KR20160110762A - Synthesis of carbon nanoparticle-polymer composite for delivery of bioactive materials and the uses thereof - Google Patents

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Abstract

The present invention provides a method for quickly synthesizing a product at a high yield as compared to a conventional method with respect to a high-temperature synthesis reaction using hydrothermal reaction and/or microwave based on carbon nanoparticles which are surface-coated with PEG or PEI. In the case of a synthesis method through a microwave, according to a change in a molecular weight of PEI used in reaction, the gene delivery finality to synthesized particles is differently determined. In the case of carbon nanoparticles coated with PEI, various types of fluorescent dyes can be bonded through surface modification and thus can be applied to a multiple imaging system. In the case of carbon nanoparticles coated with PEG, as different types of pharmaceutical active ingredients and genes or the like can be stacked by using an aromatic structure inside a particle, it is suitable for a chemotherapy formulation with respect to a tumor and/or a disease cell. In addition, the heating ability by light-sensitivity when a near-infrared laser is radiated has an apoptosis ability specific to a tumor and/or a disease cell near a particle. Therefore, according to the present invention, the complex therapy (the chemotherapy and/or light-sensitive heat generating therapy) based on carbon nanoparticles which are surface-coated with PEG or PEI is excellent, a surface of the particle is modified according to a purpose to be bonded with a target ligand, and it can be used as target therapeutics for selectively targeting a target cell or a target tissue. In addition, the gene delivery efficiency for a cell and/or a tissue based on high biocompatibility of the particle is excellent to be used in basic research fields, cosmetic fields, medicine and medicine and pharmacy fields, and the like.

Description

생리활성물질 전달을 위한 탄소나노입자-고분자 복합체의 합성과 이의 용도{SYNTHESIS OF CARBON NANOPARTICLE-POLYMER COMPOSITE FOR DELIVERY OF BIOACTIVE MATERIALS AND THE USES THEREOF}TECHNICAL FIELD The present invention relates to a carbon nanoparticle-polymer composite for physiologically active substance delivery and to its use. BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a carbon nanoparticle-

본원은 탄소나노입자와 고분자로 이루어진 생체친화적 복합체의 합성과 이를 활용하는 미용, 약제학, 의학적 효능을 가지는 생리활성물질의 전달법 및 이의 용도에 관한 것이다.
The present invention relates to the synthesis of biocompatible complexes composed of carbon nanoparticles and polymers, and to a method of transferring physiologically active substances having cosmetic, pharmacological, medical effects, and uses thereof.

의약학 또는 미용 분야에서 약제학적 유효성분을 체내로 전달하기 위하여 다양한 형태의 전달체 또는 전달입자가 개발되고 있다. 약제학적 유효성분의 효과적 전달을 위해 금, 은 등의 금속나노입자를 이용한 전달법, 고분자 등의 유기물 나노입자 혹은 실리카 등의 무기물 나노입자를 활용한 전달법 등이 개발되어 활용되고 있으나, 부작용을 최소화하고 약제학적 유효성분을 효과적으로 전달하기 위해서는 여전히 전달체의 생체적합성, 전달 시스템의 효율성 등의 개선의 여지가 남아있다. In the field of medicine or cosmetics, various types of carriers or delivery particles have been developed to deliver pharmaceutical active ingredients into the body. In order to effectively transfer the active pharmaceutical ingredient, there have been developed and utilized a delivery method using metal nanoparticles such as gold and silver, an organic nanoparticle such as polymer or a nanoparticle using inorganic nanoparticles, etc. However, There is still room for improvement in the biocompatibility of the carrier and the efficiency of the delivery system in order to minimize and effectively deliver the pharmaceutical active ingredient.

최근의 연구에서, 약제학적 유효성분을 환부로 전달해주는 단순한 형태의 전달체로서의 개념에서 벗어나 전달약물의 효능을 향진시키기 위하여 나노입자의 물리, 화학적 성질을 기반으로 한 광학적 특성을 융합한 형태의 복합치료술이 소개되고 있다. 그러나 상기 방법을 임상 및 실생활에 적용하기 위해서는 활용할 나노입자의 흡광 파장이 근적외선 영역에 일치하여야 하고, 유효약물을 효과적으로 적재할 수 있도록 부피대비 표면적 비율을 개선시켜야 한다. 이를 위한 입자 속이 비어있는 구조를 가지는 나노입자 및/또는 나노막대 등을 이용한 대량의 약제학적 유효성분의 적재 및 광감응치료 방법에 대한 연구가 진행되고 있으나, 여전히 효과적인 복합치료 상승효과를 얻기 위해서는 보다 세밀한 나노입자의 합성, 추가적인 화학물질의 처리, 그리고 광감응효과를 보이는 물질과 나노입자의 복합체 형성의 필요성 등의 한계점이 있다.In a recent study, a combination of optical properties based on the physicochemical properties of nanoparticles to enhance the efficacy of delivery drugs, away from the concept of a simple form of delivery of a pharmaceutical active ingredient to the affected part Has been introduced. However, in order to apply the above method to clinical and real life applications, the absorption wavelength of the nanoparticles to be used should be in the near infrared region, and the ratio of volume to surface area should be improved so as to effectively load the effective drug. For this purpose, studies have been carried out on the loading and photo-sensitive treatment of large quantities of pharmacologically active ingredients using nanoparticles and / or nanorods having a hollow structure, but in order to obtain an effective synergistic effect, There is a limitation in the synthesis of fine nanoparticles, the treatment of additional chemicals, and the necessity of complexing nanoparticles with photosensitizing substances.

미용 및 의약학 분야에서, 심미효과 및 치료를 목적으로 피부조직 및 생체 내로 전달하고자 하는 생리활성물질은 전달방법에 따라 크게 두가지로 구분할 수 있다. 첫째로, 유효효과를 지닌 기능성 단백질, 약제학적 조성물, 그리고 천연물 등의 고분자 물질을 전달체에 적재하여 전달하는 방법이다. 대표적으로 경피투여 방법으로써 미용학적 유효성분을 피부도포를 기반으로 진피층 침투방법이 사용되고 있으며, 즉각적인 윤기와 촉촉함, 영양의 부가적인 공급을 목적으로 에틸렌글리콜 등의 무독성/점성 액성을 보이는 물질과의 에멀전화를 통해 피부 잔여시간 향상 효과 등이 점진적으로 추가되어 왔다. 현재 가장 보편적으로 사용되는 하이드로겔은 전체의 90% 이상을 수분으로 충진시킬 수 있는 거대한 물주머니 형태의 구조를 가지며 적당한 수분과 유분이 균형을 맞추어야 하는 피부이용이나 피부트러블 해결을 위한 수분 공급에 적합한 소재 중 하나이다. 이러한 겔이나 에멀전은 유효성분을 넣은 후, 추가 도입되는 겔의 특성에 따라 산성이나 효소반응에 의해 유효성분이 방출되도록 유도함으로써 유효성분을 진피로 전달하는 전달체로 사용되고 있다. 그러나 상기의 에멀전, 하이드로겔, 농축미용 진피침투법 등은 장기 보관 시 구조가 파괴되거나 유기물의 물성이 변질되는 근본적인 문제점이 잔재하고 있으며, 배합이나 미용 및 또는 약제학적 유효성분의 적재 등에서 세밀한 조절 없이는 균일한 성분적재가 이루어지지 않는다는 단점이 있다. 또한, 기타 다른 형태의 전달체들도 유효성분 스스로가 피부장벽 침투를 단순히 기대하는 형태이거나, 피부상에 유효성분의 잔존시간을 늘려주는 형태로 개선의 여지가 있다. 둘째로, 질병 세포 내에서 비정상적으로 많이 발현되는 단백질의 발현을 억제하거나, 세포 내에서 순기능을 담당하는 단백질의 발현을 증가시켜 주기 위한 핵산 및 리보핵산 등을 전달체에 적재하여 전달하는 방법이다. 기존의 방법은 siRNA의 세포 내 전달을 통한 특정 단백질의 발현을 억제하거나 DNA의 세포 내 전달을 통해 단백질의 발현을 유도해주는 것인데, 효과적인 핵산 및 리보핵산의 세포 내 전달을 위하여 금, 은을 비롯한 자성을 가지는 금속류를 이용한 무기나노입자들을 이용한 전달법이나, 양전하성을 띄는 고분자 혹은 리포좀을 등의 유기물을 이용한 전달법이 목적에 따라 이용되어 왔다. 그러나 상기 방법들은 비교적 높은 효율에도 불구하고 전달입자의 생체독성 문제와 시스템 개발에 소요되는 시간 대비 낮은 경제성 등의 단점들이 존재한다. 따라서, 진피 또는 표적 조직으로 유효성분의 효율적인 전달이 가능하고, 인체에 안전하며, 전달체 내부에 유효성분을 적재함으로써 장기간 보존이 가능한 형태의 전달체 개발이 절실한 실정이다.
In the field of cosmetology and medicine, physiologically active substances to be delivered into the skin tissue and in vivo for the purpose of aesthetic effect and treatment can be roughly classified into two types according to the delivery method. First, it is a method of delivering a functional substance having an effective effect, a pharmaceutical composition, and a polymer material such as a natural substance on a carrier. Typically, as a transdermal administration method, a dermal layer permeation method based on skin application is used as a cosmetic active ingredient, and an emulsion of a non-toxic / viscous liquid such as ethylene glycol, etc. for the purpose of immediate lubrication, moisturizing, And the effect of improving the remaining time of skin through anger has been gradually added. Currently most commonly used hydrogels have a huge water-bag structure that can fill more than 90% of the whole water with moisture. They are suitable for moisture use for skin use or skin troubles that should be balanced with proper moisture and oil. It is one of the materials. Such a gel or emulsion is used as a carrier for transferring the active ingredient to the dermis by introducing the active ingredient and then inducing the effective ingredient to be released by acid or enzyme reaction depending on the characteristics of the gel to be introduced. However, the above-mentioned emulsion, hydrogel, thickening and dermal penetration method have a fundamental problem that the structure is destroyed or the physical properties of the organic material are altered during long-term storage, and without any fine control in mixing, cosmetic and pharmaceutical active ingredients There is a disadvantage in that uniform component loading can not be achieved. In addition, other types of carriers may be of the form that the active ingredient itself expects to penetrate the skin barrier, or it may be improved to increase the remaining time of the active ingredient on the skin. Second, it is a method of delivering a nucleic acid and a ribonucleic acid, etc., to the delivery vehicle for inhibiting the expression of an abnormally high protein in a disease cell, or for increasing the expression of a protein responsible for the innate function in the cell. The conventional method is to inhibit expression of a specific protein through intracellular delivery of siRNA or to induce expression of a protein through intracellular delivery of DNA. For effective delivery of nucleic acid and ribonucleic acid into cells, Transporting method using inorganic nanoparticles using metals having a positive charge, or transporting using an organic material such as a polymer or liposome having positive charge has been used according to purposes. However, despite the relatively high efficiency, the above methods have disadvantages such as the bio-toxicity of the delivery particle and the low economic efficiency compared to the time required for system development. Therefore, there is an urgent need to develop a delivery system capable of efficiently delivering an effective ingredient to a dermis or a target tissue, being safe for a human body, and storing an effective ingredient in the carrier for a long period of time.

본 발명인은 상술한 종래의 미용 및/또는 약제학적 유효성분 전달용 전달체의 미용, 약제학적, 의학적 문제점들을 해결하기 위하여 노력하던 중, 탄소물질을 응용하여 입자 내/외부에 유효성분의 담지가 가능하고 광감응시스템을 통한 복합치료술의 구현이 가능한 탄소나노입자를 개발하였는 바, 탁월한 약물의 담지 및 방출효과, 암세포 사멸효과, 그리고 미용학적 심미효과를 얻을 수 있다는 것을 발명함으로서 본 발명을 완성하였다.The present inventors have made efforts to solve the cosmetic, pharmaceutical and medical problems of the conventional cosmetic and / or pharmaceutical active ingredient delivery vehicle, and have been able to apply active substances to the inside and outside of the particle by applying a carbon material The inventors of the present invention completed the present invention by inventing carbon nanoparticles capable of realizing complex therapeutic treatment through a photoreceptor system and achieving superior drug loading and emptying effect, cancer cell killing effect, and cosmetic aesthetic effect.

본 발명의 신규한 탄소나노입자는 효과적으로 약물을 담지하기 위하여 내부에 최적형태의 그래핀 표면 sp2 구조형태를 유도하고, 외부에 암세포 또는 암줄기세포의 표적치료를 가능하게 하는 특정 리간드, 항체, 화합물 등을 코팅할 수 있도록 외부표면을 개질하였으며, 또한 간단한 절차를 통하여 나노입자의 합성을 달성할 수 있는 방법을 개선하여 적용하였다. 이러한 신규 탄소나노입자를 함유하는 조성물에 천연물렙仙갬유전자 등 생리활성물질들을 담지하여 적용할 경우, 약물담지 효율과 광감응치료 효과가 모두 우수하였으며 특정 세포 및 조직으로의 약물표적전달 효율과 표적치료 효과가 탁월하였다.The novel carbon nanoparticles of the present invention can be used to induce an optimal form of graphene surface sp 2 structure in the inside to effectively carry a drug and to provide a specific ligand, an antibody, a compound And the method of improving nanoparticle synthesis by a simple procedure has been improved and applied. When a physiologically active substance such as a natural reprecipitated gene is loaded on a composition containing such a novel carbon nanoparticle, the drug loading efficiency and the photo-sensitization effect are both excellent, and the drug target delivery efficiency to specific cells and tissues and the target The treatment effect was excellent.

아울러 탄소나노입자가 발광하는 자체형광을 활용하여 미용 및 의약학적 치료의 전단계에서 진단을 목적으로 하는 바이오이미징 기법을 효과적으로 가능케 하였다.
In addition, by using the self fluorescence emitted by the carbon nanoparticles, the bioimaging technique for the purpose of diagnosis in the previous stage of cosmetic and medicinal treatment was effectively made possible.

본 발명의 목적은 기존에 사용되던 단순한 형태의 약물전달시스템의 한계에서 벗어나 '유효성분 전달 + 광감응성 치료'의 복합치료술을 가능케 하는 신규의 탄소나노입자 전달체의 합성방법과 전달체의 표적세포 및 표적조직으로의 특이적 전달을 위한 기존의 방법보다 간편하고 탁월한 나노물질 표면개질 방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
It is an object of the present invention to provide a novel method for synthesizing a carbon nanoparticle delivery system capable of performing a combined treatment of 'effective ingredient delivery + photosensitivity treatment' beyond the limitation of a conventional simple drug delivery system, And to provide a simpler and more superior nanomaterial surface modification method than conventional methods for specific delivery to tissues. Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following examples and claims.

본 발명의 내용을 통하여, PEG 또는 PEI로 표면 코팅되어있는 탄소나노입자를 기반으로 수열반응 및/또는 마이크로웨이브를 이용한 고온 합성반응에 대하여, 종래의 방법에 비해 빠르고 높은 수율의 생성물을 합성할 수 있다. 마이크로웨이브를 통한 합성방법의 경우, 반응에 사용한 PEI의 분자량의 변화에 따라 합성된 입자로의 유전자 전달 목적성이 다르게 결정되었다. PEI를 코팅한 탄소나노입자의 경우, 표면개질을 통하여 다양한 종류의 형광염료의 접합이 가능하였고, 이는 다중이미징 시스템으로 적용 가능하였다. PEG을 코팅한 탄소나노입자의 경우, 입자 내부의 방향족 구조를 응용하여 각기 다른 종류의 약학적 유효성분 및 유전자 등의 적재가 가능하기 때문에 종양 및/또는 질병세포에 대한 화학요법 치료의 제형으로 적합하였으며, 근적외선 레이저 조사시 광감응에 의한 발열능은 입자 주변의 종양 및/또는 질병세포에 대해 특이적인 세포사멸능을 보여주었다. 따라서, 본 발명에서 제시하는 PEG 또는 PEI로 표면 코팅한 탄소나노입자를 기반으로 하는 복합치료(화학요법 및/또는 광감응 발열치료)에 대한 우수성을 나타내었으며, 목적에 따라 상기 입자의 표면을 개질하여 표적리간드의 접합이 가능하고, 표적세포 또는 표적조직을 선택적으로 타겟팅하는 표적치료술로의 활용이 가능하다. 또한, 상기 입자의 높은 생체적합성에 기반한 세포 및/또는 조직으로의 우수한 유전자 전달효율은 기초연구, 미용, 그리고 의약학 등의 분야에서 활용이 가능하다.
Through the content of the present invention, it is possible to synthesize a product with a faster and higher yield compared to the conventional method for hydrothermal reaction and / or microwave-assisted high-temperature synthesis reaction based on carbon nanoparticles surface-coated with PEG or PEI have. In the case of the microwave synthesis method, the purpose of gene transfer to the synthesized particles was determined differently depending on the molecular weight of the PEI used in the reaction. In the case of PEI coated carbon nanoparticles, various types of fluorescent dyes could be bonded through surface modification, which could be applied to multiple imaging systems. In the case of PEG-coated carbon nanoparticles, it is possible to apply different kinds of pharmaceutical active ingredients and genes by applying the aromatic structure inside the particles, and thus it is suitable as a form of chemotherapy treatment for tumor and / or disease cells , And the heat-generating ability by photo-sensitization at the time of near-infrared laser irradiation showed specific cytotoxicity against tumor and / or diseased cells around the particle. Therefore, the present invention is superior to the complex treatment (chemotherapy and / or photo-sensitization fever treatment) based on the carbon nanoparticles surface-coated with PEG or PEI proposed in the present invention. It is possible to conjugate the target ligand and use it as a target treatment for selectively targeting a target cell or a target tissue. In addition, excellent gene transfer efficiency to cells and / or tissues based on high biocompatibility of the particles can be utilized in fields such as basic research, beauty, and medicine.

