872는 즉시 사용가능한 PCV2/M.hyo 혼합 백신을 설명하고 있다. 이 백신은 먼저 M.hyo 항원을 가용화한 후 사포닌과 혼합하고, 이어서 PCV2 항원을 가용화하여 M.hyo/사포닌 혼합물에 첨가하여 제조한다. 마지막으로, 가용화된 항원의 혼합물은 오일-아주반트 또는 알루미늄 아주반트와 조합된다. 어떠한 예도 알루미늄 아주반트 보강 백신의 제조 또는 사용에 대해 설명하고 있지 않다.
최근 발표된 바에 따르면, 즉시 사용가능한 PCV2/M.hyo 혼합 백신의 개발은 여전히 매우 어렵다: 베링거 인겔하임 (현장 혼합용 인겔박™ 써코플렉스/미코플렉스™ 백신 생산 및 판매)은 최근에 즉시 사용가능한 PCV2/M.hyo 혼합 백신을 개발하려는 노력을 종결하였다는 성명을 언론에 발표하였다. 이는 안전 및 효능의 허용가능한 수준을 달성하지 못하였기 때문이다. 베링거 인겔하임의 2014년 9월 1일자 기업 보도 자료 (www.boehringer-ingelheim.com/news/news_releases/press_releases/2014/01_september _2014animal.html)는 다음과 같이 언급하고 있다:
"베링거 인겔하임 애니멀 헬쓰는 시장을 선도하는 돼지 백신 제조업체로서, 새로 혼합된 돼지 써코바이러스 2형 (PCV2)/미코플라스마 히오뉴모니애 (M.hyo) 백신에 집중하고, PCV2/M.hyo 즉시 사용가능한 (RTU) 혼합 백신의 개발을 수행하지 않기로 결정하였다. 따라서, 당사는 PCV2/M.hyo RTU 연구 프로그램을 중단하였다. 초기 데이터가 유망했지만, 시간이 지남에 따라 RTU 설계가, 베링거 인겔하임의 플렉스콤보(FLEXcombo)® 플랫폼에 대해 알려진 높은 수준의 효능 및 안전성을 충족시키지 못하는 것이 분명해졌다".
결과적으로, 효과적이고 안전하며 사용자 친화적이고 경제적으로 실현가능한 M.hyo 및 PCV2에 대한 개선된 혼합 백신에 대한 현장에서의 지속적인 요구가 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 선행 기술의 단점을 극복하고, 투여시에 안전성이 매우 뛰어나고 즉시 사용가능한 단일샷 백신으로서, PCV2 및 M.hyo에 의해 야기되는 감염 및 질병에 대해 매우 효과적인 PCV2/M.hyo 혼합 백신을 제공함으로써 이 분야의 상기 필요성을 수용하는 것이다.
처음에 본 발명자들은 에겐 (Eggen) 등의 상기 문헌에 발표된 결과를 표준 PCV2 VLP 항원을 사용할 때 수득할 수 없었음을 알고 실망하였다. 이러한 표준 항원은 포실리스 PCV/써컴벤트 PCV 백신과 같은 상업적인 PCV2 VLP 백신에 사용되는 항원이다. 이것은 허용가능한 안전성을 갖고 매우 효과적이다. 그러나, 고도로 정제되기보다는, 보다 경제적으로 실현가능한 수준의 하류 공정으로 생산된다. 이렇게 하면 항원이 훨씬 덜 순수해진다.
에겐 등에 의해 적용된 절차에 따라, 본 발명자들은 빈 에무나데 아주반트와 M.hyo 박테린 및 상기 표준 PCV2 VLP 항원의 직접적인 조합을 만들었다. 불행히도, M.hyo 챌린지 감염에 대한 정상적인 보호 수준의 절반 미만을 제공하는 백신을 얻었고: 폐 병변이 에무나데에 M.hyo 항원만 함유하는 백신 (M+Pac™)을 사용했을 때 66% 감소에 비해 단지 30%만 감소하였다. 그 결과는 이하 실시예 섹션에 제시된다.
따라서, 본 발명자들은 돼지에 대한 즉시 사용가능한 PCV2/M.hyo 혼합 백신에서 M.hyo 백신 효능이, 백신 항원을 포함하는 조성물의 제조에 특수 과정을 적용함으로써만, 즉 M.hyo 항원 및 수산화알루미늄 아주반트의 복합체가 형성된 후에야 PCV2 항원을 첨가함으로써만 원하는 수준으로 만들 수 있음을 발견하고 놀라게 되었다.
유사하게, 본 발명자들은 본원에서 설명되는 바와 같은 PCV2/M.hyo 혼합 백신이 PCV2 단일 항원 백신과 비교하여 상기 유의하게 개선된 안전성 프로파일을 나타냄을 놀랍게도 발견하였다.
상기 특수 제조된 항원 조성물로 만들 수 있는 PCV2/M.hyo 혼합 백신은 단일 투여 후에 이미 M.hyo 및 PCV2에 의한 감염 및 질병에 대해 매우 효과적이고, 투여시 매우 양호한 안전성을 갖고, 즉시 사용가능하고, 고순도가 아닌 PCV2 항원을 수용할 수 있다는 점에서 경제적으로 유용하다. 사실, 백신의 효능은 M.hyo 또는 PCV2에 대한 단일 항원 백신의 효능과 동일하다. 또한, 돼지에 사용시에 백신에 의한 유의한 국소 반응 또는 전신 반응이 관찰되지 않아 투여시 안전성이 완벽하였다.
상기 혼합 백신이 돼지 생산 산업에서 사용될 수 있는 잠재적으로 큰 규모를 고려할 때, 이러한 효과 및 개선은 중요하고, 상업적으로 매우 의미있는 놀라운 기술적 효과를 나타낸다. 따라서, 이러한 방식으로 본 발명의 목적이 충족될 수 있고, 따라서 선행 기술의 단점을 극복할 수 있다.
M.hyo 항원이 수산화알루미늄 아주반트에 흡착되는 동안 PCV2 항원이 존재하지 않아야 하는 이유는 현재 알려져 있지 않다. 새로운 PCV2/M.hyo 혼합 백신의 안전성이 왜 그렇게 좋은지도 알려져 있지 않다.
본 발명자들은 이러한 관찰을 설명할 수 있는 임의의 이론 또는 모델에 지지되기를 원하지 않지만, M.hyo 항원과 수산화알루미늄 아주반트 사이에 복합체가 형성되는 동안 PCV2 항원이 존재할 때, 이것이 수산화알루미늄 아주반트에 대한 M.hyo 항원의 효율적인 흡착을 어떤 방식 또는 형태로든 방해할 수 있다고 추정한다. 또한, M.hyo 항원과 같이 수산화알루미늄 아주반트에 결합하지 않는 PCV2 항원은 형성되는 복합체에 얽히게 될 수 있다. 한 가지 방식 또는 다른 방식으로, 이것은 M.hyo 항원에 대한 나중의 면역 반응을 방해한다.
새로운 혼합 백신의 안전성 증가의 원인이 유사하게 추측된다. 이것은 상기 항원과 에무나데 이중 아주반트 내의 성분, 즉 광유 및 수산화알루미늄 아주반트와의 상호작용에 의해 개선되었을 수 있고, 상기 상호작용은 알루미늄이 없는 유성 아주반트에서는 일어나지 않는 것이다. 이러한 상호작용은 그렇지 않으면 주사 부위 반응을 유발할 수 있는 PCV2 항원 내의 물질(의 영향)을 감소시킬 수 있다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 미코플라스마 히오뉴모니애 (M.hyo)의 항원 및 돼지 써코바이러스 2형 (PCV2)의 항원을 포함하는, 즉시 사용가능한 돼지용 혼합 백신을 위한 항원 조성물의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 수산화알루미늄 아주반트에 흡착된 M.hyo 항원의 미리 형성된 항원/아주반트 복합체에 PCV2 항원을 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 "즉시 사용가능한"은 표적 동물에 투여할 준비가 되기 위해 2개 이상의 용기의 내용물(의 일부)을 조합할 필요가 없다는 것을 의미한다. 예를 들어, 용해 또는 혼합 단계가 필요 없고, 단일 병 내의 에멀젼으로서 최종 사용자가 이용할 수 있다.
즉시 사용가능한 백신의 경우, 화합물의 필요한 조합은 통제된 환경에서 백신 제조업체에 의해 수행되었다. 이것은 특히 현장에서의 혼합에 비해 뚜렷한 장점이 있는데, 주로 최종 사용자가 사용하기 쉽고, 특히 매우 많은 수의 동물에게 백신을 접종할 때 편리하다. 다른 장점은 제조사가 무균 조건에서 조합을 수행할 수 있고 최종 혼합물에 대한 다양한 품질 보증 시험을 적용하여 그의 정확한 조성 및 품질을 보장할 수 있다는 것이다.
그러나, 이것은 즉시 사용가능한 백신이, 에멀젼의 침강물 또는 거품을 없애기 위해 손으로 가볍게 흔들거나 또는 백신이 냉장 보관되었을 때 접종 전의 가온과 같은 몇몇 종류의 간단한 전처리를 필요로 할 수 있다는 것을 배제하지는 않는다.
용어 "돼지 (swine)"는 수이대(Suidae) 과의 동물을 말하고, 바람직하게는 돼지 (porcine)라고도 언급되는 수스(Sus) 속 동물을 지칭한다. 그 예는 다음과 같다: 야생 돼지 또는 가축 돼지, 비육돈 (hog), 멧돼지, 바비루사 (babirusa) 또는 혹멧돼지 (warthog). 이것은 또한 예를 들어, 암퇘지 (sow), 퀸 (queen), 수퇘지 (boar), 거세한 수퇘지 (barrow), 비육돈, 새끼를 낳은 일이 없는 암퇘지 (gilt), 젖을 갓 뗀 어린 새끼 (weaner) 또는 새끼 돼지와 같은 성별 또는 나이를 나타내는 임의의 이름으로 표시되는 돼지를 포함한다.
"미코플라스마 히오뉴모니애" (M.hyo)와 "돼지 써코바이러스 2형" (PCV2)이라는 용어는 각각 그의 분류학적 군 구성원의 특징, 예컨대 형태학적, 게놈, 및 생화학적 특징, 및 그 군의 생물학적 특징, 예컨대 생리적, 면역학적 또는 병리학적 거동을 나타내는 박테리아 및 바이러스성 미생물을 의미한다. 여기에는 예를 들어 아종, 균주, 단리물, 유전자형, 변이체, 아형 또는 하위 집단 등과 같이 임의의 방식으로 하위 분류된 M.hyo 박테리아, 및 PCV2 바이러스도 포함된다.
두 미생물은 모두 관련 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌 ["The Merck veterinary manual" (10th ed., 2010, C.M. Kahn edt., ISBN: 091191093X), and: "Diseases of Swine" (10th ed., 2012, J. Zimmerman et al., edt., ISBN-10: 081382267X)]과 같은 편람에 기재되어 있다.
통상의 기술자라면, 본 발명에 대한 M.hyo 박테리아 또는 PCV2 바이러스가 현재 특정 종 및 속에 분류되지만, 이것은 새로운 통찰력을 통해 새로운 또는 상이한 분류군으로의 재분류로 이어질 수 있기 때문에, 시간에 따라 변할 수 있는 분류학적 분류라는 것을 알 것이다. 그러나, 이것은 미생물 그 자체 또는 그의 항원 레퍼토리를 변화시키지 않고 단지 그의 학술적 명칭 또는 분류만을 변경시키기 때문에, 이러한 재-분류된 미생물은 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명에서, 미생물의 "항원"은 원칙적으로 면역 반응을 유도할 수 있다면 (단독으로 또는 아주반트와 함께), M.hyo 박테리아 또는 PCV2 바이러스로부터 유래된 임의의 유형의 항원 물질일 수 있다. 바람직하게는, 각각의 항원 물질은 그것이 백신 접종된 표적 돼지에서 유도하는 면역 반응이 보호성이도록, 즉 M.hyo 또는 PCV2에 의한 감염 및 질병의 관련 징후를 예방하거나 감소시킬 수 있는 충분한 강도를 갖도록 하는 크기, 구조, 형태 또는 품질을 갖는다.
본 발명에 사용하기 위한 항원은 불활성화된 미생물일 수 있거나, 서브유닛, 추출물, 분획, 균질물 또는 초음파 처리물과 같은 그의 일부일 수 있다. 항원은 단백질, 지단백질, 당단백질 및 핵산과 같은 하나 이상의 유형의 분자를 함유할 수 있다. 항원은 생물학적이거나 (반)합성 기원일 수 있고, M.hyo 박테리아 또는 PCV2 바이러스와 같은 미생물로부터 직접적으로 또는 간접적으로 유도될 수 있다.
M.hyo 항원의 예는 박테린이다. 이것은 박테리아 배양물의 전체 또는 일부의 불활성화에 의해 관련 기술 분야에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 불활성화는 열, 방사선 또는 포르말린, 베타-프로피오락톤, 2원 에틸렌이민 (BEI) 또는 베타-에탄올아민과 같은 화학물질을 사용하여 임의의 적절한 기술로 처리함으로써 수행될 수 있다. 이어서, 생성되는 박테린은 무손상 및 손상된 세포 조각, 세포 내용물, 및 세포 배양 과정에서 세포로부터 분비된 인자, 및 배양 배지 및 그의 다양한 성분의 인자의 복합 혼합물이다.
