KR20170004821A

KR20170004821A - Dcun1d3의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 dcun1d3을 코딩하는 유전자의 발현을 저해하는 발현 저해제를 포함하는 세포의 노화 수준을 감소시키기 위한 조성물 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20170004821A
Application number: KR1020160008900A
Authority: KR
Inventors: 김명순; 김용섭; 이영삼
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2015-07-01
Filing date: 2016-01-25
Publication date: 2017-01-11

Abstract

DCUN1D3 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제를 유효성분으로 포함하는 세포의 노화 수준을 감소시키기 위한 조성물, 그를 이용한 포유 동물에서 세포의 노화 수준을 감소시키는 방법, 및 포유 동물에서 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

DCUN1D3의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자의 발현을 저해하는 발현 저해제를 포함하는 세포의 노화 수준을 감소시키기 위한 조성물 및 그의 용도{Composition for reducing the level of cellular senescence comprising inhibitor of DCUN1D3 activity or inhibitor of DCUN1D3 gene expression and use thereof}

세포의 노화 수준을 감소시키기 위한 조성물, 포유 동물에서 세포의 노화 수준을 감소시키는 방법, 및 포유 동물에서 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상을 치료하는 방법에 관한 것이다.

노화는 세포 분열 (cellular division)의 영구적 정지 (permanent halt)로서 정의될 수 있다. 복제 노화 (replicative senescence) 또는 세포 노화 (cellular senescence)는 세포 수준에서 에이징 (aging)을 위한 모델로서 관찰되었다. 세포가 연속으로 배양되는 경우, 많은 회수의 분열을 하지만, 에이징에 따라 세포는 더 이상 분열할 수 없다. 노화된 세포는 실제로 프로그램된 세포사 (programmed cell death)에 저항성이며 일부 노화된 세포는 수년 동안 비증식 상태 (nondividing state)로 유지되었다.

DCUN1D3은 혈청 반응 요소 (serum response element: SRE) 경로 활성화와 연관된 신규한 사람 유전자의 고용량 탐색 (high throughput screening)의 과정에서 발견되었다. DCUN1D3 유전자는 척추동물 중에서 고도로 보존되어 있다. 사람 DCUN1D3 상보성 DNA (cDNA)는 겉보기 분자량 34 kDa을 가진 304 아미노산 서열을 코딩한다. DCUN1D3의 아미노산 서열 및 그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Genbank Accesion Nos. NP_775746.1 및 NM_173475.2에 기재된 것일 수 있다. DCUN1D3는 여러 암세포 및 배양된 세포주에서 광범위하게 발현된다. DCUN1D3는 UV 조사된 암세포에서 그 발현 수준이 유의하게 증가한다.

Genbank Accesion No.AK027199의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산은 인간의 16번 염색체의 p 암(arm)에 위치하는 핵산으로부터 전사된 핵산일 수 있다. 상기 핵산은 인간의 16번 염색체의 ERI2(ERI1 Exoribonuclease Family Member 2) 유전자와 DCUN1D3(DCN1, Defective In Cullin Neddylation 1, Domain Containing 3) 유전자의 사이에 존재하는 핵산으로부터 전사된 핵산이다. 상기 핵산은 긴 비암호화 RNA(long ncRNA; lncRNA)일 수 있다. 상기 lncRNA는 단백질로 번역되지 않거나 낮은 단백질-암호화 가능성(low protein-coding potential)을 갖는 전사물(transcript)이다. 이하 상기 핵산은 SEAT1(senescence-associated transcript 1)이라 한다.

상기한 선행기술에 의하더라도, 세포의 노화 수준을 감소시키는 조성물 및 방법이 요구되고 있다.

일 양상은 세포의 노화 수준을 감소시키기 위한 조성물을 제공한다.

다른 양상은 포유 동물에서 세포의 노화 수준을 감소시키는 방법을 제공한다.

다른 양상은 포유 동물에서 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상을 치료하는 방법을 제공한다.

일 양상은 쿨린 네딜레이션1, 3 함유 도메인에 결함이 있는, DCN1(DCN1, defective in cullin neddylation 1, domain containing 3: DCUN1D3) 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제를 유효성분으로 포함하는, 세포의 노화 수준을 감소시키기 위한 조성물을 제공한다.

DCUN1D3은 혈청 반응 요소 (serum response element: SRE) 경로 활성화와 연관된 신규한 사람 유전자의 고용량 탐색 (high throughput screening)의 과정에서 발견되었다. DCUN1D3 유전자는 척추동물 중에서 고도로 보존되어 있다. 사람 DCUN1D3 상보성 DNA (cDNA)는 겉보기 분자량 34 kDa을 가진 304 아미노산 서열을 코딩한다. DCUN1D3의 아미노산 서열 및 그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Genbank Accesion Nos. NP_775746.1 (서열번호 3) 및 NM_173475.2 (서열번호 4)에 기재된 것일 수 있다. DCUN1D3는 여러 암세포 및 배양된 세포주에서 광범위하게 발현된다. DCUN1D3는 UV 조사된 암세포에서 그 발현 수준이 유의하게 증가한다.

DCUN1D3의 활성을 저해하는 활성 저해제는 DCUN1D3의 네딜레이션(neddylation) 활성을 저해하는 물질일 수 있다. 네딜레이션은 유비퀴틴-유사 단백질 NEDD8이 표적 단백질에 접합되는 것에 의한 과정일 수 있다.

상기 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열의 핵산(이하 "SEAT1(senescence-associated transcript 1) RNA"라고도 한다)은 긴 비암호화 리보핵산(long noncoding rebonucleic acid; lncRNA)일 수 있다. 비암호화 RNA는 단백질로 번역되지 않는 기능적 RNA 분자이다. 상기 비암호화 RNA는 작은 인 RNA(small nucleolar RNA; snoRNA), 마이크로RNA, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; 작은 인 RNA), 작은 핵 RNA(small nuclear RNA; snRNA), 세포외 RNA(extracellular RNA; exRNA), piRNA(Piwi-interacting RNA), 또는 긴 비암호화 RNA(long ncRNA; lncRNA)일 수 있다. 상기 lncRNA는 단백질로 번역되지 않거나 낮은 단백질-암호화 가능성(low protein-coding potential)을 갖는 전사물(transcript)로서 길이가 약 50 뉴클레오티드 이상, 약 100 뉴클레오티드 이상, 약 200 뉴클레오티드 이상, 또는 약 500 뉴클레오티드 이상인 RNA일 수 있다. 상기 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열의 핵산은 인간의 16번 염색체의 p 암(arm)에 위치하는 핵산으로부터 전사된 핵산일 수 있다. 상기 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열의 핵산은 인간의 16번 염색체의 ERI2(ERI1 Exoribonuclease Family Member 2) 유전자와 DCUN1D3(DCN1, Defective In Cullin Neddylation 1, Domain Containing 3) 유전자의 사이에 존재하는 핵산으로부터 전사된 핵산일 수 있다. 상기 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열의 핵산은 GenBank Accession No. AK027199의 서열일 수 있다.

상기 SEAT1 RNA의 활성을 저해하는 활성 저해제는 상기 SEAT1 RNA에 대한 작은 간섭 RNA (small interference RNA: siRNA), 작은 헤어핀 RNA (shRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, miRNA 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 SEAT1 RNA에 대한 작은 간섭 RNA는 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드(SEAT1 siRNA #1); 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드(SEAT1 siRNA #2); 또는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드(SEAT1 siRNA #3);를 포함하는 것일 수 있다. 상기 SEAT1 RNA의 활성을 저해하는 활성 저해제는 동시에 DCUN1D3의 발현을 억제하는 발현 저해제일 수 있다.

상기 SEAT1 RNA를 코딩하는 유전자는 인간의 16번 염색체의 p 암(arm)에 위치하는 것일 수 있다. 상기 유전자는 AK027199 유전자, 즉 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 SEAT1 RNA를 코딩하는 유전자는 인간의 16번 염색체의 ERI2(ERI1 Exoribonuclease Family Member 2) 유전자와 DCUN1D3(DCN1, Defective In Cullin Neddylation 1, Domain Containing 3) 유전자의 사이에 존재하는 것일 수 있다.

상기 DCUN1D3 및 SEAT1 RNA 중 하나 이상을 코딩하는 유전자의 발현을 저해하는 발현 저해제는 세포에서 DCUN1D3 및 SEAT1 RNA 중 하나 이상을 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키는 것이면 어떠한 것이든 될 수 있다. 상기 발현 저해제는 작은 간섭 RNA (small interference RNA: siRNA), 작은 헤어핀 RNA (shRNA), miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. DCUN1D3 유전장 대한 상기 siRNA는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열(DCUN1D3 siRNA #1)을 포함하는 것일 수 있다. 상기 SEAT1 RNA에 대한 작은 간섭 RNA는 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드(SEAT1 siRNA #1); 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드(SEAT1 siRNA #2); 또는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드(SEAT1 siRNA #3);를 포함하는 것일 수 있다. SEAT1 RNA를 코딩하는 유전자의 발현을 저해하는 발현 저해제는 동시에 DCUN1D3를 코딩하는 유전자의 발현을 저해하는 발현 저해제일 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 세포의 노화 수준을 감소시키는 것은 세포의 노화를 지연 또는 방지하거나, 노화된 세포 (senescent cell)를 그보다 젊은 세포 (young cell)로 전환시키는 것을 포함한다.

