KR20170093084A - 간세포성장인자를 발현하는 중간엽줄기세포 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 간세포성장인자 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터, 및 상기 벡터를 이용하여 제조된 렌티바이러스에 의해 형질감염된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 렌티바이러스는 HGF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고, 상기 렌티바이러스로 형질감염된 숙주세포는 높은 세포 증식율을 유지한다. 따라서, 상기 렌티바이러스가 형질감염되어 HGF를 발현하는 중간엽줄기세포는 세포 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 HGF(hapatocyte growth factor) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터, 및 상기 벡터를 이용하여 제조된 렌티바이러스에 의해 형질감염된 세포에 관한 것이다.
전 세계적으로 세포를 이용한 치료 방법이 개발되고 있으며, 특히 줄기세포치료제 시장은 연평균 11.7%의 성장율로 지속적인 상승 추세를 보이고 있다.
성체줄기세포인 중간엽줄기세포(MSC)는 다능성(multipotent) 세포로서, 뼈, 연골, 근육, 지방, 섬유아세포 등으로 분화할 수 있다. 또한, 상기 MSC는 골수, 제대혈, 지방 등 다양한 성체조직에서 비교적 쉽게 얻을 수 있다. MSC는 염증 또는 손상부위로 이동하는 특성이 있어, 치료 약물을 전달하기 위한 전달체로서도 큰 장점이 있다. 또한, T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 자연살해세포와 같은 면역 세포의 기능을 억제하여, 인체의 면역기능을 조절할 수 있다. 그뿐 아니라, MSC는 시험관 내(in vitro)에서 비교적 쉽게 배양할 수 있다는 장점이 있어, 이를 세포치료제로 이용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
그러나, 이와 같은 MSC의 장점에도 불구하고, 세포 치료제로서 임상에 사용할 수 있는 등급의 MSC를 생산하는데 다음과 같은 문제가 있다. 첫째, MSC의 증식에는 한계가 있어, 이를 대량으로 생산하기 어렵다. 둘째, 수득한 MSC는 다양한 종류의 세포가 혼합되어 있어, 생산시마다 동일한 효과를 유지하기 어렵다. 셋째, MSC만을 이용할 경우 치료 효과가 높지 않다.
한편, 대한민국 등록특허 제1585032호에서는 하이드로겔에서 배양한 중간엽줄기세포를 함유하는 세포 치료제를 개시하고 있다. 상기 문헌에는 세포 치료제로 사용하기 위한 중간엽줄기세포를 분리하는 공정에서, 전처리 과정을 단축하여 바로 투여 가능한 조성물을 제공하고 있다. 그러나, 상기와 같은 중간엽줄기세포의 문제점 및 이를 해소하기 위한 방안에 대해서는 전혀 언급하고 있지 않다. 따라서, 세포 치료제로 유용하게 사용할 수 있는 중간엽줄기세포에 대한 연구가 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은, HGF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 및 상기 재조합 렌티바이러스가 형질감염된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 재조합 렌티바이러스 또는 숙주세포를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HGF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 HGF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 렌티바이러스가 형질감염된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 렌티바이러스를 유효성분으로 포함하는 혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 HGF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스로 형질감염된 숙주세포는 HGF를 발현하며, 높은 세포 증식율을 유지한다. 또한, 비정상적인 분화를 억제하고 종양 형성의 가능성을 차단할 수 있어 안전성이 높다. 따라서, 상기 HGF를 발현하는 숙주세포는 세포 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 불사화된 MSC와 불사화되지 않은 MSC의 세포 증식율을 비교한 그래프이다:
imMSC: 불사화된 MSC;
MSC: 불사화되지 않은 MSC;
X축: 배양기간; 및
Y축: 누적된 세포집단배가수(population doubling level, PDL).
도 2는 pBD-4 렌티바이러스 벡터에 삽입한 유전자 컨스트럭트의 구성을 도식화한 것이다:
TRE: 테트라사이클린 반응 요소(tetracycline response elements)를 포함하는 프로모터;
HGF: 간세포성장인자;
RSVp: RSV 프로모터; 및
HygroR: 하이그로마이신에 대한 저항성을 갖는 유전자.
도 3은 HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스가 형질감염된 불사화된 MSC의 세포 증식율을 확인한 그래프이다:
X축: 배양기간; 및
Y축: 누적된 세포집단배가수.
도 4는 기탁균주인 BM-34A에 HGF가 존재하는지 여부를 확인한 것이다. 1번 레인은 마커, 2번 및 3번 레인은 BM-34A, 4번 레인은 음성대조군, 5번 레인은 양성대조군을 나타낸다.
도 5는 세 개의 다른 패시지(passage)의 BM-34A 세포주에서 HGF 단백질의 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 계대 배양하여 수득한 BM-34A 세포의 PDL 값을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 BM-34A 세포주에 대하여 유전자가 이입된 세포의 핵형을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
imMSC: 불사화된 MSC;
MSC: 불사화되지 않은 MSC;
X축: 배양기간; 및
Y축: 누적된 세포집단배가수(population doubling level, PDL).
도 2는 pBD-4 렌티바이러스 벡터에 삽입한 유전자 컨스트럭트의 구성을 도식화한 것이다:
TRE: 테트라사이클린 반응 요소(tetracycline response elements)를 포함하는 프로모터;
HGF: 간세포성장인자;
RSVp: RSV 프로모터; 및
HygroR: 하이그로마이신에 대한 저항성을 갖는 유전자.
도 3은 HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스가 형질감염된 불사화된 MSC의 세포 증식율을 확인한 그래프이다:
X축: 배양기간; 및
Y축: 누적된 세포집단배가수.
도 4는 기탁균주인 BM-34A에 HGF가 존재하는지 여부를 확인한 것이다. 1번 레인은 마커, 2번 및 3번 레인은 BM-34A, 4번 레인은 음성대조군, 5번 레인은 양성대조군을 나타낸다.
도 5는 세 개의 다른 패시지(passage)의 BM-34A 세포주에서 HGF 단백질의 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 계대 배양하여 수득한 BM-34A 세포의 PDL 값을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 BM-34A 세포주에 대하여 유전자가 이입된 세포의 핵형을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 HGF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "간세포성장인자(hapatocyte growth factor, 이하 HGF)" 단백질은 분산인자(scatter factor) 또는 헤파토포이에틴-A(hepatopoietin-A)로 알려진 헤파린 결합 당단백질이다. 이는 여러가지 간엽계 세포에 의해 생산되며, 세포의 증식을 촉진시킨다. 또한, HGF는 내피세포(endothelial cell)의 성장 및 혈관 평활근 세포(vascular smooth muscle cell)의 이동을 조절하며, 혈관신생(angiogenesis)을 유도하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 따른 HGF 단백질은 인간 유래의 단백질일 수 있다. 상기 HGF 단백질은 69 kDa의 α사슬과 34 kDa의 β사슬로 된 헤테로 2합체 단백질로, α사슬에 4개의 크린글(kringle) 구조를 포함할 수 있다. 본 발명의 HGF 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 HGF 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 한편, 상기 HGF 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 HGF 단백질을 코딩하는 염기 서열은 서열번호 2의 염기 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "렌티바이러스 벡터"는 레트로바이러스의 일종이고, 단일가닥 RNA 형태의 벡터로 렌티바이러스 트랜스퍼 벡터와 혼용하여 지칭되기도 한다. 상기 렌티바이러스 벡터는 감염 대상인 세포의 게놈 DNA에 삽입되어 안정되게 유전자를 발현시키며, 분열세포 및 비분열세포에 유전자를 전달할 수 있다. 상기 벡터는 인체의 면역반응을 유도하지 않기 때문에 발현이 지속적이다. 또한, 종래에 사용되는 바이러스 벡터인 아데노바이러스 벡터에 비하여 큰 사이즈의 유전자도 전달 가능한 이점이 있다.
