KR20170054314A - 오가자 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 오가자 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 오가자 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명의 오가자 추출물은 베타-헥소사미니데이즈 방출을 억제하고, 염증성 사이토카인 및 IgE를 억제하여 염증질환 또는 알레르기 질환의 치료에 효과적이며, 높은 농도에서도 세포 독성이 낮아 효과적이다.

Description

오가자 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising extract of Eleutherococcus sessiliflorus fruits for prevention and treatment of allergic diseases or inflammatory diseases}

본 발명은 오가자 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 오가자 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

인체 외부에서 이물질들이 체내로 들어오면 우리 몸에서는 이들로부터 우리 몸을 보호하는 면역반응이 일어나는데 이를 정상 면역반응이라고 한다. 그러나 이러한 면역반응이 지나치면 신체 이상이 초래되는 과민반응이 유발되고, 과민반응 중에서 특수한 기전으로 우리 몸에 이상이 생기는 경우를 알레르기 반응이라고 한다.

알레르기 반응의 원인은 알레르기 항원인 알러젠(allergen)으로 작용하는 외부 물질에 반응하는 인체의 면역체계에 의해 유발된다. 알러젠은 항원제시세포에 의해 세포 표면에 제시되고, 이렇게 제시된 항원은 B림프구에 의해 인식되어 형질세포(plasma cells)로 전환되며, 항원을 특정하게 인식하는 항체(IgE)를 분비하게 된다.

알레르기 질환은 알러젠에 반복적으로 접촉되어 기억세포(memory cell)에 의환 과도한 면역반응으로 발생하며, 항원과 결합하는 IgE는 조직의 비만세포(mast cells)의 수용체(FcεRI)에 결합하여 비만세포의 탈과립을 유도한다. 비만세포의 탈과립은 히스타민(histamine), 헤파린(heparin), 류코트리엔(leukotrienes), 프로스타글란딘(prostaglandine) 및 다른 과민증인자(anaphylatic agents) 등을 분비하게 된다. 이렇게 분비된 면역활성 인자들이 면역체계를 활성화시키며 염증(inflammation) 및 알레르기 반응(allergic reactions)을 발생시키는 원인이다.

과민반응은 크게 4가지 유형으로 나눌 수 있다. 일반적으로 알레르기 반응이라고 일컫는 제1형 과민반응은 특정한 항원에 대하여 나타나는 반응으로, 그 항원에 대해 특이적인 IgE 항체가 비만세포나 호염구(basophil)에 결합되어 유도되는 반응이다.

알러젠에 대하여 특이적인 IgE 항체가 많이 만들어지면 이들 항체는 비만세포나 호염구 표면에 있는 FcεRI 수용체와 결합하게 되며, 여기에 알러젠이 결합하여 이들 세포가 활성화되고, 여러 가지의 생리활성 물질이 분비되어 혈관확장, 혈관의 침투성 증가, 평활근 수축, 염증반응 등과 같은 변화가 유도된다.

이러한 반응은 이들 세포가 만들어내는 매개물질의 종류와 양에 따라 국소적으로 또는 전신적으로 나타날 수 있으며, 구체적인 알레르기 질환으로는 아토피 피부염, 비염, 천식 등이 이에 해당된다.

아토피성 피부염, 천식, 알레르기성 비염, 류마티스 관절염 등 다양한 알레르기 질환에 있어서 비만세포는 매우 중요하다. 비만세포는 다른 세포와 달리 크고 굵은 이염색성의 과립을 함유하고 있으며, IgE가 비만세포가 가지고 있는 FcεRI(high-affinity receptor for IgE)에 결합된 상태에서 항원에 의해 자극을 받게 되면 여러 면역반응과 염증반응에 관여한다.

따라서 비만세포는 알레르기 반응 중에서 일어나는 다양한 생리학적, 면역학적, 병리학적 과정, 즉 창상치유, 혈관생성, 기생충과 신생물에 대한 숙주의 반응, 급만성 염증반응과 IgE 매개의 즉각적인 알레르기 반응에 중심적인 역할을 하게 된다.

알레르기 반응에서 비만세포 활성시 분비되는 매개물질로 혈관의 확장 및 통증의 원인이 되는 생체아민(biogenic amine)인 히스타민과 5-HT(세로토닌)이 있으며, 그 외에도 IL-1, 4, 6, 10, 13, MIF, TNF 등의 사이토카인(cytokine)을 분비하여 염증 및 백혈구(leukocyte)의 이동(migration), 증식(proliferation)을 유도한다.

또한, 인지질 대사물(phospholipid metabolites)인 류코트리엔 B4(leukotrien B4, LTB4), 류코트리엔 C4(leukotrien C4, LTC4), 혈소판활성인자(platelet activating factor, PAF), 프로스타글란딘 D2(prostaglandin D2, PGD2)를 분비함으로써 백혈구 화학주성(leukocyte chemotaxis), 기도수축 및 통증을 유발한다.

그 외에도 조직손상, 통증, 안지오텐신 Ⅱ 합성(angiotensin Ⅱ synthesis)을 유도하는 카이메스(chymase), 트립타아제(tryptase) 등의 효소와 코르티코트로핀분비효소(corticotropin-releasing hormone, CRH), 엔돌핀(endolphins), 엔도텔린(endothelin), 키닌(kinins), 소마토스타틴 물질 P(somatostatin substance P, SP), 혈관작용 소장펩타이드(vasoactive intestinal peptide, VIP), 우로코르틴(urocortin), 혈관 내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 등의 펩타이드를 분비하여 염증, 소양, 통증, 혈관확장 및 기도수축 등의 일련의 알레르기 반응을 유도한다.

현재까지 개발된 알레르기성 질환 치료제는 알러젠에 의해 비만세포 등에서 분비된 히스타민이나 류코트리엔 등의 수용체에 대한 길항제들이 주를 이루고 있다. 그러나 이러한 약물들은 환자에게서 투여 후 단기간 내에 내성을 보이기 때문에 환자들의 증상호전을 위한 경우가 대부분으로, 질병의 원인을 원천적으로 차단하기에는 미비할 뿐만 아니라 약제들에 의한 부작용도 심각한 상황이다(Rabe KF, et al., Eur Respir J Suppl., 34:34s-40s, 2001).