상기 조성물에 있어서, 세포의 노화 수준을 감소시키는 것은 세포의 증식능을 증가시키는 것, 자식작용 (autophagy) 활성을 증가시키는 것, 리포푸신 축적을 감소시키는 것, β-갈락토시다제 활성을 감소시키는 것, 미토콘드리아 활성 산소 종을 감소시키는 것, 및 미토콘드리아 막 전위를 높이는 것 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 세포는 근모세포 (myoblast)를 포함한 근육세포, 섬유아세포 (fibroblast), 조기노화세포, 또는 신경세포일 수 있다. 상기 조기노화 세포는 조로증 (progeria) 유래의 세포일 수 있다. 상기 조로증은 허친슨-길포드 증후군 또는 베르너 증후군 (Werner syndrome)일 수 있다.

상기 조성물은 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상을 치료하기 위한 것일 수 있다. 상기 세포 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상은 피부주름, 상처 재생 저하, 근감소증(sarcopenia), 근위축증(muscular dystrophy), 조기노화증 (Hutchinson-Gilford progeria syndrome), 또는 그 조합인 것일 수 있다. 상기 세포 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상은 리포푸신의 축적과 연관된 질병 또는 질병 증상인 것일 수 있다. 상기 리포푸신의 축적과 연관된 질병 또는 질병 증상은 신경 세로이드 리포푸신증 (neuronal ceroid lipofuscinoses: NCL), 나이 관련 황반변성 (Age-related macular degeneration), 신경근섬유의 엉킴 (neurofibrillary tangles), 심장의 갈색위축 (Brown atrophy of the heart), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병 (Parkinson's disease), 루게릭 병 (amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 말단 비대증 (acromegaly), 탈신경 위축증 (denervation atrophy), 지질 축적 근질환 (lipid myopathy), 만성 폐쇄성 폐 질환 (chronic obstructive pulmonary disease: COPD)인 것일 수 있다. 또한, 상기 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상은 미토콘드리아 활성 산소 종의 증가, 미토콘드리아 막 전위의 감소 또는 이들의 조합과 같은 미토콘드리아 손상에 의하여 야기되는 질환일 수 있다. 또한, 상기 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상은 세포 내 β-갈락토시다제 활성의 증가에 의하여 야기되는 것일 수 있다.

상기 DCUN1D3 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 형태일 수 있다. 상기 염은 약학 분야, 예를 들면 세포의 노화와 연관된 질환 분야에서 사용되는 통상의 산 부가염, 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 술팜산, 인산 또는 질산과 같은 무기산으로부터 유도된 염 및 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 시트르산, 말레산, 말론산, 메탄술폰산, 타르타르산, 말산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔술폰산, 옥살산 또는 트리플루오로아세트산과 같은 유기산으로부터 유도된 염을 포함한다. 또한, 상기 염은 통상의 금속 염 형태, 예를 들면 리튬, 소듐, 칼륨, 마그네슘, 또는 칼슘과 같은 금속으로부터 유도된 염을 포함한다. 상기 산 부가염 또는 금속염은 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다.

상기 DCUN1D3 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제는 또한 그의 용매화합물 (solvate)의 형태일 수 있다. "용매화물"이란 하나 이상의 용질 분자, 즉 DCUN1D3) 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 하나 이상의 용매 분자에 의해 형성되는 복합체 또는 집합체를 의미한다. 용매화물은 예를 들면 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세트산과 형성된 복합체 또는 집합체일 수 있다.

상기 DCUN1D3 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제는 또한 그의 입체이성질체의 형태일 수 있다. 상기 입체이성질체는 거울상 이성질체 (enantiomer) 및 부분입체이성질체 (diastereomer)와 같은 모든 입체이성질체를 포함한다. 상기 화합물은 입체이성질체의 순수 형태 (stereoisomerically pure form) 또는 하나 이상의 입체이성질체의 혼합물, 예를 들면 라세미 혼합물일 수 있다. 특정 입체이성질체의 분리는 당해 분야에 공지된 통상의 방법 중 하나에 의해 수행될 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 세포는 사람을 포함한 포유 동물의 세포일 수 있다. 상기 포유 동물은 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병을 갖는 것일 수 있다. 상기 세포는 인 비트로 또는 인 비보에 존재하는 것일 수 있다. 상기 세포는 섬유아세포, 또는 신경세포일 수 있다.

상기 조성물은, 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물에 있어서, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분의 적용을 돕기 위하여 활성 성분과 조합되어 사용되는 물질, 일반적으로 불활성 물질을 나타낸다. 상기 담체는 통상적인 약제학적으로 허용가능한 부형제, 첨가제 또는 희석제를 포함한다. 상기 담체는 예를 들면 충전제 (filler), 결합제 (binder), 붕해제 (disintergrant), 버퍼, 보존제, 항산화제, 활택제, 향미제, 점증제 (thickener), 발색제 (coloring agent), 유화제, 현탁화제, 안정화제, 및 등장화제로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

상기 조성물은, 상기 DCUN1D3 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 "치료학적 유효량"으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에 있어서, "치료학적 유효량"은 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 치료 효과를 나타내기에 충분한 양을 의미한다. 용어 "치료"는 개체, 예를 들면 사람을 포함한 포유 동물에서 질환 또는 의학적 증상, 예를 들면 세포의 노화와 연관된 질병을 치료함을 의미하고, 이는 다음을 포함한다: (a) 질환 또는 의학적 증상의 발생을 예방, 즉, 환자의 예방적 치료; (b) 질환 또는 의학적 증상의 완화, 즉, 환자에서 질환 또는 의학적 증상의 제거 또는 회복 야기; (c) 질환 또는 의학적 증상의 억제, 즉, 개체에서 질환 또는 의학적 증상의 진행을 늦춤 또는 정지; 또는 (d) 개체에서 질환 또는 의학적 증상을 경감. 상기 "유효량"은 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 상기 "유효량"은 0.01mg 내지 10,000mg, 0.1mg 내지 1000mg, 1mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 1000mg, 0.01mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 10mg, 또는 0.01mg 내지 1mg일 수 있다.

상기 조성물은 경구 투여하거나, 정맥내, 복강내, 피하, 직장 및 국소투여를 포함한 비경구로 투여될 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 정제, 캡슐제, 수성액제 또는 현탁제 등의 다양한 형태로 제제화될 수 있다. 경구용 정제의 경우 락토스, 옥수수 전분 등의 부형제 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제가 통상 가해질 수 있다. 경구투여용 캡슐제의 경우, 락토스 및/또는 건조 옥수수 전분이 희석제로서 사용될 수 있다. 경구용 수성 현탁제가 필요할 경우, 활성성분을 유화제 및/또는 현탁화제와 결합시킬 수 있다. 필요할 경우, 특정 감미제 및/또는 향미제를 가할 수 있다. 신경내, 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여의 경우, 활성성분의 멸균 용액이 통상 제조되며, 용액의 pH를 적합하게 조절하고 완충시켜야 한다. 정맥내 투여의 경우, 용질의 총 농도는 제제에 등장성이 부여되도록 조절되어야 한다. 상기 조성물은 pH가 7.4인 염수와 같은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 수용액제의 형태일 수 있다. 상기 용액은 국소 주사 (local bolus injection)로 환자의 근육내 또는 신경내 혈류에 도입될 수 있다.

본 명세서에 있어서, "세포의 노화 (senescence of a cell or cellular senescence)"는 표준 세포 (reference cell)에 비하여 세포의 증식능의 감소, 자식작용 활성의 감소, 리포푸신 축적, β-갈락토시다제 활성 증가, 미토콘드리아 활성 산소 종 증가, 및 미토콘드리아 막 전위 감소 중 하나 이상을 포함하거나, 그를 야기하는 과정을 나타낸다. 여기서, 표준 세포는 동일 타입의 알려진 비노화된 세포 (non-senescent cell)일 수 있다. "젊은 세포 (young cell)"란 표준 세포 (reference cell)에 비하여 세포의 증식능의 증가, 자식작용 활성의 증가, 리포푸신 축적 감소, β-갈락토시다제 활성 감소, 미토콘드리아 활성 산소 종 감소, 및 미토콘드리아 막 전위 증가 중 하나 이상을 나타낸다. 여기서, 상기 표준 세포는 동일 타입의 알려진 노화 세포일 수 있다. 상기 표준 세포인 비노화된 세포 (non-senescent cell)는 18 세 내지 25세, 18 내지 23세, 또는 18세 내지 20세의 정상적인 건강한 사람으로부터 유래된 세포, 예를 들면, 섬유아세포 (fibroblast), 또는 신경세포일 수 있다.

상기 조성물은 세포의 노화 수준의 증가와 연관 질환을 치료하기 위한 하나 이상의 다른 치료제와 함께 조합될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 세포의 노화 수준의 증가와 연관 질환을 치료하기 위한 다른 활성 성분을 포함하지 않고, DCUN1D3) 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 것일 수 있다.

