KR20170087472A - 아밀로이드 β의 22번 위치 및 23번 위치의 턴 구조를 극히 특이적으로 인식하는 항체 - Google Patents

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가즈마 무라카미
다카히코 시미즈
나오타카 이즈오
쓰토무 세이토
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고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
고쿠리츠 다이가쿠 호우징 지바 다이가쿠
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Abstract

본 발명은 Aβ의 특정한 턴(turn) 구조를 가지는 Aβ(Aβ의 독성 콘포머((toxic conformer))만을 표적으로 하는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 제공한다. 또한, 본 발명은, Aβ의 독성 콘포머를 특이적으로 인식하는 항체를 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물, 또는 Aβ의 독성 콘포머의 측정 키트 또는 알츠하이머병의 진단약 등에 관한 것이다.

Description

아밀로이드 β의 22번 위치 및 23번 위치의 턴 구조를 극히 특이적으로 인식하는 항체{ANTIBODY HIGHLY SPECIFICALLY RECOGNIZING TURN STRUCTURE AT 22- AND 23-POSITIONS IN AMYLOID β}
본 출원은, 2014년 12월 12일에 일본에서 출원된 특원 2014-251898호, 및 2015년 5월 22일에 일본에서 출원된 특원 2015-104411호에 기초한 우선권을 주장하는 것이며, 상기 출원에 기재된 내용은 모두, 참조에 의해 그대로 본 명세서에 원용된다. 또한, 본원에 있어서 인용한 모든 특허, 특허 출원 및 문헌에 기재된 내용은 모두, 참조에 의해 그대로 본 명세서에 원용된다.
본 발명은, 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에 턴(turn) 구조를 가지는 아밀로이드 β를 극히 특이적으로 인식하는 항체, 상기 항체를 이용한 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에 턴 구조를 가지는 아밀로이드 β의 측정 방법, 및 알츠하이머병의 진단 방법 및 치료 방법에 관한 것이다.
알츠하이머병(이하, 「AD」라고 함)은, 일반적으로 노인반(老人斑)에서의 아밀로이드의 축적에 의해 특징지워진다. 아밀로이드는, 아밀로이드 β단백질(이하, 「Aβ」라고 함), 특히, 40 및 42 잔기의 아미노산으로 이루어지는 Aβ(이하, 각각, 「Aβ40」 및 「Aβ42」라고 함)로 구성된다. 이들 단백질은, 아밀로이드 전구체(前驅體) 단백질(APP)로부터, β- 및 γ-세크레타제의 2개의 프로테아제에 의해 분해되어 생성된다. AD의 발증에 있어서, Aβ42는, 그 응집 경향이나 신경 독성으로부터 Aβ40보다 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 여겨지고 있다. 최근의 연구에 의해, 산화 스트레스가 AD와 관련된 신경 변성에 기여하는 것으로 나타나 있다. 라디칼의 형성을 통한 Aβ42의 신경 독성은, 활성 산소종의 생성을 수반하는 10번 위치의 티로신 및 35번 위치의 메티오닌에서의 라디칼화와 밀접하게 관련되어 있다. 한편, Aβ의 올리고머의 집적이 시냅스 독성을 통해 AD를 유도하는 증거가 나타나 있다.
AD 모델 마우스에 Aβ 응집체를 백신으로서 접종하면, 뇌내에서의 Aβ의 침착(沈着)을 감소시켜, 인식 기능 장애를 억제하는 것으로부터, Aβ에 의한 면역 부여는, AD 치료의 유망한 방법으로 여겨지고 있다. 이에, Aβ42에 의해 AD 환자를 면역한 임상시험(AN1792)이 행해졌지만, 과잉의 면역 활성화와 같은 심각한 부작용에 의해 중지되어 있다. 그 후, 항Aβ 항체가 AD 치료약으로서 기대되어 현재에 이르기까지 개발이 계속되고 있다.
본 발명자들은, 지금까지 계통적 프롤린 치환법과 함께 고체 NMR법을 사용한 연구에 의해, Aβ42의 22번 위치 및 23번 위치에 턴 구조를 가지는 독성 콘포머(toxic conformer)와, Aβ42의 25번 위치 및 26번 위치에 턴 구조를 가지는 생리적 콘포머가 구별되는 것, 및 전자의 콘포머는, 강력한 응집능와 신경 독성을 나타내는 것을 보고하여 왔다(비특허 문헌 1, 특허 문헌 1).
또한, 본 발명자들은, Aβ의 22번 위치의 글루타민산을 프롤린으로 치환하여 상기 부위에서의 턴 구조를 고정한 펩티드를 항원으로서 사용함으로써, Aβ42의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에 턴 구조를 가지는 독성 콘포머를 특이적으로 인식하는 항체를 제작할 수 있는 것을 보고하고 있다(특허 문헌 2).
일본공개특허 제2006-265189호 국제 공개 WO2011/045945호
K. Murakami 등(2005) J. Am. Chem. Soc., 127: 15168-15174
본 발명자들은, 지금까지, Aβ가 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에 있어서 턴 구조를 취함으로써 아밀로이드의 응집이 촉진되어, AD 발증으로 이어지는 것은 아닐까 생각하여, 이미 보고한 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에 턴 구조를 가지는 Aβ(이하, 「22, 23-턴 Aβ」라고 함)를 특이적으로 인식하는 항체로서, IBL-101 항체(기탁 기관: 독립 행정법인 산업 기술 종합 연구소, 특허 생물 기탁 센터(일본 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1-1-1 츠쿠바 센터 중앙 제6); 수탁일: 2009년 10월 14일; 수탁 번호: FERM BP-11290)를 사용하여 AD의 진단 및 치료로의 응용에 대하여 검토해 왔다. 특히, IBL-101 항체는, 중합한 야생형 Aβ로의 결합력 도 강하고, 또한, 턴 구조를 가지지 않는 Aβ에 대한 결합력이 약한 특이성이 있으므로, AD의 진단 및 치료로의 응용이 기대되고 있었다. 그러나, IBL-101 항체에 대하여 검토를 진행한 결과, AD 모델 마우스를 사용한 치료 실험에 있어서, 일정한 효과는 시사되었지만, 치료약으로서의 실용화 가능한 정도에 도달하지 않을 것으로 여겨졌다. 이에, 본 발명자들은, IBL-101 항체에서의 이와 같은 문제의 원인에 대하여 더욱 해석을 행하였다.
그 결과, 본 발명자들은, IBL-101 항체는 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 가지는 Aβ 및 야생형 Aβ의 올리고머를 비교적 높게 인식하지만, 22번 위치 및 23번 위치에 턴 구조를 취하지 않는 다른 Aβ에도 약간 결합할 수 있는 점에 주목했다. 또한, 본 발명자들은, IBL-101 항체 이외의 22, 23-턴 Aβ에 특이적인 다양한 항체에 대하여 검토한 결과, IBL-101 항체와 비교하여, 특이성에 있어서 우수한 항체가 AD 모델 마우스를 사용한 치료 실험에 있어서 우수한 인지 기능 개선 효과 등을 가지는 것을 발견하였다. 특히, 이와 같은 항체는, 단회 투여에서도 AD 발증 후의 마우스의 기억 능력을 개선하는 지금까지의 항체에 관찰되지 않은 우수한 효과를 나타낸다. 또한, 본 항체를 사용하여, AD 환자와 정상인의 뇌척수액(CSF)에서의 Aβ량을 측정한 결과, AD 환자에 있어서, 본 항체에 결합하는 Aβ량이 많은 것이 확인되었다. 더욱, 해석을 진행한 결과, AD 환자에 있어서, 총Aβ량에 대한 본 항체에 결합하는 Aβ량의 비가 큰 것이 확인되었다. 이에, 본 발명의 항체의 결합 특성에 대하여 더욱 상세한 검토를 행한 결과, 복수의 턴 구조나 직선형 구조 등의 다양한 구조를 가지는 Aβ 중에서, 특히 22, 23-턴 Aβ에 대한 특이성이 극히 높고, 다른 구조를 가지는 Aβ로의 결합이 거의 관찰되지 않는 것이 확인되었다. 또한, AD에 있어서 가장 독성을 발휘하는 것으로 여겨지고 있는 Aβ 올리고머로의 본 항체의 결합 특성을 해석한 결과, 22, 23-턴 Aβ 모노머로의 결합보다 더욱 강하게 22, 23-턴 Aβ의 올리고머와 결합하는 것이 발견되었다. 이러한 결과로부터, 본 발명자들은 AD의 진단 및 치료에는, 22, 23-턴 Aβ 모노머와 매우 특이적으로 결합하고(즉, 다른 구조의 Aβ와는 거의 결합하지 않고), 바람직하게는, 또한 22, 23-턴 Aβ의 올리고머에 강하게 결합하는 항체를 이용하는 것이 중요한 것을 발견하였다. 환언하면, 본 발명자들은, 22, 23-턴 Aβ를 극히 특이적으로 인식하는 항체, 또는 22, 23-턴 Aβ를 극히 특이적으로 인식하고, 또한 22, 23-턴 Aβ의 올리고머에 강하게 결합하는 항체를 사용함으로써, AD의 치료 및 진단이 가능한 것을 발견하였다.
지금까지의 Aβ를 표적으로 한 면역 요법, 특히 Aβ 백신(AN1792)이나, 항Aβ 모노머 항체에서의 부작용이나 효과가 낮은 이유의 하나로서, 생리적인 (독성이 없는) Aβ42로의 결합이 고려되고 있다. 실제로, Aβ 모노머에는 항염증 작용 등의 이점도 존재하는 것이 알려져 있고(Sci Transl Med. 2012 August 1; 4(145): 145 ra105.), 생리적으로 중요한 역할도 담당할 수 있는 것이 알려져 있었다. 항Aβ 모노머 항체의 부작용이 높은 것에 더하여, Aβ는 올리고머로 됨으로써 독성을 발휘하지만, 또한 응집하여 피브릴로 되면 독성을 가지지 않는 것으로 알려져 있으므로, 현재의 Aβ를 표적으로 한 항체 의약품 개발은, 생리적 Aβ와 구별하여 독성이 있는 Aβ만을 표적화하기 위한 전략으로서, Aβ 모노머나 피브릴과 결합하지 않고, Aβ 올리고머에만 결합하는 항체를 이용하고 있다(Aducanumab, Crenezumab, BAN2401). 즉, 종래의 발상은, Aβ 모노머를 구조로 구별하지 않고, 그 중합화의 정도에 의해 독성의 유무의 근거로 하고 있었다. 본 발명자들은, 동일한 Aβ 모노머라도, 그 구조 중에 독성을 발휘할 수 있는 구조가 존재한다는 가설을 지금까지 보고하여 왔지만, 본 발명에 의해, AD의 치료 효과·진단 효과를 발휘하기 위해서는, 항체가 22, 23-턴 Aβ를 "극히" 특이적으로 인식하는 것이 중요한 것을 처음으로 발견하였다. 즉, 본 발명자들은, 지금까지 구조로 구별하지 않고 이해되어 온 Aβ 모노머가, 실제로는 극히 치밀하게 그 구조에 의해 기능이 제어되고 있고, 22, 23-턴 Aβ는 응집성이 높은(독성이 높은) Aβ인데 비해, 그 외의 구조를 가지는 Aβ는 응집성의 낮은(독성이 낮은, 생리적인) Aβ인 것, 및 22, 23-턴 Aβ를 극히 특이적으로 표적화하는 것이 항Aβ 항체를 AD 치료약·진단약으로서 개발하는 데 있어서 가장 중요하며, 부작용의 문제나 효과가 낮은 문제점을 해결할 수 있는 것을 처음으로 발견하였다. 또한, 본 발명의 항체는, Aβ 올리고머뿐만 아니라, Aβ 모노머도 표적으로 할 수 있으므로, Aβ의 응집이 진행하기 전(Aβ 올리고머 발생 전)의 모노머의 단계로부터 Aβ의 응집을 억제 가능한 점에 있어서, 종래 개발되어 온 항체 의약과 비교하더라도 보다 우수한 의약을 제공할 수 있는 것이다.
따라서, 본 발명은, 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에 턴 구조를 가지는 Aβ를 극히 특이적으로 인식하는 항체 및 그 이용에 관한 것이다. 본 발명은, 특히, 22, 23-턴 Aβ와는 결합하지만, 그 이외의 구조를 가지는 Aβ와는 결합하지 않는, 22, 23-턴 Aβ에 특이적인 항체 및 그 이용에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은, 이하의 발명에 관한 것이다. 그리고, 이하의 (1)∼(31) 또는 본 명세서 전체에 있어서, 「22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에 턴 구조를 가지는 Aβ」의 용어는, 「E22P-Aβ」, 또는 「IBL-102 항체가 결합하는 Aβ」로 치환할 수도 있다.
(1) 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에 턴 구조를 가지는 Aβ를 극히 특이적으로 인식하지만, 다른 구조를 가지는 Aβ는 인식하지 않는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
(2) 또한, Aβ의 올리고머를 인식하는, (1)에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
(3) Aβ의 올리고머가 다이머인, (2)에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
(4) Aβ가 Aβ42인, (1)∼(3) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
(5) Aβ의 다른 구조가, 적어도, 이하의 군으로부터 선택되는 1 종류 이상의 구조를 포함하는, (1)∼(4) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편: Aβ의 21번 위치 및 22번 위치의 아미노산에서의 턴 구조, Aβ의 23번 위치 및 24번 위치의 아미노산에서의 턴 구조, Aβ의 24번 위치 및 25번 위치의 아미노산에서의 턴 구조, Aβ의 25번 위치 및 26번 위치의 아미노산에서의 턴 구조, 및 Aβ의 35번 위치 및 36번 위치의 아미노산에서의 턴 구조.
(6) VH가, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가지고, 또한 VL이 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체가 결합하는 에피토프를 극히 특이적으로 인식하지만, VH가, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가지고, 또한 VL이 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체가 결합하지 않는 에피토프를 인식하지 않는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
(7) VH가, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가지고, 또한 VL이 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체와 그 항원과의 결합을 경합 저해하지만, VH가, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가지고, 또한 VL이 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체가 결합하지 않는 에피토프에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
(8) 중쇄(重鎖) 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3가, 각각, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 및 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
(9) 또한, 경쇄(輕鎖) 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3가, 각각, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 및 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열을 가지는, (8)에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
(10) 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3가, 각각, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 및 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가지는, (1)∼(7) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
(11) 또한, 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3가, 각각, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 및 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열을 가지는, (10)에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
(12) VH가, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
(13) 또한, VL이 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가지는, (12)에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
(14) 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 코딩하는 핵산 분자.
(15) 서열 번호 1의 126번째∼479번째의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산 분자인, (14)에 기재된 핵산 분자.
(16) 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 코딩하는 핵산 분자.
(17) 서열 번호 8의 130번째∼465번째의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산 분자인, (16)에 기재된 핵산 분자.
(18) 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편, 및/또는, 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 발현 가능한 벡터.
(19) (14) 또는 (15)에 기재된 핵산 분자, 및/또는, (16) 또는 (17)에 기재된 핵산 분자를 함유하는, (18)에 기재된 벡터.
(20) (18) 또는 (19)에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포.
(21) (1)∼(13) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 함유하는 의약 조성물.
(22) AD의 예방용, 치료용 또는 개선용인, (21)에 기재된 의약 조성물.
(23) AD 환자의 인지 기능을 개선하기 위한, (21)에 기재된 의약 조성물.
(24) AD 환자의 기억 장애를 개선하기 위한, (21)에 기재된 의약 조성물.
(25) (1)∼(13) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 함유하는 진단용 조성물.
(26) AD의 진단에 사용하기 위한 (25)에 기재된 진단용 조성물.
(27) (1)∼(13) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 함유하는, Aβ의 독성 콘포머를 측정하기 위한 키트.
(28) (1)∼(13) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 함유하는, Aβ의 독성 콘포머의 측정에 사용하기 위한 조성물.
(29) 검체와 (1)∼(13) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 접촉시키는 스텝을 포함하는, 검체 중에서의 Aβ의 독성 콘포머 레벨의 측정 방법.
(30) 이하의 스텝을 포함하는, AD의 진단 방법:
a) 피험자 유래의 시료와, 적어도 1개의 (1)∼(13) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 인비트로(in vitro)로 접촉시키는 스텝,
b) 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편과 결합한 항원의 레벨을 측정하는 스텝, 및
c) 결정된 항원 레벨로부터, 상기 피험자에서의 AD의 유무 또는 정도를 진단하는 스텝.
여기서, (1)∼(13) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 결합하는 항원의 레벨이 정상인 유래의 시료에서의 동일한 레벨과 비교하여 높은 경우에는, AD로 이환(罹患)하고 있을 가능성이 높은 것으로 진단되는, 방법.
(31) 이하의 스텝을 포함하는, AD의 진단 방법:
a) 피험자 유래의 시료와, 적어도 1개의 (1)∼(13) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 접촉시키는 스텝,
b) 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편과 결합한 항원의 레벨을 측정하는 스텝,
c) Aβ의 구조 비특이적인 항Aβ 항체와 피험자 유래의 시료를 접촉시켜, 그 결합물의 양을 측정함으로써, 피험자 유래의 시료에서의 총Aβ량을 측정하는 스텝, 및
d) 피험자 유래의 시료에서의, (1)∼(13) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 결합하는 항원의 레벨과 총Aβ의 레벨의 비를 계산하고, 결정된 비로부터, 상기 피험자에서의 AD의 유무 또는 정도를 판정하는 스텝,
여기서, 총Aβ의 레벨에 대한, (1)∼(13) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 결합하는 항원의 레벨이 정상인 유래의 시료에서의 동일 비와 비교하여 높은 경우에는, AD로 이환하고 있을 가능성이 높은 것으로 판정되는, 방법.
(32) 검체 중의 아밀로이드 β의 독성 콘포머의 존부(存否)를 결정하는 방법으로서,
(a) (1)∼(13) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편과 검체를 접촉시키는 스텝,
(b) 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 결합한 아밀로이드 β의 독성 콘포머를 검출하는 스텝;
(c) 상기 스텝에서 아밀로이드 β의 독성 콘포머가 검출된 경우에는, 검체 중에 아밀로이드 β의 독성 콘포머가 존재하는 것으로 판정하고, 상기 스텝에서 아밀로이드 β의 독성 콘포머가 검출되지 않은 경우에는, 검체 중에 아밀로이드 β의 독성 콘포머가 존재하지 않는 것으로 판정하는 스텝을 포함하는, 방법.
(33) 검체 중의 아밀로이드 β의 독성 콘포머의 레벨을 결정하는 방법으로서,
(a) (1)∼(13) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편과 검체를 접촉시키는 스텝,
(b) 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 결합한 아밀로이드 β의 독성 콘포머량을 측정하는 스텝;
(c) 상기 검출된 독성 콘포머량으로부터, 검체 중의 아밀로이드 β의 독성 콘포머의 레벨을 산출하는 스텝을 포함하는, 방법.
본 발명의 항체는, Aβ의 독성 콘포머와 극히 높은 특이적으로 결합할 수 있으므로, Aβ의 독성 콘포머를 표적으로 한 각종 용도에 있어서 우수한 효과를 발휘할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는, AD의 진단 용도에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는, Aβ의 독성 콘포머의 모노머 및 다이머의 양쪽의 상태와 결합할 수 있으므로, Aβ의 중합체화가 발증 또는 악화에 기여하는 질환, 예를 들면, AD의 치료 또는 예방 용도에 사용할 수 있다.
도 1은 알츠하이머병 환자(AD) 및 정상인(Control) 유래의 뇌척수액 중에서의 IBL-102 항체와 결합하는 Aβ량의 비교를 나타낸 그래프이다. 세로축은 Aβ의 독성 콘포머(IBL-102 항체와 결합하는 Aβ)양(pg/mL)을 나타낸다.
도 2는 래트 프라이머리(primary) 뉴런을 사용하여, Aβ42 유발 신경 독성에 대한 IBL-102 항체의 신경 독성 보호 효과에 대하여 검토한 결과를 나타낸 그래프이다. 좌측의 그래프는 야생형 Aβ42(Wt-Aβ42) 첨가군, 우측의 그래프는 E22P-Aβ42 첨가군의 결과를 나타낸다. 세로축은, 세포 독성 자극 없음 또한 항체 첨가 없음(Veh)군에 대한 생존율(%)의 평균값을 나타내고, 에러 바는 표준오차를 나타낸다. 각각의 그래프에 있어서, 좌측으로부터 순차적으로 세포 독성 자극 없음 또한 항체 첨가 없음(Veh), 세포 자극 있음 또한 항체 첨가 없음(-), 세포 자극 있음 또한 IgG 첨가(IgG), 및 세포 자극 있음 IBL-102 첨가(IBL-102)를 나타낸다. ***는, veh에 대하여 p<0.001을 나타내고, #는, p<0.05를 나타내고, ###은, p<0.001을 나타낸다.