PCV2 항원의 예는 현장에서 일반적으로 적용되는 바이러스 캡시드 단백질에 기반한 서브유닛 백신이다. 이것은 바이러스 ORF2 게놈 서열의 재조합 발현에 의해, 예를 들어 바큘로바이러스/곤충 세포 시스템에 의해 생성될 수 있다. 이어서, 곤충 세포 배양물로부터, 예를 들어, 원심분리를 사용하여 자체 조립된 VLP를 단리할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "포함하다" (및 "포함하다", "포함하는" 및 "포함한"과 같은 변형 표현)는 명시적으로 언급되지 않은 경우에도 이 용어가 사용된 문장, 단락, 청구항 등에 의해 포괄되거나 이들에 포함되는, 본 발명에 대해 생각가능한 모든 요소 및 임의의 가능한 조합을 지칭하고, 임의의 상기 요소(들) 또는 조합의 배제를 나타내지 않는다. 따라서, 상기 문장, 단락, 청구항 등은 또한 "포함하다" (또는 그의 변형 표현)라는 용어가 "~로 이루어지다", "~로 이루어지는" "또는 "~로 본질적으로 이루어지는"이라는 용어로 대체되는 하나 이상의 실시양태(들)에 관련될 수 있다.
"항원/아주반트 복합체"는 본원에서 정의된 바와 같이, 수산화알루미늄 아주반트에 대한 M.hyo 항원(의 성분)의 흡착시에 형성된 거대분자 구조를 의미한다. 이 흡착은 많은 물리적 및 화학적 상호작용에 의해 발생하기 때문에, 복합체는 정확하게 화학적 용어로 정의될 수 없다. 복합체의 조성 및 구조는 또한 사용된 항원 및 아주반트의 조성 및 특징, 및 이들이 형성되는 조건에 따라 좌우된다. 이것은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있고, 관련 분야에서 받아들여지고 있다. 항원 및 아주반트의 요구되고 바람직한 특징, 및 이들의 복합체를 형성하기 위한 조건이 본원에서 설명된다.
용어 "미리 형성된"은 이 용어가 의미하는 항원/아주반트 복합체의 형성이 보다 이른 시점에 일어났음을 의미한다. 본 발명에서, 이것은 M.hyo 항원과 수산화알루미늄 아주반트 사이의 복합체가 임의의 PCV2 항원이 조성물에 첨가되기 전에 형성되었고, 따라서 복합체의 형성은 PCV2 항원의 부재 하에 발생한다는 것을 의미한다.
본 발명자들은 이것이 PCV2 항원에 의한 간섭 또는 이 항원의 공동-포획 없이, 제시된 M.hyo 항원이 그 상황 하에서 수산화알루미늄 아주반트에 가능한 한 완전히 흡착되도록 허용한다고 추측한다. 결과적으로, 본 발명에 따른 항원 조성물로 제조된 백신에서, M.hyo 항원에 대한 면역 반응이 최적이다.
항원을 수산화알루미늄 아주반트에 흡착시키는 일반적인 조건은 예를 들어 제약 안내서, (인간) 백신 생산에 관한 정부 지침 및 아주반트 제조자의 지시로부터 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 그러나, 수산화알루미늄 아주반트와 M.hyo 박테린 항원은 고도로 규정된 조성을 갖고 있지 않다. 이는 공정 조건 및 본 발명을 위한 항원/아주반트 복합체의 형성을 위해 얻어지는 최종 수준을 매우 구체적으로 규정하는 것을 어렵게 만든다. 그럼에도 불구하고, 생화학자 또는 약사와 같은 제약 제제의 제조 분야의 통상의 기술자 또는 상기 기술을 가진 팀은 제시된 M.hyo 항원 및 수산화알루미늄 아주반트에 대해 가능한 최대 흡착을 달성하기 위해 상기 조건을 쉽게 변경하고 최적화할 수 있을 것이다. 이어서, 달성된 흡착 수준을 결정하여 상이한 조건 및 물질의 효과를 비교할 수 있다.
예를 들어, M.hyo 항원이 실제로 수산화알루미늄 아주반트에 흡착되어 있는지, 만약 그렇다면 얼마나 많이 흡착되었는지는 생화학적 방법으로 편리하게 결정할 수 있고, 그 이유는 수산화알루미늄 결정이 원심분리에 의해 쉽게 펠렛화될 수 있기 때문이다. 이것은 항원/아주반트 복합체의 형성 정도를 나타내는, 그 펠렛 내의 M.hyo 항원의 양을 결정할 수 있게 하고; 별법으로 이것은 복합체 형성이 일어나지 않았거나 완전하지 않은 경우에 상청액에 남아있는 M.hyo 항원의 양을 결정할 수 있게 한다.
펠렛 또는 상청액 내의 M.hyo 항원의 검출은 항체-기반 방법, 예를 들어 실시예에서 개관된 Elisa를 사용하여 실시할 수 있다. 다른 대안은 임의의 결합된 M.hyo 항원을 펠렛 내의 수산화알루미늄 아주반트로부터 해리시키고, 예를 들어 전기영동을 사용하여 방출된 항원을 분석하는 것이다. 상기 해리는 상이한 방식으로, 예를 들어, 포스페이트 이온을 사용한 pH 조절에 의해, 또는 펠렛의 초음파 처리에 의해 가능하다. 이들은 모두 관련 기술 분야에 설명되어 있다.
수산화알루미늄 아주반트의 흡착 용량이 실제로 M.hyo 항원과의 복합체 형성을 위한 특정 조건 하에서 얼마나 많이 사용되었는지 시험함으로써 추가의 최적화가 가능하다. 이것은 규정된 양의 알려진 단백질을 사용하여 후속 복합체를 형성하고, 예를 들어 유럽 약전 논문 1664에 기재된 결합 검정을 사용하여 그 시험 단백질의 어느 정도가 추가로 결합될 수 있는지를 결정함으로써 수행될 수 있다. 이것은 흡착 용량이 사용되지 않았는지 그리고 얼마나 많이 흡착 용량이 사용되었는지를 표시할 것이다.
제시된 M.hyo 항원 또는 제시된 수산화알루미늄 아주반트에 대해, 항원/아주반트 복합체 중의 M.hyo 항원의 양이 실질적으로 추가로 증가될 수 없는 경우, 예를 들어 흡착 파라미터, 예컨대 온도, pH, 지속 시간 또는 성분의 상대적인 양을 조정함으로써 복합체 형성은 가능한 한 완전해진다. 또한, 수산화알루미늄 아주반트의 결합 능력이 M.hyo 항원에 의해 가능한 한 많이 이용될 때, 복합체 형성은 가능한 한 완전해지고, 되고, 실질적으로 추가로 감소될 수 없다.
예를 들어, 항원 조성물은 본 발명의 방법에 따라 제조될 수 있다. 이것은 원심분리가 가능하고, 그 후 펠렛 및 상청액은 별도로 시험할 수 있다. 폴리클로날 토끼 항 M.hyo 항혈청을 사용함으로써, 검출가능한 M.hyo 항원의 상대적 양에 대해, 예를 들어 Elisa 설정에서 상청액의 희석 범위 또는 재현탁된 펠렛을 시험할 수 있다.
특정 조건은 M.hyo 항원과 수산화알루미늄 아주반트의 항원/아주반트 복합체 형성을 최적화하는데 도움이 되는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명에 따른 방법의 한 실시양태에서, 항원/아주반트 복합체는 다음 단계에 의해 미리 형성된다:
a. 수산화알루미늄 아주반트 및 M.hyo 항원을 수산화알루미늄 아주반트가 양전하로 하전되는 pH의 수성 담체에서 혼합하는 단계 및
b. 단계 a.의 혼합물을 인큐베이팅하여 수산화알루미늄 아주반트에 대한 M.hyo 항원의 흡착을 허용하고 항원/아주반트 복합체를 형성시키는 단계.
"수성 담체"는 항원/아주반트 복합체를 효과적이고 완전하게 형성할 수 있다면 원칙적으로 수성 액체일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 수성 담체는 정제된 물에 완충제 또는 염만을 함유하는 비교적 단순한 담체이고, 예를 들어, 수성 담체는 평형 염 용액과 같은 생리학적 완충제이거나, '정상 염수'로도 알려진 생리학적 염 용액이고; 이것은 잘 알려져 있고, 정제수 내에 0.85% w/v 염화나트륨을 함유한다. 본 발명의 경우, 액체는 그의 부피 또는 중량의 50% 초과의 물로 이루어지는 경우 '수성'이다.
'정제수'는 바람직하게는 '주사용수'이고, 일반적으로 이것은 증류수, 이중 증류수, 미세 여과수 또는 삼투압 정제수로 제조되고, 이는 멸균되고 기본적으로 발열원이 없다.
관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, "양전하로 하전된"은 규정된 조건 하에서 수용액에서 순 양전하를 갖는 화합물을 지칭한다.
수산화알루미늄 아주반트가 양전하로 하전되는 pH 범위는 0에서 약 11이고, 여기서 11은 0 전하점이다. 따라서, 약 11 이하의 pH 조건에서, M.hyo 항원은 수산화알루미늄 아주반트에 효과적으로 결합할 수 있다. 그러나, M.hyo 항원의 일부 변성이 높거나 낮은 pH 수준에서 발생할 수 있기 때문에, 보다 생리적인 pH가 바람직하다. 따라서, 수성 담체의 pH는 바람직하게는 5 내지 10, 보다 바람직하게는 5.5 내지 9, 6 내지 8, 또는 심지어 6.2 내지 7.8이다. 가장 바람직한 수성 담체의 pH는 약 6.5 내지 약 7.5다.
이들 값에서, M.hyo 항원은 생리학적 조건에서 유지되는 반면, 수산화알루미늄 아주반트는 여전히 양전하로 하전되어 M.hyo 항원이 효과적으로 흡착될 수 있다.
"단계 a.의 혼합물을 인큐베이팅하기" 위한 조건은 항원/아주반트 복합체의 효과적인 형성이 필요하긴 하지만, 그다지 중요하지 않다.
본 발명자들은 수산화알루미늄 아주반트에 대한 M.hyo 항원의 흡착이 두 성분이 혼합된 후에 신속하게 시작하지만, 완전한 흡착을 달성하기 위해서는 적절한 시간이 필요하다는 것을 발견하였다. 따라서, 단계 a.에서 설명된 바와 같이 혼합물을 인큐베이팅하기 위한 바람직한 시간은 적어도 15분, 보다 바람직하게는 적어도 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 또는 24시간이다 (바람직한 순서의 역순으로 제시됨). 실제 상황 하에서, 인큐베이팅은 바람직하게는 "밤새" 수행되고, 이것은 약 12시간 내지 약 18시간의 시간에 대응한다.
본 발명자들은 또한 수산화알루미늄 아주반트에 대한 M.hyo 항원의 흡착이 인큐베이팅 온도에 대해 비교적 넓은 허용성을 갖는다는 것을 발견하였고; 실온에서뿐만 아니라 4℃에서 냉장할 때도 효과적인 흡착이 관찰되었다. 그러나, 관련 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, 수산화알루미늄 아주반트는 결정 구조를 손상시킬 수 있으므로 냉동되지 않아야 한다. 또한, 정상적인 포유동물의 체온, 돼지의 경우 38 내지 40℃보다 훨씬 높은 온도에서는 M.hyo 항원의 일부 변성이 일어날 수 있다. 따라서, 단계 a.에서 설명된 바와 같이 혼합물을 인큐베이팅하기에 바람직한 온도는 약 2 내지 약 45℃이다. 온도는 보다 바람직하게는 4 내지 40℃ 또는 심지어 10 내지 38℃이다. 가장 바람직한 온도는 약 15℃ 내지 약 30℃인, '주위 온도'로도 알려진 '실온'이다.
수산화알루미늄 아주반트인 겔의 점성 특성을 수용하기 위해, 본 발명에 따른 방법에서 단계 a.의 혼합물의 인큐베이팅은 혼합물이 움직이고 있는 동안 수행되는 것이 바람직하다. 그러나, 관련 기술 분야에 잘 공지된 바와 같이, 수산화알루미늄 아주반트의 격렬한 혼합은 결정 구조를 손상시킬 수 있다. 따라서, 혼합물의 몇몇 종류의 완만한 교반이 선호된다. 예를 들어, 자성 막대를 사용하거나 완만한 궤도 또는 요동 (rocking) 운동을 제공하는 다양한 형태의 진탕기 또는 테이블을 사용하여 교반할 수 있다. 이들 모두가 일반적으로 이용가능하다. 본 발명에서, 완만한 교반은 250 rpm 이하, 바람직하게는 150 rpm 이하의 교반 또는 회전 운동을 위한 것이고; 하나의 '회전'은 시작 위치로 복귀할 때까지의 완전한 원 운동이다. 요동 운동을 위해서는, 200 사이클/분 이하, 바람직하게는 100 사이클/분 이하이다. 한 '사이클'은 시작 위치로 복귀할 때까지 상하 운동의 전체적인 연속 사건이다.
본 발명에 따른 방법에서 사용되는 항원에 관하여:
M.hyo 항원은 바람직하게는 전체 배양물로부터 제조된 박테린이고; 박테린은 바람직하게는 BEI로 불활성화되고; 박테린은 바람직하게는 (한외)여과 또는 투석을 사용하여 약 10 - 30배로 농축된다. 논의된 바와 같이, 박테린의 조성은 정확하게 알려지지 않았지만, 예를 들어 불활성화시에 배양물 내의 M.hyo 세포의 수를 표시함으로써 특성화되고, 농축 배수에 대해 보정될 수 있다. 본 발명에서, M.hyo 항원은 박테린의 형태일 때, 총 배양물의 ml당 101 내지 1010개의 M.hyo 세포를 함유하는 M.hyo의 배양물로부터 유래된다. 총 배양물의 ml당 104 내지 1010, 106 내지 1010, 107 내지 5x109, 및 5x107 내지 5x109개의 M.hyo 세포가 바람직하다 (바람직한 순서의 역순으로 제시됨). 본 발명에 따른 항원 조성물에 사용되는 M.hyo 항원은 상기 배양물의 불활성화된 현탁액으로부터 채취한다. 이것은 또한 여과 또는 원심분리에 의해 농축될 수 있다.