다른 양상은 DCUN1D3 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제를 유효성분으로 포함하는, 세포의 리포푸신 축적을 감소시키는 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 세포의 리포푸신 축적과 연관된 증상 또는 질병 증상을 치료하기 위한 것일 수 있다. 상기 리포푸신의 축적과 연관된 질병 또는 질병 증상은 신경 세로이드 리포푸신증 (neuronal ceroid lipofuscinoses: NCL), 나이 관련 황반변성 (Age-related macular degeneration), 신경근섬유의 엉킴 (neurofibrillary tangles), 심장의 갈색위축 (Brown atrophy of the heart), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병 (Parkinson's disease), 루게릭 병 (amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 말단 비대증 (acromegaly), 탈신경 위축증 (denervation atrophy), 지질 축적 근질환 (lipid myopathy), 만성 폐쇄성 폐 질환 (chronic obstructive pulmonary disease: COPD)인 것일 수 있다. 달리 언급이 없으면, '세포의 리포푸신 축적을 감소시키는 위한 조성물'에 있어서, 상기한 '세포의 노화 수준을 감소시키기 위한 조성물'에서 사용된 동일한 용어는 동일한 의미로서 사용된다.

다른 양상은 DCUN1D3 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제를 유효성분으로 포함하는, 세포의 증식능을 증가시키는 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 세포의 증식능 감소와 연관된 질병 또는 질병 증상을 치료하기 위한 것일 수 있다. 상기 세포의 증식능 감소와 연관된 질병 또는 질병 증상은 피부주름, 상처 재생 저하, 근감소증(sarcopenia), 근위축증(muscular dystrophy), 조기노화증 (Hutchinson-Gilford progeria syndrome), 또는 그 조합인 것일 수 있다. 달리 언급이 없으면, '세포의 증식능을 증가시키는 위한 조성물'에 있어서, 상기한 '세포의 노화 수준을 감소시키기 위한 조성물'에서 사용된 동일한 용어는 동일한 의미로서 사용된다.

다른 양상은 유효량의 DCUN1D3 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제를 포유 동물에게 투여하여, 세포의 노화 수준을 감소시키는 단계:를 포함하는, 포유 동물에서 세포의 노화 수준을 감소시키는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 "DCUN1D3 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제", "세포의 노화 수준을 감소시키는 것" 및 "포유 동물"에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 유효량은 개체에 투여되는 경우, "세포의 노화를 감소시키기에 충분한 양"을 의미한다. 상기 투여는 상기한 "DCUN1D3 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물"을 포함하는 상기한 바와 같은 조성물을 투여하는 것일 수 있다.

다른 양상은 치료학적으로 효과적인 양(therapeutically effective amount)의 DCUN1D3 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제를 포유 동물에게 투여하여, 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상을 치료하는 단계:를 포함하는, 포유 동물에서 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상을 치료하는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 "DCUN1D3 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제", "세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상" 및 "포유 동물"에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 유효량은 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상을 갖는 개체에 투여되는 경우, "세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상을 치료하기에 충분한 양"을 의미한다. 상기 투여는 상기한 "DCUN1D3 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물"을 포함하는 상기한 바와 같은 조성물을 투여하는 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 당업자는 투여시 투여경로는 환자의 상태에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 투여는 경구, 비경구, 또는 국부 투여일 수 있다. 상기 투여는 노화 세포를 포함하는 조직에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다. 상기 투여는 피부 조직, 근육 조직, 또는 신경 조직에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, "치료학적으로 효과적인 양(therapeutically effective amount)"은 포유 동물에서 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상을 치료하데 효과적인 양이다. 투여량은 전술한 바와 같이 환자의 상태, 투여 경로, 주치의의 판단 등과 같은 다양한 인자들에 따라서 다양해진다. 효과적인 투여량은 체외실험 또는 동물 모델 시험에서 얻어진 용량-반응곡선으로부터 추정할 수 있다. 투여되는 조성물에 존재하는 본 발명의 화합물의 비율 및 농도는 화학적 특성, 투여 경로, 치료적 투여량 등에 따라 결정될 수 있다. 상기 투여량은 개체에게 약 1 μg/kg 내지 약 1 g/kg per day, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 500 mg/kg per day의 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 용량은 개체의 나이, 체중, 감수성, 또는 증상에 따라 변경될 수 있다.

다른 양상은 다른 양상은 치료학적으로 효과적인 양의 DCUN1D3 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제를 포유 동물에게 투여하여, 세포의 리포푸신 수준을 감소시키는 단계:를 포함하는, 포유 동물에서 세포의 리포푸신 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 포유 동물에서 세포의 리포푸신 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상을 치료하는데 사용되는 것일 수 있다. 상기 리포푸신 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상은 신경 세로이드 리포푸신증, 나이 관련 황반변성, 신경근섬유의 엉킴, 심장의 갈색위축, 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭 병, 말단 비대증, 탈신경 위축증, 지질 축적 근질환, 또는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)인 것일 수 있다. 달리 언급이 없으면, '포유 동물에서 세포의 리포푸신 수준을 감소시키는 방법'에 있어서, 상기한 '포유 동물에서 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상을 치료하는 방법'에서 사용된 동일한 용어는 동일한 의미로서 사용된다.

다른 양상은 다른 양상은 유효량의 DCUN1D3 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제를 포유 동물에게 투여하여, 세포의 증식능을 증가시키는 단계:를 포함하는, 포유 동물에서 세포의 증식능을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 포유 동물에서 세포의 증식능의 감소와 연관된 질병 또는 질병 증상을 치료하는데 사용되는 것일 수 있다. 상기 세포의 증식능의 감소와 연관된 질병 또는 질병 증상은 피부주름, 상처 재생 저하, 근감소증(sarcopenia), 근위축증(muscular dystrophy), 조기노화증 (Hutchinson-Gilford progeria syndrome), 또는 그 조합인 것일 수 있다. 것일 수 있다. 달리 언급이 없으면, '포유 동물에서 세포의 리포푸신 수준을 감소시키는 방법'에 있어서, 상기한 '포유 동물에서 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상을 치료하는 방법'에서 사용된 동일한 용어는 동일한 의미로서 사용된다.

일 양상에 따른 DCUN1D3 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 조성물은 세포의 노화 수준을 감소시키는데 사용될 수 있다.

다른 양상에 따른 포유 동물에서 세포의 노화 수준을 감소시키는 방법에 의하면, 포유 동물에서 세포의 노화를 효율적으로 감소시킬 수 있다.

다른 양상에 따른 포유 동물에서 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상을 치료하는 방법에 의하여, 포유 동물에서 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상을 효율적으로 치료할 수 있다.

도 1은 배양된 DCUN1D3 shRNA 함유 렌티바이러스가 도입된 노화 세포를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸다.
도 2는 DCUN1D3 shRNA 또는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포에 대하여 X-gal 염색한 사진(A) 및 파란색으로 염색된 세포 수의 % 비율(B)을 나타낸다.
도 3은 DCUN1D3 shRNA 또는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포에 대하여 리포푸신을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 DCUN1D3 shRNA 또는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포의 크기를 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 DCUN1D3 siRNA 또는 대조군 siRNA가 도입된 노화 세포의 세포 주기를 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 배양된 DCUN1D3 shRNA 또는 SEAT1 shRNA 함유 렌티바이러스가 도입된 노화 세포의 수(A) 및 DNA 함량(B)을 상대적으로 나타낸 도면이다.
도 7은 scramble shRNA(A) 또는 SEAT1 shRNA(B) 또는 DCUN1D3 shRNA(C) 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포에 대하여 X-gal 염색한 사진 및 파란색으로 염색된 세포 수의 % 비율을 나타낸 도면이다.
도 8은 DCUN1D3 shRNA 또는 SEAT1 shRNA 또는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포에 대하여 리포푸신을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 DCUN1D3 shRNA 또는 SEAT1 shRNA 또는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포의 크기(A) 및 세포 구형성(granularity)(B)을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 SEAT1 siRNA 또는 DCUN1D3 siRNA 또는 대조군 siRNA가 도입된 노화 세포의 세포 주기를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 siSEAT1가 도입된 사람(A) 및 마우스 세포(B)에서 DCUN1D3 유전자와 SEAT1 유전자 등의 발현 정도를 나타낸 도면이다.
도 12는 SEAT1 shRNA 및/또는 DCUN1D3 shRNA가 세포 내 DNA 손상에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
도 13은 SEAT1 유전자 또는 DCUN1D3 유전자 발현의 억제가 hIL-6 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
도 14는 miR-20b가 DCUN1D3 유전자의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예1 : DCUN1D3 shRNA 또는 siRNA 가 노화 세포에 미치는 영향

(1) 노화 세포의 증식 유도

DCUN1D3 shRNA를 노화 세포에 형질도입하여 노화 세포의 증식에 미치는 영향을 확인하였다. 사용된 노화 세포는 4세 남아로부터 수득된 인간 진피 섬유아세포 (human dermal fibroblast: HDF) M4 세포 (서울대학교로부터 4세 남아 기증자의 포피 유래의 것임)를 37℃ 및 5% CO₂의 조건 하에서 고농도 포도당, 글루타민, 및 피루베이트를 함유한 DMEM (이하 'DMEM'이라 함)(HyClone, Logan, UT, USA:Cat no. SH30243)에 10%(v/v) 소태아혈청(FBS), 및 1x페니실린/스트렙토미신 (100 U/ml peninicillin, 100ug/ml streptomycin)을 함유한 배지에서 계대 배양하여 얻었다. 사용된 노화 세포는 계대수 33이고 분열기간이 약 14일 이상인 세포였다.