한편, 오갈피나무(Eleutherococcus sessiliflorus(Rupr. & Maxim.) S.Y.Hu 또는 Acanthopanax sessiliflorus(Rupr. & Maxim.) Seem.)는 두릅나무과(Araliaceae)에 속하는 오갈피나무속(Eleutherococcus) 식물로 낙엽활엽 관목으로, 키는 34cm이고 뿌리 근처에서 가지가 많이 갈라져 사방으로 퍼지며 잎은 호생(互生)하고 장상복엽(掌狀複葉)이며 소엽(小葉)은 35개로 난형이다.

오갈피속 식물은 동의보감을 위시한 한약집성방, 신농본초경 및 본초강목에 이르기까지 고전 한의서에 그 약리 효능이 탁월한 것으로 기재되어, 강장제로서 기관지 천식 치료, 육체력 증진, 근골격 증진, 신경통, 당뇨 등의 효과가 알려져 있으며, 최근에 들어서는 혈압강하작용, 간기능 보호작용, 조혈촉진 및 면역기능 증진작용, 혈중 콜레스테롤 저하작용, 항산화작용, 항알러지작용 및 항암작용 등을 가지는 것으로 과학적으로 규명되어, 건강기능성 식품을 포함한 여러 분야에서 관심과 사용이 증가하는 추세에 있다.

그 중 오갈피나무 열매(오가자)는 오갈피나무속 식물의 열매를 일컫는 말로, 오가피 열매는 간보호 작용, 학습력 향상, 면역력 증강, 항암 작용, 콜레스테롤 저하, 위궤양 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 하지만, 지금까지 오가피 열매 추출물의 β-hexosaminidase 방출 억제효과에 대해서는 아직까지 보고된 바는 없었다.

이에, 본 발명자들은 오가자 추출물의 아토피 치료 효과, 피부 염증 억제 효과 및 항알러지 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 오가자 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 오가자 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 오가자 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 추출물은 물, C₁~C₄ 의 알콜, 헥산, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 초산에칠, 에테르, 클로로포름 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 추출용매로 추출된 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 추출물은 건조된 오가자를 상온에서 추출용매에 침지하여 추출하거나, 가속용매추출장치(Accelerated Solvent Extraction, ASE)를 사용하여 추출하여 수득하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 추출물은 0.1 내지 50 ㎎/㎖의 농도로 조성물에 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 것 일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 알레르기 질환이란 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 천식, 아나필락시스 쇼크, 식품 알레르기, 화분증, 약제 알레르기, 식물 알레르기, 두드러기, 습진, 및 알레르기성 피부염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 염증질환은 피부 염증질환일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 아토피 피부염인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 오가자 추출물은 베타-헥소사미니데이즈(β-hexoxaminidase)의 분비를 억제하고, 염증성 사이토카인 및 면역글로불린 E를 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 것 일 수 있다. 바람직하게 상기 염증성 사이토카인은 IL-4(interleukin 4) 또는 TSLP(thymic stromal lymphopoietin)인 것일 수 있다.

본 발명은 또한, 오가자 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 및 개선용 건강기능성 식품을 포함한다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 알레르기 질환이란 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 천식, 아나필락시스 쇼크, 식품 알레르기, 화분증, 약제 알레르기, 식물 알레르기, 두드러기, 습진, 및 알레르기성 피부염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 염증질환은 피부 염증질환 또는 아토피 피부염인 것을 특징으로 하는 알레르기 질환 또는 염증질환 일 수 있다.

따라서 본 발명은 오가자 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 및 치료용 조성물 및 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 오가자 추출물은 베타-헥소사미니데이즈 방출을 억제하고, 염증성 사이토카인 및 IgE를 억제하여 염증질환 또는 알레르기 질환의 치료에 효과적이며, 높은 농도에서도 세포 독성이 낮아 효과적이다.

도 1은 오가자 추출물 2, 10 및 50 ㎍/㎖ 농도에서 세포증식 억제를 확인한 그래프이다.
도 2는 오가자 추출물 2, 10 및 50 ㎍/㎖ 농도에서 베타-헥소사미니데이즈 분비 저해능을 나타낸 그래프이다.
도 3은 오가자 추출물의 IL-4 분비 저해능을 양성대조물질인 R406과 비교하여 OD 값으로 나타낸 그래프이다.
도 4는 오가자 추출물의 IL-4 분비 저해능을 양성대조물질인 R406과 비교하여 퍼센트로 나타낸 그래프이다.
도 5는 피부각질세포인 HaCaT 세포에 대한 오가자 추출물의 세포독성실험을 비교하여 나타난 그래프이다.
도 6은 급성림프아구성 말초혈 유래의 T 세포주인 Jurcat T 세포에 대한 오가자 추출물의 세포독성실험을 비교하여 나타난 그래프이다.
도 7은 알러지 자극제로 자극된 HaCaT 세포에서 오가자 추출물에 따른 TNF-α의 mRNA 발현 수준 변화를 확인한 그래프이다.
도 8은 알러지 자극제로 자극된 Jurcat T 세포에서 오가자 추출물에 따른 IL-2의 mRNA 발현 수준 변화를 확인한 그래프이다.
도 9는 오가자 추출물을 아토피 유도 마우스에 도포하였을 때, 마우스의 스크래치 동작수를 나타낸 그래프이다.
도 10은 오가자 추출물을 아토피 유도 마우스에 도포하였을 때, 마우스의 피부조직에서 염증성 사이토카인 IL-4 방출량을 나타낸 그래프이다.
도 11은 오가자 추출물을 아토피 유도 마우스에 도포하였을 때, 마우스의 혈청 내 IgE을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 오가자 추출물의 아토피 마우스 피부조직의 TSLP 감소효과를 나타낸 전기영동 사진과 그래프이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 지금까지 오갈피나무 열매(오가자) 추출물의 베타-헥소사미니데이즈 방출 억제효과에 대해서는 아직까지 보고된 바는 없었다.

