KR20170059611A - 우무가사리 추출물을 유효성분으로 함유하는 생리활성 증진용 조성물 - Google Patents
우무가사리 추출물을 유효성분으로 함유하는 생리활성 증진용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 우무가사리(Gelidium amansii) 추출물을 유효성분으로 함유하는 생리활성 증진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 우무가사리(Gelidium amansii) 추출물은 항산화, 항염증, 항주름 및 미백 효과가 우수하여 생리활성 증진용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있으며, 생리활성 증진용 건강기능식품으로서의 적용이 가능하다.
본 발명에 따른 우무가사리(Gelidium amansii) 추출물은 항산화, 항염증, 항주름 및 미백 효과가 우수하여 생리활성 증진용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있으며, 생리활성 증진용 건강기능식품으로서의 적용이 가능하다.
Description
본 발명은 우무가사리(Gelidium amansii) 추출물을 유효성분으로 함유하는 생리활성 증진용 조성물에 관한 것이다.
경제수준의 향상으로 삶의 질이 높아지면서 건강에 대한 관심이 증대되고 있으며, 식품에서도 천연소재에 대한 관심과 기능성 식품에 대한 연구가 고조되고 있다. 따라서, 최근 천연물로부터 생리활성 물질에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 각종 질병에 대한 치료 및 예방제 또는 건강보조제로서 식물자원이 널리 이용되고 있다. 생리활성을 나타내는 물질을 이용하여 식품의 기능 강화를 위해 주로 활용되고 있는 기능성은 대표적으로 항산화, 항염증, 항주름, 미백 효능 등이 있다.
항산화 효능과 관련하여, 일반적으로 유해산소로 알려져 있는 활성산소종(Reactive oxygen species)은 생체에 존재하는 항산화 방어체계에 의해 제거됨으로써 인체의 정상적인 세포 기능이 유지된다. 그런데 활성산소의 과도한 생성이나 방어체계의 기능 저하에 기인하는 산화적 스트레스는 피부 항산화제 파괴, 지질 과산화반응의 개시, 단백질의 산화, DNA 산화, 결합조직 성분인 콜라겐, 히아루론산 등의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합에 의한 주름생성, 멜라닌 생성 등을 유발하여 피부노화를 가속시킨다.
항염증 효능과 관련하여, 염증반응은 체내에서 일어나는 면역 기작의 하나로서, 국소적으로 발생할 시 외부로부터의 병균이나 바이러스의 침입으로부터 몸을 방어하는 중요한 반응이다. 그러나, 이와 같은 염증반응이 체내 면역반응의 균형 붕괴로 인하여 전신적, 만성적으로 과다하게 활성화 되면 체내에서 일어나는 대사작용에 장애를 유발하게 된다.
미백 효능과 관련하여, 멜라닌은 동식물계에 널리 분포하는 갈색 혹은 흑색의 고분자 색소로서 인간의 피부색을 결정한다. 멜라닌 생성을 조절하는 것으로 자외선, 사이토킨, 성장 인자 및 호르몬 등을 들 수 있는데, 가장 중요한 역할을 하는 것은 α-MSH(Melanocyte stimulating hormone)이다. α-MSH는 멜라닌 생성 효소인 티로시네이즈와 관련 단백질의 발현을 자극하여, 멜라닌 세포의 멜라닌 생성을 조절하게 된다. 따라서 α-MSH는 티로시나아제 활성을 촉진하여 멜라닌 세포의 증식과 착색을 증가시키게 되는 것이다. 티로시나아제는 티로신을 산화하여 밤색의 멜라닌 색소를 생성케 하는 효소로서 그 저해하는 활성이 높을수록 피부 미백에 도움을 준다.
