KR20160118022A

KR20160118022A - Dj-1 억제제를 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR20160118022A
Application number: KR1020150046248A
Authority: KR
Inventors: 박희세
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2015-04-01
Filing date: 2015-04-01
Publication date: 2016-10-11
Also published as: KR101789261B1

Abstract

본 발명은 DJ-1 억제제를 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 DJ-1 억제제는 DJ-1에 의한 Notch1 신호전달 경로 활성화를 차단시킴으로써 유방암을 억제하는 우수한 효과를 가지고 있으므로, 유방암의 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

DJ-1 억제제를 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{A PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING OR PREVENTING BREAST CANCER COMPRISING DJ-1 INHIBITOR AS AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 DJ-1 억제제를 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 DJ-1 억제제는 DJ-1에 의한 Notch1 신호전달 경로 활성화를 차단시키거나, Notch1과 RBP-Jk의 상호작용을 하향 조절하거나, 또는 Notch1과 Fbw7의 상호작용을 상향 조절함으로써 유방암을 억제하는 우수한 효과를 가지고 있으므로, 유방암의 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

Notch는 유전적으로 잘 보존되어 있는 막관통(transmembrane) 단백질로 배아의 발생과 세포 증식, 또는 세포 사멸에 중요한 역할을 한다. 포유동물은 4개의 Notch 유전자(Notch1-4)와 그의 리간드인 Jagged(Jagged1,2) 및 Delta(Delta 1,3,4)를 가지고 있다. Notch 신호전달은 Notch와 그의 리간드 Delta 사이의 상호작용의 결과로서 세포간 접촉시발현된다. Notch 수용체는 single pass type I transmembrane 단백질로 평소에는 세포막에 존재하는데, 리간드와 결합하게 되면 Notch 수용체의 세포외 도메인(extracellular domain, ECD)과 세포내 도메인(intracellular domain, ICD)에서 분열이 생기게 되고, Notch 수용체를 표지한 세포에서 세포 안을 자유롭게 이동할 수 있는 Notch1-IC(Notch intracellular domain)가 만들어진다. Notch1-IC가 핵 안으로 들어가면 전사조절인자로서 작용하여 Notch의 작용하에 존재하는 여러 목표 유전자의 발현에 영향을 주게 된다. 이때 Notch의 가장 중요한 결합 단백질로는 포유동물에서는 CSL(CBF1/recombining binding protein suppressor of hairless(RBP-Jk)), Drosophila melanogaster의 Suppressor of Hairless(SuH), Caenorhabditis elegans의 Lag-1 그리고 mastermind-like(MAML)가 있다. 대표적인 Notch의 목표 유전자로는 HES family [Hes/E(spl) family] 와 HEY family(Hesr/Hey family)가 있다. HES family와 HEY family와 같은 Notch의 일반적인 목표 유전자 외에도 c-Myc, CD25, GATA3 등 각 조직마다 특징적으로 각기 다른 목표 유전자들이 Notch로 인해 단백질의 발현이 조절된다.

최근, Notch가 많은 조직과 기관에서 중요한 역할을 하기 때문에, 많은 여러 질병들과 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. Notch와 연관되는 질병 중 암(cancer)이 많은 비중을 차지하고 있으며, 특정 조직에 따라 Notch가 발암 유전자와 종양 억제 인자 두 가지 역할을 모두 할 수 있는 것으로 알려져 있다. Notch와 종양간의 관련성은 1991년 T세포 급성 림프구성 백혈병(T acute lymphoblastic leukemias/lymphomas, TALL)에서 Notch의 염색체 전위(chromosome translocation)를 통해 처음 알려졌다. 이 염색체 전위로 인해 Notch1이 계속적으로 활성화된 상태로 존재하게 되고, 그로 인해 전사조절인자들의 발현이 달라져 TALL을 유발한다는 것이 밝혀졌다. 이후, Notch1이 백혈병(leukemia)뿐만 아니라 T세포 전구체(T cell progenitor)의 정상적인 발달과 T 전구세포(pre-Tcell) 수용체가 정확하게 형성되는 데에도 역할을 하는 것으로 알려져 있다. Notch는 이러한 백혈병과 같은 혈액 암 이외에 유방암, 속질모세포종, 대장암, 폐암 및흑색종등과 같은 여러 고형종양에도 중요한 역할을 한다고 한다. Notch의 oncogene으로써 역할 및 기저세포암종(Spontaneous basal cell carcinomas)와 같은 고형종양뿐 만 아니라 B세포 급성 림프구성 백혈병 (B-ALL)과 같은 혈액 암에서도 종양 억제 인자로 역할을 한다고 알려져 있다. 따라서, Notch가 인간의 여러 질병을 치료할 수 있는 단서와 방안을 제시해 줄 수 있는 여러 중요한 목표 중의 하나로 떠오르고 있다.

Notch 신호전달의 조절은 리간드 및 수용체 발현의 패턴, Notch-리간드 상호작용, 수용체 및 리간드 trafficking과 같은 여러 단계 및 당화, 인산화, 아세틸화, 질산화 및 유비퀴틴화와 같은 공유 변형(covalent modification)을 발생시킨다. Notch 신호전달의 거의 대부분이 유비퀴틴화를 통해 일어나기 때문에, Notch의 E3 리가아제가 Notch 신호전달의 회전율을 결정하는 중요한 역할을 한다. 5개의 E3 리가아제가 Notch, Notch 리간드, 또는 Notch 길항제(antagonist)를 조절한다. LNX는 Notch 수용체의 기능을 억제하는 막-관련 단백질인, Notch 길항제 Numb의 양성 조절자이다. Neuralized와 Mindbomb는 Notch 리간드 Delta의 모노-유비퀴틴화 및 엔도시토시스(endocytosis)를 통하여 리간드를 활성화시킨다. E3 리가아제 Itch는 자신의 4개의 WW 모티프를 통해 Notch의 세포내 도메인에 결합하고, Notch 세포외 도메인 절단의 형태와 작용하여 그것의 HECT 도메인을 통해 Notch1-IC의 유비퀴틴화를 활성화시킨다. 그리고 Notch 신호전달에서 Notch의 세포내 도메인의 반감기에 가장 중요한 역할을 하는 단백질이 있는데 바로 Fbw7이다. Fbw7는 자신의 WD40 도메인을 통해 Notch1-IC에 결합하여 proteasome 시스템을 통해 그의 유비퀴틴화 및 분해를 조절함으로써, PEST(proline-, glutamate-, serine-, threonine-rich) 도메인-의존성 Notch 세포내 분해를 활성화시킨다.