도 1은 본원의 일 구현예에 따른 (도 1a)표적지향적 유효성분의 전달을 위한 표면 개질된 폴리에틸렌글라이콜(PEG; Polyethylene Glycol)을 코팅한 탄소나노입자의 합성과정과 (도 1b)폴리에틸렌이민(PEI; Polyethylene Imine)으로 표면 개질한 탄소나노입자의 합성과정에 대한 모식도이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 합성방법으로 형성된 PEG를 코팅한 탄소나노입자에 대한 (도 2a)자외선-가시광선 분광분석법을 통한 흡광 곡선 비교 분석, (도 2b)적외선 분석법을 통한 입자 작용기분석, (도 2c)투과전자현미경을 이용한 입자의 구조 분석, (도 2d)원자간력현미경을 이용한 입자의 구조분석이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 합성방법으로 형성된 PEI로 표면개질한 탄소나노입자에 대한 (도 3a)자외선-가시광선 분광분석법을 통한 흡광 곡선 비교 분석, (도 3b)적외선 분석법을 통한 입자 작용기분석, (도 3c)투과전자현미경을 이용한 입자의 구조 분석, (도 3d)원자간력현미경을 이용한 입자의 구조분석이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른 나노입자의 PBS 완충용액에서 수행한 안정도 테스트 분석 결과이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 탄소나노입자로의 광감응성 활성물질 적재분석 결과이다. (도 5a)자외선-가시광선 흡광분석법을 통한 적재분석, (도 5b)자외선-가시광선 형광분석법을 통한 적재분석.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른 탄소나노입자로의 유전자 적재분석 결과이다. (도 6a)젤전기영동 분석을 통한 탄소나노입자로의 siRNA 적재분석, (도 6b)젤전기영동 분석을 통한 탄소나노입자로의 pDNA 적재분석, (도 6c)젤전기영동 분석을 통한 heparin polyanion 경쟁반응 분석, (도 6d)RNase 보호반응 분석.
도 7은 본원의 일 실시예에 따른 탄소나노입자들에 대한 세포독성 테스트 분석 결과이다. (도 7a)인간 자궁경부암 세포주인 HeLa에 대한 생체적합성 분석, (도 7b)녹색형광단백질(GFP)이 지속적으로 과발현되도록 유전자 조작한 enhanced-HeLa (eGFP-HeLa) 세포주에 대한 생체적합성 분석, (도 7c) 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 과다발현된 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231에 대한 생체적합성 분석.
도 8, 도 9는 본원의 일 실시예에 따른 PEG를 코팅한 나노입자에 대한 세포 내 선택적 도입에 따른 형광기반 바이오이미징 분석결과이다.
도 10은 본원의 일 실시예에 따른 PEI를 코팅한 탄소나노입자의 세포 내 도입에 따른 (도 10a)형광기반 바이오이미징, (도 10b)투과전자현미경 분석결과이다.
도 11은 본원의 일 실시예에 따른 표적리간드 접합 및 미접합된 탄소나노입자/광감응제 복합체에 대한 (도 11a 부터 도 11d)근적외선 레이저 조사에 따른 활성산소 발생에 의한 세포사멸 분석, (도 11e)시험관 수준에서의 활성산소 발생분석, (도 11f)다양한 농도에서의 근적외선 레이저 조사에 따른 세포사멸을 분석한 결과이다.
도 12는 탄소나노입자를 이용한 세포수준에서의 광감응효과 및 바이오이미징 결과를 바탕으로한 쥐동물실험 결과이다. (도 12a)형광이미징을 통한 탄소나노입자의 종양 표적지향적 특성분석, (도 12b)실시간 형광이미징을 통한 종양 표적지향적 탄소나노입자 분포도 분석, (도 12c)쥐 장기기관 해부를 통한 종양 표적지향적 탄소나노입자 분포도 분석.
도 13은 탄소나노입자를 이용한 세포수준에서의 광감응효과 및 바이오이미징 결과를 바탕으로한 쥐동물실험 결과이다. (도 13a, 도 13b)표적리간드 접합 및 미접합된 탄소나노입자와 광감응제 복합체에 대한 근적외선 레이저 조사에 유무에 따른 활성산소 발생에 의한 종양치료 분석.
도 14는 본원의 일 실시예에 따른 탄소나노입자를 유전자전달체로 활용하여 GFP가 발현된 인간 자궁경부암 세포주 HaLa에 대한 GFP 발현억제 분석결과이다. (도 14a)형광이미징을 통한 GFP 발현억제 분석, (도 14b, 도 14c)유세포분석을 통한 GFP 발현억제율 및 GFP 형광 정량분석.
도 15는 본원의 일 실시예에 따른 탄소나노입자를 유전자전달체로 활용하여 혈관 내피 성장 인자(Vescular Endothelial Growth Factor, VEGF)가 과다발현된 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231에 대한 VEGF 발현억제 유무를 분석한 PCR 결과이다.
도 16은 본원의 일 실시예에 따른 탄소나노입자를 유전자전달체로 활용하여 인간 자궁경부암 세포주 HeLa에 대한 pGFP 전달을 통해 세포내 GFP 발현 분석결과이다. (도 16a)형광이미징을 통한 GFP 발현 분석, (도 16b, 도 16c)유세포분석을 통한 GFP 발현율 및 GFP 형광 정량분석.1 illustrates a process for synthesizing carbon nanoparticles coated with surface-modified polyethylene glycol (PEG) for delivery of a target-oriented active ingredient according to an embodiment of the present invention (FIG. 1A) (PEI: Polyethylene Imine) according to the present invention.
FIG. 2 is a graph comparing the absorption curves of PEG-coated carbon nanoparticles formed by the synthesis method according to one embodiment of the present invention (FIG. 2A) with ultraviolet-visible light spectroscopy, FIG. 2B, (FIG. 2C), and the structure analysis using a transmission electron microscope (FIG. 2D).
FIG. 3 is a graph comparing the absorption curves of the carbon nanoparticles surface-modified with PEI formed by the synthesis method according to one embodiment of the present invention (FIG. 3a) by ultraviolet-visible spectroscopy, FIG. 3b (Fig. 3c), and the analysis of the structure of particles using an atomic force microscope (Fig. 3d).
Figure 4 shows the results of a stability test performed on a nanoparticle PBS buffer according to one embodiment of the present invention.
FIG. 5 shows the result of loading the photosensitizing active material onto the carbon nanoparticles according to one embodiment of the present invention. (Fig. 5a) Loading analysis by ultraviolet-visible light absorption spectrometry, (Fig. 5b) Loading analysis by ultraviolet-visible light fluorescence analysis.
FIG. 6 shows the results of analysis of gene loading into carbon nanoparticles according to one embodiment of the present invention. (Fig. 6a) Analysis of siRNA loading onto carbon nanoparticles by gel electrophoresis analysis (Fig. 6b) Analysis of pDNA loading onto carbon nanoparticles by gel electrophoresis analysis (Fig. 6c) Heparin polyanion Competitive assay, (Fig. 6d) RNase protection assay.
FIG. 7 shows the results of a cytotoxicity test for carbon nanoparticles according to one embodiment of the present invention. (Fig. 7a) Biocompatibility analysis for human cervical cancer cell line HeLa (Fig. 7b) Biocompatibility analysis for enhanced-HeLa (eGFP-HeLa) cell line genetically engineered to overexpress green fluorescent protein (GFP) Figure 7c) Biocompatibility analysis of human breast cancer cell line MDA-MB-231 overexpressing vascular endothelial growth factor (VEGF).
FIGS. 8 and 9 are fluorescence-based bioimaging results obtained by selectively introducing PEG-coated nanoparticles into cells according to an embodiment of the present invention.
FIG. 10 is a fluorescence-based bioimaging (FIG. 10b) transmission electron microscope analysis result of intracellular introduction of PEI-coated carbon nanoparticles (FIG. 10a) according to an embodiment of the present invention.
11 is a graph showing the results of analysis of apoptosis by active oxygen generation according to near infrared laser irradiation on the target ligand conjugated and non-conjugated carbon nanoparticle / photosensitizer complexes (Figs. 11a to 11d) according to one embodiment of the present invention 11e) analysis of active oxygen generation at the test tube level (Fig. 11f), and analysis of apoptosis by near-infrared laser irradiation at various concentrations.
FIG. 12 is a photograph showing the result of a rat animal experiment based on the photo-sensitization effect at the cell level using the carbon nanoparticles and the bio-imaging result. (Fig. 12a) Tumor target-oriented characterization of carbon nanoparticles through fluorescence imaging (Fig. 12b) Analysis of tumor target-oriented carbon nanoparticle distribution through real-time fluorescence imaging, (Fig. 12c) Tumor target- Analysis of distribution of nanoparticles.
Fig. 13 shows the results of the rat model based on the photo-sensitization effect at the cellular level using the carbon nanoparticles and the bioimaging result. (FIGS. 13A and 13B). Analysis of tumor treatment by the production of reactive oxygen species with or without the use of near-infrared laser irradiation for target ligand conjugation and unfused carbon nanoparticle and photosensitizer complex.
FIG. 14 is a graph showing the inhibition of GFP expression in the human cervical cancer cell line HaLa expressing GFP by using carbon nanoparticles according to an embodiment of the present invention as a gene carrier. (Fig. 14a) GFP expression inhibition assay by fluorescence imaging (Fig. 14b, Fig. 14c) GFP expression inhibition rate and GFP fluorescence quantitative analysis by flow cytometry.
15 is a graph showing the inhibition of VEGF expression on MDA-MB-231, a human breast cancer cell line, overexpressing VEGF using a carbon nanoparticle according to an embodiment of the present invention as a gene delivery vehicle This is the PCR result.
16 shows the results of intracellular GFP expression analysis of pGFP delivery to the human cervical cancer cell line HeLa using carbon nanoparticles according to one embodiment of the present invention as a gene delivery vehicle. (Fig. 16a) GFP expression analysis by fluorescence imaging (Fig. 16b, Fig. 16c) GFP expression rate and GFP fluorescence quantitation analysis by flow cytometry.

본원 명세서 전체에서, “생리활성 물질(bioactive materials)”은 투여된 후 수 여자(동물 대상)에게 물리적으로, 생리적으로, 정신적으로, 생화학적으로, 생물학적으로, 또는 다른 신체 기능에 양성적 또는 음성적인 방식으로 영향을 줄 수 있는 어떠한 약제라도 포함하는 것을 의미한다.Throughout this specification, the term " bioactive materials " refers to substances which, after administration, are physically, physiologically, psychologically, biochemically, biologically or otherwise positively or negatively Means any medicament that may affect the medicament in a manner that is effective.

예를 들어, "생리활성 물질"은 약물, 단백질, 펩티드, miRNA, siRNA, DNA, plasmid DNA, small molecules, 항체, 바이러스, 미생물, 체세포 핵, 세포소기관, 미토콘드리아, 효소, 보조영양제, 비타민, 천연물, 추출물, 다른 활성 약제를 포함할 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 생리활성 물질은 단백질, 펩티드, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 내인성리간드, 신경전달물질, 호르몬, 오타코이드(autacoid), 사이토카인(cytokine), 항바이러스제, 항암제, 항생제, 산소-강화제, 산소-함유제, 항전간제 및 항염증 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예를 들어, 상기 생리활성 물질은 칼시토닌, 사이클로스포린, 인슐린, 옥시토신, 타이로신, 엔케팔린, 타이로트로핀 분비호르몬, 난포 자극 호르몬, 황체형성 호르몬, 성장호르몬, 아라키도닉산, 혈소판활성화인자(PAF), 안지오텐신, 키닌, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 스롬복세인, 에이코사노이드, 바소프레신 및 바소프레신 유사체, 카탈라제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 인터류킨, 인터페론, TGF-beta, BMPs, 집락 자극 인자, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 저해제 및 멜라닌세포-자극호르몬으로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 생리활성 물질은 알츠하이머 길항제 또는 백신을 포함할 수 있다. 알츠하이머병을 치료하기 위한 생리활성 물질은 메만틴 염산염(memantine hydrochloride, Merz Pharmaceuticals의 Axura, 도네페질 염산염(donepezil hydrochloride, Eisai Co. Ltd.의 Aricept, 리바스티그민 주석산염 (rivastigmine tartrate, Novatis의 Exelon, 갈란타민 염산염(galantamine hydrochloride, Johnson & Johnson의 Reminyl, 또는 타크린 염산염(tacrine hydrochloride, Parke Davis의 Cognex을 포함할 수 있다. 생리활성 물질은 약제학적으로 유효량을 갖는 콘드로이틴 황산염, 히알루론산, 성장 인자 및 단백질로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.For example, a "physiologically active substance" is a substance, protein, peptide, miRNA, siRNA, DNA, plasmid DNA, small molecules, antibodies, viruses, microorganisms, somatic nuclei, cell organelles, mitochondria, enzymes, , Extracts, and other active agents, but are not limited thereto. The physiologically active substance may be a protein, a peptide, a nucleoside, a nucleotide, an endogenous ligand, a neurotransmitter, a hormone, an autacoid, a cytokine, an antiviral agent, an anticancer agent, Antiinflammatory agents, antiinflammatory agents and antiinflammatory drugs. For example, the physiologically active substance may be selected from the group consisting of calcitonin, cyclosporine, insulin, oxytocin, tyrosine, enkephalin, thyrotropin releasing hormone, follicle stimulating hormone, luteinizing hormone, growth hormone, arachidonic acid, Baxs, TGF-beta, BMPs, colony stimulating factor, tumor necrosis factor, tumor necrosis factor, angiogenesis factor, angiotensin, quinine, prostaglandin, leukotriene, srombocyte, eicosanoid, vasopressin and vasopressin analogue, catalase, superoxide dismutase, interleukin, interferon, An inhibitor and a melanin cell-stimulating hormone. The physiologically active substance may include an Alzheimer antagonist or a vaccine. The physiologically active substance for treating Alzheimer's disease is memantine hydrochloride (Merr Pharmaceuticals' Axura, donepezil hydrochloride, Aricept of Eisai Co. Ltd., rivastigmine tartrate, Exelon of Novatis, Galantamine hydrochloride, Reminyl of Johnson & Johnson, or tacrine hydrochloride, Cognex of Parke Davis. The physiologically active substance may be a pharmaceutically effective amount of chondroitin sulfate, hyaluronic acid, growth factors, ≪ / RTI > protein.

예를 들어, 상기 생리활성 물질은 인슐린 또는 인슐린 유사체를 포함한다. 인슐린 증감제, 인슐린 분비촉진제, GLP-1 유사체, GLP-2, GLP-2 유사체, 디펩티딜 펩티다제 4의 저해제(DPP-4 저해제), 엑세나티드(exenatide), 리라글루티드(liraglutide), 알비글루티드(albiglutide), 또는 타스포글루티드(taspoglutide), 알파-글루코시다제 저해제, 아밀린 유사체, 소디움-글루코스 코-트랜스포터 타입 2(SGLT2, sodium-glucose co-transporter type 2) 저해제, 벤플루오렉스(benfluorex), 및 톨레스타트(tolrestat)로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서, 인슐린-함유 나노입자는 미량의 아연 또는 칼슘을 포함하거나, 장용피 처리된다. 일 실시예에서, 생리활성 약제는 비-인슐린 엑세나티드, 비-인슐린 프람린티드(pramlintide), 인슐린, 인슐린 유사체, 또는 이들의 조합이다.For example, the physiologically active substance includes insulin or an insulin analogue. (DPP-4 inhibitor), exenatide, liraglutide, insulin secretagogue, insulin secretagogue, GLP-1 analog, GLP-2, GLP-2 analog, dipeptidyl peptidase 4 inhibitor , Albiglutide, or taspoglutide, an alpha-glucosidase inhibitor, an amylin analog, a sodium-glucose co-transporter type 2 inhibitor (SGLT2) , Benfluorex, and tolrestat. ≪ / RTI > In another embodiment, the insulin-containing nanoparticles contain trace amounts of zinc or calcium, or are entrapped. In one embodiment, the bioactive agent is a non-insulin exenatide, a non-insulin pramlintide, an insulin, an insulin analog, or a combination thereof.

예를 들어, 상기 생리활성 물질은 또한 옥시토신, 바소프레신, 성선자극호르몬방출호르몬, 갑상선자극호르몬방출호르몬, 갑상선자극호르몬, 부신피질자극 호르몬, 프롤락틴, 루리베린(luliberin), 황체형성 호르몬, 성선자극 호르몬, 여성 호르몬, 남성 호르몬, 황체형성 호르몬 분비 호르몬, 성장 호르몬, 성장 호르몬 분비 인자, 소마토스타틴, 글루카곤, 인터페론, 가스트린, 테트라가스티린, 펜타가스트린, 유로가스트로인, 세크레틴, 칼시토닌, 엔케팔린, 엔도르핀, 안지오텐신, 레닌, 브라디키닌, 바시트라신, 폴리믹신, 콜리스틴, 타이로시딘, 그라미시딘, 알데스테론, 하이드로콜티손, 콜티손, 에스트라디올, 에스트로겐, 프로게스테론, 테스토로테론, 타이록신(tyroxine), 및 이들의 합성 유사체, 변형체 및 약물학적 활성 단편, 단클론 항체 및 가용성 백신으로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 성장 호르몬(GH)은 인간 또는 다른 동물에서 성장 및 세포 재생산을 자극하는 펩티드 호르몬이다. 이것은 뇌하수체 전엽의 측면 날개부위 내에서 성장자극 세포에 의해 합성, 저장 및 분비되는 191-아미노산의 단일 사슬 폴리펩티드 호르몬이다. For example, the physiologically active substance may also be selected from the group consisting of oxytocin, vasopressin, gonadotropin releasing hormone, thyroid stimulating hormone releasing hormone, thyroid stimulating hormone, adrenocorticotropic hormone, prolactin, luliberin, luteinizing hormone, , Growth hormone, growth hormone secretion factor, somatostatin, glucagon, interferon, gastrin, tetragastrin, penta-ghastrin, eugustroin, secretin, calcitonin, enkephalin, endorphin, But are not limited to, angiotensin, renin, bradykinin, bacitracin, polymyxin, colistin, thyrosidine, gramicidin, aldestherone, hydrocollitone, coltithone, estradiol, estrogen, progesterone, testosterone, Tyrosine, and synthetic analogs, variants and pharmacologically active fragments thereof, monoclonal antibodies and soluble vaccines ≪ / RTI > Growth hormone (GH) is a peptide hormone that stimulates growth and cell reproduction in humans or other animals. It is a single-chain polypeptide hormone of 191-amino acid that is synthesized, stored and secreted by growth stimulating cells in the lateral wing region of the anterior pituitary gland.