항주름 효능과 관련하여, 피부조직의 노화에 따른 가장 특징적인 변화는 피부기질의 변화인 것으로서, 진피층에 있는 섬유아세포가 노화되어 섬유질과 기질의 생성능력이 줄어들게 된다. 기질의 양이 전반적으로 감소하여 피부의 두께가 얇아지며 피부의 탄력을 저하시켜 주름이 형성된다. 즉, 노화가 진행됨에 따라 피부는 탄력성의 저하, 혈액순환의 장애, 피부 장벽의 약화 등이 심해지게 된다. 세포 외 기질의 주요 구성 성분인 콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질이다. 콜라겐은 피부, 건, 뼈 및 치아의 유기 물질의 대부분을 형성하는데, 특히 뼈와 피부(진피)에 그 포함량이 높다. 이러한 콜라겐은 연령 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성 및 피부 탄력과 밀접한 연관이 있다.
상기와 같이 천연물을 소재로 하여 항산화, 항염증, 항주름, 미백 등의 생리활성 효과를 구현한 종래 특허로는 대한민국등록특허공보 제10-0829083호 「생리활성을 갖는 애기달맞이 추출물」, 대한민국등록특허공보 제10-1297873호 「생리활성 효과 향상을 위한 차나무과 식물의 꽃잎 혼합 추출물 제조와 이를 포함하는 암 질환 예방 및 치료용 약학 조성물」, 대한민국등록특허공보 제10-1304293호 「쪽동백나무 조추출물, 이의 분획물 또는 그 분획물에서 분리된 생리활성물질을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물 또는 약학 조성물」 등이 있다.
한편, 우무가사리(Gelidium amansii)는 우무가사리과에 속하는 홍조류의 여러해살이 해조류로서 여름의 번식기가 지나면 본체의 상부는 녹아 없어지고 하부만 남아 있다가 다음해 봄에 다시 새싹이 자라난다. 동해안·남해안과 황해의 바깥 도서에 분포하며 동해 남부 연안에서 가장 많이 생산된다. 바닷속 20~30m 깊이의 바위에 붙어 자라는데, 바깥바다에 면하고 바닥이 모래로 되어 있으며, 해수의 소통이 잘되는 곳에 산다. 우무가사리를 민물에 깨끗이 씻어 햇볕에 말린 것을 고아서 찌꺼기를 걸러내고 식히면 우무가 된다. 이 우무는 예로부터 채쳐서 콩국에 띄워 청량음료로 사용하여 왔다. 우무가사리에는 3가지의 몸체가 있는데, 즉 유성 세대인 수배우체와 암배우체 및 무성 세대인 포자체이다. 이것들은 그 생김새가 매우 비슷하므로, 생식 기관이나 핵상을 조사하지 않으면 서로 구별할 수가 없다. 우무가사리에는 암수의 배우체 세대, 암배우체에 기생하는 작은 과포자 세대 및 사분 포자체 세대의 3가지 세대가 있으며, 생활사는 이 3세대가 순환하면서 이루어지게 된다.
상기 우무가사리는 오래 전부터 식품첨가물, 화장품, 의약품, 가축사료, 공업원료 등으로 널리 사용되고 있는 대표적인 해조류로, 한천의 주원료이다. 그러나 전체 우무가사리 생산량의 10% 미만만이 단순 가공처리되어 값싼 원료로 사용될 뿐 많은 양이 방치되고 있는 실정이다. 그러므로 국내 연안에서 대량생산되는 우무가사리, 즉 한천의 새로운 용도개발을 통한 부가가치 향상시도는 매우 중요한 과제라고 할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 천연물 중에서도 해양생물소재를 대상으로 다양한 생리활성 효과가 우수한 천연물을 탐색한 결과, 우무가사리(Gelidium amansii) 추출물이 항산화, 항염증, 항주름 및 미백 효과가 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 우무가사리(Gelidium amansii) 추출물을 유효성분으로 함유하는 생리활성 증진용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 생리활성 증진용 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 우무가사리(Gelidium amansii) 추출물을 유효성분으로 함유하는 생리활성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 우무가사리(Gelidium amansii) 추출물은 우무가사리(Gelidium amansii)를 용매로 추출한 다음 원심분리 및 여과시킨 후 상등액을 수득하는 단계; 및 상기 상등액을 농축시킨 후 동결건조시키는 단계로 제조된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 용매는 주정알코올, 메탄올 및 클로로포름으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 추출은 60 내지 120℃에서 30분 내지 24시간 동안 수행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 우무가사리(Gelidium amansii) 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 5 내지 15 중량% 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 우무가사리(Gelidium amansii) 추출물은 항산화, 항염증, 항주름 및 미백 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 다른 구현 예에서, 상기와 같은 생리활성 증진용 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 우무가사리(Gelidium amansii) 추출물은 항산화, 항염증, 항주름 및 미백 효과가 우수하여 생리활성 증진용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있으며, 생리활성 증진용 건강기능식품으로서의 적용이 가능하다.
