KR20170078445A - 필터를 이용한 미생물 신속 검출 방법 - Google Patents

필터를 이용한 미생물 신속 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 필터를 이용한 미생물 검출 방법에 관한 것으로, 고가의 장비 없이 미생물을 신속하게 검출하는 방법을 제공한다.

Description

필터를 이용한 미생물 신속 검출 방법{A METHOD FOR RAPIDLY DETECTING MICROORGANISM USING PCR PRODUCT}
본 발명은 필터를 이용한 미생물 검출 방법에 관한 것으로, 식중독 유발균을 포함하는 다양한 미생물을 신속하게 검출하는 방법을 제공한다.
식중독은 발열, 구역질, 구토, 설사 및 복통 등의 증세를 동반하는 질환으로서 세균성 식중독이 대부분이다. 세균성 식중독은 발병 형태에 따라 감염형, 독소형으로 분류된다.
감염형 식중독은 병원성 미생물에 오염된 식품의 섭취에 의해 미생물이 장 내에서 증식하여 발병하는 것으로, 살모넬라(Salmonella spp), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio paraheamolyticus), 대장균 O157(Escherichia coli O157:H7) 등이 주된 원인균이다.
독소형 식중독은 식품에 증식하는 병원성 미생물이 생산한 독소를 섭취함으로써 발병할 수 있다. 이 경우 원인균이 식품 내에서 이미 사멸되었더라도 독소의 존재에 의해 발병할 수 있으며, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 클로스트리디움 보튤리넘(Clostridiumbotulinum)이 주요 원인균이다.
식중독은 단체 급식의 확대 또는 외식의 증가 등 생활 패턴의 변화와 지구의 온난화 현상에 의해 발생 비율이 증가하고 있으며, 규모 역시 집단화, 대형화되고 있으므로, 원인균을 조기에 발견하는 것이 중요하다.
그럼에도 불구하고 식중독 유발균을 포함하는 병원성 미생물은 통상적으로 고전적인 배지법에 의해 검출되고 있으며, 상기 방법은 장시간의 증균 과정 및 분석 기간이 소요되므로 신속한 검출 결과를 담보할 수 없다.
상기 문제점을 극복하기 위하여 효소중합연쇄반응(PCR)이 적용되고 있으나, 양성인지 판단하기 위하여 전기영동법을 수행하여야 하며, 이를 위해서는 추가 장비와 시간이 소요되므로 신속한 진단에 적합하지 않다.
그 외에도 식중독균을 검출하기 위하여 리포좀을 이용한 화학 발광 면역센서, 실시간 폴리머라제 연쇄반응(PCR), 수정발진자 마이크로밸런스(QCM), 표면플라즈몬 공명(SPR) 등을 이용한 면역 센서법이 개발되고 있으나, 이러한 방법들은 103cfu/ml 이상의 낮은 검출감도로 인해 실용성이 낮다(Yacoub-George, E. et al., Analytica Chimica Acta 457, 3-12, 2002, Ho, J. A., et al., Analytical Biochemistry, 339, 342-349, 2004, Wu, V. C.H. et al., Biosensors and Bioelectronics 22, 2967-2975, 2007, Fu, Z. et al., International Journal of Food Microbiology 99, 47-57, 2005, Yang, L. et al., Analytical Chemistry, 76, 1107-1113, 2004, Waswa, J., et al., LWT, 40, 187-192, 2007).
따라서, 식품에 존재하는 미생물은 농도가 매우 낮아 검출기술이 요하는 최소한의 미생물 농도에 도달하기까지 배양해야 하기 때문에 많은 시간이 소요되는 한계가 있으므로 이를 단축시키기 위한 다양한 기술이 개발되고 있다.
