KR20170017266A - 타겟 물질 검출용 복합체 및 이를 이용한 타겟 물질 검출방법 - Google Patents
타겟 물질 검출용 복합체 및 이를 이용한 타겟 물질 검출방법 Download PDFInfo
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Abstract
업컨버팅 나노입자; 및 상기 업컨버팅 나노입자와 링커를 통해 연결된, 적어도 하나의 타겟 물질 특이적 압타머-소광체를 포함하는 타겟 물질 검출용 복합체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 타겟 물질 검출용 키트, 및 이를 이용한 타겟 물질 검출 방법이 제공된다.
본 발명에 따르면, 근적외선 광원(NIR)에 의해 여기되는 업컨버팅 나노입자(UCNPs)의 발광 공명 에너지 전달(LRET)에 기반하여 시료 내의 다양한 타겟 물질을 정확하게 정량 또는 검출할 수 있다.
본 발명에 따르면, 근적외선 광원(NIR)에 의해 여기되는 업컨버팅 나노입자(UCNPs)의 발광 공명 에너지 전달(LRET)에 기반하여 시료 내의 다양한 타겟 물질을 정확하게 정량 또는 검출할 수 있다.
Description
본 발명은 타겟 물질 검출용 복합체 및 이를 이용한 타겟 물질 검출방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 근적외선 광원(NIR)에 의해 여기되는 업컨버팅 나노입자(UCNPs)와 타겟 물질 특이적 압타머-소광체를 포함하는 타겟 물질 검출용 복합체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 타겟 물질 검출용 키트, 및 이를 이용한 타겟 물질 검출 방법에 관한 것이다.
최근 시료 내에 존재하는 곰팡이 독소 등의 타겟 물질을 검출하는 것이 중요한 이슈로 대두되고 있다.
이러한 타겟 물질 중 곰팡이 독소의 일종인 오크라톡신 A (Ochratoxin A; OTA)는 Penicillium 속과 Aspergillus 속에 속하는 곰팡이가 생산하는 독소로 주로 커피, 곡물, 두류, 와인, 포도주스 등에 존재한다. 오크라톡신 A는 일반적인 열처리와 같은 조리 과정을 통해서 파괴되지 않고, 화학적 안정성 및 긴 반감기를 가지며 DNA 손상, 염색체 이상을 유발한다고 보고되어 있다. 오크라톡신 A는 기형 유발성, 발암성, 면역 독성, 간독성 등의 특성을 지닌 인체 발암물질 (Group 2B)로 국제 암 연구소 (International Agency for Research on Cancer; IARC)에 의해 분류되어 있다. 이러한 인체 유해성과 다양한 식품에 대한 오염 가능성으로 인해 국내외에서는 식품별 오크라톡신 A에 대한 규제 기준치를 정해 놓았으며 이를 검출하는 방법에 대한 연구가 진행되고 있다.
공식 농업 화학자 협회 (Association of Official Agricultural Chemists; AOAC)에 따른 표준 검출방법으로는 고성능 액체 크로마토그래피 (High-Performance Liquid Chromatography; HPLC)가 있다. 이 방법은 감도가 높지만 추출, 카트리지, 면역친화성 칼럼 등의 세척, 분석 등의 프로세스를 거쳐야 하므로 그 검출과정이 복잡하여 전문가가 필요하고 분석에 장시간이 소요될 뿐만 아니라 비용이 높다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복할 수 있는 대안으로 효소면역분석법(ELISA)과 측면유동면역발색법(Lateral Flow Immunoassay; LFA)이 있다. 그러나 ELISA는 사용되는 항체가 오크라톡신과 유사한 물질과 교차반응을 자주 일으켜 정확성이 떨어지므로 아직까지 국제공인분석법 (AOAC)으로는 사용되지 않고 있다. 또한 ELISA와 LFA는 저분자 물질인 오크라톡신을 검출하기 위한 항체 확보가 쉽지 않고 경쟁반응을 통한 면역반응으로 인한 네거티브(negative) 신호를 얻기 때문에 감도가 좋지 않다. 특히 실제 식품 시료를 적용함에 있어서, 다양한 식품 속 부산물에 의한 매트릭스 효과로 인해 균질하게 (homogeneous) 오크라톡신 A를 검출하는데 한계가 있다.
특허문헌 1 및 특허문헌 2에서와 같이 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)에 기반한 바이오센서를 이용하는 방법도 있다. FRET 방법에 의하면 타겟 물질의 결합을 세척과정 없이 균질한 상태에서 측정할 수 있다는 장점이 있지만, 사용되는 유기형광 물질 및 양자점(Q-dot)을 여기시키기 위해 사용되는 자외선 또는 가시광선(UV or visible light)에 의한 생체분자 물질의 손상 및 시료 내 발광하는 여러 부산물에 의한 매트릭스 효과로 인해 비특이적 신호가 유발될 수 있다는 문제가 있다.
본 발명은 시료 내 존재하는 여러 부산물에 의한 매트릭스 효과를 제거하여 균질하게 타겟 물질을 검출할 수 있으며, 간단한 검출과정을 통해 분석 시간을 단축할 수 있고, 검출비용이 낮으며, 다양한 타겟 물질 검출에 활용할 수 있는 타겟 물질 검출용 복합체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 타겟 물질 검출용 키트, 및 이를 이용한 타겟 물질 검출 방법을 제시하고자 한다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 제1 측면은, 업컨버팅 나노입자; 및 상기 업컨버팅 나노입자와 링커를 통해 연결된, 적어도 하나의 타겟 물질 특이적 압타머-소광체를 포함하는 타겟 물질 검출용 복합체를 제공한다.