도 1은 본 발명의 원료로 사용되는 우무가사리의 사진이다.
도 2는 우무가사리 추출물의 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 우무가사리 추출물의 항염증 효능(COX-1, COX-2 저해)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 우무가사리 추출물의 항염증 효능(IL-6 억제)을 나타낸 그래프이다.
도 5는 우무가사리 추출물의 항염증 효능(NO 억제)을 나타낸 그래프이다.
도 6은 우무가사리 추출물의 B16F10 cell 내의 미백 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 우무가사리 추출물의 세포 내 멜라닌 생성 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 우무가사리 추출물의 콜라겐 분해 효소 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 9는 우무가사리 추출물의 항산화 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 우무가사리 추출물의 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 우무가사리 추출물의 항염증 효능(COX-1, COX-2 저해)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 우무가사리 추출물의 항염증 효능(IL-6 억제)을 나타낸 그래프이다.
도 5는 우무가사리 추출물의 항염증 효능(NO 억제)을 나타낸 그래프이다.
도 6은 우무가사리 추출물의 B16F10 cell 내의 미백 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 우무가사리 추출물의 세포 내 멜라닌 생성 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 우무가사리 추출물의 콜라겐 분해 효소 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 9는 우무가사리 추출물의 항산화 활성을 나타낸 그래프이다.
본 발명에서는 우무가사리(Gelidium amansii)를 이용하여 추출을 한 다음, 추출물이 항산화, 항염증, 항주름 및 미백 효과가 있음을 확인함으로써, 우무가사리 추출물(Gelidium amansii)이 생리활성 증진용 조성물로서 우수함을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 우무가사리(Gelidium amansii) 추출물을 유효성분으로 함유하는 생리활성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 상기 우무가사리(Gelidium amansii) 추출물은 우무가사리(Gelidium amansii)를 용매로 추출한 다음 원심분리 및 여과시킨 후 상등액을 수득하는 단계; 및 상기 상등액을 농축시킨 후 동결건조시키는 단계로 제조된 추출물인 것이 바람직하다.
더욱 상세한 우무가사리(Gelidium amansii) 추출물의 제조방법은 다음과 같다.
먼저, 도 1과 같이 국내 제주도에서 자생되고 있는 우무가사리(Gelidium amansii)를 용매를 이용하여 30 내지 5시간 동안 냉침시킨다. 이때, 상기 냉침처리를 위한 용매로는 에틸아세테이트(Ethyl acetate), 증류수, 메탄올 등을 사용할 수 있으나, 그 중에서도 증류수를 사용하는 것이 경제성 및 안전성 측면에서 바람직하다. 상기와 같이 침지시킨 우무가사리(Gelidium amansii)를 동일한 용매를 이용하여 1 내지 5회에 걸쳐 깨끗하게 세척한 후 12 내지 36시간 동안 건조시킨다. 이때, 건조하는 방법은 각별히 한정이 있는 것은 아니나, 그늘진 곳에서 선풍기를 이용하여 건조시키는 것이 경제성 및 편의성 측면에서 바람직하다.
다음으로 건조된 우무가사리(Gelidium amansii) 원료를 카터밀 등의 다양한 분쇄방법을 이용하여 분쇄를 한 다음, 분쇄된 우무가사리(Gelidium amansii) 분쇄물을 추출기에 넣고, 용매를 탱크에 주입하여 용매추출을 수행한다. 이때, 용매는 주정알코올, 메탄올 및 클로로포름으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 사용할 수 있으나, 그 중에서도 75 내지 85% 주정알코올을 사용하는 것이 안전성 및 경제성 측면에서 바람직하다. 또한, 추출 시 60 내지 120℃에서 30분 내지 24시간 동안 추출하는 것이 추출물의 수율을 최대한 향상시킬 수 있는 측면에서 바람직하다.