도 3은 AD 모델 마우스의 뇌절편을 사용하여, 82E1, IBL-101, IBL-102의 노인반에 대한 염색성을 면역 조직 화학 염색에 의해 검토한 염색상이다. 사진의 아래의 수치는, 각각 면역 염색에 사용한 항체의 농도를 나타낸다.
도 4는 AD 모델 마우스가 나타내는 신경 증상에 대한 IBL-102 항체의 신경 증상 억제 효과에 대하여 Elevated plus-maze test를 사용하여 검토한 결과이다. 세로축은, closed arm에 체재한 시간의 비율(%)의 평균값을 나타내고, 에러 바는 표준오차를 나타낸다. 그래프는 좌측으로부터 순차적으로, 항체 비투여 야생형 마우스(Wt), IgG 투여 AD 모델 마우스(Tg＋IgG), IBL-101 투여 AD 모델 마우스(Tg＋IBL-101), 및 IBL-102 투여 AD 모델 마우스(Tg＋IBL-102)를 나타낸다. *는, p<0.05를 나타낸다.
도 5는 AD 모델 마우스가 나타내는 신경 증상에 대한 IBL-102 항체의 신경 증상 억제 효과에 대하여 Nesting test를 사용하여 검토한 그래프 나타낸다. 세로축은 스코어의 평균값을 나타내고, 에러 바는 표준오차를 나타낸다. 그래프는 좌측으로부터 순차적으로, 항체 비투여 야생형 마우스(Wt), IgG 투여 AD 모델 마우스(Tg＋IgG), IBL-101 투여 AD 모델 마우스(Tg＋IBL-101), 및 IBL-102 투여 AD 모델 마우스(Tg＋IBL-102)를 나타낸다. *는, p<0.05를 나타낸다.
도 6은 AD 모델 마우스의 뇌내에서의 노인반의 축적에 대한 IBL-102 항체의 억제 효과에 대하여 면역 조직 화학 염색을 사용하여 검토한 염색상 및 노인반의 계수 결과를 나타낸 그래프이다. 그래프의 세로축은, 82E1 항체에 의해 염색된 노인반의 수의 평균값을 나타내고, 에러 바는 표준오차를 나타낸다. 가로축은, 각각 투여한 항체를 나타낸다.
도 7은 AD 모델 마우스의 해마 내에서의 노인반의 축적에 대한 IBL-102 항체의 억제 효과에 대하여 면역 조직 화학 염색을 사용하여 검토한 염색상 및 노인반의 계수 결과를 나타낸 그래프이다. 그래프의 세로축은, 82E1 항체에 의해 염색된 노인반의 수의 평균값을 나타내고, 에러 바는 표준오차를 나타낸다. 가로축은, 각각 투여한 항체를 나타낸다.
도 8은 AD 모델 마우스의 뇌내에서의 Aβ의 축적에 대한 IBL-102 항체의 억제 효과에 대하여 ELISA법을 이용하여 검토한 그래프이다. 세로축은, 위로부터 순차적으로, 뇌내 불용해성 획분 중의 Aβ40 농도, 뇌내 불용해성 획분 중의 Aβ42 농도, 및 뇌내 가용성 획분 중의 Aβ40 농도(모두, pg/mg단백질)의 평균값을 나타내고, 에러 바는 표준오차를 나타낸다. 가로축은, 각각 투여한 항체를 나타낸다.
도 9는 IBL-102 항체의 염기 서열(중쇄는 서열 번호 1, 경쇄는 서열 번호 8)이다.
도 10은 IBL-102 항체의 아미노산 서열이다. 중쇄(HC)는 서열 번호 2, 경쇄(LC)는 서열 번호 9에 기재되어 있다. 사선은 시그널 배열을 나타내고, 밑줄은 CDR을 나타내고, 테두리 내는 가변 영역을 나타낸다.
도 11은 Aβ 중합체로의 결합능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 세로축은 492 nm에서의 흡광도를 나타내고, 가로축은 피검 항체의 농도(ng/mL)를 나타낸다. 그래프는 위로부터 순차적으로, 피검 항체로서, IBL-101, IBL-102, 4G8을 사용한 결과를 나타낸다.
도 12는 IBL-102 단회 투여의 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 13은 IBL-102 단회 투여 시험의 결과를 나타낸 그래프이다. A는 대조군 및 Tg2576 마우스에 PBS 또는 IBL-102를 투여했을 때의, 각 군의 Re-exploring score를 나타낸다. B는, Tg2576 마우스의 각각의 개체마다에 있어서의, PBS 투여시와 IBL-102 항체 투여시의 Re-exploring score의 비교이다. 세로축은 재탐색 스코어(Re-exploring score)를 나타낸다.
도 14는 알츠하이머병 환자(AD 환자군) 및 비AD 대조군(비AD 대조군) 유래의 뇌척수액 중에서의, 총Aβ42(우측 도면), 및 총Aβ42에 대한 IBL-102 항체와 결합하는 Aβ의 비(좌측 도면)를 나타낸 그래프이다. 세로축은, 각각, Aβ42(ng/mL)(우측 도면), 및 Aβ의 독성 콘포머(IBL-102 항체와 결합하는 Aβ)/총Aβ의 비(좌측 도면)를 나타낸다.
도 15는 IBL-102 항체와 IBL-101 항체의 각 항원으로의 결합능을 엔자임이뮤노어세이에 의해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 상단의 그래프는 항체로서 IBL-101을 사용한 결과를 나타내고, 하단은 항체로서 IBL-102를 사용한 결과를 나타낸다. 양 그래프에 있어서 가로축은 사용한 항원을 나타내고, 좌측으로부터, 야생형 Aβ40, 야생형 Aβ42, E22P-Aβ42, E22V-Aβ42, G33P-Aβ42, L34P-Aβ42, V36P-Aβ42, G37P-Aβ42, G38P-Aβ42, V39P-Aβ42, V40P-Aβ42, I41P-Aβ42를 나타낸다. 세로축은 492 nm에서의 흡광도를 나타낸다. 각 항원에 대하여 나타난 4개의 막대 그래프는, 좌측으로부터 순차적으로 항체량으로서 15 ng/mL, 30 ng/mL, 60 ng/mL, 및 120 ng/mL를 사용한 결과를 나타낸다.
도 16은 단회 투여 시험의 스케줄 및 결과를 나타낸다. 세로축은, (신기(新奇) 물체 B로의 접촉 횟수)/((기지(旣知) 물체 A로의 접촉 횟수)＋(신기 물체 B로의 접촉 횟수))(Novel), 또는 (기지 물체 A로의 접촉 횟수)/((기지 물체 A로의 접촉 횟수)＋(신기 물체 B로의 접촉 횟수))(Similar)를 나타낸다. 「Wt」는 야생형 마우스, 「IgG」는 IgG 투여 Tg2576 마우스, 「IBL-102」는, IBL-102 투여 Tg2576 마우스를 나타내고, n은 각 군에서 사용한 마우스의 수를 나타낸다. ***는 P<0.0005를 나타낸다.
본 명세서에 있어서, 「22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에 턴 구조를 가지는 Aβ」란, 22번째의 아미노산 및 23번째의 아미노산에서의 절곡(턴) 구조(입체 구조)를 가지는 Aβ(본 명세서에 있어서, 「22, 23-턴 Aβ」라고 함)를 의미한다. 22, 23-턴 Aβ는, 22, 23-턴 Aβ42 및 22, 23-턴 Aβ40을 포함하고, 바람직하게는, 22, 23-턴 Aβ42이다. 또한, 「아밀로이드 β의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조」란, Aβ의 22번째의 아미노산 및 23번째의 아미노산에서의 절곡(턴) 구조(입체 구조)를 의미한다. 이하, 본 명세서에 있어서, Aβ의 22번째의 아미노산 및 23번째의 아미노산에서의 턴 구조 및/또는 이 구조를 가지는 Aβ를 총칭하여 「Aβ의 독성 콘포머」라고 한다. 아밀로이드 β의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조는, 예를 들면, 22번째의 글루타민산이 프롤린으로 치환된 Aβ 변이체(E22P-Aβ42 또는 E22P-Aβ40 등의 E22P-Aβ)에서의, 22번째의 아미노산 및 23번째의 아미노산에서의 절곡(턴) 구조라도 된다. 또한, 다른 표현에 있어서는, 본 발명의 IBL-102 항체는, 이와 같은 구조를 가지는 Aβ만 인식하므로, 「22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에 턴 구조를 가지는 Aβ」는, 「IBL-102 항체가 인식하는 Aβ」로 치환해도 된다.
본 명세서에 있어서, Aβ란 아밀로이드 β의 약어이며, Aβ42란, 서열 번호 15에 기재된 아미노산 서열을 가지는 펩티드이며, Aβ40이란, 서열 번호 16에 기재된 아미노산 서열을 가지는 펩티드이다. 본 명세서에 있어서, 「아밀로이드 β의 22번 위치 및 23번 위치」 또는 「22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에 턴 구조를 가지는 Aβ」 등의 표현에서의, 22번 위치 및 23번 위치란, 각각, 서열 번호 15 및 서열 번호 16에서의, 22번째 및 23번째의 아미노산(각각 야생형에서는 글루타민산 및 아스파라긴산)의 위치를 의미한다.
본 발명은, 「22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에 턴 구조를 가지는 Aβ」 및/또는 「아밀로이드 β의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조」(Aβ의 독성 콘포머)를 극히 특이적으로 인식하는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 항체는, 22, 23-턴 Aβ42, 및/또는 22, 23-턴 Aβ40을 극히 특이적으로 인식한다.
본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 의한, Aβ의 독성 콘포머의 인식은, 22번째의 아미노산의 종류에 의존하지 않아도 된다. 즉, 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편이 인식하는 「에피토프」는, 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에 턴 구조를 가지는 Aβ에 존재하는 구조 및 아미노산(22번째의 글루타민산을 제외함)을 필수로 하지만, 22번째의 아미노산이 글루타민산인 것은 반드시 필요한 것은 아니다. 또한, 본 발명의 Aβ의 독성 콘포머를 극히 특이적으로 인식하는 항체는, 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에 있어서 턴 구조를 가지는 Aβ를 극히 특이적으로 인식하면, 그 인식 부위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 Aβ의 독성 콘포머를 극히 특이적으로 인식하는 항체가 인식하는 부위는, 예를 들면, Aβ의 23번 위치의 아미노산(아스파라긴산), 및/또는, 그에 인접한 아미노산, 예를 들면, Aβ의 22번 위치 또는 23번 위치의 아미노산으로부터 1∼10 잔기(바람직하게는, 1∼5, 1∼4, 1∼3 잔기) 이내의 아미노산이라도 된다. 예를 들면, 본 발명의 항체는, Aβ의 독성 콘포머를 극히 특이적으로 인식하고, 또한, Aβ의 23번 위치의 아미노산(아스파라긴산)을 인식하는 항체라도 된다. 또는, 본 발명의 Aβ의 독성 콘포머를 극히 특이적으로 인식하는 항체는, 22번 위치 및 23번 위치로부터 먼 위치에 존재하는 Aβ 상의 입체 에피토프로서, 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에 턴 구조를 가지는 것에 의해 생길 수 있는 에피토프를 인식하고 있어도 된다. 예를 들면, 본 발명의 항체는, Aβ가 분자간 β 시트를 형성하는 영역을 인식해도 된다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 항체는, 이와 같은 영역에 존재하는 27번째의 아스파라긴 및 31번째의 이소류신을 인식한다. 또한, 본 발명의 항체는, Aβ의 3번째의 글루타민산 및 4번째의 페닐알라닌과 결합해도 된다. 또한, 본 발명의 항체는, Aβ의 11번째의 글루타민산, 12번째의 바린, 13번째의 히스티딘, 및 14번째의 히스티딘과 결합하고 있어도 된다.
Aβ는 응집하여 올리고머를 형성하고, 응집이 더욱 진행되면 프로토피브릴을 형성하고, 또한 응집이 더욱 진행되면 피브릴을 형성한다. AD 발증에 있어서는, 올리고머나 프로토피브릴 등의 가용성 응집체가 어떠한 독성을 발휘하는 것으로 여겨지고 있다. 본 명세서에 있어서, 「Aβ의 올리고머」란, Aβ의 다이머로부터 20량체 또는 90∼650 kDa의 Aβ의 응집체를 의미한다. 예를 들면, Aβ의 올리고머는, Aβ의 다이머, 트라이머, 테트라머, 펜타머, 헥사머, 헵타머, 옥타머, 노나머, 데카머 및 프로토피브릴을 포함한다. 하나의 태양에 있어서, Aβ의 올리고머는, 분자간 β 시트를 형성하고 있는 다량체이다.
본 발명의 항체는, 바람직하게는, Aβ(바람직하게는, 22, 23-턴 Aβ, 또는 E22P-Aβ42)의 올리고머(예를 들면, 다이머)에 결합해도 된다. 즉, 일 태양에 있어서, 본 발명은, 22, 23-턴 Aβ 및/또는 E22P-Aβ42의 모노머 및 올리고머(예를 들면, 다이머)의 양쪽에 결합하는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 관한 것이다.
Aβ는, 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에 턴 구조를 가지는 구조 외에, 직선에 가까운 구조나 25번 위치 및 26번 위치의 아미노산에 있어서 턴 구조를 가지는 구조 등, 다양한 구조를 취할 수 있는 것이 알려져 있다. 본 명세서에 있어서, (22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에 턴 구조를 가지는 구조 이외의) 「다른 구조」란, 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에 턴 구조를 가지는 구조 이외의 Aβ의 구조를 의미하고, 구체적으로는, Aβ의 21번 위치 및 22번 위치의 아미노산에서의 턴 구조, Aβ의 23번 위치 및 24번 위치의 아미노산에서의 턴 구조, Aβ의 24번 위치 및 25번 위치의 아미노산에서의 턴 구조, Aβ의 25번 위치 및 26번 위치의 아미노산에서의 턴 구조, Aβ의 35번 위치 및 36번 위치의 아미노산에서의 턴 구조, 및 직선형 구조(직선에 가까운 구조, 및 턴 구조에는 포함되지 않은 구조를 포함하는 구조, 이하 동일함)를 포함한다. 또는, 「다른 구조」는, A21P-Aβ42, E22V-Aβ42, D23P-Aβ42, V24P-Aβ42, G25P-Aβ42, G33P-Aβ42, L34P-Aβ42, M35P-Aβ42, V36P-Aβ42, G37P-Aβ42, G38P-Aβ42, V39P-Aβ42, V40P-Aβ42, 및/또는 I41P-Aβ42가 가지는 구조, 예를 들면, 이들 펩티드가 가지는 턴 구조를 포함할 수도 있다. 또한, 「다른 구조를 가지는 Aβ」란, 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조 이외의 구조를 가지는 Aβ를 의미하고, 구체적으로는, Aβ의 21번 위치 및 22번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 가지는 Aβ, Aβ의 23번 위치 및 24번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 가지는 Aβ, Aβ의 24번 위치 및 25번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 가지는 Aβ, Aβ의 25번 위치 및 26번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 가지는 Aβ, Aβ의 33번 위치 및 34번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 가지는 Aβ, Aβ의 34번 위치 및 35번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 가지는 Aβ, Aβ의 35번 위치 및 36번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 가지는 Aβ, Aβ의 36번 위치 및 37번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 가지는 Aβ, Aβ의 37번 위치 및 38번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 가지는 Aβ, Aβ의 38번 위치 및 39번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 가지는 Aβ, Aβ의 40번 위치 및 41번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 가지는 Aβ, Aβ의 41번 위치 및 42번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 가지는 Aβ, 및/또는, 직선형의 구조를 가지는 Aβ를 포함한다. 또는, 「다른 구조를 가지는 Aβ」는, A21P-Aβ42, E22V-Aβ42, D23P-Aβ42, V24P-Aβ42, G25P-Aβ42, G33P-Aβ42, L34P-Aβ42, M35P-Aβ42, V36P-Aβ42, G37P-Aβ42, G38P-Aβ42, V39P-Aβ42, V40P-Aβ42, 및/또는 I41P-Aβ42가 가지는 구조를 가지는 Aβ를 포함할 수도 있다.
일 태양에 있어서, 본 발명은 22, 23-턴 Aβ 및/또는 Aβ의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 극히 특이적으로 인식하는 항체에 관한 것이다. 다른 태양에 있어서, 본 발명은 22, 23-턴 Aβ 및/또는 Aβ의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 특이적으로 인식하지만, 다른 구조를 가지는 Aβ 및/또는 Aβ의 다른 구조는 인식하지 않는 항체에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편은, 22, 23-턴 Aβ 또는 Aβ의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 특이적으로 인식하지만, 다른 구조를 가지는 Aβ 및/또는 Aβ의 다른 구조, 예를 들면, Aβ의 다른 부위에서의 턴 구조는 인식하지 않는다. 본 명세서에 있어서, 「결합하지 않는다」 및 「인식하지 않는다)」란, 전혀 결합하지 않는 것 또는 전혀 인식하지 않는 것을 의미하는 것이 아니라, 목적으로 하는 항원(Aβ의 독성 콘포머)과 충분히 식별 가능한 정도로 다른 구조로의 친화성이 낮은 것을 의미한다. 예를 들면, 「결합하지 않는다」 및 「인식하지 않는다」란, 피검 항체와 다른 구조를 가지는 Aβ 또는 Aβ의 다른 구조와의 결합에 대하여, ELISA 또는 EIA에 의해 검출되는 강도(예를 들면, 형광 강도)가, 상기 피검 항체의 Aβ의 독성 콘포머로의 결합에 대하여 동일한 ELISA 또는 EIA에 의해 검출되는 강도와 비교하여, 1/3 이하, 1/4 이하, 1/5 이하, 1/6 이하, 1/7 이하, 1/8 이하, 1/9 이하, 1/10 이하, 1/20 이하, 1/30 이하, 1/40 이하, 1/50 이하, 1/100 이하인 것을 의미할 수도 있다. ELISA 또는 EIA에 의한 검출은, 후술하는 (항체 분자를 사용한 공지의 측정 방법)의 기재에 준하여 행할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는, 주반응(22, 23-턴 Aβ 또는 E22P-Aβ42에 대한 결합)에 대한, A21P-Aβ42, E22V-Aβ42, D23P-Aβ42, V24P-Aβ42, G25P-Aβ42, G33P-Aβ42, L34P-Aβ42, M35P-Aβ42, V36P-Aβ42, G37P-Aβ42, G38P-Aβ42, V39P-Aβ42, V40P-Aβ42, 및 I41P-Aβ42로부터 선택되는 1 종류 이상의 임의의 펩티드(모든 경우를 포함함)로의 결합의 교차 반응율이, 10% 이하, 8% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하, 또는 0.3% 이하라도 된다. 또는, 본 발명의 항체는, 주반응(22, 23-턴 Aβ 또는 E22P-Aβ42에 대한 결합)에 대한, A21P-Aβ42, E22V-Aβ42, D23P-Aβ42, V24P-Aβ42, G25P-Aβ42, 및 M35P-Aβ42로의 결합의 교차 반응율이, 각각 순차적으로, 0.3% 이하, 0.3% 이하, 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.6% 이하, 및 0.7% 이하라도 되고, 또한 각각 순차적으로, 0.27% 이하, 0.28% 이하, 0.50% 이하, 0.33% 이하, 0.53% 이하, 및 0.68% 이하라도 된다. 교차 반응율은, 후술하는 (교차 반응율)에 기재된 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 항체 또는 그의 면역 반응성 단편이 「특이적으로」 인식한다(결합한다)란, 그 항체 또는 그의 면역 반응성 단편이 다른 아미노산 서열이나 다른 입체 구조를 가지는 펩티드 또는 단백질에 대한 친화성보다, Aβ의 독성 콘포머에 대하여 실질적으로 높은 친화성으로 결합하는 것을 의미한다. 본 명세서에 있어서, 항체 또는 그의 면역 반응성 단편이 「극히 특이적으로」 인식한다(결합한다)란, 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편이, 그 에피토프 또는 항원과 매우 근사한 다른 아미노산 서열이나 다른 입체 구조를 가지는 펩티드 또는 단백질에 대한 친화성과 비교하여, 실질적으로 높은 친화성으로 그 에피토프 또는 항원과 결합하는 것을 의미한다. 예를 들면, 본 발명의 항체가 「극히 특이적으로」 인식한다(결합한다)란, 그 항원인 Aβ와 동일한 아미노산 서열 또는 E22P-Aβ42와 가까운 아미노산 서열(1∼2 아미노산의 상이)을 가지는 펩티드, 또는, 그 항원인 Aβ와 동일한 아미노산 서열 또는 E22P-Aβ42와 가까운 아미노산 서열(1∼2 아미노산의 상이)을 가지고, 또한, 매우 가까운 입체 구조를 가지는 펩티드 또는 단백질, 즉, Aβ(22, 23-턴 Aβ를 제외함) 또는 Aβ 변이체(예를 들면, A21P-Aβ42, D23P-Aβ42, V24P-Aβ42, G25P-Aβ42, G33P-Aβ42, L34P-Aβ42, M35P-Aβ42, V36P-Aβ42, G37P-Aβ42, G38P-Aβ42, V39P-Aβ42, V40P-Aβ42, 및/또는 I41P-Aβ42)에 대한 친화성과 비교하여, 실질적으로 높은 친화성으로 22, 23-턴 Aβ 또는 E22P-Aβ42(또는 Aβ의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조)와 결합하는 것을 의미할 수도 있다. 여기서, 「실질적으로 높은 친화성으로 결합한다」란, 원하는 측정 장치 또는 방법에 의해, 목적으로 하는 특정한 아미노산 서열이나 입체 구조를 다른 아미노산 서열이나 입체 구조로부터 구별하여 검출할 수 있을 정도로 높은 친화성을 의미한다. 예를 들면, 실질적으로 높은 친화성은, ELISA 또는 EIA에 의해 검출된 강도(예를 들면, 형광 강도)로서, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 100배 이상인 것을 의미하고 있어도 된다. 따라서, 일 태양에 있어서, 본 발명은, E22P-Aβ42와 극히 특이적으로 결합하지만, 이하의 군으로부터 선택되는 1 종류 이상의(바람직하게는 모든) 펩티드와 결합하지 않는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 관한 것이다: A21P-Aβ42, D23P-Aβ42, V24P-Aβ42, G25P-Aβ42, G33P-Aβ42, L34P-Aβ42, M35P-Aβ42, V36P-Aβ42, G37P-Aβ42, G38P-Aβ42, V39P-Aβ42, V40P-Aβ42, 및/또는 I41P-Aβ42.