DCUN1D3 shRNA는 렌티바이러스에 도입하여 DCUN1D3 shRNA 함유 렌티바이러스에 의하여 상기 노화 세포 내로 전달되었다. DCUN1D3 shRNA 함유 렌티바이러스는 pLKO.1 puro vector (OriGene 사, 미국)는 하기 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 각각 합성하고 이를 이중가닥 구조인 shRNA 구조체를 제조하고 (IDT 사, 한국), 제한 효소 AgeI과 EcoRI을 잘려진 pLKO.1 puro vector에 상기 shRNA 구조체를 연결하여, 제조하였다. 제조된 DCUN1D3 shRNA 함유 렌티바이러스를 293FT 인간 배아 신장 세포 (#R700-07: Invitrogen)에 Lipofectamine 2000을 사용하여 패키징 벡터인 VSV-G 및 PAX2 (OriGene 사, 미국)와 함께 형질도입하였다. 본 명세서에서 형질 도입 시에는 신장 세포를 포함하는 성장 배지에 폴리프린(polybrene) 6ug/ml을 첨가하여 형질도입 효율을 증가시켰다. 형질 도입 후 2일째에 렌티바이러스 상등액을 회수하고 Lenti-X (Clontech 사, cat. no.631231)을 사용하여 농축하였다.

이렇게 제조된 DCUN1D3 shRNA 함유 렌티바이러스를 상기 노화 세포에 형질감염(transfection)시키고 4주 동안 37℃ 및 5% CO₂의 조건 하에서 고농도 포도당, 글루타민, 및 피루베이트를 함유한 DMEM (이하 'DMEM'이라 함)(HyClone, cat.no. SH30243, 미국)에 10% (v/v)소태아혈청(FBS), 및 1x페니실린/스트렙토미신 ((100 U/ml peninicillin, 100ug/ml streptomycin)을 함유한 배지에서 상기 노화 세포를 계대 배양하였다. 사용된 DCUN1D3 shRNA의 뉴클레오티드 서열은 서열번호1 (센스) 및 서열번호 2(안티센스)의 뉴클레오티드 서열이다. 대조군으로 사용된 scramble RNA (Bioneer사, 한국)는 제조사에서 제공된 것을 사용하였다.

서열번호 1 (센스): GUCACUGCAUCGGGAAAUA(dTdT)

서열번호 2 (안티센스): UAUUUCCCGAUGCAGUGAC(dTdT)

도 1은 배양된 DCUN1D3 shRNA 함유 렌티바이러스가 도입된 노화 세포를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸다. 도 1에서, "control shRNA"는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포이고, "DCUN1D3 shRNA"는 DCUN1D3 shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, DCUN1D3 shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포 즉, 음성 대조군에 비하여 세포의 수가 증가하였고, 세포의 형태가 젊은 세포와 같았다. 따라서, DCUN1D3 shRNA는 노화 세포에 도입되는 경우 노화 세포의 증식을 유도한다는 것을 알 수 있다.

(2) 노화-연관 베타- 갈락토시다제 (senescence-associated beta-galactosidase: SA β-gal)의 활성의 감소

노화 세포는 SA β-gal의 활성이 증가되어, X-gal 염색시 세포가 파란색으로 염색된다. (1)에 설명된 바와 같이, 노화 세포에 DCUN1D3 shRNA 또는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스를 형질감염시키고 배양된 노화 세포에 대하여 SA β-gal의 활성을 측정하였다. DCUN1D3 shRNA 또는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스를 형질감염시키지 않은 노화 세포를 음성 대조군으로 하였다.

구체적으로, 배양된 상기 노화 세포를 Cellular Senescence Assay Kit (Cell BIOLABS, INC.)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 염색하고, 현미경으로 파란색으로 염색된 세포 수를 계수하였다. 도 2는 DCUN1D3 shRNA 또는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포에 대하여 X-gal 염색한 사진(A) 및 파란색으로 염색된 세포 수의 % 비율(B)을 나타낸다.

도 2에 나타낸 바와 같이, scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포 중 염색된 세포가 약 84%인 반면, DCUN1D3 shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포 중 염색된 세포가 약 52%이었다. 따라서, 노화 세포가 DCUN1D3 shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 경우, SA β-gal의 활성이 감소되는 것이 확인되었다. 이는 노화 세포에 DCUN1D3 shRNA 함유 렌티바이러스가 도입되는 경우, 노화 세포의 노화 수준이 감소된다는 것을 나타낸다.

(3) 자식작용 활성의 감소 및 리포푸신의 축적의 감소

노화 세포는 자식작용 활성이 감소하고, 리포푸신이 축적되고, 미토콘드리아가 손상되는 것으로 알려져 있다. 이를 확인하기 위하여, (1)에 설명된 바와 같이, 노화 세포에 DCUN1D3 shRNA 또는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스를 형질감염시키고 배양된 노화 세포에 대하여 세포 중의 리포푸신의 양을 측정하였다. DCUN1D3 shRNA 또는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스를 형질감염시키지 않은 노화 세포를 음성 대조군으로 하였다. 또한, 세포 크기를 측정하였다.

리포푸신의 양은 배양된 상기 노화 세포에 대하여 자가형광(autofluorescence) 측정법에 의하여 측정하였다. 도 3은 DCUN1D3 shRNA 또는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포에 대하여 리포푸신을 측정한 결과를 나타낸다.

도 3에 나타낸 바와 같이, scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포의 자가형광 강도에 비하여 DCUN1D3 shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포의 자가형광은 약 66%이었다. 따라서, 노화 세포가 DCUN1D3 shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 경우, 노화 세포의 리포푸신의 축적이 감소된다는 것을 나타낸다. 이는 노화 세포에 DCUN1D3 shRNA 함유 렌티바이러스가 도입되는 경우, 노화 세포의 노화 수준이 감소된다는 것을 나타낸다.

도 4는 DCUN1D3 shRNA 또는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포의 크기를 측정한 결과를 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, DCUN1D3 shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포의 크기는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포의 크기보다 작아진다는 것을 확인하였다.

도 4에서, 세포 크기, 세포 구형성(granularity), 및 자가-형광은 유세포 흐름 분석에 의하여 추정하였다. 구체적으로, 트립신 처리된 세포를 PBS 중에 회수하고, FACSCaliber instrument(Becton Dickson, 미국) 상에서 분석하였다. 100,000 세포의 세포 크기 및 구형성이 이전에 기술된 포워드 및 측면 스캐터(side scatter)를 각각 분석함으로써 평가되었다. 자가-형광은 여기에 대하여 488-nm 레이저 및 검출에 대하여 530/30 밴드패스 필터를 사용하여 측정하였다. 도 4의 A와 B의 세로 축의 FSC, SSC는 각각 포워드 스캐터 세포 크기 (forward scatter, cell size)와 측면 스캐터 세포 구형성 (side scatter, cell granularity)을 나타낸다.

(4) 세포주기 조절에 대한 영향

세포가 노화되면서 세포 주기는 G0/G1 기는 증가하고, S와 G2/M기는 감소하는 것으로 알려져 있다.

이를 확인하기 위하여, 노화 세포에 siRNA 및 대조군 siRNA를 도입하고 세포 주기를 측정하였다. 구체적으로, siRNA와 대조군 siRNA는 (1)에 설명된 바에 있는 shRNA와 scramble RNA를 렌티바이러스에 패키징하지 않고 그 자체를 lipofectamine을 사용하여 노화 세포에 도입시키고 배양된 노화 세포에 대하여 세포 주기를 측정하였다. DCUN1D3 siRNA는 상기 DCUN1D3 shRNA를 도입하여 세포 내에서 siRNA가 생성되도록 하였다.

도 5는 DCUN1D3 siRNA 또는 대조군 siRNA가 도입된 노화 세포의 세포 주기를 측정한 결과를 나타낸다. 도 5에서, 실험은 3 반복 (triplicate)로 하였으며, 배양은 3일 동안 하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, DCUN1D3 siRNA가 도입된 노화 세포의 세포 주기는 대조군 siRNA가 도입된 노화 세포의 주기보다 G0/G1기와 S기의 비율이 증가하였다. 도 5에서 세로축의 단위는 %이며, 이는 대조군 siRNA에 대한 결과를 100으로 한 경우에 대한 비율이다.

	세포 주기
	% G0/G1	% S	% G2/M
대조군 siRNA	66.83	5.50	23.87
DCUN1D3 siRNA	60.10	7.90	29.65

n=3, 3일 배양, HDF(M4, 분열기간=14일).

실시예2 : DCUN1D3 shRNA 또는 siRNA 및/또는 shSEAT1 또는 siSEAT1 가 노화 세포에 미치는 영향

본 실시예에서는 DCUN1D3와 SEAT1의 세포내 수준의 연관성을 확인하고 이들이 노화세포에 미치는 영향을 확인하였다.