전술된 용매추출이 완료되면, 3,000 내지 15,000 rpm에서 5 내지 30분 동안 원심분리를 하고 15 내지 25 ㎛의 종이여과지를 이용하여 여과시킨 다음, 농축기에 주입한 후 40 내지 80℃에서 전체 부피 대비 1/15 내지 1/25로 농축시켜 농축액을 수득한다. 상기 농축액은 장기 보관을 위하여 동결건조시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 상기 우무가사리 추출물(Gelidium amansii)은 조성물 총 중량에 대하여 5 내지 15 중량% 포함할 수 있다. 만일, 우무가사리 추출물(Gelidium amansii)이 조성물 총 중량에 대하여 5 중량% 미만일 경우에는 생리활성 증진 효과를 충분히 얻을 수 없기 때문에 생리활성 증진용 조성물로서의 기능이 떨어지고, 15 중량%를 초과하는 경우에는 그 이상의 함량을 첨가시키지 않아도 충분한 생리활성 증진 효과를 구현할 수 있기 때문에 비경제적이다.
상기와 같은 방법으로부터 수득된 우무가사리 추출물은 항산화, 항염증, 항주름 및 미백 효과를 나타내어 생리활성 증진 효과를 갖는 것일 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 생리활성 증진 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공할 수 있다.
전술된 바와 같이, 본 발명은 합성 의약품을 대체한 해양생물소재인 우무가사리를 소재로 하여 생리활성 증진 효과를 구현하기 위한 조성물을 제공하기 위한 것으로서, 식품원료의 안전성의 문제가 대두되고 있는 상황에서 자연유래 천연소재를 사용함에 따라 경제성 및 안전성을 확보함과 동시에 우수한 생리활성 증진 효과를 나타낼 수 있기 때문에 생리활성 증진용 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
1. 우무가사리 추출물 제조
제주도 수협으로부터 구매한 우무가사리 300kg을 100kg씩 3회에 걸쳐 세척한 다음, 추출, 농축 및 동결건조를 실시하고자 하였다.
먼저, 2톤 세척기에 우무가사리 시료 100kg을 넣고 시료량에 대한 10배의 정제수를 첨가한 다음 1시간 동안 냉침시켰으며, 그 후 동일한 방법으로 3회의 세척 과정을 거쳐 그늘진 곳에서 선풍기를 이용하여 24시간 냉풍 건조하였다. 냉풍 건조된 시료는 카터밀을 이용하여 분쇄한 다음, 2톤 추출기에 상기 분말시료 100kg를 부직포에 첨가한 후, 80% 주정알코올 1톤을 탱크에 주입하여 70℃에서 12시간 추출하였다. 추출된 추출물은 연속원심분리기를 이용하여 10,000 rpm에서 20분 동안 분리한 다음 20 ㎛ 크기의 종이여과지를 이용한 여과 공정을 거쳐 농축기에 주입한 후 60℃에서 전체 부피 대비 1/20로 농축하고, 동결건조를 하였으며, 3회 반복하여 최종 우무가사리 추출물을 제조하였다.
상기와 같이 동일한 조건 하에 3회 반복하여 추출한 결과, 1차 추출 시 추출 물은 8.91 kg, 2차 추출 시 추출물은 9.37 kg, 3차 추출 시 추출물은 9.34 kg으로 우무가사리 시료 100 kg 당 평균 9.2 kg의 추출 건조물을 회수하였다. 따라서 우무가사리 추출물의 평균 수율은 9.2±0.25%로 확인되었다.
2. 우무가사리 추출물의 생리활성 평가
2-1. 세포독성 평가(MTT assay)
우무가사리 추출물(GA-3)의 세포 독성을 확인하고자, 3T3L-1 세포를 이용한 MTT assay를 수행하였다.