예를 들어, 상기 생리활성 물질은 세포독성 약물, 항-바이러스 약물, 항-신생물 약물, 항-염증 약물, 항생제, 진통제 약물, 중추신경계(CNS,)에서 작용하는 약물, 양성자 펌프 억제제, 안지오텐신변환효소저해제, 안지오텐신수용체길항제, 칼슘길항제, 히스타민수용체길항제, 콜레스테롤 생합성저해제, 당뇨병치료제, 알츠하이머병치료제, 면역억제제, 합성항균제, 항종양제 또는 그들의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다. 활성 약물 부분은 퓨린과 같은 항-대사물질 마스커레이드(masquerade), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 메클로레타민(mechlorethamine), 사이클로포스파미드, 클로람부실(chlorambucil), 아이포스파미드(ifosfamide), 빈크리스틴(Vincristine), 빈블라스틴(Vinblastine), 비노렐빈(Vinorelbine), 빈데신(Vindesine), 포도필로톡신(podophyllotoxin), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel)을 포함할 수 있다.For example, the physiologically active substance may be a cytotoxic drug, an anti-viral drug, an anti-neoplastic drug, an anti-inflammatory drug, an antibiotic, an analgesic drug, a drug acting in the central nervous system (CNS), a proton pump inhibitor, A cholesterol biosynthesis inhibitor, a therapeutic agent for diabetes, an agent for treating Alzheimer's disease, an immunosuppressant, a synthetic antimicrobial agent, an anti-tumor agent, or any combination thereof. The active drug moiety may be an anti-metabolite, such as an anti-metabolite masquerade such as purine, cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, mechlorethamine, cyclophosphamide, chlorambucil chlorambucil, ifosfamide, vincristine, vinblastine, vinorelbine, vindesine, podophyllotoxin, etoposide, tenifoside, teniposide, docetaxel, paclitaxel, and the like.

본원 명세서 전체에서, "단백질"은 표적 특이적인 단백질뿐 아니라 면역글로불린, 당단백질, 항체, 폴리펩타이드, 효소, 펩타이드 등을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 대상 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드에는 헤모글로빈, 혈청 단백질, 예컨대 인자 VII, V?, 및 IX를 포함하는 혈액 인자; 면역글로불린, 사이토카인, 예컨대 인터류킨, 다시 말하면, IL-1 내지 IL-13, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 렉틴, 당 결합 단백질, 당단백질, SUMO 단백질, 바람직하게는 인터페론, 하기에 더욱 상세히 기재된 바와 같은 렉틴, 과립구 콜로니 자극 인자를 비롯한 콜로니 자극 인자, 혈소판 유래 성장 인자 및 포스포리파제(phospholipase) 활성화 단백질(PLAP)이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 일반적인 생물학적 또는 치료적 대상의 다른 단백질에는 인슐린, 신혈관생성유도인자, 예컨대 VEGF, 에리스로포이에틴(erythropoietin), 식물 단백질, 예컨대 렉틴(lectin) 및 리신(ricin), 종양 괴사 인자 및 관련 단백질, 성장 인자, 예를 들어, 형질전환 성장 인자, 예를 들어, TGF-alpha 또는 TGF-alpha 및 표피 성장 인자, 호르몬, 소마토메딘, 에리트로포이에틴, 색소성 호르몬, 시상하부 방출 인자, 항이뇨 호르몬, 프로락틴, 융모성 생식선 자극 호르몬, 난포 자극 호르몬, 갑상샘 자극 호르몬, 조직 플라스미노겐 활성화제 등이 포함된다.단백질 부분은 면역글로불린, 당단백질, 항체, 폴리펩타이드, 효소, 펩타이드, 인터페론(INF), 인터류킨, 호르몬, 소마토메딘(somatomedin), 에리트로포이에틴(erythropoietin), 색소성 호르몬(pigmentary hormone), 시상하부 방출 인자, 항이뇨 호르몬, 프로락틴(prolactin), 융모성 생식선 자극 호르몬, 여포-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬 또는 조직 플라스미노겐 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택된다. Throughout the specification, "protein" should be understood to include immunoglobulins, glycoproteins, antibodies, polypeptides, enzymes, peptides, and the like, as well as target specific proteins. The subject proteins, polypeptides and peptides include hemoglobin, blood proteins including serum proteins such as Factors VII, V, and IX; Interferon-beta, interferon-gamma, lectin, glycoprotein, glycoprotein, SUMO protein, preferably interferon, interferon-beta, interferon-gamma, But are not limited to, lectins as described in more detail in, for example, colony stimulating factors including granulocyte colony stimulating factors, platelet derived growth factors, and phospholipase activation protein (PLAP). Other proteins of general biological or therapeutic interest include insulin, neovascularization-inducing factors such as VEGF, erythropoietin, plant proteins such as lectin and ricin, tumor necrosis factor and related proteins, growth factors, For example, transgenic growth factors such as TGF-alpha or TGF-alpha and epidermal growth factor, hormone, somatomedin, erythropoietin, pigmented hormone, hypothalamus releasing factor, antidiuretic hormone, prolactin, Proteins, antibodies, polypeptides, enzymes, peptides, interferons (INF), interleukins (INF), interferons (INF) Hormone, somatomedin, erythropoietin, pigmentary hormone, hypothalamus releasing factor, It is selected from a hormone, or tissue plasminogen activator group consisting of -, PRL (prolactin), chorionic gonadotropin, follicle-stimulating hormone, thyroid.

단백질의 예들은 형광단백질, horseradish peroxidase (HRP), 카스파아제-3, 리파아제, 포토리아제 (photolyase), 수퍼옥시드 디스뮤타아제 (SOD), 보톨리눔 독소 (botulinium toxin), 겨자무 퍼옥시다아제 (HRP), 단순 헤르페스 바이러스 유래 티미딘 키나아제 (Thyamidine kinase from herpes simplex virus, HSV-TK), 카스파아제, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 우레이트 옥시다아제 (urate oxidate), 베타-글루코시다아제, 베타-헥소사미니다아제 (hexosaminidase), 마우스 (murine) 항-CD3 항체 등을 포함할 수 있다.Examples of proteins include but are not limited to fluorescent proteins, horseradish peroxidase (HRP), caspase-3, lipase, photolyase, superoxide dismutase (SOD), botulinium toxin, ), Herpes simplex virus (HSV-TK), caspase, VEGF, urate oxidase, beta-glucosidase, beta-hex Hexosaminidase, murine anti-CD3 antibody, and the like.

이하, 본원의 구현 예를 상세히 설명하였으나, 본원이 이에 제한되지 않을 수 있다.Hereinafter, embodiments of the present invention are described in detail, but the present invention is not limited thereto.

본원의 일 측면은, 평균 직경 2 nm 이상 20 nm 이하인 탄소나노입자, 및 상기 탄소나노입자의 내부 또는 외부 표면에 결합된, 단백질의 태그(tag)에 특이적으로 결합하는 물질 또는 리간드를 포함하는, 단백질 전달용 조성물을 제공할 수 있다. 또한 탄소나노입자의 내부 또는 외부에 결합 및 적재된 약제학적 유효물질 또는 올리고핵산을 포함하는, 약효성 화합물 및 올리고핵산 기반 건강 개선 및 치료학적 접근법을 제공할 수 있다. 더불어 기존 고분자 및 유기물질, 상용화되는 시약과의 비교를 통해, 추가적인 물리화학적 처리가 요구되는 표면 개질 및 내/외부 환경 개질적 측면에서 비침습적인 과정을 통하여 상기 목적에 해당하는 기능성의 범위를 대폭 확장시키는 개선된 기능성 탄소나노입자의 발명 및 이를 바탕으로 상기 언급된 단백질 태그에 특이적 결합하는 물질 또는 리간드 또는 약제학적 유효물질의 적재량 및 목표물에의 전달 및 도입 효율을 개선하는 내용을 포함한다.An aspect of the present invention relates to a carbon nanoparticle having an average diameter of 2 nm or more and 20 nm or less and a substance or ligand that specifically binds to a tag of a protein bound to the inner or outer surface of the carbon nanoparticle , A composition for protein delivery can be provided. In addition, it is possible to provide a health improvement and therapeutic approach based on a weakly bioactive compound and an oligonucleotide, which comprises a pharmaceutically active substance or an oligonucleotide bound and loaded inside or outside of carbon nanoparticles. In addition, by comparing existing polymers and organic materials with commercially available reagents, it is possible to increase the range of functionality corresponding to the above purpose through surface reforming requiring additional physicochemical treatment and non-invasive processes in terms of the internal / external environment The present invention also relates to an improved functional carbon nanoparticle to which the above-mentioned protein tag is specifically bound and to improve the transfer and introduction efficiency of the substance or ligand or the pharmaceutically active substance to the target.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질의 태그(tag)에 특이적으로 결합하는 물질 또는 리간드는 약제학적 유효성을 갖는 저분자량 화합물, 올리고핵산, 펩티드 또는 프로틴을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment herein, a substance or ligand that specifically binds to a tag of the protein may comprise a low molecular weight compound, oligonucleic acid, peptide or protein having pharmacological efficacy, but is not limited thereto .

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생리활성물질 전달용 조성물, 약제학적 저분자량 화합물, 올리고핵산, 펩티드 또는 프로틴은 상기 탄소나노입자 표면에 결합된 상기 물질 또는 리간드에 상기 태그(tag)가 결합됨으로써 상기 탄소나노입자 내부에 적재된 상기 단백질을 추가 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment of the present invention, the composition for physiologically active substance-transferring, the pharmaceutical low molecular weight compound, the oligonucleic acid, the peptide or the protein may be prepared by binding the tag to the substance or ligand bound to the surface of the carbon nanoparticle And may further include, but not limited to, the protein loaded inside the carbon nanoparticles.

본원의 일 구현예에 있어서, 약제학적 유효물질은 정전기적 상호작용에 의해 상기 기공 내에 흡착되는 것일 수 있으며 또한 화학적 결합, 연결 분자, 화학 반응을 통하여 직접적인 내부 외부 환경에의 접합을 통한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment of the invention, the pharmaceutically active material may be adsorbed in the pores by electrostatic interactions and may also be through conjugation to a direct internal environment via chemical bonds, linking molecules, or chemical reactions , But may not be limited thereto.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생리활성물질 전달용 조성물은, 상기 탄소나노입자의 표면에 결합된 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드 또는 앱타머를 추가 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment of the present invention, the composition for delivering a physiologically active substance may further include, but is not limited to, an antibody, a ligand, a cell permeable peptide, or an aptamer bound to the surface of the carbon nanoparticle .

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질은 프로테아좀 등의 단백질 복합체, caspase, RNase, DNase, RNA polymerase, DNA polymerase, kinase, phosphatase 등의 각종 효소 및/또는 각종 항체 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. In one embodiment of the present invention, the protein is selected from the group consisting of protein complexes such as proteasome, various enzymes such as caspase, RNase, DNase, RNA polymerase, DNA polymerase, kinase and phosphatase and / But is not limited thereto.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질은 내인성리간드, 전신 호르몬, 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 신경전달물질, 오타코이드(autacoid), 막단백질, 세포질내 단백질, 핵내 단백질, 수용체, 효소, 혈액내 단백질, 합성단백질, 합성펩타이드, 성장 인자 및 세포의 분화와 증식을 조절하는 다른 단백질과 같은 정상적인 치료 과정에 연관된 조절 인자 등과 이와 같은 상처를 치료할 수 있는 능력을 가지는 것으로 보고된 성장 인자. 신경전달물질으로는 도파민, 노아드레날린, 아드레날린, 아세틸콜린, 가바, 세로토닌, 히스타민, 엔케팔린, 소마토스타틴, Substance P 등의 아민계 전달물질, 펩타이드성 전달물질 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 사이토카인 및 호르몬으로는 펩타이드성 호르몬, 아미노산성 호르몬, 스테로이드성 호르몬, 형질변환 성장인자-β 슈퍼패밀리(TGF-β) 단백질, 대식세포-콜로니 형성 자극 인자(M-CSF) 및 프로테아좀 등의 단백질 복합체, caspase, RNase, DNase, RNA polymerase, DNA polymerase, kinase, phosphatase 등의 각종 효소, 각종 항체, 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment herein, the protein is an endogenous ligand, a systemic hormone, a cytokine, a chemokine, a neurotransmitter, an autacoid, a membrane protein, a cytoplasmic protein, a nuclear protein, , Enzymes, proteins in the blood, synthetic proteins, synthetic peptides, growth factors, and other proteins that regulate cell differentiation and proliferation, as well as growth factors that have been reported to have the ability to treat such wounds factor. The neurotransmitter may be selected from the group consisting of dopamine, no adrenaline, adrenaline, acetylcholine, GABA, serotonin, histamine, enkephalin, somatostatin, Substance P, , But may not be limited thereto. Examples of cytokines and hormones include peptide hormones, amino acid hormones, steroid hormones, transforming growth factor-beta superfamily (TGF-beta) proteins, macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) But are not limited to, protein complexes, caspases, RNase, DNase, RNA polymerase, DNA polymerase, kinase, phosphatase, various enzymes, various antibodies, and the like.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질은 원생동물, 토양 미생물, 해양 미생물, 식물, 바이러스, 어류, 심해저 생물, 양서류, 파충류, 포유류, 외계동식물의 세포에서 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment of the invention, the protein may be derived from a cell of a protozoan, soil microorganism, marine microorganism, plant, virus, fish, deep sea fish, amphibians, reptiles, mammals, .

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.Compositions of the present invention include a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutically acceptable carriers to be included in the composition of the present invention are those conventionally used in the present invention and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate , Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, no. The pharmaceutical composition of the present invention may further contain a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations include, but are not limited to, Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, muscle injection, intraperitoneal injection, transdermal administration or the like.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.0001-100 ㎎/㎏이다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, . The daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is, for example, 0.0001-100 mg / kg.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a unit dose form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Or by intrusion into a multi-dose container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.

본원의 다른 측면은, 평균 직경 2 nm 이상 15 nm 이하인 탄소나노입자 및 상기 탄소나노입자 내부 또는 외부 표면에 결합된, 생리활성 물질에 특이적으로 결합하는 물질 또는 리간드, 및 상기 물질 또는 링커에 결합된 생리활성 물질을 포함하는, 생리활성 물질 전달용 조성물을 제공할 수 있다.Another aspect of the present invention relates to a carbon nanoparticle having an average diameter of 2 nm or more and 15 nm or less and a substance or ligand that binds to a physiologically active substance bound to the inner or outer surface of the carbon nanoparticle and a substance or ligand that binds to the substance or the linker A physiologically active substance, and a physiologically active substance.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생리활성 물질은 약물, 단백질, 펩티드, miRNA, siRNA, pDNA, 효소, 보조영양제, 비타민, 천연물, 또는 추출물을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment of the present invention, the physiologically active substance may be a drug, a protein, a peptide, a miRNA, an siRNA, a pDNA, an enzyme, a supplementary nutrient, a vitamin, a natural product, or an extract.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질의 태그(tag)에 특이적으로 결합하는 물질 또는 리간드는 니켈, 니켈-NTA, 글루타티온, 덱스트린, 비오틴 또는 스트렙타비딘을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment of the invention, the substance or ligand that specifically binds to the tag of the protein may include, but is not limited to, nickel, nickel-NTA, glutathione, dextrin, biotin or streptavidin .

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질은 정전기적 상호작용에 의해 상기 기공 내에 흡착되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment of the invention, the protein may be, but is not limited to, being adsorbed in the pores by electrostatic interactions.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 도 1의 탄소나노입자 또는 생리활성 물질 전달용 조성물을 이용한 질환 또는 증상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.In one embodiment of the present invention, there is provided a food composition for preventing or ameliorating diseases or symptoms using the composition for delivering carbon nanoparticles or physiologically active substance of FIG. 1.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 식품 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 건강 기능성 식품, 영양 보조제, 영양제, 파머푸드(pharmafood), 건강식품, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드, 식품 첨가제 등의 모든 형태의 식품이 될 수 있는데, 예를 들면, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 될 수 있다.In one embodiment of the invention, the food composition is not particularly limited, but may be selected from the group consisting of health functional foods, nutritional supplements, nutritional supplements, pharmafoods, health foods, nutraceuticals, designer foods, It can be any form of food, such as meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice creams, Drinks, alcoholic beverages, and vitamin complexes.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 식품 조성물은 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토 스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.In one embodiment of the invention, the food composition comprises components that are typically added during the manufacture of a food product, including, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, flavoring agents and flavoring agents. Examples of the above-mentioned carbohydrates are monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; And polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol. Natural flavorings such as tau martin and stevia extract (e.g., rebaudioside A and glycyrrhizin) and synthetic flavors (saccharin, aspartame, etc.) may be used as flavorings.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민류, 광물(전해질), 식이성분, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 각 종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.In one embodiment of the present application, the food composition may include flavoring agents such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), dietary components, synthetic flavors and natural flavors, coloring agents and thickening agents (cheese, Organic acids, protective colloid thickening agents, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like. For example, when the food composition of the present invention is prepared as a drink, citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, various plant extracts and the like may be further added in addition to the active ingredient of the present invention.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 도 1의 탄소나노입자 또는 생리활성 물질 전달용 조성물을 이용한 관련 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물(기능성 화장료 조성물)을 제공한다.In one embodiment of the present invention, a cosmetic composition (functional cosmetic composition) for preventing or ameliorating a related disease using the carbon nanoparticle or the composition for delivering a physiologically active substance of FIG. 1 is provided.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 유효성분 이외에 화장품 제조에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the cosmetic composition may be prepared in any formulation conventionally produced in the art, and includes components commonly used in cosmetics in addition to the active ingredient, for example, antioxidants, stabilizers , Solubilizers, vitamins, pigments and flavoring agents.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 탄소나노입자는 표면 개질된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the carbon nanoparticles may be surface-modified, but the present invention is not limited thereto.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 탄소나노입자의 표면이 개질되어 음이온을 띠는 경우(silanol, phosphate, carboxylate, 등에 의한 표면 개질의 경우) 양이온을 띠는 생기능성 물질 적재용으로 사용될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the surface of the carbon nanoparticles can be used for loading a bioactive substance having a cation when the surface is modified to have an anion (in the case of surface modification by silanol, phosphate, carboxylate, etc.).