바람직하게는, 단계 (a)에서 첨가되는 M.hyo 항원의 양은 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 항원 조성물을 백신에 나중에 혼입시키는 것을 고려하여 계산된다. 이것은 최종 백신이 또한 일정 부피의 유상 (oily phase)을 함유할 때, 항원 조성물 내의 M.hyo 항원의 양이 추후 희석에 대해 보상된다는 것을 의미한다.
불활성화되고 농축된 배양물로부터의 M.hyo 박테린의 부피는 최종 백신 조성물의 부피에 비해 1 내지 50% v/v일 수 있다. 바람직하게는, 그 양은 최종 백신 조성물의 부피에 비해 2 내지 40%, 3 내지 30%, 4 내지 20%, 또는 약 5 내지 약 15% v/v이다 (바람직한 순서의 역순으로 제시됨).
M.hyo 항원은 바람직하게는 M.hyo J 균주, 균주 11 또는 균주 232로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, M.hyo 항원은 J 균주로부터 유래한다.
따라서, 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, M.hyo 항원은 박테린이고, 약 107 내지 약 109 세포/ml의 세포 밀도로 J 균주로부터의 M.hyo 배양물의 화학적 불활성화에 의해 제조된 후, 불활성화된 배양물은 10 - 20회 여과에 의해 농축되고, 불활성화된 농축된 배양물은 M.hyo 항원을 포함하는 최종 백신 조성물 부피에 비해 약 5 내지 약 10% v/v로 사용된다.
PCV2 항원은 바람직하게는 ORF2로 코딩된 서브유닛이고, 바람직하게는 VLP의 형태이다. VLP 항원은 바람직하게 고도로 정제되지 않는다. 본 발명에 따른 방법의 단계 b.에서 혼합되는 PCV2 항원의 양은 바람직하게는 약 2 내지 약 200 ㎍/ml의 PCV2 ORF2 VLP이다. 보다 바람직하게는 4 내지 100 ㎍/ml의 PCV2 ORF2 VLP이다.
M.hyo 항원에 대해, 첨가되는 PCV2 항원의 양은 바람직하게는 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 항원 조성물을 백신에 나중에 혼입시키는 것을 고려하여 계산된다. 이것은 최종 백신이 또한 일정 부피의 광유를 함유할 때, 항원 조성물 내의 PCV2 항원의 양이 추후 희석에 대해 보상된다는 것을 의미한다. 단계 b.에 첨가되는 PCV2 항원의 양은 최종 백신이 적어도 20 ㎍ ORF2 VLP/투여량을 함유하도록 하는 것이다.
PCV2 항원은 부분적으로만 정제되기 때문에, 이것은 원심분리 후, 50 내지 1000 ㎍/ml의 총 단백질을 함유하는 불활성화된 곤충 세포/바큘로바이러스 배양물로부터의 샘플일 수 있다. 또한, 실제적인 측면에서 이것은 최종 백신 조성물의 부피에 비해 약 3 내지 약 30% v/v인 PCV2 항원의 부피를 의미한다. 보다 바람직하게는, 최종 백신 조성물의 부피에 비해 5 내지 25, 또는 심지어는 약 10 내지 약 20% v/v이다.
따라서, 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, PCV2 항원은 VLP의 형태로 ORF2에 의해 코딩된 서브유닛 항원이고, 화학적으로 불활성화되고 원심분리된 곤충 세포/바큘로바이러스 발현 배양물로부터 수거되고, PCV2 항원을 포함하는 최종 백신 조성물에서 동물 투여량당 적어도 20 ㎍의 ORF2 VLP를 갖는다.
M.hyo 항원과 PCV2 항원 사이에는 이들의 종류 또는 투여당 양과 같은 특별한 관계가 없다. 따라서, 본 발명에 따른 항원 조성물에서 이들의 종류 및/또는 상대적인 양은 이들이 항원/아주반트 복합체의 효과적인 형성을 허용하고 효과적인 백신 접종 효과를 제공한다면, 적절할 때 독립적으로 변경할 수 있다.
본 발명에 따른 항원 조성물 및 백신의 제조에 사용될 필요가 있는 M.hyo 또는 PCV2 항원의 배치로부터 항원의 양을 결정하기 위해, 통상적으로 시험관내 효능 검정이 사용된다. 이것은 또한 M.hyo 또는 PCV2 항원의 새로운 배치가 요구되는 항원 질량을 갖는지 확인하는데 도움을 줄 수 있다. 이러한 내부 배치 방출 시험은 일반적으로 항원 질량 Elisa이다. 이것은 예를 들어 토끼의 면역화 및 M.hyo 또는 PCV2 항원의 참조 표준을 사용하여 수득된 M.hyo 또는 PCV2에 대해 생성된 폴리클로날 항혈청을 사용하여 수행될 수 있다. 참조 항원의 효능은 일련의 백신 접종-챌린지 실험에서 결정되었고, 따라서 항원의 특정 수의 임의의 단위가 원하는 백신 접종 효능에 연결될 수 있다. 한 예는 다음과 같은 등록 파일의 표현이다: 본 발명에 따른 백신은 M.hyo 박테린 항원의 적어도 2.7의 '상대 효능 단위' 및 2 ml의 백신 투여량당 PCV2 항원의 적어도 2800의 '항원 단위'를 함유할 필요가 있다. 본 발명에 따른 백신에 포함된 항원의 상기 양은 본원에서 설명되는 바와 같이 M.hyo 및 PCV2에 의한 심각한 챌린지 감염에 대한 효과적인 보호를 보장하도록 결정되었다.
본 발명에 따른 백신의 동물 투여량당 요구되는 효능을 얻기 위해, 전형적으로 M.hyo 박테린 항원은 이들 항원을 포함하는 최종 백신 조성물 부피의 5 내지 15%로 사용되고, PCV2 항원은 10 내지 20%로 사용된다.
적합한 항혈청 및 참조 표준물의 제조를 포함하는 상기 배치 방출 시험의 개발은 통상의 기술자의 통상적인 능력 범위 내에 있다.
M.hyo 항원과 혼합되는 수산화알루미늄 아주반트의 양은 M.hyo 항원의 가능한 한 완전한 흡착을 허용하기에 충분할 필요가 있다. 다른 한편으로, 사용되는 수산화알루미늄 아주반트의 양은 동물 투여량당 알루미늄 양의 허용 한계 내일 필요가 있고, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 항원 조성물을 사용하는 백신 제제와 상용성일 필요가 있다. 바람직한 실시양태에서, 단계 a.의 혼합물은 약 0.1 내지 10 mg/ml의 알루미늄 양; 바람직하게는 약 0.5 내지 5 mg/ml의 알루미늄 양에 대응하는 양의 수산화알루미늄 아주반트를 함유한다. 이를 달성하기 위해, 예를 들어 알히드로겔™과 같은 시판되는 수산화알루미늄 아주반트 제품을 사용할 수 있고, 이것은 한 변형 제품에서 "2%" 용액으로 제공된다. 이 명명법은 약간 혼동을 주지만, 약 3% w/w 수산화알루미늄에 대응하는 약 2% w/w의 산화알루미늄, 및 약 1% w/v 알루미늄을 함유하는 제품으로부터 유도된다. 이러한 제품은 최종 백신 조성물의 부피에 비해 3 내지 30% v/v의 부피로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 수산화알루미늄 아주반트 제품은 최종 백신 조성물의 부피에 비해 4 내지 20% v/v, 바람직하게는 약 5 내지 약 15% v/v로 사용된다.
따라서, 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 항원 조성물은 모두 최종 백신 조성물의 부피에 비해 5 내지 15% v/v의 M.hyo 항원, 5 내지 15% v/v의 수산화알루미늄 아주반트 제품, 및 10 내지 20% v/v의 PCV2 항원을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항원 조성물은 이 항원 조성물로 제조된 백신의 완전한 수상 (waterphase)에 대한 기초로서 사용된다. 따라서, 제조될 백신이 예를 들어 10 또는 20%의 유상을 포함하는 에멀젼인 경우, 수상은 최종 백신 조성물의 90 또는 80%를 각각 형성한다. 이 수계에는 M.hyo 항원과 수산화알루미늄 아주반트의 복합체, 수성 담체 및 PCV2 항원을 갖는 본 발명에 따른 항원 조성물이 포함된다. 본 발명에 따른 항원 조성물의 상이한 화합물의 정확한 부피는 다양할 수 있고, 예를 들어, 사용된 M.hyo 또는 PCV2 항원의 상대적인 부피는 상기한 바와 같이 사용되는 특정 항원 배치의 효능에 따라 변할 수 있다. 또한, 백신의 수상은 충전제, 안정화제, 보존제, 계면활성제, 추가의 항원 및 그로부터 제조된 최종 백신의 제조에 필요한 임의의 다른 화합물 또는 용액과 같은 다른 성분을 포함할 수 있다. 본 발명에서, 그로부터 제조된 백신에 대한 수상의 성분의 부피 차이는 수성 담체의 부피를 조정하여 수상의 원하는 총 부피에 도달함으로써 보상된다.
본 발명자들은 비교적 적은 부피로 본 발명의 항원/아주반트 복합체의 형성을 수행하는 것이 유리하다는 것을 발견하였고; 이것은 M.hyo 항원이 수산화알루미늄 아주반트에 흡착되는 최적의 접촉을 가능하게 한다. 그러나, 수산화알루미늄 아주반트의 젤라틴 특성 때문에, M.hyo 항원 단독과 일정 부피의 상업용 수산화알루미늄 아주반트 제품의 혼합물을 사용하면 최상의 결과를 얻지 못할 수 있고, 아주반트는 대체로 다소 희석될 필요가 있다. 따라서, 항원/아주반트 복합체의 형성은 또한 수성 담체를 포함하는 혼합물로 수행된다.
설명된 바와 같이, 이 수성 담체는 또한 그로부터 제조된 백신의 형성을 위한 수상의 부피를 조절하는데 사용된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 대한 항원/아주반트 복합체의 형성은 수성 담체와의 혼합물로 수행되지만, 복합체의 형성 동안 존재하는 수성 담체의 부피는 추후 백신에 대한 완전한 수상을 형성하는 데 사용될 수성 담체의 총 부피 미만이다. 이것은 백신에 대한 완전한 수상이 수성 담체의 특정 부피 X를 포함하는 경우, 항원/아주반트 복합체의 형성을 위해 수성 담체의 부피 X 미만이 사용된다는 것을 의미하고, 바람직하게는 부피 X의 75%, 보다 바람직하게는 부피 X의 50, 40, 33, 30, 25, 20 또는 심지어 10%의 부피가 사용된다 (바람직한 순서의 역순으로 제시됨). 이어서, 항원/항체 복합체의 형성 후에 수성 담체의 부피의 나머지를 항원 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명자들은 또한 단계 a.의 혼합물을 유지하기 위해 M.hyo 항원 및 수산화알루미늄 아주반트의 복합체를 가능한 한 단순하게 형성하는 것이 유리하다는 것을 발견하였고, 이것은 항원/아주반트 복합체를 형성하기 전에 완전한 수상을 이루는 임의의 다른 성분을 혼합물에 아직 포함하지 않는 것이 바람직함을 의미한다. 이러한 다른 성분은 충전제, 안정화제, 보존제, 계면활성제, 추가의 항원 등일 수 있다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법의 단계 a.의 혼합물은 M.hyo 항원 및 수산화알루미늄 아주반트 (둘 모두는 이미 일정량의 수성 담체를 함유할 수 있음) 및 수성 담체로 이루어진다.
최종 백신으로 유화되기 전에 수상에 첨가될 필요가 있을 수 있지만, 바람직하게는 M.hyo항원/수산화알루미늄 아주반트 복합체의 형성 후에만 첨가되는 화합물의 예는 다음과 같다: 에탄올 또는 글리세롤과 같은 안정화제, 추가의 항원 또는 트윈(Tween)™과 같은 계면활성제.
따라서, 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 다음 조건 중 하나 이상 또는 전부가 적용된다:
- M.hyo 항원은 M.hyo 박테린이고,
- PCV2 항원은 PCV2 ORF2에 의해 코딩되고,
- PCV2 ORF2에 의해 코딩되는 항원은 바이러스 유사 입자이고,
- 단계 a.의 수성 담체는 평형 염 용액이고,
- 단계 a.의 수성 담체의 pH는 6 내지 8이고,
- 단계 a.에서 사용된 수성 담체의 부피는 최종 백신의 수상 형성에 사용되는 수성 담체의 총 부피 미만이고,
- 단계 a.의 혼합물에는 본질적으로 다른 성분이 없고,
- 단계 b.의 인큐베이팅 시간은 10시간 내지 20시간이고,
- 단계 b.의 인큐베이팅 온도는 실온이고,
- 단계 b.의 인큐베이팅은 인큐베이팅된 혼합물의 완만한 교반을 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 항원/아주반트 복합체는 다음 단계에 의해 미리 형성된다:
a. 수산화알루미늄 아주반트 및 M.hyo 박테린을 6.5 내지 7.5의 pH에서 생리학적 염수 내에서 혼합하는 단계, 및
b. 단계 a.의 혼합물을 완만하게 교반하면서 15 내지 30℃의 온도에서 12 - 18시간 동안 인큐베이팅하여, M.hyo 박테린의 수산화알루미늄 아주반트에 대한 흡착을 허용하고 항원/아주반트 복합체를 형성시키는 단계.
본 발명에서, 화합물이 '본질적으로 없는'은 화합물이 액체 또는 고체인지 여부에 따라, 화합물의 임의의 실질적인 양을 포함하지 않는 것, 예컨대 화합물의 중량 또는 부피 기준으로 10% 미만을 포함함을 의미한다. 바람직하게는, 본질적으로 없는은 중량 또는 부피 기준으로 8, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.09, 0.05, 0.01 또는 심지어 0.001% 미만의 화합물을 포함함을 의미한다 (바람직한 순서의 역순으로 제시됨).