본 발명의 제2 측면은, 상기 타겟 물질 검출용 복합체를 포함하는 타겟 물질 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 제3 측면은, 시료를 상기 타겟 물질 검출용 복합체와 접촉시키는 단계; 및 상기 시료 속 타겟 물질과 접촉된 복합체에 근적외선 광원을 조사하고 업컨버팅 나노입자의 발광신호 감쇠 정도를 측정하는 단계를 포함하는 타겟 물질 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 제4 측면은, 링커-압타머-소광체를 준비하는 단계; 업컨버팅 나노입자의 표면을 카르복실기로 개질하는 단계; 및 상기 카르복실기와 링커-압타머-소광체 말단의 아민기를 결합시키는 단계를 포함하는, 타겟 물질 검출용 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 근적외선 광원(NIR)에 의해 여기되는 업컨버팅 나노입자(UCNPs)의 발광 공명 에너지 전달(LRET)에 기반하여 시료 내의 다양한 타겟 물질을 정확하게 정량 또는 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 업컨버팅 나노입자/압타머-소광체로 구성된 복합체에 있어서, 업컨버팅 나노입자로부터 타겟에 의한 압타머의 구조적 접힘에 의해 가까워진 소광체로 발광공명 에너지 전달이 일어나는 과정을 모식화한 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 업컨버팅 나노입자에 대한 투과전자현미경(TEM) 이미지, 사이즈 분포 히스토그램 및 전자회절분석(selected area electron diffraction, SAED) 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 업컨버팅 나노입자들을 근적외선 980 nm 다이오드 레이저의 조사 하에 발광되는 빛의 이미지 및 스펙트럼 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 업컨버팅 나노입자의 표면을 카르복실기로 표면 개질한 업컨버팅 나노입자의 제타전위(zeta-potential) 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 링커의 길이를 다양화하여 합성된 업컨버팅 나노입자/압타머-소광체 복합체에 있어서, 타겟 물질(오크라톡신 A) 존재/부존재 하에 측정된 발광신호의 스펙트럼 및 발광신호의 감쇠효율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 업컨버팅 나노입자/압타머-소광체 복합체에 있어서, pH 조건을 달리하면서 타겟 물질(오크라톡신 A) 존재/부존재 하에 측정된 발광신호의 스펙트럼 및 발광신호의 감쇠효율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 업컨버팅 나노입자/압타머-소광체 복합체에 있어서, 소광체의 종류를 달리하면서 타겟 물질(오크라톡신 A) 존재/부존재 하에 측정된 발광신호의 스펙트럼 및 발광신호의 감쇠효율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 업컨버팅 나노입자/압타머-소광체 복합체에 있어서, 최적화된 조건(링커 길이 및 pH)에서 타겟 물질(오크라톡신 A)의 농도를 달리하여 측정된 발광신호의 스펙트럼 및 발광신호의 감쇠효율을 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 소광체의 종류별 흡광(소광) 파장 영역과 최대 흡광 파장을 나타낸다.
도 10a 및 도 10b는 각각 본 발명의 일 구현예에 따른 타겟 물질 검출용 키트에 대한 평면 모식도 및 입체 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 업컨버팅 나노입자에 대한 투과전자현미경(TEM) 이미지, 사이즈 분포 히스토그램 및 전자회절분석(selected area electron diffraction, SAED) 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 업컨버팅 나노입자들을 근적외선 980 nm 다이오드 레이저의 조사 하에 발광되는 빛의 이미지 및 스펙트럼 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 업컨버팅 나노입자의 표면을 카르복실기로 표면 개질한 업컨버팅 나노입자의 제타전위(zeta-potential) 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 링커의 길이를 다양화하여 합성된 업컨버팅 나노입자/압타머-소광체 복합체에 있어서, 타겟 물질(오크라톡신 A) 존재/부존재 하에 측정된 발광신호의 스펙트럼 및 발광신호의 감쇠효율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 업컨버팅 나노입자/압타머-소광체 복합체에 있어서, pH 조건을 달리하면서 타겟 물질(오크라톡신 A) 존재/부존재 하에 측정된 발광신호의 스펙트럼 및 발광신호의 감쇠효율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 업컨버팅 나노입자/압타머-소광체 복합체에 있어서, 소광체의 종류를 달리하면서 타겟 물질(오크라톡신 A) 존재/부존재 하에 측정된 발광신호의 스펙트럼 및 발광신호의 감쇠효율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 업컨버팅 나노입자/압타머-소광체 복합체에 있어서, 최적화된 조건(링커 길이 및 pH)에서 타겟 물질(오크라톡신 A)의 농도를 달리하여 측정된 발광신호의 스펙트럼 및 발광신호의 감쇠효율을 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 소광체의 종류별 흡광(소광) 파장 영역과 최대 흡광 파장을 나타낸다.
도 10a 및 도 10b는 각각 본 발명의 일 구현예에 따른 타겟 물질 검출용 키트에 대한 평면 모식도 및 입체 모식도이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "구성된다" 또는 "포함한다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 여러 구성 요소들, 또는 여러 단계들을 반드시 모두 포함하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 그 중 일부 구성 요소들 또는 일부 단계들은 포함되지 않을 수도 있고, 또는 추가적인 구성 요소 또는 단계들을 더 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 제 1, 제 2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제 1 구성요소는 제 2 구성 요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제 2 구성 요소도 제 1 구성 요소로 명명될 수 있다.
본 발명에서 용어 "타겟(target) 물질"이란, 시료내에 존재하고 압타머와 결합함으로써 정량분석 또는 검출의 대상이 되는 물질을 의미한다. 압타머에 결합함으로써 정량분석 또는 검출될 수 있는 물질은 제한없이 포함되며, 그 예로, 곰팡이 독소, 세포, 단백질, 핵산, 화합물 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질일 수 있다.
본 발명에서 용어 "압타머(aptamer)"란, 시료 내의 검출하고자 하는 타겟 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산 (DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는 것으로, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 타겟 물질의 존재를 확인할 수 있다. 압타머의 제조는 일반적인 압타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 타겟 물질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 링커의 작용기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 -NH2로 변형을 시킴으로써 이루어질 수 있다.
본 발명에서 용어 "시료"란, 검출하고자 하는 타겟 물질이 들어 있을 것으로 예상되는 식품, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "검출"은 시료 중의 타겟 물질의 존재 여부를 확인하는 행위를 의미한다.
본 발명에서는 식품 내 곰팡이독소 또는 검체 내 다양한 바이오마커를 검출하기 위해, 근적외선 광원(NIR)에 의해 여기되는 업컨버팅 나노입자(UCNPs)의 발광 공명 에너지 전달(LRET)에 기반한 플랫폼을 제공하고자 한다.
이를 위하여, 본 발명에서는 타겟 물질 검출용 복합체 및 이를 포함하는 검출 키트를 제공하며, 구체적으로 상기 복합체는 (i) 업컨버팅 나노입자; 및 (ii) 상기 업컨버팅 나노입자와 링커를 통해 연결된, 적어도 하나의 타겟 물질 특이적 압타머-소광체를 포함한다.
상기 업컨버팅 나노입자는 두 개 이상의 광자의 순차적인 흡수로 인하여 근적외선 영역의 빛을 흡수하여 여기 파장(excitation wavelength)보다 더 단파장 영역인 자외선 또는 가시광선 영역에서 발광하는 물질이다. 큰 신호 세기의 발광, 우수한 안정성 및 생체 적합성의 특성을 가지고 있으며 호스트(host), 활성제(activator), 증감제(sensitizer)의 종류 및 농도 등의 조절로 발광하는 신호의 파장을 조절할 수 있다는 장점이 있다.
특히, 상기 업컨버팅 나노입자를 여기시킬 때 근적외선을 사용하므로 타겟 물질을 검출하기 위한 압타머 및 검출 대상 물질의 손상을 방지할 수 있으며 실제 시료 내에 존재하는 다양한 부산물에 의해 유발되는 매트릭스 효과로 인한 검출 신호의 감소 및 비특이적 반응들을 방지할 수 있다.