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 탄소나노입자의 표면이 개질되어 양이온을 띠는 경우 (아미노기, 양이온성 고분자 등에 의한 표면 개질의 경우) 음이온을 띠는 생기능성 물질 적재용으로 사용될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the surface of the carbon nanoparticles can be used for loading biofunctional materials having anions when the surface of the carbon nanoparticles is modified to have positive ions (in the case of surface modification with amino groups, cationic polymers, etc.).

본원의 일 구현예에 있어서, 특정 태그와 결합하는 물질 또는 리간드에 의하여 상기 탄소나노입자의 표면이 개질된 경우(Nickel-NTA, glutathione, dextrin, 스트렙타비딘, 또는 아비딘 등에 의한 표면 개질의 경우: 이들은 각각 his-태그, GST, MBP, 비오틴, 또는 비오틴 태그와 결합할 수 있음) 특정 태그가 포함된 단백질 적재용으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In one embodiment of the present invention, when the surface of the carbon nanoparticle is modified by a substance or ligand that binds to a specific tag (in the case of surface modification by Nickel-NTA, glutathione, dextrin, streptavidin, These can be used for protein loading, including but not limited to a specific tag, which can bind to his-tag, GST, MBP, biotin, or biotin tags, respectively.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 탄소나노입자의 표면은 세포투과성 펩타이드(세포내 전달 효율증가), PEG(입자 외부표면에 비선택적인 생분자의 흡착을 방지하고, 입자의 뭉침 현상 방지), 포스파티딜에틸아민, 항체, 엡타머, 또는 리간드 등에 의하여 개질될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 항체, 엡타머, 또는 리간드 등은 상기 생리활성물질 또는 단백질 전달용 조성물이 특정 세포 또는 특정 장기에 선택적으로 전달되도록 할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the surface of the carbon nanoparticles is selected from the group consisting of a cell permeable peptide (enhancing intracellular delivery efficiency), PEG (preventing adsorption of nonselective biomolecules on the outer surface of the particle and preventing aggregation of particles) Phosphatidylethylamine, antibodies, epotherms, or ligands, but are not limited thereto. For example, the antibody, the eptamer, or the ligand may selectively transfer the physiologically active substance or the protein delivery composition to a specific cell or a specific organ.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 탄소나노입자는 도 1에 도시된 바와 같이, 니켈, 니켈-NTA, 글루타티온, 덱스트린, 비오틴, 또는 스트렙타비딘에 의하여 표면 개질된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 단백질 내의 태그가 상기 금-은 할로우 입자의 기공에 결합되어 상기 기공 내에 내에 효과적으로 담지될 수 있다. 예를 들어, 니켈 또는 니켈-NTA로 표면 개질된 탄소나노입자의 니켈이 단백질의 His-태그와 비공유 상호작용하여 상기 단백질이 상기 입자 표면으로 흡착될 수 있다. GST-태그를 갖는 단백질의 흡착을 위해서는 글루타티온으로 탄소나노입자를 표면 개질시킬 수 있으며, MBP-태그를 갖는 단백질의 흡착을 위해서는 덱스트린으로 탄소나노입자를 표면 개질시킬 수 있고, 비오틴-태그를 갖는 단백질의 흡착을 위해서는 스트렙타비딘으로 탄소나노입자를 표면개질시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the carbon nanoparticles may be surface modified by nickel, nickel-NTA, glutathione, dextrin, biotin, or streptavidin, as shown in FIG. . A tag in the protein can be bound to the pores of the gold-silver hollow particles and effectively be carried in the pores. For example, the nickel of the carbon nanoparticle surface-modified with nickel or nickel-NTA can noncovalently interact with the His-tag of the protein so that the protein can be adsorbed to the surface of the particle. For the adsorption of GST-tagged proteins, it is possible to surface-modify the carbon nanoparticles with glutathione. In order to adsorb the MBP-tagged proteins, surface modification of the carbon nanoparticles with dextrin, The surface modification of carbon nanoparticles with streptavidin may be performed, but the present invention is not limited thereto.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 탄소나노입자는 단분산(monodispersity) 특성을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 이러한 단분산 특성은 분자량의 분포 범위 또는 입자 크기 범위가 매우 좁은 특성으로서, 특히 나노물질의 단분산은 나노입자의 크기와 관련하여 체계적인 약물전달시스템 설계에 있어서 필수적이다. 상기 단분산 특성은 전달용 조성물의 세포 내 흡수 및/또는 약효를 결정하는 데에 있어서 나노물질의 모양 및/또는 표면의 화학적 특성에 더하여 하나의 요소가 될 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the carbon nanoparticles may have monodispersity characteristics, but the present invention is not limited thereto. This monodisperse property is a very narrow molecular weight distribution range or particle size range, and monodispersity of nanomaterials in particular is essential for systematic drug delivery system design with respect to nanoparticle size. The monodisperse property may be one factor in addition to the shape and / or surface chemical properties of the nanomaterial in determining intracellular absorption and / or drug efficacy of the delivery composition.

예를 들어, 상기 탄소나노입자는 조절 가능한 입자 크기, 넓은 표면적, 큰 내부 적재 공간, 표면 기능화의 용이성, 또는 세포독성이 적거나 없어 높은 생체적합성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.For example, the carbon nanoparticles may have an adjustable particle size, a large surface area, a large internal loading space, an ease of surface functionalization, or a high biocompatibility with little or no cytotoxicity, but may not be limited thereto.

예를 들어, 상기 기능성 단백질 또는 단백질 약물은 상기 탄소나노입자 내/외부에 포함되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 단백질이 상기 탄소나노입자 내/외부에 포함됨으로써, 상기 단백질은 외부의 단백질 분해효소(protease), 또는 혈청단백질을 포함하는 세포 내외의 환경으로부터 보호될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 이러한 외부 분해효소로부터의 생분자 보호 기능은 약물 전달체 또는 기능성 고분자 전달체로서 임상적 의의가 있는 중요한 요소의 하나이다. 또한, 상기 단백질은 상기 다양한 분해효소 또는 상기 혈청단백질을 포함하는 세포 내외의 환경으로부터 보호되기 위하여 잠금 핵산(Locked nucleic acid; LNA), O-메틸화, 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 핵산 등과 같이 노동력을 요하고 높은 비용 및 시간을 소모하는 화학적 변형을 요구하지 않으므로 제조가 용이하고 경제적이다.For example, the functional protein or protein drug may be contained in / outside the carbon nanoparticles, but may not be limited thereto. Since the protein is contained in / outside the carbon nanoparticles, the protein can be protected from external or internal environment including an external protease or serum protein, but is not limited thereto. Biomolecule protection from external degradation enzymes is one of important clinical significance as a drug delivery system or a functional polymer delivery system. In addition, the protein may be used in a variety of ways such as a locked nucleic acid (LNA), O-methylation, or phosphorothioate nucleic acid to protect the environment from intracellular and extracellular environments including the various degrading enzymes or the serum proteins And does not require high cost and time-consuming chemical deformation, making it easy to manufacture and economical.

예를 들어, 상기 탄소나노입자는 그의 위치 추적을 위한 형광 염료를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 탄소나노입자는 그 표면에 형광 염료를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.For example, the carbon nanoparticle may include, but is not limited to, a fluorescent dye for tracking its position. For example, the carbon nanoparticles may include, but not limited to, fluorescent dyes on their surfaces.

예를 들어, 상기 탄소나노입자에 단백질을 적재시키는 과정은 상기 탄소나노입자와 상기 단백질을 용액 내에서 단순히 혼합하여 적재시키는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 탄소나노입자에 단백질을 적재시키는 과정은 표면 개질된 탄소나노입자와 상기 단백질을 PBS(phosphate buffered saline)가 포함된 용액 내에 혼합하여 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 이러한 과정은 화학적 결합, 가교결합, 또는 복잡한 정제 분리 과정을 필요로 하지 않으므로 간단하고 비용이 적게 들며 효율적인 모듈 방식으로 실행할 수 있다.For example, the process of loading proteins into the carbon nanoparticles may include, but is not limited to, simply mixing and loading the carbon nanoparticles and the protein in solution. For example, the process of loading the protein on the carbon nanoparticles may include, but is not limited to, surface-modified carbon nanoparticles and the protein in a solution containing PBS (phosphate buffered saline) . This process does not require chemical bonding, cross-linking, or complex purification separation processes, so it can be implemented in a simple, cost-effective and efficient modular manner.

예를 들어, 상기 탄소나노입자는 세포에 독성을 나타내지 않으며 생체친화적인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 추가적으로, 상기 탄소나노입자는 약물 전달 효율 상승 및/또는 세포 내로의 도입을 위하여 추가적인 표면 처리를 필요로 하지 않는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.For example, the carbon nanoparticles may not be toxic to cells but may be biocompatible, but the present invention is not limited thereto. In addition, the carbon nanoparticles may not require additional surface treatment for increasing the drug delivery efficiency and / or introduction into the cell, but may not be limited thereto.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 탄소나노입자의 내부에 그래핀 구조인 sp2 aromatic 구조가 형성되어 있으며, 상기 저분자량 화합물, 올리고핵산, 펩티드 또는 단백질은 상기 표면과의 pi-pi 상호작용과 수소결합에 의해 상기 입자 내부에 흡착되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the carbon nanoparticle has a sp 2 aromatic structure, which is a graphene structure, and the low molecular weight compound, the oligonucleic acid, the peptide or the protein has pi-pi interaction with the surface And may be adsorbed to the inside of the particle by hydrogen bonding, but it may not be limited thereto.

상기 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드 또는 엡타머는 외부 물질을 세포막을 통하여 세포 내로 도입하는 것을 촉진하는 펩타이드를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 세포 투과성 펩타이드는 상기 펩타이드 서열 자체로 세포 내부 도입을 촉진하는 것일 수 있고, 또는 다른 물질, 예를 들어 단백질의 도움을 받아서 세포 내부 도입을 촉진하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. The antibody, ligand, cell permeable peptide, or eptamer may include, but is not limited to, peptides that facilitate the introduction of foreign material into cells through the cell membrane. The cell permeable peptide may be one that promotes intracellular introduction into the peptide sequence itself, or may facilitate, but not limited to, promoting intracellular introduction with the aid of another substance, such as a protein.

예를 들어, 상기 세포 투과성 펩타이드는 세포막에 존재하는 단백질의 도움을 받아서 외부 물질의 세포 내부로의 도입을 촉진하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 세포의 세포막(plasma membrane)은 외부 물질이 세포 내로 들어오는 것을 방지하기 위해 존재한다. 그러나 약물(drug) 또는 리포터(reporter) 분자들이 세포 내에서 활성을 나타내기 위해서는 세포 내로의 도입이 효율적으로 이루어져야 한다. 따라서 짧은 가닥의 분자인 양이온성 펩타이드(cationic peptide)를 약물 전달체에 결합시킴으로써 소분자, 핵산, 항체, 및/또는 나노입자 등의 약물을 세포 내로 전달하는데 응용할 수 있다.For example, the cell permeable peptide may be, but not limited to, promoting the introduction of foreign substances into the cell with the help of proteins present in the cell membrane. The cell's plasma membrane is present to prevent foreign substances from entering the cell. However, in order for a drug or reporter molecule to exhibit activity in a cell, introduction into the cell must be efficient. Therefore, it is possible to apply drugs such as small molecules, nucleic acids, antibodies, and / or nanoparticles into a cell by binding a short-chain molecule, a cationic peptide, to the drug delivery vehicle.

이러한 세포 투과성 펩타이드의 세포 도입 기전이 명확히 밝혀지지는 않았으나, 여러 가지의 기전을 통해 세포 투과가 이루어지는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 에너지 의존성 엔도시토시스(energy dependent endocytosis) 및 에너지 비의존성 직접이동(energy independent direct translocation) 등이 있다. 본원에서 사용될 수 있는 세포 투과성 펩타이드는 상기 두 가지 기전 중 어떠한 기전에 의해서도 상기 탄소나노입자를 세포 내로 도입할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.Although the mechanism of cell transduction of these cell permeable peptides has not been clarified yet, it is known that cell permeation occurs through various mechanisms. For example, there are energy dependent endocytosis and energy independent direct translocation. The cell permeable peptide that can be used in the present invention can introduce the carbon nanoparticles into the cell by any mechanism of the above two mechanisms, but may not be limited thereto.

이와 관련하여, 도 1는 본원의 일 구현예에 따른 단백질 약물 및/또는 생리활성 물질 전달용 조성물의 모식도이다.In this regard, FIG. 1 is a schematic diagram of a composition for delivering a protein drug and / or a physiologically active substance according to an embodiment of the present invention.

도 6-1,6-2,7을 참조하면, 본원의 일 구현예에 따른 상기 탄소나노입자는 작은 크기와 그 입자표면 특성 때문에 세포에 의해 흡수(endocytosis)될 수 있어 흡착된 단백질 약물과 함께 세포 내로 도입될 수 있다.Referring to FIGS. 6-1, 6-2, and 7, the carbon nanoparticles according to one embodiment of the present invention can be endocytosed by cells due to its small size and particle surface characteristics, Can be introduced into cells.

상기 세포 투과성 펩타이드의 아미노산 서열은 상기 세포 투과성 펩타이드의 활성이 유지되는 한 그 서열 일부에 변형이 가해질 수도 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.The amino acid sequence of the cell permeable peptide may be modified, but not limited thereto, as long as the activity of the cell permeable peptide is maintained.

예를 들어, 상기 세포 투과성 펩타이드는 MPAP, TAT, 또는 폴리아르기닌을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 MPAP는 미리스틱산(myristic acid)-ARRRRRRRC의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있고, 상기 TAT는 RKKRRQRRR의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있으며, 상기 폴리아르기닌은 RRRRRRRRR(9 개의 아르기닌)의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.For example, the cell permeable peptide may include, but is not limited to, MPAP, TAT, or polyarginine. For example, the MPAP may have an amino acid sequence of myristic acid-ARRRRRRRC, the TAT may have an amino acid sequence of RKKRRQRRR, and the polyarginine may be an amino acid of RRRRRRRRR (9 arginine) Sequence, but may not be limited thereto.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 포스파티딜 에틸아민 또는 폴리에틸렌글리콜화에 의하여 상기 탄소나노입자의 표면에 폴리에틸렌글리콜이 결합될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 포스파티딜 에틸아민 또는 폴리에틸렌글리콜화에 의하여 상기 탄소나노입자의 뭉침이 방지되거나, 다른 생분자와의 비특이적 결합이 최소화 되거나 RNA 흡착이 감소되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, polyethylene glycol may be bonded to the surface of the carbon nanoparticles by the phosphatidylethylamine or polyethylene glycolization, but the present invention is not limited thereto. But may not be limited to, the above-mentioned phosphatidylethylamine or polyethylene glycolization, to prevent aggregation of the carbon nanoparticles, minimize non-specific binding with other biomolecules, or reduce RNA adsorption.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 탄소나노입자의 평균 직경은 2 nm 이상 15 nm 이하로 조절될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the average diameter of the carbon nanoparticles may be controlled to be 2 nm or more and 15 nm or less, but the present invention is not limited thereto.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 탄소나노입자는, 탄소나노입자를 형성하는 단계; 및 탄소나노입자의 표면 고분자 코팅을 입자형성시 탄소화 반응과 고분자화반응에 의하여 개질하는 단계로 구성되나, 이에 제한되지 않을 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the carbon nanoparticles may include carbon nanoparticles; And a step of modifying the surface polymer coating of the carbon nanoparticles by a carbonization reaction and a polymerisation reaction when forming the particles, but the present invention is not limited thereto.

예를 들어, 상기 탄소나노입자를 형성하는 단계는, 탄소를 제공하는 고분자로부터 탄소나노입자를 형성하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. For example, the step of forming the carbon nanoparticles may include, but not limited to, forming carbon nanoparticles from the carbon-providing polymer.