(1) 노화 세포의 증식 유도

DCUN1D3 shRNA 또는 SEAT1(senescence-associated transcript1) shRNA를 노화 세포에 형질도입하여 노화 세포의 증식에 미치는 영향을 확인하였다. 사용된 노화 세포는 4세 남아로부터 수득된 인간 진피 섬유아세포 (human dermal fibroblast: HDF) M4 세포 (서울대학교로부터 4세 남아 기증자의 포피 유래의 것임)를 37℃ 및 5% CO₂의 조건 하에서 고농도 포도당, 글루타민, 및 피루베이트를 함유한 DMEM (이하 'DMEM'이라 함)(HyClone, Logan, UT, USA:Cat no. SH30243)에 10%(v/v) 소태아혈청(FBS), 및 1x페니실린/스트렙토미신 (100 U/ml peninicillin, 100ug/ml streptomycin)을 함유한 배지에서 계대 배양하여 얻었다. 사용된 노화 세포는 계대수 33이고 분열기간이 약 14일 이상인 세포였다.

DCUN1D3 shRNA 또는 SEAT1 shRNA는 렌티바이러스에 도입하여 DCUN1D3 shRNA 또는 SEAT1 shRNA 함유 렌티바이러스에 의하여 상기 노화 세포 내로 전달되었다. DCUN1D3 shRNA 또는 SEAT1 shRNA 함유 렌티바이러스는 pLKO.1 puro vector (OriGene 사, 미국)는 하기 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 각각 합성하고 이를 이중가닥 구조인 shRNA 구조체를 제조하고 (IDT 사, 한국), 제한 효소 AgeI과 EcoRI을 잘려진 pLKO.1 puro vector에 상기 shRNA 구조체를 연결하여, 제조하였다. 제조된 DCUN1D3 shRNA 또는 SEAT1 shRNA 함유 렌티바이러스를 293FT 인간 배아 신장 세포 (#R700-07: Invitrogen)에 Lipofectamine 2000을 사용하여 패키징 벡터인 VSV-G 및 PAX2 (OriGene 사, 미국)와 함께 형질도입하였다. 본 명세서에서 형질 도입 시에는 신장 세포를 포함하는 성장 배지에 폴리프린(polybrene) 6ug/ml을 첨가하여 형질도입 효율을 증가시켰다. 형질 도입 후 2일째에 렌티바이러스 상등액을 회수하고 Lenti-X (Clontech 사, cat. no.631231)을 사용하여 농축하였다.

이렇게 제조된 DCUN1D3 shRNA 또는 SEAT1 shRNA 함유 렌티바이러스를 상기 노화 세포에 형질감염(transfection)시키고 4주 동안 37℃ 및 5% CO₂의 조건 하에서 고농도 포도당, 글루타민, 및 피루베이트를 함유한 DMEM (이하 'DMEM'이라 함)(HyClone, cat.no. SH30243, 미국)에 10% (v/v)소태아혈청(FBS), 및 1x페니실린/스트렙토미신 ((100 U/ml peninicillin, 100ug/ml streptomycin)을 함유한 배지에서 상기 노화 세포를 계대 배양하였다. 사용된 DCUN1D3 shRNA의 뉴클레오티드 서열은 서열번호1 (센스) 및 서열번호 2(안티센스)의 뉴클레오티드 서열이다. 사용된 SEAT1 shRNA의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드(SEAT1 siRNA #1); 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드(SEAT1 siRNA #2); 또는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드(SEAT1 siRNA #3);를 포함하는 것일 수 있다. . 대조군으로 사용된 scramble RNA (Bioneer사, 한국)는 제조사에서 제공된 것을 사용하였다.

DCUN1D3 shRNA:

서열번호 1 (센스): GUCACUGCAUCGGGAAAUA(dTdT)

서열번호 2 (안티센스): UAUUUCCCGAUGCAGUGAC(dTdT)

SEAT1 #1 shRNA:

SEAT1 siRNA #1; 서열번호 6(센스) 및 서열번호 7(안티센스)의 폴리뉴클레오티드

SEAT1 siRNA #2; 서열번호 8(센스) 및 서열번호 9(안티센스)의 폴리뉴클레오티드

SEAT1 siRNA #3; 서열번호 10(센스) 및 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드(안티센스)

도 6은 배양된 DCUN1D3 shRNA 또는 SEAT1 shRNA 함유 렌티바이러스가 도입된 노화 세포의 수(A) 및 DNA 함량(B)을 상대적으로 나타낸 도면이다. 도 6에서, "control shRNA"는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포이고, "DCUN1D3 shRNA"와 "SEAT1 shRNA"는 각각 DCUN1D3 shRNA (서열번호 1 및 2) 또는 SEAT1 shRNA (서열번호 6 및 7) 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, DCUN1D3 shRNA 또는 SEAT1 shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포 즉, 음성 대조군에 비하여 세포의 수 및 DNA 함량이 증가하였다. 또한, 세포의 형태가 젊은 세포와 같았다. 따라서, DCUN1D3 shRNA 또는 SEAT1 shRNA는 노화 세포에 도입되는 경우 노화 세포의 증식을 유도한다는 것을 알 수 있다. 도 6에서, DNA 함량은 아래와 같이 측정하였다. 세포를 평평한-바닥 6-웰 미크로플레이트(flat-bottomed 6-well microplate)의 웰당 20,000 개 세포를 시딩하였다. 세포 수를 Fluorstar microplate reader (BMG Labtec, Cary, NC, USA) 상에서 SYBR Gold(Invitrogen) 형광 강도를 측정함으로써 정해된 시간에 측정하였다.

노화 세포는 SA β-gal의 활성이 증가되어, X-gal 염색시 세포가 파란색으로 염색된다. (1)에 설명된 바와 같이, 노화 세포에 DCUN1D3 shRNA 또는 SEAT1 shRNA 또는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스를 형질감염시키고 배양된 노화 세포에 대하여 SA β-gal의 활성을 측정하였다. DCUN1D3 shRNA 및 SEAT1 shRNA 및 scramble shRNA 함유 렌티바이러스를 형질감염시키지 않은 노화 세포를 음성 대조군으로 하였다.

구체적으로, 배양된 상기 노화 세포를 Cellular Senescence Assay Kit (Cell BIOLABS, INC.)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 염색하고, 현미경으로 파란색으로 염색된 세포 수를 계수하였다. 도 7은 scramble shRNA(A) 또는 SEAT1 shRNA(B) 또는 DCUN1D3 shRNA(C) 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포에 대하여 X-gal 염색한 사진 및 파란색으로 염색된 세포 수의 % 비율을 나타낸 도면이다.

도 7에 나타낸 바와 같이, scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포 중 염색된 세포가 약 85.5%인 반면, DCUN1D3 shRNA 및 SEAT1 shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포 중 염색된 세포가 각각 약 52.3% 및 약 12.6%이었다. 따라서, 노화 세포가 DCUN1D3 shRNA 및/또는 SEAT1 shRNA함유 렌티바이러스로 형질감염된 경우, SA β-gal의 활성이 감소되는 것이 확인되었다. 이는 노화 세포에 DCUN1D3 shRNA 및/또는 SEAT1 shRNA 함유 렌티바이러스가 도입되는 경우, 노화 세포의 노화 수준이 감소된다는 것을 나타낸다.

노화 세포는 자식작용 활성이 감소하고, 리포푸신이 축적되고, 미토콘드리아가 손상되는 것으로 알려져 있다. 이를 확인하기 위하여, (1)에 설명된 바와 같이, 노화 세포에 DCUN1D3 shRNA 또는 SEAT1 shRNA 또는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스를 형질감염시키고 배양된 노화 세포에 대하여 세포 중의 리포푸신의 양을 측정하였다. DCUN1D3 shRNA 및 SEAT1 shRNA 및 scramble shRNA 함유 렌티바이러스를 형질감염시키지 않은 노화 세포를 음성 대조군으로 하였다. 또한, 세포 크기를 측정하였다.

리포푸신의 양은 배양된 상기 노화 세포에 대하여 자가형광(autofluorescence) 측정법에 의하여 측정하였다. 도 8은 DCUN1D3 shRNA 또는 SEAT1 shRNA 또는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포에 대하여 리포푸신을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.

도 8에 나타낸 바와 같이, scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포의 자가형광 강도에 비하여 SEAT1 shRNA 및 DCUN1D3 shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포의 자가형광은 각각 약 10% 및 약 66%이었다. 따라서, 노화 세포가 SEAT1 shRNA 또는 DCUN1D3 shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 경우, 노화 세포의 리포푸신의 축적이 감소된다는 것을 나타낸다. 이는 노화 세포에 SEAT1 shRNA 또는 DCUN1D3 shRNA 함유 렌티바이러스가 도입되는 경우, 노화 세포의 노화 수준이 감소된다는 것을 나타낸다.