상기 렌티바이러스 벡터는 티미딘인산화효소(thymidine kinase, TK) 단백질을 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 상기 TK 단백질은 ATP의 γ위치의 인산을 티미딘에 결합시켜 티미딜산 생성반응을 촉매하는 효소로, 이로 인해 티미딘은 삼인산 형태로 변형된다. 변형된 티미딘은 DNA 복제에 사용될 수 없고, 따라서 이를 포함하는 세포의 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다. 상기 TK 단백질은 공지된 서열이라면 모두 사용가능하다. 일 실시예에 의하면, 상기 TK 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 한편, 상기 TK 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터는 프로모터에 의해 이에 적재된 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡기세포융합바이러스(RSV), 인간 성장인자-1 알파(human elongation factor-1 alpha, EF-1α 또는 TRE(tetracycline response elements) 프로모터일 수 있다. 일 실시예에 의하면, 재조합 렌티바이러스 벡터는 1개의 프로모터에 의해서 HGF 단백질의 발현을 조절할 수 있다. 상기 프로모터는 발현시키고자 하는 단백질을 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된다.
일 실시예에 의하면, 상기 HGF 단백질은 TRE 프로모터에 연결될 수 있다. 상기 TRE 프로모터는 tTA(tetracycline transactivator) 단백질에 의하여 프로모터와 연결된 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있다. 구체적으로, tTA 단백질은 테트라사이클린(tetracycline) 또는 독시사이클린(doxycycline)이 존재하지 않을 때 TRE 프로모터에 결합하여 전사를 활성화시키고, 이들이 존재하는 경우에는 TRE 프로모터에 결합하지 못하여 전사를 활성화시키지 못한다. 따라서, HGF 단백질의 발현은, 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 첨가 여부에 따라 이를 조절할 수 있다.
상기 용어 "작동가능하게 연결된"은 특정 폴리뉴클레오티드가 그 기능을 발휘할 수 있게 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 것을 의미한다. 즉, 특정 단백질을 코딩하는 유전자가 프로모터에 작동가능하게 연결되었다는 것은 당해 프로모터의 작용에 의해 mRNA로 전사되고 당해 단백질로 번역까지 될 수 있게 연결되었다는 것을 의미한다.
본 발명은 HGF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스를 제공한다.
상기 재조합 렌티바이러스는 본 발명의 렌티바이러스 벡터, 패키징 플라스미드 및 엔벨로프(envelope) 플라스미드로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 및 형질전환된 숙주세포로부터 렌티바이러스를 분리하는 단계를 통하여 수득할 수 있다.
상기 용어 "패키징 플라스미드(packaging plasmid)" 및 "엔벨로프 플라스미드(envelope plasmid)"는, 효율적인 형질감염을 위해, 본 발명의 렌티바이러스 벡터로부터 렌티바이러스를 생산하기 위한 헬퍼 구조물(예를 들어, 플라스미드 또는 단리된 핵산)을 제공할 수 있다. 이러한 구조물은 숙주세포에서 렌티바이러스 벡터를 제조하고, 이를 패키징하는데 유용한 요소들을 함유한다. 상기 요소로는 gag 전구체와 같은 구조 단백질; pol 전구체와 같은 프로세싱 단백질; 프로테아제, 외피 단백질, 및 숙주세포에서 단백질을 제조하고 렌티바이러스 입자를 생산하는데 필요한 발현 및 조절 신호 등을 포함할 수 있다.
재조합 렌티바이러스의 생산에는 Clontech Laboratories사의 Lenti-X Lentiviral Expression System이나, Addgene사에서 제공하는 패키징 플라스미드(예를 들어, pRSV-Rev, psPAX, pCl-VSVG, pNHP 등) 또는 엔벨로프 플라스미드(예를 들어, pMD2.G, pLTR-G, pHEF-VSVG 등)를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 렌티바이러스가 형질감염된 숙주세포를 제공한다.
상기 용어 "형질감염(transfection)"은, 바이러스 감염(infection)을 통하여 재조합 렌티바이러스 벡터에 적재된 유전자를 전달하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 숙주세포는 인간배아줄기세포(human embryonic stem cell, hES), 골수줄기세포(bone marrow stem cell, BMSC), 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC), 인간신경줄기세포(human neural stem cell, hNSC), 윤부줄기세포(limbal stem cell) 또는 경구점막상피세포(oral mucosal epithelial cell)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 숙주세포는 중간엽줄기세포일 수 있다.
상기 용어 "중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)"는 골세포, 연골세포 및 지방세포를 포함하는 다양한 세포로 분화될 수 있는 다분화능 기질세포를 말한다. 중간엽줄기세포는 뼈, 연골, 지방, 힘줄, 신경조직, 섬유아세포 및 근육세포 등 구체적인 장기의 세포로 분화될 수 있다. 이들 세포는 지방조직, 골수, 말초신경 혈액, 제대혈, 골막, 진피, 중배엽-유래 조직 등으로부터 분리 또는 정제될 수 있다.
상기 숙주세포는 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다:
1) 숙주세포에 hTERT 및 c-myc 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 1차 감염시키는 단계;
2) 1차 감염된 숙주세포에 tTA 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 2차 감염시키는 단계;
3) 2차 감염된 숙주세포에 HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 3차 감염시키는 단계.
상기 단계 1)에서 hTERT 및 c-myc은 숙주세포를 불사화시키는 유전자로서, 상기 hTERT 및 c-myc 이외에도 불사화 유전자로 알려진 다른 유전자도 사용가능하다. 일 실시예에 의하면, 상기 hTERT 및 c-myc 단백질은 각각 서열번호 7 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 한편, 상기 hTERT 및 c-myc 단백질을 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 8 및 서열번호 6의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 단계 2)에서 tTA는 표적 단백질의 발현을 조절할 수 있는 유전자로, 테트라사이클린 트랜스액티베이터를 의미한다. 본 발명에서 사용된 Tet-off 시스템은, 상기 서술한 바와 같은 방법으로 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 존재 유무에 따라 표적 단백질의 발현을 조절할 수 있다.
상기 단계 3)에 해당하는 일 실시예에 의하면, 불사화된 MSC에 HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 3차감염시켜 HGF 유전자를 발현하는 세포를 제조하여 수득하였다. 상기 제조된 세포를 BM-34A로 명명하고, 이를 2017년 1월 6일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁번호 KCTC 13183BP로 기탁하였다.
본 발명은 상기 서술한 바와 같은 재조합 렌티바이러스 또는 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "혈관계 질환(vascular disease)"은 혈관의 노화 또는 탄력 저하에 의해 야기될 수 있는 질환을 의미한다. 본 발명의 재조합 렌티바이러스 또는 숙주세포는 HGF의 발현을 통해 혈관생성 효과를 나타낼 수 있기 때문에, 다양한 혈관계 질환의 치료에 사용될 수 있다.
상기 혈관계 질환은 관상동맥, 뇌혈관, 말초동맥질환 등에서 발생하는 질환으로, 협심증, 심근경색, 동맥경화증, 죽상동맥경화증, 결절성 동맥주위염, 고안동맥염, 혈관폐색, 뇌졸중, 뇌출혈, 뇌색전, 뇌부종 및 허혈성 질환으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 일종의 세포치료제로서, 약학적 조성물의 제형에 필요한 약학적으로 허용가능한 담체, 첨가제 또는 부형제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 담체는 약품 제조시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 담체는 본 발명의 약학 조성물 총 중량을 기준으로 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 약학적으로 허용가능한 첨가제는 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%로 포함될 수 있다.