Fbw7/Cdc4(F-box and WD40 repeat domain-containing 7)은 세포 증식, 세포-주기 진행과 같은 다양한 세포 과정을 조절하는 종양 억제 단백질로서 종종 암에서 불활성화된다. Fbw7 내의 돌연변이는 유전자 돌연변이 및 발현 하향조절을 통해 유방암과 같은 다양한 인간 암을 유발한다. Fbw7은 SCF^FBW7(Skp1, CUL1 및 F-box 단백질의 복합체) 유비퀴틴 리가아제 복합체를 위해 기질 adaptor가 결합되어 기질 단백질의 인식 및 결합을 조절하는 F-box 단백질이다. SCF^FBW7는 세포 성장, 증식, 분화 및 생존에 중요한 역할을 하는 c-Myc, cyclin E, Mcl-1, c-Jun, 포유동물의 라파마이신타겟(mammalian target of rapamycin,mTOR), 및 Notch와 같은 proto-oncogene을 분해한다. 놀랍게도, 대부분의 Fbw7 기질은 다양한 인간 암에서 oncogene으로서 역할을 할 수 있는 것으로 알려져 있다.

한편, DJ-1은 PARK7로도 불리며, 파킨슨병(Parkinson's disease, PD)에 관여하는 것으로 알려져 있다. DJ-1의 기능적 불활성화는 그의 안정화를 차단하는 Leu166의 Pro으로의 돌연변이에 의해 야기된다. 다른 병원성 돌연변이인 M26I, E64D, L10P 및 P158Δ도 상염색체 열성유전을 보이는 조기 발병형 파킨슨병을 야기하는 것을 보고되어 있다. 기능적으로, DJ-1는 그의 시스테인 잔기의 자가-산화에 의해 산화 스트레스에 대한 소거(scavenging) 활성을 갖는다. 매우 보존된 Cys106 잔기는 그의 산화에 필수적이다. DJ-1은 질산화 스트레스(nitrosative stress, NS) 하에서 lys130인 것으로 거동한다. DJ-1은 산화 스트레스 유도 세포 사멸에 대한 보호에 관여한다.

비록, DJ-1이 주로 파킨슨병에서의 그의 신경보호 기능으로 알려져 있지만, DJ-1는 처음 NIH3T3 세포에서 H-ras와 함께 형질전환 활성을 갖는 발암 유전자로 확인되었다. 최근 연구에서는 DJ-1이 악성 종양의 종양형성과 매우 밀접하게 관련되어 있는 것으로 보고되고 있다. DJ-1의 발현 수준은 유방암, 췌장암, 폐암 및 비-소 세포성 폐암을 포함하는 다양한 암에서 증가된다. 이는 또한 DJ-1이 세포 증식 및 생존 메커니즘, 대표적으로 PI3K/Akt/mTOR 경로에 관여한다는 것을 나타낸다. DJ-1은 스트레스 유도 아포프토시스로부터 세포를 보호하는 AKT 인산화를 촉진시킨다. DJ-1은 PTEN, 종양 억제 유전자의 기능을 억제하여 PI3K 생존 경로를 조절한다. DJ-1는 PI3K/Akt/mTOR 경로에 의해 촉진된 HIF1 전사 활성을 양성 조절한다. 저산소 조건 하에서, DJ-1은 HIF1 유도에 의한 저산소 스트레스에 대한 내성을 증가시킨다. DJ-1은 또한 저산소 동안 대사 센서 AMPK의 활성을 조절한다. 또 다른 측면에서, DJ-1은 또한 p53-의존성 경로를 통해 세포 주기 어레스트(arrest) 메커니즘을 조절한다. p53의 손실은 DJ-1의 높은 발현과 상관관계에 있으며, DJ-1은 산화 스트레스에 대한 p53-매개 세포 반응에 관여한다. DJ-1은 아포프토시스를 억제하고, 세포분열 및 혈관 신생을 차단함으로써 종양형성을 일으키는 서바이빈 발현(survivin expression)을 유도하는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 DJ-1이 Notch1 신호전달 경로를 활성화시킴으로써 유방암에 관여한다는 것을 규명하였다. 나아가 본 발명자들은 DJ-1이 RBP-JK와 Notch1 전사 복합체의 형성을 촉진시키는 반면 Fbw7, Notch1 E3 ligase 및 Pin1과 상호작용하여 Fbw7 자가-유비퀴틴화를 야기함으로써 Notch1 단백질의 안정성을 향상시킬 수 있음을 규명하였다. 따라서, 본 발명자들은 유방암의 치료 또는 예방에서의 DJ-1 억제제의 용도를 제공하고자 한다.

1. DJ -1이 유방암 세포에서 Notch1 신호전달경로를 촉진시킴을 규명

본 발명자들은 우선 인간 유방암 세포주 MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 및 SK-BR-3에서 DJ-1, Notch1 및 그의 타겟 유전자 Hes1 및 Hes5의 단백질 수준을 평가하였다. 그 결과, 유방암 세포주 MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 및 SK-BR-3에서는 정상 유방 세포주 MCF-10A에 비해, DJ-1, Notch1 및 그의 타겟 유전자 Hes1 및 Hes5의 발현 수준이 상향 조절(upregulated)됨을 확인하였다 (도 1A). 또한, DJ-1 및 Notch1이 유방암에 관여하는지를 알아보기 위하여, MCF-7 세포의 생존력이 DJ-1 또는 Notch1 발현 억제에 의해 조절되는지 여부를 실험하였다. 그 결과, gamma-secretase inhibitor로 알려진 DAPT로 MCF-7 세포를 처리한 경우, 세포 생존력이 억제됨을 확인하였다 (도 1B). 놀랍게도, DAPT에 의한 세포 생존력 억제는 특이적shRNA를 이용하여 DJ-1이 제거된 MCF-7 세포에서 더욱 효과적으로 나타났다.

본 발명자들은 DJ-1이 Notch1 신호전달 경로를 조절하여 세포 생존력에 영향을 미치는지 여부를 알아보기 위하여, DJ-1 발현 수준에 따른 Notch1 타겟 유전자의 전사 활성을 분석하였다. 루시퍼라아제 리포터 유전자로서 Hes1-Luc, Hes5-Luc 및 인공 4xCSL-Luc를 이용하여 HEK293 세포에서 루시퍼라아제 리포터 검정법을 수행한 결과, DJ-1의 투여량이 증가함에 따라 Notch1 전사 활성이 촉진됨을 확인하였다 (도 2A-C).

본 발명자들은 또한 Notch1의 전사 활성의 상향 조절에서 DJ-1의 역할을 알아보기 위하여, Notch1-매개 유전자 활성이 DJ-1의 부존재시 바뀌는지 여부를 실험하였다. Notch1-의존성 유전자의 전사 유도를 대조 shRNA와 DJ-1 shRNA를 안정적으로 발현하는 MCF-7 세포로부터 단리한 전체 RNA를 이용하여 실시간 정량 PCR (Q-PCR)로 측정한 결과, 내인성 DJ-1의 넉다운이 Hes1 및 Hes5의 mRNA 수준을 하향 조절함을 확인하였다. 놀랍게도, shDJ-1의 Notch1 타겟 유전자 발현 억제 효과는 Hes 패밀리 유전자에 국한되지 않고, Hes6, Hey1, Hey2, p21, p27 및 c-Myc와 같은 다른 Notch1 타겟 유전자의 mRNA 수준도 DJ-1 넉다운에 의해 감소됨을 확인하였다 (도 3). 이로써, DJ-1의 과발현이 Notch1-매개 유전자의 활성을 촉진하여 종양 세포의 세포 성장을 야기시킨다는 것이 입증되었다.