상기 탄소나노입자는 제조방법이 단순하여 합성이 용이한 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 탄소나노입자는 실험실 기구를 이용할 경우 상기 제조 방법에 의해 1 회 합성에 약 10 mL 이상의 분산용액을 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.The carbon nanoparticles may include, but are not limited to, those having a simple production method and easy synthesis. For example, when using a laboratory apparatus, the carbon nanoparticles may be prepared by a method described above, but the present invention is not limited thereto.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 탄소나노입자 표면 고분자 코팅에 마이크로웨이브를 이용한 기능성 작용기를 도입하는 단계는, 상기 탄소나노입자를 고온에서 단시간 노출시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 마이크로웨이브에 1~5분 동안 노출시키는 범위일 수 있으나, 이에 제한되지 않아 10분 이상 제한 없는 기간까지의 노출에 대한 내용을 포함한다. 또한, 상기 탄소나노입자를 고온에서 산화 촉매 반응을 통해 단시간 내에 기능성 작용기를 도입하는 반응을 수반할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the step of introducing the functional group using the microwave into the carbon nanoparticle surface polymer coating may include exposing the carbon nanoparticles at a high temperature for a short time, but the present invention is not limited thereto. For example, the range of exposure to microwaves for 1 to 5 minutes may be, but is not limited to, includes exposure to an unlimited period of not less than 10 minutes. In addition, the carbon nanoparticles may be accompanied by a reaction to introduce a functional group in a short period of time through an oxidation catalyst reaction at a high temperature, but the present invention is not limited thereto.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생리활성물질 또는 단백질 전달용 조성물은 혈관주사용 약물, 경구투여용 약물, 경피투여용 약물 또는 패치, 국부투여용 약물, 화장품, 연고, 식품, 음료, 샴푸, 세제, 백혈병, 투석, 혈액이식, 혈관이식, 치아이식, 임플란트식립, 혈관성형술, 모발이식, 조직이식, 장기이식, 골이식, 핵이식, 세포이식, 생식세포이식, 배아이식, 동물복제, 형질전환배아의 제작, 형질전환동물 제작, 형질전환 세포 제작, 형질전환 식물 제작, 형질전환 어류 제작, 형질전환 동물모델 제작, 줄기세포 제작, 품질개량식물 제작, 유전자 변형 식물 제작, 동식물 세포내 유전자 전달, 이종간핵이식, 이종간장기이식, 유도만능줄기세포 제작, 배아발생기술(microinjection, parthenogenesis, zygogenesis, nuclear transfer, blastomere transfer, blastomere fusion, IVF, ICSI, 등), 세포분화유도기술, 줄기세포 치료제, 세포치료제, 호르몬제, 항체치료제, 캡슐제, 시럽, 연구용 시약, 환경오염물질 정화, 생화학 무기, 다이어트 용품, 성형술 (두개악안면성형, 양악성형, 가슴성형) 등에 적용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the physiologically active substance or the composition for delivering a protein can be administered orally or parenterally in the form of a vascular drug, a drug for oral administration, a drug or patch for percutaneous administration, a drug for local administration, cosmetics, ointment, Implantation, embryo transfer, transplantation, animal reproduction, transplantation, blood transplantation, blood transplantation, tooth implant, implant placement, angioplasty, hair transplantation, tissue transplantation, organ transplantation, bone graft, nuclear transfer, cell transplantation, germ cell transplantation Production of transgenic embryos, production of transgenic animals, production of transgenic plants, production of transgenic plants, production of transgenic animals, production of transgenic animal models, production of stem cells, production of quality improvement plants, production of transgenic plants, gene transfer in plants and animals , Embryogenesis (microinjection, parthenogenesis, zygogenesis, nuclear transfer, blastomere transfer, blastomere fusion, IVF, ICSI, etc.), interspecies nuclear transfer, Cellulite, Antibody Therapeutics, Capsules, Syrups, Research Reagents, Environmental Pollutants Purification, Biochemical Weapons, Diet Supplies, Plastic Surgery (Cranio Maxillofacial, Amniocentesis, Breast) But is not limited thereto.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생리활성물질 또는 단백질 전달용 조성물은 자가면역질환(아토피, 피부가려움증, 천식, 류마티스 관절염), 고형암, 혈액암, 뇌질환, 심혈관계질환, 순환기계질환, 호흡기계질환, 소화기계질환(위장관질환, 역류성식도염, 소화성궤양, 위궤양), 염증성 질환, 뇌신경 질환, 만성질환, 급성질환, 노인성 질환, 난치성 질환, 치주질환, 구강질환, 두개악안면 질환, 허혈성질환, 간질환, 폐질환, 피부질환, 세균성 질환, 바이러스성 질환, 감염질환, 골질환(골다공증, 골절, 등), 관절염질환, 척추질환, 알레르기질환, 환경성 질환, 음주질환, 대사성 질환, 과민성 질환, 신장질환, 갑상선 질환, 생식기 질환, 신생물성 질환, GERD, 자가면역 증상, 당뇨병, 유전적 증상, 바이러스/박테리아/기생충 감염, 기생충 증상, 신체 증상, 프리온 질환, 영양결핍증, 비타민/미네랄 결핍증, 미토콘드리아 질환, 사고, 성매개 질환, 임신 증상, 모유수유 증상, 선천적 기형, 남성/여성/영유아/소아/청소년 증상, 면역 장애, 균형 장애, 통증, 전신 장애, 혈액 증상, 혈관 증상, 신경 증상, 근육 증상, 심장 증상, 등/목/척수 증상, 눈 증상, 뇌 증상, 정신 증상, 코 증상, 입 증상, 치아 증상, 발/다리/무릎 증상, 상지 증상, 어깨 증상, 귀 증상, 폐 증상, 간 증상, 신장 증상, 담낭 증상, 췌장 증상, 소화계 증상, 전립선 증상, 남성 생식기 증상, 산과적 증상, 부인과적 증상, 갑상샘 장애, 청각 장애, 미용적 적용, 색소침착, 탈모, 발모, 제모 등에 적용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the invention, the composition for delivering a physiologically active substance or protein is at least one selected from the group consisting of autoimmune diseases (atopy, skin itching, asthma, rheumatoid arthritis), solid tumors, blood cancer, brain diseases, cardiovascular diseases, Inflammatory diseases, cerebral diseases, chronic diseases, acute diseases, geriatric diseases, intractable diseases, periodontal diseases, oral diseases, craniofacial diseases, ischemic diseases, gastrointestinal diseases, gastrointestinal diseases, gastrointestinal diseases, gastrointestinal diseases, reflux esophagitis, peptic ulcer, (Including osteoporosis, fracture, etc.), arthritic disease, spinal disease, allergic disease, environmental disease, alcoholic disease, metabolic disease, irritable disease, Atherosclerotic disease, thyroid disease, genital disease, neoplastic disease, GERD, autoimmune symptoms, diabetes, genetic symptoms, viral / bacterial / parasitic infections, parasitic symptoms, somatic symptoms, Symptoms of male / female / infant / child / adolescent, immunodeficiency, balance disorder, pain, systemic disorder, diabetes mellitus, malnutrition, malnutrition, vitamin deficiency, vitamin / mineral deficiency, mitochondrial disease, , Blood symptoms, vascular symptoms, neurological symptoms, muscle symptoms, cardiac symptoms, back / neck / spinal symptoms, eye symptoms, brain symptoms, mental symptoms, nose symptoms, mouth symptoms, dental symptoms, , Pancreas symptoms, digestive system symptoms, prostate symptoms, male genital symptoms, obstetric symptoms, gynecological symptoms, thyroid disorders, deafness, cosmetic application, Pigmentation, hair loss, hair growth, hair removal, etc. However, the present invention is not limited thereto.

본원의 또 다른 측면은, 하기를 포함하는, 단백질의 전달 방법을 제공할 수 있다: 평균 직경 2 nm 이상 15 nm 이하인 탄소나노입자; 상기 탄소나노입자의 기능성 작용기 표면에 결합된, 단백질의 태그(tag)에 특이적으로 결합하는 물질, 약제학적 유효물질, 올리고핵산, 펩티드 또는 리간드; 및 상기 금-은 할로우 입자의 내부에 적재된 단백질을 포함하는 단백질 전달용 조성물, 약제학적 유효물질, 올리고핵산, 펩티드 등을 목적 세포 내로 도입하는 것. Another aspect of the present application can provide a method of delivering a protein, comprising: carbon nanoparticles having an average diameter of 2 nm or more and 15 nm or less; A substance which specifically binds to a tag of a protein, a pharmaceutically effective substance, an oligonucleic acid, a peptide or a ligand, which is bound to the functional functional surface of the carbon nanoparticle; And a composition for transferring a protein, a pharmaceutically effective substance, an oligonucleic acid, a peptide or the like, which contains the protein loaded in the inside of the gold-silver hollow particle, into the target cell.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질은 프로테아좀 등의 단백질 복합체, caspase, RNase, DNase, RNA polymerase, DNA polymerase, kinase, phosphatase 등의 각종 효소, 각종 항체, 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment of the present invention, the protein is selected from the group consisting of protein complexes such as proteasome, various enzymes such as caspase, RNase, DNase, RNA polymerase, DNA polymerase, kinase and phosphatase, , But may not be limited thereto.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질은 전신 호르몬, 사이토킨, 성장 인자 및 세포의 분화와 증식을 조절하는 다른 단백질과 같은 정상적인 치료 과정에 연관된 조절 인자 등과 이와 같은 상처를 치료할 수 있는 능력을 가지는 것으로 보고된 성장 인자. 사이토킨 및 호르몬으로는 형질변환 성장인자-β 슈퍼패밀리(TGF-β) 단백질, 대식세포-콜로니 형성 자극 인자(M-CSF) 및 프로테아좀 등의 단백질 복합체, caspase, RNase, DNase, RNA polymerase, DNA polymerase, kinase, phosphatase 등의 각종 효소, 각종 항체, 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment of the invention, the protein is capable of treating such wounds and regulatory factors associated with normal therapeutic processes such as systemic hormones, cytokines, growth factors, and other proteins that regulate cell differentiation and proliferation Reported growth factors. Cytokines and hormones include protein complexes such as transforming growth factor-β superfamily (TGF-β) protein, macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and proteasome, caspase, RNase, DNase, RNA polymerase, DNA polymerase, kinase, phosphatase and the like, various antibodies, and the like, but may not be limited thereto.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것은, 상기 단백질 전달용 조성물을 세포 배양액에 첨가하여 상기 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment of the present invention, the introduction of the protein transferring composition into a target cell may include, but is not limited to, introducing the protein transferring composition into a cell culture medium and introducing the composition into the target cell have.

본원의 일 구현예에 있어서, 단백질 전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것은, 상기 단백질 전달용 조성물을 혈관 내 투여, 경구투여, 경피투여 또는 주사에 의한 국부투여에 의하여 상기 목적 세포 내로 도입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment of the present invention, the introduction of the protein delivery composition into the target cell can be achieved by introducing the protein delivery composition into the target cell by local administration by intravascular administration, oral administration, transdermal administration or injection But may not be limited thereto.

예를 들어, 상기 목적 나노입자가 세포 내로의 도입을 통한 약물 전달에 대한 접근법 이외에, 세포 내로의 미도입 상태에서 조직 내부에 거주하며 적재된 전달물질의 꾸준한 방출을 통하여 중장기적 지속 효과를 내는 범위를 포함한다. 결과적으로 체내 혈관 내부 순환 유지를 통한 적재물질 방출, 근육 조직 내부에서의 적재 물질 방출, 장기 내부에서의 적재 물질 방출, 피부 표면에서의 적재 물질 방출에 대한 내용을 포함하며, 이에 제한되지 않을 수 있다.For example, in addition to the approach for drug delivery through the introduction of the target nanoparticles into cells, the target nanoparticles reside in the tissue under the non-introduced state into the cell, and have a long-term sustained effect through sustained release of the transferred substance . As a result, it may include, but is not limited to, release of loading material through internal circulation maintenance of the vasculature, release of loading material within the muscle tissue, release of loading material within the organ, release of loading material from the skin surface .

예를 들어, 상기 목적 세포는 상기 세포는 원핵 동물 또는 진핵 동물 유래의 세포일 수 있으며, 예를 들어 포유류 세포일 수 있고, 예를 들어 인간 유래 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 암세포, 장기의 조직 세포를 포함하는 것일 수 있으며, 암세포, 골세포, 위세포, 장세포, 폐세포, 간세포, 뇌세포, 혈관 세포, 면역 세포, 적혈구, 백혈구, 또는 림프구 세포를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.For example, the target cell may be a prokaryotic or eukaryotic cell, for example, a mammalian cell, for example, a human-derived cell, but is not limited thereto. For example, the cells may be cancer cells, tissue cells of organs, and may be cancer cells, bone cells, stomach cells, intestinal cells, lung cells, hepatocytes, brain cells, blood vessel cells, immune cells, red blood cells, But may be, but not limited to, lymphocyte cells.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 단백질 약물은 프로테아좀 등의 단백질 복합체, caspase, RNase, DNase, RNA polymerase, DNA polymerase, kinase, phosphatase 등의 각종 효소, 각종 항체 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the protein drug is selected from the group consisting of protein complexes such as proteasome, various enzymes such as caspase, RNase, DNase, RNA polymerase, DNA polymerase, kinase and phosphatase, , But may not be limited thereto.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 단백질 전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것은 상기 단백질 전달용 조성물을 세포 배양액에 첨가하여 상기 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the introduction of the protein-transferring composition into the target cell may include, but is not limited to, introducing the protein-transferring composition into the cell culture medium and introducing the composition into the target cell .

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 단백질 전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것은 상기 단백질 전달용 조성물을 혈관 내 투여, 경구투여, 경피투여, 또는 주사에 의한 국부투여에 의하여 상기 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the introduction of the protein-transferring composition into a target cell is carried out by introducing the protein-transferring composition into the target cell by intravascular administration, oral administration, transdermal administration, or local administration by injection But may not be limited thereto.

예를 들어, 상기 혈관 내 투여에 의하면 순환계를 통하여 몸 전체에 단백질을 전달하는 것이 가능하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 경구투여에 의하면 주로 소화계로의 단백질전달이 용이해질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.For example, according to the intravascular administration, the protein can be delivered to the entire body through the circulatory system, but the present invention is not limited thereto. For example, such oral administration may facilitate protein delivery to the digestive tract, but may not be limited thereto.

예를 들어, 상기 경피투여에 의하면, 피부를 통하여 단백질을 전달하는 것이 가능하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 경피투여의 타겟이 되는 질병에는 아토피, 탈모, 색소침착, 또는 피부병 등이 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.For example, according to the transdermal administration, it is possible to transmit the protein through the skin, but it may not be limited thereto. For example, the target disease to be transdermally administered may include, but is not limited to, atopy, hair loss, pigmentation, or skin disease.

예를 들어, 상기 주사에 의한 국부투여는 눈, 피부, 점막, 또는 국부적인 종양 조직과 같은 국소적이고 국부적 조직에의 적용이 가능하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 국부투여시 높은 생물학적 적용 가능성, 목적 조직에의 접근성, 및/또는 전신 적용시 일반적으로 수반되는 부작용을 줄일 수 있다. 예를 들어, 상기 국부 투여의 타겟이 되는 질병에는 시력 감퇴, 아토피성 피부염, 헌팅턴병, 만성 통증, 또는 다형교아증 등이 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.For example, local administration by injection may be applicable to, but not limited to, local and local tissues such as the eye, skin, mucosa, or local tumor tissue. For example, such topical administration may reduce the potential for high bioavailability, access to the target tissue, and / or side effects generally associated with systemic application. For example, the targeted disease for topical administration may include, but is not limited to, decreased vision, atopic dermatitis, Huntington's disease, chronic pain, or polymorphic mellitus.

본원의 또 다른 측면은, 상기 탄소나노입자를 기반으로 한 근적외선 조사를 통한 광감응 효과를 이용한 발열 및 활성산소 발생을 포함한다. 이와 같은 발열 및 활성산소 발생은 그 자체를 활용한 광열치료 및 광역동효과를 기반한 적재 전달물질의 조절적 방출 또는 전달물질로 인한 치료 및 의도된 효과의 증대를 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 광감응성을 갖는 탄소나노입자물질을 통한 응용은 상기 언급된 크기의 범위에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어 단일 나노입자, 복합 나노입자, 나노입자 군집체, 재조립 나노입자, 마이크로입자, 마이크로-나노입자 복합체에 대한 범위를 포함하며, 이에 제한되지 않을 수 있다. 치료를 위한 조사 레이저 영역은 근적외선에 제한되지 않을 수 있다. 예를들어, 다양한 크기의 나노입자의 극대화된 효과를 위하여 자외선, 가시광선, 근적외선, 원적외선의 범위에서 광감응효과를 수행하는 범위를 포함한다.Another aspect of the present invention includes generation of heat and active oxygen using a photo-sensitization effect by irradiation with near infrared rays based on the carbon nanoparticles. Such exothermic and reactive oxygen production may include, but is not limited to, treatment with modulated release or delivery of a load transfer substance based on its photothermal therapy and broad-spectrum effects, and an increase in the intended effect . Applications through the carbon nanoparticle material with photosensitivity may not be limited to the range of sizes mentioned above. But are not limited to, for example, ranges for single nanoparticles, complex nanoparticles, nanoparticle aggregates, reassembled nanoparticles, microparticles, and micro-nanoparticle complexes. The irradiation laser region for treatment may not be limited to near infrared rays. For example, it encompasses a range of performing a photo-sensitization effect in the range of ultraviolet rays, visible rays, near-infrared rays, and far-infrared rays for the maximized effect of nanoparticles of various sizes.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the present invention.