또한, 예를 들면, 본 발명의 항체가 「극히 특이적으로」 인식한다(결합한다)란, 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편이 고농도인 경우라도, 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편의 에피토프 또는 항원과 매우 근사한 다른 아미노산 서열이나 다른 입체 구조와 결합하지 않는 것을 의미할 수도 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체가 「극히 특이적으로」 인식한다(결합한다)란, 고농도의 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편이, 그 에피토프 또는 항원과 매우 근사한 다른 아미노산 서열이나 다른 입체 구조를 가지는 펩티드 또는 단백질에 대한 친화성과 비교하여, 실질적으로 높은 친화성으로 그 에피토프와 결합하는 것을 의미할 수도 있다. 여기서, 고농도의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편이란, 예를 들면, 15 ng/mL 또는 그 이상, 30 ng/mL 또는 그 이상, 40 ng/mL 또는 그 이상, 50 ng/mL 또는 그 이상, 60 ng/mL 또는 그 이상, 70 ng/mL 또는 그 이상, 80 ng/mL 또는 그 이상, 90 ng/mL 또는 그 이상, 100 ng/mL 또는 그 이상, 110 ng/mL 또는 그 이상, 120 ng/mL 또는 그 이상, 130 ng/mL 또는 그 이상, 140 ng/mL 또는 그 이상, 또는 150 ng/mL 또는 그 이상이라도 된다. 또한, 이와 같은 특이성은, 예를 들면, ELISA 또는 EIA 어세이에 있어서 측정된 것이라도 된다.
본 발명의 항체와 Aβ의 독성 콘포머 또는 E22P-Aβ42와의 결합에서의 결합 속도 상수(Ka1)로서는, 예를 들면, 1×104 Ms-1 이상, 1×105 Ms-1 이상, 2×105 Ms-1 이상, 2.3×105 Ms-1 이상이며, 바람직하게는, 2.32×105 이상이다. 또한, 본 발명의 항체와 Aβ의 독성 콘포머 또는 E22P-Aβ42와의 결합에서의 해리 속도 상수(Kd1)로서는, 예를 들면, 1×10-3 이하, 9×10-4 이하, 8×10-4 이하이며, 바람직하게는, 7.09×10-4 이하이다. 본 발명의 항체와 Aβ의 독성 콘포머 또는 E22P-Aβ42와의 결합에서의 결합 상수(KD)로서는, 예를 들면, 1×10-8(M) 이하, 7×10-8(M) 이하, 5×10-8(M) 이하, 4×10-9 이하일 수 있고, 바람직하게는, 3.05×10-9 이하이다. 본 명세서에서의 항체의 결합 속도 상수(Ka1), 해리 속도 상수(Kd1), 및 결합 상수(KD)는 BIACORE(GE 헬스케어 바이오사이언스 주식회사, BIACORE-X100)를 사용하여, 제조자 제공의 매뉴얼에 따라, SA 칩에 비오틴화 E22P-Aβ42 또는 비오틴화 야생형 Aβ42를 고정한 후, 피검 항체를 흐르게 하고, 결합 속도 상수 Ka1, 해리 속도 상수 Kd1을 측정하고, bivalent 피팅을 사용하여 결합 상수 KD값을 결정할 수 있다
본 발명의 항체는, 폴리클로날 항체라도, 모노클로날 항체라도 되지만, 바람직하게는, 모노클로날 항체이다. 본 발명에 있어서, 「모노클로날 항체」는, 단일 항원 결정기와 반응하는, 구조가 거의 균일한 항체이다. 또한, 본 발명의 항체는, 비인간 동물의 항체, 비인간 동물의 항체의 아미노산 서열과 인간 유래의 항체의 아미노산 서열을 가지는 항체, 및, 인간 항체를 포함한다. 비인간 동물의 항체로서는, 예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 래빗, 개, 원숭이, 양, 염소, 닭, 집오리 등의 항체가 있고, 바람직하게는, 하이브리도마(hybridoma)를 제작할 수 있는 동물의 항체이며, 더욱 바람직하게는 마우스, 래트 또는 토끼의 항체이다. 비인간 동물의 항체의 아미노산 서열과 인간 유래의 항체의 아미노산 서열을 가지는 항체로서는, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체를 예로 들 수 있다. 상기에 있어서, 「키메라 항체」란, 비인간 동물 유래로서 Aβ의 독성 콘포머와 극히 특이적으로 결합하는 항체의 정상(定常) 영역을 인간의 항체와 동일한 정상 영역을 가지도록 유전자 공학적으로 변형한 항체이며, 바람직하게는, 인간·마우스·키메라 항체(유럽 특허 공개 공보 EP0125023 참조)이다. 「인간화 항체」란, 비인간 동물 유래로서 Aβ의 독성 콘포머와 극히 특이적으로 결합하는 항체의 H쇄과 L쇄의 상보(相補) 인식 영역(CDR) 이외의 1차 구조를 인간의 항체에 대응하는 1차 구조에 유전자 공학적으로 변형한 항체이다. 여기서, CDR이란, Kabat 등("Sequences of Proteins of I㎜unological Interest", Kabat, E.등, U. S. Department of Health and Human Services, 1983) 또는 Chothia 등(Chothia&Lesk(1987) J. Mol. Biol., 196: 901-917)의 어느 정의에 의한 것이라도 된다. 「인간 항체」란, 완전히 인간 유래의 항체 유전자의 발현 산물인 인간 항체이며, 예를 들면, 인간의 항체 생산에 관여하는 유전자를 도입한 트랜스제닉(transgenic) 동물을 사용하여 제작한 모노클로날 항체(유럽 특허 공개 공보 EP0546073 참조) 등이 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체를 치료, 예방, 또는 체내에 투여함으로써 사용하는 진단에 사용하는 경우에는, 본 발명의 항체로서 바람직하게는, 인간·비인간 동물의 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체이다.
본 발명의 항체의 이뮤노글로불린 클래스는 특별히 한정되지 않으며, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, 또는 IgY의 어느 이뮤노글로불린 클래스(동종(isotype))라도 되고, 바람직하게는 IgG이다. 또한, 본 발명의 항체가 IgG인 경우, 어느 서브 클래스(IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)라도 된다. 또한, 본 발명의 항체는, 모노스페시픽(monospecific), 바이스페시픽(2중 특이성 항체), 트리스페시픽(3중 특이성 항체)(예를 들면, WO1991/003493호)이라도 된다.
항체는 그 가변 영역(특히, CDRs)이 결합 특성을 부여하고 있는 것으로 알려져 있고, 완전 항체가 아닌 항체 단편이라도 그 결합 특성을 이용 가능한 것으로 당업자에게 널리 알려져 있다. 본 명세서에 있어서, 「면역 반응성 단편」이란, 항체의 일부분(부분 단편)을 포함하는 단백질 또는 펩티드로서, 항체의 항원으로의 작용(면역 반응성·결합성)을 유지하는 단백질 또는 펩티드를 의미한다. 이와 같은 면역 반응성 단편으로서는, 예를 들면, F(ab')2, Fab', Fab, Fab3, 단일 가닥 Fv(이하, 「scFv」라고 함), (탠덤)바이스페시픽 단일 가닥 Fv(sc(Fv)2), 단일 가닥 트리플보디, 나노보디, 2가(divalent) VHH, 5가(pentavalent) VHH, 미니보디, (2중 가닥) 다이아보디, 탠덤다이아보디, 바이스페시픽트리보디, 바이스페시픽바이보디, 듀얼어피니티리타게팅 분자(DART), 트리아보디(또는 트리보디), 테트라보디(또는 [sc(Fv)2]2), 또는 (scFv-SA)4)디술피드 결합 Fv(이하, 「dsFv」라고 함), 컴팩트 IgG, 중쇄 항체, 또는 이들의 중합체가 있다(Nature Biotechnology, 29(1): 5-6 (2011); Maneesh Jain et al., TRENDS in Biotechnology, 25(7)(2007): 307-316; 및 Christoph stein등, Antibodies(1): 88-123(2012) 참조). 본 명세서에 있어서, 면역 반응성 단편은, 모노스페시픽, 바이스페시픽(2중 특이성), 트리스페시픽(3중 특이성), 및 멀티스페시픽(다중 특이성) 중 어느 것이라도 된다.
본 명세서의 Aβ의 독성 콘포머를 극히 특이적으로 인식하는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편의 구체예로서, IBL-102 항체 또는 그의 유도체를 들 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는, (i) 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3가, 각각, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 및 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편; (ii) 상기 (i)의 항체 또는 면역 반응성 단편으로서, 또한, 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3가, 각각, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 및 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열을 가지는, 항체 또는 그의 면역 반응성 단편이 있다. 또는, 본 명세서의 「아밀로이드 β의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 특이적으로 인식하는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편」으로서는, 예를 들면, 이하의 (iii)∼(viii)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편이 있다: (iii) VH가, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열과 스트린젠트(stringent)인 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편으로서, Aβ의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 극히 특이적으로 인식하지만, Aβ의 다른 부위에서의 턴 구조는 인식하지 않는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편, (iv) 상기 (iii)의 항체 또는 면역 반응성 단편으로서, 또한, VL이 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열과 스트린젠트인 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편; (v) VH가, 서열 번호 4의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편으로서, Aβ의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 극히 특이적으로 인식하지만, Aβ의 다른 부위에서의 턴 구조는 인식하지 않는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편; (vi) 상기 (v)의 항체 또는 면역 반응성 단편으로서, 또한, VL이, 서열 번호 11의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편; (vii) VH가, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편; (viii) 상기 (vii)의 항체 또는 면역 반응성 단편으로서, 또한, VL이 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편. 여기서, 상기 (iii)∼(vi)의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편은, 또한, 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3가, 각각, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 및 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가지고, 또한/또는, 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3가, 각각, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 및 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열을 가지고 있어도 된다. 본 명세서에 있어서, 「IBL-102 모노클로날 항체」라는 언급은, 광의적으로는(특별히 이와 같이 해석하는 것이 부정합(不整合)한 경우를 제외하고), 상기 (i)∼(viii)에 기재된 항체, 및 이들의 면역 반응성 단편을 포함하는 경우가 있다.
본 명세서에 있어서, 「서열 번호 5, 서열 번호 6, 및 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열」은, 도 10에 있어서 IBL-102HC로서 나타낸 아미노산 서열에 있어서 밑줄 및 굵은 글씨로 나타낸 3종류의 아미노산 서열의 좌측 위로부터 좌측 방향으로 판독하여 등장하는 순서로 각각 치환할 수도 있다. 즉, 서열 번호 5(DYNMD), 서열 번호 6(DINPNTGVTIDNPKFKG), 서열 번호 7(LPDNYVMDY)이라도 된다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「서열 번호 12, 서열 번호 13, 및 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열」의 용어는, 도 10에 있어서 IBL-102LC로서 나타낸 아미노산 서열에 있어서 밑줄 및 굵은 글씨로 나타낸 3종류의 아미노산 서열을 좌측 위로부터 좌측 방향으로 판독하여 등장하는 순서로 각각 치환할 수도 있다. 즉, 서열 번호 12(RCSQSLVHRNGNTNLH), 서열 번호 13(KVSNRFS), 서열 번호 14(SQSTYVPLT)라도 된다. 본 명세서에 있어서, 「서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열」의 용어는, 도 10에 있어서 IBL-102HC로서 나타낸 아미노산 서열에서의 프레임 내의 아미노산 서열과 치환할 수도 있다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열」의 용어는, 도 10에 있어서 IBL-102LC로서 나타낸 아미노산 서열에서의 프레임 내의 아미노산 서열과 치환할 수도 있다.
본 명세서에 있어서 제공되는 IBL-102 모노클로날 항체는, AD와의 상관관계가 높은 물질과 결합할 수 있고, 또한, 일정한 치료 효과를 가져오므로, IBL-102 모노클로날 항체가 결합하는 항원(또는 IBL-102 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프를 가지는 단백질)은, AD의 발증·악화나 Aβ의 독성 발휘에 깊이 관계하고 있는 것이 나타났다. 이와 같은 효과는, 동일하게 Aβ의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 포함하는 항원으로부터 취득된 IBL-101 항체에 있어서는 확인되지 않았다. 따라서, IBL-102 모노클로날 항체가 결합하는 항원(또한 에피토프)과 IBL-102와 동등한 특이성으로 결합하는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편은, IBL-102 모노클로날 항체와 마찬가지로 AD의 진단 및 치료에 이용할 수 있는 것이 나타났다. 따라서, 다른 태양에 있어서, 본 발명은, IBL-102 모노클로날 항체가 결합하는 항원(또는 에피토프)에 극히 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 관한 것이다. 예를 들면, 본 발명은, IBL-102 항체가 결합하는, Aβ 내에 존재할 수 있는 에피토프를 극히 특이적으로 인식하지만, IBL-102 항체가 결합하지 않는, Aβ 내에 존재할 수 있는 에피토프를 인식하지 않는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편이라도 된다. 또는, 본 발명은, IBL-102 항체가 결합하는 Aβ(또는, E22P-Aβ42)를 극히 특이적으로 인식하지만, IBL-102 항체가 결합하지 않는 다른 구조를 가지는 Aβ는 인식하지 않는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편이라도 된다. 다른 태양에 있어서, 본 발명은, IBL-102 항체와, Aβ(예를 들면, 22, 23-턴 Aβ, E22P-Aβ42, 또는 Aβ 올리고머(E22P-Aβ42의 올리고머를 포함함))로의 특이적 결합에 대하여 경합하는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편이며, 바람직하게는, 또한, IBL-102 항체가 결합하지 않는 구조를 가지는 Aβ와는 결합하지 않는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 관한 것이다.
본 명세서에 있어서, 피검 항체가, 목적으로 하는 에피토프 또는 목적으로 하는 항원을 극히 특이적으로 인식하는(결합하는)지의 여부는 상기 에피토프를 가지는 펩티드 또는 상기 항원으로의 상기 항체의 결합, 및, 그 외의 에피토프, 그 외의 구조를 가지는 항원, 또는 그 외의 항원으로의 상기 항체의 결합을 조사함으로써 판정할 수 있다. 이와 같은 결합의 측정은, 후술하는 (항체 분자를 사용한 공지의 측정 방법)의 기재에 준하여 행할 수 있다. 또한, 피검 항체가, IBL-102 항체와, Aβ(예를 들면, 22, 23-턴 Aβ의 모노머 또는 올리고머, 또는 E22P-Aβ42)로의 특이적 결합에 대하여 경합하는지의 여부는, IBL-102 항체를 피검 항체와 함께 또는 IBL-102 항체 단독으로 항원(예를 들면, 22, 23-턴 Aβ의 모노머 또는 올리고머, 또는 E22P-Aβ42)에 접촉시킨 후, 항원에 결합한 IBL-102 항체의 양을 비교함으로써 결정할 수 있다. 피검 항체를 동시에 반응시킨 경우의 IBL-102 항체의 항원으로의 결합량이 IBL-102 항체를 단독으로 첨가한 경우의 동일 항체의 항원으로의 결합량보다 적은 경우에는, 상기 피검 항체는 IBL-102 항체와 경합하는 것으로 결정할 수 있다. 항체의 항원으로의 결합의 측정은, 후술하는 (항체 분자를 사용한 공지의 측정 방법)의 기재에 준하여 행할 수 있다.
IBL-102 모노클로날 항체가 결합하는 항원(또는 에피토프)에 극히 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편은, IBL-102 항체와, Aβ(또는, E22P-Aβ42)로의 특이적 결합에 대하여 경합하지만, IBL-102 항체가 결합하지 않는 구조를 가지는 Aβ와는 결합하지 않는다. IBL-102 모노클로날 항체가 결합하는 항원(또는 에피토프)에 극히 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편은, 바람직하게는, 또한, Aβ(E22P-Aβ42를 포함함)의 올리고머에 결합한다.
(핵산 분자·벡터·숙주 세포)
다른 태양에 있어서, 본 발명은, 전술한 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 가지는 핵산 분자에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명의 핵산 분자는, VH로서 서열 번호 4에 기재된 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 가지는 핵산 분자, VL로서 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 가지는 핵산 분자, 또는 VH로서 서열 번호 4에 기재된 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 VL로서 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 가지는 핵산 분자를 포함한다. VH로서 서열 번호 4에 기재된 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들면, 서열 번호 1에서의 126번째로부터 479번째의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드라도 된다. 또한, VL로서 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서는, 서열 번호 8의 130번째로부터 465번째의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드라도 된다. 또한, 본 발명은, 상기 핵산 분자를 가지는 벡터를 포함한다. 이와 같은 벡터로서는, 항체의 발현에 이용 가능한 벡터이면 특별히 제한되는 것은 아니며, 적절한 플라스미드 벡터 등을 사용하는 숙주에 따라 선택할 수 있다. 다른 태양에 있어서, 본 발명은, 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포로서는, 항체의 발현에 이용 가능한 숙주 세포이면 특별히 제한되는 것은 아니며, 포유류 세포(마우스 세포, 래트 세포, 토끼 세포, 인간 세포 등), 효모, 미생물(대장균 등)을 예로 들 수 있다.
(의약 조성물)
또한, 다른 태양에 있어서, 본 발명은, 전술한 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 의약 조성물의 대상 질환으로서는, AD를 예로 들 수 있다. 따라서, 본 발명의 의약 조성물은, AD의 예방약, 치료약, 진행 억제제 또는 개선약으로 할 수 있다. 또는, 본 발명의 의약 조성물은, AD 환자에서의 인지 장애(단기 또는 장기의 기억 장애, 방향감 장애(disorientation), 학습 장애, 주의 장애, 공간 인지 기능, 및/또는 문제 해결 능력의 장애)를 개선하기 위한 의약 조성물로 할 수 있다. 또는, 본 발명은, 상기 의약 조성물을 제조하기 위한, 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 의약 조성물은, 환자에게 투여할 수 있는 제제이면 경구(經口) 또는 비경구의 어떠한 제제를 채용해도 된다. 비경구 투여를 위한 조성물로서는, 예를 들면, 주사제, 점비제, 좌제, 첩포제, 연고 등이 있다. 바람직하게는, 주사제이다. 본 발명의 의약 조성물의 제형은, 예를 들면, 액제 또는 동결건조 제제가 있다. 본 발명의 의약 조성물을 주사제로서 사용하는 경우, 필요에 따라, 프로필렌글리콜, 에틸렌디아민 등의 용해 보조제, 인산염 등의 완충재, 염화 나트륨, 글리세린 등의 등장화제, 아황산염 등의 안정제, 페놀 등의 보존제, 리도카인 등의 무통화제 등의 첨가물(「의약품 첨가물 사전」 약사 일보사, 「Handbook of Pharmaceutical Excipients Fifth Edition」APhA Publications사 참조)을 가할 수 있다. 또한, 본 발명의 의약 조성물을 주사제로서 사용하는 경우, 보존 용기로서는, 앰플, 바이알, 프리필드시린지, 펜형 주사기용 카트리지, 및 링겔용 백 등을 예로 들 수 있다.
(키트)
또한, 다른 태양에 있어서, 본 발명은, 전술한 항체 또는 그의 면역 결합성 단편을 구비하는 키트에 관한 것이다. 일 태양에 있어서, 본 발명의 키트는, IBL-102 항체가 결합하는 항원의 검출용 또는 측정용의 키트일 수 있다. 또한, 다른 태양에 있어서, 본 발명의 측정용 키트는, Aβ의 독성 콘포머의 검출용 또는 측정용의 키트일 수 있다. 또한 다른 태양에 있어서, 본 발명의 키트는, AD의 진단용으로 할 수 있다. 또한, 본 발명은, 이와 같은 키트를 제조하기 위한, 전술한 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편의 사용을 포함한다.