본 발명의 오가자 추출물은 베타-헥소사미니데이즈 방출을 억제하고, 염증성 사이토카인 및 IgE를 억제하여 염증질환 또는 알레르기 질환의 치료에 효과적이며, 높은 농도에서도 세포 독성이 낮아 효과적이다.

본 발명의 오가자는 오갈피나무 열매를 뜻하며, 오갈피나무는 오가피, 오갈피, 서울오갈피나무, 서울오갈피 등의 이명을 가진다. 본원 발명에서 사용되는 오가자는 오갈피나무속에 속하는 식물의 열매를 모두 이르는 말이다.

바람직하게 본원 발명의 오가피는 털오갈피나무, 가시오갈피, 서울오갈피, 섬오갈피나무, 오갈피나무, 지리산 오갈피, 단경오갈피나무, 당오갈피나무, 왕가시오갈피나무 및 털오갈피로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

털오갈피나무는 Eleutherococcus divaricatus로 나타낼 수 있으며, 오갈피나무는 Eleutherococcus sessiliflorus(Rupr. et Maxim.) S. Y. Hu 또는 Acanthopanax sessiliflorus(Rupr. et Maxim.) Seem.로 나타낼 수 있고, 서울오갈피는 Eleutherococcus seoulensis 또는 Acanthopanax seoulense Nakai로 나타낼 수 있고, 섬오갈피나무는 Eleutherococcus gracilistylus(W.W.Sm.) S.Y.Hu 또는 Acanthopanax koreanum Nakai로 나타낼 수 있다. 또한, 가시오갈피는 Eleutherococcus senticosus(Rupr. & Maxim.) Maxim., Acanthopanax senticosus (Rupr.&Maxim.) Harms. 또는 Acanthopanax senticosus for. inermis.의 학명으로 나타낼 수 있고, 지리산오갈피는 Eleutherococcus divaricatus var. chiisanensis(Nakai) C.H.Kim & B.Y.Sun 또는 Acanthopanax chiisanensis Nakai로 나타낼 수 있고, 단경오갈피나무는 Acanthopanax sessilitlorus로 나타낼 수 있고, 당오갈피나무는 Acanthopanax siebololianum로 나타낼 수 있고, 왕가시오갈피나무는 Acanthopanax senticosus var. koreanus .로 나타낼 수 있고, 털오갈피는 Acanthopanax rufinerve Nakai로 나타낼 수 있다.

더욱 바람직하게 본 발명의 오가피는 섬오갈피나무, 오갈피나무 또는 가시오갈피일 수 있다.

본 발명은 오가자 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 오가자 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

1) 오가자에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및

3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계.

본 발명은 상기 오가자 추출물은 물, C₁~C₄ 의 알콜, 헥산, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 초산에칠, 에테르, 클로로포름 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 추출용매로 추출된 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 물, C₁~C₄ 알콜의 저급알콜 또는 이들의 혼합용매 중 어느 하나를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 물, 메탄올, 에탄올 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 추출용매로 추출할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 오가자 추출물의 추출 방법으로는 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 상온 추출, 가속용매 추출, 환류냉각 추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있으며, 구체적으로 여과법, 침지추출, 상온 추출 또는 가속용매 추출 방법으로 추출하는 것이 바람직하다. 가속용매추출 방법은 가속용매추출장치에 오가자 및 추출용매를 가하고 고온 및 고압에서 빠른 속도로 추출하는 방법으로서, 오가자 내의 유용 활성 성분의 구조 변화가 최소화되기 때문에 수율이 증가하며 따라서 알레르기 질환 또는 염증 질환의 치료 효과가 증가할 수 있다.

상기 추출용매는 건조된 오가자 분량의 2 내지 20 배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20 내지 80℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 보다 바람직하게는, 여과법, 침지추출 및 상온추출 방법으로 오가자 추출물을 제조하는 경우 추출온도는 20 내지 40℃인 것이 바람직하고, 가속용매 추출 방법으로 추출물을 제조하는 경우 추출온도는 45 내지 60℃인 것이 바람직하다.

또한, 상기 침지추출 및 상온추출 방법으로 오가자 추출물을 제조하는 경우 추출시간은 10 내지 100 시간인 것이 바람직하며, 구체적으로 24 내지 96 시간이 더욱 바람직하고, 보다 구체적으로 24 내지 36 시간이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

또한 본 발명의 오가자 추출물은 독성 및 부작용 등의 문제가 없다. 본발명의 일실시예에서는 오가자 추출물의 세포 증식을 확인하였는데, 50 ㎍/㎖ 농도에서 80% 이상의 세포증식능을 보여, 독성 및 부작용이 거의 없거나, 낮은 것으로 확인되었다.

이에, 상기 오가자 추출물은 바람직하게는 0.1 내지 50 ㎍/㎖의 농도로 조성물에 함유될 수 있다.

본 발명의 상기 알레르기 질환이란 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 천식, 아나필락시스 쇼크, 식품 알레르기, 화분증, 약제 알레르기, 식물 알레르기, 두드러기, 습진, 및 알레르기성 피부염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 일 수 있다.

상기 염증질환은 피부 염증질환일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 아토피 피부염인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 오가자 추출물은 베타-헥소사미니데이즈의 분비를 억제하고, 염증성 사이토카인 및 면역글로불린 E를 억제하는 활성을 갖는 것일 수 있다. 여기서 염증성 사이토카인은 IL-4 또는 TSLP일 수 있다.

본 발명의 도 2 또는 실시예 <2-2>에 따르면, 오가자 추출물을 처리하였을 때, 베타-헥소사미니데이즈의 분비가 억제되는 것을 확인할 수 있으며, 가장 바람직하게는 오가자 추출물 50 ㎍/㎖의 농도로 처리할 때, 가장 높게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 도 3 및 도 4 또는 실시예 <2-3>에 따르면, 오가자 추출물이 양성 대조군보다 IL-4 분비 억제 효과가 우수하다는 것을 확인하였다.