도 9는 DCUN1D3 shRNA 또는 SEAT1 shRNA 또는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포의 크기(A) 및 세포 구형성(granularity)(B)을 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 9에 나타낸 바와 같이, DCUN1D3 shRNA 또는 SEAT1 shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포의 크기는 scramble shRNA 함유 렌티바이러스로 형질감염된 노화 세포의 크기보다 작아진다는 것을 확인하였다.

도 8 및 9에서, 세포 크기, 세포 구형성(granularity), 및 자가-형광은 유세포 흐름 분석에 의하여 추정하였다. 구체적으로, 트립신 처리된 세포를 PBS 중에 회수하고, FACSCaliber instrument(Becton Dickson, 미국) 상에서 분석하였다. 100,000 세포의 세포 크기 및 구형성이 이전에 기술된 포워드 및 측면 스캐터(side scatter)를 각각 분석함으로써 평가되었다. 자가-형광은 여기에 대하여 488-nm 레이저 및 검출에 대하여 530/30 밴드패스 필터를 사용하여 측정하였다. 도 9의 A와 B의 세로 축의 FSC, SSC는 각각 포워드 스캐터 세포 크기 (forward scatter, cell size)와 측면 스캐터 세포 구형성 (side scatter, cell granularity)을 나타낸다.

(4) 세포주기 조절에 대한 영향

이를 확인하기 위하여, 노화 세포에 siRNA 및 대조군 siRNA를 도입하고 세포 주기를 측정하였다. 구체적으로, siRNA와 대조군 siRNA는 (1)에 설명된 바에 있는 shRNA와 scramble RNA를 렌티바이러스에 패키징하지 않고 그 자체를 lipofectamine을 사용하여 노화 세포에 도입시키고 배양된 노화 세포에 대하여 세포 주기를 측정하였다. SEAT1 siRNA 및 DCUN1D3 siRNA는 상기 SEAT1 shRNA 및 DCUN1D3 shRNA를 각각 도입하여 세포 내에서 siRNA가 생성되도록 하였다.

도 10은 SEAT1 siRNA 또는 DCUN1D3 siRNA 또는 대조군 siRNA가 도입된 노화 세포의 세포 주기를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 10에서, 실험은 3 반복 (triplicate)로 하였으며, 배양은 3일 동안 하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, SEAT1 siRNA 또는 DCUN1D3 siRNA가 도입된 노화 세포의 세포 주기는 대조군 siRNA가 도입된 노화 세포의 주기보다 G0/G1기와 S기의 비율이 증가하였다. 도 10에서 세로축의 단위는 %이며, 이는 대조군 siRNA에 대한 결과를 100으로 한 경우에 대한 비율이다.

	세포 주기
	% G0/G1	% S	% G2/M
대조군 siRNA	66.8	5.5	23.9
DCUN1D3 siRNA	60.1	7.9	29.7
SEAT1 shRNA #1	59.4	9.8	27.5
SEAT1 shRNA #2	61.4	8.4	27.5

n=3, 3일 배양, HDF(M4, 분열기간=14일).

SEAT1 shRNA #2의 서열은 다음과 같다.

SEAT1 #2 shRNA:

(5) SEAT1 의 표적 단백질로서 DCUN1D3

DCUN1D3 유전자가 Lnc RNA인 SEAT1의 표적인지를 확인하였다.

먼저, 사람 세포와 마우스 세포에 siSEAT1을 도입한 경우 DCUN1D3 유전자의 발현이 함께 감소하는지를 확인하였다. 사용된 사람 세포는 (1)에서 사용된 노화된 HDF M4 세포이며, 마우스 세포는 MEF (mouse embryo fibrlblast) 세포를 사용하였다. siRNA의 세포 내로의 도입은 (4)에 기재된 바와 동일하게 수행하였다.

도 11은 siSEAT1가 도입된 사람(A) 및 마우스 세포(B)에서 DCUN1D3 유전자와 SEAT1 유전자 등의 발현 정도를 나타낸 도면이다. 도 11에 나타낸 바와 같이, SEAT1 siRNA가 도입된 경우, SEAT1 유전자뿐만 아니라 DCUN1D3 유전자의 발현도 함께 감소하였다. 이는 SEAT1 유전자의 발현이 SEAT1 유전자의 발현과 강하게 연관되어 있다는 것을 나타낸다. 즉, SEAT1 유전자는 SEAT1의 표적이다는 것을 나타낸다.

(6) SEAT1 및 DCUN1D3 가 DNA 손상에 미치는 영향

SEAT1 및 DCUN1D3가 DNA 손상을 감소 또는 증가시키는지를 확인하였다.

구체적으로 (1)에 기재된 노화된 HDF M4 세포에 SEAT1 shRNA와 DCUN1D3 shRNA를 (1)에 기재된 바에 따라 각각 도입하고 배양한 후 DNA 손상된 마커인 νH2AX와 53BP1에 특이적인 단일클론 항체를 사용하여 νH2AX 및/또는 53BP1 양성인 세포를 확인하였다. 구체적으로, 세포를 폴리-L-리신-코팅된 커버슬립(#08-774-383; Corning Inc., Corning NY, USA) 상에 또는 35-mm 디쉬(#81156:Corning Inc.) 중에 성장시켰다. 세포를 실온에서 신선하게 준비된 PBS 중의 2% 파라포름알데히드로 10 내지 20분 동안 고정한 다음 PBS 중 0.5% Triton X-100 및 2 ug/ml Hoechst 33342(Sigma-Aldrich)로 5 분 동안 투과성이게 하였다(permeabilized). 차단(blocking)은 실온에서 30분 동안 PBS 중 2% BSA로 수행하였다. 시료를 실온에서 1 내지 2 시간 동안 또는 밤새 2% BSA/PBS로 희석된 일차 항체와 함께 인큐베이션한 PBS 세척하고, 2차 항체(secondary antibodies)(Jackson ImmunoResearch)로 30분 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 시료를 ProLong Gold Antifade reagent(Invitrogen)을 사용하여 탑재하고(mounted) -30℃에서 저장하거나, 즉시 이미지화하였다. 형광 신호는 Zeiss AxioObserver D1 또는 Zeiss 710 confocal microscope(Wetzlar, Germany)를 사용하여 가시화하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12는 SEAT1 shRNA 및/또는 DCUN1D3 shRNA가 세포 내 DNA 손상에 미치는 영향을 나타낸 도면이다. 도 12에 나타낸 바와 같이, SEAT1 shRNA 또는 DCUN1D3 shRNA가 노화된 세포에 도입되는 경우, DNA 손상을 현저하게 감소시켰다. 이는 SEAT1 shRNA 또는 DCUN1D3 shRNA가 노화된 세포를 젊은 세포로 전환 또는 노화된 세포를 보호한다는 것을 나타낸다. 또한, SEAT1 shRNA 또는 DCUN1D3 shRNA가 노화와 연관된 질병 또는 증상을 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 나타낸다. 도 12에서, "Proliferating"은 HDF M4 세포를 나타낸다. 도 12에서 세로축은 νH2AX와 53BP1 이중 양성인 세포의 비율을 나타내는 것으로서, 이 수치가 크면 DNA 손상이 많다는 것을 나타낸다.

(7) SEAT1 유전자 또는 DCUN1D3 유전자 발현의 억제가 hIL -6 발현에 미치는 영향

SEAT1 유전자 또는 DCUN1D3 유전자 발현의 억제가 hIL-6 발현에 미치는 영향을 확인하였다. IL-6(interleukin-6)는 염증 촉진성 시토킨(pro-inflammatory cytokine)이며 사람에서는 IL6 유전자에 의하여 발현된다. 노화된 세포는 젊은 세포에 비하여 IL-6의 수준이 높은 것으로 알려져 있어서, IL-6의 세포 내 수준을 감소시키는 것은 노화된 세포의 보호 또는 노화된 세포를 젊은 세포로 전환하는 능력의 지표가 될 수 있다.

구체적으로 (1)에 기재된 노화된 HDF M4 세포에 SEAT1 siRNA와 DCUN1D3 siRNA를 (1)에 기재된 바에 따라 각각 도입하고 배양한 후 hIL-6 특이적인 단일클론 항체를 사용하여 ELISA에 의하여 Luminex로 hIL-6의 배양 상등액 중의 수준을 측정하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13은 SEAT1 유전자 또는 DCUN1D3 유전자 발현의 억제가 hIL-6 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다. 도 13에서, siSEAT1 #3, DCUN1D3 #2, 및 #3은 하기 서열을 갖는 shRNA로부터 만들어지는 siRNA를 나타낸다. 또한, siSEAT1 #1,2,3과 siDCUN1D3 #1,2,3은 각각 3개 siRNA가 공동 도입된 것을 나타낸다.

SEAT1 #3 shRNA:

서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 (센스)

서열번호 11의 폴리뉴클레오티드(안티센스)

DCUN1D3 #2 shRNA:

서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 (센스)

서열번호 13의 폴리뉴클레오티드(안티센스)

DCUN1D3 #3 shRNA:

서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 (센스)

서열번호 15의 폴리뉴클레오티드(안티센스)

도 13에 나타낸 바와 같이, SEAT1 및/또는 DCUN1D3의 siRNA가 노화된 세포에 도입된 경우 hIL-6의 수준을 현저하게 감소시켰다. 이는 SEAT1 및/또는 DCUN1D3의 siRNA가 노화된 세포는 젊은 세포로 전환시키거나, 노화된 세포를 보호하거나, 개체의 노화와 연관된 질병 또는 증상을 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 나타낸다.

