KR20160145035A - 생체분자의 수집, 안정화 및 용리를 위한 기재 및 방법 - Google Patents

Abstract

단백질의 추출, 안정화 및 저장을 위한 고체 기재가 제공된다. 상기 기재는 실질적 건조 상태 하에 폴리사카라이드, 예컨대 멜레지토스를 포함한다. 기재는 샘플로부터 단백질을 추출하고, 추출된 단백질을 장기간의 시간 동안 주위 조건 하에 건조 포맷으로 안정화하도록 구성된다. 건조 고체 기재에 저장된 단백질을 수집 및 회수하기 위한 방법도 기술된다.

Description

생체분자의 수집, 안정화 및 용리를 위한 기재 및 방법 {SUBSTRATES AND METHODS FOR COLLECTION, STABILIZATION AND ELUTION OF BIOMOLECULES}

본 발명은 생물학적 샘플로부터의 생체분자의 수집, 안정화 및 용리를 위한 건조 고체 기재에 관한 것이다. 본 발명은 또한 건조 고체 기재로부터의 생물학적 샘플 유래 생체분자의 수집, 안정화 및 용리를 위한 방법에 관한 것이다.

생물학적 샘플로부터의 단리 또는 정제 동안 생체분자의 구조적 및 기능적 완전성을 보존하는 것은 피분석물 검출, 감지, 법의학, 진단 또는 치료 적용분야 등을 포함한 다양한 이후 적용분야에 있어서 필수적이다. 생물학적 샘플로부터 유래하는 단백질, 펩티드 또는 아미노산의 추출 및 안정화는 비제한적으로 용액 pH, 온도, 그리고 편재성인 다양한 프로테아제들의 존재를 포함한 수많은 환경적 인자들에 민감하다. 이에 따라, 가수분해 및 효소 분해를 방지하고 단백질 구조 또는 기능의 완전성을 보존하기 위하여, 용액 상태의 단백질 또는 펩티드는 통상적으로 냉장하에 (예컨대 4℃, -20℃ 또는 -80℃) 저장된다.

건조 포맷에서의 단백질 또는 펩티드의 성공적인 수집 및 보존을 주장하는 건조-상태 기술은 통상적으로 저장 전에 단백질이 샘플로부터 "사전-정제" 및 "농축"될 것을 필요로 한다. 건조 포맷에서의 단백질의 보존을 위한 다른 건조-상태 기술은 추가적인 건조 설비 (예컨대 강제 기류, 동결건조)를 필요로 한다. 따라서, 이러한 방법들은 추가적인 상당한 처리 단계 없이 샘플 (예컨대 생물학적 샘플)로부터의 단백질 또는 펩티드의 수집 및 안정화를 수행하는 데에는 도움이 되지 않는다.

단백질 또는 펩티드는 변성되기가 쉬우며, 그에 따라 저장 동안 생물학적 활성 또는 항원결정인자 인식을 상실하는 경향이 있다. 바이오마커 또는 생물학적 치료용 약물과 같이 여러 분석 시험의 표적이 되는 단백질들은 미정제 상태에서 적은 양으로 존재할 수 있다. 따라서, 해당 단백질 피분석물의 회수를 최대화하는 방법이 매우 바람직하다. 단백질 또는 펩티드의 분해는 예를 들면 프로테아제 활성을 억제하는 화학 첨가제를 사용하면 지연 또는 방지될 수 있다. 그러나, 화학 첨가제의 존재는 질량 분광법 및 면역 검정을 포함한 하류 분석 기술에 영향을 줄 수 있다.

903 또는 31ETF 종이 (와트만(Whatman)™, GE 헬스케어(Healthcare) 사) 또는 등급 226 종이 (알스트롬(Ahlstrom), 퍼킨엘머(PerkinElmer) 사)와 같은 미처리 셀룰로스 종이 기재가 신생아 시험과 같은 분석 목적을 위한 건조된 혈액 스팟 중 효소, 항체, 단백질, 펩티드 및 아미노산의 보존에 광범위하게 사용되고 있다. 그러나, 미처리 셀룰로스 기재로부터의 피분석물의 회수, 및 이후의 상기 피분석물, 특히 분해되기 쉬운 단백질의 생물학적 활성은 종종 충분하지 않다. 건조된 시편, 예컨대 신생아 시험에 사용되는 건조된 혈액 스팟 샘플은 일반적으로 피분석물 안정성을 유지하기 위하여 냉장하에 저장된다. 건조된 혈액 스팟으로부터 비효율적으로 용리될 수 있는 피분석물은 저조한 기능적 회수로 인하여 관련 기술분야에서 불안정한 표적으로 해석될 수 있다. 상이한 화학 충전재를 보충하여 단백질을 안정화하는 것이 관련 기술분야에 보고되어 있으나, 상기 충전재는 민감한 단백질을 회수하고 안정화함에 있어서 제한된 능력을 갖는다.

따라서, 생물학적 샘플로부터의 단백질, 펩티드 또는 아미노산을 포함한 생체분자의 수집 및 추출을 가능케 하며, 이어서 사전-정제 없이 건조-상태 및 주위 조건 하에서 생체분자를 안정화하고, 이후 추가적인 분석을 위하여 실질적 무손상 형태로 생체분자를 용리시키는 조성물 및 방법이 매우 바람직하다.

[발명의 개요]

생체분자의 추출, 안정화 및 용리를 위한 고체 기재의 일 실시양태는 실질적 건조 상태 하에 멜레지토스를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 생체분자의 수집, 안정화 및 용리를 위한 고체 기재는 실질적 건조 상태 하에 트리사카라이드를 포함한다.

고체 기재 상에 배치된 생물학적 샘플로부터 생체분자를 추출, 안정화 및 용리시키기 위한 방법의 일 예는 생물학적 샘플을 기재에 접촉시키는 것; 생물학적 샘플을 실질적 건조 상태로 건조시키는 것; 및 기재를 용리 완충제 중에서 재수화시킴으로써, 기재 상에 건조되어 있는 생물학적 샘플로부터 생체분자를 용리시키는 것을 포함하는데, 여기서 상기 고체 기재는 실질적 건조 상태 하에 멜레지토스, 그리고 임의적으로 실질적 건조 상태 하에 그 내부에 함침되어 있는 1종 이상의 용해 시약, 핵산 변성 시약 또는 이들의 조합을 포함한다.