2. DJ -1이 Notch1 - IC 및 RBP - Jk 와 상호작용하여 Notch1 전사 복합체 형성에 관여함을 규명

본 발명자들은 DJ-1에 의한 Notch1 신호전달 경로 메커니즘을 알아보기 위하여 니켈 아가로스 비드에 고정된 정제 His-DJ-1 단백질을 이용하여 in vitro 결합 검정법을 수행하였다. 그 결과, DJ-1이 직접 Notch1에 결합함이 확인되었다 (도 4). 핵에서 Notch1-IC는 DNA에 리크루팅(recruit)되는 RBP-Jk와 상호작용하여 타겟 유전자 발현을 조절한다. RBP-Jk는 리크루팅 단백질 복합체에 의존하여 전사 억제자 또는 활성자로 작용할 수 있다. 이에 본 발명자들은 DJ-1이 Notch1 전사 활성을 유도하는 것과 마찬가지로, DJ-1과 RBP-Jk 복합체 사이의 상호관계를 분석하였다. 그 결과, DJ-1은 그의 c-말단 도메인을 통해 RBP-Jk와 상호작용하였으며 (도 5A-C), 또한 DJ-1은 Notch1 및 RBP-Jk와 동시에 상호작용함으로써 3중 복합체(ternary complex)를 형성함이 확인되었다 (도 6A). 실제로, 상기 3중 복합체는 MDA-MB-231 유방암 세포주에서도 검출되었다 (도 6B).

본 발명자들은 Notch1 전사 복합체에서의 DJ-1의 조절 기능을 알아보기 위하여, 유방암 세포주 MCF-7에서 DJ-1의 유무에 따른 내인성 면역침강 검정법을 수행하였다. 그 결과, DJ-1의 제거는 Notch1 및 RBP-Jk 사이의 상호작용을 감소시켰으나 (도 7A), Notch1 전사 복합체의 억제 인자인 SMRT는 RBP-Jk에 더 강하게 결합됨을 확인하였다 (도 7B). 이로써, DJ-1이 상호작용을 통해 Notch1 전사 복합체 형성에 관여한다는 것이 입증되었다.

3. DJ -1이 Fbw7 E3 리가아제를 통해 Notch1 - IC 단백질의 안정성을 유지시킴을 규명

본 발명자들은 특정 shRNA를 이용한 DJ-1 넉다운이 Notch1 단백질 수준을 점진적으로 감소시키므로 (도 8A), 시클로헥시미드(cyclohexamide; CHX) 추적을 통해 Notch1 단백질의 반감기를 확인하였다. 그 결과, shRNA 대조군에 비해 DJ-1 shRN을 이용한 경우 Notch1 단백질의 반감기가 짧아졌으나 (도 8B), Notch1의 mRNA 수준은 DJ-1 넉다운에 의해 조절되지 않음이 확인되었다 (도 8C). 따라서,본 발명자들은 DJ-1이 Notch1 단백질의 안정성에 직접 관여한다는 것을 예상하였다. Notch1-IC는 F-box 단백질 Fbw7/Sel-10/hCdc4/Ago에 의한 ubiquitin-proteasome system으로 분해된다. 이에 본 발명자들은 Fbw7이 DJ-1에 의한 Notch1-IC의 하향 조절의 매개 인자로서 작용하는지 알아보기 위하여, DJ-1이 Fbw7-매개 Notch1 분해에 영향을 미치는지 여부를 실험하였다. 면역침강 검정법 수행 결과, DJ-1이 Notch1과 Fbw7 사이의 상호작용을 현저히 억제함이 확인되었다 (도 9A). DJ-1 shRNA로 형질전환된 HEK293 세포에서 Notch1-IC와 Fbw7 사이의 내인성 결합은 대조군인 shRNA로 형질전환된 세포보다 더 많음이 확인되었다 (도 9B). 이로써, DJ-1이 정상 세포에서 Notch1-IC와 Fbw7의 상호작용을 억제하여, Notch1-IC 타겟 유전자의 트랜스활성을 양성 조절할 수 있음이 입증되었다.

4. DJ -1이 Pin1 과 함께 Fbw7 의 유비퀴틴화를 촉진시킴을 규명

Fbw7은 Notch1을 포함하는 발암유전자(oncogene)의 분해를 촉진함으로써 세포 경로의 조절에 관여하는 종양 억제 인자로 알려져 있다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 Fbw7 단백질 수준이 DJ-1과 역 상관관계에 있음을 발견하였다. Fbw7 단백질 수준은 DJ-1 과발현에 의해 감소된 반면, DJ-1의 넉다운은 대조군에 비해 Fbw7 단백질 수준을 증가시켰다. 이를 바탕으로 본 발명자들은 DJ-1이 Fbw7을 직접 조절한다는 가정 하에, 이를 확인하기 위하여 in vitro 결합 검정법 및 면역침강 검정법을 수행하였다. in vitro 결합 검정법의 결과, His-DJ-1과 Fbw7 사이의 상호작용이 비드 복합체에 감지되었으며 (도 10A), 면역침강 검정법의 결과, Myc-Fbw7과 Flag-DJ-1를 코딩하는 벡터로 형질전환된 HEK293 세포에서도 상기 상호작용이 확인되었다 (도 10B). 또한, 상기 DJ-1과 Fbw7 사이의 내인성 결합이 확인되었다 (도 10C). 그 다음, 본 발명자들은 DJ-1이 Fbw7 단백질 수준을 조절하며, Fbw7의 반감기를 단축시키는지 여부를 알아보았다. 놀랍게도, HEK293 세포에서 DJ-1 발현 증가는 Fbw7의 불안정성을 야기한 반면 DJ-1 발현차단은 Fbw7의 안정성을 증가시킴이 확인되었다 (도 10D). 내인성 Fbw7 단백질의 반감기는 약 4시간이었으나, DJ-1에 특이적shRNA를 도입한 경우 약 8 시간 까지 증가되었다 (도 10E). 이로써,DJ-1이 Fbw7와 물리적으로 상호작용하여 Fbw7 단백질의 안정성을 조절한다는 것이 입증되었다.