먼저, 6-웰 플레이트에 세포를 넣고, 37℃에서 24시간 배양한 다음, 샘플(대조군과 실험군)을 농도 별로 각 웰에 첨가한 후, 37℃에서 2일 동안 배양하고, 배양 후 배양액을 제거하고, 각 웰에 MTT 용액(테트라졸리움 염료 MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드)의 용액)을 100 ㎕씩 첨가하여 2시간 동안 배양시킨 후 MTT 용액을 제거하였다. 각 웰에 100 ㎕의 디메틸설폭사이드를 첨가하여 15 내지 20분간 반응시킨 후 광학밀도 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 대조군으로는 인도메타신(Indomethacin)을 사용하였다.
그 결과, 도 2에서 확인할 수 있듯이, 우무가사리 추출물을 농도별로 처리하였을 경우 200 ㎍/ml 까지 세포 생존율이 80% 이상으로 세포 독성이 없는 것을 확인하였다.
2-2. 항염증 효능 분석(COX-1, COX-2 저해)
우무가사리 추출물(GA-3)의 항염증 효능을 확인하고자, COX-1(사이클로옥시게나아제-1(Cyclooxygenase-1))과 COX-2(Cyclooxygenase-2)의 저해 활성을 측정하였다.
먼저, 96-웰 플레이트의 배경 웰(Background well)로 3 웰에 160㎕ 분석용 완충제(Assay buffer), 10㎕ 헴(Heme) 및 10㎕ 에탄올(억제제(Inhibitor)를 용해시켰던 용매)을 첨가하였다. 100% 초기 활성(Initial activity) 측정을 위해 3 웰에 150㎕ 분석용 완충제, 10㎕ 헴, 10㎕ 효소(COX-2) 및 10㎕ 에탄올을 첨가하였다. 표준 억제제(Standard inhibitor)로는 인도메타신(Indomethacin ; 1㎎/㎖)을 사용하였으며, 3 웰 각각에 150㎕ 분석용 완충제, 10㎕ 헴, 10㎕ 효소(COX-1 또는 COX-2)와 샘플(대조군과 실험군) 10㎕를 첨가하고, 25℃에서 약 5분간 반응시켰다. 비색 기질(Colorimetric substrate)을 모든 웰에 20㎕씩 첨가하고 즉시 20㎕의 아라키돈산(Arachidonic acid)을 첨가한 다음, 25℃에서 5분간 반응시킨 후, 효소결합면역흡착 분석 판독기로 590㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 3에서 확인할 수 있듯이, 대조군인 인도메타신(Indomethacin)의 경우 COX-1에서 56.7±2.0%, COX-2에서 15.1±0.0%으로 저해 활성을 보였으나, 우무가사리 추출물의 경우 COX-1에서 44.3±0.7%, COX-2에서 9.3±0.2%의 저해 활성을 나타내어, 우무가사리 추출물의 항염증 활성이 우수함을 확인하였다.
2-3. 항염증 효능 분석 (IL-6 억제)
우무가사리 추출물(GA-3)의 항염증 효능을 확인하고자, IL-6(인간 인터류킨-6)의 억제 활성을 측정하였다.
먼저, 세포를 48-웰 플레이트에 첨가하고 37℃에서 24시간 배양한 다음, 지질다당류(LPS: lipopolysaccharide) 1 ㎍/㎖가 첨가된 배양액으로 교체한 후, 시료를 농도별로 처리하고 37℃에서 48시간 배양하였다. 배양액을 취하여 총 단백질량을 측정한 다음, 각 웰의 단백질량을 동일하게 보정하고 인간 인터류킨-6 효소결합면역흡착 킷트(Human IL-6 ELISA kit ; 써모사)를 이용하여 염증반응 유도한 후, 사이토카인의 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 4에서 확인할 수 있듯이, 대조군인 인도메타신(Indomethacin)은 50 ㎍/ml에서 6.2%의 IL-6 억제 활성을 나타내었고, 그 이상의 농도에서는 IL-6 억제 활성이 거의 100%으로 나타났다. 우무가사리 추출물의 경우에도 농도 의존적으로 IL-6 억제 활성이 있는 것으로 확인되어, 우무가사리 추출물의 항염증 활성이 우수함을 확인하였다.