상기 업컨버팅 나노입자는 희토류 원소를 주성분으로 포함한다. 구체적인 예로써, 상기 업컨버팅 나노입자는 이트륨(Y) 또는 이터븀(Yb) 중에서 선택된 1종 이상과 활성제(activator)로 얼븀(Er), 홀뮴(Ho), 툴륨(Tm) 중에서 선택된 1종 이상을 포함한다. 조성을 다양하게 조절하여 도 3에서와 같이 NIR 조사 하에 다양한 파장대를 갖는 나노입자가 합성될 수 있다. 일반적으로 업컨버팅 나노입자 합성시, 증감제(sensitizer)로 사용되는 이터븀(Yb)의 농도보다 활성제(activator)로 사용되는 얼븀(Er), 홀뮴(Ho), 툴륨(Tm)의 농도를 10배 정도 작게 넣어 합성하나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적인 구현예에 따르면, 상기 업컨버팅 나노입자는 하기 화학식 1, 화학식 2, 또는 화학식 3의 화학적 조성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 보다 다양한 조성을 가질 수 있으며, 증감제와 활성제의 농도 비율도 달리 설정할 수 있다.
[화학식 1]
NaYF4: 20% Yb3+, 2% Er3+
[화학식 2]
NaYF4: 20% Yb3+, 2% Ho3+
[화학식 3]
NaYF4: 20% Yb3+, 2% Tm3+
업컨버팅 나노입자-압타머 복합체를 형성하기 위해 업컨버팅 나노입자 표면을 개질할 수 있다. 합성된 업컨버팅 나노입자는 소수성이므로 타겟 물질을 검출하기 위한 다양한 압타머들을 결합시키기 위해 물에 잘 분산되도록 표면을 개질하는 것이 필수적이다. 표면개질을 위한 방법으로는 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 의한 업컨버팅 나노입자의 캡슐화(encapsulation) 및 실리카에 의한 코팅 방법을 이용할 수 있다. 상기 업컨버팅 나노입자 평균 직경은 약 25 내지 30 nm이며, 실리카 코팅 및 PEG 캡슐화된 업컨버팅 나노입자는 근적외선에 응답하며 수용액에 잘 분산되어 생체물질과의 결합을 형성할 수 있다.
이와 같이, 표면 개질된 상기 업컨버팅 나노입자를 이용하여 상기 업컨버팅 나노입자/압타머-소광체 복합체를 형성함으로써, 업컨버팅 나노입자에 다양한 압타머-소광체를 제한 없이 고정할 수 있다. 상기 고정되는 압타머-소광체는 타겟 물질의 종류에 따라 선택된 1종 이상이 사용될 수 있다. 압타머는 타겟 물질의 종류에 따라 그 서열이 달라질 수 있으며 다종의 타겟 물질을 동시 진단 시에는 서로 다른 발광 파장을 가지는 업컨버팅 나노입자 및 그 발광 파장과 유사한 영역대의 흡광 파장을 가지는 소광체가 사용될 수 있다. 따라서, 적절한 흡광 파장을 가지는 소광체를 선택하여 압타머에 결합하여 사용할 수 있으며, 상기 소광체는 압타머 합성과정 중에 소광체를 도입하는 방법 또는 압타머의 말단을 특정 관능기로 변형한 후 그와 결합할 수 있는 관능기가 결합된 소광체를 화학적 결합시켜 도입하는 방법에 의할 수 있다.
예를 들어, 상기 압타머의 합성 과정 중 커플링(coupling) 단계에서 구아닌(Guanine; G), 아데닌(Adenine; A), 티민(Thymine; T), 사이토신(Cytosine; C) 대신 소광체가 결합되어있는 포스포라미디트 모노머(phosphoramidite monomer)를 이용한다면 압타머 말단에 소광체를 도입할 수 있다. 또는, 압타머 말단을 아민기로 변형하고 n-hydroxysuccinimide(NHS)-소광체와 반응시켜 압타머 말단에 소광체를 도입할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 소광체로는 Blackhole quencher(BHQ), 유기형광물질, 및 양자점(Quantum dot; Q-dot)으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상이 사용될 수 있다. 도 9에는 예시적으로 본 발명에서 사용될 수 있는 소광체의 종류와 그의 흡광(소광) 파장 영역을 나타내었다.
상기 압타머-소광체는 상기 업컨버팅 나노입자와 링커를 통해 연결되어 있으며, 상기 링커는 압타머를 소광체에 도입하는 과정과 유사하게, 압타머의 일 말단에 도입될 수 있다. 즉, 압타머의 합성시에 아데닌(A)과 같이 의미없는 서열을 개수를 조절하여 압타머의 일 말단에 결합시킬 수 있다. 상기 링커는 소광체가 결합되지 않은 압타머의 일 말단에 형성되어 에너지 전달이 효율적으로 일어날 수 있는 길이가 되도록 개수를 제어하는 것이 바람직하다.
상기 업컨버팅 나노입자와 상기 링커-압타머-소광체는 표면이 개질된 업컨버팅 나노입자의 관능기와 링커-압타머-소광체 말단의 관능기간의 물리적 또는 화학적 결합을 통해 연결될 수 있다. 상기 화학적 결합의 예로서 공유 결합, 이온 결합 등을 들 수 있고, 상기 물리적 결합의 예로는 흡착 등의 경우가 있을 수 있다. 상기 링커-압타머-소광체의 일측 말단(5')에는 업컨버팅 나노입자에 결합할 수 있는 관능기를 가질 수 있으며, 타측 말단(3')에는 발광된 업컨버팅 나노입자의 발광 에너지를 흡수시킬 수 있는 소광체를 포함할 수 있다. 상기 5' 말단과 3' 말단은 서로 양 말단을 구분하기 위한 것일 뿐, 일측 말단이 5' 말단이면 타측 말단은 3' 말단일 수 있고, 일측 말단이 3' 말단이면 타측 말단은 5' 말단일 수 있다.
상기 복합체의 업컨버팅 나노입자는 에너지 주게(donor) 역할을 할 수 있고, 근적외선 조사 하에 주게의 발광 파장과 유사한 영역대의 흡광 파장을 가지는 소광체는 에너지 받게(acceptor) 역할을 할 수 있다. 이때, 업컨버팅 나노입자/압타머-소광체 복합체에서 압타머와 타겟 물질과의 특이적인 결합에 의해 주게에서 받게로 발광공명 에너지 전달이 일어나게 된다. 검출 대상인 타겟 물질의 농도가 증가할수록 업컨버팅 나노입자의 발광되는 신호 세기가 점점 감소하게 된다. 즉, 감쇠된 발광 신호를 통해 정량적으로 타겟 물질을 검출할 수 있다. 상기 업컨버팅 나노입자의 발광 파장 영역의 일부 또는 전부와 충첩되는 흡광 파장 영역을 가지는 소광체가 결합된 압타머가 타겟 물질과의 특이적 결합에 의해 소광체와 업컨버팅 나노입자 사이의 거리가 가까워진다. 이에 따라 발광공명 에너지 전달을 통한 감쇠된 발광신호로 다양한 타겟 물질을 효과적으로 검출할 수 있게 된다. 필요에 따라, 발광 파장 영역이 다양하도록 상기 업컨버팅 나노입자의 종류를 달리 선택할 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, 상기 타겟 물질 검출용 복합체에 근적외선이 조사되면 에너지 주게(donor)인 업컨버팅 나노입자의 들뜬 상태의 발광공명 에너지가 에너지 받게(acceptor)인 압타머 말단의 소광체로 전달된다. 따라서, 상기 업컨버팅 나노입자의 발광 파장영역과 상기 압타머-소광체를 구성하는 소광체의 흡광 파장영역이 일부 또는 전부 중첩되는 것이 에너지 전달 측면에서 유리하다. 이 때, 압타머-소광체는 상기 업컨버팅 나노입자와 링커를 통해 연결되어 있으며, 타겟 물질에 의해 압타머의 구조적 접힘이 생기면 상기 업컨버팅 나노입자와 상기 소광체의 거리가 가까워져서 에너지 전달이 수월해질 수 있다. 에너지 전달로 인한 감쇠된(quenched) 발광신호를 통하여 타겟 물질을 검출할 수 있다.