Pin1은 인산화-의존적 방식으로 Fbw7와 상호작용하여 Fbw7의 자가-유비퀴틴화 및 Fbw7의 다이머 형성 교란에 의한 단백질 분해를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 DJ-1에 의한 Fbw7의 조절이 Pin1에 의해 매개되는지 여부를 형질전환된 HEK293 세포에서 실험하였다. 유의적으로, shPin1에 의한 Pin1의 결손은 Fbw7 수준에 미치는 DJ-1의 효과를 무력화시켰다 (도 11A). 놀랍게도, HEK293 세포에서 Pin1 shRNA의 유도는 DJ-1 발현을 불안정화시켰다. 실제, Pin1 발현 유도는 Fbw7의 수준을 점진적으로 감소시키는 반면 DJ-1 단백질 수준은 증가시켰다 (도 11B). 또한, 본 발명자들은 DJ-1 넉다운이 Pin1-유도 Fbw7 불안정화에 영향을 미치는지 여부를 실험하였다. Pin1이 대조군 HEK293 세포에서 Fbw7 단백질 수준은 감소시켰으나 DJ-1 결핍상황에서는 감소시키지 않음으로써, Pin1에 의한 Fbw7 불안정화 역시 DJ-1 발현에 의존적인 것임이 확인되었다 (도 12A). 게다가 DJ-1은 Fbw7과 Pin1 간의 상호작용은 촉진시키지만 (도 12B), Fbw7의 자가-유비퀴틴화를 방지하는다이머 형성을 방해함으로써 (도 12C), DJ-1과 Pin1이 다각적으로 Fbw7의 단백질 안정성을 조절한다는 것이 확인되었다. 이를 바탕으로 본 발명자들은 Fbw7의 자가-유비퀴틴화에 DJ-1이 관여하는지 여부를 알아보기 위하여 Flag-Fbw7를 코딩하는 벡터로 HEK293 세포를 형질전환하고, His-DJ-1 또는 DJ-1 shRNA를 갖는 HA-유비퀴틴으로 유비퀴틴화 검정법을 수행하였다. 면역블롯팅 분석 결과 DJ-1 넉다운은 Fbw7의 유비퀴틴화를 억제하는 반면, DJ-1 과발현은 Fbw7의 유비퀴틴화를 촉진하는 것이 확인되었다 (도 13A). Pin1 매개의 중요성을 확인하기 위하여, Pin1 야생형 및 T205A 돌연변이, Pin1-결합 결핍 돌연변이로 실험을 반복한 결과, Fbw7 T205A 돌연변이가 Fbw7의 DJ-1 유도 유비퀴틴화를 억제함이 확인되었다 (도 13B). Fbw7 유비퀴틴화는 DJ-1과 Pin1 모두를 과발현하는 세포에서 대폭 증가하였다 (도 13C). 이로써, DJ-1이 Fbw7의 자가 유비퀴틴화를 촉진함으로써 Fbw7-매개성 Notch1 분해를 방지한다는 것이 입증되었다.

5. DJ -1이 Fbw7 의존적 방법으로 유방암에서 종양형성을 촉진시킴을 규명

본 발명자들은 DJ-1 유도성 종양형성이 Fbw7에 의해 매개되는지 여부를 알아보기 위하여, shRNA 벡터를 이용하여 DJ-1과 Fbw7의 고갈 상태가 유지되는 MCF-7 세포를 제조하였다. DJ-1 shRNA 발현 세포는 대조군 shRNA 세포에 비해 세포 증식율이 감소되었으나, Fbw7 shRNA와 DJ-1 shRNA를 동시 발현하는 세포는 세포 증식율이 회복되는 결과를 나타내었다 (도 14). 또한, 본 발명자들은 창상치유 검정법을 통해 세포 이동 활성을 알아보았다. 도 15A를 참고하면, DJ-1의 고갈은 세포이동능력을 현저하게 저하시키지만, Fbw7 고갈에 의해 세포이동능력이 회복됨이 확인되었다. 또한, 본 발명자들은 transwell 이동 검정법 (도 15B)과 마트리겔 세포침습 검정법 (도 15C)을 통해서도 마찬가지의 결과를 확인하였다. DJ-1의 넉다운은 소프트 아가에서 병소와 콜로니의 수를 감소시켰으나, DJ-1과 Fbw7 모두의 넉다운은 콜로니 형성능을 회복시킴이 확인되었다 (도 16A-B).

본 발명자들은 DJ-1의 생물학적 기능을 연구하고 마우스 이식 모델을 확립하기 위하여, DJ-1 shRNA와 Fbw7 shRNA를 안정적으로 발현하는 MCF-7 종양세포를 누드 마우스에 피하주사하고 몇 주에 걸쳐 종양 성장을 평가하였다 (도 17). in vitro 성장 곡선과 마찬가지로,내인성 DJ-1이 제거된 유방암 이식 모델에서 종양 세포의 성장이 억제되었으나 이런 억제 효과는 Fbw7 붕괴에 의해 무효화됨이 확인되었다.

본 발명자들은 마지막으로 상기 실험 데이터의 임상적 관련성을 확인하기 위하여, 인간 유방암환자 조직에서 DJ-1, Notch1 및 Fbw7의 발현 수준을 알아보았다 (도 18). 총 43개의 인간 종양 조직 시료를 면역블로팅하여 정상 유방 조직과 비교분석하였다. 정상 유방조직에 비해 DJ-1은 41/43 (95%)개의 시료에서 과발현되었으며, Notch1은 31/43 (72%)개의 시료에서 촉진되었다. 반면, Fbw7 수준은 36/43 (84%) 개의 시료에서 정상조직이 종양조직보다 높게 나왔다. 따라서, DJ-1은 Notch1과 상관관계를 나타내지만 Fbw7과는 역 상관관계가 있음이 확인되었다 (도 19). 이로써, DJ-1이 Fbw7 매개 경로를 통해 이동 및 코로니 형성 활성을 조절하여 유방암의 성장을 유의적으로 촉진시킴이 입증되었다.

일 구현예에 따르면, DJ-1 유전자의 발현 억제제인 DJ-1 유전자에 특이적인 siRNA, shRNA 또는 안티센스 핵산을 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이 제공된다.

본 발명에 따른 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 DJ-1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 DJ-1 유전자의 발현 억제제는 Notch1, 또는 Hes1 및 Hes5를 포함하는 Notch1 타겟 유전자의 발현 수준을 하향 조절하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 DJ-1 유전자의 발현 억제제는 Notch1과 RBP-Jk의 상호작용을 하향 조절하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 DJ-1 유전자의 발현 억제제는 Notch1과 Fbw7의 상호작용을 상향 조절하는 것을 특징으로 한다.

다른 구현예에 따르면, DJ-1 단백질의 활성 억제제인 DJ-1 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이 제공된다.

본 발명에 따른 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 DJ-1 단백질의 활성 억제제는 Notch1, 또는 Hes1 및 Hes5를 포함하는 Notch1 타겟 단백질의 활성을 하향 조절하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 DJ-1 단백질의 활성 억제제는 Notch1과 RBP-Jk의 상호작용을 하향 조절하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 DJ-1 단백질의 활성 억제제는 Notch1과 Fbw7의 상호작용을 상향 조절하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 구현예에 따르면,

(a) 발현 세포주에 피검 물질을 처리하는 단계;

(b) 상기 세포주의 DJ-1 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및

(c) 상기 DJ-1 단백질의 발현 또는 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 유방암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.