도 1은 비개질 31-ETF 셀룰로스와 비교하였을 때의 15% 멜레지토스를 포함하는 기재로부터 회수되는 동안의 활성인 비-변성 β-gal의 강화된 용리 효율을 보여주는 그래프이다.

실시양태는 단백질, 펩티드, 아미노산, 효소 및 항체와 같은 생체분자의 추출, 안정화 및 용리를 위한 적합한 매트릭스 및 방법을 제공한다. 변성되기 쉬운 생체분자는 그로 인해 무손상 형태로 보존하기가 어렵다. 본 발명의 하나 이상의 실시양태는 생체분자의 추출, 안정화 및 용리를 위한 고체 기재에 관한 것이며, 여기서 상기 기재는 실질적 건조 상태 하에 멜레지토스와 같은 트리사카라이드를 포함한다. 상기 고체 기재는 생물학적 샘플을 수집한 다음, 장기간 동안 샘플로부터 단백질, 펩티드 또는 아미노산을 추출 및 안정화한 후, 이어서 단일 공정 단계 이내로 용리시키도록 구성된다. 용리된 단백질 또는 펩티드는 다양한 하류 적용분야에서 사용된다. 상기 기재는 주위 온도에서 실질적 건조-상태로 단백질 또는 펩티드를 안정화하고, 실질적으로 완전한 단백질의 구조 및/또는 기능을 유지하도록 구성된다.

청구 발명의 주제를 더 분명하고 간결하게 기술하기 위하여, 특정 용어들에 대하여 하기의 정의가 제공되는 바, 하기하는 상세한 설명 및 첨부된 청구범위에서 사용된다. 명세서 전체에 걸쳐, 특정 용어에 대한 예시는 비-제한적인 예로 간주되어야 한다.

문맥상 분명하게 달리 지정되지 않는 한, 단수 표현에는 복수의 언급도 포함된다. 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 본원에서 사용될 때, 그것이 관련되어 있는 기본적인 기능의 변화를 초래하지 않고 변화가 허용될 수 있는 소정의 양적 표현을 수식하는 데에는, 개략적인 언어가 적용될 수 있다. 따라서, "약"과 같은 용어에 의해 수식되는 값이 열거된 정확한 값으로 제한되는 것은 아니다. 일부 예에서는, 개략적인 언어가 값을 측정하기 위한 기기의 정밀도에 상응할 수 있다. 필요할 경우, 범위가 제공될 수 있는데, 그와 같은 범위는 그 사이의 모든 하위-범위들을 포괄하는 것이다.

본원에서 언급될 때의 "생물학적 샘플"이라는 용어에는 인간을 포함한 임의의 생물체로부터 수득되는 혈액, 혈청, 조직 및 타액이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 생물학적 샘플은 자가-진단 시험 (예컨대 혈당 모니터링)을 적용받는 개인에 의해, 또는 예를 들면 바늘을 사용하여 혈액을 흡인하는 것 또는 환자 피부상의 병변과 같은 특정 영역을 긁어내거가 도포하는 것을 포함한 다양한 기술들을 통하여 훈련된 의료 전문가에 의해 수득될 수 있다. 다양한 생물학적 샘플을 수집하는 방법에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. "샘플"이라는 용어에는 상기에서 정의된 바와 같은 생물학적 샘플이 포함될 뿐만 아니라, 예를 들면 조직 배양 세포 및 정제된 단백질도 포함된다.

본원에서 언급될 때의 "환원제"라는 용어에는 또 다른 화학물질 종에 전자를 제공하는 소정의 화학물질 종이 포함된다. 다양한 환원제들이 관련 기술분야에 알려져 있다. 대표적인 환원제에는 디티오트레이톨 (DTT), 2-메르캅토에탄올 (2-ME) 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)이 포함된다. 또한, 이들 또는 다른 환원제들의 어떠한 조합도 사용될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 환원제는 TCEP이다.

본원에서 사용될 때의 "완충제"라는 용어에는 예를 들면 2-아미노-2-히드록시메틸-프로판-1,3-디올 (트리스(Tris)), 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (MES), 3-(N-모르폴리노) 프로판술폰산 (MOPS), 시트레이트 완충제, 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES) 및 포스페이트 완충제가 포함된다. 잠재적 완충제의 이와 같은 목록은 단지 예시 목적이다. 본원에서 개시되는 조성물 및 방법에서 사용하기 위하여 선택되는 완충제의 pH는 통상적으로 3 내지 10의 범위이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 사용되는 완충제의 pH는 6 내지 9의 범위이거나, 또는 일부 다른 실시양태에서, 완충제의 pH는 7 내지 8의 범위이다.

생체분자의 수집, 안정화 및 용리를 위한 고체 기재의 일 실시양태는 실질적 건조 상태 하에 트리사카라이드를 포함한다. 상기 트리사카라이드는 멜레지토스, 라피노스, 말토트리울로스, 이소말토트리오스, 니제로트리오스, 말토트리오스, 케토스 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.

고체 기재의 하나 이상의 실시양태는 실질적 건조 상태 하에 멜레지토스를 포함한다. 멜레지토스는 504.44 g/mol의 분자량을 가지는 비-환원성의 트리사카라이드 당이다. 하나 이상의 실시양태에서, 고체 기재는 멜레지토스를 포함하며, 여기서 멜레지토스의 농도는 약 10 내지 30% 범위이다. 일 실시양태에서, 멜레지토스의 농도는 15%이다. 멜레지토스는 기재에 함침될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기재에서의 함침된 멜레지토스 농도는 10 내지 30% 사이이다. 일부 다른 실시양태에서는, 15% 멜레지토스가 기재에 함침된다. 기재는 멜레지토스에 의해 수동적으로 코팅되거나, 또는 공유-개질될 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 기재는 멜레지토스의 15% 용액에 의해 코팅된다. 멜레지토스를 포함하는 기재는 높은 단백질 안정성을 나타냄은 물론, 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같은 더 높은 수율을 제공한다.