상기 압타머는 실제 시료(식품 또는 검체) 속 타겟 물질에 대하여 특이적이며, 타겟 물질이 없을 때는 상기 업컨버팅 나노입자의 발광신호의 감쇠가 일어나지 않아 업컨버전 신호가 높게 나타나지만, 타겟 물질이 존재하면 타겟 물질에 의하여 압타머의 구조적 변화가 일어나면 발광신호의 감쇠가 일어나서 업컨버전 신호가 낮게 나타난다.
본 발명의 목적상 상기 압타머는, 일례로 일 말단에 아민기(-NH2)가 결합된 DNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 압타머는 타겟 물질에 따라 자유롭게 선택할 수 있다. 따라서, 다양한 타겟 물질을 검출하고자 한다면 이들 타겟 물질에 각각 특이적인 압타머를 선택할 수 있으므로, 상기 업컨버팅 나노입자에 링커를 통해 연결되는 압타머-소광체는 적어도 하나일 수 있다. 환언하자면, 타겟 물질의 종류에 따라 선택되는 압타머-소광체 1종 이상이 상기 업컨버팅 나노입자에 연결되어 있는 형태일 수 있다. 또한, 상기 압타머-소광체는 적어도 하나의 타겟 물질에 대해 특이적인 것일 수 있다.
상기 업컨버팅 나노입자와 상기 압타머는 적절한 길이를 유지하는 것이 바람직하며, 링커를 이용하여 연결함으로써 이를 달성할 수 있다 에너지 주게에서 받게로 에너지 전달이 가장 효율적으로 일어날 수 있는 최적의 거리를 찾기 위해서 링커의 길이를 조절하는 것은 중요하다. 링커가 너무 길면 주게와 받게 사이의 거리가 너무 멀어 에너지 전달이 효과적으로 일어날 수 없기 때문이다. 따라서, 적절한 길이의 링커를 선택하는 것이 중요하며, 링커의 길이를 조절함으로써 발광신호의 감쇠 정도를 최적할 수 있을 것으로 기대된다. 이러한 측면에서 화학적 링커를 사용하는 것은 장점이 있다. 예컨대, 아데닌(Adenine), 티민(Thymine), 사이토신(Cytosine) 또는 PEG(polyethylene glycol) 등을 삽입하고 그 개수를 조절하여 링커의 길이를 조절할 수 있다.
바람직하게, 상기 링커의 말단 부분에는 관능기를 도입하여, 업컨버팅 나노입자에 도입된 관능기와 결합시킬 수 있다. 즉, 관능기 간의 물리적 또는 화학적 결합을 통해 복합체를 형성시킬 수 있다. 참고로, 링커가 없는 것('0'로 표시된 것)은 압타머 서열이 끝나는 5' 부분에 아민기가 도입된 경우이다.
링커를 포함하는 압타머 말단 (5')의 관능기는 다음과 같은 과정을 통해 상기 업컨버팅 나노입자의 관능기와 결합된다. 이하, 압타머와 업컨버팅 나노입자의 결합 형성 관련하여 언급된 압타머는 링커를 포함하는 경우 또는 링커가 없는 경우로 이해할 수 있으며, 간단히 압타머로 나타내기로 한다.
상기 화학적 결합 중에서, 특히 공유결합은 아래와 같은 방법으로 형성할 수 있는 바, 업컨버팅 나노입자 표면에 도입된 알데하이드기와 타겟 물질 특이적 압타머와의 결합 형성은 아래와 같은 단계에 의해서 이루어질 수 있다.
(A) 업컨버팅 나노입자에 실리카를 코팅하는 단계, (B) 상기 업커버팅 나노입자에 코팅된 실리카에 아민기를 도입하는 단계, (C) 상기 아민기를 알데하이드기로 변환하는 단계, (D) 상기 알데하이드기와 상기 압타머 말단의 아민기와 결합시키는 단계.
이때, 상기 (A) 단계는 업컨버팅 나노입자와 테트라에틸 오소실리케이트를 반응시킴으로써 수행될 수 있고, 상기 (B) 단계는 아미노프로필트리메톡실레인을 이용하여 수행될 수 있으며, 상기 (C) 단계는 글루타르알데하이드를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 상기 (D) 단계는 반응식 2와 같이 상기 압타머 말단의 아민기, 리간드의 아민기가 업컨버팅 나노입자의 알데하이드기와 쉬프베이스(schiff base) 구조를 형성함으로써 수행될 수 있다.
[반응식 2]
또한 상기 공유결합은 업컨버팅 나노입자의 표면에 도입된 에폭시기와 상기 압타머와의 결합에 의해서도 이루질 수 있는데, 구체적으로 아래와 같은 단계에 의해 이루어질 수 있다.
(A) 업컨버팅 나노입자에 실리카를 코팅하는 단계, (B) 상기 업커버팅 나노입자에 코팅된 실리카에 에폭시기를 도입하는 단계, (C) 상기 에폭시기를 압타머의 아민기와 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 또한 (C) 단계에서 상기 에폭시기를 압타머 말단의 아민기나 싸이올기, 또는 리간드의 아민기와 결합시킬 수도 있다.
상기 (A) 단계는 업컨버팅 나노입자와 테트라에틸 오소실리케이트를 반응시킴으로써 수행될 수 있고, 상기 (B) 단계는 글리시독시프로필 트리메톡실레인을 이용하여 수행될 수 있으며, 상기 (C) 단계는 반응식 3과 반응식 4와 같이 상기 압타머 말단의 아민기 또는 싸이올기, 또는 리간드이 아민기가 업컨버팅 나노입자의 에폭시기와 공유결합을 형성함으로써 수행될 수 있다.
[반응식 3]
[반응식 4]
또한 상기 공유결합은 업컨버팅 나노입자의 표면에 도입된 카르복시기와 압타머와의 결합에 의해서도 이루질 수 있는데, 이에 대한 구체적인 내용은 후술한다.
상기 결합은 상기 업컨버팅 나노입자의 표면에 도입된 카르복실기와 상기 압타머 말단의 아민기 사이의 아미드 결합이다. 구체적인 예를 들면, 상기 결합은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC) 및 히드록실석식이미드(NHS) 사이의 반응에 의한 것이다.