통상의 기술자라면 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 방법은 본원에서 특정된 단계를 적용함으로써; 즉 시간 순서로, M.hyo 항원 및 수산화알루미늄 아주반트를 수성 담체에서 혼합하고, 인큐베이팅하여 항원/아주반트 복합체를 형성시키고, 미리 형성된 복합체에 PCV2 항원을 첨가함으로써 수행될 수 있고; 이들은 모두는 본원에서 정의된 바와 같다.
그러나, 방법의 시작, 중간 또는 끝에, 예를 들어 이 방법을 확장 또는 최적화하기 위해 하나 이상의 단계를 추가하거나 삽입할 수도 있다. 예를 들어, 단계 b. 후에, 미리 형성된 항원/아주반트 복합체는 보관될 수 있거나, 또는 필요할 때, 예를 들어 원심분리 및 재현탁화에 의해 정제될 수 있다. 이 모두는 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해, 즉시 사용가능한 돼지 혼합 백신의 제조에 사용될 수 있는 수상의 기초가 될 수 있는 항원 조성물이 생산될 수 있고, 상기 백신은 M.hyo 또는 PCV2에 의한 감염 및 질병의 관련 징후를 단일 투여 후에 예방하거나 감소시킬 수 있다.
따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 항원 조성물에 관한 것이다. 항원 조성물은 PCV2 항원, 및 수산화알루미늄 아주반트에 흡착된 M.hyo 항원의 항원/아주반트 복합체를 포함하고, 이들은 모두 본원에서 정의된 바와 같다.
본 발명에 따른 항원 조성물은 M.hyo 항원과 수산화알루미늄 아주반트의 항원/아주반트 복합체를 포함한다는 점에서 선행 기술의 조성물과 상이하고, 여기서 M.hyo 항원은 M.hyo 항원의 제시된 배치 및 제시된 수산화알루미늄 아주반트에 대해 가능한 한 완전히 수산화알루미늄 아주반트에 흡착된다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항원 조성물은 항원 조성물에 존재하는 M.hyo 항원의 적어도 50%가 항원/아주반트 복합체에, 수산화알루미늄 아주반트에 흡착된 상태로 위치한다.
이것은 시험에 의해 확인될 수 있고: 본 발명에 따른 항원 조성물을 1000-2000 xg에서 1-2분 동안 원심분리하고, 본원에서 설명되는 바와 같은 적절한 혈청 진단 방법에 의해 M.hyo 항원을 검출한 후, 항원 조성물 내의 M.hyo 항원의 적어도 50%가 펠렛 내에 위치한다.
이것은 항원이 수산화알루미늄 아주반트에 흡착된 항원/아주반트 복합체에 위치하는 M.hyo 항원의 상대적 양을 나타낸다.
바람직하게는, 수산화알루미늄 아주반트에 흡착된, 항원/아주반트 복합체에 존재하는 본 발명에 따른 항원 조성물의 M.hyo 항원의 상대적인 양은 60% 초과이고; 보다 바람직하게는 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 초과이거나 또는 100%이다 (바람직한 순서의 역순으로 제시됨).
따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항원 조성물은 조성물 내의 M.hyo 항원의 100%가 수산화알루미늄 아주반트에 흡착되어 항원/아주반트 복합체에 위치한다는 것을 특징으로 한다.
통상의 기술자가 이해할 수 있는 바와 같이, 이들 백분율의 보완물은 원심분리 후 본 발명에 따른 항원 조성물의 상청액에 남아있는 M.hyo 항원의 존재에 적용된다: 조성물에 존재하는 50% 초과의 M.hyo 항원이 펠렛 내에 위치하는 경우, 논리적으로 항원 조성물 내의 M.hyo 항원의 50% 미만이 상청액에 존재한다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항원 조성물은 조성물 내의 M.hyo 항원의 50% 미만이 수산화알루미늄 아주반트에 흡착된 항원/아주반트 복합체 내에 위치하지 않고, 원심분리 후 상청액에 위치한다는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 수산화알루미늄 아주반트에 흡착된, 항원/아주반트 복합체 내에 위치하지 않는 본 발명에 따른 항원 조성물의 M.hyo 항원의 상대적인 양은 40% 미만이고; 보다 바람직하게는 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1% 미만이거나 또는 0%이다 (바람직한 순서의 역순으로 제시됨).
본 발명에서, 본 발명에 따른 항원 조성물을 특성화하는 바람직한 방법은 수산화알루미늄 아주반트에 흡착된 M.hyo 항원의 상대적인 양을 측정하는 것이다.
그러나, 또한, 본 발명에 따른 항원 조성물은 그의 결합능이 M.hyo 항원에 의해 가능한 한 많이 사용되는 수산화알루미늄 아주반트를 포함한다는 점에서 선행 기술의 조성물과 상이하다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항원 조성물은 50% 초과의 그의 단백질 결합능이 M.hyo 항원에 의해 사용되는 수산화알루미늄 아주반트를 포함한다.
이것은 공지된 양의 공지된 단백질로 추가로 흡착시키고, 적절한 혈청 진단 방법에 의해 얼마나 많은 공지된 단백질이 시험되는 항원 조성물 내의 수산화알루미늄 아주반트에 추가로 흡착될 수 있는지 검출함으로써, 시험함으로써 (설명된 바와 같이) 검출될 수 있다.
이것은 본 발명에 따른 항원 조성물 내의 수산화알루미늄 아주반트의 미사용 단백질 결합 능력을 나타낸다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항원 조성물 내의 수산화알루미늄 아주반트의 단백질 결합능은 M.hyo 항원에 의해 60% 초과로 사용되고; 보다 바람직하게는, M.hyo 항원에 의해 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 초과로 또는 100%로 사용된다 (바람직한 순서의 역순으로 제시됨).
가장 유리한 유용성에서, 본 발명에 따른 항원 조성물 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 항원 조성물은 M.hyo 또는 PCV2에 의한 감염의 예방 또는 감소에 및 관련된 질병의 징후의 예방 또는 감소에 효과적이고 사용하기에 안전하고 경제적으로 실현가능하고 즉시 사용할 수 있다는 점에서 사용자 친화적인 돼지용 백신의 생산에 사용될 수 있다.
따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 M.hyo 또는 PCV2에 의한 감염 및 관련된 질병의 징후의 예방 또는 감소를 위한 돼지용의 즉시 사용가능한 백신에 관한 것으로서, 상기 백신은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 항원 조성물, 또는 본 발명에 따른 항원 조성물 및 추가의 아주반트를 포함한다.
"추가의 아주반트"는 이미 항원 조성물에 포함되어 있는 수산화알루미늄 아주반트에 추가로 사용된다는 의미에서 추가적이다. 이 추가적인 아주반트는 본 발명에 따른 백신이 적어도 PCV2 또는 M.hyo에 대한 선행 기술의 단일-항원 백신만큼 효능이 있음을 보장한다.
"아주반트"는 비-특이적인 방법으로 표적의 면역 반응을 자극하는 잘 알려진 백신 성분이다. 많은 상이한 아주반트가 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 아주반트의 예는 다음과 같다: 프로인트 (Freund) 완전 및 불완전 아주반트, 비타민 E, 비-이온성 블록 중합체 및 폴리아민, 예컨대 덱스트란 황산염, 카르보폴(Carbopol)™, 피란, 사포닌, 예컨대 Quil A™ 또는 Q-vac™. 사포닌 및 백신 성분은 ISCOM™에서 조합될 수 있다.
또한, 무라밀디펩티드, 디메틸글리신, 터프트신과 같은 펩티드, 및 광유, 예를 들어 베이올(Bayol)™, 드라케올(Drakeol)™, 클레아롤(Klearol)™ 또는 마르콜(Marcol)™, 몬타니드(Montanide)™ 또는 경질 광유 (파라핀); 비-광유, 예컨대 스쿠알렌, 스쿠알렌; 식물성 오일 또는 이의 유도체, 예를 들어 에틸 올레에이트가 종종 아주반트로 사용된다. 또한, 세픽 (Seppic)의 ISA™ 또는 딜루박포르테(DiluvacForte)™와 같은 조합 제품이 유리하게 사용될 수 있다.
아주반트 및 그 사용 및 효과에 대한 안내서는 ["Vaccine adjuvants" (Methods in molecular medicine, vol. 42, D. O'Hagan ed., 2000, Humana press, NJ, ISBN-10: 0896037355)]이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 백신은 수상 및 유상의 에멀젼으로서 제조되고; 바람직하게는 에멀젼은 유중수 (w/o), 수중유 (o/w), 수중유중수 (w/o/w) 또는 이중 오일 에멀젼 (DOE)이다. '추가의 아주반트'가 바람직하게는 유상인 수중유 에멀젼 인 본 발명에 따른 백신이 보다 바람직하다. 바람직하게는, 오일은 광유이다.
유상은 항원을 서서히 방출함으로써 백신 접종한 동물에게 디포 (depot) 효과를 제공하여 표적의 면역계의 장기간 자극을 제공한다. 이 방식에서, 수중유 에멀젼인 백신은 유리하게는 수상으로부터의 직접 면역 자극, 및 유상으로부터의 지연된 면역 자극의 특성을 나타낸다.
따라서, 본 발명에 따른 백신의 실시양태에서, 백신은 수중유 에멀젼이다.
본 발명에 따른 백신의 또 다른 실시양태에서, 추가의 아주반트는 광유이다. 상기 아주반트는 수의학 백신의 면역원성에 대해 유리한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 따른 백신의 실시양태에서, 백신은 수중유 에멀젼이고, 추가의 아주반트는 광유이다.
본 발명에 따른 백신의 바람직한 실시양태에서, 광유는 마르콜™ (엑손모빌 (ExxonMobil)), 클레아롤™ (소네본 (Sonneborn)) 또는 드라케올™ (펜레코 (Penreco))과 같은 상표명으로 상업적으로 입수할 수 있는 경질 또는 백색 광유 또는 파라핀 오일이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 백신은 최종 백신의 부피에 비해 30 내지 80% v/v의 본 발명에 따른 항원 조성물을 포함한다. 바람직하게는, 최종 백신의 부피에 비해 바람직하게는 40 내지 75% v/v, 45 내지 70% v/v, 50 내지 65% v/v 또는 심지어 55 내지 65% v/v의 본 발명에 따른 항원 조성물을 포함한다 (바람직한 순서의 역순으로 제시됨).
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 백신은 추가의 아주반트로서 광유를 최종 백신의 부피에 비해 3 내지 50% v/v의 양으로 포함한다. 바람직하게는, 최종 백신의 부피에 비해 4 내지 40% v/v, 5 내지 30% v/v, 5 내지 20% v/v, 또는 심지어 5 내지 15% v/v의 양으로 포함한다 (바람직한 순서의 역순으로 제시됨).
아주반트 보강, 비히클 화합물 또는 희석제의 첨가, 본 발명에 따른 백신의 유화 또는 안정화를 위한 다른 방법이 또한 본 발명의 범위 내에 있음은 물론이다.
용어 "백신"은 백신에 포함되는 면역학적 유효량의 항원을 사용하는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 백신에 대해 '면역학적 유효량'을 구성하는 것은 원하는 효과 및 사용되는 백신 유형의 특정 특성에 의존한다. 유효량의 결정은 통상적인 기술자의 기술 범위 내에 있고, 예를 들어 백신 접종 후 표적의 면역 반응을 모니터링함으로써, 또는 챌린지 감염 후, 예를 들어 표적의 임상 징후 및 혈청학적 파라미터를 모니터링하고 이를 백신 접종을 받지 않은 챌린지 시험된 동물에게서 나타나는 반응과 비교함으로써 수행된다.
돼지가 실제로 M.hyo 및/또는 PCV2 감염으로 고통받는지 및 얼마나 심각한지는 경험이 많은 축산업 종사자 또는 수의사와 같은 유자격자가 질병의 증상에 대한 통상적 인 지식을 사용하거나 적절한 진단 도구를 사용하여 확인될 수 있다.
통상적으로, 백신은 또한 (심각한) 유해한 영향을 미치지 않으면서 백신의 제조, 적용 또는 보존을 돕는 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 이러한 담체는 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 수성 담체일 수 있다. 보다 복잡한 형태에서, 담체 용액은 예를 들어 안정화제, 보존제 또는 아주반트와 같은 추가의 첨가제를 포함할 수 있는 완충제일 수 있다. 자세한 내용 및 예는 예를 들어 공지된 안내서, 예컨대 문헌 ["Remington: the science and practice of pharmacy" (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472)], 및 ["Veterinary vaccinology" (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681)]에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 즉시 사용가능한 PCV2/M.hyo 혼합 백신의 예는 2015년에 시판될 포실리스® PCV M Hyo (MSD AH) 백신이다. 이 백신은 본 발명의 모든 유리한 특징, 예컨대 우수한 안전성 프로파일과 함께 단일 투여 후에도 M.hyo 및 PCV2에 대한 백신 효능을 보이는 것으로 밝혀졌고, 즉시 사용가능하고, 경제적으로 실현가능하다. 상세한 내용은 실시예 및 포실리스 PCV M Hyo (EMEA/V/C/003796/0000, 2014년 9월 11일)에 대한 CVMP 평가 보고서에 설명되어 있다. 이 보고서는 2 - 8℃에서 27개월 동안 보관한 후에도 M.hyo 및 PCV2의 챌린지 감염에 대한 백신 효능 기준을 충족시키는 상기 새로운 백신에 대해 설명한다. 매우 많은 실험실 및 현장 백신 접종 연구에서, 백신은 약 3주령의 새끼 돼지에게 2 ml 용량의 근내 접종시 안전한 것으로 밝혀졌고, 이것은 접종 부피에 의한 팽윤 이외의 다른 주사 부위 반응이 관찰되지 않았고, 직장 온도의 약 1℃의 일시적이고 부수적인 증가 이외의 다른 전신 반응이 없기 때문이다. 또한, 백신은 바이러스 혈증의 감소, 폐 및 림프계 조직에서의 바이러스 부하 감소, PCV2 감염에 의한 바이러스 배출 감소, 및 M.hyo 감염에 의한 폐 병변의 중증도 감소가 가능하다는 점에서 효과적이었다. 또한, 백신은 최종 기간 동안 1일 체중 증가의 손실을 감소시켰다. 유도된 백신 면역력은 접종 후 22주까지 검출할 수 있었고, 이것은 돼지 최종 기간 전체를 포함한다.