[[ 실시예Example ]]

제조예Manufacturing example 1:  One: PEGPEG 로 코팅된 탄소나노입자(Coated carbon nanoparticles ( CDCD -- PEGPEG ))

핵심 실험군인 탄소나노입자의 형성은 고온조건에서 이루어지는데 고온조건을 제공함에 있어서 범용적으로 사용하고 있는 수열반응 통하여 합성하였다 (도 1a). 구체적으로 둥근바닥 플라스크에 5 mL증류수를 넣고 탄소를 제공해줄 수 있는 alpha-cyclodextrin을 2 g 넣어 충분히 녹여준다. 이 후 8 mL의 황산용액을 넣어주어 충분히 섞어주었다. 1시간 정도 상온에서 저어주면서 충분히 반응이 이루어지도록 한 후 40 mL의 증류수를 넣어주어 반응용액을 묽혀 주고, 이 후 정제과정을 따른다. 먼저 원심분리기를 이용하여 4000 rpm에서 10분간 회전시킨 후 가라앉고 남은 용액을 제거해주고 증류수를 이용하여 가라앉은 생성물을 세척해주었고, 이 정제과정을 두번 반복하였다. 충분히 정제과정을 거친 후 생성물을 5 mL의 물과 6 mL의 질산에 고르게 분산시키고 1시간 동안 잘게 부수기 위해 sonication과정을 진행하였다. 이 후 고온에서의 반응을 위해 질소기체를 흘려주는 반응조건하에서 12시간 동안 120 ℃ 조건에서 reflux를 진행하였다. Reflux이후에는 산성조건을 반응용액을 중화시키기 위해서 탄산칼륨을 충분히 넣어주었다. 이 후 반응하고 남은 과량의 염과 순수한 탄소나노입자를 얻기 위해서 증류수를 이용한 투석방법으로 정제하여 작은 크기의 탄소나노입자를 획득하였다. 합성된 탄소나노입자는 투과 전자 현미경 분석을 통해 약 2 ~ 10 nm 크기의 분포로 형성되었음을 확인하였다. The formation of carbon nanoparticles, which is a core experimental group, is carried out at high temperature, and synthesized through a generalized hydrothermal reaction in providing high temperature conditions (FIG. 1A). Specifically, add 5 mL of distilled water to a round-bottomed flask and add 2 g of alpha-cyclodextrin to provide carbon. After that, 8 mL of sulfuric acid solution was added and mixed well. Allow the reaction to take place for about 1 hour at room temperature, add 40 mL of distilled water to dilute the reaction solution, and then follow the purification procedure. After centrifugation at 4000 rpm for 10 minutes, the solution was submerged and the remaining solution was removed. The precipitated product was washed with distilled water, and the purification procedure was repeated twice. After thorough purification, the product was evenly dispersed in 5 mL of water and 6 mL of nitric acid and sonicated for 1 hour. Thereafter, the reaction was allowed to proceed at 120 ° C. for 12 hours under a reaction condition of flowing nitrogen gas for the reaction at a high temperature. After reflux, acidic conditions were enough to add potassium carbonate to neutralize the reaction solution. After the reaction, the reaction mixture was purified by dialysis using distilled water to obtain excess salts and pure carbon nanoparticles to obtain small size carbon nanoparticles. The synthesized carbon nanoparticles were found to have a distribution of about 2 ~ 10 nm by transmission electron microscopy.

이후 실시예에서 실험군으로 사용하기 위해 표면개질을 시도하였다. 처음에 합성된 탄소나노입자는 표면에 히드록시기(-OH), 카르복시기(-COOH) 등의 작용기가 다량 존재하기 때문에 아미노기(-NH2)와의 반응을 통해 공유결합을 형성시킬 수 있으므로 아미노기가 존재하는 PEG를 이용하여 표면개질 하였다. 구체적으로, 탄소나노입자를 다량의 증류수 조건에서 PEG (150 mM)을 첨가하여 72시간동안 120 ℃ 조건에서 reflux를 진행하엿고, reflux 이후 상기에 명시된 방법으로 투석하여 정제하는 과정을 거치며 이 과정에서 반응하지 않은 과량의 PEG은 제거된다.
In the following examples, surface modification was attempted for use as an experimental group. Since the carbon nanoparticles synthesized at the beginning have a large amount of functional groups such as a hydroxyl group (-OH) and a carboxyl group (-COOH) on the surface thereof, a covalent bond can be formed through reaction with an amino group (-NH 2 ) The surface was modified with PEG. Specifically, PEG (150 mM) was added to the carbon nanoparticles under a large amount of distilled water, refluxed for 72 hours at 120 ° C., refluxed, dialyzed and refined as described above, Unreacted excess PEG is removed.

제조예Manufacturing example 2: 표적  2: Target 리간드Ligand 접합과  Junction 광감응제를Photosensitizer 담지한Bearing 탄소나노입자Carbon nanoparticles

실시예에서 이용하기 위한 탄소나노입자는 표적지향성을 부여하여 특정 질병을 대표하는 세포수준에서의 선택적 도입에 의한 치료효과를 증대시키고자 하였고, 탄소나노입자에 광감응제를 적재함으로써 치료의 효과를 달성하고자 하였다. 도 1a에서 보여지듯이, 실시예에서 사용된 CD-PEG는 대부분의 암세포에서 과다발현되어 있는 엽산수용체(Folate Receptor, FR)를 이용하여 선택적 세포내 도입을 위하여 PEG가 코팅되어있는 탄소나노입자 (CD-PEG)에 엽산(Folic acid, FA)을 접합시켰다. 엽산은 두 개의 카르복시기 작용기와 한 개의 아미노기 작용기를 가지고 있으므로 CD-PEG의 아미노기 작용기와 공유결합을 형성함으로서 도입이 가능하다. 구체적으로, 둥근플라스크를 이용하여 10 mM의 엽산과 10 nM의 1-ethly-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(EDC)를 탄산수소나트륨 포화수용액에 넣어 충분히 저어주고, 반응용액에 합성된 CD-PEG (1 mg/mL)을 넣어 18시간 동안 상온에서 반응시킨다. 이후 반응하고 남은 과량의 엽산을 제거하기 위해 상기된 투석방법을 이용하여 정제하고 엽산이 접합된 PEG가 코팅된 탄소나노입자(CD-PEG-FA)를 합성하였으며, 상기 합성된 탄소나노입자 유도체들을 자외선-가시광선 흡광분석과 적외선 분광법 등을 이용한 분석을 통해 평균 10 nm 정도의 분포를 가진 입자들의 합성이 확인되었다. The carbon nanoparticles to be used in the examples were targeted to enhance the therapeutic effect by selective introduction at a cellular level representing a specific disease, and the effect of the treatment by loading the photosensitizer on the carbon nanoparticles . As shown in FIG. 1A, the CD-PEG used in the Examples is a PEG-coated carbon nanoparticle (CD) for selective introduction into cells using a folate receptor (FR) overexpressed in most cancer cells -PEG) was conjugated with folic acid (FA). Since folic acid has two carboxyl groups and one amino group, it can be introduced by forming a covalent bond with the amino group of CD-PEG. Specifically, 10 mM of folic acid and 10 nM of 1-ethly-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) were added to a saturated aqueous solution of sodium hydrogencarbonate using a round flask, Add PEG (1 mg / mL) and incubate at room temperature for 18 hours. PEG-coated carbon nanoparticles (CD-PEG-FA) were synthesized by using the dialysis method to remove excess folic acid remaining after reaction and folate-conjugated PEG-conjugated carbon nanoparticle derivatives Ultraviolet - visible light absorption spectroscopy and infrared spectroscopy were used to confirm the synthesis of particles with an average distribution of about 10 nm.

이후 탄소나노입자로 광감응제를 효과적으로 적재하기 위해서 탄소나노입자의 내부표면 sp2 구조를 이용하여 광감응제와의 pi-pi 상호작용을 통해 적재하였다. 이때 사용된 광감응제는 시판되고 있는 빛에 대한 들뜸의 효율이 높은 Zinc Phthalocyanine(ZnPc)를 후보군으로 하였다. 구체적으로, 250 mL 둥근바닥플라스크를 이용하여 2 g의 ZnPc를 에탄올에 충분히 녹여 고르게 분산시킨 후 에탄올을 모두 증발시킨다. 이 후 증류수에 분산되어있는 CD-PEG-FA (1 mg/mL)를 넣어 1시간 동안 sonication을 해주고 이때 온도가 상승하지 않도록 얼음을 이용하여 4℃를 유지하도록 한다. 적재되지 않은 과량의 ZnPc를 제거하기 위해 0.2 μm 크기 이하만을 통과시키는 polyvinylidene difluoride(PVDF) 필터를 이용한다. 이 후 자외선-가시광선 흡광분석을 통하여 1 mg의 CD-PEG-FA에 60 μg의 ZnPc가 적재됨을 확인하였다 (도 5).
It was then loaded to the photo sensitive to the carbon nanoparticles effectively using the inside surface structure of sp 2 carbon nanoparticles loaded through a pi-pi interaction with the photosensitive agent. The photosensitizer used in this study was Zinc Phthalocyanine (ZnPc), which has high efficiency of light excitation for commercially available light. Specifically, 2 g of ZnPc is sufficiently dissolved in ethanol using a 250 mL round-bottomed flask and uniformly dispersed, followed by evaporation of all of the ethanol. After this, CD-PEG-FA (1 mg / mL) dispersed in distilled water is added and sonication is performed for 1 hour. At this time, it is kept at 4 ° C using ice to prevent the temperature from rising. Use a polyvinylidene difluoride (PVDF) filter that passes only 0.2 μm or less to remove excess unloaded ZnPc. Thereafter, 60 μg of ZnPc was loaded on 1 mg of CD-PEG-FA through ultraviolet-visible light absorption analysis (FIG. 5).

제조예Manufacturing example 3:  3: PEIPEI 로 코팅된 탄소나노입자(Coated carbon nanoparticles ( CDCD -- PEIPEI ))

실시예에서 사용된 CD-PEI의 합성은 도 1b에 표기된 바 다음과 같이 수행된다. 평균 분자량 10,000의 PEI 0.25 g을 5 mL의 증류수에 용해시키고, 50 mL의 비이커를 사용하여 0.25 g의 시트르산 (Citric acid, CA)이 녹아 있는 증류수와 섞어준다. 두 용액이 고르게 섞일 수 있도록 상온에서 저어주며 10분간 반응시키고 이때 투명한 용액이 관찰되면 반응용액이 잘 준비되었음을 시사한다. 이 후 마이크로웨이브를 이용한 고온반응을 위해 700W 가정용 전자레인지 안에 반응용액이 담긴 비이커를 넣고 3 분 동안 가동시켜 합성반응을 진행한다. 반응 종료 후 진한 갈색 혹은 검은색계통의 고체생성물을 관찰을 통해 탄소나노입자의 합성을 일차적으로 끝낼 수 있다. 이 과정에서 고체생성물이 아닌 고체와 액체생성물이 공존하는 경우에도 탄소나노입자의 합성이 이루어진 것이라 할 수 있다. 이후 10 ~ 20 mL의 증류수를 넣어주어 생성물을 충분히 분산시키고 필요에 따라 sonication을 진행한다. 이때 노란색 혹은 갈색계통의 용액이 관찰되면 반응이 잘 진행됨을 시사한다. 반응하고 남은 PEI를 제거하기 위해서 10 kDa 이상 분자량을 가지는 물질을 통과시키는 투석막을 이용하여 2일간 투석방법으로 정제하여 PEI가 코팅된 탄소나노입자 (CD-PEI)를 얻을 수 있다. 합성된 탄소나노입자 유도체들을 자외선-가시광선 흡광분석과 적외선 분광법 등을 이용한 분석을 통해 평균 10 nm 정도의 분포를 가진 입자들의 합성이 확인되었다 (도 3). 실시예서의 다양한 목적에 따라 PEI의 분자량을 달리하여 탄소나노입자를 합성하였으며 합성과정은 동일하다. 본 연구진에서 사용한 PEI는 10 kDa의 branched PEI와 25 kDa linear PEI이다.
The synthesis of CD-PEI used in the examples is carried out as shown in FIG. 0.25 g of PEI with an average molecular weight of 10,000 is dissolved in 5 mL of distilled water and mixed with distilled water containing 0.25 g of citric acid (CA) using a 50 mL beaker. The reaction was stirred for 10 minutes at room temperature so that the two solutions could be mixed evenly, suggesting that the reaction solution was well prepared when a clear solution was observed. Then, for the high-temperature reaction using the microwave, the beaker containing the reaction solution is put into a 700W domestic microwave oven and the reaction is carried out for 3 minutes to perform the synthesis reaction. After completion of the reaction, the synthesis of the carbon nanoparticles can be ended by observing the solid brown or black solid product. In this process, carbon nanoparticles are synthesized even when solid and liquid products coexist, rather than a solid product. After that, 10 ~ 20 mL of distilled water is added to disperse the product sufficiently and sonication is carried out if necessary. This suggests that the reaction proceeds well when yellow or brown solution is observed. To remove the remaining PEI, PEI-coated carbon nanoparticles (CD-PEI) can be obtained by dialysis using a dialysis membrane that passes a substance having a molecular weight of 10 kDa or more. Synthesized carbon nanoparticle derivatives were analyzed by ultraviolet-visible light absorption spectrometry and infrared spectroscopy to synthesize particles having an average distribution of about 10 nm (FIG. 3). Carbon nanoparticles were synthesized by varying the molecular weight of PEI according to various purposes of the examples and the synthesis procedure was the same. The PEIs used in this study were branched PEI of 10 kDa and 25 kDa linear PEI.

실시예Example 1:  One: PEGPEG 코팅된  Coated 탄소나노입자(CD-PEI)와Carbon nanoparticles (CD-PEI) and PEIPEI 코팅된 탄소나노입자( Coated carbon nanoparticles ( CDCD -PEI) 특성 분석-PEI) Characteristic Analysis

표면개질되지 않은 탄소나노입자는 물에서 매우 높은 안정도를 가지며 분산되어 있으며 입자표면의 카르복시기 작용기와 히드록시기 작용기가 풍부하게 존재하므로 입자의 전하는 약 -40 mV를 나타낸다. 도 2a에서 보여지는 바와 같이, 자외선-가시광선 분석 결과에 따르면, CD, CD-PEG, CD-PEG-FA 경우 공통적으로 230 nm 부근에서 sp2 탄소구조 형태의 전형적인 방향족구조(aromatic)를 나타내는 흡광도를 나타내며, FA의 대표적인 흡광곡선이 283 nm 에서 나타남에 따라 탄소나노입자에 FA이 효과적으로 접합되었음을 알 수 있다. 처음 사용되는 탄소나노입자의 전하역시 PEG, FA 접합에 따라 약 -12.4 mV, -8.24 mV로 증가함으로서 음전하를 작용기들이 공유결합에 사용되어 전체 전하가 증가함을 시사한다. 또한 360 nm 부근에서의 흡광이 존재함에 따라 동일한 파장에서의 형광이 관찰되며 특히 450 nm 에서 파란색 계열을 나타내는 강한 형광특성을 가지는 것을 확인할 수 있다.The surface-unmodified carbon nanoparticles have very high stability in water and are dispersed. Since the carboxy functional group and the hydroxyl functional group are abundant on the particle surface, the electric charge of the particles shows about -40 mV. As shown in FIG. 2A, ultraviolet-visible light analysis results show that the absorbance of a typical aromatic structure in the form of sp 2 carbon structure in the vicinity of 230 nm in the case of CD, CD-PEG, and CD-PEG- , And the FA exhibits a typical absorption curve at 283 nm, indicating that FA is effectively bonded to the carbon nanoparticles. The charge of the first used carbon nanoparticles also increases to -12.4 mV and -8.24 mV according to the PEG and FA junctions, suggesting that the charge is used for the covalent bond and the total charge increases. In addition, fluorescence at the same wavelength was observed with the presence of an absorption at around 360 nm, and it can be confirmed that it has a strong fluorescence characteristic showing a blue system at 450 nm.

적외선 분광분석의 경우, 탄소나노입자의 표면개질에 따른 작용기의 존재를 나타내며, 이는 CD, CD-PEG, CD-PEG-FA 각각의 특징을 독립적으로 보여준다 (도 2b). CD의 경우, 1068 cm-1에서의 C-O stretching, 1608 cm-1에서의 C=C stretching, 2848 cm-1과 2925 cm-1에서의 C-H stretching, 그리고 3457 cm-1에서의 넓은 범위의 곡선은 카르복시기 작용기와 히드록시기 작용기의 존재를 나타낸다. CD-PEG의 경우, 1102 cm-1에서 C-O bond의 존재를 나타낼 뿐 아니라, 1340 cm-1과 1594 cm-1에서 새로운 N-H in-plane, C-N stretching을 각각 보여줌으로써 성공적인 표면개질을 시사한다. 마지막으로 FA의 접합에 따른 FA 존재하는 상기 곡선들이 1481 cm-1, 1605 cm-1, 1697 cm-1에서 증가하는 것을 보여줌으로서 CD-PEG-FA 탄소나노입자 유도체들이 성공적으로 형성되었음을 나타낸다.In the case of infrared spectroscopic analysis, the presence of functional groups on the surface modification of carbon nanoparticles shows independent characteristics of each of CD, CD-PEG and CD-PEG-FA (FIG. For CD, CO stretching at 1068 cm -1 , C = C stretching at 1608 cm -1 , CH stretching at 2848 cm -1 and 2925 cm -1 , and a broad range of curves at 3457 cm -1 Indicating the presence of a carboxyl group and a hydroxyl group. In the case of CD-PEG, the presence of CO bond at 1102 cm -1 , as well as new NH in-plane and CN stretching at 1340 cm -1 and 1594 cm -1 , respectively, suggest successful surface modification. Finally, it is shown that the above curves existing at FA due to FA bonding increase at 1481 cm -1 , 1605 cm -1 , and 1697 cm -1 , indicating that CD-PEG-FA carbon nanoparticle derivatives were successfully formed.

투과전자현미경과 원자간력현미경을 통한 탄소나노입자 유도체들의 전체적인 크기와 형태분석에서 볼 수 있듯이, 구형을 가지며 평균적으로 5 nm 정도의 탄소나노입자들의 존재를 확인할 수 있다. 또한 고해상도의 투과전자현미경 분석의 interlayer spacing에서 0.34 nm 을 나타냄으로써 합성된 탄소나노입자가 그래핀 형태의 탄소구조를 가지고 있음을 확인할 수 있다 (도 2c, 도 2d).As shown in the overall size and morphology of the carbon nanoparticle derivatives through the transmission electron microscope and the atomic force microscope, the presence of carbon nanoparticles having a spherical shape and having an average size of about 5 nm can be confirmed. In addition, it is confirmed that carbon nanoparticles synthesized by the high resolution transmission electron microscope analysis exhibit 0.34 nm in the interlayer spacing have a graphene-like carbon structure (FIGS. 2c and 2d).