이에 대해서 좀더 구체적으로 살펴보면, 카르복실화 실리카 코팅 업컨버팅 나노입자에 EDC를 첨가하여 카르복실기를 활성화시키게 된다. 즉 EDC는 반응 활성화를 위해 투입되어 일종의 불안정한 중간체를 형성하는 바, 최종적인 복합체 구조에는 포함되지 않는다. 이후, NHS를 첨가하여 NHS-에스테르 결합을 형성시킨다. 이러한 EDC/NHS 반응 후, 링커를 포함하는 압타머-소광체를 첨가함으로써 링커를 포함하는 압타머 말단의 아민기와 아미드 결합을 통해 안정한 공유결합을 형성하여 업컨버팅 나노입자-(링커)-압타머-소광체로 구성된 복합체를 합성할 수 있다.
[반응식 5]
또 다른 구현예에 따르면, 상기 업컨버팅 나노입자는 실리카 코팅 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 캡슐화에 의해 표면이 개질되어 있다.
실리카 코팅 또는 PEG 캡슐화는 압타머와의 복합체를 형성하기 위해 업컨버팅 나노입자에 관능기를 도입하는 방법으로서, 우선 실리카 코팅에 대해서는 위에서 살펴본 바와 같이 실리카 코팅 후 알데하이드기, 에폭시기 또는 카르복시기를 도입하게 되고, 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
다른 한편으로는 업컨버팅 나노입자에 PEG 캡슐화를 시킴으로써 카르복시기를 도입할 수도 있는 바, PEG-인지질(PEG-phospholipids)을 이용하여 업컨버팅 나노입자를 에워싸 마이셸 구조를 형성함으로써 물에 잘 분산되며 카르복실기를 띄는 업컨버팅 나노입자를 얻을 수 있다.
구체적으로, 업컨버팅 나노입자에 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에타놀아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (mPEG (2000))와 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[카르복시(폴리에탄올글리콜)-2000] (DSPE-PEG(2000) Carboxylic Acid)을 혼합 및 교반한 뒤, 반응용매를 증발시키고 세척함으로써 얻을 수 있다.
위에서 설명한 공유결합 외에도 이온결합과 흡착 등과 같은 비공유 결합을 통해서도 업컨버팅 나노입자와 타겟에 대한 특이적 압타머가 결합될 수 있다.
이러한 비공유 결합의 예로서, 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin)과 같은 단백질과 바이오틴(biotin)과 같은 화학 물질과의 결합을 이용할 수도 있다. 이러한 결합은 항체와 항원과의 반응처럼 매우 큰 친화력을 가지는 것으로 알려져 있다.
이러한 결합은 아래 여러 원인이 복합적으로 작용한 결과인 것으로 볼 수 있다. 우선 위 단백질의 결합 주머니(binding pocket)와 바이오틴 사이의 매우 상보적인 모양을 원인으로 들 수 있고, 둘째 바이오틴이 위 결합 자리에 있을 때 형성되는 거대한 수소결합의 네트워크를 원인으로 볼 수도 있다. 마지막으로, 바이오틴이 결합하는 결합 주머니는 소수성이므로 이러한 결합자리에 있을 때 바이오틴에 의해 만들어지는 소수성 상호작용에 의해 형성되는 반데르발스 인력을 이유로 들 수 있다.
따라서, 업컨버팅 나노입자를 위에 열거한 단백질의 아민과 결합시킴으로써 업컨버팅 나노입자와 위 열거한 단백질과의 복합체를 형성하는 한편, 압타머 말단에 바이오틴을 결합시키고 나서, 위 언급한 결합을 이용한다면 업컨버팅 나노입자/압타머-소광체 복합체를 형성할 수 있다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 업컨버팅 나노입자의 평균 직경은 25 내지 30 nm이다.
타겟 물질 특이적인 압타머를 결합시키고 세척 및 반응함에 있어서 업컨버팅 나노입자의 크기가 상기 범위의 상한 값을 초과하면 가라앉을 가능성이 있어 바람직하지 않으며, 하한 값 미만인 경우에는 본 발명의 효과를 충분히 발현하지 못할 우려가 있어 바람직하지 않다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 표면 개질된 업컨버팅 나노입자와 소광체가 말단에 붙어있는 타겟 물질 특이적 압타머-소광체의 복합체를 포함하는 타겟 물질 검출용 키트를 제공한다. 바람직하게는 이러한 키트는 상기 복합체가 포함된 조성물을 기판상에 고정시켜 바이오칩 형태로 제공되거나, 컬럼에 충진시킨 형태로 제공될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 복합체가 용기에 담겨있는 형태로 구성될 수도 있다.
이러한 키트 내에는 근적외선 광원이 추가로 포함될 수도 있다. 근적외선 광원으로는 파장이 980nm인 다이오드 레이저를 사용할 수도 있다.
또한, 상기 키트에는 디텍터가 추가로 포함될 수도 있다. 상기 디텍터는 시료 처리되기 전 복합체 자체의 발광 세기와 시료 처리된 복합체의 발광 세기를 각각 측정할 수 있는 성능을 갖춘 것이다.
또한, 상기 키트는 상기 디텍터로부터 시료 처리되기 전 복합체 자체의 발광 세기 수치와 시료 처리된 복합체의 발광 세기 수치를 각각 제공받아, 복합체 자체의 발광 세기를 기준으로 시료 처리된 복합체 발광 세기의 감쇠된 정도를 연산할 수 있는 연산부를 추가로 포함할 수 있고, 또한 감쇠된 정도를 정량적 또는 정성적으로 표시할 수 있는 디스플레이부를 추가로 포함할 수 있다.
이러한 타겟 물질 검출용 키트에 대한 평면 모식도 및 입체 모식도를 각각 도 10a 및 도 10b에 제시하였다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 키트를 활용하여 타겟 물질 검출하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 타겟 물질이 포함된 시료를 상기 타겟 물질 검출용 복합체와 접촉시키는 단계; 및 상기 시료 속 타겟 물질과 접촉된 복합체에 근적외선 광원을 조사하고 업컨버팅 나노입자의 발광신호 감쇠 정도를 측정하는 단계를 포함한다.
이때, 상기 타겟 물질이 포함된 시료는 상기 복합체와 함께 버퍼 용액 상에서 접촉이 이루어지는데 상기 시료의 pH를 조절함으로써 상기 복합체와 타겟 물질 간의 반응을 최적화하고, 이에 따라 발광신호 감쇠 정도를 최적화할 수 있다.
상기 타겟 물질 검출용 복합체의 링커의 길이를 조절함으로써 상기 발광신호 감쇠 정도를 최적화할 수 있음은 상술한 바와 같으므로, 구체적인 설명은 생략한다.
한편, 본 발명의 타겟 물질 검출용 복합체, 즉 업컨버팅 나노입자/압타머-소광체 복합체의 제조방법의 일례를 살펴보면 다음과 같다.