하나 이상의 실시양태에서, 기재는 또한 1종 이상의 시약, 예컨대 용해 시약, 완충제 시약 또는 환원제에 의해 함침된다. 일부 실시양태에서, 함침된 시약은 실질적 건조 상태 하에 그 내부에 함침되어 있는 세포 용해 시약, 생체분자 안정화 시약 예컨대 단백질-안정화 시약, 단백질 저장 화학물질 및 이들의 조합을 포함한다.

상기 기재는 또한 생물학적 샘플로부터 단백질 또는 펩티드를 추출하고 그것을 주위 온도에서 실질적 건조 상태로 보존하도록 구성된다. 본원에서 사용될 때, "실질적 건조 상태"라는 용어는 대략 2% 미만의 물 함량을 가지도록 추출된 생체분자를 건조시키는 것을 지칭한다. 마찬가지로, 시약들은 실질적 건조 상태로 기재에 함침된다.

기재에의 조성물의 "도입"에는 하기하는 "침지" 절차가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 그와 같은 방법은 건조 고체 기재에의 조성물의 도입을 수행한다. 건조 고체 기재에의 조성물의 도입 후, 고체 기재는 임의의 적절한 방법을 사용하여 건조된다.

하나 이상의 실시양태에서, 기재는 용해 시약을 포함한다. 상기 용해 시약은 세제, 카오트로프제(chaotrope), 변성제 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 특정 변성제로 제한하고자 하는 것은 아니나, 그것은 그의 생물물리학적 특성 및 생물학적 효소 활성 (예컨대 프로테아제)을 완전히 억제하는 능력에 따라 약하거나 강한 용해 시약 중 어느 하나로 범주화될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 약한 단백질 변성제 (예컨대 세제)가 세포를 용해시키고, 단백질은 변성시키지 않으면서 단백질-단백질 상호작용을 붕괴시키는 데에 사용될 수 있다. 수많은 용해 시약들이 관련 기술분야에 알려져 있어서, 본원에서 기술되는 조성물 및 방법에 사용하기 위하여 선택될 수 있다. 특정 용해 시약으로 제한하고자 하는 것은 아니나, 대표적인 용해 시약에는 구아니디늄 티오시아네이트, 구아니디늄 히드로클로라이드, 나트륨 티오시아네이트, 칼륨 티오시아네이트, 아르기닌, 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 우레아 또는 이들의 조합이 포함된다.

주지된 바와 같이, 용해 시약에는 세제가 포함될 수 있는데, 대표적인 세제들은 이온성 세제, 비-이온성 세제 또는 양쪽이온성 세제로 범주화될 수 있다. 이온성 세제는 음이온성 세제 예컨대 나트륨 도데실술페이트 (SDS) 또는 양이온성 세제 예컨대 에틸 트리메틸 암모늄 브로마이드를 포함할 수 있다. 세포 용해를 위한 비-이온성 세제의 비-제한적인 예에는 트리톤(Triton)X-100, NP-40, 브리즈(Brij) 35, 트윈(Tween) 20, 옥틸 글루코시드, 옥틸 티오글루코시드 또는 디지토닌이 포함된다. 일부 양쪽이온성 세제는 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트 (CHAPS) 및 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판술포네이트 (CHAPSO)가 포함될 수 있다.

하나 이상의 실시양태에서, 용해 시약은 티오시아네이트 염을 포함한다. 기재의 하나 이상의 실시양태는 건조 상태로 함침되어 있는 티오시아네이트 염을 포함한다. 대표적인 티오시아네이트 염에는 구아니디늄 티오시아네이트, 나트륨 티오시아네이트, 칼륨 티오시아네이트 또는 이들의 조합이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 다른 실시양태에서, 용해 시약은 구아니디늄 티오시아네이트, 나트륨 티오시아네이트, 나트륨 도데실 술페이트 (SDS) 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.

하나 이상의 실시양태에서, 기재는 생물학적 샘플로부터의 추출 후에 원하는 수준으로 단백질의 안정성 및 완전성을 유지한다. 일 실시양태에서, 기재는 1종 이상의 단백질 안정화 시약에 의해 함침된다. 이러한 안정화 시약에는 프로테아제 억제제, 완충제 또는 킬레이트화제 (예컨대 EDTA)가 포함될 수 있다.

프로테아제 존재하에서의 회수된 단백질의 분해는 1종 이상의 프로테아제 억제제를 기재에 첨가하는 것에 의해 회피될 수 있는데, 여기서 프로테아제 억제제는 외부적으로 첨가될 수 있거나, 또는 기재에 함침될 수 있다. 일 실시양태에서, 함침된 프로테아제 억제제는 건조 기재의 습윤화시 활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기재는 추가적으로 프로테아제 억제제를 포함하는데, 여기서 상기 프로테아제 억제제는 합성 또는 자연 발생의 것 (예컨대 자연-발생 펩티드 또는 단백질)이며, 아프로티닌, 베스타틴, 키모스타틴, 류펩틴, 알파-2-마크로글로불린, 펩스타틴, 페닐메탄술포닐 플루오라이드, N-에틸말레이미드, 에틸렌디아민테트라아세트산, 항트롬빈 또는 이들의 조합을 포함한다. 일 예에서, 이와 같은 프로테아제 억제제의 첨가는 프로테아제 또는 펩티다제를 억제하는 것에 의해 액체 상태 및 건조-포맷 모두에서 단백질의 안정성을 강화한다.

기재의 소정 실시양태는 건조-상태로 완충제 시약을 포함하며, 추출 과정 동안 그것이 재-수화될 수 있다. 이러한 완충제의 예에는 2-아미노-2-히드록시메틸-프로판-1,3-디올 (트리스), 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (MES), 3-(N-모르폴리노) 프로판술폰산 (MOPS), 시트레이트 완충제, 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES), 포스페이트 완충제 또는 이들의 조합이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 주지된 바와 같이, 기재는 수화시 6 내지 8의 pH를 제공하는데, 이는 생물학적 샘플로부터의 생체분자의 추출 및 추출된 생체분자의 안정화를 가능케 한다. 수화는 물 또는 임의의 다른 용액 (예컨대 완충제 용액)을 샘플에 첨가하는 것에 의해 달성될 수 있다. 기재의 하나 이상의 실시양태는 수화시 2 내지 7 범위의 pH를 제공한다. 일부 실시양태에서, 기재는 수화시 7 내지 10 범위의 pH를 제공한다. 일 실시양태에서, 기재는 수화시 6 내지 8 범위의 pH를 제공한다.