따라서, 돼지에서 본 발명에 따른 백신의 수의학적 효과는 M.hyo 또는 PCV2에 의한 감염 및 이들 질병의 관련 징후를 예방하거나 감소시키는 것이다. 이는 본 발명에 따른 백신이 갖는 다음과 같은 치료적 및 예방적 효과를 지칭한다: 바이러스 혈증 및 감염 수준의 감소, M.hyo 또는 PCV2의 복제 및 전염 감소; 및 폐 병변, 폐렴, ADWG 및 사료 전환의 감소 등과 같은 임상 징후의 감소 또는 심지어 예방.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 백신은 M.hyo 감염에 의해 유발된 폐 병변을 감소시키고/시키거나 돼지에서 PCV2에 의한 바이러스 혈증을 감소시키는 것이다.
본 발명에 따른 백신의 추가의 유리한 효과는 자손에게 수직으로, 및 무리 또는 집단 내에서, 및 지리적 영역 내에서 수평으로의, 돼지 무리에서 M.hyo 및/또는 PCV2의 전파의 예방 또는 감소이다. 따라서, 본 발명에 따른 백신의 사용은 M.hyo 및/또는 PCV2의 유병률을 감소시킨다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 백신은 지리적 영역에서의 M.hyo 및/또는 PCV2의 유병률을 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 추가의 측면은 다음과 같다:
- 집단 또는 지리적 영역에서 M.hyo 및/또는 PCV2의 유병률을 감소시키기 위한 본 발명에 따른 백신의 사용 및
- 집단 또는 지리적 영역에서 M.hyo 및/또는 PCV2의 유병률을 감소시키기 위한 본 발명에 따른 백신.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 백신은 또한 안정화제를 포함할 수 있다. 이것은 백신 에멀젼의 특성 개선, 분해되기 쉬운 성분의 보호 및/또는 백신의 유효 기간 연장의 역할을 수행할 수 있다. 일반적으로, 상기 안정화제는 지질, 탄수화물 또는 단백질과 같은 고분자량의 큰 분자; 예를 들어 우유 분말, 젤라틴, 혈청 알부민, 소르비톨, 수크로스, 트레할로스, 스페르미딘, NZ 아민, 덱스트란 또는 폴리비닐 피롤리돈 및 완충제, 예컨대 알칼리 금속 포스페이트이다.
바람직하게는, 안정화제는 동물 유래의 화합물을 함유하지 않거나, 심지어 WO 2006/094974에 개시된 바와 같이 화학적으로 규정된다.
본 발명에 따른 백신은 보존제, 예컨대 티메로살, 메르티올레이트, 페놀 화합물 및/또는 겐타미신을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 보존제는 사용되지 않는다.
본 발명에 따른 백신은 바람직하게는 적어도 12개월, 보다 바람직하게는 18개월 또는 심지어 24개월 동안 안정하다. '안정한'이란 적절한 조건 하에서 장기간 보관한 후의 화학적 및 물리적 구조 및 생물학적 효능의 유지, 특히 그의 권장 유효 기간이 끝날 때까지 백신 효능의 유지를 의미한다.
본 발명에 따른 백신의 제약 안정성 또는 유효성에 필요하거나 유리한 다른 첨가제를 혼합하는 것 역시 본 발명의 범위 내에 있음은 물론이다.
본 발명에 따른 백신의 표적은 돼지이다. 백신 접종 표적의 연령, 체중, 성별, 면역 상태 및 기타 파라미터는 중요하지 않지만, 건강하고 감염되지 않은 표적에 백신 접종을 하고 PCV2 또는 M.hyo의 임의의 현장 감염을 예방하기 위해 가능한 한 조기에 백신 접종을 하는 것이 분명히 유리하다. 상기 감염은 어린 나이에 이미 확립될 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 백신은 약 3주령부터 적용하는 것이 바람직하다.
유리하게는, 본 발명에 따른 백신의 효능은 어린 돼지가 보유할 수 있는 모계 유래 항체의 수준에 의해 영향받지 않는다.
따라서, 본 발명에 따른 백신은 효과적인 프라이밍 (priming) 백신 접종으로서 작용할 수 있고, 이는 추후 부스터 백신 접종이 수행되어 증폭될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 백신은 약 2 내지 10일령에 투여되고, 약 3주 후에 다시 투여될 수 있고, 각각의 백신 접종은 1 ml 부피에서 수행될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 백신은 단일 투여 후에 이미 효과적이기 때문에, 바람직한 실시양태는 예를 들어 약 3주령으로부터 약 2 ml의 단일 투여량을 투여하는 것이다. 이 백신 접종은 비육기 전체 동안 돼지를 보호한다.
본 발명에 따른 백신의 돼지 표적, 예컨대 번식을 위한 암퇘지 또는 정자 생산을 위한 수퇘지가 6개월 초과 동안 유지되도록 의도될 때, 이들에게 1, 2 또는 3회의 정기적인 부스터 백신 접종이 이루어질 수 있고, 예를 들어 암퇘지의 경우, 매번 분만하기 전에 1회의 부스터 백신 접종이 이루어지고, 이것은 평균 약 2.2회/년이다.
따라서, 본 발명에 따른 백신은 M.hyo 및/또는 PCV2에 의한 감염의 확립 및 진행을 모두 방해하므로 예방적 또는 치료적 처치로서 또는 둘 모두로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 백신의 투여 요법은 바람직하게는 동물에 대한 스트레스를 줄이고 인건비를 줄이기 위해, 표적 돼지가 필요로 할 수 있는 다른 백신의 기존 백신 접종 스케쥴에 통합된다. 이들 다른 백신은 그의 등록된 용도와 적합한 방식으로 동시의, 병용 또는 순차적인 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 백신은 표적 동물에 대해 허용가능한 부피로 투여될 수 있고, 예를 들어 부피는 약 0.1 내지 약 10 ml일 수 있다. 바람직하게는, 1회 투여량은 약 0.1 내지 약 5 ml이고, 보다 바람직하게는 1회 동물 투여량은 0.2 내지 3 ml 부피이다. 바람직하게는, 근내 투여량은 약 1 내지 약 3 ml, 바람직하게는 약 2 ml이고; 피내 투여량은 약 0.1 내지 약 0.5 ml, 바람직하게는 약 0.2 ml이다.
본 발명에 따른 백신은 관련 기술 분야에 공지된 방법에 따라 표적 돼지에게 투여될 수 있다. 바람직한 적용은 비경구 경로, 예컨대 피부 내 또는 피부를 통한 주사, 예를 들어, 근내, 정맥내, 복강내, 피내, 점막하 또는 피하 투여에 의해 이루어진다. 본 발명에 따른 백신의 보다 바람직한 투여 경로는 근내 또는 피하 주사이다. 뒷다리 또는 목에 근내 투여하는 것이 훨씬 더 바람직하다.
최적의 적용 경로는 사용되는 백신의 특수 사항 및 표적의 특성에 따라 달라질 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 백신은 약 3주령의 돼지에게 약 2 ml의 단일 투여량으로 근내 투여된다.
근내 투여에 바람직한 부위는 목이다.
본 발명에 따른 백신을 추가로 최적화하는 것은 통상의 기술자에 의해 충분히 달성될 수 있다. 일반적으로, 이것은 백신의 효능을 미세 조정하여 충분한 면역 보호를 제공하는 것을 수반한다. 이것은 백신의 용량, 부피 또는 항원 함량을 조정함으로써; 백신을 다른 형태 또는 제제로 사용함으로써; 백신의 다른 구성분 (예를 들어, 안정화제 또는 추가의 아주반트)을 조정함으로써; 또는 다른 경로, 방법 또는 요법을 통한 적용에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 백신은 추가의 항원, 시토카인 또는 비메틸화된 CpG를 포함하는 면역자극 핵산 등과 같은 다른 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 별법으로, 본 발명에 따른 백신은 유리하게는 제약 성분, 예를 들어 항생제, 호르몬, 항염증제 또는 구충 약물과 유래하게 조합될 수 있다. 또는, 본 발명에 따른 백신은 그 자체가 백신에 첨가될 수 있다.
본 발명에 따른 백신은 예를 들어 다른 병원체로부터 유래된 다른 항원과 유리하게 조합될 수 있다. 이러한 혼합 백신의 이점은 백신 접종을 위한 표적 동물의 1회 취급만을 필요로 하면서, M.hyo 및 PCV2에 대한 면역 반응뿐만 아니라 다른 병원체에 대한 면역 반응도 유도하여, 표적에 대한 백신 접종 스트레스 및 시간 및 인건비를 감소시킨다는 것이다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 백신은 돼지에 병원성인 미생물로부터 유래된 추가의 항원 물질을 포함한다.
"추가의 항원 물질"은 그 자체가 복제성 또는 불활성화된 형태 또는 서브유닛일 수 있고, 아주반트를 갖거나 갖지 않을 수 있다. 추가의 항원 물질은 항원일 수 있고, 단백질, 탄수화물, 지질다당류 또는 핵산 분자와 같은 생물학적 또는 합성 분자로 이루어질 수 있다. 별법으로, 이것은 상기 다른 미생물로부터의 핵산 조각 또는 상기 핵산 조각을 포함하는 벡터로부터의 발현 산물일 수 있고; 벡터는 그 자체가 미생물 또는 진핵 숙주 세포일 수 있다.
추가의 항원 물질은 임의의 방식으로, 예를 들어 추출물, 분획, 균질물 또는 초음파 처리물로서, 돼지에 병원성인 다른 미생물로부터 "유래한" 것일 수 있다.
본 발명을 위한 "돼지에 병원성인 미생물"은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 따라서, 추가의 항원 물질은 원칙적으로 돼지에게 병원성인 임의의 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균, 리케챠, 원생동물 및/또는 기생충으로부터 유도될 수 있다.
돼지에 병원성인 상기 미생물의 예는 다음과 같다: 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스, 위광견병 바이러스, 돼지 파르보 바이러스, 전통적인 돼지 발열 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 구제역 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스, 전염성 위장 장염 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis), 악티노바실루스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae), 브라키스피라(Brachyspira), 이. 콜라이(E. coli), 해모필루스(Haemophilus), 스트렙토코쿠스, 살모넬라(Salmonella), 클로스트리디아(Clostridia), 파스테우렐라, 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix), 보르데텔라(Bordetella), 톡소플라스마(Toxoplasma), 이소스포라(Isospora) 및 트리키넬라(Trichinella).
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 백신 에멀젼을 혼합함으로써 재구성될 수 있는 살아있지 않은 동결건조된 항원으로서 추가의 항원 물질이 본 발명에 따른 백신에 첨가된다. 이것은 예를 들어 WO 2010/106095에 설명되어 있다.
본 발명에 따른 백신의 바람직한 실시양태에서, 백신은 M.hyo, PCV2, 로소니아 인트라셀룰라리스 및 PRRSV로부터의 항원을 포함한다.
이들은 중요한 돼지 질병이기 때문에, 이들의 단일샷 즉시 사용가능 백신으로의 조합은 매우 유리하다.
본 발명에 따른 백신은 통상의 기술자에게 공지된 수단에 의해 제조된다.
따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 항원 조성물 또는 본 발명에 따른 항원 조성물 및 추가의 아주반트를 혼합하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 백신의 제조 방법에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 항원 조성물 또는 본 발명에 따른 항원 조성물, 및 광유를 수중유 에멀젼으로 유화시키는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 백신의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 상기한 바와 같이 돼지에서 M.hyo 및/또는 PCV2에 의한 감염 및 질병의 관련 징후를 예방하거나 감소시키는 유리한 효과를 갖는, 본 발명에 따른 백신의 유용성을 제시한다.
"백신 제조 방법"의 상세한 내용 및 예가 본원에서 설명되고, 이것은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 적용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항원 조성물은 산업적으로 더 작거나 더 큰 부피로 제조될 수 있고, 제약상 허용되는 부형제와 조합되고, 백신으로 제제화되고, 적절한 크기의 용기에 충전된다. 제조 방법의 다양한 단계는 적절한 시험에 의해, 예를 들어 항원의 품질 및 양에 대한 면역학적 시험에 의해, 및 불활성화, 멸균 및 외부 물질의 부재에 대한 미생물학적 시험에 의해; 및 궁극적으로는 백신 효능 및 안전성을 확인하기 위한 동물 연구에 의해 모니터링될 것이다. 품질, 양 및 멸균 시험을 마친 후, 백신 제품은 판매를 위해 출시될 수 있다.
이들 모두는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 백신 제조에 적용되는 일반적인 기술 및 고려 사항은 정부 지침 및 규정 (약전) 및 잘 알려진 안내서에 설명되어 있다.
본 발명에 따른 백신은 돼지 표적에 투여하기 적합하고, 목적하는 적용 경로 및 목적하는 효과에 부합하는 형태로 제조될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 백신은 비경구 주사에 적합한 형태, 즉 주사가능한 액체, 예컨대 현탁액, 용액, 분산액 또는 에멀젼으로 제제화된다. 통상적으로, 상기 백신은 생리학적 pH에서 멸균된 상태로 제조된다.
따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 다음에 관한 것이다:
- M.hyo 또는 PCV2에 의한 감염 및 질병의 관련 징후를 예방하거나 감소시키기 위한 돼지용 백신에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 항원 조성물 또는 본 발명에 따른 항원 조성물.