본 발명의 키트는, 바람직하게는, 고상(固相), 하프텐, 및 불용성 담체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 담체를 포함한다. 본 발명의 측정 키트는, 항체 분자를 사용한 공지의 검출 및/또는 측정 방법에 기초할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 「항체 분자를 사용한 공지의 검출 및/또는 측정 방법」은, 예를 들면, 효소 면역 측정법(EIA법)용 키트, 간이 EIA법용 키트, 효소 결합 이뮤노소르벤트어세이법(ELISA법)용 키트, 라이오이뮤노어세이법(RIA법)(RIA법용 키트), 형광 면역 측정법(FIA법)용 키트 등의 표지화 면역 측정법용 키트; 웨스턴블로팅법용 키트 등의 이뮤노블로팅법용 키트; 금 콜로이드 응집법용 키트 등의 이뮤노크로마토법용 키트; 이온 교환 크로마토그래피법용 키트, 어피니티 크로마토그래피법용 키트 등의 크로마토그래피법용 키트; 비탁법(比濁法)(TIA법)용 키트; 비왁스법(NIA법)용 키트; 비색법용 키트; 라텍스 응집법(LIA법)용 키트; 입자 계수법(CIA법)용 키트; 화학 발광 측정법(CLIA법, CLEIA법)용 키트; 침강 반응법용 키트; 표면 플라즈몬 공명법(SPR법)용 키트; 공명거울검출법(RMD법)용 키트; 비교 간섭법용 키트 등을 포함한다. 본 발명의 키트가, 원하는 검출 및/또는 측정을 행할 수 있는지의 여부는, 표준 검체 또는 목적으로 하는 검체를 사용하여, 각 측정법을 당업자 주지(周知)의 방법에 의해 실시함으로써, 검출 및/또는 측정 가능한지의 여부를 판정함으로써 확인할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 키트는, (i) 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편인 제1 항체가 고정화한 고상 또는 하프텐, 및 (ii) 표지화된 항Aβ 항체(항Aβ42 항체, 및 항Aβ40 항체를 포함하는, 본 명세서 전체에 있어서 동일함)인 제2 항체를 포함하는 면역 화학 측정의 키트로 할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트가 하프텐을 포함하는 경우, 또한 하프텐과 특이적으로 결합하는 물질이 고정화한 고상을 더 포함할 수도 있다. 또한, 상기 제1 항체를 표지화 항체로 하고, 상기 제2 항체를 고정화 항체로 해도 된다.
또는, 본 발명의 키트는, (i) 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편인 제1 항체가 고정화한 고상, 및, (ii) 항Aβ 항체인 제2 항체가 고정화한 하프텐을 포함하는 면역 화학 측정의 키트로 할 수 있다. 또한, 상기 키트는 또한, 하프텐과 특이적으로 결합하는, 표지된 물질을 포함할 수도 있다. 또한, 상기 제1 항체를 하프텐 결합 항체로 하고, 상기 제2 항체를 고상 고정화 항체로 해도 된다.
또는, 본 발명의 키트는, (i) 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편인 제1 항체가 고정화한 불용성 담체, 및, (ii) 항Aβ 항체인 제2 항체가 고정화한 불용성 담체를 포함하는 면역 화학 측정의 키트로 할 수 있다.
상기한 어느 키트의 예에 있어서도, 상기 제1 항체와 상기 제2 항체는 Aβ(Aβ42, Aβ40을 포함함. 본 명세서 전체에 있어서 동일함)의 상이한 부위를 인식한다. 또한, 상기 제1 항체를 모노클로날 항체 또는 그의 면역 반응성 단편으로 하고, 제2 항체를 폴리클로날 항체 또는 그의 면역 반응성 단편으로 해도 되고, 제1 항체를 폴리클로날 항체 또는 그의 면역 반응성 단편으로 하고, 제2 항체를 모노클로날 항체 또는 그의 면역 반응성 단편으로 해도 되며, 또는 제1 및 제2의 양쪽 항체를 모노클로날 항체 또는 그의 면역 반응성 단편으로 해도 된다. 본 명세서의 키트에 있어서, 예를 들면, 제1 항체를 전술한 본 발명의 항체로 하고, 제2 항체를 Aβ의 N말단 부근(N말단으로부터 1∼20 아미노산) 또는 C말단 부근(C말단으로부터 1∼20 아미노산)을 특이적으로 인식하는 항체로 해도 된다.
본 발명의 키트가 표지화된 항체 또는 그의 면역 결합성 단편을 포함하는 경우, 상기 표지로서는, 방사능 표지, 효소, 형광 표지, 생물 발광 표지, 화학 발광 표지 금속 등의 검출 가능한 표지를 사용할 수 있다. 이와 같은 표지로서는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만 예로서, 32P, 3H, 125I, 14C 등의 방사능 표지; β갈락토시다아제, 퍼옥시다제, 알칼리포스파타제, 글루코오스옥시다제, 락트산 옥시다제, 알코올옥시다제, 모노아민옥시다제, 호스래디시퍼옥시다제 등의 효소; FAD, FMN, ATP, 비오틴, 헴(heme) 등의 조효소 또는 보결 분자족; 플루오레세인 유도체(플루오레세인이소티오시아네이트(FITC), 플루오레세인티오플루바밀 등), 로다민 유도체(테트라메틸로다민, 트리메틸로다민(RITC), 텍사스 레드, 로다민 110 등), Cy 색소(Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7), Cy-크롬, 스펙트럼 그린, 스펙트럼 오렌지, 프로피듐요오드화물, 알로피코시아닌(APC), R-피코에리트린(R-PE) 등의 형광 표지; 루시퍼라제 등의 생물 발광 표지; 또는, 루미놀, 이소루미놀, N-(4-아미노부틸)-N-에틸이소루미노스에스테르 등의 루미놀 유도체, N-메틸아크리디늄에스테르, N-메틸아크리디늄아실술폰아미드에스테르 등의 아크리디늄 유도체, 루시게닌, 아다만틸디옥세탄, 인독실 유도체, 루테늄 착체 등의 화학 발광 표지; 금 콜로이드 등의 금속 등의 검출 가능한 표지를 들 수 있다.
본 발명의 키트는, 필요에 따라, 발색 시약, 반응 정지용 시약, 표준 항원 시약, 검체 전처리(前處理)용 시약, 블로킹 시약 등을 포함할 수도 있다. 또한, 본 발명의 키트가 표지화된 항체를 포함하는 경우, 또한 표지와 반응하는 기질을 포함할 수도 있다. 또한, 본 발명의 키트는, 종이 상자 또는 플라스틱 케이스 등의 키트의 구성물을 저장하는 패키지, 및 취급 설명서 등을 포함할 수도 있다.
본 발명의 키트에 사용하는 검체로서는, 예를 들면, 생검으로서 피험자로부터 채취한 조직 시료 또는 액체를 사용할 수 있다. 사용되는 생검은, 원하는 검출 및/또는 측정의 대상이 되는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 혈액, 혈장, 혈청, 림프액, 뇨, 장액(漿液), 수액(髓液), 뇌척수액, 관절액, 안방수(眼房水), 누액(淚液), 타액, 뇌 조직 또는 이들의 분획물 또는 처리물이 있다. 본 발명의 키트에 의한 분석은, 정성적, 정량적 또는 반정량적으로 행할 수 있다.
(검출·측정·진단용의 약제, 검출·측정·진단용 조성물)
다른 태양에 있어서, 본 발명은, 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 함유하는, IBL-102 항체가 결합하는 항원 또는 Aβ의 독성 콘포머의 검출 및/또는 측정에 사용하기 위한 약제 또는 조성물(이하, 「측정용의 약제 또는 조성물」이라고 함)에 관한 것이다. 본 명세서에 있어서, 측정용의 약제 또는 조성물은, AD의 진단 용도에 사용되는 것, 즉 AD의 진단약 또는 AD의 진단용 조성물을 포함한다. 또는, 본 발명은, 상기 진단용 조성물을 제조하기 위한, 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편의 사용에 관한 것이다.
예를 들면, 생체외에서 사용하는(인비보(in vitro) 또는 엑스비보(ex vivo)) 것을 목적으로 하는 경우, 본 발명의 검출 및/또는 측정용의 약제 또는 조성물은, 필요에 따라, 전술한 본 발명의 키트에 준한 구성으로 할 수 있다.
또한, 본 발명의 검출 및/또는 측정용의 약제 또는 조성물은, 화상 진단용을 포함하는, 생체 내에 투여하여 사용되기 위한 형태(이하, 「인비보(in vivo) 검출 및/또는 측정용의 약제 또는 조성물」이라고 함)라도 된다. 본 발명의 인비보(in vivo) 검출 및/또는 측정용의 약제 또는 조성물에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편은, 표지 물질을 함유하고 또는 표지 물질과 결합하고 있다. 표지 물질로서는, 예를 들면, 방사성 동위 원소 등의 당업자 주지의 물질을 사용할 수 있고, 바람직하게는 양전자 방출 방사성 동위 원소 또는 γ선 방사성 동위 원소이며, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 131I, 123I, 124I, 86Y, 62Cu, 64Cu, 111In, 67Ga, 68Ga, 99mTc, 94mTc, 18F, 11C, 13N, 15O 및 75Br이 있다. 본 발명의 인비보(in vivo) 검출 및/또는 측정용의 약제 또는 조성물에서의, 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편은, 바람직하게는, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체이다. 또한, 본 발명의 인비보(in vivo) 검출 및/또는 측정용의 약제 또는 조성물은, 인간으로의 투여에 적절한 의약상 허용되는 형태로서, 생리학적으로 허용할 수 있는 첨가제, 예를 들면, 약학적으로 허용할 수 있는 희석제, 완충제, 가용화제, 무통화제, 용제, 안정화제 또는 산화 방지제를 포함할 수도 있다. 본 발명의 인비보(in vivo) 검출 및/또는 측정용의 약제 또는 조성물의 투여량은, 대상 부위, 사용하는 검출·측정·진단 방법, 피험자의 연령, 성별 그 외의 조건, 질환의 정도에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「XNY」(X 및 Y는 아미노산 1문자 표기; N은 자연수)은, N번 위치의 아미노산 X가 아미노산 Y로 치환되어 있는 것을 나타내고, 「Aβp-q」(p 및 q는 자연수)는, Aβ의 p번 위치의 아미노산으로부터 q번 위치의 아미노산으로 이루어지는 펩티드를 나타낸다. 특히 Aβ1-40 및 Aβ1-42는, 각각, Aβ40 및 Aβ42로 기재한다. 예를 들면, E22P-Aβ42는, 22번 위치의 글루타민산이 프롤린으로 치환된 Aβ의 1번 위치에서 42번 위치까지의 아미노산으로 이루어지는 펩티드를 나타내고, G9C, E22P-Aβ9-35는, 9번 위치의 글리신이 시스테인으로 치환되고, 22번 위치의 글루타민산이 프롤린으로 치환된 Aβ의 9번 위치-35번 위치까지의 아미노산으로 이루어지는 펩티드를 나타낸다.
[발명을 실시하기 위한 형태]
1. 항체의 제작
(항체의 취득)
본 발명의 항체는, Aβ42의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 구비하는 물질, 바람직하게는, E22P-Aβ42, Aβ-락탐(22K-23E), 또는 P3-Aβ42(일본공개특허 제2006-265189호; K. Murakami 등(2005) J. Am. Chem. Soc., 127: 15168-15174)를 면역원으로 하고, 필요에 따라 면역 부활제(예를 들면, 광유 또는 알루미늄 침전물과 가열 사균 또는 리포 다당체, 프로인트 완전 아쥬반트(complete Freund's adjuvant), 또는 프로인트 불완전 아쥬반트 등)와 함께, 비인간 포유동물 또는 조류에 면역함으로써 제작할 수 있다. 면역 동물로서는, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 래빗, 개, 원숭이, 양, 염소, 닭, 집오리 등 하이브리도마를 제작할 수 있는 동물이면 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 마우스 또는 래트이며, 더욱 바람직하게는 마우스이다. 동물로의 면역원의 투여는, 예를 들면, 0.1∼1000 μg을 1회 또는 적당한 간격을 두고 수회(통상 1∼6 주마다 1회의 면역을 합계 2∼10 회 정도), 피하 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 피내 주사, 근육내 주사 또는 족척(足蹠) 주사에 의해 행할 수 있다. 마지막 면역으로부터 1∼2 주 후에, 면역한 동물의 안와(眼窩) 또는 미정맥(尾靜脈)으로부터 채혈을 행하고, 그 혈청을 사용하여 항체가(抗體價)의 측정을 행한다. 본 발명의 항체는, 충분한 항체가를 나타낸 동물의 혈청으로부터 정제함으로써 얻을 수 있다.
모노클로날 항체는, 상기 방법에 의해 면역한 면역 감작(感作) 동물로부터 얻은 항체 생산 세포와 골수종계 세포(미엘로마 세포)를 융합함으로써 얻어지는 하이브리도마를 배양함으로써 얻을 수 있다. 상기 융합 방법으로서는, 예를 들면, 밀스타인 등의 방법(Galfre, G. & Milstein, C. (1981) Methods Enzymol., 73: 3-46)이 있다. 사용하는 항체 생산 세포는, 상기 방법에 의해 면역하고 혈청이 충분한 항체가를 나타낸 마우스 또는 래트의 비장, 췌장, 림프절, 말초혈로부터 채취할 수 있다. 사용하는 골수종계 세포는, 예를 들면, 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 래빗 또는 인간 등의 포유동물로부터 유래하는 세포로서, 인비트로(in vitro)로 증식 가능한 세포이면 특별히 한정은 없다. 이와 같은 세포로서는, 예를 들면, P3-X63Ag8(X63)(Nature, 256, 495, 1975), P3/NS1/1-Ag4-1(NS1)(Eur. J. I㎜unol., 6, 292, 1976), P3X63Ag8U1(P3U1)(Curr. Top. Microbiol. I㎜unol., 81, 1, 1978), P3X63Ag8.653(653)(J. I㎜unol. , 123, 1548, 1979), Sp2/0-Ag14(Sp2/O)(Nature, 276, 269, 1978), Sp2/O/FO-2(FO-2)(J. I㎜unol. Methods, 35, 1, 1980) 등이 있으며, 바람직하게는, 항체 생산 세포와 동종 동물 유래의 세포이며, 더욱 바람직하게는, 항체 생산 세포와 동일 계통의 동물 유래의 세포이다. 예를 들면, 마우스 유래의 골수종계 세포로서, 바람직하게는, P3U1 또는 P3X63-Ag8-653이다.
항체 생산 세포와 골수종 세포를 융합시켜 하이브리도마를 형성하는 방법으로서는, 폴리에틸렌글리콜(이하, 「PEG」라고 함) 등을 사용하는 방법(PEG법), 센다이바이러스를 사용하는 방법, 전기 융합 장치를 사용하는 방법 등을 예로 들 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별은, 공지 또는 이에 준한 방법에 의해 행할 수 있다. 통상, HAT(히포크산틴-아미노프테린-티미딘)를 첨가한 동물세포용 배지에서 통상, 5일∼3주일, 바람직하게는 1주일∼2주일 선택적으로 증식시킴으로써, 하이브리도마 세포의 선별을 행할 수 있다.
배양 후, 배양 상청액을 채취하고, ELISA 등에 의해, Aβ의 독성 콘포머 결합이 극히 특이적인 클론을 선택한다. 선택된 클론에 대하여, 한계 희석법을 1∼5 회 반복함으로써 단일 세포화를 행하고, 상기 단일 세포화된 클론이 생산하는 항체 중, Aβ로의 독성 콘포머로의 특이성이 극히 높은 항체를 스크리닝함으로써, 안정적으로 높은 특이성을 나타내는 항체를 생산하는 세포를 선택할 수 있다. 본 발명의 Aβ의 독성 콘포머와 극히 특이적으로 결합하는 항체의 스크리닝은, 22번 위치 및 23번 위치에 β-턴 구조를 취하는 Aβ 변이체(E22P-Aβ42)(K. Murakami 등(2003) J. Biol. Chem., 278: 46179-46187)로의 결합능이 높고, 그 이외의 Aβ의 구조(예를 들면, A21P-Aβ42, D23P-Aβ42, V24P-Aβ42, G25P-Aβ42, M35P-Aβ42, E22V-Aβ42로부터 선택되는 1 종류 이상의 펩티드 또는 이들 모든 펩티드)로의 결합능이 낮은 것을 지표(指標)로 하고, 결합력보다 특이성을 우선하여 특이성이 높은 클론을 선택하는 것을 반복함으로써 행할 수 있다.
얻어진 항체는, 균일하게 될 때까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 어피니티크로마토그래피 등의 컬럼 크로마토그래피, 필터, 한외(限外) 여과, 염석, 투석, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 적절하게 선택하고, 조합함으로써, 항체를 분리, 정제할 수 있다(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 어피니티 크로마토그래피에 사용하는 컬럼으로서는, 예를 들면, 프로테인 A 컬럼, 프로테인 G 컬럼이 있다. 또한, 항체의 클래스에 의하지 않고, E22P-Aβ42 고상화 컬럼, 이온 교환 크로마토그래피, 소수(疏水) 상호 작용 크로마토그래피 등을 사용할 수도 있다.
또는, VH가, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열과 스트린젠트인 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 가지고, 또한 VL이 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열과 스트린젠트인 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편; VH가, 서열 번호 4의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지고, 또한 VL이, 서열 번호 11의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편; CDRH1, CDRH2 및 CDRH3가, 각각, 서열 번호 5, 6, 및 7에 기재된 아미노산 서열을 가지고, 또한 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3가, 각각, 서열 번호 12, 13, 및 14에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편의 아미노산 서열을 디자인하고, 상기 디자인된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 조제하고, 발현 벡터에 포함되고, 적당한 숙주 세포에 상기 벡터를 도입하여 발현시킴으로써 얻은 항체로부터, 전술한 방법에 의해 Aβ의 독성 콘포머로의 특이성이 극히 높은 항체를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다.
또한, 예를 들면, 본 발명의 항체는, 서열 번호 2(시그널 펩티드를 가지는 중쇄), 서열 번호 3(시그널 펩티드를 포함하지 않는 중쇄), 및 서열 번호 4(중쇄 가변 영역) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA, 및 서열 번호 9(시그널 펩티드를 가지는 중쇄), 서열 번호 10(시그널 펩티드를 포함하지 않는 중쇄), 및 서열 번호 11(경쇄 가변 영역) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 합성하고, 또는 서열 번호 1 및 8에 기재된 핵산 서열을 가지는 DNA를 합성하고, 상기 DNA 서열 번호 2∼서열 번호 4, 및 서열 번호 9∼11에 기재된 아미노산 서열을 가지는 H쇄 및 L쇄 또는 이들의 가변 영역을 얻는 것에 의해 제조할 수 있다.
(인간형 키메라 항체 제작)
본 발명의 항체가 인간형 키메라 항체인 경우, Aβ의 독성 콘포머를 극히 특이적으로 인식하는 비인간 동물 모노클로날 항체(예를 들면, IBL-102 모노클로날 항체)의 VH 및 VL을 코딩하는 DNA를 조제하고, 이것을 인간 면역 글로불린의 정상 영역 cDNA와 결합하여 발현 벡터에 포함하고, 적당한 숙주 세포에 상기 벡터를 도입하여 발현시킴으로써 얻을 수 있다(Morrison, S. L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, 1984).
(인간화 항체 제작)
본 발명의 항체가 인간화 항체인 경우에는, Aβ의 독성 콘포머를 특이적으로 인식하는 비인간 동물 모노클로날 항체(예를 들면, IBL-102 모노클로날 항체)의 VH 및 VL의 CDR을 코딩하는 아미노산 서열을 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 이식한 V 영역을 코딩하는 DNA를 구축하고, 구축한 DNA를 인간 유래 면역 글로불린의 정상 영역 cDNA와 결합하여 발현 벡터에 포함하고, 적당한 숙주 세포에 상기 벡터를 도입하여 발현시킴으로써 얻을 수 있다(L. Rieohmann 등, Nature, 332, 323, 1988: Kettleborough, C. A. 등, Protein Eng., 4, 773-783, 1991; Clark M., I㎜unol. Today., 21, 397-402, 2000 참조). 비인간 동물 모노클로날 항체의 CDR은, 전술한 방법에 의해 얻어진 비인간 동물 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 DNA 서열로부터 예측되는 아미노산 서열과, 기지의 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열을 비교하여 얻을 수 있다. 기지의 항체의 아미노산 서열은, 예를 들면, 프로테인·데이터뱅크 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 항체의 아미노산 서열로부터 얻을 수 있다. 또한, 인간화 항체의 FR로서는, 이식 후의 항체가 본 발명의 효과를 얻을 수 있는 것이면 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 인간화 항체의 가변 영역(이하, 「V 영역」이라고 함)이 CDR이 유래하는 비인간 동물 모노클로날 항체의 V 영역과 유사한 입체 구조가 되는 인간 항체의 FR, 또는 사용하는 비인간 동물 모노클로날 항체의 FR의 아미노산 서열과 상동성이 높은 인간 항체 FR이다. 인간화 항체에 있어서, 인간 항체로부터 유래하는 FR을 구성하는 아미노산의 일부(특히, 입체적으로 CDR과 근접한 위치에 존재하는 아미노산)는, 필요에 따라 CDR이 유래하는 비인간 동물 모노클로날 항체의 FR 서열로 치환되어 있어도 된다(Queen 등, 미국 특허 제5585089호 참조). 사용하는 인간화 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA 서열은, 비인간 동물 모노클로날 항체의 CDR의 아미노산 서열과 인간 항체의 FR의 아미노산 서열을 결합한 아미노산 서열에 대응하는 DNA 서열로서 설계한다. 인간화 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA는, 설계한 DNA 서열을 바탕으로, 당업자 주지의 방법에 의해 제작할 수 있다.