일부 실시양태에서, 기재는 추가적으로 1종 이상의 환원제를 포함하며, 여기서 상기 환원제는 디티오트레이톨 (DTT), 2-메르캅토에탄올 (2-ME), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP) 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 기재는 1종 이상의 킬레이트화제를 포함한다. 상기 킬레이트화제는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 시트르산, 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (EGTA) 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.

일부 실시양태에서, 기재는 추가적으로 폴리사카라이드를 포함한다. 상기 폴리사카라이드는 덱스트란, 피콜(Ficoll)?, 키토산, 아밀로펙틴, 알기네이트, 카르복시메틸 셀룰로스 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 일 실시양태에서, 폴리사카라이드는 피콜?이다. 일 실시양태에서, 기재는 추가적으로 GE 헬스케어(Healthcare) 사의 15% 일루스트라(Illustra)™ 레디-투-고(Ready-To-Go) (RTG) 성분 용액을 포함한다.

기재는 기재 재료를 가용화하지 않으면서 단백질 또는 펩티드의 수집, 추출 및 저장을 가능케 한다. 고체 기재는 니트로셀룰로스 멤브레인, 셀룰로스 멤브레인, 셀룰로스 아세테이트 멤브레인, 재생 셀룰로스 멤브레인, 니트로셀룰로스 혼합 에스테르 멤브레인, 폴리에테르술폰 멤브레인, 나일론 멤브레인, 폴리올레핀 멤브레인, 폴리에스테르 멤브레인, 폴리카르보네이트 멤브레인, 폴리프로필렌 멤브레인, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인, 폴리에틸렌 멤브레인, 폴리스티렌 멤브레인, 폴리우레탄 멤브레인, 폴리페닐렌 옥시드 멤브레인, 폴리(테트라플루오로에틸렌-코-헥사플루오로프로필렌 멤브레인, 유리 섬유, 및 상기 멤브레인 2종 이상의 임의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

고체 기재는 다공성일 수 있다. 일 실시양태에서, 고체 기재는 다공성 셀룰로스 종이, 예컨대 와트만™ 유래의 셀룰로스 기재이다. 일 예에서, 와트만™ 유래 셀룰로스 기재는 903-셀룰로스, FTA™ 또는 FTA™ 엘류트(Elute)를 포함한다.

주지된 바와 같이, 고체 기재는 건조 상태로 조성물을 포함하며, 또한 건조 조건 하에 추출된 단백질을 보존한다. 추출 및 저장에 있어서의 건조 고체 기재의 사용은 액체-기반 추출에 비해 유리한데, 건조 기재가 기재에 적용되는 샘플의 최소한의 부피 희석을 보장하기 때문이다. 액체-기반 추출은 과량 부피의 안정화 시약 중에서 샘플의 농도를 희석시킬 수 있다. 반면, 생체분자 추출 및 안정화용 건조 고체 기재는 샘플은 물론 추출되는 생체분자의 농도를 유지하고, 불충분한 부피의 액체 보존제 중에서의 샘플의 부적당한 희석과 관련되어 있는 샘플 분해와 같은 문제를 제거한다. 또한, 고체 기재는 고정된 조성의 건조 시약들을 포함하는데, 이는 수화시 단백질, 펩티드 또는 아미노산과 같은 생체분자의 효율적인 추출에 이어지는 주위 온도에서의 추출된 생체분자의 안정화를 가능케 한다.

이하, "주위 조건" 또는 "주위 온도"라는 용어는 호환가능하게 사용된다. 본원에서 사용될 때, "주위 온도"라는 용어는 0℃ 내지 60℃ 사이 범위의 온도를 지칭한다. 하나 이상의 실시양태에서, 주위 온도는 실온이다. 일부 실시양태에서, 기재는 주위 온도 하에 건조 상태로 단백질을 저장 또는 보존하도록 구성된다.

주지된 바와 같이, 고체 기재는 건조-상태 하에서 장기간 동안 단백질을 저장 또는 보존하도록 구성된다. "~하도록 구성되다" 또는 "~용으로 구성되다"라는 용어는 본원에서 기재가 주위 온도에서 장기간 동안 단백질을 추출하고 저장하는 것을 가능케 하는 기재의 구조 또는 조성을 지칭한다. "저장" 또는 "보존"이라는 용어는 추출된 단백질을 추가적인 분석에 적합한 포맷으로 유지하는 것과 관련하여 본원에서 호환가능하게 사용될 수 있다. 더 구체적으로, 단백질은 고체 기재 중에 저장 또는 보존될 수 있으며, 여기서 기재는 분자의 완전성을 유지하는 것을 보장한다.

일부 실시양태에서, 기재는 고체 상 추출 기재이다. 고체 상 추출 방법이 사용되는 경우, 본원에서 기재는 고체 상 추출 기재로 지칭된다. 고체-상 추출 (SPE) 기술은 서열분석 및 기타 적용분야를 위한 고순도 단백질의 추출 시간을 감소시키는 지렛대 효과를 갖는다. 고체 상 추출은 고체 상 및 액체 상을 사용하여 재료로부터 동일 유형이거나 상이한 유형인 1종 이상의 분자를 단리하는 추출 방법이다. 기재는 예를 들면 크로마토그래피 분리 또는 기타 분석 방법의 상류에서 샘플을 정제하는 데에 사용된다.

일부 예에서, 기재는 주위 온도에서의 건조 포맷으로의 (예컨대 고체 기재 상에서의) 분해되기 쉬운 단백질의 저장을 가능케 한다. 하나 이상의 실시양태에서, 기재는 주위 온도에서 생체분자에 대해 향상된 안정성 및 용리를 제공하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 기재는 20 내지 22℃ 사이의 주위 온도에서 적어도 1개월 내지 3개월의 저장 동안 생체분자에 대해 향상된 안정성을 제공하도록 구성된다.

기재는 단백질을 주위 온도에서 실질적 무손상 형태 하에 건조 포맷으로 저장하도록 구성된다. 단백질의 "형태"라는 용어는 단백질의 완전한 구조 또는 기능을 지칭한다.