상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 서술한 바와 같은 혈관계 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 상기 약학 조성물의 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료 효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 약학 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우, 그 예로는 피하, 눈, 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내, 뇌 내, 두개 내(intracranial), 척추 내, 뇌실 내, 수강막 내, 비 내, 정맥 내, 심장 내 투여가 있다.
상기 투여는 1회 이상, 1 내지 3회 투여될 수 있고, 구체적으로 2회로 나누어 투여될 수 있다. 이를 반복투여하는 경우에는 12 내지 48시간, 24 내지 36시간 간격으로 투여할 수 있고, 구체적으로는 24시간 간격으로 투여할 수 있다. 상기 투여는 렌티바이러스의 경우, 성인 기준 1일 1.0x106 내지 1.0x1012 TU, 구체적으로 1.0x108 내지 1.0x1010 TU의 양으로 투여될 수 있다. 한편, 세포의 경우, 성인 기준 1일 1.0x105 내지 1.0x1011 cells, 구체적으로 1.0x107 내지 1.0x109 cells의 양으로 투여될 수 있다. 투여량이 많은 경우에는 하루에 수회에 걸쳐 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 불사화된 중간엽줄기세포(MSC)의 제조
1-1. 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 제조
MSC를 불사화시키기 위하여, 불사화 유전자인 c-Myc 및 hTERT를 각각 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제조하였다. 이때, Tet-off 시스템을 사용하기 위해 tTA 단백질을 발현하는 유전자 컨스트럭트를 함께 삽입하였다.
먼저, pWPT 벡터(Addgene, 미국)의 발현 카세트 내에 EF 프로모터를 CMV 프로모터로 치환하고, 그 하위에 RSV 프로모터를 추가 연결하여 pBD 렌티바이러스 벡터를 제작하였다.
상기 pBD 렌티바이러스 벡터에, c-Myc 유전자(서열번호 6) 및 티미딘인산화효소(thymidine kinase, TK) 유전자(서열번호 4)를 IRES로 연결하여 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD-1로 명명하였다.
한편, pBD 렌티바이러스 벡터에, hTERT 유전자(서열번호 8)를 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 여기에, 지오마이신(zeomycin)에 대한 저항성을 갖는 유전자(ZeoR; 서열번호 14)는 RSV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD-2로 명명하였다.
또한, pBD 렌티바이러스 벡터에, tTA(tetracycline transactivator) 유전자(서열번호 10)를 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 여기에 퓨로마이신(puromycin)에 대한 저항성을 갖는 유전자(PuroR; 서열번호 12)는 RSV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD-3로 명명하였다.
1-2. 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 생산
상기 실시예 1-1에서 제작된 렌티바이러스 벡터를 이용하여, 다음과 같은 방법으로 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 생산하였다.
먼저, 렌티-X 세포(Clontech Laboratories, 미국)는 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 150 ㎜ 디쉬(dish)에 배양하였다. 한편, 렌티바이러스 벡터는 EndoFree Plasmin Maxi Kit(Qiagen, 미국)를 사용하여 DH5α 대장균 세포로부터 추출 및 정량하였다.
상기 배양된 렌티-X 세포를 PBS로 세척한 후, 3 ㎖의 TrypLE™ Select CTS™(Gibco, 미국)을 첨가하였다. 세포를 37℃에서 약 5분 동안 방치한 뒤, 세포가 탈착된 것을 확인하였다. 탈착된 세포를 7 ㎖의 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지를 첨가하여 중화시켰다. 중화된 세포는 50 ㎖ 튜브에 모아서 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 10 ㎖의 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배양배지를 첨가하여 세포를 재현탁하였다. 현탁된 세포는 헤마토사이토미터로 그 수를 측정한 뒤, 150 ㎜ 디쉬에 1.2x107개의 세포가 되도록 분주하였다. 상기 분주된 세포의 세포 포화도가 약 90% 정도로 배양되었을 때, 12 ㎍의 렌티바이러스 벡터, 12 ㎍의 psPAX(Addgene; gag-pol 발현, 패키징 플라스미드) 및 2.4 ㎍의 pMD.G 플라스미드(Addgene; VSVG 발현, 엔벨로프 플라스미드) 혼합물을 상기 세포에 형질도입하였다. 형질도입을 돕기 위해, 리포펙타민(Invitrogen, 미국)과 플러스 리에이전트(Invitrogen, 미국)를 사용하였다. 형질도입 6시간 후, 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM으로 배지를 교환하였다. 이를 48시간 추가 배양한 뒤, 상층액을 모았다.
상기 수득된 상층액을 렌티바이러스 농축키트(Lenti-X concentrator, Clontech Laboratories, 미국)와 혼합한 후, 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이를 4℃, 4,000 rpm의 조건으로 2시간 동안 원심분리하여 바이러스를 수득하고, 이를 FBS가 포함되지 않은 0.5 ㎖의 DMEM에 재현탁하였다. 그 결과, pBD-1, pBD-2 및 pBD-3 렌티바이러스 벡터로부터 생산된 렌티바이러스를 각각 4.0x108 TU/㎖, 2.0x108 TU/㎖ 및 1.2x109 TU/㎖의 농도로 준비하였다.
1-3. 불사화된 중간엽줄기세포의 제조
상기 실시예 1-2에서 생산된 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 사용하여, 불사화된 MSC를 제조하였다.
먼저, 골수유래 MSC를 다음과 같은 방법으로 준비하였다. 구체적으로, 건강한 공여자(donor)의 장골능(iliac crest)에서 골수천자액(bone marrow aspirate)을 수득하였다. 이를 멸균 콘테이너에서 20 IU/㎖의 헤파린과 혼합하여 응고를 억제하였다. 상기 골수 혼합액을 4℃, 739 g의 조건으로 7분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하고, 10배 부피의 멸균된 물과 혼합하였다. 이를 동일한 조건으로 다시 원심분리하여 세포의 펠렛을 수득하였다. 수득된 펠렛을 20%의 FBS 및 5 ng/㎖의 b-FGF(100-18B, Peprotech, 미국)가 포함된 DMEM-low glucose(11885-084, Gibco, 미국) 배지에 현탁하여 배양 플라스크에 분주하였다. 이를 37℃, 5% CO2 조건에서 24 내지 48시간 동안 배양한 뒤, 새로운 배지로 교체하였다. 이를 3 내지 4일 간격으로 새로운 배지로 교체하면서 계대 배양하였고, 배양 2주 후 형광세포분석기를 사용하여 MSC 여부를 확인하였다.
상기 실시예 1-2에서 생산된 pBD-1 렌티바이러스로 상기 준비된 MSC를 레트로넥틴(Retronectin, Clontech Laboratories, 미국)을 사용하여 100 MOI로 감염시켰다. 감염된 세포에 동일한 방법으로, pBD-2 렌티바이러스 벡터를 100 MOI로 감염시켰다. 감염 후, 안정화된 세포의 배양액에 500 ㎍/㎖의 지오마이신을 첨가하여 pBD-2 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다.
상기 선별된 세포에 pBD-3 렌티바이러스 벡터를 100 MOI로 감염시켰다. 감염 후, 안정화된 세포의 배양액에 1 ㎍/㎖의 퓨로마이신을 첨가하여 pBD-3 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다.
그 결과, 불사화 유전자를 포함하는 MSC 및 그렇지 않은 MSC의 세포 증식율을 도 1에 나타내었다. 보이는 바와 같이, 불사화 유전자인 c-myc 및 hTERT를 포함하는 렌티바이러스에 의해 감염된 MSC 세포는, 배양 120일 이후에도 높은 세포 증식율을 유지하였다. 반면, 정상 MSC 세포는 배양 40일 이후에는 세포 증식율이 급격히 감소하였다.