본 발명의 도 5 및 6 또는 실시예 <3-1>에 따르면, 다양한 추출 조건으로 제조된 오가자 추출물은 피부각질세포 및 급성립프아구성 말초혈 유래 T 세포에 대하여 높은 세포증식률을 나타내어, 세포독성이 낮다는 것을 확인하였다.

본 발명의 도 7 및 도 8 또는 실시예 <3-2>에 따르면, 다양한 추출 조건으로 제조된 오가자 추출물은 알러지 자극제로 자극된 세포에서 염증반응을 유발하는 사이토카인인 TNF-α 및 IL-2의 발현 수준을 감소시켜, 유의적인 항알러지 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 도 9에 따르면, 오가자 추출물을 실험동물에 도포하였을 때, 스크레치 횟수가 현저히 감소하였음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 도 10 및 도 12에 따르면, 오가자 추출물을 도포한 아토피 유도 마우스의 피부조직에는 IL-4 염증성 사이토카인 및 TSLP 사이토카인이 낮게 관찰되었으며, 본 발명의 도 11에 따르면, 오가자 추출물을 도포한 마우스의 혈장에서 IgE이 낮게 관찰되었음을 확인하였다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 오가자 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 및 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.

본 발명의 상기 알레르기 질환이란 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 천식, 아나필락시스 쇼크, 식품 알레르기, 화분증, 약제 알레르기, 식물 알레르기, 두드러기, 습진, 및 알레르기성 피부염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 일 수 있으며, 바람직하게는 알레르기성 피부염 또는 아토피 피부염일 수 있다.

상기 염증질환은 피부 염증질환일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 아토피 피부염인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 오가자 추출물은 베타-헥소사미니데이즈의 분비를 억제하고, 염증성 사이토카인 및 면역글로불린 E를 억제하는 활성을 갖는 것일 수 있다. 여기서 염증성 사이토카인은 IL-4 또는 TSLP일 수 있다.

오가자 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다. 또한, 고혈압 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다.

이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물들은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실험재료의 준비

<1-1> 상온 추출 오가자 추출물의 준비

실험에 사용된 오가자(Eleutherococcus sessiliflorus(Rupr. & Maxim.) S.Y.Hu 또는 Acanthopanax sessiliflorus(Rupr. & Maxim.) Seem. fruits)는 2012년 시중에서 구입한 것을 사용하였다. 건조한 오가자를 분쇄한 후 하기 [표 1]에 기재된 조건에 따라 상기 오가자의 10배량의 물, 에탄올 또는 에탄올 수용액에 침지하고 24 시간 동안 3회 추출 한 후 동결건조기를 사용해 용매를 제거하고, 상온 추출 오가자 추출물을 수득하였다. 추출물량(g) 및 추출 수율(%)은 하기 [표 1]에 기재된 바와 같은 것으로 확인하였다.

본 발명에서 제조한 오가자 추출물의 추출 조건 및 추출물 수율

시료번호	추출조건	시료무게(g)	추출물량(g)	수율(%)	채취장소
1	상온·100%에탄올 추출	200	18.10	9.1	충북제천
2	상온·70%에탄올 추출	200	41.29	20.6	충북제천
3	상온·50%에탄올 추출	200	60.04	30.0	충북제천
4	상온·30%에탄올 추출	200	55.96	28.0	충북제천
5	상온·물 추출	200	51.05	25.5	충북제천
6	100%에탄올ASE추출	179.67	12.82	7.1	충북제천
7	70%에탄올ASE추출	209.82	44.47	21.2	충북제천
8	30%에탄올ASE추출	72.47	22.92	31.6	충북제천
9	50%에탄올ASE추출	414.75	103.11	24.9	충북제천
10	100%ASE추출	200	51.05	25.5	충북제천

<1-2> 가속용매 추출 오가자 추출물의 준비

실험에 사용된 오가자(Eleutherococcus sessiliflorus(Rupr. & Maxim.) S.Y.Hu 또는 Acanthopanax sessiliflorus(Rupr. & Maxim.) Seem. fruits)는 2012년 시중에서 구입한 것을 사용하였다. 건조한 오가자를 분쇄한 후 상압 및 상온 조건 또는 가속용매추출장치(Accelerated Solvent Extraction, ASE)에 가한 후, 상기 [표 1]에 기재된 조건에 따라 상기 오가자의 10배량의 물, 에탄올 또는 에탄올 수용액을 ASE에 가하여 50℃/고압에서 추출 한 후 동결건조기를 사용해 용매를 제거하고, 상온 추출 오가자 추출물 또는 ASE 추출물을 수득하였다. 추출물량(g) 및 추출 수율(%)은 상기 [표 1]에 기재된 바와 같은 것으로 확인하였다.

<1-3> 세포의 배양

실험에 사용된 비만 세포(mast cells)인 RBL-2H3 세포주는 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 구입하였으며, 15% 소태아혈청(FBS), 100 mM 피루브산 나트륨, 페니실린이 보충된 48 웰 배양 플레이트에 2.5⁵ 세포수/웰에 5% CO₂, 37℃조건의 배양기에서 배양하였다.

피부각질세포인 HaCa T 세포와 Jurkat T 세포(모두 한국세포주은행에서 구입)는 10% 우태아혈청, 100 IU/㎖ 페니실린G, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민을 포함하는 RPMI640 배지에서 배양하였다. 각각의 세포주는 대수증식기(Log-phase)에 해당하는 세포를 각각의 실험에 맞게 12-웰, 6-웰 또는 60 ㎜ 페트리 디쉬에 분주하여 배양하였다.

비만세포에서 오가자 추출물의 항알러지 효과 확인

<2-1> MTT법을 이용한 세포 독성 평가

상기 실시예 <1-3>에서 준비한 비만 세포를 배양 후, 상기 실시예 <1-1>에서 준비한 상온 또는 ASE에서 추출된 오가자 물 추출물을 각각 비만 세포에 24시간 처리하고 음성 대조군으로 용매인 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 첨가하였다. 하루 동안 37 ℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 세포 독성을 측정하기 위하여 MTT(USB, Cleveland, Ohio, USA) 용액 200 ㎍/㎖ 되도록 넣고 3시간동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 4시간 배양하였다. 그 후 MTT 용액을 제거하고, DMSO 100 ㎕를 첨가한 후 Biotek Synergy HT plate reader(Biotek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 오가자 추출물은 처리농도에 비례하여 세포증식을 감소시키는 경향을 보였으나, 50 ㎍/㎖ 처리 농도에서도 120%정도의 비교적 높은 세포증식을 나타내었다. 이를 토대로, 오가자 추출물은 비교적 높은 농도에서 낮은 세포 독성을 나타낸다는 것을 확인하였다.