CD-PEI의 경우, 도 3a에서 보여지는 바와 같이, 자외선-가시광선 분석 결과에서 243 nm 부근에서 sp2 탄소구조 형태의 π → π* 전이를 보여주는 전형적인 방향족구조(aromatic)의 흡광도를 나타내며, 354 nm 부근에서 카르복시기 작용기의 n → π* 전이를 타나내는 흡광곡선을 관찰하였다. 또한 360 nm 부근에서의 흡광이 존재함에 따라 동일한 파장에서의 형광이 관찰되며 특히 450 nm 에서 파란색 계열을 나타내는 강한 형광특성을 가지는 것을 확인할 수 있다. CD-PEI의 경우 PEI의 풍부한 아미노기 작용기의 양전하의 영향으로 약 22 mV의 전체 입자전하를 가진다. In the case of CD-PEI, as shown in FIG. 3A, the absorption spectrum of a typical aromatic structure showing the transition of π → π * in the form of sp 2 carbon structure at around 243 nm in the ultraviolet-visible light analysis, and 354 The extinction curve showing the n → π * transition of the functional group of the carboxyl group was observed in the vicinity of nm. In addition, fluorescence at the same wavelength was observed with the presence of an absorption at around 360 nm, and it can be confirmed that it has a strong fluorescence characteristic showing a blue system at 450 nm. CD-PEI has a total particle charge of about 22 mV due to the positive charge of the rich amino group of PEI.

적외선 분광분석의 경우, 도 2b에서 보여지듯이 3394 cm-1에서 O-H와 N-H 작용기의 존재를 확인할 수 있으며, 1700 cm-1에서의 C=0 stretching, 1576 cm-1에서의 N-H in-plane, 1389 cm-1에서의 C-N stretching을 각각 보여줌으로써 CD-PEI 탄소나노입자유도체의 성공적 합성을 시사한다.In the case of infrared spectroscopic analysis, the presence of OH and NH groups at 3394 cm -1 as shown in FIG. 2b can be confirmed. C stretching at 1700 cm -1 , NH in-plane at 1576 cm -1 , 1389 cm -1 , respectively, suggesting the successful synthesis of CD-PEI carbon nanoparticle derivatives.

투과전자현미경과 원자간력현미경을 통한 탄소나노입자 유도체들의 전체적인 크기와 형태분태 분석에서 볼 수 있듯이, 구형을 가지며 3 ~ 7 nm 정도의 탄소나노입자들의 존재를 확인할 수 있다. 또한 고해상도의 투과전자현미경분석의 interlayer spacing에서 0.21 nm 을 나타냄으로써 합성된 탄소나노입자가 흑연이 가지는 100 탄소구조를 나타냄을 확인할 수 있다 (도 3c, 도 3d). 이상의 분석에서 탄소나노입자 유도체들의 성공적인 표면개질을 판단할 수 있었으며 이후의 실시예에 적용하였다.
As can be seen from the analysis of the overall size and morphology of carbon nanoparticle derivatives through transmission electron microscopy and atomic force microscopy, it is possible to confirm the presence of carbon nanoparticles having a spherical shape of 3 to 7 nm. It is also confirmed that the synthesized carbon nanoparticles exhibit a 100 carbon structure of graphite by showing 0.21 nm in the interlayer spacing of the high-resolution transmission electron microscopic analysis (FIGS. 3C and 3D). In the above analysis, successful surface modification of carbon nanoparticle derivatives was determined and applied to the following examples.

실시예Example 2: 합성된 나노입자의 안정도 비교 분석 2: Comparative analysis of stability of synthesized nanoparticles

도 4에서 보여지는 바와 같이, 완충 용액 내에서의 안정도를 확인하여 주었다. 완충 용액은 1x Phosphate Buffered Saline(PBS)를 사용하였는데, 이는 체내 유체 조성에 유사한 완충 용액으로 실제적인 의료 및 바이오 응용을 위하여 높은 입자 안정성이 요구되는 사항이다. 증류수에 농축되어 분산되어 있는 각각의 나노입자 용액을 10x 농도의 PBS 수용액과 9:1 조성비로 혼합하여 최종 완충용액 농도를 1x 비율로 설정하여 주었다. 나노입자들을 증류수 하 동일 농도에서, 1x PBS 조성으로 변환 1 시간 후, 6 시간 후, 12 시간 후에 각각의 나노입자의 흡광 최대점에서의 흡광을 자외선-가시광선 분광분석기를 통하여 측정하여 준다. 증류수 하 동일 농도에서의 흡광량과 비교하여 상대적으로 분석하여 준 결과, 합성된 대부분의 탄소나노입자 유도체들의 흡광도가 12 시간 경과 후에도 안정적으로 유지됨을 알 수 있었으며, 이로부터 세포, 동물 및 인체 수준에서의 약제학적 유효물질 전달 및 치료 연구에 적합한 수준의 안정성을 보이는 것으로 확인되었다.
As shown in FIG. 4, the stability in the buffer solution was confirmed. The buffer solution used was 1x Phosphate Buffered Saline (PBS), a buffer solution similar to the fluid composition in the body, requiring high particle stability for practical medical and bio-applications. Each nanoparticle solution concentrated and dispersed in distilled water was mixed with a 10x concentration PBS solution at a 9: 1 composition ratio, and the concentration of the final buffer solution was set to 1x. The nanoparticles were measured by ultraviolet-visible spectrophotometry at the maximum concentration of the respective nanoparticles after 1 hour, 6 hours and 12 hours after conversion to 1x PBS composition at the same concentration under distilled water. As a result, it was found that the absorbance of most of the carbon nanoparticle derivatives synthesized was stable even after 12 hours. From this, it was found that the absorbance of the synthesized carbon nanoparticle derivatives was stable at the cell, animal and human level Of the present invention exhibits a level of stability suitable for pharmaceutical effective substance delivery and treatment studies.

실시예Example 3: 합성된  3: Synthesized 탄소나노입자Carbon nanoparticles 유도체로의  As a derivative 광감응제Photo-sensitizer 및 유전자 적재 분석 And gene load analysis

도 5와 도 6에서 보여지는 바와 같이, 각각의 합성된 나노입자의 유효성분의 효과적인 전달 및 작용여부를 분석하기 위하여 CD-PEG-FA, CD-PEI 탄소나노입자 유도체를 이용하여 광감응제인 ZnPc와 핵산의 일종인 siRNA과 pDNA을 적재하고자 하였다. 먼저 ZnPc의 경우, CD-PEG-FA 내부의 방향족구조와 pi-pi 상호작용을 통하여 적재하고자 하였고, 적재 전,후의 자외선-가시광선 흡광분석법을 이용하여 입자를 분석하였다. ZnPc를 적재한 CD-PEG-FA (CD-PEG-FA/ZnPc)의 경우 ZnPc 고유의 흡광곡선이 666 nm 에서 689 nm 로 보다 장파장쪽으로 이동하는 것을 나타냈으며, 이는 적재된 ZnPc와 CD-PEG-FA 사이의 유효공간으로 인하여 particle-in-a-box 형태로 전자의 이동공간의 확장됨에 따른 파장이동을 시시한다 (도 5a). 측정된 흡광 세기를 기준으로, 689 nm 에서의 흡광값과 기존 보고되어있는 666 nm 에서의 흡광계수를 이용한 Beer-Lambert 수식을 통해 계산하여 주었다.
As shown in FIG. 5 and FIG. 6, in order to analyze the effective delivery of the active ingredients of each synthesized nanoparticle, CD-PEG-FA and CD-PEI carbon nanoparticle derivatives were used to measure the photosensitizer ZnPc And siRNA and pDNA, which are a kind of nucleic acid. In the case of ZnPc, the aromatic structure inside the CD-PEG-FA was loaded through the pi-pi interaction, and the particles were analyzed by ultraviolet-visible light absorption analysis before and after loading. In the case of CD-PEG-FA (CD-PEG-FA / ZnPc) loaded with ZnPc, the intrinsic absorption curve of ZnPc migrated from 666 nm to 689 nm toward longer wavelength, indicating that the loaded ZnPc and CD- The wavelength shifts according to the expansion of the electron movement space in the particle-in-a-box form due to the effective space between the FAs (FIG. 5A). The Beer-Lambert equation was used to calculate the absorbance at 689 nm and the absorbance at 666 nm.

A = A = ebcebc

[A: 측정된 [A: Measured 흡광Absorbance 세기, e:  Century, e: 흡광Absorbance 계숙Killing , b: 측정 용기의 경로 길이 (1 , b: path length of measuring container (1 cmcm ), ),

c: 물질의 몰 농도]c: molar concentration of substance]

또한 적재된 ZnPc의 650 nm 부분에서의 고유 형광이 소강되는 것을 볼 때 ZnPc와 CD-PEG-FA 사이의 형광공명에너지전달(FRET) 현상에 의한 형광 소강으로 이는 CD-PEG-FA/ZnPc의 효과적인 형성을 나타낸다 (도 5b). In addition, fluorescence resonance energy transfer (FRET) between ZnPc and CD-PEG-FA induced fluorescence in 650 nm of the loaded ZnPc, suggesting that CD-PEG-FA / ZnPc (Fig. 5B).

siRNA, pDNA과 같은 핵산의 경우, CD-PEI와의 정전기적인력 상호작용을 통하여 적재하고자 하였고, 이는 상기 언급한 CD-PEI의 표면양전하와 핵산의 phosphate backbone의 음전하 간의 인력을 이용하는 것이다. 본 연구진은 녹색형광단백질을 표적 모델로 하여 핵산을 선정하였으며 실시 예의 테이터 상에서 siGFP, pGFP라 표기하였으며 이하에서 siGFP와 pGFP는 각각 siRNA, pDNA를 의미한다. 적재 후의 젤전기영동을 통해 확인하였을 때 siGFP의 경우, 고정된 CD-PEI 농도 대비 증가되는 siGFP의 농도에 따른 이동된 밴드세기가 진해지는 것을 알 수 있었으며, 이를 통해 CD-PEI의 1 μg 당 50 pmol의 siGFP의 적재율을 계산할 수 있었다 (도 6a). pGFP 역시 젤전기영동을 통한 결과에서 볼 수 있듯이 1 μg 의 CD-PEI당 0.5 μg의 pDNA를 적재할 수 있는 것을 확인하였다 (도 6b). 본 발명자는 각각의 탄소나노입자들에 목적에 맞는 유효성분을 성공적으로 적재함으로써 이후 세포, 동물 및 인체 수준에서의 약제학적 유효물질 전달 및 치료 연구에 적합한 수준의 전달체 역할이 가능할 것으로 판단하였다.
In the case of nucleic acids such as siRNA and pDNA, they are intended to be loaded through electrostatic attraction interaction with CD-PEI, which utilizes the attraction between the surface charge of CD-PEI mentioned above and the negative charge of the phosphate backbone of the nucleic acid. We used a green fluorescent protein as a target model and selected nucleic acids. In the data of the example, siGFP and pGFP are denoted as siGFP and pGFP, respectively. It was found through gel electrophoresis after loading that the shifted band intensity of siGFP increased with increasing siGFP concentration relative to the fixed CD-PEI concentration, indicating that 50 μg per 1 μg of CD-PEI The loading rate of pmol siGFP could be calculated (Fig. 6A). pGFP was also confirmed to be capable of loading 0.5 μg of pDNA per 1 μg of CD-PEI as shown in the results of gel electrophoresis (FIG. 6b). The inventors of the present invention have succeeded in successfully loading the respective effective carbon nanoparticles with the desired active ingredients, and thus have succeeded in providing a suitable level of carrier for the study of effective pharmaceutical substance delivery and treatment at the cellular, animal and human levels.

실시예Example 4:  4: 탄소나노입자유도체를Carbon nanoparticle derivatives 이용한  Used siRNAsiRNA 전달 및 보호능력 분석 Analysis of delivery and protection capability

의학 및 약제학에서의 유효성분을 특정질환 부위로 효과적으로 전달하는 것은 전달체로부터의 유효성분의 온전한 적재, 보호, 방출을 의미한다. 본 연구진은 탄소나노입자 유도체를 이용한 siRNA 등의 핵산 전달에서도 이와 같은 의미를 부여하기 위하여 탄소나노입자 유도체의 siRNA 전달 및 보호능력 분석을 실시하였다. 도 6에서 보여지듯이, 효과적인 적재 이후의 보호 및 전달을 확인하기 위하여 heparin polyanion 경쟁반응과 Ribonuclease(RNase) 보호테스트를 진행하였다. 먼저 heparin polyanion 경쟁반응의 경우, 풍부한 음이온성 물질을 제공해 줌으로써 정전기적인력에 의해 형성되어있는 siGFP/CD-PEI의 구조에 영향을 주어 CD-PEI로부터 siGFP의 분리를 유도한다. 젤전기영동에서 볼 수 있듯이 처리해준 heparin의 농도가 증가할수록 siGFP의 농도가 증가하는 것을 확인함으로써 생체환경에서의 효과적으로 방출되어 유효부위로 전달이 가능할 수 있음을 시사한다 (도 6c). Effective delivery of the active ingredient in medicine and pharmacology to a particular disease site implies the complete loading, protection, and release of the active ingredient from the carrier. In order to give the same meaning to nucleic acid transfer such as siRNA using carbon nanoparticle derivatives, we conducted siRNA delivery and protection of carbon nanoparticle derivatives. As shown in FIG. 6, heparin polyanion competition reaction and ribonuclease (RNase) protection test were conducted to confirm protection and transmission after effective loading. First, the heparin polyanion competition reaction affects the structure of siGFP / CD-PEI formed by electrostatic attraction by providing abundant anionic material, which induces the separation of siGFP from CD-PEI. As can be seen from gel electrophoresis, it was confirmed that the concentration of siGFP increased as the concentration of heparin treated increased, suggesting that it could be effectively released in the living environment and transferred to the active site (FIG. 6C).

또한 방출되기 전까지의 온전한 형태로의 보존을 위해서 siGFP를 분해시킬 수 있는 RNase를 처리함으로써 CD-PEI에 적재되어 있는 siGFP의 보호 유무를 분석하였다. 젤전기영동을 통한 분석결과에서 나타나듯이 충분한 heparin과 함께 RNase를 처리한 경우에만 siGFP의 분해를 확인할 수 있었고, heparin을 처리하지 은 siGFP/CD-PEI의 경우 RNase에 의한 siGFP의 분해를 관찰할 수 없었다 (도 6d).For the preservation of intact form until release, siGFP loaded on CD-PEI was analyzed for the protection of siGFP by treatment with RNase capable of degrading siGFP. As shown in the results of gel electrophoresis, the degradation of siGFP was confirmed only when RNase was treated with heparin and heparin-treated siGFP / CD-PEI was degraded by RNase (Fig. 6D).

본 연구진은 탄소나노입자들에 목적에 맞는 유효성분을 성공적으로 적재, 보호, 방출을 종합적으로 확인함으로써 이후 세포, 동물 및 인체 수준에서의 약제학적 유효물질 전달 및 치료 연구에 적합한 수준의 전달체 역할이 가능할 것으로 판단하였다.
We successfully identified, successfully loaded, protected, and released active ingredients in carbon nanoparticles to provide an appropriate level of carrier for subsequent pharmacologically active substance delivery and therapeutic studies at the cellular, animal, and human levels .

실시예Example 5:  5: 탄소나노입자Carbon nanoparticles 유도체들의 생체적합성 분석 Biocompatibility analysis of derivatives

나노입자의 경우 크기,전하,표면구조 등의 여러 미세요인들이 악영향을 미칠 경우 나노입자 자체의 세포독성이 관찰될 수 있으며, 이러한 나노입자의 세포독성은 생물학적 응용에 가장 큰 결격 사유가 될 수 있다. 따라서, 나노입자 기반으로의 약제학적 유효물질 전달을 통한 화학약물치료법 및 광복합 치료법의 치료효율을 비교하기 위해서는 나노입자 자체에서 유래하는 입자농도별 독성정도의 확인이 반드시 요구된다.In the case of nanoparticles, the cytotoxicity of nanoparticles themselves can be observed when various micro factors such as size, charge, and surface structure are adversely affected, and the cytotoxicity of these nanoparticles may be the most disqualified cause for biological applications . Therefore, in order to compare the treatment efficacy of the chemical medicament therapy and the optical composite therapy through the pharmaceutical effective substance transfer on the basis of nanoparticles, it is absolutely required to confirm the degree of toxicity by the particle concentration derived from the nanoparticles themselves.

도 7에서 보여지는 바와 같이, 합성된 탄소나노입자 유도체들의 생체적합성에 대한 검증 실험을 진행하기 위하여 세포모델로써 인간 자궁경부암 세포주인 HeLa와 이에 녹색형광단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)이 지속적으로 과발현되도록 유전자 조작한 enhanced GFP-HeLa (eGFP-HeLa) 세포주, 그리고 혈관 내피 성장 인자(Vescular Endothelial Growth Factor, VEGF)가 과다발현된 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231를 이용한 실험을 진행하였으며, 세포독성 또는 생체적합성 검증에 범용적으로 이용되고 있는 Cell Count Kit-8(CCK-8)을 사용하였다. 먼저 CD-PEG 유도체들의 경우, 평균 10,000개의 HeLa 세포에 대하여 96-well culture plate에 분주하였고, 24시간 정도 후에 세포 분포(cell confluency)가 80~90% 에 이르렀을 때 탄소나노입자 유도체를 농도를 다르게 하여 혈청이 포함됨 세포배지와 함께 12시간 동안 세포에 처리해주었다. 이후, 잔여 나노입자를 1x PBS로 두 차례 가볍게 씻어내어 준 후, 혈청이 제거된 세포배지와 CCK-8를 함께 1시간 동안 추가 처리하여 충분한 세포 생장 및 사멸을 통하여 주황색 색상이 발색되는 것을 확인한 후, 최종적으로 다양한 농도의 나노입자 처리가 HeLa 세포생장에 미치는 세포독성 정도를 확인하기 위하여 CCK-8 분석법에 따른 자외선-가시광선 흡광분석법에 의한 생성물의 흡광도 수치와 세포독성과의 관계도를 비교하였다. 세포 대사를 통하여 수용성 formazane 염이 형성되므로 670 nm 에서 흡광세기를 측정하며, 통계처리를 위하여 각 실험 조건마다 3개의 동일 실험을 수행하여 모든 값들의 평균을 바탕으로 상대적인 세포 생존률을 비교하여 주었다. 도 7a에서 보여지듯이 최대 450 μg/mL에 해당하는 농도의 탄소나노입자 유도체들에서 세포독성이 매우 낮은 것으로 분석되었다.As shown in FIG. 7, in order to verify the biocompatibility of synthesized carbon nanoparticle derivatives, HeLa, a human cervical cancer cell line, and Green Fluorescent Protein (GFP) were continuously overexpressed MDA-MB-231, a human breast cancer cell line that has been overexpressed by a modified GFP-HeLa (eGFP-HeLa) cell line and a Vescular Endothelial Growth Factor (VEGF) Cell Count Kit-8 (CCK-8), which is commonly used for biocompatibility testing, was used. In the case of CD-PEG derivatives, an average of 10,000 HeLa cells were dispensed into a 96-well culture plate, and when cell confluency reached 80-90% after 24 hours, the concentration of the carbon nanoparticle derivative The cells were treated for 12 hours with the cell culture medium containing serum differently. Thereafter, the remaining nanoparticles were rinsed twice with 1 × PBS, and then CCK-8 was further treated with serum-removed cell culture medium for 1 hour. After sufficient cell growth and apoptosis, the orange color was developed , And ultimately the degree of cytotoxicity of HeLa cells on the growth of various concentrations of nanoparticles was compared with that of CCK-8 by ultraviolet-visible light spectrophotometry . Since the water soluble formazane salt is formed through the cell metabolism, the absorption intensity is measured at 670 nm. For the statistical treatment, three identical experiments are performed for each experimental condition, and the relative cell viability is compared based on the average of all the values. As shown in FIG. 7A, the cytotoxicity of carbon nanoparticle derivatives at concentrations up to 450 μg / mL was analyzed to be extremely low.