본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 고가의 장비 없이 미생물을 신속하게 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면은 (a) 탄소원 및 질소원을 포함하는 제1 배양액에 피검시료를 투입하고 균질화하는 단계; (b) 여과필터를 이용하여 상기 피검시료 내의 미생물을 여과하는 단계; (c) 피루빈산(pyruvate) 및 계면활성제를 포함하는 제2 배양액을 이용하여 상기 여과된 미생물을 분리하는 단계; 및 (d) 상기 미생물을 탐지하는 단계;를 포함하는 미생물의 신속 검출 방법을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 제1 배양액 및 상기 피검시료는 10 내지 15 : 1 내지 2의 중량비로 혼합될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 제1 배양액은 탄소원 2.0 내지 10.0%(w/v), 질소원 0.1 내지 1.0%(w/v)를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 여과필터는 셀룰로오스계 필터일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 여과필터는 질산셀룰로오스(Cellulose Nitrate), 초산셀룰로오스(Cellulose Acetate), 또는 셀룰로오스 혼합 에스테르(Mixed Cellulose Ester) 필터일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 (c) 단계에서 상기 제2 배양액은 효모 추출물(yeast extract)을 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 (c) 단계는 상기 여과필터를 상기 제2 배양액에 투입하고 스토마칭(stomaching)하거나 초음파를 조사하여 수행될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 배양액 및 상기 제2 배양액은 20 내지 30 : 1 내지 3의 중량비로 수행될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 (c) 단계 이후 상기 분리된 미생물을 배양하여 증식시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 미생물의 신속 검출 방법은 고가의 장비 없이 피검시료 내의 미생물을 농축하여 신속하게 검출한계에 도달할 수 있으므로 휴대성이 우수하고 현장에서 즉시 미생물의 존부를 탐지할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미생물의 신속 검출 방법을 도식화 한 것이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위하여서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.
본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.
본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따른 미생물의 신속 검출 방법은 (a) 탄소원 및 질소원을 포함하는 제1 배양액에 피검시료를 투입하고 균질화하는 단계; (b) 여과필터를 이용하여 상기 피검시료 내의 미생물을 여과하는 단계; (c) 피루빈산(pyruvate) 및 계면활성제를 포함하는 제2 배양액을 이용하여 상기 여과된 미생물을 분리하는 단계; 및 (d) 상기 미생물을 탐지하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 피검시료는 균질화 후 필터에 의해 여과되어 상기 피검 시료내의 미생물이 농축될 수 있다. 상기 피검시료는 미생물에 의한 오염 여부를 평가하기 위하여 대상물로부터 일부가 분리될 수 있다. 상기 피검시료의 종류는 특별히 제한되지 아니하나 식중독 등 질병을 유발할 수 있는 미생물에 의한 오염이 의심되는 식품을 지칭할 수 있다.
상기 미생물은 식품에서 증식하여 섭취 시 식중독을 유발할 수 있는 미생물로서, 대장균 O157(E. coli O157:H7), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 열시니아 엔테리콜리티카(Yersinia entericolitica), 클로스트리디움 보튤리넘(Clostridiumbotulinum), 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens), 살모넬라 속 균주(Salmonella spp .), 또는 쉬겔라 속 균주(Shigella spp .)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식품은 고형물, 액체(예컨대, 용액, 분산물, 에멀젼, 현탁액) 또는 반고형 식용 조성물일 수 있다. 상기 식품은 육류, 가금류, 난류, 생선, 해산물, 야채류, 과일류, 조리 식품(예컨대, 수프, 소스, 페이스트), 곡물 제품(예컨대, 곡분, 시리얼, 빵), 통조림, 밀크, 기타 유제품(예컨대, 치즈, 요구르트, 사워 크림), 지방, 오일, 디저트, 양념류, 향신료, 파스타, 음료, 물, 동물 사료일 수 있으나, 식용으로서 섭취될 수 있으면 그 종류가 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 (a) 단계에서 탄소원 및 질소원을 포함하는 제1 배양액에 피검시료를 투입하고 균질화할 수 있다. 상기 (a) 단계는 상기 피검시료에 존재하는 미생물을 배양액에서 전배양함으로써 이후 미생물의 증식을 촉진할 수 있으며, 상기 피검시료는 액상의 배양액에 현탁되므로 상기 여과필터에 의해 회수될 수 있다.