일부 실시양태에서, 기재에 함침되어 있는 건조 시약들은 완충제, 물 또는 샘플을 첨가하는 것에 의해 수화된다. 일 실시양태에서, 함침된 건조 시약은 단백질의 추출 또는 저장을 위하여 기재 상에 배치되는 샘플, 더 구체적으로는 생물학적 샘플에 의해 수화된다. 일부 다른 실시양태에서는, 샘플 이외에, 기재를 수화하기 위하여 물 또는 완충제가 첨가됨으로써, 기재에 매립되어 있는 시약들을 재구성하거나 활성화한다. 일부 실시양태에서, 기재의 수화는 기재 상에서의 단백질의 추출을 위한 적절한 pH를 생성시킨다. 일부 실시양태에서, 수화는 또한 건조된 형태로 기재에 존재하는 세포-용해 시약, 단백질 안정화 시약, 환원제, 완충제 시약과 같은 시약들의 재구성을 초래한다.

본원에서는, 고체 기재 상에 배치되어 있는 생물학적 샘플로부터 생체분자를 추출, 안정화 및 용리시키기 위한 방법이 제공된다. 방법의 예는 생물학적 샘플을 기재에 접촉시키는 것을 포함하는데, 여기서 상기 기재는 실질적 건조 상태 하에 멜레지토스, 그리고 실질적 건조 상태 하에 그 내부에 함침되어 있는 1종 이상의 용해 시약, 핵산 변성 시약 또는 이들의 조합을 포함한다. "생물학적 샘플을 접촉시키는 것"이라는 용어의 비-제한적인 예에는 피펫, 카테터, 주사기 또는 도관을 사용하여 기재 상에 샘플을 적용하거나 샘플을 배치하는 것이 포함된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 기재 상에 부어질 수 있다. 상기 방법은 또한 생물학적 샘플을 실질적 건조 상태로 건조시키는 것을 포함한다. 용리의 경우, 용리 완충제에서 기재를 재수화시킴으로써, 기재 상에 건조되어 있는 생물학적 샘플로부터 생체분자가 용리된다.

"추출"이라는 용어는 샘플, 더 구체적으로는 생물학적 샘플로부터 단백질을 분리하거나 단리하기 위한 소정의 방법을 지칭한다. "추출" 및 "수집"이라는 용어는 본원에서 호환가능하게 사용된다. 단백질 및 펩티드와 같은 생체분자는 세포-용해에 의해 세포로부터 방출될 수 있다. 일 실시양태에서, 단백질은 증발에 의한 세포-용해 동안 방출될 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, 세포 용해 시약을 포함하는 기재와의 접촉에 의해 세포가 분해된다. 예를 들면 FTA™ 또는 FTA™ 엘류트 셀룰로스 종이를 사용하는 것에 의해, 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 기재에 접촉시키는 것은 단백질을 방출하는 세포 용해를 초래한다.

주지된 바와 같이, 상기 방법은 또한 생물학적 샘플을 실질적 건조 상태로 건조시키는 것을 포함하며, 건조된 샘플은 장기간 동안 기재 상에서 저장될 수 있다. 고체 기재는 공기-건조 또는 진공-건조와 같은 임의의 적절한 방법을 사용하여 건조된다. 샘플 건조된 기재는 수주 또는 수개월 동안 저장될 수 있으며, 필요에 따라 기재상의 건조 샘플로부터 단백질 또는 펩티드가 용리될 수 있다.

일 실시양태에서, 상기 방법은 또한 주위 온도에서 실질적 건조 상태로 고체 기재상의 추출된 단백질을 저장하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 1개월의 시간 기간을 초과하여 저장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 6개월의 기간을 초과하여 저장될 수 있다. 일부 단백질 또는 펩티드는 분해되기가 쉽기 때문에, 기재를 사용한 추출 및 보존은 유용하며, 회수되는 단백질 또는 펩티드는 다양한 하류 적용분야에 추가적으로 사용될 수 있다.

주지된 바와 같이, 상기 방법은 또한 기재를 용리 완충제 중에서 재수화시킴으로써, 기재 상에 건조되어 있는 생물학적 샘플로부터 생체분자를 용리시키는 것을 포함한다. "용리"라는 용어는 다양한 수단에 의해 기재로부터 단백질 또는 펩티드와 같은 생체분자를 회수하는 것을 지칭한다. 방법의 하나 이상의 실시양태는 고체 상 추출 기술에 의해 기재로부터 생체분자를 회수하는 것을 포함한다. 하나 이상의 실시양태에서는, 수성 용액, 완충제 또는 유기 용액에서 기재를 재수화시키는 것에 의해, 단백질이 고체 기재로부터 용리되며, 상기 단백질은 추가적인 분석에 적용된다. 샘플 (예컨대 정제되지 않은 생물학적 샘플)로부터의 생체분자의 용리를 가능케 하는 어떠한 방법도 사용될 수 있다. 단백질은 수성 용액, 상기에서 정의된 바와 같은 완충제 용액, 또는 유기 용액 중에서 고체 기재 (예컨대 셀룰로스 종이)를 재수화시키는 것에 의해, 용리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 전기용리, 전기영동, 또는 용리 완충제를 사용한 세척에 의해 고체 기재로부터 회수된다.

상기에서 제시된 방법은 임의적으로 추가적인 분석을 위하여 고체 기재로부터 단백질을 용리시키기 전에 기재를 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 기재는 단백질의 용리 전에 적합한 완충제 또는 물을 사용하여 1회 이상 세척될 수 있다.

일부 실시양태에서, 기재는 기재로부터의 생체분자의 용리시 70 내지 90% 회수를 제공하도록 구성된다. 용리는 생체분자가 무손상 형태로 용리되도록 수행된다. 상기 방법의 실시양태에서, 생체분자의 용리는 효과적인 안정화 및 보존을 위한 단백질 또는 펩티드의 사전-정제를 필요로 하지 않는다. 단백질 또는 펩티드는 추출 후 이어서 단일 단계에서 안정화 및 용리될 수 있다.

주지된 바와 같이, 장기 저장시 분해되기 쉬운 단백질 또는 펩티드는 생물학적으로 활성인 상태에서의 단백질의 % 회수 면에서 정의될 수 있다. 분해되기 쉬운 단백질은 실온에서 1주 동안의 기재에서의 저장 후 생물학적으로 활성인 상태로 약 60% 미만의 회수를 가지거나 약 40% 미만의 회수를 가지는 단백질로 정의되는데, 이 경우 기재에는 어떠한 시약도 없다.