(인간 항체)
인간 항체는, 예를 들면, 인간 항체 파지 라이브러리 또는 인간 항체 생산 트랜스제닉 마우스를 이용함으로써 얻을 수 있다(토미즈카 등, Nature Genet., 15, 146-156(1997)). 인간 항체 파지 라이브러리를 이용하는 경우, 예를 들면, E22P-Aβ42를 고상으로 고정화하고, 파지 항체 라이브러리를 반응시켜, 비결합의 파지를 세정 제거한 후, 결합한 파지를 회수함으로써, 원하는 클론을 얻을 수 있다(패닝(panning)). 인간 항체 생산 트랜스제닉 마우스는, 내인성(內因性) 면역 글로불린(Ig) 유전자를 녹아웃한 마우스에 인간 항체의 Ig 유전자를 도입한 마우스이다. 인간 항체 생산 트랜스제닉 마우스를 면역 동물로 하여, 전술한 본 발명의 항체 제작 방법에 준하여 항원(바람직하게는, E22P-Aβ42)을 면역함으로써, Aβ의 독성 콘포머를 특이적으로 인식하는 인간 항체를 얻을 수 있다.
(교차 반응율)
예를 들면, 본 발명의 항체는, 주반응(E22P-Aβ42에 대한 결합)에 대한, A21P-Aβ42, E22V-Aβ42, D23P-Aβ42, V24P-Aβ42, G25P-Aβ42, 및 M35P-Aβ42로부터 선택되는 1 종류 이상의 임의의 수(전체를 포함함)의 펩티드로의 결합의 교차 반응율이, 5% 이하, 3% 이하, 또는 1% 이하라도 된다. 또는, 본 발명의 항체는, 주반응(E22P-Aβ42에 대한 결합)에 대한, A21P-Aβ42, E22V-Aβ42, D23P-Aβ42, V24P-Aβ42, G25P-Aβ42, 및 M35P-Aβ42로부터 선택되는 1 종류 이상의 임의의 수(전체를 포함함)의 펩티드로의 결합의 교차 반응율이, 각각 순차적으로, 0.3% 이하, 0.3% 이하, 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.6% 이하, 및 0.7% 이하라도 되고, 또한 각각 순차적으로, 0.27% 이하, 0.28% 이하, 0.50% 이하, 0.33% 이하, 0.53% 이하, 및 0.68% 이하라도 된다.
따라서, 예를 들면, 상기 선택은, Aβ의 독성 콘포머와 그 이외의 구조를 가지는 Aβ(예를 들면, A21P-Aβ42, 및 E22V-Aβ42)와의 교차 반응성을 지표로 하여 행할 수 있다. 즉, 교차 반응율이 상기 범위 내에 포함되는 항체로서 선택할 수 있다. 교차 반응율은, 먼저, 측정 대상 희망의 측정계에 있어서, Aβ의 독성 콘포머(예를 들면, E22P-Aβ42, 또는 E22P-Aβ40)를 표준 물질로서 사용하여 검량선을 작성한 후에, 비독성 콘포머(예를 들면, A21P-Aβ42, 및 E22V-Aβ42)에 대하여 얻어진 측정값(예를 들면, 흡광도)을, Aβ의 독성 콘포머를 사용하여 작성한 검량선에 적용시켜 농도를 산출하고, 산출된 농도(실측값)/(비독성 콘포머의 실제 첨가 농도)×100(%)에 의해, 구할 수 있다. 교차 반응율의 결정 방법에서의 측정은, 항체 분자를 사용한 공지의 측정 방법이면 특별히 한정되지 않고, 후술하는 Aβ의 독성 콘포머의 측정 방법에 준하여 행할 수 있다.
(핵산, 벡터, 숙주 세포)
본 발명의 핵산은, 전술에 있어서 얻어진 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 클로닝하거나, 또는 전술에 있어서 얻어진 항체 또는 그의 면역 반응성 단편의 아미노산 서열을 바탕으로, 적절하게 핵산 서열을 설계함으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 벡터는, 얻어진 핵산을 적절하게 발현에 적합한 벡터에 포함함으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 벡터는, 본 발명의 핵산 외에, 발현에 필요한 영역(프로모터, 인핸서, 터미네이터 등)을 포함할 수도 있다. 또한, 본 발명의 숙주 세포는, 본 발명의 벡터를 적절한 세포주(예를 들면, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 대장균 등의 미생물)에 도입함으로써 얻을 수 있다.
(표지)
항체 또는 그의 면역 반응성 단편으로의 표지의 결합은 당 분야에 있어서 일반적인 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 단백질 또는 펩티드를 형광 표지하는 경우, 단백질 또는 펩티드를 인산 완충액으로 세정한 후, DMSO, 완충액 등으로 조정한 색소를 가하고, 혼합한 후 실온에서 10분간 정치(靜置)함으로써 결합시킬 수 있다. 또한, 시판 중인 표지 키트로서, 비오틴 표지 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, Biotin Labeling Kit-SH: 주식회사 도진 화학 연구소), 알칼리포스파타제 표지용 키트(Alkaline Phosphatase Labeling Kit-NH2, Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH: 주식회사 도진 화학 연구소), 퍼옥시다제 표지 키트(Peroxidase Labering Kit-NH2, Peroxidase Labering Kit-NH2: 주식회사 도진 화학 연구소), 피코빌리프로테인 표지 키트(Allophycocyanin Labeling Kit-NH2, Allophycocyanin Labeling Kit-SH, B-Phycoerythrin Labeling Kit-NH2, B-Phycoerythrin Labeling Kit-SH, R-Phycoerythrin Labeling Kit-NH2, R-Phycoerythrin Labeling Kit-SH: 주식회사 도진 화학 연구소), 형광 표지 키트(Fluorescein Labeling Kit-NH2, HiLyte Fluor(등록상표) 555 Labeling Kit-NH2, HiLyte Fluor(등록상표) 647 Labeling Kit-NH2: 주식회사 도진 화학 연구소), DyLight547, DyLight647(테크노케미컬 주식회사), Zenon(등록상표) Alexa Fluor(등록상표) 항체 표지 키트, Qdot(등록상표) 항체 표지 키트(인비트로겐사), EZ-Label Protein Labeling Kit(후나코시 주식회사) 등을 사용하여 표지할 수도 있다. 또한, 표지한 항체 또는 그의 단편의 검출은, 적절하게 표지에 적합한 기기를 사용함으로써 행할 수 있다.
(키트)
또한, 본 발명은, 전술한 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 함유하는, Aβ의 독성 콘포머 측정 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트는, 전술한 방법에 의해 제작한 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 사용하여, 목적에 따라 당업자에게 관용의 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
(Aβ의 독성 콘포머의 검출 및/또는 측정 방법)
다른 태양에 있어서, 본 발명은, Aβ의 독성 콘포머의 검출 및/또는 측정 방법에 관한 것이다. 본 발명의 Aβ의 독성 콘포머의 검출 및/또는 측정 방법은, 기본적인 구성으로서, 검체와 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 접촉시키는 스텝, 및, 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 결합한 Aβ의 독성 콘포머를 검출 및/또는 측정하는 스텝을 포함한다. 또한, 본 발명의 검출 및/또는 측정 방법은, 인비트로(in vitro) 및 인비보(in vivo) 중 어느 하나로 행해지는 것이라도 되지만, 바람직하게는, 인비트로(in vitro)로 행해진다. 예를 들면, 본 발명의 검출 및/또는 측정 방법은, 항체 분자를 사용한 공지의 검출 및/또는 측정 방법에 기초하여 행할 수 있다.
보다 구체적으로는, 본 발명의 검출 방법은, 예를 들면, 이하의 방법을 포함한다:
(a) Aβ의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 극히 특이적으로 인식하지만, Aβ의 다른 부위에서의 턴 구조는 인식하지 않는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편과 검체를 접촉시키는 스텝,
(b) 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 결합한 아밀로이드 β의 독성 콘포머를 검출하는 스텝;
(c) 상기 스텝에서 아밀로이드 β의 독성 콘포머가 검출된 경우에는, 검체 중에 아밀로이드 β의 독성 콘포머가 존재하는 것으로 판정하고, 상기 스텝에서 아밀로이드 β의 독성 콘포머가 검출되지 않은 경우에는, 검체 중에 아밀로이드 β의 독성 콘포머가 존재하지 않은 것으로 판정하는 스텝을 포함하는, 검체 중의 아밀로이드 β의 독성 콘포머의 존부를 결정하는 방법.
또한, 본 발명의 측정 방법은, 예를 들면, 이하의 방법을 포함한다:
(a) Aβ의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 극히 특이적으로 인식하지만, Aβ의 다른 부위에서의 턴 구조는 인식하지 않는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편과 검체를 접촉시키는 스텝;
(b) 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 결합한 아밀로이드 β의 독성 콘포머량을 측정하는 스텝;
(c) 상기 검출된 독성 콘포머량으로부터, 검체 중의 아밀로이드 β의 독성 콘포머의 레벨을 산출하는 스텝을 포함하는, 검체 중의 아밀로이드 β의 독성 콘포머의 레벨을 결정하는 방법.
본 발명의 측정 방법을 정량적으로 행하는 경우, 사전에 적절하게 기지의 농도로 단계 희석된 표준 물질(예를 들면, E22P-Aβ42)을 검체의 검출과 동시에 또는 따로따로 사용하여 검량선을 작성하고, 검체 중의 측정값으로부터 상기 검량선을 바탕으로 아밀로이드 β의 독성 콘포머의 농도를 계산하여 구할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「항체 또는 그의 면역 반응성 단편과 검체를 접촉시키는 스텝」 및 「검체 중의 아밀로이드 β의 독성 콘포머를 검출하고 또는 정량하는 스텝」은, 예를 들면, 샌드위치 ELISA로 행할 수 있다. 구체적으로는, 고상으로 고정화된 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 피험 시료(검체)를 접촉시키고, 세정 후, 검출 대상 물질(아밀로이드 β의 독성 콘포머)과 결합 가능한 표지화 항체를 첨가한 후, 비결합 항체를 세정에 의해 제거하고, 상기 항체의 표지를 검출 또는 표지량(또는 강도)을 측정함으로써 행할 수 있다. 또한, 이뮤노크로마토에 의해 행하는 경우에는, 고정화되어 있지 않은 검출 대상 물질(아밀로이드 β의 독성 콘포머)과 결합 가능한 표지화 항체에 검체를 접촉시킨 후, 상기 혼합물을 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편이 특정 부위에 고정화된 담체와 접촉시키고, 상기 부위에서의 상기 표지화 항체를 검출 또는 표지량(또는 강도)을 측정함으로써 행할 수 있다. 본 단락의 기재에 있어서는, 검출 대상 물질(아밀로이드 β의 독성 콘포머)과 결합 가능한 표지화 항체 대신, 표지화된 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 사용하고, 또한 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편 대신, 검출 대상 물질(아밀로이드 β의 독성 콘포머)과 결합 가능한 항체를 시용(試用)해도 된다.
또는, 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편은, 인비보(in vivo)에서의 Aβ의 독성 콘포머의 검출 및/또는 측정에 사용할 수도 있다. 예를 들면, 본 발명은, 형광 또는 방사성 물질로 표지한 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 생체 내에 투여하는 스텝, 생체 내에서의 상기 표지를 검출 및/또는 측정하는 스텝을 포함하는, 생체 내에서의 Aβ의 독성 콘포머의 검출 방법 또는 측정 방법을 포함한다. 예를 들면, 그 응용된 태양으로서, 본 발명은, 형광 또는 방사성 물질로 표지한 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 생체 내에 투여하는 스텝, 생체 내에서의 상기 표지를 검출하여 그 존재 위치를 결정하는 스텝을 포함하는, 생체 내에서의 Aβ의 독성 콘포머의 존재 위치의 결정 방법이라도 된다. 또는, 본 발명은, 형광 또는 방사성 물질로 표지한 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 생체 내에 투여하는 스텝, 생체 내에서의 상기 표지의 양 또는 강도를 측정하는 스텝, 측정된 표지량 또는 강도로부터 Aβ의 독성 콘포머의 레벨을 결정하는 스텝을 포함하는, 생체 내에서의 Aβ의 독성 콘포머량을 결정하는 방법이라도 된다. 또는, 본 발명은, 형광 또는 방사성 물질로 표지한 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 생체 내에 투여하는 스텝, 생체 내에서의 상기 표지의 존재 위치 및 양 또는 강도를 측정하는 스텝, 측정된 표지량 또는 강도로부터 Aβ의 독성 콘포머의 레벨을 결정하는 스텝, Aβ의 독성 콘포머의 존재 위치와 레벨을 상관시키는 스텝을 포함하는, 생체 내에서의 Aβ의 독성 콘포머의 존재 위치와 그 양을 결정하는 방법이라도 된다.
(AD의 진단 방법)
Aβ의 독성 콘포머는, AD의 발증 및 악화와 관련이 있다. 즉, 종래에는 Aβ40 또는 Aβ42의 레벨(총Aβ량)이 AD의 발증 및 악화와 관련인 있는 것으로 여겨져 왔지만, 현재는, 총Aβ량의 증가보다, 이들 Aβ 중 특정한 입체 구조(독성 콘포머)를 취하는 것의 증가가 AD 발증에 관여하는 것이 시사되어 있다. Aβ는 다양한 입체 구조를 취할 수 있는 것으로 알려져 있지만, 본 발명의 항체 및 그의 면역 반응성 단편은, Aβ의 독성 콘포머만을 극히 특이적으로 인식한다. 따라서, 본 발명의 항체 및 그의 면역 반응성 단편은, 보다 정확한 AD의 진단을 달성할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 전술한 본 발명의 항체 및 그의 면역 반응성 단편을 유효 성분으로서 함유하는, AD의 진단약을 포함한다. 또한, 본 발명은, 전술한 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 사용하여 Aβ의 독성 콘포머를 측정하는 것을 포함하는, AD의 진단 방법, AD의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법, AD 상태 또는 진행을 모니터링하는 방법, 및 후보 AD 치료약의 치료 효과의 판정 방법(이하, 총칭하여 「본 발명의 진단 방법 등」이라고 함)을 포함한다. 본 명세서 전체에 걸쳐, 「AD의 진단」 및 「AD를 진단한다」의 용어는, 이와 같이 해석하는 것이 부정합한 경우를 제외하고, 「AD의 진단을 위한 정보를 제공한다」, 「AD 상태 또는 진행의 모니터링」 및 「AD 상태 또는 진행을 모니터링한다」, 또는 「후보 AD 치료약의 치료 효과의 판정」 및 「후보 AD 치료약의 치료 효과를 판정한다」로 바꾸어 말할 수도 있다. 다른 태양에 있어서, 본 발명은, AD를 진단하기(또는, AD 상태 또는 진행을 모니터링하거나, 또는 후보 AD 치료약의 치료 효과를 판정하기) 위한, 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편의 사용을 포함한다. 또는, 본 발명은, AD를 진단하기(또는, AD 상태 또는 진행을 모니터링하거나, 또는 후보 AD 치료약의 치료 효과를 판정하기) 위한 약제 또는 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편의 사용에 관한 것이다.
본 명세서에 있어서, 「진단」의 용어는, 특별히 이와 같이 해석하는 것이 부정합한 경우를 제외하고, AD인지의 여부를 판정하고, 및/또는 AD의 중증도를 판정하는 것(협의의 진단) 외에, 그 목적에 따라, AD의 진단을 위한 정보를 제공하는 것, 또는 AD 상태 또는 진행을 모니터링하는 것으로 해석해도 된다. 본 발명의 진단 방법 등에서의, Aβ의 독성 콘포머의 존부의 검출 또는 레벨의 측정은, 예를 들면, 전술한 Aβ의 독성 콘포머의 측정 방법에 준하여 행할 수 있다.
본 발명의 AD의 진단 방법 등은, 검체 중의 Aβ의 독성 콘포머를 측정하는 스텝을 포함하고, Aβ의 독성 콘포머량을 지표로 하여 진단을 행한다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 진단 방법 등은, 이하의 방법을 포함한다:
a) 적어도 1개의 Aβ의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 극히 특이적으로 인식하지만, Aβ의 다른 부위에서의 턴 구조는 인식하지 않는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편과 피험자 유래의 검체를 접촉시키는 스텝,
b) 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 결합한 Aβ의 독성 콘포머를 측정하고, 측정값으로부터 Aβ의 독성 콘포머의 레벨을 결정하는 스텝, 및
c) 측정된 Aβ의 독성 콘포머의 레벨로부터, 상기 피험자에서의 AD 발증의 유무 또는 정도를 판정하는 스텝을 포함하는, AD의 진단 방법,
여기서, Aβ의 독성 콘포머의 레벨이 높은 피험자는, AD로 이환하고 있거나 또는 이환의 중증도가 높은 것으로 판정된다.
여기서, 본 발명의 진단 방법 등이 AD의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법인 경우, 이하의 방법을 포함한다:
a) 적어도 1개의 Aβ의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 극히 특이적으로 인식하지만, Aβ의 다른 부위에서의 턴 구조는 인식하지 않는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편과, 피험자 유래의 검체를 접촉시키는 스텝,
b) 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 결합한 Aβ의 독성 콘포머를 측정하고, 측정값으로부터 Aβ의 독성 콘포머의 레벨을 결정하는 스텝, 및
c) 측정된 Aβ의 독성 콘포머의 레벨로부터, 상기 피험자에서의 AD 발증의 유무 또는 정도를 판정한 결과의 정보를 제공하는 스텝을 포함하는, AD의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
여기서, Aβ의 독성 콘포머의 레벨이 높은 피험자는, AD로 이환하고 있거나 또는 이환의 중증도가 높은 것으로 판정된다.
또한, 본 발명의 진단 방법 등이 AD 상태 또는 진행을 모니터링하는 방법인 경우, 이하의 방법을 포함한다:
a) 적어도 1개의 Aβ의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 극히 특이적으로 인식하지만, Aβ의 다른 부위에서의 턴 구조는 인식하지 않는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편과, 피험자 유래의 검체를 접촉시키는 스텝,
b) 상기 검체 중의 Aβ의 독성 콘포머와 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편과의 결합을 측정하고, 측정값으로부터 Aβ의 독성 콘포머의 레벨을 결정하는 스텝, 및
c) 결정된 Aβ의 독성 콘포머의 레벨과, 상기 결정 이전에 상기 결정과는 별도로 동일한 방법에 의해 결정된 Aβ의 독성 콘포머의 레벨을 비교함으로써, 상기 피험자에서의 AD 발증의 변화를 판정하는 스텝을 포함하는 AD 상태 또는 진행을 모니터링하는 방법으로서,
여기서, 상기 결정 이전에 상기 결정과는 별도로 동일한 방법에 의해 결정된 Aβ의 독성 콘포머의 레벨과 비교하여, 결정된 Aβ의 독성 콘포머의 레벨이 상승한 경우에는, AD가 진행되고 있는 것으로 판정된다.
또한, 본 발명의 진단 방법 등에 있어서, Aβ의 독성 콘포머와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 면역 결합성 단편을 생체 내에 투여하는 경우, 화상 진단에 의해 진단할 수 있다. 화상 진단에 의해 측정하는 경우, 본 발명의 진단 방법 등은 이하의 방법을 포함한다:
a) 적어도 1개의 Aβ의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 극히 특이적으로 인식하지만, Aβ의 다른 부위에서의 턴 구조는 인식하지 않는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편이 투여된 피험자에 대하여, 화상 진단 장치(예를 들면, 신티그래피, PET 또는 SPECT 형식)를 사용하여 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편의 일부 이상의 화상을 생성시킴으로써, 생체 내에서의 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 검출 및/또는 측정하는 스텝,
b) 검출 및/또는 측정된 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편의 위치 또는 값(예를 들면, 강도)으로부터, 상기 피험자의 체내에서의 Aβ의 독성 콘포머의 존부, 국재, 및/또는 레벨을 결정하는 스텝, 및
c) Aβ의 독성 콘포머가 존재하고 또는 레벨이 높은 것으로 결정된 피험자, 뇌내에 있어서 Aβ의 독성 콘포머가 검출된 피험자, 또는 뇌내에서의 Aβ의 독성 콘포머의 레벨이 높은 피험자는, AD로 이환하고 있거나 또는 AD의 중증도가 높은 것으로 판정하는 스텝을 포함하는, AD의 진단 방법.