본 발명에 따른 유방암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 DJ-1 단백질의 발현은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법 (RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯팅(Western Blotting) 또는 유세포 분석법 (FACS)으로 측정되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 유방암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 DJ-1 단백질의 활성은 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 또는 단백질 칩으로 측정되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 DJ-1 억제제는 DJ-1에 의한 Notch1 신호전달 경로 활성화를 차단시킴으로써 유방암을 억제하는 우수한 효과를 가지고 있으므로, 유방암의 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1(A)는 MCF-10A 정상 유방 세포주, 및 MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 및 SK-BR-3를 포함하는 유방암 세포주에서의 DJ-1, Notch1 및 그의 타겟 유전자에 대한 웨스턴 블롯팅 검출 결과를 나타낸다. β-actin이 로딩 대조군으로 사용되었다. 도 1(B)는 모 MCF-7 세포 또는 DJ-1이 안정적으로 넉다운된 MCF-7 유도 세포로부터 제조된 추출물을 이용한 트리판 블루 제외 검정법 결과를 나타낸다.
도 2(A-C)는 Notch1-IC, DJ-1, 4xCSL, Hes1 또는 Hes5-Luc, β-galactosidase용 발현 벡터로 형질감염된 HEK293 세포의 루시퍼라아제 활성을 나타낸다.
도 3은 shDJ-1을 안정적으로 발현하는 MCF-7 세포 및 대조군 MCF-7 세포에서 Hes1, Hes5, Hes6, Hey1, Hey2, p21, p27 및 c-Myc를 포함하는 Notch1 타겟 유전자를 검출하는 프라이머를 이용한 실시간 q-PCR 결과를 나타낸다.
도 4는 고정된 His-DJ-1과 HEK293 세포의 pull-down 검정법 결과를 나타낸다.
도 5(A)는 고정된 His-DJ-1과 HEK293 세포의 pull-down 검정법 결과를 나타낸다. 도 5(B)는 형질감염된 HEK293 세포의 면역침강 검정법 결과를 나타낸다. 도 5(C)는 DJ-1 넉다운 HEK293 세포 및 대조군에서 anti-DJ-1 면역침강물의 웨스턴 블롯팅 결과를 나타낸다.
도 6(A)는 발현 벡터로 형질감염된 HEK293 세포에서의 면역침강 검정법 결과를 나타낸다. 도 6(B)는 MDA-MB-231 유방암 세포주에서 내인성 단백질 수준의 면역침강 검정법을 나타낸다.
도 7(A-B)는 MCF-7 유방암 세포주에서 DJ-1의 존재 및 부존재시 비교한 면역침강 검정법 결과를 나타낸다.
도 8(A)는 DJ-1 발현에 따른 Notch1-IC 단백질 안정성에 대한 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 나타낸다. 도 8(B)는 시간에 대한 시클로헥시미드(CHX) 100 μM로 처리한 HEK293 세포에서 Notch1-IC 단백질 반감기에 대한 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 나타낸다. β-actin이 로딩 대조군으로 사용되었다. 도 8(C)는 각각 형질감염된HEK293 세포에서 Notch1의 mRNA 발현에 대한 실시간 q-PCR 분석 결과를 나타낸다.
도 9(A)는 표시된 발현 벡터로 형질감염된 HEK293 세포에서의 면역침강 검정법 결과를 나타낸다. 도 9(B)는 HEK293 세포에서 DJ-1의 존부에 따른 내인성 단백질 수준에 대한 면역침강 검정법 결과를 나타낸다.
도 10(A-C)는 표시한 구조물로 형질감염된 HEK293 세포 추출물을 이용한 면역침강 검정법 결과를 나타낸다. 도 10(D)는 Flag-DJ-1 또는 shDJ-1으로 형질감염된 HEK293 세포에서 Notch1-IC 단백질 안정성에 대한 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 나타낸다. 도 10(E)는 DJ-1 고갈 및 대조군 HEK293 세포에서 표시된 시간 동안 시클로헥시미드(CHX) 처리 이후의 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 나타낸다.
도 11(A-B)는 표시된 구조물로 형질감염된 HEK293 세포에 대한 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 나타낸다.
도 12(A)는 표시된 구조물로 형질감염된 HEK293 세포에 대한 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 나타낸다. 도 12(B-C)는 표시된 단백질을 발현하는 HEK293 세포에서 특정 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 나타낸다.
도 13(A-C)는 6시간 동안 5 μM MG132를 첨가한 이후에 표시된 구조물을 발현하는 HEK293 세포의 유비퀴틴화 검정법 결과를 나타낸다.
도 14는DJ-1 및 Fbw7의 shRNA를 안정적으로 발현하는 MDA-MB-231 SQ 세포를 위한 Balb/c-nude 마우스에서 종양의 무게를 측정한 결과이다.
도 15(A)는 DJ-1 및 Fbw7 특정 shRNA로 형질감염된 MDA-MB-231 세포에 대한 창상-치유 검정법 결과를 나타낸다. 도 15(B)는 shDJ-1 및 shFbw7을 안정적으로 발현하는 MCF7 세포의 트랜스웰 이동성 검정법 결과를 나타낸다. 도 15(C)는 shDJ-1 및 shFbw7을 안정적으로 발현하는 MCF7 세포를 이용한 Matrigel 침습 검정법 결과를 나타낸다.
도 16(A)는 shDJ-1 및 shFbw7를 안정적으로 발현하는 MCF7 세포를 이용한 콜로니 형성 및 소프트 아가 검정법 결과를 나타낸다. 도 16(B)는 shDJ-1 및 shFbw7를 발현하는 MCF7 세포에서 콜로니 형성 검정법 결과를 나타낸다.
도 17은 DJ-1 및 Fbw7의 shRNA를 발현하는 MDA-MB-231 SQ 세포를 위한 Balb/c-nude 마우스에서 이종이식 종양형성 검정법 결과를 나타낸다.
도 18은 인간 유방암 조직 시료에서 anti-DJ-1, anti-Notch1 및 anti-Fbw7 항체에 대한 면역블롯팅 분석 결과를 나타낸다.
도 19는 paired t-test를 이용하여 계산된 표준 검사물과 비교한 42개의 인간 유방암 조직에서의 DJ-1, Notch1 및 Fbw7의 발현 수준에 대한 비율을 통계적으로 분석한 결과를 나타낸다.

I. 일반적인 기술

다르게 표시되지 않는 한, 본 발명의 방법 및 기술들은 일반적으로 업계에 잘 알려져 있는 통상적인 방법에 따라, 그리고 다르게 표시되지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 인용 및 논의되는 다양한 일반적이면서도 구체적인 참고문헌들에 기술되어 있는 바와 같이 수행된다.