(ⅰ)압타머-소광체를 준비하였다. 상기 압타머-소광체는 링커가 없는 것 또는 링커가 결합된 링커-압타머-소광체를 의미할 수 있다.
(ⅱ)복합체 제조용 업컨버팅 나노입자를 합성하기 위하여, 업컨버팅 나노입자의 전구체와 용매의 혼합 용액을 열처리한 후, 상온까지 식히고 나서 수산화나트륨과 암모늄 플로라이드를 포함하는 메탄올을 첨가하였다. 그리고 나서, 질소가스 분위기 하에서 열처리를 하여 1 시간 동안 반응을 지속한 뒤 상온까지 식히고 나서, 에탄올로 침전물을 세척하여 업컨버팅 나노입자를 얻었다.
(ⅲ)상기 합성된 업컨버팅 나노입자의 표면을 카르복실기로 개질하였다. 상기 PEG 캡슐화를 시킴으로써 카르복시기를 도입할 수도 있는 바, PEG-인지질(PEG-phospholipids)을 업컨버팅 나노입자에 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에타놀아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (mPEG (2000))와 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[카르복시(폴리에탄올글리콜)-2000] (DSPE-PEG(2000) Carboxylic Acid)을 혼합한 뒤, 30분 동안 교반하였다. 이후, 반응용매를 증발시키고 세척함으로써 카르복실기로 개질된 업컨버팅 나노입자를 얻었다.
(ⅳ)상기 카르복실기로 개질된 업컨버팅 나노입자의 카르복실기와 (링커)-압타머-소광체 말단의 아민기의 아미드 결합을 형성하는 반응에 의해 상기 화학적 결합을 형성하였다. 아미드 결합 형성에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC)와 N-히드록실석식이미드(NHS)의 EDC/NHS 반응이 이용될 수 있도록, 예를 들어 개질된 카르복실화 업컨버팅 나노입자에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC) 및 N-히드록실석식이미드(NHS)를 함께 첨가하여 반응시켰다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 예일 뿐, 본 발명의 권리범위를 제한하지는 않는다.
[실시예]
시험예 1: 합성된 업컨버팅 나노입자의 특성 확인
0.78 mmol YCl3 (Yttrium(III) chloride, 이트륨 클로라이드), 0.2 mmol YbCl3 (이터븀 클로라이드, Ytterbium(III) chloride), 0.02 mmol ErCl3 (얼븀 클로라이드, Erbium(III) chloride)를 올레산(oleic acid) 8 mL과 옥타데센(octadecene) 15 mL의 혼합 용액에 넣고 질소 가스 하에서 교반하면서 160℃까지 열처리를 한 뒤 진공 상태에서 30 분 동안 유지시킨 후 상온으로 식혔다. 이후, 0.25M 수산화나트륨과 0.4M 암모늄 플로라이드를 포함하는 메탄올을 첨가하였다. 질소 가스 하에 300℃까지 열처리를 하여 1 시간 동안 반응을 지속한 뒤 상온까지 식힌 후 에탄올로 침전을 잡아 세척하여 업컨버팅 나노입자를 얻었다.
합성된 상기 업컨버팅 나노입자를 투과전자현미경을 이용하여 모양 및 크기를 확인하였다. 도 2는 합성된 업컨버팅 나노입자에 대하여 투과전자현미경으로 얻은 이미지이다. hexagonal phase의 rod 모양을 갖고 평균 직경은 약 25 내지 30 nm인 업컨버팅 나노입자가 얻어졌다.
도 3에서는 상기 합성된 NaYF4: 20% Yb3+, 2% Er3+ 조성의 (Green emission) 업컨버팅 나노입자를 근적외선 980 nm 다이오드 레이저로 조사 시에 발광되는 빛에 대하여, 발광 및 형광 스펙트로미터(fluorescence and luminescence spectrometer, 제조사: Shinco(Korea), 모델명- FS-2)를 사용하여 540-550 nm (green light)에서 주요 피크를 가지는 스펙트럼 및 발광되는 초록빛의 신호 이미징을 확인할 수 있었다.
시험예 2: PEG 캡슐화된 업컨버팅 나노입자의 특성 확인
상기 합성된 업컨버팅 나노입자를 PEG 캡슐화를 통해 카르복실기로 개질한 후 제타전위 분석기(Zeta-potential analyzer) (제조사: Photal Otsuka electronics (Japan), 모델명: ELS Z)를 이용하여 표면 전위를 측정하여 도 4에 나타내었다. 카르복실기로 개질 전 5.80 mV에서 카르복실기로 개질 후 -2.81 mV와 같이 음전하로 하전된 것을 확인하였다.
앞서 사용된 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[카르복시(폴리에탄올글리콜)-2000] (DSPE-PEG(2000) Carboxylic Acid) 대신에 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에탄올글리콜)-2000] (DSPE-PEG(2000) Amino)를 이용하여 아민기로 개질하였더니, 개질 전 5.80 mV에서 개질 후 56.22 mV와 같이 양전하로 하전된 것을 확인할 수 있었다.
시험예 3: 합성된 복합체의 업컨버팅 나노입자에서 소광체로 발광 공명 에너지 전달 반응 최적화
도 5는 압타머 말단의 아데닌(adenine) 수에 따라 링커 길이를 조절하여 합성된 업컨버팅 나노입자/압타머-소광체 복합체에 있어서, 타겟 물질(오크라톡신 A) 존재/부존재 하에 발광 공명 에너지 전달에 의한 감쇠된 발광신호의 스펙트럼 및 감쇠효율 정도를 나타낸 그래프이다.
여기서 사용된 복합체의 형태는 하기 표 1에서와 같이 정리될 수 있다.
하기 표 1에서 밑줄 친 부분은 링커이고, 링커의 다음에 연결된 것이 압타머의 서열이다. 링커가 없는 것은 압타머 서열의 말단(5') 부분에 아미노 관능기가 도입되어 있다.
도 5의 결과를 통해 아데닌(A)의 수가 10 개일 때 에너지 전달이 가장 효과적으로 일어나는 것을 확인할 수 있었다. (반응조건: 농도가 0.02 배 희석된 복합체, 10 ppb (ng/ml) 오크라톡신, 10 mM Tis-HCl (pH 8.8)에서 10 분 반응)
도 6은 합성된 업컨버팅 나노입자/압타머-소광체 복합체에 있어서, pH 조건(버퍼 조성)을 달리하면서 타겟 물질(오크라톡신 A) 존재/부존재 하에 측정된 발광신호의 스펙트럼 및 발광신호의 감쇠효율을 나타낸 그래프이다.
여기서 버퍼로 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), PBS(Phosphate buffered saline), PB(Phosphate buffer), Borate, Tris-HCl, Carbonate를 사용하였다.