또는, 본 발명의 AD의 진단 방법 등은, 검체 중의 Aβ의 독성 콘포머를 측정하는 스텝을 포함하고, 또한 총Aβ량과 Aβ의 독성 콘포머량과 비를 지표로 하여 진단을 행한다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 진단 방법 등은, 이하의 방법을 포함한다:
이하의 스텝을 포함하는, AD의 진단 방법:
a) 피험자 유래의 시료와, 적어도 1개의 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 접촉시키는 스텝,
b) 상기 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편과 결합한, 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 결합하는 항원의 레벨을 측정하는 스텝,
c) Aβ의 구조 비특이적인 항Aβ 항체와 피험자 유래의 시료를 접촉시키고, 그 결합물의 양을 측정함으로써, 피험자 유래의 시료에서의 총Aβ량을 측정하는 스텝, 및
d) 피험자 유래의 시료에서의, 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 결합하는 항원의 레벨과 총Aβ의 레벨의 비를 계산하고, 결정된 비로부터, 상기 피험자에서의 AD의 유무 또는 정도를 판정하는 스텝,
여기서, 총Aβ의 레벨에 대한, 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 결합하는 항원의 레벨이 정상인 유래의 시료에서의 동일 비와 비교하여 높은 경우에는, AD로 이환하고 있을 가능성이 높은 것으로 판정되는, 방법.
총Aβ량과 Aβ의 독성 콘포머량의 비를 지표로 하여 진단을 행하는 방법은, 전술한 AD의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법, AD 상태 또는 진행을 모니터링하는 방법에 준한 방법으로 할 수도 있다.
본 발명의 진단 방법 등에서의 「판정 스텝」은, Aβ의 독성 콘포머의 레벨, 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량과 비를 이용하여 행할 수 있다. 본 발명의 진단 방법 등에 있어서 Aβ의 독성 콘포머의 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량과 비를 이용하는 경우, 판정 스텝은, 피험자에서의 Aβ의 독성 콘포머의 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량의 비를, 정상인, AD가 아닌 환자, 및/또는 AD가 아닌 것으로 믿어지고 있는 환자(이하, 총칭하여 「음성 비교 대조군」이라고 함)에서의 Aβ의 독성 콘포머의 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량와 비와 비교하는 것에 의해 행할 수 있다. 피험자 유래의 검체에서의 Aβ의 독성 콘포머의 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량의 비가, 이와 같은 음성 비교 대조군 유래의 검체에서의 Aβ의 독성 콘포머의 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량의 비보다 높은 경우에는, 「Aβ의 독성 콘포머레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량과 비가 높다」, 즉 AD로 이환하고 있는 또는 AD의 중증도가 높은 것으로 판정할 수 있고, 피험자 유래의 검체에서의 Aβ의 독성 콘포머의 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량과 비가, 이와 같은 비교 대조군 유래의 검체에서의 Aβ의 독성 콘포머의 레벨 또는 총Aβ량과 Aβ의 독성 콘포머량과 비와 비교하여 높지 않은(즉, 동등하거나 낮은) 경우에는, 「Aβ의 독성 콘포머 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량과 비가 높지 않다」, 즉 AD로 이환하고 있지 않거나 또는 AD의 중증도가 낮는 것으로 판정할 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 검체 중의 Aβ의 독성 콘포머의 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량과 비가, 각각, 비교 대조가 되는 검체에서의 Aβ의 독성 콘포머의 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량과 비보다 높은지의 여부는, 통계적 분석에 의해 결정할 수 있다. 통계학적 유의성은, 2 이상의 검체를 비교하여, 신뢰 구간 및/또는 p값을 결정함으로써 결정된다(Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiely & Sons, NewYord, 1983). 본 발명의 신뢰 구간은, 예를 들면, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 99.99%라도 된다. 또한, 본 발명의 p값은, 예를 들면, 0.1, 0.05, 0.025, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0002 또는 0.0001이라도 된다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 「비교 대조군」(양성·음성 포함함)에서의 Aβ의 독성 콘포머의 레벨은, 피험자에서의 Aβ의 독성 콘포머의 레벨의 측정과 마찬가지로 하여 측정할 수 있다. 또는, 이미 이와 같은 비교 대조군에 있어서 측정한 Aβ의 독성 콘포머의 레벨에 대한 정보가 있으면, 이와 같은 정보를 비교 대조군에서의 Aβ의 독성 콘포머의 레벨 또는 총Aβ량과 Aβ의 독성 콘포머량과 비로서 이용할 수도 있다.
또한, 판정 스텝은, 예를 들면, 사전에 얻어진 음성 비교 대조군에서의 Aβ의 독성 콘포머의 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량과 비, 및 AD 환자, 또는 AD인 것으로 믿어지고 있는 환자(이하, 총칭하여 「양성 비교 대조군」이라고 함)에서의 Aβ의 독성 콘포머의 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량과 비(및 그 AD 발증의 중증도에 대한 정보)로부터, Aβ의 독성 콘포머의 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량과 비에 대하여 AD 이환의 유무의 지표 또는 AD 이환의 중증도의 지표로서 임계값 레벨 또는 비를 설정하고, 피험자 유래의 검체에서의 Aβ의 독성 콘포머의 레벨을, 설정된 임계값 레벨 또는 비와 비교함으로써 행할 수도 있다.
특히, 「AD 이환의 중증도」로서 진단하는 경우, 판정 스텝은, 심플하게 사전에 얻어진 음성 비교 대조군 및 양성 비교 대조군에서의 Aβ의 독성 콘포머의 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량과 비와 비교하여, 동일한 정도의 β의 독성 콘포머 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량과 비를 나타낸 대조군의 AD의 중증도로서 진단할 수도 있다. 또는, 「AD 이환의 중증도」의 판정 스텝은, 동일한 정도의 AD 이환의 중증도에 대한 몇 개 그룹 군(클래스)(예를 들면, 중도(重度), 중(中) 정도, 경도(輕度), 미발증 등, 또는 인지 장애의 정도)을 설정함으로써 행할 수 있다. 즉, 사전에 얻어진 음성 비교 대조군 및 양성 비교 대조군에서의 Aβ의 독성 콘포머의 레벨 또는 총Aβ량과 Aβ의 독성 콘포머량과 비, 및, 양성 비교 대조군의 AD의 중증도에 대한 정보로부터, Aβ의 독성 콘포머의 임계값 레벨을 2 종류 이상 설정하고, 가장 낮은 임계값 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량과 비를 상한값으로 하는 그룹, 가장 가까운 2개의 임계값 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량과 비를 상한값·하한값으로 하는 그룹, 가장 높은 임계값 레벨을 하한값으로 하는 그룹의, 적어도 3개의 그룹을 작성하고, 각각의 그룹에 속하는 비교 대조군의 중증도(정상인, 미발증, 경도 AD, 중 정도 AD, 또는 중도 AD 등)를 상기 그룹의 중증도 클래스로서 결정함으로써, 각 클래스(그룹)에 대하여 AD 이환의 중증도를 대응시킨다. 피험자 유래의 검체에서의 Aβ의 독성 콘포머의 레벨을 측정하고, 상기 레벨이 포함되는 클래스를 결정하고, 결정된 클래스에 대응된 AD의 중증도 클래스를, 상기 피험자의 AD의 중증도로서 판정해도 된다. 전술에 있어서, 「AD 발증의 중증도에 대한 정보」는, 사전에 확립된 AD 발증에 대한 각종 지표를 사용하여 결정할 수 있다. 그리고, 상기 클래스 분류에 있어서는, Aβ의 독성 콘포머의 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량과 비가 높을수록, AD 발증의 중증도가 높은 클래스로서 분류된다.
전술한 바와 같은 임계값 레벨은, 감도가, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 또는 98 % 이상이 되도록 설정할 수 있다. 또한, 임계값 레벨은, 특이도가, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 또는 98 % 이상이 되도록 설정할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단 방법 등이 후보 AD 치료약의 치료 효과의 판정 방법인 경우, 이하의 방법을 포함한다:
a) 적어도 1개의 Aβ의 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에서의 턴 구조를 극히 특이적으로 인식하지만, Aβ의 다른 부위에서의 턴 구조는 인식하지 않는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편과, 후보 AD 치료약이 투여되어 있지 않은 피험자 유래의 검체, 및/또는, 후보 AD 치료약이 투여된 피험자 유래의 검체를, 각각 접촉시키는 스텝,
b) 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 결합한 Aβ의 독성 콘포머를 측정하고, 측정값으로부터 Aβ의 독성 콘포머의 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량과 비를 결정하는 스텝, 및
c) 후보 AD 치료약이 투여되어 있지 않은 피험자 유래의 검체, 및 후보 AD 치료약이 투여된 피험자 유래의 검체에서의 측정된 Aβ의 독성 콘포머의 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량과 비를 비교함으로써, 피험자에서의 후보 AD 치료약의 효과성을 판정하는 스텝을 포함하는 후보 AD 치료약의 치료 효과의 판정 방법으로서,
여기서, 후보 AD 치료약이 투여되어 있지 않은 피험자 유래의 검체와 비교하여, 후보 AD 치료약이 투여된 피험자 유래의 검체에 있어서 Aβ의 독성 콘포머의 레벨 또는 총Aβ량에 대한 Aβ의 독성 콘포머량과 비가 낮은 경우에는, 후보 AD 치료약에 AD 치료 효과가 있는 것으로 판정된다.
본 발명의 진단 방법 등은, 이미 AD의 지표로서 사용되고 있는 그 외의 지표와 조합하여 행할 수도 있다.
본 명세서에 있어서, 「AD」란, DSM-IV 분류에 의한 Alzheimer형 치매의 진단 기준(American Psychiatric Association: Diagnostid and statistical manual of mental disorders, 4th ed(DSM-IV). American Psychiatric Association, Washington D. C., 1994), 또는 NINCDS­ADRDA Work Group의 Alzheimer병의 임상 진단 기준(McKahann G et al: Clinical diagnosis of Alzheimer's disease-report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspieces of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's disease. Neurology 34: 939, 1984)에 의해, AD 또는 AD형 치매로 진단되는 것을 의미한다. 구체적으로는, 기억 장애 및 인지 기능의 장애(실어증, 실행증, 실인증 또는 실행 기능); 인지 장애에 의한 사회적 또는 직업적 기능의 현저한 장애 등; 완만한 발증과 지속적인 인지의 저하에 의해 특징지워지는 경과를 나타내고; 다른 중추신경 질환, 전신성 질환, 또는 외인성 물질에 의한 치매는 아니며; 상기 장애가, 의식 장애(섬망(delirium))의 기간 중에만 출현하는 것은 아니고; 상기 장애가 다른 주요 정신 질환에 의해 설명되지 않는 경우에는, AD 또는 AD형 치매로 진단될 수도 있다. 또는, 인지 기능 중 2개 이상의 장애가 일어나고, 기명력(記銘)과 다른 인지 기능이 진행성으로 악화되고, 의식 장애가 없으며, 치매의 원인이 되는 전신 질환이나 AD 이외의 뇌질환이 없는 경우에, AD 또는 AD형 치매로 진단될 수도 있다. 또는, 생검이나 부검으로 얻어진 뇌에서 병리 조직학적으로 AD를 확인할 수도 있다.
(레벨)
본 명세서 전체에 있어서, 「레벨」이란, 수치화된 존재량에 대한 지표를 의미하고, 예를 들면, 농도, 양 또는 그를 대신하여 사용할 수 있는 지표를 포함한다. 따라서, 레벨은 형광 강도 등의 측정값 그 자체라도 되고, 농도로 환산된 값이라도 된다. 또한, 레벨은, 절대적인 수치(존재량, 단위 면적당의 존재량 등)라도 되며, 또는 필요에 따라 설정된 비교 대조군과 비교한 상대적인 수치라도 된다.
(검체)
전술한 모든 본 발명의 방법에 있어서, 사용하는 검체는, 본 발명의 방법에 있어서 Aβ의 독성 콘포머를 측정 가능한 검체이면 특별히 한정되지 않으며, 이용 목적에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 있어서, 「검체」란, 세포 배양 상청액, 세포 용해물, 생검으로서 피험자로부터 채취한 조직 시료 또는 액체 등을 포함한다. 피험자 유래의 체액으로서는, 예를 들면, 혈액, 혈장, 혈청, 림프액, 뇨, 장액, 수액, 뇌척수액, 관절액, 안방수, 누액, 타액 등의 체액 또는 이들의 분획물 또는 처리물이 있다. 또한, 피험자 유래의 조직 시료로서는, 뇌 조직, 또는 뇌 조직 용해물을 예로 들 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 있어서 사용하는 검체는, 피험자 유래의 시료를 측정 시험에 앞서 전처리한 것이라도 되고, 피험자로부터 채취한 시료를 그대로 검체로서 사용해도 된다. 여기서, 피험자란, 인간 및 인간 이외의 동물을 포함한다. 또한, 본 발명의 방법에서의 분석은, 정성적, 정량적 또는 반정량적으로 행할 수 있다.
(항체 분자를 사용한 공지의 측정 방법)
항체 분자를 사용한 공지의 측정 방법 중, EIA법을 채용하는 경우, Aβ의 독성 콘포머와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 면역 결합성 단편과 검체 중의 Aβ의 독성 콘포머를 반응시킨 후, 상기 Aβ의 독성 콘포머와 결합하는 항체 또는 그의 면역 결합성 단편과, 상기 항체 또는 그의 면역 결합성 단편을 인식하는 표지화한 항체를 결합시키고, 비결합 항체를 제거한 후, 표지 물질에 적합한 방법으로 측정하여 형성된 복합체를 측정함으로써, Aβ의 독성 콘포머와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 면역 결합성 단편과 검체 중의 Aβ의 독성 콘포머와의 결합을 측정할 수 있다. 정량적인 측정을 행하는 경우에는, 사전에 농도가 판명되어 있는 표준 물질(E22P-Aβ42)을 단계 희석한 표준액을 이용하여 검량선을 작성하고, 상기 검량선으로부터 측정값에 해당하는 농도를 계산함으로써 결정할 수 있다.
이뮤노크로마토법에 의해 측정하는 경우, 검체를 표지 항체와 결합시킨 후, 니트로셀룰로오스 막의 모세관 현상을 이용한 크로마토그래피를 행하고, 고상화한 Aβ의 독성 콘포머와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 면역 결합성 단편과 결합시킴으로써 검출할 수 있다. 그리고, 이뮤노크로마토법에 있어서, 표지로서 금 콜로이드를 이용함으로써, 고상화 항체와 검체/표지 항체 복합체와의 결합을 육안에 의해 확인할 수도 있다.
(의약 조성물(치료약, 예방약) 및 인비보(in vivo) 검출 및/또는 측정용의 약제 또는 조성물)
본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편은, 필요에 따라 정제한 후, 통상적인 방법에 따라 제제화함으로써, 의약 조성물(AD의 치료약 및 예방약을 포함함) 또는 인비보(in vivo) 검출 및/또는 측정용의 약제 또는 조성물로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은, 의약 조성물(AD의 치료약 및 예방약을 포함함) 또는 인비보(in vivo) 검출 및/또는 측정용의 약제 또는 조성물을 제조하기 위한, 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편의 사용을 포함한다. 또는, 본 발명은, 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편의, AD의 치료 또는 예방 또는 인비보(in vivo) 검출 또는 측정을 위한 사용을 포함한다.
예를 들면, 본 발명의 의약 조성물(치료약 또는 예방약) 또는 인비보(in vivo) 검출 또는 측정용의 약제 또는 조성물은, 주사제로서 이용할 수 있고, 정맥주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 링겔 주사제 등의 제형을 포함한다. 이와 같은 주사제는, 공지의 방법에 따라, 예를 들면, 상기 항체 등을 통상 주사제에 사용되는 무균의 수성 또는 유성액에 용해, 현탁 또는 유화함으로써 조제할 수 있다. 주사용의 수성액으로서는, 예를 들면, 생리 식염수, 포도당, 수크로오스, 만니톨, 그 외의 보조약을 포함하는 등장액 등을 사용할 수 있고, 적당한 용해 보조제, 예를 들면, 알코올(예, 에탄올), 폴리알코올(예, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온 계면활성제[예, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, HCO-50(polyoxyethylene(50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)] 등과 병용할 수 있다. 유성액으로서는, 예를 들면, 참기름, 대두유 등을 사용할 수 있고, 용해 보조제로서 벤조산 벤질, 벤질 알코올 등과 병용할 수 있다. 조제된 주사액은, 통상, 적당한 앰플, 바이알, 시린지에 충전된다. 또한, 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 적당한 부형제를 첨가함으로써, 동결 건조 제제를 조제하고, 사용시, 주사 용수, 생리 식염수 등으로 용해하여 주사액으로 할 수도 있다. 그리고, 일반적으로 항체 등의 단백질의 경구 투여는 소화기에 의해 분해되기 때문에 곤란하게 되는 경우가 있지만, 항체 단편이나 수식한 항체 단편과 제형의 창의적인 연구에 의해, 경구 투여의 가능성도 있다. 경구 투여의 제제로서는, 예를 들면, 캡슐제, 정제, 시럽제, 과립제 등이 있다.
본 발명의 의약 조성물(치료약 또는 예방약) 또는 인비보(in vivo) 검출 또는 측정용의 약제 또는 조성물은, 활성 성분의 투여량에 적합한 투약 단위의 제형으로 조제되는 것이 바람직하다. 이와 같은 투약 단위의 제형으로서는, 주사제(앰플, 바이알, 프리필드시린지)가 예시되며, 투약 단위 제형당 통상 5∼500 mg, 5∼100 mg, 10∼250 mg의 본 발명의 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 함유하고 있어도 된다.
본 발명의 의약 조성물(치료약 또는 예방약) 또는 인비보(in vivo) 검출 또는 측정용의 약제 또는 조성물의 투여는, 국소적이라도 되고, 전신적이라도 된다. 투여 방법에는 특별히 제한은 없고, 전술한 바와 같이 비경구적 또는 경구적으로 투여된다. 비경구적 투여 경로로서는, 피하, 복강내, 혈중(정맥내, 또는 동맥내) 또는 척수액으로의 주사 또는 링겔 등을 예로 들 수 있고, 바람직하게는 혈중으로의 투여이다. 본 발명의 의약 조성물(치료약 또는 예방약) 또는 인비보(in vivo) 검출 또는 측정용의 약제 또는 조성물은, 일시적으로 투여해도 되고, 지속적 또는 단속적(斷續的)으로 투여해도 된다. 예를 들면, 투여는, 1분∼2주일 지속적으로 투여할 수도 있다.
본 발명의 의약 조성물의 투여량은, 원하는 치료 효과 또는 예방 효과를 얻을 수 있는 투여량이면 특별히 한정은 없고, 증상, 성별, 연령 등에 따라 적절하게 결정할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물의 투여량은, 예를 들면, AD의 치료 효과 또는 예방 효과를 지표로 하여 결정할 수 있다. 예를 들면, AD 환자의 예방 및/또는 치료를 위해 사용하는 경우에는, 본 발명의 의약 조성물의 유효 성분의 1회량으로서, 통상 0.01∼20 mg/kg체중 정도, 바람직하게는 0.1∼10 mg/kg체중 정도, 더욱 바람직하게는 0.1∼5 mg/kg체중 정도를, 1개월 1∼10 회 정도, 바람직하게는 1개월 1∼5 회 정도, 정맥주사에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 다른 비경구 투여 및 경구 투여의 경우도 이에 준하는 양을 투여할 수 있다. 증상이 특히 심한 경우에는, 그 증상에 따라, 증량 또는 투여 횟수를 증가시켜도 된다.
또한, 본 발명의 인비보(in vivo) 검출 또는 측정용의 약제 또는 조성물의 투여량은, 원하는 검출, 측정 또는 진단이 가능한 투여량이면 특별히 한정은 없고, 증상, 성별, 연령 등에 따라 적절하게 결정할 수 있다. 예를 들면, AD 환자의 진단을 위해 사용하는 경우에는, 본 발명의 인비보(in vivo) 검출 또는 측정용의 약제 또는 조성물의 유효 성분의 1회량으로서, 통상 0.01∼20 mg/kg체중 정도, 바람직하게는 0.1∼10 mg/kg체중 정도, 더욱 바람직하게는 0.1∼5 mg/kg체중 정도를, 1회∼수회 정도, 정맥 주사에 의해 투여할 수 있다. 다른 비경구 투여 및 경구 투여의 경우도 이에 준하는 양을 투여할 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위해 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이것으로 한정되는 것은 아니다. 그리고, 본원 전체를 통해 인용되는 전체 문헌은 참조에 의해 그대로 본원에 원용된다.