<2-2> 비만세포 탈과립 관련 베타-헥소사미니데이즈의 방출량 측정

알러지 반응은 염증성 질환의 한 종류로, 비만 세포가 탈과립되어 일어나는데 이때 히스타민이 분비되게 된다. 히스타민은 비만 세포에서 합성, 저장되고 급성 염증반응에 많은 영향을 끼치는 것으로 알려져 있으며, 베타-헥소사미니데이즈는 히스타민과 비만 세포 내에 함께 존재하는 효소로 탈과립에 의해 누출되는 히스타민의 양과 비례하는 것으로 알려져 있어, 항알러지 효과 확인의 지표로서 이용되고 있다. 이에, 오가자 추출물의 항알러지반응을 확인하기 위하여, 베타-헥소사미니데이즈의 방출량을 측정하였다.

비만 세포를 배양 후 Tyrode's buffer로 교체하고 DNP-IgE(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 200 ng/㎕를 처리하여 24시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 그 후, 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 상온 오가자 물 추출물을 1시간 전 처리한 후 DNP-BSA(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 50 ng/㎕을 넣고 2시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 그런 다음 얼음 위에서 탈과립 반응을 멈추었다. 96웰 검정 플레이트에 상층액 25 ㎕와 2.4 mM 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-b-D-glucosaminide(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 100 ㎕를 혼합 후 1시간동안 37 ℃에서 배양 하였다. 그 후, 0.1 M 글리신-카보네이트 버퍼(pH 10.0) 175 ㎕를 첨가하여 반응을 멈추고 Biotek Synergy HT plate reader(Biotek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 형광을(ex:360nm em:450nm)를 측정하였다.

그 결과 도 2에 보이는 바와 같이, 오가자 추출물 2 ㎍/㎖를 처리한 실험군에서는 베타-헥소사미니데이즈 방출 억제능이 8%로 나타났으며, 오가자 추출물 10 ㎍/㎖를 처리한 실험군에서는 억제능이 3%로 나타났다. 반면 오가자 추출물 50 ㎍/㎖ 를 처리한 실험군에서는 약 20% 가량의 베타-헥소사미니데이즈 방출 억제능을 보여, 아주 우수한 베타-헥소사미니데이즈 억제 효과를 나타내었다.

<2-3> 알러지 반응 관련 IL-4 사이토카인의 생성량 변화 측정

사이토카인 IL-4의 과량 생산은 알러지 질환과 연관이 있다. 이에, 본 실시예 4에서는 오가자 추출물 처리에 따른 IL-4 사이토카인 생성량의 변화를 측정하였따.

상기 실시예 <1-3>에서 준비한 비만세포에, 블랭크 대조군(Blank control), 각 표준물질(양성 대조군 R406) 및 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 상온 오가자 물 추출물 100 ㎕ 씩을 웰에 가한 후 모든 웰에 1×anti-IL-4 50 ㎕를 가하고 커버해서 실온(18~25℃)에서 4시간동안 배양하였다. 커버를 제거하고 수차례 플레이트를 세척한 후 1×solution 100 ㎕를 가하여 상온에서 30분 동안 리-커버(re-cover)하고 배양하고 세척하였다. 각 웰에 chromogen TMB substrate solution 100 ㎕를 가한 후 알루미늄 호일에 있는 플레이트를 싸서 실온, 암소에서 10 내지 20 분간 배양하였다. 각 웰에 stop reagent 100 ㎕를 가해 Biotek Synergy HT plate reader(Biotek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 즉시 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 3 및 도 4에 나타나는 바와 같이, 오가자 추출물이 양성대조물질인 R406에 비해 IL-4 분비를 저해하는 효과가 우수하였음을 확인할 수 있었다.

피부각질세포에서 오가자 추출물의 항알러지 효과 확인

<3-1> MTT법을 이용한 세포 독성 평가

구체적으로, HaCaT 세포 또는 Jurkat T 세포를 각각 5×10⁵ 세포/웰 농도로 10% FBS 및 1% 항생제(앰피실린, 스트렙토마이신)을 포함하는 DMEM 배지를 분주한 48-웰 플레이트에 접종한 다음, 37℃의 5% CO2 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 후, 배지에 상기 실시예 <1-1> 및 <1-2>에서 제조한 상온 추출 또는 가속용매 추출한 오가자 추출물을 각각 20 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 24 시간 동안 추가 배양하였다. 배양 후, 각각의 웰에 0.1% MTT(Sigma M2128) 용액을 100 ㎕씩 가하고, 3시간동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양하였다. 그 후 배양액 및 MTT 용액을 제거하고, DMSO 100 ㎕를 첨가한 후 Biotek Synergy HT plate reader(Biotek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 5 및 도 6에서 나타난 바와 같이 다양한 용매 및 추출 조건으로 제조된 오가자 추출물은 피부각질세포에 대하여 90% 이상의 증식률을 나타내는 것을 확인하였다. HaCaT 세포의 경우, 모든 오가자 추출물이 91% 이상의 높은 세포 증식율을 나타내는 것을 확인하였으며, 특히 가속용매추출장치(ASE)에서 물을 용매로하여 추출하였을 때 105.6%의 가장 높은 수준의 증식 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 5). 급성림프아구성 말초혈 유래의 T 세포주인 Jurkat T 세포의 경우, 모든 오가자 추출물 처리군에서 94% 이상의 높은 수준의 세포증식율을 나타내는 것을 확인하였으며, 특히 상온에서 70% 에탄올 수용액을 용매로 사용하여 추출한 추출물에서 99.6%의 세포증식률을 나타내는 것을 확인하였다(도 6).