II. 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물

본 발명은 DJ-1 유전자의 발현 억제제 또는 DJ-1 단백질의 활성 억제제를 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "DJ-1"은 "PARK7"으로도 불리며, 파킨슨병의 열성 상염색체 (autosomal recessive gene)로도 알려져 있다. DJ-1은 Thi/Pfp1 수퍼패밀리에 속하는 호모다이머(homodimer)이며, 인간에서 E. coli까지 매우 잘 보존되어 있으며, 세포질, 핵 및 미토콘드리아에 분포한다. DJ-1 단백질은 항산화 활성, 섀퍼론-유사 성질 및 전사 조절 등의 다양한 기능을 수행한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "DJ-1 유전자의 발현 억제제"는 DJ-1의 유전자 수준의 발현을 억제하는 물질로서, 바람직하게는 DJ-1 유전자에 특이적으로 결합하는 siRNA, shRNA 또는 안티센스 핵산을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "siRNA"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법 또는 유전자 치료 방법으로 제공될 수 있다. 상기 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의해 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출한 구조와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 또한 siRNA는 표적 유전자의 발현 억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들면, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들면, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA 분자 또는 인공의 RNA 분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단 구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중 사슬 RNA 일반의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스텝 루프형 구조일 수도 있다. 본 발명에 따른 siRNA는 그 자체로 폴리뉴클레오타이드 페어링을 갖는 완전한 형태, 즉 시험관 내에서 siRNA를 직접 합성한 두 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 생체 내에 투여된 후 이러한 형태를 갖도록 하나의 단일쇄 올리고뉴클레오타이드 단편과 이의 역방향(reverse) 상보물이 스페이서에 의해 분리된 단일쇄 폴리뉴클레오타이드로부터 유도될 수 있는 형태, 예를 들면 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유도된 siRNA 발현 카세트를 형질전환 또는 감염(infection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태일 수 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "shRNA" 는 siRNA의 고가의 생합성 비용, 낮은 세포 형질감염 효율로 인한 RNA 간섭 효과의 단시간 유지 등의 단점을 극복하기 위한 것으로 RNA 중합효소 Ⅲ의 프로모터로부터 아데노 바이러스, 렌티 바이러스 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 이를 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있으며, 이러한 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소(Dicer or Rnase Ⅲ)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 목적 유전자의 사일런싱을 유도함이 널리 알려져 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "안티센스 핵산"은 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는DNA 또는RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발명의 안티센스 서열은 DJ-1 mRNA에 상보적이고 DJ-1 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, DJ-1 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다. 안티센스 RNA의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나, 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 RNA를 합성하는 한 예는 RNA 폴리머라제 Ⅰ를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 사용된 용어 "DJ-1 단백질의 활성억제제"는 DJ-1의 단백질 수준의 활성을 억제하는 물질로서, 바람직하게는 DJ-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 화합물이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "항체"는 단일클론항체 및 이에 대한 카이메릭 항체, 인간화 항체 및 인간 항체를 모두 포함하는 것이고, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있다. 상기 항체는 DJ-1을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다. 또한, DJ-1의 활성을 억제하는 화합물로는 암세포의 저산소 상태에서 DJ-1의 활성을 저해하는 역할을 수행하는 것이라면 제한없이 사용할 수 있으며, DJ-1에 직접 작용하여 활성의 약화시키거나 기질 또는 리간드와의 결합을 방해하여 활성을 저해하는 화합물을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유방암"은 유방에 일차적으로 발생하는 악성종양인 원발성 유방암 또는 다른 장기에 발생한 암이 유방에 전이되어 생기는 전이성 유방암을 포함한다. 예를 들면, 유관 상피내암종(ductal carcinoma in situ: DCIS), 침윤성 유관암(invasive ductal carcinoma: IDC), 수질암종, 침윤성소엽암종(invasive lobular carcinoma: ILC), 관형성암종, 점액암종, 염증성 유방암(inflammatory breast cancer: IBC), 유방상피내암종(lobular carcinoma in situ: LCIS), 남성 유방암, 파젯병 또는 유방의 엽상종양을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 "치료"는 유방암의 하나 이상의 증상의 개선을 유발하거나, 증상의 진행을 저지하는 것을 의미한다. 예를 들면, 유방암의 치료와 관련하여 바람직하게는 종양의 성장 속도를 감소시키거나, 종양 크기를 감소시키거나, 전이의 수를 감소시키거나, 종양 진행 시간을 증가시키거나, 환자의 생존 기간을 늘리는 것을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "예방"은 동물의 병리학적 세포(예를 들면 과다증식성 또는 신생물 세포)의 발생의 감소를 의미한다. 예방은 완전할 수 있으며, 이는 예를 들면 개체 내에 병리학적 세포가 전혀 없는 경우이다. 예방은 또한 부분적일 수도 있으며, 이 경우에는 개체 내의 병리학적 세포의 발생이 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 사용하지 않은 경우에 발생하는 것보다 적은 상태를 의미한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 더욱 포함할 수 있다. 예를 들면, 경구 투여시에는 결합체, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들면, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물의 유효 투여량의 범위는 성별, 체표면적, 질환의 종류 및 중증도, 연령, 약물에 대한 민감도, 투여경로 및 배출비율, 투여시간, 치료기간, 표적세포, 발현 수준 등 기타 의학 분야에 잘 알려진 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

III. 유방암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법

본 발명은

(a) 발현 세포주에 피검 물질을 처리하는 단계;

(c) 상기 DJ-1 단백질의 발현 또는 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 유방암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.

상기 (b) 단계에서 DJ-1 단백질의 발현은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 또는 유세포 분석법(FACS)으로 측정될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 (b) 단계에서 DJ-1 단백질의 활성은 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 또는 단백질 칩으로 측정될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의실시예는 발명의 이해를 쉽게하기 위해 제공되는 것일뿐 발명의 보호범위가 이 이하의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1: 세포 배양 및 형질감염

인간 태아 신장세포 293 (HEK293), MCF7, MDA-MB-468 및 SK-BR-3를 10% 소태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 배양하였다. MDA-MB-231는 10% 소태아 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI에서 배양하였다. MCF10A 세포는 5% 말 혈청(horse serum), 100ng/ml 콜레라 독소, 20ng/ml EGF, 500ng/ml 하이드로코티손 및 10㎍/ml 인슐린이 보충된 (1:1) DMEM:F12 배지(Hyclone)에서 배양하였다. 플라스미드 DNA 형질감염을 위해,상기 세포들을 50-60%의 조밀도로 배양하고, 하룻밤 성장시킨 후, calcium phosphate method 또는 Lipofectamine-PLUS 시약을 이용하여 플라스미드 DNA의 존재 하에 발현 벡터에 형질전환하였다.

실시예 2: shRNA 형질감염

Notch1에 대한 short hairpin RNA용 pSUPER-유래 발현 벡터는 종래 알려진 방법에 따라 제작하였Mo et al., 2013, Notch1 modulates oxidative stress induced cell death through suppression of apoptosis signal-regulating kinase 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110; 6865-6870).

하기의 shRNA 표적 서열을 사용하였다:

Notch1: 5'-AAGTGTCTGAGGCCAGCAAGA-3'

Fbw7: 5'-CCTTCTCTGGAGAGAGAAA-3'

Pin1: 5'-GCCATTTGAAGACGCCTCG-3'

서열의 특이도(specificity)는 BLAST 검색으로 측정하고, 임의의 공지된 포유동물 GENEBANK 서열과도 매칭되지 않는 스크램블(scrambled) shRNA를 대조군으로이용하여 확인하였다:

Scrambled shRNA: 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'

DJ-1 표적 shRNA 서열은 하기와 같다:

DJ-1: 5'-UGGAGACGGUCAUCCCUGUdTdT-3'(upper strand) 및 3'-dTdTACCUCUGCCAGUAGGGACA-5'(lower strand).

대조군과 DJ-1 shRNA를 제조사의 지시에 따라 Lipofectamine-PLUS(Invitrogen)를 이용하여 세포에 형질감염시켰다.