일부 실시양태에서, 기재를 사용하는 전체 방법, 예컨대 생물학적 샘플을 적용하는 것, 기재 상에서 샘플을 건조시키는 것, 기재로부터의 단백질 또는 펩티드의 저장, 추출 및 용리는 무균 조건 하에 수행될 수 있다.

이와 같은 방법에서 이용되는 샘플에는 인간을 포함한 임의의 생물체로부터 수득되는 혈액, 혈청, 조직 및 타액과 같은 생물학적 샘플이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

추출되는 생체분자는 단백질, 펩티드, 아미노산, 효소, 항체 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 생체분자에는 자연 발생 단백질, 합성 단백질, 돌연변이 단백질, 융합 단백질 또는 키메라 단백질이 포함될 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 화학적으로 합성될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 또는 펩티드는 세포에서 자연적으로 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체분자는 세포 또는 조직 절편으로부터 단리될 수 있는 재조합 단백질 또는 펩티드이다. 생체분자에는 번역 후 변형된 단백질 또는 펩티드가 포함될 수 있다. 단백질은 효소 또는 촉매를 포함할 수 있다. 단백질, 펩티드 또는 아미노산은 세균 공급원, 동물 공급원 또는 인간 공급원과 같은 다양한 공급원으로부터 단리될 수 있다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 종이 기재의 제조

시약: 31-ETF는 GE 헬스케어 사의 것이었다. 적절한 배합물의 가온 용액에 셀룰로스 종이 (와트만 31ETF)를 침지한 후, 이어서 라인 오븐 컨베이어(line oven conveyor)를 사용하여 기재를 건조시키는 것에 의해, 종이 기재를 멜레지토스 및 기타 시약들로 함침시켰다. 다음에, 건조된 기재를 추가 시험시까지 건조제와 함께 밀라(Mylar) 백에 밀봉하였다. 하기 4종의 침지 배합물을 제조하였다: (1) 15% (부피-당-중량 기준) 멜레지토스 용액, (2) 역시 15%의 멜레지토스를 함유하는 표준 FTA 용액. 표준 FTA 성분은 하기를 포함함 (부피-당-중량 기준): 0.24% EDTA, 1.63% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 1.61% 트리스 완충제 염 및 0.56% 요산, (3) 5% (부피-당-중량 기준) 피콜 PM400, 및 (4) 하기 %의 하위-성분들을 함유하는 용액: 6.5% 멜레지토스, 4.2% 피콜 PM70 및 4.2% 피콜 PM400 (이하 멜레지토스-피콜 배합물로 지칭됨).

실시예 2: 단백질 안정성 검정

셀룰로스-기반 기재에서의 최초 안정성 평가를 위하여 하기 3종의 단백질을 선택하였다: 시토카인 IL-8, 콜레스테롤 단백질인 아포지질단백질 B (ApoB), 및 효소인 β-갈락토시다제 (β-gal). IL-8은 그것이 호흡기 감염의 대표적인 바이오마커이기 때문에 선택되었다. ApoB는 모델 불안정 단백질 (즉 건조된 혈액 스팟에서의 짧은 반감기로 알려져 있음)로서 선택되었다. β-gal은 효소 활성의 직접적인 정량을 제공하는 그의 능력때문에 제3의 모델 단백질로서 선택되었다.

각 기재 배합물의 평가를 위하여, 해당 단백질이 첨가된 완충제 또는 시트레이트-포스페이트-덱스트로스 (CPD)-안정화 인간 혈액 3 μL를 사용하여 기재의 3 mm 펀치(punch)를 개별적으로 스팟화하였다. 사용된 첨가 농도는 하기였다: ApoB의 경우 0.1 mg/mL, IL-8의 경우 3.3 ng/mL, 그리고 β-gal의 경우 10 ㎍/mL. 다음에, 스팟화된 샘플을 건조시키고, 낮은 습도 환경에서 저장하였다. ApoB 및 IL-8의 경우, 용리 완충제를 첨가하는 것에 의해 단백질을 용리 분리하였으며, 연속 진탕하에서 기재를 인큐베이팅하였다. 다음에, 시중의 ELISA 키트를 사용하여 용리된 단백질을 검출하였다. β-gal의 경우, 두 가지 상이한 방법을 사용하여 단백질 안정성을 측정하였다. 첫 번째 방법에서는, 각 기재로부터 용리 완충제로 단백질을 용리시킨 후, 용리된 단백질의 활성을 측정하였다. 두 번째 방법에서는, 각 기재의 펀치를 직접적으로 분석 완충제에 위치시키고, '종이-상(on-paper)' 효소 활성을 분석하였다. 완충된 샘플을 사용하여서는, 무색 기재 o-니트로페닐 갈락토시드의 황색인 생성물 o-니트로페놀로의 전환에 의해 β-gal 활성을 평가하였다. 혈액 샘플로는, 클로로페놀 레드 갈락토피라노시드 (CPRG)를 포함하는 기재의 클로로페놀 레드로의 전환에 의해 β-gal 활성을 평가하였다. 후자의 연구에서는, IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 포함한 다른 단백질들을 처리하여, 상기한 바와 같이 IL-8과 유사한 방식으로 분석하였다.

FTA™ 용액 또는 FTA™ + 15% 멜레지토스 용액에 침지-코팅된 31-ETF 셀룰로스를 사용하여, 실온에서 장기 저장 후 건조 혈액 스팟에서의 단백질의 안정성을 측정하고, 양 기재로부터의 상대적인 안정성 데이터를 하기 표 1에 나타내었다. 비개질 31-ETF™ 셀룰로스상의, 또는 그로부터 용리 분리된 각 단백질 피분석물의 신호에 대하여 데이터를 표준화하였다. 표 1은 침지 배합물 중 어느 하나에서의 멜레지토스의 포함이 31-ETF™ 셀룰로스 또는 FTA™ 기재 중 어느 하나에 비해 예상 밖으로 향상된 피분석물 신호를 초래한다는 것을 분명하게 입증하고 있다. 신호 향상의 크기가 다소 단백질 의존성이기는 하지만, 최고의 신호는 본 실시예 각 피분석물의 FTA™ + 15% 멜레지토스를 포함하는 기재에서 달성되었다. 멜레지토스-함유 기재는 ~20-22℃ 범위의 주위 온도에서 1개월 이상의 샘플 저장 후 비개질 31-ETF™으로부터 용리된 단백질과 비교하였을 때 용리된 단백질의 신호에 있어서 최소 20-60%의 향상을 나타내었다 (표 1). 저장 일수는 괄호 내에 표시하였으며, % 향상은 하기와 같이 계산하였다: (시험 종이의 신호 - 31ETF의 신호) / (31ETF의 신호) * 100.