- M.hyo 또는 PCV2에 의한 감염 및 질병의 관련 징후를 예방하거나 감소시키기 위한 백신의 제조를 위한, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 항원 조성물 또는 본 발명에 따른 항원 조성물의 용도.
- M.hyo 또는 PCV2에 의한 감염 및 질병의 관련 징후를 예방하거나 감소시키기 위한, 본 발명에 따른 백신 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 백신의 용도.
- 본 발명에 따른 백신 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 백신의 돼지에 대한 투여를 포함하는, 돼지에서 M.hyo 또는 PCV2에 의한 감염 및 질병의 관련 징후를 예방하거나 감소시키는 방법.
본 발명은 이제 다음의 비-제한적인 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다.
실시예
1. M. hyo 항원의 제조
M.hyo 박테린 항원은 상업용 M+Pac 백신과 유사한 방법으로 제조되었다. 이것은 본질적으로 WO 1993/016.726에 기재된 바와 같다. 간단히 설명하면, M.hyo 균주 J는 프리스 (Friis) (1975, 상기 문헌)에 의해 처음 설명된 배지를 기초로 하여 영양이 풍부한 배지에서 현탁 배양하였다. 이것은 효모 추출물, 혈청 및 돼지와 소의 다양한 추출물을 함유한 복합 배지이다. 수 회의 사전 배양 후, 주 배양은 교반 및 pH 조절을 수행하면서 37℃의 대형 발효기에서 이루어졌고, 일반적으로 고정상에 도달하기까지 20 내지 60시간이 소요되었다. 배양물을 불활성화하기 위해, 발효기에 BEI를 첨가하고, 이를 1시간 동안 교반한 후, 전체 내용물을 제2 용기로 옮기고, 37℃에서 교반하면서 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 과량의 BEI는 37℃에서 24시간까지 교반하여 티오황산나트륨을 사용하여 중화하였다. 이어서, 불활성화되고 중화된 배양액을 한외여과로 15회까지 농축하였다. M.hyo 박테린 항원 벌크는 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. 항원 질량 및 상대 효능은 M.hyo-특이적 폴리클로날 토끼 항혈청을 사용하여, 그리고 공지된 효능의 참조 표준 M.hyo 박테린 제제와 비교하여 사내 Elisa로 측정하였다.
2. PCV2 항원의 제조
ORF2에 의해 코딩되는 VLP인 서브유닛 형태의 PCV2 항원은 포실리스 PCV와 유사한 방법으로 생산되었고; 이것은 본질적으로 이전에 설명된 바와 같다 (예를 들어, WO 2007/028823). 간단히 설명하면, Sf21 곤충 세포의 현탁 배양물에, 바큘로바이러스 p10 유전자 프로모터의 제어 하에 삽입된 PCV2 ORF2 유전자를 포함하는 재조합 바큘로 바이러스를 감염시켰고; 감염 시기에 세포 밀도는 약 1.4 x 106 세포/ml이었고, 감염 다중도 (MOI)는 0.01이었다. 약 27℃에서 4 - 8일 배양한 후, 전체 배양물을 산업용 규모의 초음파 처리기에 통과시켜 초음파 처리하였다. 다음에, 재조합 바큘로바이러스를 교반 및 pH 조절을 수행하면서 37℃에서 72시간 동안 BEI로 불활성화하였다. 불활성화 후, BEI는 티오황산나트륨으로 중화하였다. 중화 후, 원심분리에 의해 세포 잔해물을 제거하였다. 이어서, 공지된 양의 마커 단백질의 희석 범위와 비교한 SDS 겔-전기영동 또는 사내 Elisa를 사용하여 PCV2 캡시드 VLP의 항원 질량을 측정하기 위해 상청액을 사용하였다.
3. M. hyo 및 PCV2 항원의 항원 조성물 제조 및 즉시 사용가능한 백신의 제제화
본 발명에 따른 항원 조성물 및 이후에 본 발명에 따른 백신을 제조하기 위한 예시적인 프로토콜은 다음과 같이 18%의 유상을 갖는 본 발명에 따른 백신의 100 ml 배치의 제조이다: 비이커 유리 내에서 다음을 무균 하에서 조합하였다: 약 60 RPU/ml의 M.hyo 박테린 항원의 배치로부터의 5 ml, 알히드로겔 2% 10 ml 및 정상 염수 12 ml. 이 양은 최종 백신에서 3 RPU M.hyo 항원/ml 및 약 1 mg/ml 알루미늄을 나타낸다. 이것들은 수성 담체 (여기서는 염수)와 조합되었다. 이 백신에서는, 37ml의 염수를 첨가하여 수상을 완성시켰는데, 여기서 그 부피의 33%, 즉 12 ml를 사용하여 항원/아주반트 복합체를 형성시켰다.
상기 혼합물을 4 N 염산을 사용하여 pH 6.5로 조정하고, 혼합물을 자기 혼합판 및 멸균된 자기 혼합 막대를 사용하여 완만하게 교반하면서 실온 (약 20℃)에서 밤새 (16시간) 인큐베이팅하였다. 다음날 아침, 혼합물을 약 14000 AU/ml (최종 백신에서 약 2300 AU/ml을 제공)의 17 ml의 PCV2 항원 배치 및 에탄올 96% 및 글리세롤 (멸균됨)과 함께 나머지 부피의 염수와 혼합하였다. 10분 동안 계속 혼합한 후, 백신에 대한 수상이 준비되었다. 이어서, 트윈, 스판 (Span) 및 드라케올의 혼합물로 이루어진 18 ml의 유상을 첨가하였다. 다음으로, 2개의 상을 울트라-투락스 (ultra-turrax) 혼합기를 사용하여 10,000 rpm으로 2분 동안 균질화시켰다.
본질적으로 동일한 방식으로 100리터까지의 더 큰 부피의 백신 배치를 제조하였고, 본원에서 설명되는 다양한 실험실 및 현장 백신 접종 실험에 사용하였다. 이 규모에서는, 보다 큰 부피를 수용하기 위해 큰 크기의 혼합 용기가 사용되었고, 미리 형성된 항원/아주반트 복합체가 PCV2 항원 및 수상의 다른 성분과 혼합되는 시점에 조정이 이루어졌다: 이것은 60분으로 증가하였고; pH는 6.2 내지 7.5로 유지하였고, 인큐베이팅은 실온에서 수행하였다. 또한, 사용된 항원 배치의 효능에 맞추기 위해 수상 및 항원 배치의 부피는 상이하였다. 또한, 이러한 부피의 유화는 대규모 균질화기 (디스팍스 (Dispax) 반응기, IKA)를 사용하여 수행되었다.
실험은 항원/아주반트 복합체의 사전 형성을 위해 본 발명에 따른 방법의 조건을 계속 최적화한다. 예를 들어, 인큐베이팅의 온도 및 지속 시간, 혼합물의 pH 및 M.hyo 항원에 대한 수산화알루미늄 아주반트의 비율을 변화시킴으로써 최적화한다.
이어서, M.hyo 항원이 수산화알루미늄 아주반트에 흡착되는지, 및 얼마나 많이 흡착되는지 시험하기 위한 샘플을 유화 전에 수상으로부터 채취하고, 원심분리하여 상청액 및 펠렛을 시험하였다. 백신을 수중유 에멀젼으로 만들 때, 이것은 최종 백신의 샘플을 사용하여 실시할 수 있다.
4. 항원/ 아주반트 복합체 형성에 대한 상이한 조건의 효과
M.hyo 항원과 수산화알루미늄 아주반트 사이의 복합체 형성 동안 PCV2 항원의 존재 또는 부재 하의 상이한 방법을 사용하여 제조된 항원 조성물을 사용하여 M.hyo/PCV2 혼합 백신을 상기 기술된 바와 같이 제조하였다. 실험 동물에서 이들 백신을 시험함으로써, M.hyo 항원의 효능에 대한 상이한 방법에 의한 효과를 비교할 수 있었다.
4.1. 물질 및 방법
항원 조성물은 M.hyo 박테린의 10x 농축 배치의 5% (최종 백신 부피의) 및 시판되는 PCV2 백신과 대등한 표준량의 PCV2 항원를 사용하여 제조하였다. 백신을 다음 스케쥴에 따라 제조하였다:
흡착 단계 후에, 수상의 나머지 성분을 첨가한 후, 유상을 첨가하고 유화시켜 최종 백신 생성물을 수득하였다. 백신은 사용하기 전까지 2-8℃에서 보관하였다.
이어서, 8마리의 새끼 돼지로 이루어진 4개의 군이 백신 접종-챌린지 실험에 사용되었다: 3개의 군은 각각 특정 백신 중 하나를 투여하고, 하나의 군은 백신을 접종하지 않은 대조군으로 사용되었다. 3가지 백신을 3주령에 2 ml 용량으로 근내 투여하였다.
4주 후, 7주령의 모든 돼지에게 2일 연속으로 프리스 배지에서 독성 M.hyo 단리물의 배양물 5 ml를 기관내 점적하여 챌린지하였다. 다시 3주 후 (10주령)에, 돼지를 부검하고, 경화된 M.hyo 폐 병변을 굿윈 (Goodwin) 척도에 따라 평가하였다.
실험 동안, 백신 접종시, 챌린지시, 부검시 혈청 검사를 위한 혈액 샘플을 채취하였다. 항-PCV2 항체 수준은 Elisa를 사용하여 임의의 단위로 결정되었다.
4.2. 결과
<표 1>: M.hyo 폐 병변 점수 및 PCV2 혈청 검사 결과
*: 대조군과 유의하게 상이한 병변 점수 (p<0.05, 만-휘트니 (Mann-Whitney) U 시험).
표 1에 나타난 바와 같이, M.hyo 단일 항원 백신 A로 백신을 접종한 결과, 백신을 접종하지 않은 대조군의 병변의 중증도에 비해, M.hyo에 의해 유발된 폐 병변의 중증도가 유의하게 66% 감소하였다. 이 백신은 M+Pac 시판 제품과 유사하다. 그러나, M.hyo 항원 및 PCV2 항원 둘 모두가 복합체 형성 동안 존재하는 항원 조성물로 제조된 백신 B의 경우, 이는 본질적으로 상이하다: 이 백신은 폐 병변의 30% 감소만을 유도하였다. M.hyo 백신 효능은 백신 C에 대해 본질적으로 단일-항원 백신의 수준인 58% 폐 병변 감소로 회복되었고; 이 백신은 본 발명에 따른 방법에 따라 제조된 항원 조성물로 제조되었다.
PCV2 항체 수준과 관련하여, 모든 군의 돼지는 백신 접종시에 PCV2 항원에 대한 모체 유래 항체를 가지고 있었다. 이들 모체 항체는 백신 A를 투여받은 군 및 대조군에서 감소하였다. PCV2 항원을 함유한 백신 B 또는 C를 투여받은 군은 혈청 반응을 보호 수준까지 나타내었다. 이들 사이에 유의한 차이가 없었고, 이것은 PCV2 백신의 효능이, 항원이 수산화알루미늄 아주반트에 흡착되는 방식과 관련되지 않음을 나타낸다.
4.3. 결론
항원 조성물이 제조되는 방식에 따라, M.hyo 감염에 대한 백신 효능의 명확하고 유의한 차이가 있다: PCV2 항원이 M.hyo 항원의 수산화알루미늄에 대한 흡착 동안 존재할 때, 생성되는 백신은 미리 형성된 M.hyo 항원/수산화알루미늄 아주반트 복합체에 PCV2 항원을 이후에 첨가했을 때와 비교할 때, 단지 1/2만 효과적이었다.
5. 즉시 사용가능한 PCV2 /M. hyo 백신의 안전성 및 효능에 대한 연장된 시험
아래에서 설명되는 연구의 목적은 실험실 및 현장 조건 하에서 새로운 포실리스 PCV M Hyo 백신의 효능 및 안전성을 평가하는 것이었다.
5.1. 물질 및 방법
5.1.1. 백신
시험된 백신은 설명된 바와 같이 M.hyo 박테린 항원, 바큘로바이러스-발현 PCV2 ORF2 VLP 항원 및 에무나데 아주반트를 함유하였다. 백신은 3주령의 새끼 돼지에게 2 ml 단일 용량으로 목에 근내 투여하였다.
5.1.2. GLP 안전성 시험
12마리의 건강한 SPF 돼지로 이루어진 2개의 군을 19-21일에 포실리스 PCV M Hyo로 백신 접종하거나 (백신 접종군) 또는 포스페이트 완충 염수 (대조군)로 주사하였다. 백신 접종 후 14일까지, 새끼 돼지에서 비정상적인 전신 또는 국소 반응이 매일 관찰되었다. 직장 온도는 백신 접종 전날, 백신 접종 직전, 백신 접종 후 4시간 후 및 4일 동안 매일 기록하였다. 백신 접종 14일 후에, 모든 동물을 주사 부위 검사를 위해 희생시켰다.
5.1.3. 면역화 및
챌린지
실험
2개의 백신 항원 각각에 대한 면역 개시 (OOI) 및 면역 지속 기간 (DOI)을 실험 챌린지 연구에서 결정하였다. 각 실험에서, 백신 접종 시점에 M.hyo가 없고 PCV2에 대해 혈청 양성인 무리로부터 3주령 돼지를 무작위로 2개의 군 (백신 및 대조군)으로 나누었다 (PCV2 OOI/DOI: 군당 15마리의 돼지, M.hyo OOI: 군당 19마리의 동물, DOI: 군당 40마리의 돼지). 혈액 샘플은 백신 접종 직전, 챌린지 시에 및 챌린지 2주 후 (PCV 챌린지 연구만 해당) 및 챌린지 3주 후 채취하였다. DOI의 결정을 위해, 혈액 샘플도 백신 접종과 챌린지 사이에 규칙적인 간격으로 채취되었다.