(실시예 1) Aβ42의 22번 위치 및 23번 위치에 턴 구조를 가지는 독성 콘포머에 대한 항체의 제작
실시예 1의 실험에 있어서, 마우스의 유지 및 실험은, 면역 생물 연구소의 동물 보호 위원회의 승인을 받은 프로토콜에 따라 행하였다. G9C, E22P-Aβ9-35 및 E22P-Aβ9-35의 분자량은 MALDI-TOF-MS를 사용하여 확인하였다(K. Murakami 등(2010) ACS. Chem. Neurosci., 1: 747-756).
보고되어 있는 방법(K. Murakami 등(2002) Biochem. Biophys. Res. Co㎜un., 294: 5-10; K. Murakami 등(2007) ChemBioChem, 8: 2308-2314)에 따라, G9C, E22P-Aβ9-35 펩티드(CYEVHHQKLVFFAPDVGSNKGAIIGLM: 서열 번호 1)를 합성하여, 면역원으로서 사용하였다. N말단에는, 9번째의 글리신 대신 시스테인을 부가하고, 캐리어(carrier) 단백질인 소 사이로글로불린과 결합시켰다(Y. Horikoshi 등(2004) Biochem. Biophys. Res. Co㎜un., 319: 733-737). BALB/c 마우스(일본 찰스 리버 주식회사, 일본)를, 50 mg/마우스의 G9C, E22P Aβ9-35펩티드 융합체로 1주에 1회, 1개월간 면역했다. 얻어진 클론은, 50 mg/mL의 다양한 항체 변이체로 코팅된 96 웰의 Maxisorp 플레이트(Nunc사, 덴마크) 중, 실온에서 1시간 배양한 후, 서양 와사비퍼옥시다제 결합 항마우스 IgG 항체(시그마사, 세인트루이스, 미주리주, 미국)로 처리하고, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(Pierce사, 록필드, 일리노이주, 미국) 또는 o-페닐렌디아민 이염산염 기질(시그마사)로 정량했다. 얻어진 45 클론을, 22번 위치 및 23번 위치에 β-턴 구조를 취하는 경향이 있는 Aβ 변이체(E22Q-Aβ42, E22G-Aβ42, E22K-Aβ42, E22P-Aβ42, 및 D23N-Aβ42)(K. Murakami 등(2003) J. Biol. Chem., 278: 46179-46187)로의 결합능이 높은 클론을 스크리닝하고, 선택된 클론을 서브클로닝했다. 스크리닝을 반복하여, 양성도가 낮거나 또는 위양성의 클론을 제외했다. 얻어진 클론에 대하여, 웨스턴블롯에 의해 더욱 스크리닝을 행함으로써, 클론 IBL-102를 얻었다.
(실시예 2) IBL-102 항체의 결합 특이성의 측정 1
얻어진 클론 IBL-102가 생산하는 모노클로날 항체(이하, IBL-102 항체」라고 함)의, 다음의 각 항원으로의 결합능을 엔자임이뮤노어세이에 의해 측정하였다: 22, 23 락탐-Aβ, E22P-Aβ42, E22G-Aβ42, E22G-Aβ40, E22K-Aβ42, E22Q-Aβ40, E22Δ-Aβ42, E22Δ-Aβ40, 25, 26 락탐-Aβ, A21P-Aβ42, E22V-Aβ42, D23P-Aβ42, V24P-Aβ42, G25P-Aβ42, M35P-Aβ42, 야생형 Aβ38, 야생형 Aβ40, 야생형 Aβ42, recom. Aβ42, 야생형 Aβ43, 및 야생형 Aβ46. 구체적으로는, 1μg/웰의 82E1 항체(Aβ 서열의 1-16 잔기(턴 구조 부분이 아님)를 인식한다; Y. Horikoshi 등(2004) Biochem Biophys Res Co㎜un. 2004 Jul 2; 319(3): 733-7. 참조; 이하 동일함)를 0.1 M 탄산 완충액으로 고상화(코팅)한 96 웰 플레이트에, 4000, 1000, 250, 62.5 pg/mL의 상기 각 항원, 또는 컨트롤로서 0.1%(w/v) BSA를 첨가하였다. 4℃에서 하룻밤 정치한 후, 웰의 반응액을 제거하고, 세정하였다. 각 웰에 호스래디시퍼옥시다제(HRP) 표지 항Aβ 마우스 모노클로날 항체 IBL-102를 100μL 첨가하였다. 4℃에서 60분간 정치한 후, 웰의 반응액을 제거하고, 세정하였다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질액을 100μL 첨가하고, 차광하여 실온에서 30분간 정치한 후, 1N H2SO4를 100μL 부가하여 발색 반응을 정지시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
IBL-102 항체의 상기 각 항원으로의 결합능을 측정한 결과를 표 1에 나타내었다. 수치는, 표 1은 450 nm에서의 흡광도를 나타낸다. IBL-102 항체는 E22P-Aβ42에 극히 특이적인 면역 반응성을 나타내고, 그 외의 항원에 대해서는 낮은 어피니티를 나타낸다. 이 결과는, IBL-102 항체는 22번 위치 및 23번 위치에 턴 구조를 가지는 Aβ42만을 매우 특이적으로 인식하는 것을 나타내고 있다. 표 1에 나타낸 E22P-Aβ42의 데이터로부터 검량선을 작성하고, A21P-Aβ42, E22V-Aβ42, D23P-Aβ42, V24P-Aβ42, G25P-Aβ42, 및 M35P-Aβ42의 각각에 대하여 4000 pg/mL를 측정한 OD 값을 작성한 검량선에 적용시켜 E22P로서의 농도를 산출하고, 실제로 측정한 농도(4000 pg/mL)와의 비(%)로서 교차 반응율을 구하였다. 그 결과, IBL-102 항체의 주반응(E22P-Aβ42에 대한 결합)에 대한, A21P-Aβ42, E22V-Aβ42, D23P-Aβ42, V24P-Aβ42, G25P-Aβ42, 및 M35P-Aβ42로의 교차 반응율은, 각각 순차적으로, 0.27%, 0.28%, 0.50%, 0.33%, 0.53%, 및 0.68%였다.
[표 1]
Figure pct00001
(실시예 3) IBL-102 항체의 결합 특이성의 측정 2
얻어진 모노클로날 항체 IBL-102(이하, IBL-102 항체」라고 함)의, 다음의 각 항원으로의 결합능을 엔자임이뮤노어세이에 의해 측정하였다: E22P-Aβ42, E22V-Aβ42, 야생형 Aβ42, 야생형 Aβ40, 및 컨트롤로서의 우혈청 알부민(BSA). 각 항원을 고상용 완충액(0.1M 탄산 완충액 PH 9.5)으로 50 ng/well의 농도로 ELISA용 96 웰 플레이트에 가하고, 4℃에서 하룻밤 반응시키고 고상화시켰다. PBS로 세정한 후, 블로킹액(1% BSA, 0.05% Tween 20/PBS)에 의해 블로킹했다. 이와 같이 하여 각 항원을 고상화한 후, IBL-102 항체를, 1, 0.5, 0.25, 0.125 μg/mL의 농도로 희석하고, 50μL/웰로 각 고상 항원에 가한다. 37℃, 30분간의 반응 후, 세정하고, 표지 항체(Anti-Mouse IgG (H＋L) Goat Fab'-HRP)를 50μL/웰 가하고, 37℃, 30분간 반응 후, 세정하였다. 발색용 기질액(o-페닐렌디아민 이염산염; OPD)을 가하여 발색(차광하여 실온, 15분간), 정지액(1N H2SO4)을 가하여 정지시킨 후, 490 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 컨트롤로서 IBL-101 항체(#10379, Anti-Human Amyloidβ E22P(11A1) Mouse IgG MoAb 주식회사 면역 생물 연구소, 일본)도 마찬가지로 시험했다.
IBL-102 항체와 IBL-101 항체의 상기 각 항원으로의 결합능을 측정한 결과를 표 2에 나타내었다. 수치는 490 nm에서의 흡광도를 나타낸다. IBL-102 항체는 E22P-Aβ42에 극히 특이적인 면역 반응성을 나타내고, 그 외의 항원에 대해서는 낮은 어피니티를 나타낸다. IBL-101 항체는 E22V-Aβ42, 야생형 Aβ42, 야생형 Aβ40등에 대해서도 약하게 반응하는 데 비해, 이 결과는, IBL-102 항체는 22번 위치 및 23번 위치에 턴 구조를 가지는 Aβ42만을 매우 특이적으로 인식하는 것을 나타내고 있다.
[표 2]
Figure pct00002
(실시예 4) IBL-102 항체를 이용한 알츠하이머병 환자의 진단
쿄토부립 의과 대학 신경 내과에서 진찰한 인지증 환자에서 문서에 의한 동의를 얻은 후 수액을 채취한 환자 중, 그 후의 임상 경과 및 화상 진단 등에 의해 AD로 진단된 환자를 AD 환자로 하였다. 또한, 다양한 신경 질환의 진단의 과정에서 수액 검사를 행하고, 그 검체를 연구 목적으로 사용하는 것에 대하여 문서에 의한 동의를 얻은 환자를 대조군(정상인)으로 하였다. 수액 샘플은, 이하의 방법에 의해 채취하였다. 공복 시에 요추천자(lumbar puncture)에 의해 뇌척수액을 멸균 개별 포장 스피츠(spitz)(아시아 기재, PP 스크루스피츠 15 mL)로부터 직접 채취하였다.
96 웰 플레이트에 항Aβ 마우스 모노클로날 82E1 항체(인간 Aβ의 N말단(1∼16 번째의 아미노산)을 인식하는 항체; Horikoshi Y 등, Biochem Biophys Res Co㎜un. (2004) 319(3): 733-7; 주식회사 면역 생물 연구소, #10323. 이하 동일함)를 1μg/웰로 0.1M 탄산 완충액을 사용하여 고상화(코팅)했다. 검체, 단계 희석한 표준 물질(E22P Aβ-40 dimer), 및 희석용 완충액(블랭크)을 각 100μL 각각의 웰에 넣었다. 4℃에서 하룻밤 정치한 후, 웰의 반응액을 제거하고, 세정하였다. 각 웰에 HRP 표지 항Aβ 마우스 모노클로날 항체 IBL-102를 100μL 첨가하였다. 4℃에서 60분 정치한 후, 웰의 반응액을 제거하고, 세정하였다. TMB 기질액을 100μL 첨가하고, 차광하고 실온에서 30분 정치한 후, 1N H2SO4를 100μL로 하여 발색 반응을 정지시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 표준 물질에 의해 얻어진 검량선을 사용하여, 각 샘플 중의 독성 콘포머를 가지는 Aβ의 양을 결정했다.
또한, 이미 보고된 방법에 의해, 동일한 수액 샘플 중의 Aβ42의 양을 측정하고, 전체 Aβ42의 양을 결정했다. 결정된 전체 Aβ42량에 대한, 독성 콘포머를 가지는 Aβ의 양을 계산하고, AD 발증과의 상관 관계를 조사하였다.
알츠하이머병 환자(AD) 및 정상인(Control) 유래의 뇌척수액 중에서의, IBL-102 항체와 결합하는 물질(Aβ의 독성 콘포머: ToxicAβ)을 측정한 결과를 도 1에 나타낸다. 또한, 동일한 뇌척수액 중에서의 전체 Aβ42, 및 전체 Aβ42의 양에 대한, 독성 콘포머를 가지는 Aβ의 양의 비를 산출한 결과를 도 14에 나타낸다. AD 환자에서는 IBL-102 항체를 사용함으로써, ToxicAβ 레벨이 높은 값을 나타낸 것에 비해, 정상인에서는 ToxicAβ 레벨은 낮은 값을 나타낸다. Mann Whitney test에 의해 검정한 결과, P=0.0635였다. 이와 같은 AD 환자와 정상인에서의 명확한 차이는 IBL-101 항체에서는 발견할 수 없었다(도시하지 않음). 또한, 이 차이는 전체 Aβ42의 양에 대한, 독성 콘포머를 가지는 Aβ의 양의 비로서 산출하면 보다 현저한 것으로 나타났다. 즉, AD 환자의 전체 Aβ42의 양에 대한, 독성 콘포머를 가지는 Aβ의 양의 비는, 비AD 환자의 동일 비보다 유의하게(p< 0.05) 높은 것으로 나타났다. 따라서, IBL-102 항체는, AD의 진단에 이용 가능한 것이 나타났다.
(실시예 5) IBL-102 항체의 Aβ42 유도 신경 세포 독성으로의 효과
IBL-102 항체가 Aβ42의 세포 독성을 억제할 수 있는지의 여부를 결정하기 위하여, 래트 프라이머리 뉴런에서의 Aβ42 유도 신경 세포 독성을 MTT 어세이에 의해 평가하였다(K. Murakami 등(2003) J. Biol. Chem., 278: 46179-46187). 배양한 래트 프라이머리 뉴런에, 1μM의 야생형 Aβ42 또는 E22P-Aβ42를 첨가하여 세포 독성 자극을 주었다. 세포 독성 자극 비첨가군을 컨트롤군(자극 없음)으로 하였다. Aβ42 또는 E22P-Aβ42 첨가 후, 피검 약제로서, 각각 0.1 mg/mL의 IBL-102 항체 및 IgG 항체(음성 컨트롤군)를 첨가하였다. 항체 비첨가군을 컨트롤군(약제 없음)으로 하였다. 37℃에서 4일간 배양했다. 사용한 Aβ의 농도는, 야생형 Aβ42의 IC50값에 가까운 10-6 M로 하였다. 통계학적인 유의차는, 1원 배치 분산 분석 후의 Tukey's test에 의해 평가했다.
결과를 도 2에 나타낸다. 1μM의 야생형 Aβ42 및 E22P-Aβ42로 처리한 래트 프라이머리 뉴런은, 컨트롤 세포와 비교하여 낮은 생존능을 나타낸다. IBL-102 항체를 첨가함으로써, Aβ42 및 E22P-Aβ42의 세포 독성이 저해되었다. 따라서, IBL-102 항체는, Aβ42 및 Aβ의 독성 콘포머에 의한 세포 독성을 현저하게 저해할 수 있는 것으로 나타났다.
(실시예 6) AD 모델 마우스(촉진형 APP 트랜스제닉 마우스) 뇌의 면역 염색
AD 모델 마우스로서, APP 트랜스제닉 마우스, Tg2576(K. Hsiao 등(1996) Science, 274: 99-102)에 Aβ42 생산 효소인 Presenilin2를 과잉 발현시킨 마우스, PS2, Tg2576(T. Toda 등(2011) J. Biomed. Biotech., 2011, 617974)을 사용하였다. 디에틸에테르 마취 하에서 마우스의 뇌를 적출하고, 4% 파라포름알데히드(Paraform aldehyde)에 의해 고정하였다. 파라핀에 의해 포매(包埋)하고, 5㎛의 두께로 얇게 절단함으로써 절편을 제작하였다. 절편은 탈파라핀 처리, 친수화 처리 후, 포름산에 의해 항원을 활력화하고, 내인성 퍼옥시다제를 불활성화한 후, 혈청 블로킹을 행하였다. 1차 항체로서, 1μg/ml 또는 5μg/ml의 82E1(양성 대조군), 5μg/ml 또는 20μg/ml의 IBL-101 및 5μg/ml 또는 20μg/ml의 IBL-102를 4℃에서 하룻밤 반응시키고, 세정한 후, 2차 항체로서 비오틴화 항마우스 IgG 항체를 사용하여 실온에서 반응시켰다. 아비딘비오틴 복합체 키트를 사용하여 면역 반응 강도를 증강하고, 3,3'-디아미노벤지딘(3,3'-Diaminobenzidine)에 의해 염색했다.
결과를 도 3에 나타낸다. 양성 대조군인 82E1은, 1μg/ml 및 5μg/ml의 농도에서의 적용에 의해 노인반을 명료하게 염색했다. IBL-101은, 5μg/ml에서의 적용에 의해, 노인반에 더하여 뇌실질(腦實質)의 염색이 관찰되고, 20μg/ml에서의 적용에서는 염색성이 증강되었다. 한편, IBL-102는, 5μg/ml 및 20μg/ml의 어느 농도에서의 적응에 있어서도, 노인반 및 뇌실질의 염색은 관찰되지 않았다. IBL-102는, IBL-101과 달리 노인반에는 반응하지 않고, 특징적인 반응성을 나타내는 것이 밝혀졌다.
(실시예 7) AD 모델 마우스(촉진형 APP 트랜스제닉 마우스)에서의 약효 평가 시험
AD 모델 마우스로서, PS2, Tg2576을 사용하였다. 마우스 탄생을 0일째로 하고, 3개월째부터 항체 투여를 개시하고, 6개월째에 행동 시험을 행하였다. 투여 항체로서는, IgG, IBL-101 항체, 및 IBL-102 항체를 사용하였다(각 군 n=5∼9). 각 항체는, 10 mg/kg의 투여량으로, 주 1회의 빈도로 3개월간 투여를 행하였다.
평가는, 신경 증상의 행동 평가로서, Elevated plus-maze test, Nesting test를 행하였다. 또한, 병리학적 평가로서, 노인반의 면역 조직 화학 염색(82E1 항체를 사용), 및 ELISA에 의한 뇌내(가용성 획분 및 불용해성 획분)의 Aβ량의 측정을 행하였다. 가용성 획분 및 불용해성 획분의 조제는 통상적인 방법에 따라 행하였다. 통계학적인 유의차는, 1원 배치 분산 분석 후의 Tukey's test에 의해 평가했다.
Elevated plus-maze test의 결과를 도 4에 나타낸다. PS2, Tg2576은, IgG 투여군에 있어서 Closed arm으로의 지향성의 저하를 나타낸다. 이와 같은 신경 증상은, IBL-101의 투여에서는 개선될 수 없었지만, IBL-102의 투여에서는 현저한 개선을 나타낸다. 이상의 결과는, 독성 콘포머에 대한 선택성의 높이가, AD의 항체 치료에는 중요하며, 선택성이 높은 IBL-102는 현저한 치료·예방 효과를 나타내는 것으로 나타났다.
Nesting test의 결과를 도 5에 나타낸다. Nesting test는, 사방 6 cm의 정사각형의 종이편 10장이 들어간 케이지에 마우스를 넣고, 4일 후의 둥지 만들기의 모습을 이하의 기준에 따라 스코어링함으로써 행하였다. 스코어 0: 둥지 만들기 없음(No Nesting); 스코어 1: 모서리에 모든 세편(細片)을 모음(Gather all strips at a corner); 스코어 2: 모서리에 모든 세편을 모아서 작업함(Gather and process all strips); 스코어 3: 모아서 미세한 단편으로 찢음(Gather and tear to small pieces). PS2, Tg2576은, IgG 투여군에 있어서 둥지 만들기 스코어의 저하를 나타낸다. 이와 같은 신경 증상은, IBL-101의 투여에서는 개선되지 않았지만, IBL-102의 투여에서는 개선을 나타낸다. 이상의 결과는, 독성 콘포머에 대한 선택성의 높이가, AD의 항체 치료에는 중요하며, 선택성이 높은 IBL-102는 치료·예방 효과를 나타내는 것으로 나타났다.
노인반의 면역 염색의 결과를 도 6(뇌) 및 도 7(해마)에 나타낸다. PS2, Tg2576의 뇌내 및 해마에서는, IgG 투여군에 있어서 노인반의 존재가 확인되었다. 이 노인반의 침착을, IBL-101 및 IBL-102의 투여는, 억제할 수 없었다. 이상의 결과로부터, IBL-101 및 IBL-102는 노인반의 수를 감소시키는 효과는 없는 것이 밝혀졌다. 또한 IBL-102는, 노인반의 수와는 관계없이 신경 증상을 개선한 것으로 여겨진다.
ELISA에 의한 뇌내의 Aβ량을 측정한 결과를 도 8에 나타낸다. PS2, Tg2576의 뇌내에서는, IgG 투여군에 있어서 Aβ40 및 Aβ42가 검출되었다. 이 Aβ40 및 Aβ42를, IBL-101 및 IBL-102의 투여는, 감소시킬 수는 없었다. 이상의 결과로부터, IBL-101 및 IBL-102는 뇌내의 Aβ40 및 Aβ42의 총량을 감소시키는 효과는 없는 것이 밝혀졌다. 또한 IBL-102는, Aβ40 및 Aβ42의 총량과는 관계없이 신경 증상을 개선한 것으로 여겨진다.
(실시예 8) IBL-102 항체의 배열 결정
IBL-102 항체의 유전자 서열을 결정하기 위하여, 중쇄(이하, 「Hc」라고 함) 및 경쇄(이하, 「Lc」라고 함)의 클로닝을 행하였다. IBL-102 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 mRNA를 추출하고, cDNA를 제작하였다. 통상적인 방법에 따라, 5'-Rapid amplification cDNA end(5'-RACE)를 행하고, Hc 및 Lc 유전자의 5'말단의 염기 서열을 결정했다. Hc, Lc에 특이적인 프라이머(primer)를 사용하여, 각각의 전체 길이 cDNA를 클로닝했다. 결정된 Hc 및 Lc의 유전자 서열은 도 9(서열 번호 1 및 서열 번호 8), 아미노산 서열(시그널 배열을 포함함)은 도 10(서열 번호 2 및 서열 번호 9)에 각각 기재된 바와 같았다. 또한, IBL-102 항체의 VH 및 VL의 배열은, 각각 순차적으로 서열 번호 4 및 서열 번호 11에 기재된 바와 같았다. 또한, IBL-102 항체의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 배열은, 각각 순차적으로, 서열 번호 5, 6, 7, 12, 13, 및 14에 기재된 바와 같았다.