실시예 2. HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 제작
2-1. HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 제작
상기 제작된 pBD 렌티바이러스 벡터에, HGF 유전자(서열번호 2)를 삽입하였다. 이때, 삽입된 HGF 유전자는 TRE 프로모터에 의해 발현이 조절되도록 하였다. TRE 프로모터는 독시사이클린의 첨가 유무에 따라 이와 연결된 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
여기에, 하이그로마이신(hygromycin) 저항성을 갖는 유전자(HygroR)(서열번호 16)는 RSV 프로모터에 의해 발현이 조절되도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD-4로 명명하였고, 그 유전자 컨스트럭트의 구조를 도 2에 나타내었다.
2-2. HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 생산
상기 실시예 2-1에서 제작된 HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 이용하여, 상기 실시예 1-2에 기재된 바와 동일한 방법으로 렌티바이러스를 생산하였다. 생산된 렌티바이러스는 3.5x108 TU/㎖의 농도로 준비하였다.
실시예 3. HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스가 형질감염된 MSC의 제조
3-1. HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스가 형질감염된 MSC의 제조
상기 실시예 1-3에서 제조한 불사화된 MSC에, 상기 실시예 2-2에서 생산한 HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 감염시켜, HGF 유전자를 발현하는 세포를 제조하였다. 감염은 실시예 1-3에 기재된 바와 동일한 방법으로 수행되었다. 감염 후, 안정화된 세포의 배양액에 25 ㎍/㎖의 하이그로마이신을 첨가하여 pBD-4 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다. 선별된 세포는 2 ㎍/㎖의 독시사이클린(doxycycline, 631311, Clontech, 미국)이 첨가된 배지에서 배양함으로써, 배양중에 HGF 단백질의 발현을 억제시켰다.
상기 선별된 세포가 콜로니를 형성하도록 배양하였다. 형성된 콜로니로부터 단일클론의 세포를 배양하여 세포주를 확립하고 이를 BM-34A라고 명명하였다. 세포주 BM-34A는 2017년 1월 6일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁번호 KCTC 13183BP로 기탁하였다. 그 결과, 확립된 세포주의 증식율을 도 3에 나타내었다. 보이는 바와 같이 BM-34A 세포주는 안정적으로 증식하였다.
3-2. BM-34A 세포주의 도입유전자 확인 시험
상기 확립된 세포주인 BM-34A 검체를 37℃ 항온수조에서 약 1분간 해동하고 9 ㎖ PBS가 포함된 15 ㎖ 튜브에 옮긴 후 1,500 rpm으로 5분간 셀 다운(Cell Down) 시켰다. PBS를 완전히 제거한 뒤, 1.5 ㎖ 튜브에 200 ㎕의 PBS로 펠렛을 현탁하여 옮겼다. NucleoSpin? Tissue (MN, 740952.250)를 이용하여 gDNA를 준비하고 하기 표 1과 같이 혼합물을 만든 후, 하기 표 2의 단계로 PCR을 수행하였다. 이때, 양성대조군으로 100 ng의 BM-34A 플라스미드 DNA를, 음성대조군으로 1 ㎕의 dW를 넣었다.
Forward primer(서열번호 17) (10 pmol/㎕, BM163) | 1 ㎕ |
Reverse primer(서열번호 18) (10 pmol/㎕, BM151) | 1 ㎕ |
검체 (100 ng/㎕) | 1 ㎕ |
dW | 17 ㎕ |
Total volume | 20 ㎕ |
Step | Temperature | Time | Cycle |
1st | 95℃ | 5min | 1 |
2nd |
95℃ | 45sec | 35 |
60℃ | 45sec | ||
72℃ | 1min | ||
3rd | 72℃ | 7min | 1 |
4th | 4℃ | Indefinitely | 1 |
1% 아가로오스 겔을 전기영동 키트에 넣었다. 첫번째 웰에 10 ㎕의 DNA Size Marker를 로딩하였고, 다음 웰부터 BM-34A 검체(2개), 음성대조군, 양성대조군의 순서로 각각 10 ㎕씩 로딩하였다. 이후 100 V로 20분동안 전기영동을 실시하였고, 겔 사진을 찍어 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, BM-34A 세포주 검체 2개 모두 양성대조군과 동일한 사이즈 (1.0kb)의 PCR 프로덕트를 확인하였다.
3-3. 확립된 세포주에서 HGF 단백질의 발현 확인
상기 실시예 3-1에서 확립된 BM-34A 세포주에서 HGF 단백질의 발현을 ELISA 분석 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 독시사이클린이 포함되지 않은 배양액으로 이틀동안 배양하였다. BM-34A 세포주를 12-웰 플레이트에 1X105 세포 수로 총 부피가 1 ㎖가 되도록 시딩(seeding)하였다. 48시간 후, 약 1 ㎖의 세포 배양액을 수득하여 인간 HGF DuoSet ELISA 키트 (R&D systems, DY294, USA)를 이용하여 분석하였다. 실험은 각 키트에 포함되어 있는 매뉴얼에 따라 수행되었다. 각 계대별로 발현율의 변함이 없는지 확인하기 위해, 세 개의 다른 패시지(passage)의 세포를 이용하여 분석하였다. 그 분석 결과를 도 5에 나타내었으며, 독시사이클린을 제거한 배지에서 약 1x105개의 세포로부터 24시간 동안 발현이 유도된 HGF 단백질의 발현 수준을 하기 표 3에 나타내었다.
표적 단백질 | 발현 수준 |
HGF | 47.72 ng/㎖ |
도 5에 나타난 바와 같이, 독시사이클린이 제거된 배지에서 배양한 BM-34A 세포주에서 HGF가 발현되는 것을 확인하였으며, 상기 표 3과 같이, 본 발명의 BM-34A 세포주에서 약 47.72 ng/㎖의 HGF 단백질이 발현되는 것을 확인하였다.
3-4. 세포의 PDL (Population doubling level) 분석
BM-34A 세포주를 4x105 세포 수로 하여 T75 플라스크에 2 ㎍/㎖의 독시사이클린이 포함된 배지를 이용하여 시딩하였다. 3일 또는 4일 정도 계대 배양하여 세포를 수득하였고 총 세포수를 측정하였다. 같은 수의 세포를 시딩하여 3 내지 4일 간격으로 PDL을 측정하였다. PDL 값은 하기 수학식 1을 이용하여 계산하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이때, 하기 수학식 1에서 X는 초기 PDL, I는 혈관에 시드된 초기 세포 수, Y는 최종 세포수율, 또는 성장기 말의 세포 수를 나타낸다.
도 6에 나타난 바와 같이, 장기 계대 배양시에도 안정된 성장을 보여주고 있음을 확인하였다.
3-5. 세포의 핵형 분석
BM-34A 세포주에 대하여 유전자가 이입된 세포의 염색체 이상 여부를 판단하기 위해 이원생명과학연구원(한국)에 분석 의뢰하여 정해진 프로토콜에 따라 수행되었다. 분석 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, BM-34A 세포주에 대하여 유전자가 이입된 세포의 염색체에서 이상 여부는 관찰되지 않았으며 정상 핵형으로 분석되었다.
<110> SLBIGEN Inc.