실시예 3: 항체

블로팅된 단백질을 anti-Myc(9E10), anti-HA(12CA5), anti-Flag M2(Sigma Chemical Co.), anti-DJ-1(abcam), anti-Hes1(R&D Systems), anti-Hes5(EMD Millipore), anti-Notch1, anti-RBP-Jk, anti-SMRT, anti-Fbw7, anti-Pin1 및 anti-β-actin (Santa Cruz Biotechnology)로 프로브 처리하고, anti-mouse HRP(horseradish peroxidase) 컨쥬게이트된 2차 항체(Amersham Biosciences, Inc.)와 배양하였다.

실시예 4: RNA 추출 및 RT - PCR 및 Q- PCR

Trizol시약(Invitrogen, Camarillo, CA, USA)을 이용하여 총 RNA를 추출한 후, RNase-free DNase I(Takara, Toyko, Japan)로 37℃에서 30분 동안 하기의 조건: RNA 20 mg, Tris-HCl 40mM, MgCl₂ 8mM, DTT 5mM, RNase-inhibitor 0.4 U/mL(Promega, Madison, WI, USA), 및 DNase I 10 유닛하에 전체 부피를 50 mL로 하여 처리하였다. 그 다음, 페놀/클로로포름 추출법을 이용하여 RNA를 침전시켰다. 전체 RNA(2 mg)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 M-MLV 역전사 효소(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, Promega)로cDNA를 합성하고, 시료를 RNase-free DNase 처리하여 오염된 DNA를 제거하였다. PCR 분석시 대조군으로서GAPDH를 이용하였다. 사용한 프라이머는 다음과 같다:

프라이머 세트
Hes1	(Forward) 5'- GGT GCT GAT AAC AGC GGA AT -3'
	(Reverse) 5'- TGA GCA AGT GCT GAG GGT TT -3'
Hes5	(Forward) 5'- GGT GCC TCC ACT ATG ATC CTT A -3'
	(Reverse) 5'- TCC ACG TGA CTG AGA GTT CAA T -3'
Hes6	(Forward) 5'- CGA AGT GCT GGA GCT GAC GGT G -3'
	(Reverse) 5'- CAC TGG ATG TAG CCG GCA GCG AA -3'
Hey1	(Forward) 5'- GCA TCT CAA CAA CTA CGC TTC CCA -3'
	(Reverse) 5'- TGT GCG GGT GAT GTC CGA A -3'
Hey2	(Forward) 5'- GGG TAA AGG CTA CTT TGA CGC AC -3'
	(Reverse) 5'- CGG AAT CCT ATG CTC ATG AA -3'
p21	(Forward) 5'- GGC CCA GTG GAC AGC GAG CA -3'
	(Reverse) 5'- CCC AGG CGA AGT CAC CCT CC -3'
p27	(Forward) 5'- GGT TAG CGG AGC AAT GCG-3'
	(Reverse) 5'- TCC ACA GAA CCG GCA TTT G -3'
c-Myc	(Forward) 5'- CTG TGG AAA AGA GGC AGG CT -3'
	(Reverse) 5'- GCT GTG AGG AGG TTT GCT GTG -3

실시예 5: 면역블롯팅 검정법

48 시간의 형질감염 이후에, 배양된 HEK293 세포를 수집한 후, 4℃에서 30분 동안 RIPA [50mM의 Tris-HCl(pH 7.5), 150mMNaCl, 1% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1mM의 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride), 1mM DTT 및 류펩틴과 아프로티닌 각각 2 ㎍]로 용해시켰다. 파쇄된 세포를 4℃에서 12,000 g로 20분 동안 원심분리하고, 생성된 가용 분획물을 Laemmli 버퍼에서 변성시키고 SDS-PAGE를 수행했다. 겔 전기영동 이후에, 분리된 단백질을 electroblotting을 이용하여 PVDF(polyvinylidenedifluoride) 막으로 옮겼다. 상기 막은 0.1% Tween 20과5% 탈지유가 함유된 TBS(Tris-buffered saline) 용액(pH 7)으로 차단하였다. ECL(enhanced chemiluminescence)을 사용하여 블롯팅을 진행하였다.

실시예 6: 루시퍼라아제 리포터 검정법

세포를 1M K₂HPO₄, 18.3% 1M KH₂PO₄, 1.7% PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride), 1mM DTT를 함유하는 화학발광 용해 버퍼(chemiluminescent lysis buffer)를 이용하여 용해시키고, 루시퍼라아제 검정 키트(Promega)를 이용하여 루시퍼라아제 활성을 분석하였다. 형질감염된 세포 내의 루시퍼라아제 리포터 단백질의 활성은 동일 시료에서 측정된, β-갈락토시다아제 활성을 기준으로 하여 측정하였다.

실시예 7: 면역침전 검정법( Co - immunoprecipitation Assay )

세포를 30분 동안 4℃에서 RIPA 버퍼를 이용하여 용해시켰다. 12,000 g로 20분 동안 원심분리한 후, 상층액을 적절한 항체와 결합된 단백질 A-agarose 비드에 면역침강 시켰다. 생성된 면역침강물을 pH 7.4의 PBS(phosphate-buffered solution)로 3회 세척하고 Laemmli 시료버퍼를 면역 침강 펠렛에 첨가하였다. 상기 펠렛을 95℃에서 5분 동안 가열한 후 SDS-PAGE 분석을 시행했다. 웨스턴 블롯팅은 해당 항체를 이용해 수행하였다.

실시예 8: In vitro 결합 검정법

재조합 His-DJ-1 단백질을 Escherichia coli균주 BL21에서 발현시켰다. 그 다음, 니켈 비드(Sigma)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 DJ-1 단백질을 정제하였다. 동량의 His 또는 His-DJ-1 융합 단백질을 HEK293 세포의 파쇄물과 배양하고, 교반 하에 4℃에서 발현 벡터로 3 시간 동안 형질감염하였다. 배양 이후에, 상기비드를 냉각된 PBS로 3회 세척하고, 20μl의 Laemmli시료 버퍼로 가열하였다. 침전물을 SDS-PAGE로 분리하고, pull-down 단백질을 특정 항체로 면역블롯팅하여 검출하였다.

실시예 9: 단백질 안정성 검사

세포를 50-60%의 조밀도로 시딩(seeding)하고 밤새 배양하였다. 상기 세포를 배지에 첨가시 0, 0.5, 1, 2, 4 또는 6시간 동안 0.1 mM 시클로헥시미드로 처리하여 새로운 단백질과의 합성을 차단하고, 각 시간별로 수집하여 RIPA 또는 Laemmli 버퍼를 이용하여 용해하였다. 내인성 Notch1의 단백질 수준은 1:3000으로 희석된 항- Notch1 항체를 이용해 면역블롯팅법으로 측정하였다.