<표 1> 장기간 실온 저장 후 비개질 31-ETF™ 셀룰로스에 대한 단백질 신호의 변화

FTA™ 기재는 SDS와 같은 변성제를 함유하였는데, 표 1에 나타낸 바와 같이, 이는 일부 피분석물에서 31-ETF™에 대한 단백질 신호의 % 변화에 있어서 음성 값을 초래하였다. 예상 밖으로, 기재에 함침된 멜레지토스와 같은 트리사카라이드는 실온 샘플 저장 동안 SDS의 존재하에서 향상된 검출 신호 (순수 양성 값)를 초래함으로써, 멜레지토스가 없는 FTA™에 비해 강화된 단백질 안정성을 입증하였다.

실시예 3: 30℃에서의 단백질 안정성

장기 (90-일) 샘플 저장 후 단백질 안정성을 측정하기 위한 배합물의 목록을 선택하였다. 본 실시예에서는, 해당 피분석물을 함유하는 인간 혈액 샘플을 각 기재에 적용하고, 낮은 습도 조건 하에 30℃에서 90일 동안 저장한 다음, 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이 단백질 안정성을 측정하였다. 모든 기재는 실시예 1에서 상기한 바와 같이 제조하였다. 기재 배합물의 펀치에 혈액 중 IL-1β (6 pg/μL), IL-8 (7.5 ng/mL), TNF-α (8 pg/μL) 또는 β-gal (10 ㎍/mL)을 개별적으로 투여하고, 상기한 바와 같이 실온에서 건조하였다. 선택된 기재로부터의 건조된 혈액 스팟을 30℃에서의 장기 저장 (저장 일수는 괄호 내에) 후 비개질 31-ETF 셀룰로스와 비교하였다.

ELISA 또는 효소 활성 데이터로 볼 때, 멜레지토스-함유 기재의 안정화 효과는 시험되는 단백질 피분석물의 유형에 따라 가변적이었으나, 모든 피분석물이 31-ETF 셀룰로스에 비해 멜레지토스를 함유하는 기재에서 향상된 신호를 나타내었다 (표 2). 예를 들면, 90일 저장 후, 용리되는 IL-1β 신호는 비개질 31-ETF에서의 해당 신호에 비해 15%의 멜레지토스를 함유하는 기재에서 24% 더 컸으며, 멜레지토스-피콜 배합물을 함유하는 기재에서는 52% 더 컸다. 30℃에서의 장기 저장 후 31-ETF 셀룰로스에 대한 멜레지토스-함유 기재의 순수 신호 향상을 하기 표 2에 나타내었다. 여기에서 조사된 바와 같이 5% 피콜 PM400 단독이 IL-1β, IL-8, TNF-α 및 β-gal과 같은 일부 단백질에 대하여 안정화 효과를 제공하기는 하였지만, 표 2에 나타낸 바와 같이, 피콜과의 조합으로서 멜레지토스를 포함하는 멜레지토스-피콜 배합물 (또는 피콜의 것과 유사한 조성물)을 포함하는 기재가 탁월한 안정화 효과를 나타내었다. 표 2에서, 모든 건조 혈액 스팟 샘플의 저장 일수는 괄호 안에 나타내었으며, % 향상은 하기와 같이 계산하였다: (시험 종이 - 31ETF) / (31ETF) * 100.

<표 2> 30℃에서의 장기 저장 후 31-ETF 셀룰로스에 대한 멜레지토스-함유 기재의 신호 향상

실시예 4: 건조 샘플로부터의 β-gal의 용리 효율

시토카인 표적 (IL-1β, IL-8 및 TNF-α) 및 ApoB의 ELISA 신호는 서로 다른 셀룰로스 기재들의 상대적 안정화 효과에 대한 유용한 척도를 제공하였다. 피분석물 신호가 억제되는 경우, 억제된 신호가 실질적인 단백질 변성과 연계된 완전 용리에 기인하는 것인지, 또는 실질적으로 활성인 비-변성 단백질의 불완전 용리에 기인하는 것인지를 확인하기가 어렵다. β-gal 신호는 반드시 활성 단백질에 따라 달라지므로, 이와 같은 특별한 피분석물은 "종이-상" 신호를 용리 신호와 비교하는 것에 의한 활성인 비-변성 단백질의 실제 용리 효율을 측정하는 기회를 제공하였다.

β-gal 첨가 혈액 샘플을 상기와 같이 제조하고, 실시예 3과 동일한 방식으로 장기 저장 동안 단백질의 안정성을 측정하였다. 이에 따라, 샘플을 3 mm 기재 펀치상에 스팟화하고, 건조시킨 후, 낮은 습도 조건 하에 30℃에서 저장하였다. 샘플을 14-90일 동안 저장한 바, 도 1에 나타낸 바와 같이, 이와 같은 저장 기간 전체에 걸쳐 대략 50%의 용리 향상이 지속적으로 관찰되었다. 도 1의 각 데이터 점은 비색측정 효소 활성 검정에 의해 측정하였을 때의 활성 단백질의 용리-대-총 ("종이-상") 신호 비를 나타낸다. 용리 조건은 3 mm 건조 혈액 스팟 샘플을 100 mL 완충제 (PBS/0.05% 트윈-20)과 함께 미세원심분리 튜브에 위치시키고, 철저하게 혼합한 후 (800 rpm, 1시간), 용리 효율을 측정하는 것에 의해 달성되었다. 도 1은 이와 같은 방식으로 측정되었을 때의 비개질 31-ETF 셀룰로스에 대한 15% 멜레지토스를 포함하는 기재로부터 회수되었을 때의 활성인 비-변성 β-gal의 강화된 용리 효율을 나타낸다.