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<211> 728
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of HGF
<400> 1
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
20 25 30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
35 40 45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
50 55 60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65 70 75 80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys
85 90 95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
100 105 110
Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys
115 120 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
130 135 140
Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His
145 150 155 160
Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr
165 170 175
Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser
180 185 190
Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu
195 200 205
Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp
210 215 220
His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro
225 230 235 240
His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp
245 250 255
Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr
260 265 270
Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys
275 280 285
Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu
290 295 300
Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile
305 310 315 320
Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu
325 330 335
His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn
340 345 350
Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr
355 360 365
Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp
370 375 380
Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met
385 390 395 400
Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp
405 410 415
Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala
420 425 430
Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His
435 440 445
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys
450 455 460
Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu
465 470 475 480
Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val
485 490 495
Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg
500 505 510
Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp
515 520 525
Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr
530 535 540
Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys
545 550 555 560
Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly
565 570 575
Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp
580 585 590
Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu
595 600 605
Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn
610 615 620
Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu
625 630 635 640
Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu
645 650 655
Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp
660 665 670
Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu
675 680 685
Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly
690 695 700
Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile
705 710 715 720
Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser
725
<210> 2
<211> 2187
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of HGF
<400> 2
atgtgggtga ccaagctgct gcccgccctg ctgctgcagc acgtgctgct gcacctgctc 60
ctgctgccca tcgccatccc ctacgccgag ggccagagaa agagaagaaa caccatccac 120
gagttcaaga agagcgccaa gaccacactg atcaagatcg accccgccct gaagatcaag 180
accaagaagg tgaacaccgc cgaccagtgc gccaacagat gcaccagaaa caagggcctg 240
cccttcacct gcaaggcctt cgtgttcgac aaggccagaa agcagtgcct gtggttcccc 300
ttcaacagca tgagcagcgg cgtgaagaag gagttcggcc acgagttcga cctgtacgag 360
aacaaggact acatcagaaa ctgcatcatc ggcaagggca gaagctacaa gggcaccgtg 420
agcatcacca agagcggcat caagtgccag ccctggagca gcatgatccc ccacgagcac 480
agcttcctgc ccagcagcta cagaggcaag gacctgcagg agaactactg tagaaaccct 540
agaggcgagg agggcggacc ctggtgcttc accagcaacc ccgaggtgag atacgaggtg 600
tgcgacatcc cccagtgcag cgaggtggag tgcatgacct gcaacggcga gagctacaga 660
ggcctgatgg accacaccga gagcggcaag atctgccaga gatgggacca ccagaccccc 720
cacagacaca agttcctgcc cgagagatac cccgacaagg gcttcgacga caattactgc 780
aggaaccctg atggccagcc cagaccctgg tgctacaccc tggaccccca caccagatgg 840
gagtactgcg ccatcaagac ctgcgccgac aacaccatga acgacaccga cgtgcccctg 900
gagacaaccg agtgcatcca gggccagggc gagggctaca gaggcaccgt gaacaccatc 960
tggaacggca tcccctgcca gaggtgggat agccagtacc cccacgagca cgacatgacc 1020
cccgagaact tcaagtgcaa ggacctgaga gagaattact gtaggaatcc cgacggcagc 1080
gagagcccct ggtgcttcac aaccgacccc aacatcagag tgggctactg cagccagatc 1140
cccaactgcg acatgagcca cggccaggac tgctacagag gcaacggcaa gaactacatg 1200
ggcaacctga gccagaccag aagcggcctg acctgcagca tgtgggacaa gaacatggag 1260
gacctgcaca gacacatctt ctgggagccc gacgccagca agctgaacga gaactactgc 1320
agaaatcccg acgacgacgc ccacggccct tggtgctaca ccggcaaccc cctgatcccc 1380
tgggactact gccccatcag cagatgcgag ggcgacacca cacccaccat cgtgaacctg 1440
gaccaccccg tgatctcctg cgccaagacc aagcagctga gagtggtgaa cggcatcccc 1500
accagaacca acatcggctg gatggtgagc ctgagataca gaaacaagca catctgcggc 1560
ggcagcctga tcaaggagag ctgggtgctg accgccagac agtgcttccc cagcagagac 1620
ctgaaggact acgaggcctg gctgggcatc cacgacgtgc acggcagagg cgacgagaag 1680
tgcaagcagg tgctgaacgt gagccagctg gtgtacggcc ccgagggcag cgacctggtg 1740
ctgatgaagc tggccagacc cgccgtgctg gacgacttcg tgagcaccat cgacctgccc 1800
aactacggct gcaccatccc cgagaagacc agctgcagcg tgtacggctg gggctacacc 1860
ggcctgatca actacgacgg cctgctgaga gtggcccacc tgtacatcat gggcaacgag 1920
aagtgcagcc agcaccacag aggcaaggtg accctgaacg agagcgagat ctgcgccggc 1980
gccgagaaga tcggcagcgg cccctgcgag ggcgactacg gcggccctct ggtgtgcgag 2040
cagcacaaga tgagaatggt gctgggcgtg atcgtgcccg gcagaggctg cgccatcccc 2100
aacagacccg gcatcttcgt gagagtggcc tactacgcca agtggattca caagatcatc 2160
ctgacctaca aggtgcccca gagctaa 2187
<210> 3
<211> 376
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of TK
<400> 3
Met Ala Ser Tyr Pro Cys His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala
1 5 10 15
Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg
20 25 30
Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Leu Glu Gln Lys Met Pro Thr
35 40 45
Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr
50 55 60
Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr
65 70 75 80
Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Gln Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr
85 90 95
Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile
100 105 110
Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met
115 120 125
Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Val Gly
130 135 140
Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile
145 150 155 160
Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg
165 170 175
Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala
180 185 190
Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu
195 200 205
Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly
210 215 220
Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly
225 230 235 240
Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Trp
245 250 255
Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala
260 265 270
Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu
275 280 285
Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu
290 295 300
Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg
305 310 315 320
Pro Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys
325 330 335
Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Val Gln Thr His Val
340 345 350
Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe
355 360 365
Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn
370 375
<210> 4
<211> 1131
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of TK
<400> 4
atggccagct acccctgtca ccagcacgcc agcgccttcg accaggccgc tagaagcaga 60