(실시예 9) BIACORE에 의한 해리 상수의 측정
IBL-102 항체 및 IBL-101 항체에 대하여, 상기 항체와 항원과의 해리 상수(KD)를 BIACORE(GE 헬스케어 바이오사이언스 주식회사, BIACORE-X100)를 사용하여 측정하였다. BIACORE(GE 헬스케어 바이오사이언스 주식회사, BIACORE-X100)의 매뉴얼에 따라, SA 칩에 비오틴화 E22P-Aβ42 또는 비오틴화 야생형 Aβ42를 고정 후, IBL-101 항체 또는 IBL-102 항체를 흐르게 하고, 결합 속도 상수 Ka1, 해리 속도 상수 Kd1을 측정하고, bivalent 피팅을 사용하여 결합 상수 KD값을 결정했다.
Ka1, Kd1, 및 KD 값의 결과를 이하의 표 3에 나타내었다. 이하와 같이, IBL-102 항체는 IBL-101 항체와 비교하여, E22P-Aβ42 및 E22P-Aβ42 다이머에 강하게 결합하였다.
[표 3]
Figure pct00003
(실시예 10) Aβ중합체로의 결합능 측정
Aβ는 서로 결합하여 올리고머로 되는 것에 의해 독성을 가지는 것으로 여겨지고 있다. IBL-102 항체의 Aβ 올리고머로의 결합을 조사하기 위하여, 다음의 각 항원으로의 결합능을 엔자임이뮤노어세이에 의해 측정하였다: 야생형 Aβ42; E22P-Aβ42; E22P, V40L, LDap-Aβ42 다이머; 및 E22P, A」30L, LDap-Aβ40 다이머. 각 항원을 고상용 완충액(0.1M 탄산 완충액 PH 9.5)으로 50 ng/well의 농도로 ELISA용 96 웰 플레이트에 가하고, 4℃에서 하룻밤 반응시켜 고상화시켰다. PBS로 세정한 후, 블로킹액(1% BSA, 0.05% Tween 20/PBS)에 의해 블로킹했다. 이와 같이 하여 각 항원을 고상화한 후, IBL-102 항체를, 1, 0.5, 0.25, 0.125 μg/mL의 농도로 희석하고, 100μL/웰로 각 고상 항원에 가한다. 실온에서, 60분간의 반응 후, 세정하고, 표지 항체(Anti-Mouse IgG (H＋L) Goat Fab'-HRP)를 50μL/웰 가하고, 실온에서 60분간 반응시킨 후, 세정하였다. 발색용 기질액(o-페닐렌디아민 이염산염; OPD)을 가하여 발색(차광하여 실온, 30분간), 정지액(2N H2SO4)을 가하여 정지시킨 후, 492 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 컨트롤로서 IBL-101 항체 및 4G8 항체(Aβ 서열의 18-22 잔기(턴 구조 부분이 아님)에 에피토프를 가지는 모노클로날 항체; H. M. Wisniewski 등(1989) Acta. Neuropathol., 78: 22-27)도 마찬가지로 시험했다.
결과를 도 11에 나타낸다. IBL-101 항체는, 야생형의 Aβ42, E22P-Aβ42의 모노머, E22P, V40L, LDap-Aβ42의 다이머, E22P, V40L, LDap-Aβ40의 다이머 중 어느 것과도 거의 동등한 약한 결합력을 나타낸다. 이에 비해, IBL-102 항체는, 야생형의 Aβ42로의 결합력은 IBL-101과 동등하지만, E22P-Aβ42의 모노머에 강하게 결합하고, 또한 E22P, V40L, LDap-Aβ42의 다이머, 및 E22P, V40L, LDap-Aβ40의 다이머에는 더욱 강하게 결합하였다. 컨트롤로서 사용한 4G8 항체는, 야생형의 Aβ42에는 강하게 결합하지만, E22P 변이형의 Aβ42에는 약하게 밖에 결합하지 않았다. 이러한 사실로부터, IBL-102 항체가 Aβ 올리고머와 특이적으로 강하게 결합하는 것으로 나타났다.
(실시예 11) 백신 단회 투여 시험
IBL-102 항체의 정맥 내로의 단회 투여의 효과에 대하여 조사하기 위하여, 18 개월령(月齡)의 AD 모델 마우스 Tg2576에 IBL-102 항체를 투여했다. 실험의 스케줄을 도 12에 나타낸다. 첫회 항체 투여로부터 1주일 간격으로 합계 2회, IBL-102 항체(10-20 mg/kg) 또는 PBS를 교호적(交互的)으로 투여했다. 마우스를 A군 및 B군의 2군(각 n=7)으로 나누고, A군에는, 첫회: IBL-102 항체, 2회째: PBS를 투여하고, B군에는, 첫회: PBS, 2회째: IBL-102 항체를 투여했다. 첫회 및 2회째 투여 전(Pre test) 및 후(Post test)에 행동 시험을 행하여, 항체 투여에 의한 효과를 조사하였다. 행동 시험은, 신규 물체에 대한 접촉 시간(냄새를 맡고 있는 시간)을 계측하고, 대조군 마우스(약령(弱齡) B6)와의 비교에 의해 호기심의 지표를 스코어화했다. 구체적으로는, 재탐색 스코어(Re-exploring score)는, IBL-102 투여군 또는 PBS 투여군의 각각의 개체의 (Post test에서의 접촉 횟수)/(Pre test에서의 접촉 횟수)를, 대조 마우스군의 (Post test에서의 접촉 횟수)/(Pre test에서의 접촉 횟수)의 평균값으로 나누어 구하였다. 첫회와 2회째 투여의 행동 시험에서는, 상이한 물체를 사용하였다.
결과를 도 13에 나타낸다. PBS 투여군에 있어서는, Pre test에서 한 번 접촉된 것을 잊고, Post test에 있어서 재차 동일한 물체를 신규 물체로 인식하여 탐색 행동을 취한 마우스가 대조군과 비교하여 많았는 데 비해, IBL-102 항체를 투여함으로써, Pre test에서 한 번 접촉된 물체에는 접촉하지 않는 마우스의 수가 증가했다. 이러한 사실로부터, IBL-102 항체의 투여는 Aβ에 의한 기억 장애를 개선하는 것으로 나타났다.
(실시예 12) IBL-102 항체의 결합 특이성의 측정 3
IBL-102 항체와 IBL-101 항체의, 다음의 각 항원으로의 결합능을 엔자임이뮤노어세이에 의해 측정하고, 비교하였다: 야생형 Aβ40, 야생형 Aβ42, E22P-Aβ42, E22V-Aβ42, G33P-Aβ42, L34P-Aβ42, L34P-Aβ42, V36P-Aβ42, G37P-Aβ42, G38P-Aβ42, V39P-Aβ42, V40P-Aβ42, I41P-Aβ42. 구체적으로는, 1μg/웰의 82E1 항체(Aβ 서열의 1-16 잔기(턴 구조 부분이 아님)를 인식한다; Y. Horikoshi 등(2004) Biochem Biophys Res Co㎜un. 2004 Jul 2; 319(3): 733-7. 참조; 이하 동일함)을 0.1 M 탄산 완충액으로 고상화(코팅)한 96 웰 플레이트에, 2.5μg/웰의 상기 각 항원을 첨가하였다. 실온에서 2시간 정치한 후, 웰의 반응액을 제거하고, 세정한 후, 4℃에서 하룻밤 블로킹했다. 각 웰에 항Aβ 마우스 모노클로날 항체 IBL-101 및 HRP 표지 항Aβ 마우스 모노클로날 항체 IBL-102를 100μL 첨가하였다(120, 60, 30, 15 ng/mL). 실온에서 60분간 정치한 후, 웰의 반응액을 제거하고, 세정한 후, HRP 표지 2차 항체를 실온에서 1 시간 반응시켰다. o-페닐렌디아민(OPD) 기질액을 100μL 첨가하고, 차광하고 실온에서 30분간 정치한 후, 2M H2SO4를 50μL 가하여 발색 반응을 정지시켰다. 492 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
IBL-102 항체와 IBL-101 항체의 상기 각 항원으로의 결합능을 측정하고, 비교한 결과를 도 15에 나타낸다. 수치는, 492 nm에서의 흡광도를 나타낸다. IBL-102 항체는 E22P-Aβ42에 극히 특이적인 면역 반응성을 나타내고, 그 외의 항원에 대해서는 낮은 어피니티를 나타낸다. 이 결과는, IBL-102 항체는 22번 위치 및 23번 위치에 턴 구조를 가지는 Aβ42만을 매우 특이적으로 인식하는 것을 나타낸다.
(실시예 13) 백신 단회 투여 시험(IgG 컨트롤군)
IBL-102 항체의 정맥 내로의 단회 투여의 효과에 대하여 조사하기 위하여, 16-19 개월령의 AD 모델 마우스 Tg2576에 IBL-102 항체를 투여했다. 야생형 마우스 및 Tg2576에 대하여, 2개의 매우 유사한 물체 A1 및 A2를 1일 10분간씩 3일간 기억시켰다. 그 다음날, 야생형 마우스에는 PBS를, Tg2576에는 IgG 또는 IBL-102(20 mg/kg)를 투여했다. 투여한 다음날, 2개의 기억시킨 물체 A1 및 A2 중, 한쪽(A1) 및 신규한 물체 B의 2개에 대한 마우스의 접촉 횟수를 계수하고, 각각, (물체 A1으로의 접촉 횟수)/((물체 A1으로의 접촉 횟수)＋(물체 B로의 접촉 횟수)) 및 (물체 B로의 접촉 횟수)/((물체 A1으로의 접촉 횟수)＋(물체 B로의 접촉 횟수))를, 마우스의 기억력의 지표로서 평가했다.
결과를 도 16에 나타낸다. 야생형 마우스에서는, 신기 물체(Novel: B)에 대하여 유의하게 높은 지향성을 나타내지만(p=0.0003), IgG 투여 Tg2576에서는 그 경향이 관찰되지 않아, 기억력의 저하를 나타낸다. 한편, IBL-102 투여 Tg2576은, 신기 물체에 대한 유의한 지향성을 나타내고(p=0.0002), 기억력의 저하를 나타내지 않았다. 이러한 사실로부터, IBL-102 항체의 투여는 Aβ에 의한 기억 장애를 개선하는 것으로 나타났다.
SEQUENCE LISTING <110> Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. Kyoto University National University Corporation Chiba University <120> An antibody that very specifically recognize turn structure at positions 22 and 23 of amyloid beta <130> PW15017IB <150> JP2014-251898 <151> 2012-12-12 <150> JP2015-104411 <151> 2015-05-22 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1483 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody <220> <221> CDS <222> (69)..(1454) <220> <221> sig_peptide <222> (69)..(126) <400> 1 ctacagcgtt tacttaagct tggtaccgag ctcggatcca ctagtccagt gtggtggaat 60 tcctaacc atg gga tgg agc tgg atc ttt ctc ctc ttc ctg tca gga act 110 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Leu Phe Leu Ser Gly Thr 1 5 10 gca ggt gtc ctc tct gag gtc cag ctg caa cag tct gga cct gag ctg 158 Ala Gly Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 15 20 25 30 gtg aag cct ggg gct tca gtg aag ata ttc tgc aag gct tct gga tac 206 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Phe Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 act ttc act gac tac aat atg gac tgg gtg aag cag agt cat 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His Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 3 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hc without signal peptide <400> 3 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Phe Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Val Thr Ile Asp Asn Pro Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Ser Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Pro Asp Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Gln His 180 185 190 Leu Ala Gln Pro Asp Arg His Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro 210 215 220 Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp 260 265 270 Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser 305 310 315 320 Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 325 330 335 Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln 340 345 350 Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe 355 360 365 Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu 370 375 380 Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe 385 390 395 400 Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn 405 410 415 Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 420 425 430 Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 4 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 4 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Phe Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Val Thr Ile Asp Asn Pro Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Ser Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Pro Asp Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 <400> 5 Asp Tyr Asn Met Asp 1 5 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 <400> 6 Asp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Val Thr Ile Asp Asn Pro Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 <400> 7 Leu Pro Asp Asn Tyr Val Met Asp Tyr 1 5 <210> 8 <211> 820 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody <220> <221> CDS <222> (73)..(789) <220> <221> sig_peptide <222> (73)..(92) <400> 8 cataccaagc gttttactta gcttggtacc gagctcggat ccactagtcc agtgtgggtg 60 gaattcctca aa atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg 111 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp 1 5 10 att cct gct tcc agc agt gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc tcc 159 Ile Pro Ala Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser 15 20 25 ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tgt agt 207 Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Cys Ser 30 35 40 45 cag agc ctt gta cac aga aat gga aac acc aat tta cat tgg tac ctg 255 Gln Ser Leu Val His Arg Asn Gly Asn Thr Asn Leu His Trp Tyr Leu 50 55 60 cag aag tca ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac 303 Gln Lys Ser Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn 65 70 75 cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca 351 Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 80 85 90 gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt 399 Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val 95 100 105 tat ttc tgc tct caa agt aca tat gtt ccg ctc acg ttc ggt gtt ggg 447 Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Val Gly 110 115 120 125 acc aag ctg gag ctg aaa cgg gct gat gct gca cca act gta tcc atc 495 Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile 130 135 140 ttc cca cca tcc agt gag cag tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg 543 Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val 145 150 155 tgc ttc ttg aac aac ttc tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aag 591 Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys 160 165 170 att gat ggc agt gaa cga caa aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat 639 Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp 175 180 185 cag gac agc aaa gac agc acc tac agc atg agc agc acc ctc acg ttg 687 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu 190 195 200 205 acc aag gac gag tat gaa cga cat aac agc tat acc tgt gag gcc act 735 Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr 210 215 220 cac aag aca tca act tca ccc att gtc aag agc ttc aac agg aat gag 783 His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu 225 230 235 tgt tag gcgggccgct cgagtctaga gggcccgttt a 820 Cys <210> 9 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Cys Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Val His Arg Asn Gly Asn Thr Asn Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Ser 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 Ser Gln Ser Thr Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Val Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly 165 170 175 Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp 195 200 205 Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr 210 215 220 Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 10 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lc without sigal peptide <400> 10 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Cys Ser Gln Ser Leu Val His Arg 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Asn Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Val Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 11 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 11 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Cys Ser Gln Ser Leu Val His Arg 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Asn Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Val Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 <400> 12 Arg Cys Ser Gln Ser Leu Val His Arg Asn Gly Asn Thr Asn Leu His 1 5 10 15 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 <400> 13 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 <400> 14 Ser Gln Ser Thr Tyr Val Pro Leu Thr 1 5

Claims (33)

  1. 22번 위치 및 23번 위치의 아미노산에 턴(turn) 구조를 가지는 Aβ를 극히 특이적으로 인식하지만, 다른 구조를 가지는 Aβ는 인식하지 않는, 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    Aβ의 올리고머를 인식하는, 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
  3. 제2항에 있어서,
    Aβ의 올리고머가 다이머(dimer)인, 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    Aβ가 Aβ42인, 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    Aβ의 다른 구조가, 적어도, 하기 군으로부터 선택되는 1 종류 이상의 구조를 포함하는, 항체 또는 그의 면역 반응성 단편:
    Aβ의 21번 위치 및 22번 위치의 아미노산에서의 턴 구조, Aβ의 23번 위치 및 24번 위치의 아미노산에서의 턴 구조, Aβ의 24번 위치 및 25번 위치의 아미노산에서의 턴 구조, Aβ의 25번 위치 및 26번 위치의 아미노산에서의 턴 구조, 및 Aβ의 35번 위치 및 36번 위치의 아미노산에서의 턴 구조.
  6. VH가, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가지고, 또한, VL이 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체가 결합하는 에피토프를 극히 특이적으로 인식하지만, VH가, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가지고, 또한, VL이 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체가 결합하지 않는 에피토프를 인식하지 않는, 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
  7. VH가, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가지고, 또한, VL이 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체와 그 항원과의 결합을 경합(競合) 저해하지만, VH가, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가지고, 또한, VL이 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체가 결합하지 않는 에피토프에는 결합하지 않는, 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
  8. 중쇄(重鎖) 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3가, 각각, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 및 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
  9. 제8항에 있어서,
    경쇄(輕鎖) 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3가, 각각, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 및 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3가, 각각, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 및 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
  11. 제10항에 있어서,
    경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3가, 각각, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 및 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
  12. VH가, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
  13. 제12항에 있어서,
    VL이 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 면역 반응성 단편.
  14. 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 코딩하는, 핵산 분자.
  15. 제14항에 있어서,
    서열 번호 1의 126번째∼479번째의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산 분자인, 핵산 분자.
  16. 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 코딩하는, 핵산 분자.
  17. 제16항에 있어서,
    서열 번호 8의 130번째∼465번째의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산 분자인, 핵산 분자.
  18. 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편, 및/또는, 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 발현 가능한, 벡터.
  19. 제18항에 있어서,
    제14항 또는 제15항에 기재된 핵산 분자, 및/또는, 제16항 또는 제17항에 기재된 핵산 분자를 함유하는, 벡터.
  20. 제18항 또는 제19항에 기재된 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  21. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 함유하는, 의약 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    AD의 예방용, 치료용 또는 개선용인, 의약 조성물.
  23. 제21항에 있어서,
    AD 환자의 인지 기능을 개선하기 위한, 의약 조성물.
  24. 제21항에 있어서,
    AD 환자의 기억 장애를 개선하기 위한, 의약 조성물.
  25. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 함유하는, 진단용 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    AD의 진단에 사용하기 위한, 진단용 조성물.
  27. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 함유하는, Aβ의 독성 콘포머(toxic conformer)를 측정하기 위한 키트.
  28. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 함유하는, Aβ의 독성 콘포머의 측정에 사용하기 위한 조성물.
  29. 검체(檢體)와 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 접촉시키는 단계를 포함하는, 검체 중에서의 Aβ의 독성 콘포머레벨의 측정 방법.
  30. AD의 진단 방법으로서,
    a) 피험자 유래의 시료와, 적어도 1개의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 인비트로(in vitro)로 접촉시키는 단계,
    b) 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편과 결합한 항원의 레벨을 측정하는 단계 및
    c) 결정된 항원 레벨로부터, 상기 피험자에서의 AD의 유무 또는 정도를 진단하는 단계를 포함하고,
    여기서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 결합하는 항원의 레벨이 정상인 유래의 시료에서의 동일 레벨과 비교하여 높은 경우에는, AD로 이환(罹患)하고 있을 가능성이 높은 것으로 진단되는, 방법.
  31. AD의 진단 방법으로서,
    a) 피험자 유래의 시료와, 적어도 1개의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편을 접촉시키는 단계,
    b) 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편과 결합한 항원의 레벨을 측정하는 단계,
    c) Aβ의 구조 비특이적인 항Aβ 항체와 피험자 유래의 시료를 접촉시키고, 그 결합물의 양을 측정함으로써, 피험자 유래의 시료에서의 총Aβ량을 측정하는 단계 및
    d) 피험자 유래의 시료에서의, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 결합하는 항원의 레벨과 총Aβ의 레벨의 비를 계산하고, 결정된 비로부터, 상기 피험자에서의 AD의 유무 또는 정도를 판정하는 단계를 포함하고,
    여기서, 총Aβ의 레벨에 대한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 결합하는 항원의 레벨이 정상인 유래의 시료에서의 동일 비와 비교하여 높은 경우에는, AD로 이환하고 있을 가능성이 높은 것으로 판정되는, 방법.
  32. 검체 중의 아밀로이드 β의 독성 콘포머의 존부(存否)를 결정하는 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편과 검체를 접촉시키는 단계,
    (b) 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 결합한 아밀로이드 β의 독성 콘포머를 검출하는 단계 및
    (c) 상기 단계에서 아밀로이드 β의 독성 콘포머가 검출된 경우에는, 검체 중에 아밀로이드 β의 독성 콘포머가 존재하는 것으로 판정하고, 상기 단계에서 아밀로이드 β의 독성 콘포머가 검출되지 않은 경우에는, 검체 중에 아밀로이드 β의 독성 콘포머가 존재하지 않은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 검체 중의 아밀로이드 β의 독성 콘포머의 레벨을 결정하는 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 면역 반응성 단편과 검체를 접촉시키는 단계,
    (b) 상기 항체 또는 그의 면역 반응성 단편에 결합한 아밀로이드 β의 독성 콘포머량을 측정하는 단계 및
    (c) 상기 검출된 독성 콘포머량으로부터, 검체 중의 아밀로이드 β의 독성 콘포머의 레벨을 산출하는 단계를 포함하는, 방법.
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