상기 제1 배양액은 미생물이 에너지원으로 사용할 수 있는 탄소원 및 질소원 등 영양성분을 포함하므로, 상기 피검시료에 포함된 미생물은 이후 단계에서 활발한 대사작용으로 인하여 단시간 내에 최대 개체수(약 1010/mL)에 도달할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 배양액은 탄소원 2.0 내지 10.0%(w/v), 질소원 0.1 내지 1.0%(w/v)를 포함할 수 있다. 상기 제1 배양액은 통상적인 미생물들이 공통적으로 이용 가능한 에너지원으로 포함하나, 상기 에너지원의 함량이 과소한 경우 미생물이 효과적으로 증식되지 않을 수 있으며, 과다한 경우에는 에너지원의 함량에 따라 미생물의 성장이 비례하지 않아 비용 효율이 저하될 수 있다.
상기 (a) 단계에서 상기 피검시료가 상기 제1 배양액 내에서 미세한 입자상으로 균일하게 분산될 수 있도록 균질화할 수 있다. 상기 피검시료는 미세한 크기로 분쇄되어 상기 제1 배양액에 투입될 수 있으며, 호모게나이져(homogenizer), 스토마쳐(stomacher), 초음파 분산기 등 다양한 균질화 장치에 의해서 상기 배양액 내에 균일하게 분포될 수 있다.
한편, 상기 (a) 단계에서 상기 제1 배양액 및 상기 피검시료는 10 내지 15 : 1 내지 2의 중량비로 혼합될 수 있다. 상기 제1 배양액의 비율이 과소한 경우 피검시료가 상기 제1 배양액 내에서 균일하게 분산되지 않아 여과 효율 저하되고 미생물의 성장이 둔화될 수 있으며, 상기 제1 배양액의 비율이 과다한 경우 시간 및 비용 효율이 저하될 수 있다.
상기 (b) 단계에서 여과필터를 이용하여 상기 피검시료 내의 미생물을 여과할 수 있다. 상기 (b) 단계에서 상기 제1 배양액에 균일하게 분산된 고형의 미세입자를 여과하여 피검시료에 포함된 미생물을 효과적으로 회수할 수 있다.
상기 필터는 미세한 기공크기를 가지고 미생물을 포함한 고형의 성분을 여과할 수 있으면 그 종류가 특별히 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게는 셀룰로오스계 필터일 수 있다. 상기 셀룰로오스계 필터는 질산셀룰로오스(Cellulose Nitrate), 초산셀룰로오스(Cellulose Acetate), 또는 셀룰로오스 혼합 에스테르(Mixed Cellulose Ester) 필터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 셀룰로오스계 필터는 섬유질의 극성 성분이 미생물과 정전기적으로 상호 작용하고 섬유층이 복수층으로 형성되어 있으므로 여과 효율이 우수하다. 특히, 상기 셀룰로오스계 필터는 섬유질의 3차원적 망상 구조로 인해 결정화도가 높고 기계적 강도, 흡착성, 보수성, 현탁 안정성, 결착성이 우수하므로 상기 미생물의 여과에 적합하다.
상기 (c) 단계에서 피루빈산(pyruvate) 및 계면활성제를 포함하는 제2 배양액을 이용하여 상기 여과된 미생물을 분리할 수 있다.
상기 제2 배양액은 상기 피루빈산(pyruvate)을 포함하므로 상기 (a) 단계의 균질화 과정에서 손상된 세포의 회복을 촉진할 수 있으며, 상기 단계에서 미생물의 증식을 현저히 증대시킬 수 있다. 상기 제2 배양액은 상기 피루빈산과 함께 펩톤(Peptone), 성장 인자 등 미생물의 성장을 촉진시킬 수 있는 다양한 첨가제를 더 포함할 수 있다.