2-4. 항염증 효능 분석 (NO 억제)
우무가사리 추출물(GA-3)의 항염증 효능을 확인하고자, NO 억제 활성을 측정하였다.
먼저, 48-웰 플레이트에 세포를 넣고 37℃에서 24시간 배양한 다음, 지질다당류(LPS: lipopolysaccharide) 1㎍/㎖이 첨가된 배양액으로 교체한 후, 시료를 농도별로 처리하고 37℃에서 48시간 배양하였다. 배양액을 회수한 후 96-웰 플레이트에 배양액 100 ㎕을 옮기고, 반응 용액(1% sulfanilamide : 0.1% N-(1-naphtyl) ethylenediamine dihydrochloride regent = 1:1) 100 ㎕를 첨가하여 10분간 상온에 방치한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 5에서 확인할 수 있듯이, 대조군인 인도메타신(Indomethacin)은 20 ㎍/ml에서 63.2%의 NO 억제 활성을 나타내었고, 농도가 증가함에 따라 점차 감소하다가 200 ㎍/ml 이상에서는 NO 억제가 증가하지 않았다. 우무가사리 추출물의 경우에는 20 ㎍/ml에서 89.1%의 NO 억제 활성을 나타내었고, 농도가 증가함에 따라 점차 감소하다가 500 ㎍/ml에서 22.8%까지 감소하였다.
2-5. 멜라닌 생성 억제 분석
우무가사리 추출물의 미백 효능을 확인하고자, B16F10 cell 내의 미백 효과 및 세포 내 멜라닌 생성 억제 활성을 측정하였다.
먼저, 48-웰 플레이트에 세포를 넣고 37℃에서 24시간 배양한 다음, 알파-멜라닌세포자극호르몬(α-MSH: α-melanocyte stimulating hormone ; 13개의 아미노산으로 되는 분자량 1823의 폴리펩티드) 100nM/㎖가 첨가된 배양액으로 교체한 후, 샘플을 농도별로 처리한 후(대조군은 코직산(Kojic acid)) 37℃에서 4일 동안 배양하였다. 배양 후, 세포는 인산 완충 식염수(PBS)로 세척한 후, 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(Trypsin-EDTA)으로 처리하여 세포를 회수하고, 5,000 내지 10,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 펠릿(Pellet)을 60℃에서 건조시켰다. 펠릿에 10% 디메틸설폭사이드(DMSO: dimethyl sulfoxide)가 함유된 1M 수산화나트륨(NaOH) 100㎕를 첨가하고 60℃에서 세포 내 멜라닌을 얻은 후, 96-웰 플레이트에 옮기고 효소결합면역흡착 분석 판독기(ELISA Reader)로 490㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 6 및 7에서 확인할 수 있듯이, 저농도인 50 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml에서는 코직산(Kojic acid)의 미백 효과가 우수하였으나, 250 ㎍/ml 이상부터는 우무가사리 추출물도 약 50%의 억제 활성을 나타내어 미백 기능성 성분인 코직산(Kojic acid)과 동일한 효능이 있는 것으로 확인되었다.
2-6. 항주름 효능
우무가사리 추출물의 항주름 효능을 확인하고자, 콜라겐 분해 효소 억제 활성을 측정하였다.
교원효소 저해 활성 측정은 키 더블류법(Qi W. method)을 변형시켜 사용하였다. 50mM 트리스-염산 완충제(Tris-HCl buffer) 50㎕에 5㎕ 교원효소(2㎎/㎖) 및 희석된 시료 10㎕를 37℃에서 10분 간 전 처리한 후, 중탕 가열한 6㎎/㎖의 젤라틴(Gelatin)이 포함된 기질용액 0.5㎖(50mM 트리스-염산 완충제, pH 7.5)와 37℃에서 30분 간 반응시켰다. 효소 반응을 정지시키기 위해 10%(w/v) 트리클로로아세트산(TCA: trichloroacetic acid) 0.5㎖를 첨가한 후, 닌히드린(Ninhydrin) 용액 0.5㎖을 혼합하고 100℃에서 10분 간 끓이고, 빙수(Ice-water)에서 냉각시켰다. 가수분해되지 않은 단백질을 침전시키기 위해 50% 1-프로판올(1-propanol)을 가하여 15분 간 방치한 후, 10,000rpm에서 10분 간 원심분리시키고 570㎚에서 흡광도를 측정하였다.