<3-2> TNF-α 및 IL-2 mRNA 발현 수준 확인을 통한 오자가 추출물의 항알러지 활성 확인

본 발명의 오가자 추출물이 알러지 반응 유도를 매개하는 비만세포 외에 알러지 자극 반응을 받은 피부각질세포에 대해서도 항알러지 효과는 나타낼 수 있는지 확인하기 위하여, 알러지 자극을 받은 피부각질세포에서 TNF-α 및 IL-2의 발현 수준을 확인하였다.

구체적으로, 피부각질세포인 HaCaT 세포 또는 Jurkat T 세포를 각각 2×10⁶ 세포/웰 농도로 6-웰 플레이트에 분주한 다음, 각각의 세포 배지에 알러지 자극제를 첨가하였다. HaCaT 세포를 자극하기 위한 자극제로서는 TNF-α 및 INF-γ(모두 R&D systems, USA)을 첨가하였으며, Jurlat T 세포를 자극하기 위한 자극제로서는 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA) 및 A23187(모두 sigma, USA)를 배지에 첨가하였다. 24 시간 동안 세포를 배양한 다음, 상기 실시예 <1-1> 및 <1-2>에서 제조한 상온 추출 또는 가속용매 추출한 오가자 추출물을 각각 20 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 4 시간 동안 추가 배양하였다.

배양 후, 세포를 수득하여 클로로포름을 첨가하여 20 내지 30초 동안 볼텍싱 혼합하고 4℃에서 15,000 rpm으로 15 분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 3 층으로 분리된 시료 중 최상층액을 새 튜브로 옮긴 뒤, 동량의 이소프로판올을 가하고 10 분 동안 실온 방치한 후, 다시 4℃에서 15,000 rpm으로 20 분 동안 원심분리하였다. 분리된 상층액을 버리고 침전물만 수득하여, 핵산가수분해효소 억제제를 포함하는 75% 에탄올 수용액으로 세척한 후, 4℃에서 13,000 rpm으로 5 분 동안 원심분리하였다. 분리된 상층액을 다시 제거한 후 수득한 침전물을 핵산가수분해효소 억제제(diethyl pyrocarbonate, DEPC)를 포함하는 증류수에 녹여 세포로부터 mRNA를 추출 분리하였다. 추출 분리한 mRNA는 -80℃에서 보관하였으며, 전체 RNA 농도는 RNase가 처리된 0.1% DEPC 수용액에 용해하여 UV 분광광도계로 260 ㎚/280 ㎚에서 흡광도 측정하여 계산하였다. 추출 분리한 1 ㎍의 mRNA를 주형으로 하고 100 pmole 올리고뉴클레오티드 dT 프라이머 및 Accupower^ⓡ RT PreMix(Bioneer Co, Korea)를 혼합하여, 증류수로 반응 전체 용량을 20 ㎕로 조절한 PCR 반응물을 70℃에서 5분, 42℃에서 1시간 및 80℃에서 15분 동안 반응하여 cDNA를 역전사 합성하였다.

합성된 cDNA를 주형으로 하여 1 ㎍ cDNA, Accupower^ⓡ RT PreMix(Bioneer Co, Korea) 및 정방향/역방향 프라이머 각각 10 pmol을 혼합하여 PCR 반응물을 제조하고 PCR 반응하여 TNF-α 또는 IL-4 mRNA 서열을 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 1% 아가오로스 젤에서 전기영동하여 밴드의 두께 및 밝기를 이용하여 ImageJ 1.44d 프로그램을 통해 정량분석하였다.

또한, mRNA 발현 수준의 실시간 정량 분석을 위해 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하였다. 상기 역전사 합성한 cDNA를 주형으로 하여 DyNAmo SYBR Green qPCR 키트(TaKaRa Bio Inc., Japan)의 2×PCR master mix 및 정방향/역방향 프라이머를 혼합하고 PCR 조건에 맞추어 DNA Engine Opticon(MJ Research, 미국) 기기를 이용하여 PCR 증폭 수행을 하였다. 상대적인 DNA 정량 분석을 위한 보정을 위해 각각의 시료군 내 GAPDH의 발현 수준을 기준으로 TNF-α 및 IL-2 발현 수준을 보정하였다. 용매 대조군(CON)으로는 알러지 자극제를 처리하지 않고 추출물 대신 DMSO를 처리한 군을 대상으로 하였으며, 추출물 처리군에서의 TNF-α 및 IL-2 발현 수준을 용매대조군과 비교하여 상대적인 유전자 발현 수준을 계산하였다. 음성 대조군(NC)으로는 알러지 자극제를 처리하고 추출물을 처리하지 않는 군을 대상으로 하였다.

그 결과, 도 7 및 도 8에서 나타난 바와 같이 다양한 용매 및 추출 조건으로 제조된 오가자 추출물은 피부각질세포에 대하여 TNF-α 및 IL-2의 발현 수준을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다. HaCaT 세포의 경우, 모든 오가자 추출물이 -2.9% 내지 94.9% 범위로 TNF-α의 mRNA 발현을 억제하는 것을 확인하였으며, 특히 상온에서 30% 에탄올 수용액을 추출용매로 하여 제조한 오가자 추출물의 경우 음성 대조군에 비해 94.4% 수준으로 TNF-α의 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 이를 용매 대조군(CON)과 비교하였을 때, 용매 대조군은 음성 대조군에 비해 93.9% 수준으로 TNF-α의 발현 억제를 나타내므로, 본 발명의 오가자 추출물은 알러지 자극되지 않은 피부각질세포의 수준으로 TNF-α 발현 수준을 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 7). 이 외에도, ASE에서 100% 에탄올을 용매로 하여 추출하였을 때 음성 대조군에 비해 51.7%의 TNF-α 발현 수준을 나타내며, 상온에서 100% 에탄올을 용매로 하여 추출하였을 때 24.7%의 TNF-α 발현 수준을 나타내어, 비교적 우수한 TNF-α 발현 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 7).