상기 계면활성제는 계면의 경계를 완화시키므로 상기 여과필터에 흡착되어 있는 고형의 성분이 외력에 의해 용이하게 이탈될 수 있도록 한다. 상기 계면활성제는 크레모포르(Cremophor), 트윈(Tween)-20, 트윈-80, 솔루톨(Solutol), 트리톤(Triton), 펩타이드(예컨대, 히스톤, 프로타민), 지질, 리간드, 탄수화물, 핵산, 소분자, 생체적합성 중합체를 포함할 수 있으나, 바람직하게는 트윈-20, 또는 트윈-80일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 (c) 단계에서 상기 제2 배양액은 효모 추출물(yeast extract)을 더 포함할 수 있다.
상기 제2 배양액은 상기 피루빈산 및 계면활성제를 포함하므로, 상기 여과필터에 흡착된 미생물이 용이하게 상기 제2 배양액으로 이탈될 수 있으며, 상기 미생물의 에너지원으로서 효모 추출물을 포함하므로 아미노산, 비타민 등 영양분이 풍부하여 미생물의 증식을 촉진할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 (c) 단계는 상기 여과필터를 상기 제2 배양액에 투입하고 스토마칭(stomaching)하거나 초음파를 조사하여 수행될 수 있다.
상기 스토마칭은 통상적으로 스토마쳐(stomacher) 장치에 의해 수행되는 것으로 상기 제2 배양액에 상기 여과필터를 투입한 후 일정 주파수 및 진폭으로 진동시킴으로써 상기 여과필터에 흡착된 미생물을 이탈시킬 수 있다. 또한, 상기 초음파는 초음파 발생기에 의해 조사될 수 있으며, 상기 초음파의 진동수는 15KHz 내지 25KHz, 진폭은 5 내지 50㎛일 수 있다. 상기 초음파는 상기 범위 내에서 상기 여과필터를 효과적으로 진동시켜 흡착된 고형성분을 효율적으로 탈리시킬 수 있다.
한편, 상기 제1 배양액 및 상기 제2 배양액은 20 내지 30 : 1 내지 3의 중량비로 수행될 수 있다.
상기 다량의 제1 배양액에 피검시료를 투입하고 여과한 후, 상대적으로 소량의 제2 배양액에서 분리함으로써 배양액 내의 미생물의 밀도 및 미생물 증식 속도가 현저히 증가될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 피검시료 250mL를 여과한 후 제2 배양액 2.5mL에 여과필터를 재부유 시킴으로써, 미생물이 약 100배 이상 농축될 수 있다.
상기 (c) 단계 이후 상기 분리된 미생물을 배양하여 증식시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 증식 방법은 특별히 제한되지 않으며 상기 분리된 미생물을 별개의 액체 배지에 투입하고 종래 알려진 방법으로 배양함으로써 수행될 수 있다.
한편, 상기 (d) 단계에서 상기 농축 및 증식된 미생물을 탐지할 수 있다. 상기 미생물은 종래에 널리 알려진 다양한 방법에 의해 탐지될 수 있으며, 상기 미생물은 상기 농축 방법에 의해 단시간 내에 검출한계에 도달할 수 있으므로 장시간 소요되는 배양시간이 현저히 단축되어 미생물에 대한 신속한 검출이 가능하다.
본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 본 발명의 기재내용에 기초하여 각 구성의 종류, 도입 비율 등을 변화시켜 적용할 수 있을 것이며, 상기 변형에도 불구하고 동등한 기술적 효과가 구현되는 경우라면, 본 발명의 기술적 사상에 포괄된다고 할 것이다.
이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.