PCV2 챌린지는 5주 또는 25주령에, 최근 네덜란드 PCV2 현장 단리물의 비강내 점적 (약 106 TCID50을 사용, 콧구멍당 3 ml)에 의해 수행되었다. PCV2 챌린지 3주 후, 모든 돼지를 부검하고, PCV2 바이러스 부하를 정량하기 위해 장간막 및 사타구니 림프절, 편도선 및 폐를 수집하였다.
M.hyo 챌린지는 7주 또는 24주령에 약 107 색상 변화 단위/ml (CCU/ml)을 함유하는 덴마크 현장 단리물의 배양물 10 ml (내셔널 베터리너리 래보래토리 (National Veterinary Laboratory, 덴마크 코펜하겐)의 엔. 프리스 박사 (Dr N. Friis)가 제공함)를 사용하여 2일 연속 기관내로 실시하였다. 챌린지 3주 후, 돼지를 부검하여 굿윈 등 (상기 문헌)이 설명한 바와 같이 평가된 폐 병변을 평가하였다.
모든 연구 동안, 돼지는 임상적 이상에 대해 매일 관찰되었다.
5.1.4. 현장 시험
네덜란드의 두 양돈 농장 및 독일의 한 양돈 농장에서 무작위 맹검 설계에 따라 어린 새끼 돼지에서 현장 안전성 시험을 실시하였다. 각각의 농장에서, 17-24일된 적어도 56마리의 건강한 3주령의 젖먹이 새끼 돼지를 무작위로 두 군 중 한 군에 할당하였다. 한 군 (백신)의 새끼 돼지는 포실리스® PCV M Hyo로 백신 접종하고, 다른 군 (대조군)의 새끼 돼지는 멸균 완충 염수를 주사하였다. 승인시 (백신 접종 전날), 백신 접종 직전, 백신 접종 1 및 4시간 후, 및 14일 동안 매일 새끼 돼지의 전반적인 건강 상태를 확인하였다. 백신 접종 전날, 백신 접종 직전, 백신 접종 4시간 후, 및 백신 접종 후 4일 동안 매일 모든 새끼 돼지의 직장 온도를 측정하였다. 주사 부위는 백신 접종 1시간 및 4시간 후, 및 이어서 14일 동안 매일 촉진에 의해 국소 반응을 검사하였다. 모든 연구용 새끼 돼지는 승인시 (-1일), 및 연구가 끝날 때 (백신 접종 후 21일) 개별적으로 체중을 측정하였다.
또한, M.hyo 및 PCV2 현장 감염으로 고통받는 프랑스 돼지 무리에서, 통제된 무작위 맹검 설계에 따라 현장 안전성 및 효능에 대한 조합 연구를 수행하였다. 건강한 3주령의 젖먹이 새끼를 각각 대략 300마리의 새끼 돼지로 이루어지는 두 군 중 하나에 무작위로 배정하였다. 한 군 (백신)의 돼지에게 포실리스® PCV M Hyo를 백신 접종하고, 다른 군 (대조군)의 돼지에게 멸균 완충 염수를 주사하였다. 1차 효능 파라미터는 도살시 폐 병변, PCV2 바이러스 혈증 및 비육기 (즉, 백신 접종 후 7주 내지 19주 (wpv)) 동안의 평균 1일 체중 증가 (ADWG)이었다. 2차 파라미터는 총 ADWG (즉, 백신 접종과 19 wpv 사이의), 사망률, 이환율, 늑막염 병변 및 PCV2 배출이었다. 또한, 백신 접종 또는 현장 감염에 대한 혈청학적 반응이 결정되었다. 돼지는 백신 접종시, 마무리 장치로 옮길 때, 및 도살 전에 개별적으로 체중을 측정하였다. 약물 치료가 기록되었고, 연구 중에 사망한 돼지는 사망 원인을 밝히기 위해 사후에 조사하였다. 폐를 개별적으로 도살하여 전형적인 M.hyo 병변 및 늑막염의 중증도를 평가하였다. 처리군당 25마리의 새끼 돼지에서 혈청 샘플을 채취하고, 직장 및 비강 스왑을 면봉으로 약 4주마다 채취하였다. 안전성이 이 연구의 주요 목적은 아니지만, 조사자는 백신 접종시, 및 군으로서 백신 접종 4시간 후 및 백신 1, 4, 7 및 14일 후에 동물을 정기적으로 관찰하였다.
5.1.5. 혈청학
M.hyo 혈청학을 위해, 시판되는 Elisa (M.hyo Ab 시험, IDEXX)를 제조사의 지침에 따라 사용하였다. 결과는 음성, 양성 또는 결정 불가로 표현된다.
PCV2 혈청학에 대해, 사내 ELISA를 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다 (Haake et al., 상기 문헌).
5.1.6.
PCV2
DNA의 정량
혈청, 림프 기관, 폐 및 배설물 내의 PCV2 바이러스 부하의 정량은 상기한 바와 같이 qPCR에 의해 수행되었다 (Haake et al., 상기 문헌).
5.1.7. 통계 분석
PCV2 챌린지 후에 수집된 혈청 샘플에 대한 qPCR 데이터의 곡선 하 면적 (AUC)을 선형 사다리꼴 규칙에 의해 계산하고, 윌콕슨 순위합 (Wilcoxon Rank Sum) 시험으로 분석하였다. 챌린지 실험에서의 폐 병변 점수 및 사타구니 및 장간막 림프절, 폐 및 편도선의 qPCR 데이터를 윌콕슨 순위합 시험으로 분석하였다.
현장 연구에서, AUC 데이터는 백신 접종군, 생산 배치 및 이들의 고정 효과로서의 상호작용을 사용하여 ANOVA에 의해 분석하기 전에 평가하였다. 현장 연구에서 폐 병변 점수는 혼합된 모델 ANOVA를 사용하여 군 간에 비교되었다. 백신 접종군, 생산 배치 및 이들의 상호작용은 고정 효과로서 포함되고, 암퇘지는 무작위 효과로서 포함되었다. 늑막염이 있거나 존재하지 않는 돼지의 비율, 사망률 및 이환율을 코크란-맨텔-헨젤 (Cochran Mantel Haenszel) 방법에 의한 백신 접종군과 분류 변수로서의 생산 배치를 비교하였다. 평균 1일 체중 증가는 혼합 모델 ANOVA를 사용하여 군 간에 비교되었다. 적절한 상호작용을 하는 백신 접종군, 생산 배치 및 성별은 고정 효과로 포함되었고, 암퇘지는 무작위 효과로서 포함되었다. 승인시의 체중은 공변량으로 모델에 포함되었다. 국소 또는 전신 반응을 보이는 돼지의 수를 피셔의 정밀 시험 (Fischer's exact test)과 비교하였다.
5.2. 결과
5.2.1. 안전성 시험
모든 안전성 연구의 종합 결과는 표 1에 요약되어 있다.
GLP 안전성 연구에서, 동물 중 어느 것도 국소 또는 전신 반응을 보이지 않았고, 부검시 주사 부위에서 육안상 이상은 관찰되지 않았다. 백신 접종 4시간 후, 백신 접종된 동물의 직장 온도는 대조군 동물보다 평균 1.1℃ 더 높았지만 (p<0.001), 백신 접종한 다음날 정상으로 돌아왔다.
현장 안전성 연구에서, 처리는 국소 주사 부위 반응을 유발하였고, 최대 직경이 백신 접종자의 13%에서 1 cm이었고, 대조군의 4%에서는 0.3 cm이었다. 이러한 국소 반응은 백신 접종 후 4시간에만 관찰되었고, 다음날 사라졌다. 처리 후 정상적인 건강 상태에서 벗어난 새끼 돼지의 수는 두 군 모두에서 유사하였다 (백신 접종자 및 대조군에서 각각 6%와 5%). 백신 접종 후 4시간에 1.1℃ 더 높은 평균 직장 온도 (p<0.0001)가 백신 접종자에서 측정되었고 (40.6℃ 대 39.5℃), 백신 접종 당일 정상으로 돌아왔다. 체중 증가는 처리 후 3주 관찰 기간 동안 군 사이에 차이가 없었다.
현장 안전성 및 효능 연구에서, 두 군의 돼지 중 약 1%에서 국소 반응이 관찰되었다. 백신 접종자의 국소 반응의 최대 크기는 2 cm이었고, 최대 지속 기간은 하루이었다. 백신 접종자의 3% 및 대조군의 1%에서 정상적인 전반적인 건강 상태로부터 벗어남이 관찰되었다. 일부 동물들은 백신 접종 4시간 후에 약간의 불편한 징후를 나타냈다.
5.2.2.
챌린지
실험
백신 접종과 챌린지 사이의 기간에 처리와 관련될 수 있는 임상적 이상은 없었다. 그러나, 일부 백신 접종 돼지 및 대조군 돼지는 연구 중 다리를 절었고, 이것은 주로 스트렙토코쿠스 수이스 감염으로 인한 것일 가능성이 가장 높았다. PCV2 챌린지 감염은 임상 징후를 유발하지는 않았지만, qPCR 데이터는 다양한 림프계 조직 및 폐의 감염을 명확하게 보여주었다 (도 1). 평균 바이러스 부하는 백신 접종 돼지에서 일반적으로 대략 2 내지 3 log10 정도 더 낮았고, 군 사이의 차이는 통계적으로 유의하였다 (p<0.05).
포실리스® PCV Mhyo에 대해 PCV2, 특정 항체 역가 약 3 Log2 이상은 바이러스 부하의 유의한 감소와 밀접한 관련이 있다. 이 실험에서, 백신 접종은 또한 백신 접종 후 PCV2에 대한 명확한 항체 반응을 유도하는 반면, 대조군은 챌린지 시간까지 모체 항체 역가가 감소한 후에 혈청학적으로 음성으로 유지되었다. 챌린지 후, 백신 접종자는 면역기억 (anamnestic) 반응을 보이고, 대조군의 동물들은 혈청전환을 시작하였다.
백신 접종 후 혈청 반응이 또한 4 wpv에서 84%의 동물이 혈청 양성 반응을 보이고 21 wpv에서 97%의 동물이 혈청 양성 반응을 보인 M.hyo 챌린지 실험에서도 관찰되었다 (도 2). 거의 모든 대조군 동물은 챌린지 감염에 대해 혈청학적 반응을 보였다. 챌린지 3주 후의 부검에서, M.hyo에 의해 유발된 폐 병변의 중앙값은 백신 접종군보다 77% (OOI 연구) 및 50% (DOI 연구) 더 낮았다 (p<0.05).
5.2.3. 현장 효능 연구
현장 연구 (도 3)에서 돼지의 PCV2 혈청학적 프로파일은 8 내지 12 wpv의 PCV2 현장 감염을 나타낸다. 사실, 백신 접종 후 8주에 PCV2의 존재는 12 wpv에 비강 및 대변 배설물에서 및 16 wpv에 혈청에서 피크에 도달하는 대조군 동물에서 낮은 양으로 검출될 수 있다. 그러나, 대조군 동물에 비해, 백신 접종된 동물의 바이러스 부하 (AUC로 계산됨)는 각각 혈청, 비강 및 대변 배설물에서 79% (p<0.0001), 70% (p<0.0001) 및 55% (p=0.0159)만큼 유의하게 감소되었다.
도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 백신 접종된 동물의 46%는 4 wpv에 M.hyo 혈청 양성 반응을 보였다. M.hyo 혈청 양성 대조군 동물은 16 wpv에 관찰되었다. 도축시에서, 백신 접종군의 폐 병변 점수는 대조군 동물에 비해 46% 더 낮았다 (p<0.0001). 특히, 심한 폐 병변 (점수 > 10)이 있는 동물의 비율은 56% 감소하였다. 늑막염이 있는 동물의 수는 백신 접종군에서 더 낮았고 (32% 대 39%), 이 감소는 통계적으로 유의하지 않았다 (p=0.121).
또한, 포실리스® PCV M Hyo로 백신 접종을 한 결과, 대조군 동물보다 비육기 동안 34 g 더 높은 ADWG (p=0.0019) 및 전체 연구 기간 동안 19 g 더 높은 ADWG (p <0.0001)가 유도되었다 (표 3). 이환율 및 사망률은 모두 백신 접종군에서 더 낮았지만, 대조군과의 차이는 통계적으로 유의하지 않았다.
5.3. 논의
본 연구는 새로운 포실리스® PCV M Hyo 백신이 3주령의 새끼 돼지에게 안전하게 투여될 수 있음을 지지한다. 전신 반응의 빈도는 매우 낮았고, 이들 반응은 염수가 주사된 대조군에서도 관찰되었듯이, 백신 접종의 결과라기보다는 치료 자체 (2 ml 부피의 주사)와 더 관련이 있는 것으로 보인다. 또한, 백신 접종은 보육기 동안 돼지의 성장에 부정적인 영향을 미치지 않았고, 국소 반응은 작고 일시적이었다. 백신 접종 4시간 후에 직장 온도가 평균적으로 약 1℃ 증가하는 것이 관찰되었다. 그러나, 온도는 다음 날 정상으로 되돌아갔고, 동물의 일반적인 행동 또는 사료 섭취량 (현장 연구에서 백신 접종 3주 또는 7주 후에 체중에 의해 측정됨)이 영향을 받지 않았기 때문에, 직장 온도의 상기 일시적인 증가는 허용가능한 백신 관련 발견이다. 또한, 상기 1℃의 평균 증가는 유럽 약전 2448 (돼지 유행성 폐렴 백신 (불활성화))에 따라 허용되는 1.5℃의 한계 이내이다.
실험적인 챌린지 연구 결과, 백신 접종 후 2주 (PCV2) 내지 4주 (M.hyo)만큼 조기에 면역이 시작되고 적어도 21주 (M.hyo) 내지 22주 (PCV2) 동안 지속되는 것으로 나타났다. 이것은 림프계 장기 및 폐에서의 PCV2 바이러스 부하의 유의한 감소 및 M.hyo 특이적 폐 병변의 유의한 감소에 의해 증명되었다. 따라서, 3주령의 동물에 대한 1회 백신 접종은 비육기 동안 비육 동물을 PCV2 및 M.hyo 감염으로부터 보호할 수 있다.