ggccacagca acagaagaac cgccctgaga cccagaagac agcaggaggc cacagaggtg 120
agactggagc agaagatgcc caccctgctg agagtgtaca tcgatggacc ccacggcatg 180
ggcaagacca caacaaccca gctgctggtg gccctgggca gcagagacga catcgtgtac 240
gtgcccgagc ccatgaccta ctggcaggtg ctgggagcca gcgagaccat cgccaacatc 300
tacaccacac agcacagact ggaccagggc gagatcagcg ccggcgacgc tgccgtggtg 360
atgaccagcg cccagatcac aatgggcatg ccctacgccg tgaccgatgc cgtgctggct 420
ccccacgtgg gcggagaggc cggcagcagc cacgcccctc cccctgccct gaccctgatc 480
ttcgacagac accccatcgc cgccctgctg tgctaccccg ccgctagata cctgatgggc 540
agcatgacac cccaggccgt gctggccttc gtggccctga tcccccctac cctgcccggc 600
accaacatcg tgctgggcgc cctgcccgag gacagacaca tcgacagact ggctaagaga 660
cagagacccg gcgagagact ggacctggcc atgctggccg ccatcagaag agtgtacggc 720
ctgctggcca acaccgtgag atacctgcag ggaggcggca gctggtggga ggactggggc 780
cagctgagcg gcaccgccgt gcctccccag ggcgccgagc cccagagcaa cgccggccct 840
agaccccaca tcggcgacac cctgttcacc ctgtttagag cccccgagct gctggccccc 900
aacggcgacc tgtacaacgt gttcgcctgg gccctggacg tgctggccaa gagactgaga 960
cccatgcacg tgttcatcct ggactacgac cagagccccg ccggctgcag agatgccctg 1020
ctgcagctga ccagcggcat ggtgcagacc cacgtgacca cacccggcag catccccacc 1080
atctgcgacc tggccagaac ctttgccaga gagatgggcg aggccaactg a 1131
<210> 5
<211> 454
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of c-Myc
<400> 5
Met Asp Phe Phe Arg Val Val Glu Asn Gln Gln Pro Pro Ala Thr Met
1 5 10 15
Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp
20 25 30
Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr Gln
35 40 45
Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp Ile
50 55 60
Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser Arg
65 70 75 80
Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr Pro Phe Ser
85 90 95
Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala Asp
100 105 110
Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn Gln
115 120 125
Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile Ile
130 135 140
Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu Val
145 150 155 160
Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly Ser
165 170 175
Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu Tyr
180 185 190
Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser Val
195 200 205
Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys Ala
210 215 220
Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu Ser
225 230 235 240
Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu His
245 250 255
Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Glu
260 265 270
Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala Pro
275 280 285
Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser Lys
290 295 300
Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr His
305 310 315 320
Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro Ala
325 330 335
Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile Ser
340 345 350
Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu Asn
355 360 365
Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu
370 375 380
Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu
385 390 395 400
Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr Ala
405 410 415
Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
420 425 430
Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln
435 440 445
Leu Arg Asn Ser Cys Ala
450
<210> 6
<211> 1365
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of c-Myc
<400> 6
atggatttct ttcgcgtcgt cgagaaccag cagccacccg ccactatgcc tctgaacgtg 60
tcttttacta acaggaacta tgatctggat tacgacagcg tgcagcccta cttctattgc 120
gatgaggaag agaactttta tcagcagcag cagcagagcg agctgcagcc acctgcacct 180
tccgaagaca tttggaagaa attcgagctg ctgcctacac cacccctgtc tccaagtcgg 240
agaagcggcc tgtgttcacc cagctacgtg gccgtcactc ctttcagcct gaggggggac 300
aatgatggcg ggggaggctc cttttctaca gccgatcagc tggaaatggt gactgagctg 360
ctggggggag acatggtcaa ccagagcttc atttgcgatc ctgacgatga aacttttatc 420
aagaacatca tcatccagga ctgtatgtgg tcaggcttta gcgccgctgc aaagctggtg 480
tctgagaaac tggcaagtta tcaggccgct cggaaagata gtgggtcacc taacccagct 540
agaggacact ccgtgtgctc tacaagctcc ctgtacctgc aggacctgag cgcagccgct 600
tccgagtgta ttgatccctc cgtggtcttc ccctatcctc tgaatgactc tagttcaccc 660
aagagttgcg catcacagga cagctccgcc ttttcacctt ctagtgatag cctgctgtca 720
agcactgaat cctctccaca gggcagccca gagccactgg tgctgcatga agagacccct 780
ccaaccacaa gttcagattc cgaagaggaa caggaggacg aggaagagat cgatgtggtc 840
tctgtggaaa agcgccaggc tccaggaaaa cgaagcgagt ccggctctcc aagtgcagga 900
ggacactcca agccacctca ttctcccctg gtgctgaaaa ggtgccacgt ctccacccac 960
cagcataact acgcagcccc accctctaca cgaaaggact atccagctgc aaagcgcgtg 1020
aaactggata gcgtgagagt cctgaggcag atcagtaaca atcggaagtg tacttcaccc 1080
agaagctccg acaccgaaga gaacgtgaaa aggcgcaccc ataatgtcct ggaacgccag 1140
cgacggaatg agctgaagag gtccttcttt gccctgcgcg atcagattcc tgaactggag 1200
aacaatgaga aggctccaaa agtggtcatt ctgaagaaag ccacagctta catcctgtct 1260
gtgcaggccg aagagcagaa actgatcagt gaagaggacc tgctgagaaa acgcagggaa 1320
cagctgaaac ataaactgga acagctgaga aactcttgtg cttaa 1365
<210> 7
<211> 1132
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of hTERT
<400> 7
Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser
1 5 10 15
His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly
20 25 30
Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg
35 40 45
Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro
50 55 60
Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu
65 70 75 80
Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val
85 90 95
Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro
100 105 110
Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr
115 120 125
Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val
130 135 140
Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val
145 150 155 160
Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr
165 170 175
Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly
180 185 190
Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg
195 200 205
Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg
210 215 220
Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg
225 230 235 240
Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp
245 250 255
Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val
260 265 270
Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala
275 280 285
Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His
290 295 300
Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro
305 310 315 320
Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly
325 330 335
Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro
340 345 350
Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser
355 360 365
Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His
385 390 395 400
Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg
405 410 415
Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln
420 425 430
Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu
435 440 445
Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe
450 455 460
Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser
465 470 475 480
Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser
485 490 495
Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met
500 505 510
Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys
515 520 525
Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe
530 535 540
Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe
545 550 555 560
Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr
565 570 575
Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His
580 585 590
Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln
595 600 605
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile
610 615 620
Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val
625 630 635 640
Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser
645 650 655
Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg
660 665 670
Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg
675 680 685
Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro
690 695 700
Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile
705 710 715 720
Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln
725 730 735
Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His
740 745 750
Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp
755 760 765
Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser
770 775 780
Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu
785 790 795 800
Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His
805 810 815
Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro
820 825 830
Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp
835 840 845
Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu
850 855 860
Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala
865 870 875 880
Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys
885 890 895
Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu
900 905 910
Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe
915 920 925
Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser
930 935 940
Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe
945 950 955 960
Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly
965 970 975
Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn
980 985 990
Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln
995 1000 1005
Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln
1010 1015 1020
Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala
1025 1030 1035 1040
Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu
1045 1050 1055
Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp
1060 1065 1070
Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr
1075 1080 1085
Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu Ser
1090 1095 1100
Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn
1105 1110 1115 1120
Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp
1125 1130
<210> 8
<211> 3399
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of hTERT
<400> 8
atgcccagag ctcccagatg cagagccgtg agaagcctgc tgagaagcca ctacagagag 60
gtgctgcccc tggccacctt cgtgagaaga ctgggacccc agggctggag actggtgcag 120
agaggcgacc ccgcagcctt tagagccctg gtggcccagt gcctggtgtg cgtgccctgg 180
gacgccagac ctcctcccgc tgcccccagc ttcagacagg tgagctgcct gaaggagctg 240
gtggccagag tgctccagag actgtgcgag agaggcgcca agaacgtgct ggcctttggc 300
ttcgccctgc tggatggagc cagaggcgga cctcccgagg ccttcaccac aagcgtgaga 360
agctacctgc ccaacaccgt gaccgatgcc ctgagaggct ccggcgcctg gggcctgctc 420
ctgagaagag tgggcgacga cgtgctggtg cacctgctgg ccagatgcgc cctgttcgtg 480
ctggtggctc ccagctgcgc ctaccaggtg tgcggacccc ctctgtacca gctgggagcc 540
gccacccagg caagaccccc tccccacgcc tctggaccca gaagaagact gggctgcgag 600
agagcctgga accacagcgt gagagaggct ggcgtgcccc tgggcctgcc cgcccctggc 660
gccagaagaa gaggcggcag cgccagcaga agcctgcccc tgcccaagag acccagacgc 720
ggcgccgctc ccgagcctga gagaacaccc gtgggccagg gcagctgggc ccaccccggc 780
agaaccagag gacccagcga cagaggcttc tgcgtggtga gccctgccag acccgccgag 840
gaggccacca gcctggaggg cgccctgagc ggcaccagac acagccaccc cagcgtgggc 900
agacagcacc acgccggccc tcctagcacc agcagacccc ccagaccttg ggacaccccc 960
tgcccccctg tgtacgccga gaccaagcac ttcctgtaca gcagcggcga caaggagcag 1020
ctgagaccca gcttcctgct gagctccctg agacccagcc tgaccggcgc cagaagactg 1080
gtggagacca tcttcctggg cagcagaccc tggatgcccg gcacccccag aagactgccc 1140
agactgcccc agagatactg gcagatgaga cccctgttcc tggagctgct gggcaaccac 1200
gcccagtgcc cctacggcgt gctgctgaag acccactgcc ccctgagagc tgccgtgacc 1260
cccgcagctg gcgtgtgcgc cagagagaag ccccagggca gcgtggccgc tcccgaggag 1320
gaggacaccg atcccagaag actggtgcag ctgctgagac agcacagcag cccctggcag 1380
gtgtacggct tcgtgagagc ctgcctgaga agactggtgc ctcccggcct gtggggcagc 1440
agacacaacg agagaagatt cctgagaaac accaagaagt tcatcagcct gggcaagcac 1500
gccaagctga gcctccagga gctgacatgg aagatgagcg tgagagactg cgcctggctg 1560
aggagaagcc ctggcgtggg ctgcgtgccc gccgccgagc acagactgag agaggagatc 1620
ctggccaagt ttctgcactg gctgatgagc gtgtacgtgg tggagctgct gagaagcttc 1680
ttctacgtga ccgagaccac attccagaag aacagactgt tcttttacag gaagagcgtg 1740
tggagcaagc tccagagcat cggcatcaga cagcacctga agagagtgca gctgagagag 1800
ctgagcgagg ccgaggtgag acagcacaga gaggccagac ccgccctgct gaccagcaga 1860
ctgagattca tccccaagcc cgatggcctg agacccatcg tgaacatgga ctacgtggtg 1920
ggagccagaa cctttagaag agagaagaga gccgagagac tgaccagcag agtgaaggcc 1980
ctgttcagcg tgctgaacta cgagagagcc agaagacccg gcctgctggg cgccagcgtg 2040
ctgggcctgg acgacatcca cagagcctgg agaaccttcg tgctgagagt gagagcccag 2100
gaccctcctc ccgagctgta cttcgtgaag gtggacgtga ccggcgccta cgacaccatc 2160
ccccaggaca gactgaccga ggtgatcgcc agcatcatca agccccagaa cacctactgc 2220
gtgagaagat acgccgtggt gcagaaggcc gcccacggcc acgtgagaaa ggccttcaag 2280
agccacgtga gcaccctgac cgacctccag ccctacatga gacagttcgt ggcccacctc 2340
caggagacca gccccctgag agatgccgtg gtgatcgagc agagctcttc cctgaacgag 2400
gcctccagcg gcctgttcga cgtgttcctg agattcatgt gccaccacgc cgtgagaatc 2460
agaggcaaga gctacgtgca gtgccagggc atcccccagg gcagcatcct gagcaccctg 2520
ctgtgcagcc tgtgctacgg cgacatggag aacaagctgt tcgctggcat cagaagagac 2580
ggcctgctgc tgagactggt ggacgacttc ctgctggtga ccccccacct gacccacgcc 2640
aagaccttcc tgagaaccct ggtgagaggc gtgcccgagt acggctgcgt ggtgaacctg 2700
agaaagaccg tggtgaactt tcccgtggag gacgaggccc tgggcggcac cgccttcgtg 2760
cagatgcccg cccacggcct gtttccctgg tgcggcctgc tcctcgacac cagaaccctg 2820
gaggtgcaga gcgactacag cagctacgca agaaccagca tcagagccag cctgaccttc 2880
aacagaggct tcaaggccgg cagaaacatg agaagaaagc tgttcggcgt gctgagactg 2940
aagtgccaca gcctgttcct ggacctccag gtgaacagcc tccagaccgt gtgcaccaac 3000
atctacaaga tcctgctgct ccaggcctac agattccacg cctgcgtgct ccagctgccc 3060
ttccaccagc aggtgtggaa gaatcccacc ttcttcctga gagtgatcag cgacaccgcc 3120
agcctgtgct acagcatcct gaaggccaag aatgccggca tgagcctggg cgccaagggc 3180
gccgctggac ccctgcccag cgaggccgtg cagtggctgt gccaccaggc cttcctgctg 3240
aagctgacca gacacagagt gacctacgtg cccctgctgg gcagcctgag aaccgcccag 3300
acccagctga gcagaaagct gcctggcaca accctgaccg ccctggaggc agccgcaaac 3360
cccgccctgc ccagcgactt caagaccatc ctggactag 3399
<210> 9
<211> 248
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of tTA
<400> 9
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
1 5 10 15
Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
20 25 30
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
35 40 45
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
50 55 60
Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65 70 75 80
Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly
85 90 95
Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
100 105 110
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
115 120 125
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145 150 155 160
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
165 170 175
Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
180 185 190
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Gly Pro
195 200 205
Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala
210 215 220
Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp
225 230 235 240
Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Gly
245
<210> 10
<211> 747
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of tTA
<400> 10
atgtcaaggc tggataaaag caaagtgatt aactccgctc tggaactgct gaacgaagtc 60
ggcattgagg ggctgaccac acgcaagctg gcacagaagc tgggagtgga gcagcccacc 120
ctgtactggc acgtgaagaa caagcgcgcc ctgctggacg ccctggccat cgagatgctg 180
gatcggcacc acacacactt ctgccctctg gagggcgaga gctggcagga cttcctgcgg 240
aacaatgcca agagctttag atgtgccctg ctgtcccaca gggatggagc aaaggtgcac 300
ctgggcacca gaccaacaga gaagcagtac gagaccctgg agaaccagct ggccttcctg 360