제조예 : 균주 배양 및 분리
스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 BHI 배지(brain heart infusion broth; Oxoid, Hampshire, England)를 이용하여 챔버(Whitley A35 anaerobic chamber; Don Whitley Scientific Ltd., Shipley, UK)에서 혐기적으로 37℃에서 48시간 배양하였다. 그 후 선택배지(selective agar; BD BBL, Sparks, USA)에 도말하여 장파 자외선(long-wave ultraviolet light)에서 녹색/노랑(green/yellow) 형광을 나타내는 단일 콜로니를 분리하여 실험에 사용하였다.
실험예 1 : 여과필터 선별
상기 여과필터의 흡착효율을 확인하기 위해 7종류의 필터를 이용하여 제조예 1의 미생물을 여과하고 그 회수율을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 상기 미생물을 생선회에 접종하고 일정시간 동안 배양하여 증식시켰으며, 피검시료로 사용 하였다.
각 필터에 대한 회수율을 측정한 결과, 셀룰로오스계 필터의 회수율은 더 짧은 시간 동안 여과시켰음에도, 나일론, 폴리에테르 설폰, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 필터 보다 회수율이 우수한 것으로 확인되었다. 따라서, 셀룰로오스계 필터를 이용함으로써 미생물의 검출 효율이 증대될 수 있다.
구분 여과조건 회수율(%)
기공크기(㎛) 직경(mm) 시간(초)
질산 셀룰로오스 0.2 47 240 85
질산 셀룰로오스 0.45 47 70 92
초산 셀룰로오스 0.45 47 70 100
셀룰로오스 혼합 에스테르 0.45 47 70 94
나일론 0.45 47 150 76
폴리에테르 설폰 0.45 47 150 75
폴리비닐리덴 디플루오라이드 0.45 47 150 80
실험예 2 : 여과효율 측정
실험예 1에서 여과 효율이 가장 높은 것으로 확인된 초산 셀룰로오스(Cellulose Acetate) 필터의 식품 종류별 회수율을 측정하고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
스타필로코커스 아우레우스 균주를 각 식품에 접종하고, 각 식품을 탄소원 5%(w/v), 질소원 1.0%(w/v), KH2PO4 0.15%(w/v), MgSO4ㆍ7H2O 0.15%(w/v), 잔량의 증류수를 포함하는 배양액에서 균질화하였다. 상기 식품을 여과 조건을 동일하게 하여 여과하고 회수량을 측정한 결과, 회수율은 약 88% 내지 96%에 이르러 필터에 의하여 미생물이 효과적으로 여과될 수 있음을 확인하였다.
구분 접종량(㎍) 회수량(㎍) 회수율(%)
생선(광어회) 1300 1205 92.7
생선(우럭회) 1300 1153 88.7
양상추 1300 1232 94.8
사과 1300 1242 95.5
당근 1300 1226 94.3
식빵 1300 1197 92.1
밥(쌀) 1300 1213 93.3
실험예 3 : 여과필터 미생물 분리
여과된 필터의 미생물을 효과적으로 분리하기 위한 방법을 확인하기 위하여 다양한 분리방법을 적용하고 회수율을 측정하였다.
분리 방법을 달리하고 처리 시간을 동일하게 하여 처리 방법에 따른 회수 효율을 하기 표 3에서 비교하였다. 상기 미생물을 여과필터로 여과하고 상기 여과필터를 배양액에서 방법을 달리하여 물리적인 외력을 가하였다.
진동수 20KHz의 초음파를 30초간 조사하였을 때 회수율은 약 92%에 달했으며, 스토마쳐를 이용하여 스토마칭을 수행하였을 때 회수율은 96% 이상으로 확인되었다. 그러나, 30초간 볼텍싱 또는 교반하였을 때, 회수율은 50 내지 60%에 불과하여 분리 효율이 매우 저조한 것으로 확인되었다.