저해율(%)은 저해제를 첨가한 것의 반응 전(A)과 반응 후(B)의 흡광도, 저해제를 첨가하지 않은 것의 반응 전(C)과 반응 후(D)의 흡광도로부터 하기 계산식 1을 사용하여 산출하였다.
<계산식 1>
그 결과, 도 8에서 확인할 수 있듯이, 아스코르빈산(Ascorbic aicd)은 58.2%의 콜라겐 분해 효소(Collagenase) 저해 활성을 나타내었고, 우무가사리 추출물의 경우에는 49.0% 콜라겐 분해 효소(Collagenase) 저해 활성을 나타내어, 대조군인 아스코르빈산(Ascorbic aicd) 보다 약간 낮은 수준의 콜라겐 분해 효소(Collagenase) 저해 활성을 나타내었으나, 콜라겐 분해 효소(Collagenase) 저해 활성이 있다는 것을 확인하였다.
2-7. 항산화 활성 분석
우무가사리 추출물의 항산화 효능을 확인하고자, DPPH 라디칼 제거 활성을 측정하였다.
먼저, 항산화 효과를 측정하기 위해 전자공여능(EDA: electron donating ability) 측정법으로 블리오스법(Blois method)을 변형하여 측정하였다(DPPH assay). DPPH 라디칼 제거 효과는 추출물의 DPPH에 대한 전자공여효과로 시료의 환원력을 측정하는 방법에 의하여 측정하였다. 시료 용액 10㎕(대조: 99.5% 에탄올)에 0.1mM DPPH(99.5% 에탄올 용액 중) 용액 190㎕를 가하고, 37℃에서 30분 동안 반응 시킨 후, 마이크로플레이트 판독기(Microplate Reader; Bio-Tek, US)를 이용하여 517㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 L-아스코르빈산(L-ascorbic acid)을 사용하여 같은 방법으로 측정하였다.
각 시료의 항산화 효과는 하기 계산식 2을 사용하여 대조군에 비하여 감소된 흡광도로부터 라디칼 제거율을 산출하였다. 계산식 2에서 Sample O.D.는 시료를 가한 시험액의 흡광도이고, Control O.D.는 시료를 가하지 않은 시험액의 흡광도를 의미한다.
<계산식 2>
그 결과, 도 9에서 확인할 수 있듯이, L-아스코르빈산(L-ascorbic acid)은 87%의 DPPH 라디칼 제거 활성을 나타내었으며, 우무가사리 추출물의 경우에는 71.5%으로 나타나 대조군 보다 약간 낮은 수준의 항산화 활성을 나타내었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (7)
- 우무가사리(Gelidium amansii) 추출물을 유효성분으로 함유하는 생리활성 증진용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 우무가사리(Gelidium amansii) 추출물은 우무가사리(Gelidium amansii)를 용매로 추출한 다음 원심분리 및 여과시킨 후 상등액을 수득하는 단계; 및 상기 상등액을 농축시킨 후 동결건조시키는 단계로 제조된 것을 특징으로 하는 생리활성 증진용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 용매는 주정알코올, 메탄올 및 클로로포름으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 생리활성 증진용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 추출은 60 내지 120℃에서 30분 내지 24시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 생리활성 증진용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 우무가사리(Gelidium amansii) 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 5 내지 15 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 생리활성 증진용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 우무가사리(Gelidium amansii) 추출물은 항산화, 항염증, 항주름 및 미백 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 생리활성 증진용 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 생리활성 증진용 조성물을 포함하는 건강기능식품.
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WO2021215677A1 (ko) * | 2020-04-24 | 2021-10-28 | 경북대학교 산학협력단 | 홍조류 유래 셀룰로오스 나노소재를 이용한 피부손상 개선 조성물 및 이의 제조방법 |
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