(8) miR -20b에 의한 DCUN1D3 유전자 발현의 조절

SEAT1과 DCUN1D3 유전자의 서열을 공지된 miRNA 서열과 비교하여, DCUN1D3 유전자 발현 조절에 관여하는 miR-20b(서열번호 16)를 확인하였다.

구체적으로 (1)에 기재된 노화된 HDF M4 세포에 miR-20b를 (1)에 기재된 바에 따라 각각 도입하고 배양한 후 DCUN1D3 특이적인 단일클론 항체를 사용하여 ELISA에 의하여 DCUN1D3의 세포 중의 수준을 측정하였다. 구체적으로 노화된 HDF M4 세포에 miR-20b를 아래 방법에 따라 형질감염(transfection)하고 3일 동안 배양 후 수확하고 RNA를 추출하고, 추출된 RNA를 주형으로 하여 RT-PCR을 수행하여 DCUN1D3 mRNA 수준을 측정하였다.: HDF M4 세포 형질감염은 제조자의 지시에 따라 Lipfectamine RNAiMAX(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 혼합된 50nM siRNA를 사용하여 수행되었다. 세포를 형질감염 3일 후 수확하여 RNA를 추출하였다. HDF M4 세포 중에서 miR-20b 모사(mimic) (50nM) 및 음성 대조군(50nM)을 사용하여 miR-20b 기능 획득(gain-of-function) 실험을 수행하였다. 기능 획득 실험은 HDF M4 세포주 중 miR-20b 저해제(75nM)와 음성 대조군(75nM)을 사용하여 수행하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14는 miR-20가 DCUN1D3 유전자의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다. 도 14에서, 세로축은 상대적인 DCUN1D3 수준을 나타내는 것이다. 도 14에 나타낸 바와 같이, miR-20b이 노화된 세포에 도입되는 경우, DCUN1D3의 발현을 현저하게 감소시켰다.

<110> Samsung Co., Ltd. <120> Composition for reducing the level of cellular senescence comprising inhibitor of DCUN1D3 activity or inhibitor of DCUN1D3 gene expression and use thereof <130> PN109860KR <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA: sense sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> nucleotide sequence (RNA) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxynucleotide sequence (DNA) <400> 1 gucacugcau cgggaaauat t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA: antisense sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> nucleotide sequence (RNA) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxynucleotide sequence (DNA) <400> 2 uauuucccga ugcagugact t 21 <210> 3 <211> 304 <212> PRT <213> Homo sapiens : DCN1-like protein 3 <400> 3 Met Gly Gln Cys Val Thr Lys Cys Lys Asn Pro Ser Ser Thr Leu Gly 1 5 10 15 Ser Lys Asn Gly Asp Arg Glu Pro Ser Asn Lys Ser His Ser Arg Arg 20 25 30 Gly Ala Gly His Arg Glu Glu Gln Val Pro Pro Cys Gly Lys Pro Gly 35 40 45 Gly Asp Ile Leu Val Asn Gly Thr Lys Lys Ala Glu Ala Ala Thr Glu 50 55 60 Ala Cys Gln Leu Pro Thr Ser Ser Gly Asp Ala Gly Arg Glu Ser Lys 65 70 75 80 Ser Asn Ala Glu Glu Ser Ser Leu Gln Arg Leu Glu Glu Leu Phe Arg 85 90 95 Arg Tyr Lys Asp Glu Arg Glu Asp Ala Ile Leu Glu Glu Gly Met Glu 100 105 110 Arg Phe Cys Asn Asp Leu Cys Val Asp Pro Thr Glu Phe Arg Val Leu 115 120 125 Leu Leu Ala Trp Lys Phe Gln Ala Ala Thr Met Cys Lys Phe Thr Arg 130 135 140 Lys Glu Phe Phe Asp Gly Cys Lys Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ile Asp 145 150 155 160 Gly Ile Cys Ala Arg Phe Pro Ser Leu Leu Thr Glu Ala Lys Gln Glu 165 170 175 Asp Lys Phe Lys Asp Leu Tyr Arg Phe Thr Phe Gln Phe Gly Leu Asp 180 185 190 Ser Glu Glu Gly Gln Arg Ser Leu His Arg Glu Ile Ala Ile Ala Leu 195 200 205 Trp Lys Leu Val Phe Thr Gln Asn Asn Pro Pro Val Leu Asp Gln Trp 210 215 220 Leu Asn Phe Leu Thr Glu Asn Pro Ser Gly Ile Lys Gly Ile Ser Arg 225 230 235 240 Asp Thr Trp Asn Met Phe Leu Asn Phe Thr Gln Val Ile Gly Pro Asp 245 250 255 Leu Ser Asn Tyr Ser Glu Asp Glu Ala Trp Pro Ser Leu Phe Asp Thr 260 265 270 Phe Val Glu Trp Glu Met Glu Arg Arg Lys Arg Glu Gly Glu Gly Arg 275 280 285 Gly Ala Leu Ser Ser Gly Pro Glu Gly Leu Cys Pro Glu Glu Gln Thr 290 295 300 <210> 4 <211> 2886 <212> DNA <213> Homo sapiens DCN1, defective in cullin neddylation 1, domain containing 3 (DCUN1D3), mRNA <400> 4 agaaagggtt tgactggagg aacctctgga gcagctgttg gctggctcct ctggctgatg 60 gcatgttgag gtacatgggc cagcggcagc gagggcatcc aatccagagg ggtccactct 120 agaggccagg ccaccagcac catgggccag tgtgtcacca agtgtaagaa tccctcatcg 180 accctgggca gcaaaaatgg agaccgtgag cccagcaaca agtcacatag caggaggggt 240 gcaggccacc gtgaggagca ggtaccaccc tgtggcaagc caggtggaga tatcctcgtc 300 aacgggacca agaaggccga ggctgccact gaggcctgcc agctgccaac gtcctcggga 360 gatgctggga gggagtccaa gtccaatgcc gaggagtctt ccttgcaaag attggaagaa 420 ctgttcaggc gctacaagga tgagcgggaa gatgcaattt tggaggaagg catggagcgc 480 ttttgcaatg acctgtgtgt tgaccccaca gaatttcgag tgctgctctt ggcttggaag 540 ttccaggctg caaccatgtg caaattcacc aggaaggagt tttttgatgg ctgcaaagca 600 ataagtgcag acagcattga cggaatctgt gcacggttcc ctagcctctt aacagaagcc 660 aaacaagagg ataaattcaa ggatctctac cggtttacat ttcagtttgg cctggactct 720 gaagaagggc agcggtcact gcatcgggaa atagccattg ccctgtggaa actagtcttt 780 acccagaaca atcctccggt attggaccaa tggctaaact tcctaacaga gaacccctcg 840 gggatcaagg gcatctcccg ggacacttgg aacatgttcc ttaacttcac tcaggtgatt 900 ggccctgacc tcagcaacta cagtgaagat gaggcctggc caagtctctt tgacaccttt 960 gtggagtggg aaatggagcg aaggaaaaga gaaggggaag ggagaggtgc actcagctca 1020 gggcctgagg gcttgtgtcc cgaggagcag acttagtggc tctgtcccag gagcagcagc 1080 aaggatctgc cagctgccct gcagccaact gaggaattgg accattttgg aaattactga 1140 agatccggat attttctact ttacaccttt ctctgccttg tatctgaaag ggctctaaaa 1200 tgctgtatca tgttttaggc actttcttca tttttttggt tattttggtt atttcctttt 1260 tggggggatc tcccagaata tttgaacctg gttacatgtt gtgtatcttt ttttgaagcc 1320 ttcagataga 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cagaacatca gggtgatgtg gagaggggca ggatgtggac 120 gccacattgg aaatcggcaa catctgaggg caacaacaaa caagtgtgtt gggaaataag 180 aaataactca gttttgacaa ctggctttgt cagcttttgt gatgtttctt tagcagttta 240 ttggaaagat ggtatgagat gacgtgctgc ttcattgaat tgctctttcc cccatctttg 300 ccaaatctca atgtatcgtt cttaacccca cctcctgtaa ggggctttgc tatgcttcag 360 ctggttgtct cagcagctga agtgctgccc acctgtgtga gttgggtcca ggaaaccatg 420 tctgcccttc tgataaggga agatgaatct agagctgggt gaagatctaa attttaacca 480 aacccctggg cccaggaaaa taacaattga aaatgtacaa ggcagtgttt tcaatattaa 540 acttccccaa ggaaagcaca aactagtctt tttggaaagg gagaaaggat taagccacac 600 agtattagtc tttgaagcag tactggtctc taggggctgg tgccaaaatg gagtcccata 660 gtagttacac tcgatggcct catgtactat atactgtgcc gaattgtatt aaacagtggt 720 ggggagttac tgggataaga acttgtctaa aagtttacaa accaaaacag atctgttagg 780 ttggtgcaaa agtaagtttt tgccatactt aatgtattgc cattaagtat ggcaaaaacc 840 acaattactt ttacaccaac ctatgtattt aagaatgttt ggtttgccag attccaaatg 900 aggtcttcag tgcagcaaag cccaaaaggt gtagactcag ttatgcaatt ataaggttaa 960 ggcgtagaag aaagctgctg ctaggttttt gttgcatttt acttgactgc tctgctgttt 1020 ttcttgtctc tcatgtttgg ttagctatga cttgagcatc ttggtaactg acaaaggtct 1080 tccttggggg acttgaacat cttggtaaat gacaggtctt cttggaggac tccagcagta 1140 tcttgtttaa acgactgaaa ggactattaa ggttgttgaa ttgtgttaat tggaactcat 1200 tgaggaaatg cgacattgat cctcctctta ttccacagtg tgttttctga tcatataaag 1260 aaggttccga accatccatc cccctcagag tttattcccc tggtaagctg taattgcata 1320 tccagtttaa actggactgg gactgcatgt tggtgaggat cggcaggggt tttccccctt 1380 ttcgaaagat gaaatagatt cttgagcact ggttgcagaa gccaaaatag ttcaaatagc 1440 tttgcataac cattgggttc tgcttctgat tcaggtgctg ggcatcatgt cctccctatt 1500 cttctcttct tggaaaccca gcctatctca taaataccta cttccggcca cccatccaac 1560 ctccctgctc ctttcaacac aaatcttgga tattgccaaa ggaagccatt cagcagctgc 1620 tggggttttt catccccctg acatgcatac atttgctctg ggagaagtgt cttccctctg 1680 accctggtcc ccagctccgt ctgtgcttaa ttgctcttac ctgttgcact aatgaatatg 1740 actaggtttt aaagggggaa tgtgaagcaa taggcacatg gggcttggat gaattggtcc 1800 cacagatata ccctgcctta agccgctgag gtgatgagtc cactgctcat gtgaccctcc 1860 acctttgtgg atccctcttg gtttgtgacc agtgtgtctg tttgttgagg ttgtacaaac 1920 ttgacaaaag ttaatacttt tgtttgtatt ttctgcactg ttgcactctc caaatggccc 1980 cttgagtatt tttattgact tgttacacac atttttgtct ttgatgtcta cattttttcc 2040 tttaatgttt tttatttgga aggttacctg ctgttggatt taataaattt gtttacttga 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2118 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA #1 SEAT 1(sense) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxynucleotide sequence <400> 6 gagugagcag uaagucugut t 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA #1 SEAT 1(anti_sense) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxynucleotide sequence <400> 7 acagacuuac ugcucacuct t 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA #2 SEAT 1(sense) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxynucleotide sequence <400> 8 cuuuuuggaa agggagaaat t 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA #2 SEAT 1(anti-sense) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxynucleotide sequence <400> 9 uuucucccuu uccaaaaagt t 21 <210> 10 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA #3 SEAT 1(sense) <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> deoxynucleotide sequence <400> 10 gagggaaaug cgacauugau tt 22 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA #3 SEAT 1(anti_sense) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxynucleotide sequence <400> 11 aucaaugucg cauuuccuct t 21 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DCUN1D3 siRNA #2(sense) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxynucleotide sequence <400> 12 caguguguca ccaaguguat t 21 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DCUN1D3 siRNA #2(antisense) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxynucleotide sequence <400> 13 uacacuuggu gacacacugt t 21 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DCUN1D3 siRNA #3(sense) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxynucleotide sequence <400> 14 gucacugcau cgggaaauat t 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DCUN1D3 siRNA #3(antisense) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxynucleotide sequence <400> 15 uauuucccga ugcagugact t 21 <210> 16 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 16 caaagugcuc auagugcagg uag 23