또한, Jurkat T 세포의 경우, 모든 오가자 추출물이 3.5 내지 34.8% 범위로 IL-2의 mRNA 발현을 억제하는 것을 확인하였으며, 이중 상온에서 물로 추출한 오가자 추출물의 경우 음성 대조군에 비해 34.8% 수준으로 IL-2의 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 이 외에도, ASE에서 50% 에탄올 수용액을 용매로 하여 추출하였을 때 음성 대조군에 비해 33.6%의 IL-2 발현 수준을 나타내며, ASE에서 30% 에탄올 수용액을 용매로 추출한 오가자 추출물에서 33.3%, 상온에서 70% 에탄올 수용액을 용매로 추출한 오가자 추출물에서 30.8% 수준으로 IL-2 발현을 억제하여, 비교적 우수한 IL-2 발현 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 8).

생체 내에서 오가자 추출물의 항알러지 활성 확인

<4-1> 실험동물 준비 및 아토피 모델군의 제조

아토피실험을 위한 실험동물로는 NC/Nga 마우스를 사용하였으며, 본 실험에 앞서 1주일이상 실험환경에 적응시킨 후 사용하였다. 사육실은 12시간의 명암주기와 23℃의 실내온도를 유지시켰고, 사료는 대한바이오링크에서 구입한 멸균된 고형사료를 급여하였고, 자외선으로 살균한 물을 급수하였다.

아토피 유발은 목과 등부위를 제모한 후 24시간 후 4% SDS(sodium dodecyl sulfate)로 피부의 피부장벽 붕괴를 유도하고 3시간 후 집먼지진드기를 사용하여 유도하였다. 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 상온 오가자 물 추출물은 1% 및 5% 농도로 70% 에탄올에 녹여 조제한 후 매일 오전에 피부에 도포하였다.

아토피를 유발한 동물 모델에 대하여 오가자 추출물을 도포한 실험은 두 가지로 나누어 수행하였다. 먼저, 첫 번째 실험 조건으로 아토피 유발은 주 2회씩 55일간 동안 총 15회 50 ㎎ 도포하여 유도하였고 오가자 추출물은 아토피가 유발된 것이 확인된 29일 이후부터 22일간 주6회 매일 오전에 피부에 도포하였다. 두번째 실험 조건으로 아토피 유발은 주 2회씩 14일 동안 총 4회 50 ㎎ 도포하여 유도하였고 오가자 추출물은 아토피 유발과 병행하여 총 13일간(6회/주) 매일 오전에 피부에 도포하였다.

<4-2> 실험동물의 스크래치 횟수 측정

55일간 아토피를 유발하면서 22일간 오가자 추출물을 도포한 마우스에서 오가자 추출물의 개선효과를 동물행동으로 확인하고자 긁는 횟수를 측정하였다. 측정 장비로는 동물특수행동측정장치(METRIS, LABORAS, 네델란드)를 사용하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 아토피를 유발한 마우스(NC)에서는 정상 마우스보다 스크래치 횟수가 2배 이상 높았다. 한편, 오가자 추출물을 도포한 마우스에서는 아토피가 유발된 음성대조군(NC)보다 스크래치 횟수가 현저히 감소하였다. 스크래치의 횟수는 오가자 추출물을 1% 농도로 도포할 때 보다, 5% 농도로 도포하였을 경우 크게 감소하는 것으로 나타났다. 한편, 양성 대조군으로 사용한 타크로리무스 연고보다 5% 농도의 오가자 추출물이 더욱 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되어, 본 발명의 오가자 추출물이 아토피 치료에 효과적이라는 것을 확인하였다.

<4-3> 오가자 추출물의 아토피 유도 마우스 피부조직에서의 염증성 사이토카인 IL-4 감소 효과

상기 실시예 <4-1>에서 준비한 아토피 유도 마우스에 상기 두번째 실험 조건의 방법으로 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 상온 오가자 물 추출물을 도포하였다. 그 후 피부조직을 떼어내어 피부 조직 균질액을 준비하였다. 300 ㎎의 제모된 생쥐 피부조직을 1.6 ㎖의 Tissue homogenate buffer(10 mM HEPES, pH 7.8, 10 mM KCL, 2 mM MgCl, 1 mM dithiothreitol(DTT), 0.1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, 1 μM pepstatin, 1 mM p-aminobenzamidine)와 함께 균질화하였다. 15 분 후 10 % Nonidet p40을 125 ㎕ 추가하여 20 초 정도 섞은 후 12,000 rpm 5분간 원심분리하여 상등액을 사용하였다. 다음으로 웨스턴 블롯을 위해 40 ㎍의 단백질이 포함된 조직 균질액을 겔 로딩 버퍼(0.125 M Tris, pH 6.8, 4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 0.2 % bromphenol blue)와 혼합한 후 80℃에서 5분간 가열하였다. 각각의 샘플을 12 % SDS-폴리아마이드 미니-겔에서 2시간 110V로 전기영동시켰다. Towbin 버퍼(25 mM Tris, 192 mM 글리신, 20% 메탄올)를 이용하여 polyvinylidene difluoride(PVDF) 멤브레인 이동시키고, 비 특이적 단백결합을 차단하기 위해 멤브레인을 5% 무지방 우유를 함유한 세척 버퍼에 시간 교반시킨 후 세척하고 1차 항체와 4 ℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 세척하고 horseradish-peroxidase가 결합 된 2차 항체와 실온에서 30분 반응시켰다. 세척 후 ECL detection reagent를 가하여 생성되는 형광을 이미지 분석기로 촬영하여 신호를 확인하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 14일간 아토피를 유발하면서 13일간 오가자 추출물을 도포한 마우스의 피부조직에서 양성대조물질인 타크로리무스 연고만큼 효과적인 IL-4 감소를 보이지는 않았으나, 처리량에 비례하여 IL-4 감소효과가 있었다.