구분 시간(초) 회수율(%)
초음파 처리(sonication) 30 92.16
스토마칭(stomaching) 30 96.16
볼텍싱(vortexing) 30 67.70
교반(agitation) 30 56.94
실험예 4 : 분리된 미생물의 배양
제조예 1의 미생물을 tryptic soya broth에 접종하여 포화농도로 성장시킨 후 10진 희석법을 이용하여 연속희석 하였다. 101cfu/mL 수준으로 희석된 미생물 배양액 250mL을 멸균된 초산 초산 셀룰로오스 필터를 이용하여 여과하였다.
여과 후 상기 여과지를 분리하여 피루빈산, 효모 추출물, 트윈-80, 0.85% NaCl를 포함하는 enrichment broth 2.5mL에 넣은 후 30초간 스토마칭하여 여과지에 흡착된 미생물을 분리하였다.
분리 후 배양액을 2시간 간격으로 100μL씩 취하여 tryptic soya agar에 분주하였으며 균 수를 측정하고 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
표 4에 나타난 바와 같이 짧은 시간 배양에 균수가 급속하게 증가하여 단시간 내에 미생물의 검출한계를 상회할 수 있으므로 미생물 검출 시간이 현저히 단축되었다.
배양 시간 미생물 수(cfu/mL)
0 110
2 410
4 4200
6 69000
8 355000
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. (a) 탄소원 및 질소원을 포함하는 제1 배양액에 피검시료를 투입하고 균질화하는 단계;
    (b) 여과필터를 이용하여 상기 피검시료 내의 미생물을 여과하는 단계;
    (c) 피루빈산(pyruvate) 및 계면활성제를 포함하는 제2 배양액을 이용하여 상기 여과된 미생물을 분리하는 단계; 및
    (d) 상기 미생물을 탐지하는 단계;를 포함하는 미생물의 신속 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 상기 제1 배양액 및 상기 피검시료는 10 내지 15 : 1 내지 2의 중량비로 혼합되는 미생물의 신속 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 상기 제1 배양액은 탄소원 2.0 내지 10.0%(w/v), 질소원 0.1 내지 1.0%(w/v)를 포함하는 미생물의 신속 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 상기 여과필터는 셀룰로오스계 필터인 미생물의 신속 검출 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 상기 여과필터는 질산셀룰로오스(Cellulose Nitrate), 초산셀룰로오스(Cellulose Acetate), 또는 셀룰로오스 혼합 에스테르(Mixed Cellulose Ester) 필터인 미생물의 신속 검출 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 상기 제2 배양액은 효모 추출물(yeast extract)을 더 포함하는 미생물의 신속 검출 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 상기 여과필터를 상기 제2 배양액에 투입하고 스토마칭(stomaching)하거나 초음파를 조사하여 수행되는 미생물의 신속 검출 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제1 배양액 및 상기 제2 배양액은 20 내지 30 : 1 내지 3의 중량비로 수행되는 미생물의 신속 검출 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계 이후 상기 분리된 미생물을 배양하여 증식시키는 단계를 더 포함하는 미생물의 신속 검출 방법.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2005526509A (ja) * 2002-04-09 2005-09-08 ジェネシステム 複雑な混合物から核酸を抽出する方法及びオートマトン
KR20090078136A (ko) * 2008-01-14 2009-07-17 재단법인서울대학교산학협력재단 중공사막 한외여과를 이용한 미생물 채집 및 검출방법
JP2012029687A (ja) * 2010-07-02 2012-02-16 Meiji Co Ltd 大腸菌群の検出方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005526509A (ja) * 2002-04-09 2005-09-08 ジェネシステム 複雑な混合物から核酸を抽出する方法及びオートマトン
KR20090078136A (ko) * 2008-01-14 2009-07-17 재단법인서울대학교산학협력재단 중공사막 한외여과를 이용한 미생물 채집 및 검출방법
JP2012029687A (ja) * 2010-07-02 2012-02-16 Meiji Co Ltd 大腸菌群の検出方法

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