Claims

쿨린 네딜레이션1, 3 함유 도메인에 결함이 있는, DCN1(DCN1, defective in cullin neddylation 1, domain containing 3: DCUN1D3) 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제를 유효성분으로 포함하는, 세포의 노화 수준을 감소시키기 위한 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 발현 저해제는 작은 간섭 RNA (small interference RNA: siRNA), 작은 헤어핀 RNA (shRNA), miRNA(microRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 shRNA는 서열번호 1 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 활성 저해제는 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레티드에 대한 작은 간섭 RNA (small interference RNA: siRNA), 작은 헤어핀 RNA (shRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 세포의 노화 수준을 감소시키는 것은 세포의 증식능을 증가시키는 것, 자식작용(autophage) 활성을 증가시키는 것, 리포푸신 축적을 감소시키는 것, β-갈락토시다제 활성을 감소시키는 것, 미토콘드리아 활성 산소 종을 감소시키는 것, 및 미토콘드리아 막 전위를 높이는 것 중 하나 이상을 포함하는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상을 치료하기 위한 것인 조성물.
청구항 6에 있어서, 상기 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상은 피부주름, 상처, 근감소증(sarcopenia), 근위축증(muscular dystrophy), 조기노화증 (Hutchinson-Gilford progeria syndrome) 또는 그 조합인 것인 조성물.
청구항 6에 있어서, 상기 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상은 리포푸신의 축적과 연관된 질병 또는 질병 증상인 것인 조성물.
청구항 8에 있어서, 상기 리포푸신의 축적과 연관된 질병 또는 질병 증상은 신경 세로이드 리포푸신증 (neuronal ceroid lipofuscinoses: NCL), 나이관련황반변성 (Age-related macular degeneration), 신경근섬유의 엉킴 (neurofibrillary tangles), 심장의 갈색위축 (Brown atrophy of the heart), 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 파킨슨병 (Parkinson's disease), 루게릭 병 (amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 말단 비대증 (acromegaly), 탈신경 위축증 (denervation atrophy), 지질 축적 근질환 (lipid myopathy), 또는 만성 폐쇄성 폐 질환 (chronic obstructive pulmonary disease: COPD)인 것인 조성물.
쿨린 네딜레이션1, 3 함유 도메인에 결함이 있는, DCN1(DCN1, defective in cullin neddylation 1, domain containing 3: DCUN1D3) 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제를 유효성분으로 포함하는, 세포의 리포푸신 축적을 감소시키기 위한 조성물.
청구항 10에 있어서, 상기 세포는 인 비보에 존재하고, 상기 조성물은 리포푸신의 축적과 연관된 질병 또는 질병 증상을 치료하기 위한 것인 조성물.
쿨린 네딜레이션1, 3 함유 도메인에 결함이 있는, DCN1(DCN1, defective in cullin neddylation 1, domain containing 3: DCUN1D3) 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제를 포유 동물에게 투여하여, 세포의 노화 수준을 감소시키는 단계:를 포함하는, 포유 동물에서 세포의 노화 수준을 감소시키는 방법.
쿨린 네딜레이션1, 3 함유 도메인에 결함이 있는, DCN1(DCN1, defective in cullin neddylation 1, domain containing 3: DCUN1D3) 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제를 포유 동물에게 투여하여, 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상을 치료하는 단계:를 포함하는, 포유 동물에서 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상을 치료하는 방법.
청구항 13에 있어서, 상기 발현 저해제는 작은 간섭 RNA (small interference RNA: siRNA), 작은 헤어핀 RNA (shRNA), miRNA(microRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
청구항 13에 있어서, 상기 활성 저해제는 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레티드에 대한 작은 간섭 RNA (small interference RNA: siRNA), 작은 헤어핀 RNA (shRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
청구항 13에 있어서, 상기 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상은 피부주름, 상처, 근감소증(sarcopenia), 근위축증(muscular dystrophy), 조기노화증 (Hutchinson-Gilford progeria syndrome) 또는 그 조합인 것인 방법.
청구항 13에 있어서, 상기 세포의 노화 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상은 리포푸신의 축적과 연관된 질병 또는 질병 증상인 것인 방법.
청구항 17에 있어서, 상기 리포푸신의 축적과 연관된 질병 또는 질병 증상은 신경 세로이드 리포푸신증 (neuronal ceroid lipofuscinoses: NCL), 나이관련황반변성 (Age-related macular degeneration), 신경근섬유의 엉킴 (neurofibrillary tangles), 심장의 갈색위축 (Brown atrophy of the heart), 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 파킨슨병 (Parkinson's disease), 루게릭 병 (amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 말단 비대증 (acromegaly), 탈신경 위축증 (denervation atrophy), 지질 축적 근질환 (lipid myopathy), 또는 만성 폐쇄성 폐 질환 (chronic obstructive pulmonary disease: COPD)인 것인 방법.
쿨린 네딜레이션1, 3 함유 도메인에 결함이 있는, DCN1(DCN1, defective in cullin neddylation 1, domain containing 3: DCUN1D3) 단백질 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 활성을 저해하는 활성 저해제 또는 DCUN1D3을 코딩하는 유전자 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 저해하는 발현 저해제를 포유 동물에게 투여하여, 세포의 리포푸신 수준을 감소시키는 단계:를 포함하는, 포유 동물에서 세포의 리포푸신 수준을 감소시키는 방법.
청구항 19에 있어서, 상기 방법은 포유 동물에서 세포의 리포푸신 수준의 증가와 연관된 질병 또는 질병 증상을 치료하는데 사용되는 것인 방법.