챌린지 실험 동안의 관찰은 현장 효능 시험에서 확인되었다: PCV2 바이러스 부하 및 M.hyo-유발 폐 병변의 강한 감소가 측정되었다. 현장 효능 연구에 따르면, 포실리스® PCV M Hyo의 백신 접종이 혈청 내 돼지의 바이러스 부하 수준을 감소시킬 뿐만 아니라 감염 후 비강 및 대변 경로를 통해 바이러스가 배설되는 시간을 단축하였다. 현장 연구에서 발생한 PCV2 감염은 주로 무증상이었지만, 무리에서 M.hyo 감염의 징후로서 기침이 관찰되었다.
현장 효능 연구에서 동물의 혈청학적 및 바이러스학적 프로파일링은 PCV2 감염이 약 8 wpv에서 시작되고 M.hyo 혈청 반응 동물의 수가 12-16 wpv 사이에서 관찰되었음을 나타낸다. M.hyo에 대한 혈청 전환이 일반적으로 감염 후 약 3-4주에 발생한다는 것을 고려하면, 혈청학적 프로파일은 PCV2 감염의 피크와 거의 동시에 M.hyo 감염을 나타낸다 (12-16 wpv, 15 내지 19주령). PCV2와 M.hyo의 이중 감염의 경우, PCV2는 M.hyo 병변의 중증도를 강화시키는 것으로 나타났고, M.hyo는 PCV2 바이러스 혈증의 중증도를 강화시키는 것으로 나타났다. 그리고, 두 병원체 중 하나에 대한 백신 접종만으로는 두 병원체 모두에 의한 이중 감염으로부터 동물을 보호하기에 충분하지 않다. 따라서, 동물 생산성에 대한 공동 감염의 영향은 대체로 두 병원체 중 어느 하나의 경우보다 훨씬 더 크다. 이러한 상승적 질병 영향에 대해 보호하는, 조합된 PCV2-M.hyo 백신의 이점은 비육기 (10주령 내지 22주령의 기간) 동안 34 g 더 높은 ADWG에 의해 현장 연구에서 반영되었다.
5.4. 결론:
안전:
- 백신 접종은 백신 접종 당일 적당한 온도 상승 및 백신 접종 돼지의 낮은 비율에서 낮은 전신 및 국소 반응을 유발하였다.
- 관찰된 국소 반응은 작았고 (최대 2cm) 일시적이었다 (최대 1 일).
효능:
- 개별 병원체를 사용한 단기간 (면역의 시작) 및 장기간 (면역 지속 기간) 챌린지 연구에서, PCV2/M.hyo 혼합 백신은 혈청, 림프계 조직 및 폐 내의 PCV2 부하뿐만 아니라, M.hyo 유발 폐 병변을 유의하게 감소시켰다.
- PCV2 및 M.hyo 둘 모두가 존재하는 농장에서의 위약 대조 현장 시험 (placebo-controlled field trial)에서, 3주령의 새끼 돼지의 백신 접종은 PCV2 바이러스 혈증 및 배출을 감소시키고, 도축시 폐 병변 점수를 저하시켰다.
- 또한, 비육기에 평균 1일 체중 증가 (+ 34 g/일)에 대한 백신 접종의 긍정적인 효과가 관찰되었다
5.5. 표:
<표 2>
PCV2/M.hyo 혼합 백신의 안전성 분석
<표 3>
PCV2/M.hyo 혼합 백신을 사용한 현장 효능 시험에서의 실험 동물 및 그의 생산성에 대한 설명 데이터
1백신 군 - 대조군
6. M. hyo 항원을 수산화알루미늄 아주반트에 결합시키는 조건의 영향
6.1. 소개
추가 연구에서, M.hyo 항원의 수산화알루미늄 아주반트에 대한 결합 조건을 변화시켜 항원/아주반트 복합체의 형성 효율에 대한 효과를 시험하였다.
구체적으로, M.hyo 항원의 결합에 대한 수산화알루미늄의 온도, pH 및 양의 영향을 소규모로 다수의 완전한 o/w 백신 제제를 제조하여 조사하였다. 다음으로, 완전한 백신 에멀젼에서 및 백신 에멀젼의 원심분리 후 펠렛 또는 상청액 샘플에서 항원/아주반트 복합체에 결합된 M.hyo 항원의 상대적인 양을 측정하였다.
6.2. 물질 및 방법
6.2.1. 백신
에멀젼
제조
상이한 백신 제제의 제조는 본질적으로 실시예 3에서 설명한 바와 같았다. M.hyo 또는 PCV2 항원의 표준 배치로부터, M.hyo 항원을 6% (w/v)의 농도로 첨가하고, PCV2 항원을 2500 U/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 20 ml의 백신 에멀젼을 상이한 조건 하에 제조하였다 (표 4 참조). 제조 후, 모든 백신을 2-8℃에서 시험할 때까지 보관하였다
<표 4>
상이한 백신에 대한 파라미터의 변경
6.2.2. 샘플 제조
10 ml의 백신을 낮은 g 값 (600 xg에서 20분)에서 원심분리하고, 상청액 (8.5 ml)을 제거하였다. 샘플 번호 7로부터, 수산화알루미늄의 양이 많아서 펠렛이 더 큰 부피를 갖기 때문에 7.5 ml의 상청액만이 제거될 수 있었다. '펠렛' 및 상청액의 동일한 부피를 비교할 수 있도록, 제거된 상청액의 부피와 동일한 부피의 0.9% 생리학적 염수로 펠렛을 보충하고 균질화하였다.
6.2.3. M.
hyo
항원 정량
시험 샘플 내의 M.hyo 항원의 양은 상청액 및 펠렛 샘플 둘 모두에 대해 표준 Elisa로 측정할 수 있었다. 측정된 OD로부터 항원 양의 계산은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수행하였다. 각각의 샘플을 2회 시험하고, 백신, 펠렛 및 개별 블렌드의 상청액을 하나의 미량역가판에서 동시에 시험하였다. 표 5에 제시된 결과는 각각의 중복 시험의 평균값이다. 펠렛 및 상청액의 상대적인 효능 단위 (RPU) 값은 100%로 설정된 각각의 완전한 백신 에멀젼 내의 M.hyo 항원의 양에 비례하여 계산되었다.
6.3. 결과
샘플의 원심분리는 낮은 g 값에서 수행하였고, 이것은 아주반트에 대한 그의 결합과 독립적으로, M.hyo 항원을 펠렛화하지 않고 수산화알루미늄을 펠렛화하기에 충분하였다. 또한, 상기 낮은 g 값에서 상청액은 여전히 수중유 에멀젼으로 이루어졌다.
원심분리가 어렵지 않다는 것을 확인하기 위해, M.hyo 및 PCV2 항원을 빈 에무나데 o/w 에멀젼과 직접 혼합한 다음, 동일한 낮은 g 값에서 즉시 원심분리하여 대조군 샘플을 제조하였다. 이 대조군 샘플의 결과는 상기 조건 하에서 M.hyo 항원이 그 자체로서 유의한 수준으로 침전되지 않았다는 것을 입증한다: 이 펠렛에서 검출된 13% M.hyo 항원은 단지 상기 시험된 백신의 총 부피로부터 펠렛의 부피 부분 (10 ml로부터 1.5 ml)을 나타낼 뿐이다.
pH 값 또는 인큐베이팅 온도에서 편차가 있는 샘플을 제외하고, 다른 샘플의 pH는 6.8 내지 7.3이었고, 실험 당시의 주위 온도는 22℃이었다.
표준 조건은 O/N 인큐베이팅, 주위 온도, 6.5 내지 7.5의 pH 및 9.8 w/w% 수산화알루미늄 아주반트이다.
다양한 샘플의 펠렛 및 상청액에서 측정된 M.hyo 항원의 RPU 백분율을 표 5에 나타내었다. 온도 및 pH의 경우, M.hyo 항원의 수산화알루미늄 아주반트에 대한 결합에 대한 유의한 영향은 관찰되지 않았다. 수산화알루미늄 상에서 검출된 M.hyo 항원의 상대적인 양은 상기 조건에서 74 - 82%이었다.
그러나, 에멀젼 내의 수산화알루미늄의 양은 유의한 영향을 미쳤다: 9.8로부터 5% w/w로의 감소는 펠렛에서 M.hyo 항원의 상대적인 양을 거의 절반으로 줄였고 (48%), 수산화알루미늄의 양이 25%로 증가하면 M.hyo 항원의 거의 완전한 결합이 관찰되었다 (96%).
<표 5>
펠렛 및 상청액에 존재하는 M.hyo 항원의 상대적인 백분율
6.4. 결론
결합의 온도 또는 pH 조건의 변화에 따라 M.hyo 항원의 수산화알루미늄에 대한 결합에 관하여 유의한 차이는 발견되지 않았다. 결합시 수산화알루미늄 양의 변화의 효과가 확인되었다.
<도면의 설명>
도 1: PCV2 챌린지 연구의 결과:
qPCR에 의해 검출되는 항-PCV2 항체 역가 및 PCV2 바이러스 부하로 표현되는 면역의 개시 및 지속 기간.
도 2: M.hyo 챌린지 연구의 결과:
항-M.hyo 항체 역가 및 폐 병변 점수로 표현되는 면역의 개시 및 지속 기간.
도 3: 현장 효능 연구에서 얻은 PCV2 데이터:
실험 8주와 12주 사이에 PCV2 현장 감염이 발생한 현장 효능 연구의 결과. 결과는 혈청학 및 바이러스 DNA 검출로부터 제시된다.
도 4: 현장 효능 연구에서 얻은 M.hyo 데이터:
실험 12주경에 M.hyo 현장 감염이 발생한 현장 효능 연구의 결과. 결과는 혈청학 및 폐 병변 점수로부터 제시된다.
Claims (15)
- 수산화알루미늄 아주반트 (Aluminium-hydroxide adjuvant)에 흡착된 미코플라스마 히오뉴모니애 (M.hyo) 항원의 미리 형성된 항원/아주반트 복합체에 돼지 써코바이러스 2형 (PCV2) 항원을 혼합하는 단계를 포함하는, 미코플라스마 히오뉴모니애 (M.hyo) 및 돼지 써코바이러스 2형 (PCV2)의 항원을 포함하는 즉시 사용가능한 돼지용 혼합 백신을 위한 항원 조성물의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 항원/아주반트 복합체가
a. 수산화알루미늄 아주반트 및 M.hyo 항원을 수산화알루미늄 아주반트가 양전하로 하전되는 pH의 수성 담체에서 혼합하는 단계 및
b. 단계 a.의 혼합물을 인큐베이팅하여 수산화알루미늄 아주반트에 대한 M.hyo 항원의 흡착을 허용하고 항원/아주반트 복합체를 형성시키는 단계
에 의해 미리 형성되는 것인 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조건 중 하나 이상 또는 전부가 적용되는 것인 방법:
M.hyo 항원은 M.hyo 박테린이고; PCV2 항원은 PCV2 ORF2에 의해 코딩되고; PCV2 ORF2에 의해 코딩되는 항원은 바이러스 유사 입자이고; 단계 a.의 수성 담체는 평형 염 용액이고; 단계 a.의 수성 담체의 pH는 6 내지 8이고; 단계 a.의 혼합물에는 본질적으로 다른 성분이 없고; 단계 b.의 인큐베이팅 시간은 10시간 내지 20시간이고; 단계 b.의 인큐베이팅 온도는 실온이고; 단계 b.의 인큐베이팅은 인큐베이팅된 혼합물의 완만한 교반을 포함한다. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 항원 조성물.
- 제4항에 있어서, M.hyo 항원의 적어도 50%가 항원/아주반트 복합체에 위치하는 것인 항원 조성물.
- 제5항에 있어서, 수산화알루미늄 아주반트의 단백질 결합능의 적어도 50%가 M.hyo 항원에 의해 사용되는 것인 항원 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 항원 조성물 또는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항원 조성물 및 추가의 아주반트를 포함하는, M.hyo 또는 PCV2에 의한 감염 및 질병의 관련 징후의 예방 또는 감소를 위한 돼지용의 즉시 사용가능한 백신.
- 제7항에 있어서, 백신이 수중유 에멀젼이고 추가의 아주반트가 광유인 백신.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 백신이 돼지에 병원성인 미생물로부터 유래된 추가의 항원 물질을 포함하는 것인 백신.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 항원 조성물 또는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항원 조성물 및 추가의 아주반트를 혼합하는 단계를 포함하는, 제7항에 따른 백신의 제조 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 항원 조성물 또는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항원 조성물 및 광유를 수중유 에멀젼으로 유화시키는 단계를 포함하는, 제8항에 따른 백신의 제조 방법.
- M.hyo 또는 PCV2에 의한 감염 및 질병의 관련 징후를 예방하거나 감소시키기 위한 돼지용 백신에 사용하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 항원 조성물 또는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항원 조성물.
- M.hyo 또는 PCV2에 의한 감염 및 질병의 관련 징후를 예방하거나 감소시키기 위한 백신의 제조를 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 항원 조성물 또는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항원 조성물의 용도.
- M.hyo 또는 PCV2에 의한 감염 및 질병의 관련 징후를 예방하거나 감소시키기 위한, 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 백신 또는 제10항 또는 제11항에 따른 방법에 의해 수득가능한 백신의 용도.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 백신 또는 제10항 또는 제11항에 따른 방법에 의해 수득가능한 백신을 돼지에게 투여하는 것을 포함하는, 돼지에서 M.hyo 또는 PCV2에 의한 감염 및 질병의 관련 징후를 예방하거나 감소시키는 방법.
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