실시예 10: 면역형광염색

4% 파라포름알데히드를 녹인 PBS로 세포를 고정시키고, 0.1% Triton-X 100을 녹인 PBS를 침투시켰다. 상기 세포를 1% BSA가 첨가된 PBS로 차단하고, 1:100으로 희석한 1차 항체에 반응시켰다. 1차 항체와 반응시킨 이후에, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 1:100으로 희석한 Alexa Fluor®488(Invitrogen) 또는 Alexa Fluor®532 (Invitrogen)이 결합된 항-마우스 2차 항체를 첨가하고, DNA는 TO-PRO®-3 Iodide를 사용하여 염색하였다. 염색된 세포를 공초점 현미경(confocal microscope, Leica TCS SPE)을 이용하여 검출하고, 각 이미지는 동일한 세포 수준으로 단일의 Z 구역에서 관찰했다. 최종 이미지는 LAS AF 소프트웨어(Leica)가 구비된 공초점 현미경을 이용하여 분석하였다.

실시예 11: 창상치유 검정법

세포를 12-웰 플레이트에서 성장시키고, 단층을 P200 마이크로피펫 팁을 이용하여 창상을 입혔다. 측정 이후, 10% FBS가 보충된 DMEM을 즉시 교체하였다. 창상-치유 이미지를 현미경 시스템을 이용하여 6시간 간격으로 촬영하였다. 세포의 이동 속도는 Image J 프로그램을 이용하여 각 시점에서 스케치된 영역의 거리를 측정하여 계산하였다.

실시예 12: 콜로니형성 및 소프트 아가 검정법

콜로니 형성 검정법은 6웰 배양 플레이트에서 하부 아가와 상부 아가로스로 구성된 세포-성장 매트릭스에 500개의 세포를 시딩(seeding)하여 수행하였다. 하부층(1.5 ml)은 DMEM 배지, 10% FBS 및 0.5 % 아가를 함유하고, 상부층(1.5 ml)은 DMEM 배지, 10% FBS, 0.35% 아가로스 및 세포 부유물(1x10³)을 함유하였다. 세포는 3일 마다 공급하였으며, 2-3주 후에 콜로니를 측정하였다.

실시예 13: 세포 이동 및 침습 검정법

트랜스웰 챔버(8 ㎛ 폴리카바네이트 막, Corning)를 이용하여 트랜스웰 이동 검정법을 수행하였다. 마트리겔 세포침습 검정법은 BD BioCoat Growth Factor로 수행하였다. 전형적으로, 2.5x10⁴~ 2.5x10⁵ 개의 세포를 10 ㎍/ml 피브로넥틴으로 코팅된 챔버에 시딩하였다. 37℃, 5% CO₂ 하에서 16시간 동안 배양한 후 필터의 상면에 부착되어 있는 세포들을 면봉으로 제거하였다. 세포들을 3.7% 포름알데히드 또는 100% 메탄올로 고정한 후, DAPI로 염색하여 세포의 개수를 측정하였다. 이동한 세포의 수는 무작위적으로 선택한 복수의 현미경 시야내에서 염색된 세포의 수로 측정하였다.

실시예 14: 마우스 이식 및 전이 모델

암컷 C57BL/6 마우스(Orient Bio, Korea)를 국립암센터의 동물 실험실의 무균 시설에서 관리하였다. shCon(대조군), DJ-1 및 Fbs7용 특정 shRNA를 안정적으로 발현하는 MDA-MB-231-SQ 유방암 세포주(100 ㎕ PBS 내의 1 x 10⁶ cells/ml)를 6주령 암컷 C57BL/6 마우스(그룹 당 5마리)의 측부 꼬리 정맥에 주사하였다. 4주 이후에, 상기 마우스들은 마취제 과량 투여법을 통해 안락사시켰다. 종양 크기는 캘리퍼스로 측정하고, 종량의 부피는 V = (L x W²) x 0.5 공식에 따라 계산하였L: 종양의 길이, W: 종양의 폭).

통계처리

데이터는 3번의 반복된 실험의 평균±표준편차로 표시하였고, 통계적 유의성은 two-tailed paired Student's t-test로 측정하였다. **P < 0.01을 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> A PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING OR PREVENTING BREAST CANCER COMPRISING DJ-1 INHIBITOR AS AN ACTIVE INGREDIENT <130> DPP-2014-0247 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DJ-1 <400> 1 Met Ala Ser Lys Arg Ala Leu Val Ile Leu Ala Lys Gly Ala Glu Glu 1 5 10 15 Met Glu Thr Val Ile Pro Val Asp Val Met Arg Arg Ala Gly Ile Lys 20 25 30 Val Thr Val Ala Gly Leu Ala Gly Lys Asp Pro Val Gln Cys Ser Arg 35 40 45 Asp Val Val Ile Cys Pro Asp Ala Ser Leu Glu Asp Ala Lys Lys Glu 50 55 60 Gly Pro Tyr Asp Val Val Val Leu Pro Gly Gly Asn Leu Gly Ala Gln 65 70 75 80 Asn Leu Ser Glu Ser Ala Ala Val Lys Glu Ile Leu Lys Glu Gln Glu 85 90 95 Asn Arg Lys Gly Leu Ile Ala Ala Ile Cys Ala Gly Pro Thr Ala Leu 100 105 110 Leu Ala His Glu Ile Gly Phe Gly Ser Lys Val Thr Thr His Pro Leu 115 120 125 Ala Lys Asp Lys Met Met Asn Gly Gly His Tyr Thr Tyr Ser Glu Asn 130 135 140 Arg Val Glu Lys Asp Gly Leu Ile Leu Thr Ser Arg Gly Pro Gly Thr 145 150 155 160 Ser Phe Glu Phe Ala Leu Ala Ile Val Glu Ala Leu Asn Gly Lys Glu 165 170 175 Val Ala Ala Gln Val Lys Ala Pro Leu Val Leu Lys Asp 180 185

Claims

DJ-1 유전자의 발현 억제제인 DJ-1 유전자에 특이적인 siRNA, shRNA 또는 안티센스 핵산을 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DJ-1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DJ-1 유전자의 발현 억제제는 Notch1, 또는 Hes1 및 Hes5를 포함하는 Notch1 타겟 유전자의 발현 수준을 하향 조절하는 것인, 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DJ-1 유전자의 발현 억제제는 Notch1과 RBP-Jk의 상호작용을 하향 조절하는 것인, 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DJ-1 유전자의 발현 억제제는 Notch1과 Fbw7의 상호작용을 상향 조절하는 것인, 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
DJ-1 단백질의 활성 억제제인 DJ-1 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 DJ-1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 DJ-1 단백질의 활성 억제제는 Notch1, 또는 Hes1 및 Hes5를 포함하는 Notch1 타겟 단백질의 활성을 하향 조절하는 것인, 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 DJ-1 단백질의 활성 억제제는 Notch1과 RBP-Jk의 상호작용을 하향 조절하는 것인, 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 DJ-1 단백질의 활성 억제제는 Notch1과 Fbw7의 상호작용을 상향 조절하는 것인, 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
(a) 발현 세포주에 피검 물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 세포주의 DJ-1 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 DJ-1 단백질의 발현 또는 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 유방암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
제11항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 DJ-1 단백질의 발현은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법 (RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 또는 유세포 분석법 (FACS)으로 측정되는 것인, 유방암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
제11항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 DJ-1 단백질의 활성은 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 또는 단백질 칩으로 측정되는 것인, 유방암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.