도 6의 결과를 통해 10 mM Borate 버퍼 pH 8.5에서 에너지 전달이 가장 효과적으로 일어나는 것을 확인할 수 있었다. (반응조건: adenine이 10 개인 압타머-소광체를 이용한 복합체, 농도가 0.02 배 희석된 복합체, 10 ppb (ng/ml) 오크라톡신에서 10 분 반응)
도 7은 소광체의 종류를 달리하여 합성된 업컨버팅 나노입자/압타머-소광체 복합체에 있어서, 타겟 물질(오크라톡신 A) 존재/부존재 하에 측정된 발광신호의 스펙트럼 및 발광신호의 감쇠효율을 나타낸 그래프이다.
소광체로는 BHQ1 및 BHQ3를 사용하였다.
도 7의 결과를 통해 546.1nm에서 BHQ1의 소광 효율은 34.27%, BHQ3의 소광 효율은 6.34%로 나타났고, 659.7nm에서 BHQ1의 소광 효율은 29.87%, BHQ3의 소광 효율은 27.08%로 나타남을 확인할 수 있었다. (반응조건: adenine이 10 개인 압타머-소광체를 이용한 복합체, 농도가 0.02 배 희석된 복합체, 10 ppb (ng/ml) 오크라톡신, 10 mM Tis-HCl (pH 8.8)에서 10 분 반응)
시험예 4: 합성된 복합체의 업컨버팅 나노입자에서 소광체로 발광 공명 에너지 전달을 이용한 곰팡이 독소 검출
도 8은 업컨버팅 나노입자/압타머-소광체 복합체에 있어서, 최적화된 조건(링커 길이 및 pH)에서 타겟 물질(오크라톡신 A)의 농도를 달리하여 측정된 발광신호의 스펙트럼 및 발광신호의 감쇠효율을 나타낸 그래프이다.
검출 대상인 곰팡이독소(오크라톡신 A) 농도에 따라 복합체의 업컨버팅 나노입자에서의 발광 신호 세기가 점점 감소한 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 오크라톡신 A 농도가 증가할수록 업컨버팅 나노입자(donor)에서 소광체(acceptor)로 발광공명 에너지 전달이 잘 일어나 발광신호의 감쇠 효율을 증가시키는 것을 알 수 있다. (반응조건: adenine 이 10 개인 압타머-소광체를 이용한 복합체, 농도가 0.02 배 희석된 복합체, 10 mM Borate (pH 8.5)에서 10 분 반응)
Claims (19)
- (i) 업컨버팅 나노입자; 및
(ii) 상기 업컨버팅 나노입자와 링커를 통해 연결된, 적어도 하나의 타겟 물질 특이적 압타머-소광체를 포함하는 타겟 물질 검출용 복합체. - 제 1항에 있어서,
상기 업컨버팅 나노입자와 상기 압타머-소광체는 상기 업컨버팅 나노입자에 도입된 관능기와 링커-압타머-소광체 말단의 관능기 간의 화학적 결합 또는 물리적 결합에 의하여 연결된 것인, 타겟 물질 검출용 복합체. - 제 1항에 있어서,
상기 업컨버팅 나노입자의 발광 파장영역과 상기 압타머-소광체를 구성하는 소광체의 흡광 파장영역이 일부 또는 전부 중첩되는 것인, 타겟 물질 검출용 복합체. - 제 1항에 있어서,
상기 업컨버팅 나노입자는 희토류 원소를 포함하는 것인, 타겟 물질 검출용 복합체. - 제 1항에 있어서,
상기 압타머-소광체는 적어도 하나의 타겟 물질에 대해 특이적인 것인, 타겟 물질 검출용 복합체. - 제 2항에 있어서,
상기 화학적 결합은 상기 업컨버팅 나노입자의 표면에 도입된 카르복실기와 상기 링커-압타머-소광체 말단의 아민기 사이의 아미드 결합인 것인, 타겟 물질 검출용 복합체. - 제 6항에 있어서,
상기 결합은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC) 및 히드록실석식이미드(NHS) 사이의 반응에 의한 것인, 타겟 물질 검출용 복합체. - 제 1항에 있어서,
상기 업컨버팅 나노입자는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 캡슐화 또는 실리카 코팅에 의해 표면이 개질되어 있는 것인, 타겟 물질 검출용 복합체. - 제 8항에 있어서,
상기 업컨버팅 나노입자의 평균 직경은 25 내지 30 nm인 것인, 타겟 물질 검출용 복합체. - 제 1항에 있어서,
상기 타겟 물질은 곰팡이 독소, 세포, 단백질, 핵산, 화합물 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 타겟 물질 검출용 복합체. - 제 1항 내지 제 10항 중 어느 하나의 항에 따른 타겟 물질 검출용 복합체를 포함하는 타겟 물질 검출용 키트.
- 제 11항에 있어서,
상기 타겟 물질 검출용 복합체를 포함하는 바이오칩 또는 컬럼의 형태로 제공되는 타겟 물질 검출용 키트. - 제 11항에 있어서,
상기 키트는 근적외선 광원을 추가로 포함하는 것인, 타겟 물질 검출용 키트. - 제 13항에 있어서,
상기 키트는 디텍터를 추가로 포함하는 것인, 타겟 물질 검출용 키트. - 시료를 제 1항 내지 제 10항 중 어느 하나의 항에 따른 타겟 물질 검출용 복합체와 접촉시키는 단계; 및
상기 시료 속 타겟 물질과 접촉된 복합체에 근적외선 광원을 조사하고 업컨버팅 나노입자의 발광신호 감쇠 정도를 측정하는 단계를 포함하는 타겟 물질 검출 방법. - 제 15항에 있어서,
상기 타겟 물질 검출용 복합체의 링커의 길이를 조절함으로써 상기 상기 발광신호 감쇠 정도를 최적화하는 타겟 물질 검출 방법. - 제 15항에 있어서,
상기 시료의 pH를 조절함으로써 상기 발광신호 감쇠 정도를 최적화하는 타겟 물질 검출 방법. - (A)링커-압타머-소광체를 준비하는 단계;
(B)업컨버팅 나노입자의 표면을 카르복실기로 개질하는 단계; 및
(C)상기 카르복실기와 링커-압타머-소광체 말단의 아민기를 결합시키는 단계를 포함하는, 타겟 물질 검출용 복합체의 제조방법. - 제 18항에 있어서,
상기 (C) 단계의 상기 결합은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC) 및 히드록실석식이미드(NHS) 사이의 반응에 의한 것인, 타겟 물질 검출용 복합체의 제조방법.