본원에서는 본 발명의 소정 특징들만을 예시하고 기술하였지만, 통상의 기술자라면, 많은 변형 및 변경들을 수행하게 될 것이다. 이에 따라, 첨부된 청구범위는 모든 그와 같은 변형 및 변경들을 본 발명의 영역 내에 속하는 것으로 포괄하고자 하는 것임이 이해되어야 한다.

Claims (20)

1. 실질적 건조 상태 하에 멜레지토스를 포함하는, 생체분자의 추출, 안정화 및 용리를 위한 고체 기재.
2. 제1항에 있어서, 멜레지토스의 농도가 10 내지 30%의 범위인 기재.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 멜레지토스의 농도가 15%인 기재.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적 건조 상태 하에 그 내부에 함침되어 있는 1종 이상의 용해 시약, 생체분자 안정화 시약 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 기재.
5. 제4항에 있어서, 용해 시약이, 티오시아네이트 염, 음이온성 세제, 비이온성 세제, 양이온성 세제, 우레아 또는 이들의 조합, 바람직하게는 구아니디늄 티오시아네이트, 나트륨 티오시아네이트, 나트륨 도데실 술페이트 (SDS) 또는 이들의 조합으로부터 선택된 세제, 카오트로프제(chaotrope), 변성제 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 기재.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 환원제, 완충제, 항산화제, 킬레이트화제 또는 이들의 조합을 추가로 포함하며, 여기서 환원제는 디티오트레이톨 (DTT), 2-메르캅토에탄올 (2-ME), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP) 또는 이들의 조합으로부터 선택되고; 완충제는 2-아미노-2-히드록시메틸-프로판-1,3-디올 (트리스), 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (MES), 3-(N-모르폴리노) 프로판술폰산 (MOPS), 시트레이트 완충제, 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES), 포스페이트 완충제 또는 이들의 조합으로부터 선택되며; 킬레이트화제는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 시트르산, 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (EGTA) 또는 이들의 조합으로부터 선택된 것인 기재.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 덱스트란, 피콜, 키토산, 아밀로펙틴, 알기네이트, 카르복시메틸 셀룰로스 또는 이들의 조합으로부터 선택된 폴리사카라이드를 추가로 포함하는 기재.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 니트로셀룰로스 멤브레인, 셀룰로스 멤브레인, 셀룰로스 아세테이트 멤브레인, 재생 셀룰로스 멤브레인, 니트로셀룰로스 혼합 에스테르 멤브레인, 폴리에테르술폰 멤브레인, 나일론 멤브레인, 폴리올레핀 멤브레인, 폴리에스테르 멤브레인, 폴리카르보네이트 멤브레인, 폴리프로필렌 멤브레인, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인, 폴리에틸렌 멤브레인, 폴리스티렌 멤브레인, 폴리우레탄 멤브레인, 폴리페닐렌 옥시드 멤브레인, 폴리(테트라플루오로에틸렌-코-헥사플루오로프로필렌 멤브레인, 유리 섬유 또는 이들의 조합으로부터 선택된 기재.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 주위 온도에서 생체분자에 대해 향상된 안정성 및 용리를 제공하도록 구성된 기재.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 20 내지 22℃ 사이의 주위 온도에서 적어도 1개월 내지 3개월의 저장 동안 생체분자의 향상된 안정성을 제공하도록 구성된 기재.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 생체분자가 단백질, 펩티드, 아미노산, 효소, 촉매 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 기재.
12. 멜레지토스, 라피노스, 말토트리울로스, 이소말토트리오스, 니제로트리오스, 말토트리오스, 케토스 또는 이들의 조합으로부터 선택된 트리사카라이드를 실질적 건조 상태 하에 포함하는, 생체분자의 수집, 안정화 및 용리를 위한 고체 기재.
13. 실질적 건조 상태 하에 그 내부에 함침되어 있는 멜레지토스를 포함하는 기재에 생물학적 샘플을 접촉시키는 것;
    생물학적 샘플을 실질적 건조 상태로 건조시키는 것; 및
    기재를 용리 완충제 중에서 재수화시킴으로써, 기재 상에 건조되어 있는 생물학적 샘플로부터 생체분자를 용리시키는 것
    을 포함하는, 고체 기재 상에 배치된 생물학적 샘플로부터의 생체분자의 추출, 안정화 및 용리 방법.
14. 제13항에 있어서, 기재가, 기재로부터 생체분자의 70 내지 90% 회수를 제공하도록 구성된 것인 방법.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 기재가 생체분자를 무손상 형태로 용리시키도록 구성된 것인 방법.
16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 기재가 셀룰로스를 포함하는 것인 방법.
17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 멜레지토스가 10 내지 30% 범위의 농도, 바람직하게는 15%의 농도로 존재하는 것인 방법.
18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 기재가 1종 이상의 용해 시약, 핵산 변성 시약 및 이들의 조합을 추가로 포함하며, 여기서 용해 시약은 티오시아네이트 염, 세제, 우레아 또는 이들의 조합으로부터 선택되고, 바람직하게는 용해 시약은 구아니디늄 티오시아네이트, 나트륨 티오시아네이트, 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 아르기닌, 우레아 또는 이들의 조합으로부터 선택된 것인 방법.
19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 기재가 덱스트란, 피콜, 키토산, 아밀로펙틴, 알기네이트, 카르복시메틸 셀룰로스 또는 이들의 조합으로부터 선택된 폴리사카라이드, 바람직하게는 1 내지 10% 피콜을 추가로 포함하는 것인 방법.
20. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 기재가 그 내부에 함침되어 있는 환원제, 완충제, 항산화제, 킬레이트화제 또는 이들의 조합을 추가로 포함하며, 여기서 환원제는 디티오트레이톨 (DTT), 2-메르캅토에탄올 (2-ME), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP) 또는 이들의 조합으로부터 선택되고; 완충제는 2-아미노-2-히드록시메틸-프로판-1,3-디올 (트리스), 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (MES), 3-(N-모르폴리노) 프로판술폰산 (MOPS), 시트레이트 완충제, 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES), 포스페이트 완충제 또는 이들의 조합으로부터 선택되며; 킬레이트화제는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 시트르산, 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (EGTA) 또는 이들의 조합으로부터 선택된 것인 방법.

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