tgccagcagg gcttttctct ggagaatgcc ctgtatgccc tgagcgccgt gggacacttc 420
accctgggat gcgtgctgga ggaccaggag caccaggtgg ccaaggagga gagagagaca 480
cctaccacag actccatgcc ccctctgctg aggcaggcca tcgagctgtt tgatcaccag 540
ggcgccgagc cagccttcct gtttggcctg gagctgatca tctgcggcct ggagaagcag 600
ctgaagtgtg agtctggagg accagcagat gccctggacg atttcgacct ggatatgctg 660
cccgccgacg ccctggacga ttttgatctg gacatgctgc ctgctgatgc cctggatgat 720
tttgacctgg atatgctgcc tggataa 747
<210> 11
<211> 199
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of PuroR
<400> 11
Met Thr Glu Tyr Lys Pro Thr Val Arg Leu Ala Thr Arg Asp Asp Val
1 5 10 15
Pro Arg Ala Val Arg Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ala Asp Tyr Pro Ala
20 25 30
Thr Arg His Thr Val Asp Pro Asp Arg His Ile Glu Arg Val Thr Glu
35 40 45
Leu Gln Glu Leu Phe Leu Thr Arg Val Gly Leu Asp Ile Gly Lys Val
50 55 60
Trp Val Ala Asp Asp Gly Ala Ala Val Ala Val Trp Thr Thr Pro Glu
65 70 75 80
Ser Val Glu Ala Gly Ala Val Phe Ala Glu Ile Gly Pro Arg Met Ala
85 90 95
Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu Ala Ala Gln Gln Gln Met Glu Gly Leu
100 105 110
Leu Ala Pro His Arg Pro Lys Glu Pro Ala Trp Phe Leu Ala Thr Val
115 120 125
Gly Val Ser Pro Asp His Gln Gly Lys Gly Leu Gly Ser Ala Val Val
130 135 140
Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala Phe Leu
145 150 155 160
Glu Thr Ser Ala Pro Arg Asn Leu Pro Phe Tyr Glu Arg Leu Gly Phe
165 170 175
Thr Val Thr Ala Asp Val Glu Val Pro Glu Gly Pro Arg Thr Trp Cys
180 185 190
Met Thr Arg Lys Pro Gly Ala
195
<210> 12
<211> 600
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of PuroR
<400> 12
atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta 60
cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac 120
cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac 180
atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag 240
agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt 300
tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag 360
cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc 420
agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg 480
gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc 540
gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga 600
600
<210> 13
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of ZeoR
<400> 13
Met Ala Lys Leu Thr Ser Ala Val Pro Val Leu Thr Ala Arg Asp Val
1 5 10 15
Ala Gly Ala Val Glu Phe Trp Thr Asp Arg Leu Gly Phe Ser Arg Asp
20 25 30
Phe Val Glu Asp Asp Phe Ala Gly Val Val Arg Asp Asp Val Thr Leu
35 40 45
Phe Ile Ser Ala Val Gln Asp Gln Val Val Pro Asp Asn Thr Leu Ala
50 55 60
Trp Val Trp Val Arg Gly Leu Asp Glu Leu Tyr Ala Glu Trp Ser Glu
65 70 75 80
Val Val Ser Thr Asn Phe Arg Asp Ala Ser Gly Pro Ala Met Thr Glu
85 90 95
Ile Gly Glu Gln Pro Trp Gly Arg Glu Phe Ala Leu Arg Asp Pro Ala
100 105 110
Gly Asn Cys Val His Phe Val Ala Glu Glu Gln Asp
115 120
<210> 14
<211> 375
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of ZeoR
<400> 14
atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgatgtggc cggagcggtc 60
gagttctgga ccgaccggct cgggttcagc cgggacttcg tggaggacga cttcgccggt 120
gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt ggtgccggac 180
aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag 240
gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag 300
ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc 360
gaggagcagg actaa 375
<210> 15
<211> 345
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of HygroR
<400> 15
Met Lys Lys Pro Glu Leu Thr Ala Thr Ser Val Glu Lys Phe Leu Ile
1 5 10 15
Glu Lys Phe Asp Ser Val Ser Asp Leu Met Gln Leu Ser Glu Gly Glu
20 25 30
Glu Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Gly Gly Arg Gly Tyr Val Leu
35 40 45
Arg Val Asn Ser Cys Ala Asp Gly Phe Tyr Lys Asp Arg Tyr Val Tyr
50 55 60
Arg His Phe Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ile Pro Glu Val Leu Asp Ile
65 70 75 80
Gly Glu Phe Ser Glu Ser Leu Thr Tyr Cys Ile Ser Arg Arg Ala Gln
85 90 95
Gly Val Thr Leu Gln Asp Leu Pro Glu Thr Glu Leu Pro Ala Val Leu
100 105 110
Gln Pro Val Ala Glu Ala Met Asp Ala Ile Ala Ala Ala Asp Leu Ser
115 120 125
Gln Thr Ser Gly Phe Gly Pro Phe Gly Pro Gln Gly Ile Gly Gln Tyr
130 135 140
Thr Thr Trp Arg Asp Phe Ile Cys Ala Ile Ala Asp Pro His Val Tyr
145 150 155 160
His Trp Gln Thr Val Met Asp Asp Thr Val Ser Ala Ser Val Ala Gln
165 170 175
Ala Leu Asp Glu Leu Met Leu Trp Ala Glu Asp Cys Pro Glu Val Arg
180 185 190
His Leu Val His Ala Asp Phe Gly Ser Asn Asn Val Leu Thr Asp Asn
195 200 205
Gly Arg Ile Thr Ala Val Ile Asp Trp Ser Glu Ala Met Phe Gly Asp
210 215 220
Ser Gln Tyr Glu Val Ala Asn Ile Phe Phe Trp Arg Pro Trp Leu Ala
225 230 235 240
Cys Met Glu Gln Gln Thr Arg Tyr Phe Glu Arg Arg His Pro Glu Leu
245 250 255
Ala Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile Gly Leu Asp
260 265 270
Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Val Asp Gly Asn Phe Asp Asp Ala Ala Trp
275 280 285
Ala Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Val
290 295 300
Gly Arg Thr Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val Trp Thr Asp Gly
305 310 315 320
Cys Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg
325 330 335
Pro Arg Ala Lys Glu Val Gly Arg Val
340 345
<210> 16
<211> 1038
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of HygroR
<400> 16
atgaagaagc ccgaactcac cgctaccagc gttgaaaaat ttctcatcga gaagttcgac 60
agtgtgagcg acctgatgca gttgtcggag ggcgaagaga gccgagcctt cagcttcgat 120
gtcggcggac gcggctatgt actgcgggtg aatagctgcg ctgatggctt ctacaaagac 180
cgctacgtgt accgccactt cgccagcgct gcactaccca tccccgaagt gttggacatc 240
ggcgagttca gcgagagcct gacatactgc atcagtagac gcgcccaagg cgttactctc 300
caagacctcc ccgaaacaga gctgcctgct gtgttacagc ctgtcgccga agctatggat 360
gctattgccg ccgccgacct cagtcaaacc agcggcttcg gcccattcgg gccccaaggc 420
atcggccagt acacaacctg gcgggatttc atttgcgcca ttgctgatcc ccatgtctac 480
cactggcaga ccgtgatgga cgacaccgtg tccgccagcg tagctcaagc cctggacgaa 540
ctgatgctgt gggccgaaga ctgtcccgag gtgcgccacc tcgtccatgc cgacttcggc 600
agcaacaacg tcctgaccga caacggccgc atcaccgccg taatcgactg gtccgaagct 660
atgttcgggg acagtcagta cgaggtggcc aacatcttct tctggcggcc ctggctggct 720
tgcatggagc agcagactcg ctacttcgag cgccggcatc ccgagctggc cggcagccct 780
cgtctgcgag cctacatgct gcgcatcggc ctggatcagc tctaccagag cctcgtggac 840
ggcaacttcg acgatgctgc ctgggctcaa ggccgctgcg atgccatcgt ccgcagcggg 900
gccggcaccg tcggtcgcac acaaatcgct cgccggagcg cagccgtatg gaccgacggc 960
tgcgtcgagg tgctggccga cagcggcaac cgccggccca gtacacgacc gcgcgctaag 1020
gaggtaggtc gagtttaa 1038
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM163 Forward primer
<400> 17
tacatcatgg gcaacgagaa 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM151 Reverse primer
<400> 18
tcgtcctgca gttcattcag 20
Claims (11)
- 간세포성장인자(hapatocyte growth factor, HGF) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터.
- 제1항에 있어서,
상기 HGF 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인, 재조합 렌티바이러스 벡터.
- 제1항에 있어서,
상기 벡터가 프로모터를 포함하는 것인, 재조합 렌티바이러스 벡터.
- 제3항에 있어서,
상기 프로모터가 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡기세포융합바이러스(RSV), 인간 성장인자-1 알파(human elongation factor-1 alpha, EF-1α) 또는 TRE(tetracycline response elements) 프로모터인, 재조합 렌티바이러스 벡터.
- HGF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스.
- 제5항에 있어서,
상기 렌티바이러스는 제1항의 렌티바이러스 벡터, 패키징 플라스미드 및 엔벨로프 플라스미드로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 및
형질전환된 숙주세포로부터 렌티바이러스를 분리하는 단계를 통하여 수득되는 것인, 재조합 렌티바이러스.
- 제5항의 재조합 렌티바이러스로 형질감염된 숙주세포.
- 제7항에 있어서,
상기 숙주세포는 중간엽줄기세포인, 형질감염된 숙주세포.
- 제5항의 재조합 렌티바이러스를 유효성분으로 포함하는 혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 혈관계 질환이 협심증, 심근경색, 동맥경화증, 죽상동맥경화증, 결절성 동맥주위염, 고안동맥염, 혈관폐색, 뇌졸중, 뇌출혈, 뇌색전, 뇌부종 및 허혈성 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.
- 제7항의 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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