<4-4> 오가자 추출물의 아토피 유도 마우스 혈청 중 IgE 감소효과

상기 실시예 <4-1>의 두 번째 방법으로 준비한 마우스의 혈청을 복부대동맥에서 취하여 15분간 냉장보관 후 원심분리하여 얻어 각 웰에 각 표준액과 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 상온 오가자 물 추출물을 100 ㎕를 투여하여 실온에서 2.5 시간 흔들어서 배양하였다. 용액을 버리고 세척한 후 1X Biotinylated IgE Detection Antibody 100 ㎕를 추가하여 흔들면서 실온에서 1 시간 동안 배양하고, 다시 용액을 제거하고 세척하였다. 1X HRP-Streptavidin solution 100 ㎕를 추가하고 흔들면서 실온에서 45 분 배양하고, 용액 제거 및 세척을 반복하였다. 그 후 각 웰에 TMB One-Step Substrate Reagent 100 ㎕를 추가하여 실온에서 30 분 배양하고 각 웰에 Stop Solution 50 ㎕를 추가한 후 즉시 450 nm에서 측정하였다.

그 결과, 도 11에서 보이는 바와 같이, 14일간 아토피를 유발하면서 13일간 오가자 추출물을 도포한 마우스가 정상군에 비해 IgE의 농도가 증가된 것을 확인할 수 있었다. 반면, 음성대조군에 비해 오가자 추출물을 도포한 실험군들에서 IgE 감소효과가 있었으며 이러한 결과는 양성대조물질보다 우수하였다.

<4-5> 피부조직의 TSLP(thymic stromal lymphopoietin) 함량 분석

피부조직에서 TSLP는 IL-7과 유사한 구조를 갖고있는 사이토카인으로 피부의 각질형성세포, 상기페소, 평활근 세포 및 폐의 섬유모세포 등에서 발현된다. TSLP는 수지상 세포를 활성화시켜 헬퍼 T 세포를 Th2 세포로 분화시키며, Th2 세포의 분화는 아토피 피부염의 증상을 유발시키는 데 중요한 역할을 하므로, 오가자 추출물의 TSLP 억제 효과를 측정하였다.

상기 실시예 <4-1>에서 준비한 아토피 유도 마우스에 상기 두번째 실험 조건의 방법으로 오가자 추출물을 도포하였다. 그 후 피부조직을 떼어내어 피부 조직 균질액을 준비하였다. 300 ㎎의 제모된 생쥐 피부조직을 1.6 ㎖의 Tissue homogenate buffer(10 mM HEPES, pH 7.8, 10 mM KCL, 2 mM MgCl, 1mM dithiothreitol(DTT), 0.1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, 1 μM pepstatin, 1 mM p-aminobenzamidine)와 함께 균질화하였다. 15 분 후 10 % Nonidet p40을 125 ㎕ 추가하여 20 초 정도 섞은 후 12,000 rpm 5분간 원심분리하여 상등액을 사용하였다. 다음으로 웨스턴 블롯을 위해 40 ㎍의 단백질이 포함된 조직 균질액을 겔 로딩 버퍼(0.125 M Tris, pH 6.8, 4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 0.2 % bromphenol blue)와 혼합한 후 80℃에서 5분간 가열하였다. 각각의 샘플을 12 % SDS-폴리아마이드 미니-겔에서 2시간 110V로 전기영동시켰다. Towbin 버퍼(25 mM Tris, 192 mM 글리신, 20% 메탄올)를 이용하여 polyvinylidene difluoride(PVDF) 멤브레인 이동시키고, 비 특이적 단백결합을 차단하기 위해 멤브레인을 5% 무지방 우유를 함유한 세척 버퍼에 시간 교반시킨 후 세척하고 1차 항체와 4 ℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 세척하고 horseradish-peroxidase가 결합 된 2차 항체와 실온에서 30분 반응시켰다. 세척 후 ECL detection reagent를 가하여 생성되는 형광을 이미지 분석기로 촬영하여 신호를 확인하였다.

그 결과 도 12에 보이는 바와 같이, 55일간 아토피를 유발하면서 22일간 오가자 추출물을 도포한 마우스에서는 음성 대조군에서 보다 피부조직의 TSLP는 다소 감소하였음을 확인하였다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제제예 1] 산제의 제조

실시예 1의 오가자 추출물 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

[제제예 2] 정제의 제조

실시예 1의 오가자 추출물 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

[제제예 3] 캅셀제의 제조

실시예 1의 오가자 추출물 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

[제제예 4] 주사제의 제조

실시예 1의 오가자 추출물 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

[제제예 5] 액제의 제조

실시예 1의 오가자 추출물 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

[제제예 6] 건강 음료의 제조

실시예 1의 오가자 추출물 100 ㎎

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3 g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강 음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (11)

1. 오가자 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C₁~C₄ 의 알콜, 헥산, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 초산에칠, 에테르, 클로로포름 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 추출용매로 추출된 것을 특징으로 하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 건조된 오가자를 상온에서 추출용매에 침지하여 추출하거나, 가속용매추출장치(Accelerated Solvent Extraction, ASE)를 사용하여 추출하여 수득하는 것을 특징으로 하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 0.1 내지 50 ㎍/㎖의 농도로 조성물에 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 알레르기 질환이란 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 천식, 아나필락시스 쇼크, 식품 알레르기, 화분증, 약제 알레르기, 식물 알레르기, 두드러기, 습진, 및 알레르기성 피부염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 염증질환은 피부 염증질환 또는 아토피 피부염인 것을 특징으로 하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 오가자 추출물은 베타-헥소사미니데이즈(β-hexoxaminidase)의 분비를 억제하고, 염증성 사이토카인 및 면역글로불린 E를 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 염증성 사이토카인은 IL-4(interleukin 4) 또는 TSLP(thymic stromal lymphopoietin)인 것을 특징으로 하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
9. 오가자 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 및 개선용 건강기능성 식품.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 알레르기 질환이란 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 천식, 아나필락시스 쇼크, 식품 알레르기, 화분증, 약제 알레르기, 식물 알레르기, 두드러기, 습진, 및 알레르기성 피부염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 및 개선용 건강기능성 식품.
    
11. 제9항에 있어서, 상기 염증질환은 피부 염증질환 또는 아토피 피부염인 것을 특징으로 하는 알레르기 질환 또는 염증질환의 예방 및 개선용 건강기능성 식품.
    

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