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019009495A1 (ko) * | 2017-07-07 | 2019-01-10 | 한국과학기술연구원 | 강화된 적외선 흡·발광 나노입자 및 이를 이용하는 현장용 진단키트 |
KR20190005523A (ko) * | 2017-07-07 | 2019-01-16 | 한국과학기술연구원 | 적외선을 흡광 및 발광하는 진단용 포획제-나노입자 복합체 및 이를 이용하는 현장용 진단키트 |
KR20190090431A (ko) * | 2018-01-25 | 2019-08-02 | 한국과학기술연구원 | 강화된 적외선 흡·발광 나노입자 및 이를 이용하는 현장용 진단키트 |
KR20200095144A (ko) | 2019-01-31 | 2020-08-10 | 한국기술교육대학교 산학협력단 | 표적단백질 검출용 바이오프로브, 이의 제조 방법, 이를 갖는 분석장치 및 그 방법 |
WO2020235697A1 (ko) * | 2019-05-17 | 2020-11-26 | 주식회사 넥스모스 | 개선된 압타머 코팅된 마이크로니들 기반 진단용 피부 패치 제조방법 및 그 패치 |
KR20210096338A (ko) * | 2020-01-28 | 2021-08-05 | 한국광기술원 | 단백질 분해효소 검출입자를 포함한 검출액 및 이를 제조하는 방법 |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101701885B1 (ko) * | 2015-01-21 | 2017-02-02 | 광주과학기술원 | 업컨버팅 나노입자 및 특이적 리셉터를 포함하는 당뇨병 진단용 복합체 |
CN108866063A (zh) * | 2018-06-28 | 2018-11-23 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种peg修饰的核酸适配体及其制备方法和应用 |
CN109839361B (zh) * | 2019-01-24 | 2021-06-04 | 广州市美素力营养品有限公司 | 一种基于转换纳米材料检测婴儿配方奶粉中胆碱含量的方法 |
CN110075306B (zh) * | 2019-04-28 | 2020-11-06 | 大连理工大学 | 一类近红外光控可视药物载体的制备方法 |
CN110241182B (zh) * | 2019-05-07 | 2023-05-05 | 江苏大学 | 猝灭荧光rna标志物合成方法及应用于食源性致病菌检测的方法 |
CN112255212B (zh) * | 2020-10-15 | 2022-08-05 | 天津大学 | 检测h5n1甲型流感病毒血凝素的方法 |
CN112630185B (zh) * | 2020-12-16 | 2023-10-17 | 集美大学 | 一种基于近红外光电复合材料检测冈田酸毒素的方法 |
CN113092766A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-07-09 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 多种真菌毒素的检测试剂盒,其制备方法及检测方法和应用 |
KR102554261B1 (ko) * | 2021-07-26 | 2023-07-11 | 한국과학기술연구원 | 샌드위치 면역분석용 근적외선 기반 lret 시스템 및 이의 제조방법 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110129537A1 (en) * | 2008-03-31 | 2011-06-02 | Duke University | Functionalized metal-coated energy converting nanoparticles, methods for production thereof and methods for use |
KR20130005757A (ko) | 2011-07-07 | 2013-01-16 | 부산대학교 산학협력단 | 양이온성 공액 고분자 전해질 기반 표적 물질 검출 방법 |
WO2015102535A1 (en) * | 2014-01-06 | 2015-07-09 | National University Of Singapore | Uniform core-shell tio2 coated upconversion nanoparticles and use thereof |
KR20150080417A (ko) | 2013-12-30 | 2015-07-09 | 경희대학교 산학협력단 | 링커를 통해 연결된 동일한 표적 물질에 결합하는 항체 및 앱타머를 포함하는 집게 분자 및 이의 용도 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006096754A2 (en) * | 2005-03-07 | 2006-09-14 | Archemix Corp. | Stabilized aptamers to psma and their use as prostate cancer therapeutics |
DE102005062377A1 (de) * | 2005-12-23 | 2007-06-28 | Bayer Technology Services Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von Mykotoxinen |
EP2459751A4 (en) * | 2009-08-01 | 2012-12-26 | Neoventures Biotechnology Inc | METHOD FOR DETERMINING THE PRESENCE AND CONCENTRATION OF SUBSTANCES TO BE ANALYZED USING LIGAND NUCLEIC ACID AND RARE EARTH METAL |
CN102782573A (zh) * | 2009-11-22 | 2012-11-14 | 圣诺制药公司 | 在治疗和诊断中应用的稀土掺杂上转换纳米颗粒 |
JP6170508B2 (ja) * | 2012-01-31 | 2017-07-26 | ザ・ユニバーシティ・オブ・トレド | 分析物の検出および測定のための方法および装置 |
US20150362500A1 (en) * | 2012-09-12 | 2015-12-17 | Clemson University | X-ray Excited Optical Materials and Methods for High Resolution Chemical Imaging |
US9029342B2 (en) * | 2012-09-17 | 2015-05-12 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Compositions of matter that reduce pain, shock, and inflammation by blocking linoleic acid metabolites and uses thereof |
-
2015
- 2015-08-06 KR KR1020150110936A patent/KR102042661B1/ko active IP Right Grant
-
2016
- 2016-08-05 US US15/229,913 patent/US9995741B2/en active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110129537A1 (en) * | 2008-03-31 | 2011-06-02 | Duke University | Functionalized metal-coated energy converting nanoparticles, methods for production thereof and methods for use |
KR20130005757A (ko) | 2011-07-07 | 2013-01-16 | 부산대학교 산학협력단 | 양이온성 공액 고분자 전해질 기반 표적 물질 검출 방법 |
KR20150080417A (ko) | 2013-12-30 | 2015-07-09 | 경희대학교 산학협력단 | 링커를 통해 연결된 동일한 표적 물질에 결합하는 항체 및 앱타머를 포함하는 집게 분자 및 이의 용도 |
WO2015102535A1 (en) * | 2014-01-06 | 2015-07-09 | National University Of Singapore | Uniform core-shell tio2 coated upconversion nanoparticles and use thereof |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Nano Res. Vol(7), pp. 1327-1336, 2014* * |
Talanta Vol(111), pp. 105-110, 2013* * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019009495A1 (ko) * | 2017-07-07 | 2019-01-10 | 한국과학기술연구원 | 강화된 적외선 흡·발광 나노입자 및 이를 이용하는 현장용 진단키트 |
KR20190005523A (ko) * | 2017-07-07 | 2019-01-16 | 한국과학기술연구원 | 적외선을 흡광 및 발광하는 진단용 포획제-나노입자 복합체 및 이를 이용하는 현장용 진단키트 |
US11320425B2 (en) | 2017-07-07 | 2022-05-03 | Korea Institute Of Science And Technology | Enhanced infrared ray absorbing/emitting nanoparticles and on-site diagnosis kit using same |
KR20190090431A (ko) * | 2018-01-25 | 2019-08-02 | 한국과학기술연구원 | 강화된 적외선 흡·발광 나노입자 및 이를 이용하는 현장용 진단키트 |
KR20200095144A (ko) | 2019-01-31 | 2020-08-10 | 한국기술교육대학교 산학협력단 | 표적단백질 검출용 바이오프로브, 이의 제조 방법, 이를 갖는 분석장치 및 그 방법 |
WO2020235697A1 (ko) * | 2019-05-17 | 2020-11-26 | 주식회사 넥스모스 | 개선된 압타머 코팅된 마이크로니들 기반 진단용 피부 패치 제조방법 및 그 패치 |
KR20210096338A (ko) * | 2020-01-28 | 2021-08-05 | 한국광기술원 | 단백질 분해효소 검출입자를 포함한 검출액 및 이를 제조하는 방법 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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