CD-PEI의 경우 상기 명시한 조건으로 eGFP-HeLa 와 MDA-MB-231 세포에 대해 생체적합성 검증실험을 진행하였다. 기존의 연구들에서 PEI는 높은 양전하를 제공함으로 이 특성을 이용한 유효성분의 전달에 많이 이용되고 있으나, 전체 높은 양전하를 동반한 입자와 세포막의 상호작용에서 독성이 매우 높아 관련연구에 제한이 있었다. 도 7b과 도 7c에서 보여지듯이 CD-PEI의 경우 PEI와 대조적으로 높은 전체 양전하를 유지함에도 불구하고 최대 450 μg/mL에 해당하는 농도의 CD-PEI에서도 세포독성이 매우 낮은 것으로 분석되었다. In the case of CD-PEI, biocompatibility tests were performed on eGFP-HeLa and MDA-MB-231 cells under the above conditions. In previous studies, PEI has been widely used for the delivery of active ingredients using this property because it provides a high positive charge. However, there is a limit to the related studies because of the high toxicity of the interaction between the particles and the cell membrane. As shown in FIGS. 7B and 7C, CD-PEI showed high cytotoxicity even at a concentration of CD-PEI of up to 450 μg / mL, in spite of maintaining high total positive charge in contrast to PEI.

따라서, 본 발명자는 탄소나노입자 유도체들의 세포들에 대한 높은 생체적합성을 확인함으로써 세포, 동물 및 인체 수준에서의 약제학적 유효물질 전달 및 치료 연구에 적합한 수준의 전달체 역할이 가능할 것으로 판단하였다.
Accordingly, the present inventors confirmed that the carbon nanoparticle derivatives have high biocompatibility with cells, and thus, they can play a role of a carrier suitable for pharmaceutical effective substance delivery and therapeutic research at the cellular, animal, and human levels.

실시예Example 6:  6: 탄소나노입자Carbon nanoparticles 유도체들의 세포 내 도입 분석 Analysis of intracellular introduction of derivatives

다음으로, 탄소나노입자 유도체들의 생체적합성과 세포 수준에서의 약제학적 유효물질 전달체로써의 역할을 검증하기 위해서, 합성된 탄소나노입자 유도체들의 세포내 도입 효율을 검증하였다. 탄소나노입자 유도체들은 상기 실시 예에서 언급했듯이 입자자체의 형광을 나타내므로 특정 형광필터(Blue 필터 또는 DAPI필터)를 이용한 형광현미경 관찰을 통해 세포수준에서의 세포내 도입을 확인할 수 있으며, 이는 본 연구진이 합성한 탄소나노입자 유도체들의 바이오이미징으로의 적용 즉, 미용과 의약제학 분야의 진단 및 심미효과에 적용 가능함을 시사한다. Next, in order to examine the biocompatibility of carbon nanoparticle derivatives and their role as a pharmacologically active substance carrier at the cellular level, the efficiency of intracellular introduction of synthesized carbon nanoparticle derivatives was verified. Since the carbon nanoparticle derivatives exhibit fluorescence of the particles themselves as mentioned in the above embodiment, intracellular introduction at the cellular level can be confirmed by observing fluorescence microscopy using a specific fluorescent filter (Blue filter or DAPI filter) Suggesting that the synthesized carbon nanoparticle derivatives can be applied to bioimaging, that is, to diagnostic and aesthetic effects in the field of cosmetics and medicine.

CD-PEG의 경우, 표적 리간드를 접합하여 선택적 질환 치료목적에 목적을 두고자 하였으며 본 연구에서는 엽산(FA)을 이용한 표적성을 부여하고자 하였다. 120,000개의 HeLa 세포주를 4-well glass plate에 분주하고 적당한 농도의 CD-PEG, CD-PEG-FA, CD-PEG-FA/ZnPc를 혈청이 없는 세포배지와 함께 12시간 동안 처리해 준 후 1x PBS로 잔여 물질을 씻어주는 과정을 거치고 혈청이 포함된 새로운 배지로 교체하고 12시간 동안 추가로 세포를 배양하였다. 이 후 358 nm 과 647 nm 에서 형광필터를 가지는 형광현미경으로 각각의 세포를 관찰하였으며 각각은 탄소나노입자의 형광(358 nm, 푸른색), ZnPc의 형광(647 nm, 붉은색)을 나타낸다. 도 8에서 보여지듯이, 표적리간드가 접합된 CD-PEG-FA를 처리해 준 세포에서 탄소나노입자의 강한 푸른 형광이 세포질에서 관찰되었으며 동일한 원리를 적용하여, CD-PEG-FA/ZnPc를 처리해 준 세포에서 탄소나노입자의 형광과 ZnPc의 형광을 모두 세포질에서 관찰할 수 있었다. 반면에 표적 리간드가 접합되지 않은 CD-PEG의 경우에서는 어떠한 형광신호도 관찰되지 않았다. 또한 표적 리간드 FA의 유무에 따른 탄소나노입자 유도체의 세포내 도입을 보다 검증하기 위해서 FA와 FA 수용체 (Folate receptor, FR)와의 상호작용에 따른 세포내 도입을 확인하고자 발현량의 차이가 있는 MDA-MB-231 세포주(FR+)와 A-549 세포주(FR-)를 선택하여 분석하였다. 도 9에서 보여지듯이 CD-PEG-FA/ZnPc를 처리해준 MDA-MB-231 세포주에서만 탄소나노입자 유도체와 ZnPc의 형광이 세포질에서 관찰되었고 표적 리간드가 접합되지 않은 CD-PEG/ZnPc를 처리해준 MDA-MB-231 세포주나 CD-PEG/ZnPc과 CD-PEG-FA/ZnPc를 모두 처리한 A-562 세포주에서는 어떠한 형광도 관찰되지 않았다. 이러한 결과에서 본 연구진이 합성한 CD-PEG의 경우, 표적 리간드를 접합하여 선택적 질환 치료목적에 부합됨을 검증할 수 있었다.In the case of CD-PEG, the target ligand was conjugated to the objective of selective disease treatment. 120,000 HeLa cell lines were plated on a 4-well glass plate and treated with CD-PEG, CD-PEG-FA and CD-PEG-FA / ZnPc for 12 hours with serum- The remaining material was rinsed, replaced with fresh medium containing serum, and cells were further cultured for 12 hours. Each cell was observed by fluorescence microscopy with a fluorescence filter at 358 nm and 647 nm, and fluorescence (358 nm, blue) and fluorescence of ZnPc (647 nm, red), respectively, were observed for carbon nanoparticles. As shown in FIG. 8, strong blue fluorescence of carbon nanoparticles was observed in the cytoplasm in CD-PEG-FA-treated cells to which the target ligand was conjugated, and the cells treated with CD-PEG-FA / ZnPc Both the fluorescence of carbon nanoparticles and the fluorescence of ZnPc were observed in cytoplasm. On the other hand, no fluorescence signal was observed in the case of CD-PEG in which the target ligand was not conjugated. In order to further confirm the intracellular introduction of carbon nanoparticle derivatives with and without the target ligand FA, in order to confirm the intracellular introduction by the interaction of FA and FA receptors (folate receptor, FR), MDA- MB-231 cell line (FR +) and A-549 cell line (FR-) were selected and analyzed. As shown in FIG. 9, only the MDA-MB-231 cell line treated with CD-PEG-FA / ZnPc showed fluorescence of the carbon nanoparticle derivative and ZnPc in the cytoplasm and MDA treated with CD- PEG / ZnPc without target ligand conjugation No fluorescence was observed in the MB-231 cell line or in the A-562 cell line treated with both CD-PEG / ZnPc and CD-PEG-FA / ZnPc. These results demonstrate that CD-PEG synthesized by the present inventors can be conjugated with the target ligand to meet the purpose of selective disease treatment.

CD-PEI의 경우, CD-PEI 표면의 PEI에 의한 세포내 도입이 촉진될 것이라 예상하였으며, 또한 이전의 연구들에서 PEI는 endocytosis를 통해 세포 내 endosome으로 들어가고, 이후 endosome 내의 낮은 pH에 의한 아미노기 작용기의 protonation 현상에 의해 endosome 내부로 물이 유입되어 endosome이 파괴되는 양성자 스펀지효과(Proton sponge effect)를 통해 세포질로 방출이 되는 것으로 알려져 있다(Boussif 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995, 92, 7297; Fischer 등, Pharm. Res. 1999, 16, 1273). 본 연구진은 CD-PEI가 유효물질인 핵산을 올바로 적재한 상태로 세포내 도입 후 세포질로의 방출까지의 과정을 관찰하고자 GFP 발현을 억제시키는 siRNA에 형광염료인 Cy5를 접합시켜 Cy5-siGFP/CD-PEI를 형성하였고 이를 eGFP-HeLa 세포주에 처리하였다. 120,000개의 eGFP-HeLa 세포주를 4-well glass plate에 분주하고 적당한 농도의 Cy5-siGFP/CD-PEI를 혈청이 없는 세포배지와 함께 12시간 동안 처리해 준 후 1x PBS로 잔여 물질을 씻어주는 과정을 거치고 혈청이 포함된 새로운 배지로 교체하고 12시간 동안 세포성장을 추가로 진행시켰다. 이 후 358 nm, 520 nm, 647 nm 에서 형광필터를 가지는 형광현미경으로 각각의 세포를 관찰하였으며 각각은 탄소나노입자의 형광(373 nm, 푸른색), GFP발현 세포의 형광(521 nm, 녹색), Cy5의 형광(650 nm, 붉은색)을 나타낸다. 도 10a에서 보여지듯이, Cy5-siGFP/CD-PEI를 처리해 준 세포에서 탄소입자의 형광과 Cy5의 형광을 모두 세포질에서 관찰할 수 있었으며, GFP발현이 유지되고 있는 세포의 형광 또한 관찰하였다. 또한 주사전자현미경을 통해서 분석한 결과, 세포핵 근처에서 탄소나노입자 유도체의 존재가 확인되었으며, 일부는 endosome 내에 포함되어 있는 것을 볼 수 있었다 (도 10b). 상기의 결과에서 탄소나노입자가 효과적으로 siRNA을 내부로 전달할 뿐만 아니라, endosome을 벗어난 이후 siRNA을 방출함으로써 GFP 발현이 억제되었음을 확인하였다. In the case of CD-PEI, it was expected that the intracellular introduction of PEI on the surface of CD-PEI would be accelerated. In addition, in previous studies, PEI entered into the intracellular endosome through endocytosis, (Boussif et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 1995, Proton sponge effect), which is caused by protonation of water into the endosome and destruction of endosome (Proton Sponge effect) 92, 7297; Fischer et al., Pharm. Res. 1999, 16, 1273). In order to observe the progression of cytoplasmic release after the intracellular introduction of CD-PEI into the cell, the cytoplasmic Cy5-siGFP / CD -PEI was formed and treated with eGFP-HeLa cell line. 120,000 eGFP-HeLa cell lines were plated on a 4-well glass plate, treated with appropriate concentrations of Cy5-siGFP / CD-PEI for 12 hours with serum-free cell culture medium and washed with 1x PBS The medium was replaced with fresh medium containing serum and further cell growth was allowed to proceed for 12 hours. Each cell was observed by fluorescence microscopy with a fluorescence filter at 358 nm, 520 nm, and 647 nm. Fluorescence (373 nm, blue), fluorescence of GFP-expressing cells (521 nm, green) , And Cy5 fluorescence (650 nm, red). As shown in FIG. 10A, in the cells treated with Cy5-siGFP / CD-PEI, the fluorescence of the carbon particles and the fluorescence of Cy5 were both observed in the cytoplasm and the fluorescence of the cells in which GFP expression was maintained was also observed. In addition, analysis by a scanning electron microscope revealed that carbon nanoparticle derivatives were present near the nucleus, and some of them were contained in the endosome (FIG. 10B). From the above results, it was confirmed that the carbon nanoparticles effectively inhibited GFP expression by not only transferring the siRNA into the inside, but also releasing the siRNA after leaving the endosome.

본 연구진은 탄소나노입자 유도체들의 세포들에 대한 표적지향성 선택적 세포 내 도입과 유효성분을 효과적으로 전달함을 형광이미지를 통해 확인함으로써 이후 세포, 동물 및 인체 수준에서의 약제학적 유효물질 전달 및 치료 연구에 적합한 수준의 전달체 역할이 가능할 것으로 판단하였다.
Our researchers confirmed that the carbon-nanoparticle derivatives efficiently target the target-directed intracellular introduction and effective delivery of the cells to the cells, It was considered that a proper level of the carrier role would be possible.

실시예Example 7:  7: CDCD -- PEGPEG -- FAFA // ZnPcZnPc 의 of 광감응Optical response 효과 검증 및 인간 자궁경부암 세포주에 대한  Effectiveness and validity for human cervical cancer cell lines 광역동치료Photodynamic therapy 분석 analysis

도 11에서 보여지는 바와 같이, 약제학적 유효분자의 전달 및 치료를 보완할 수 있는 근적외선 조사를 통한 광감응에 따른 활성산소 생성효과 및 광역동치료 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 우선적으로, 용액 상에서 탄소나노입자를 포함한 후보군들의 1x PBS 완충 용액 상에서의 근적외선 조사에 의한 활성산소 발생 여부를 확인하기 위하여, ZnPc를 대조군으로 실험을 진행하였다. 근적외선 조사가 이루어졌을 때 ZnPc에서 주변의 산소로의 에너지 전이에 따른 활성산소 발생이 이루어지며 이러한 활성산소 발생여부는 singlet oxygen sensor green(SOSG) 시약을 사용하여 확인하였다. SOSG가 활성산소와 반응하여 만들어진 생성물을 통해 525 nm 에서의 형광이 증가하는 점을 이용하였다. 도 11e에서 보여지듯이 이들 후보군들이 포함된 용액에 660 nm의 근적외선 레이저를 30 mW/cm2의 세기로 조사해 주었을때, ZnPc에 의해 상당한 양의 활성산소를 발생시키는 것을 관찰할 수 있었으며, 합성된 탄소나노입자에 적재된 ZnPc는 세포구성요소를 넣어줌으로써 활성산소의 발생이 촉진됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 ZnPc가 올바르게 탄소나노입자에 적재되어 있는 경우 분자간 에너지 전이를 통해 ZnPc의 활성산소 발생이 저해되고 세포 구성요소와의 상호작용에 따른 탄소나노입자로부터 ZnPc의 방출 시에만 빛에 감응하여 활성산소를 발생시키는 것을 확인할 수 있었으며, 본 연구진이 합성한 탄소나노입자가 생물학적 환경에서 광감응전달체로써 효과적으로 적용될 수 있음을 시사한다. 이러한 결과를 바탕으로 표적 리간드를 접합하여 선택적 질환 치료목적에 목적을 두고자 120,000개의 HeLa 세포주를 12-well culture plate에 분주하고 적당한 농도의 CD-PEG, CD-PEG-FA, CD-PEG-FA/ZnPc를 혈청이 없는 세포배지와 함께 12시간 동안 처리해 준 후 1x PBS로 잔여 물질을 씻어주는 과정을 거치고 혈청이 포함된 새로운 배지로 교체하고 각각의 well에 660 nm의 근적외선 레이저를 30 mW/cm2의 세기로 10분 동안 조사하여 주었다. 그 후 4 시간 동안의 추가적인 세포 배양을 5% CO2, 37℃ 조건의 incubator를 이용하여 진행한 후 200 μL의 Live/Dead 염색약을 처리하여 주었다(해당 Live/Dead 염색 용액은 2 μM의 calcein AM과 2 μM의 EthiD-1의 멸균 PBS 조성이다). 염색을 위해 30분 간을 incubator에서 추가 배양한 후, 이를 형광 현미경을 통하여 관찰하여 주었으며 사용한 형광필터는 520 nm (녹색), 630 nm (붉은색) 이다. 도 11a부터 도 11d에서 보여지듯이, 결과적으로 근적외선 조사가 이루어진 영역에서는 광역동 효과에 의한 활성산소 생성에 따라 암세포 사멸이 유도되어 Live/Dead 염색 결과 붉은 색으로 염색된 세포들의 영역이 전체적으로 관찰되었으며, 근적외선 조사가 이루지지 않은 영역에서는 암세포들의 생존이 Live/Dead 염색을 통해 녹색으로 염색된 결과를 형광 현미경 이미지를 통해서도 확인할 수 있었다. 앞서 시험관 수준의 용액 상에서의 활성산소 발생 결과와, 실제적인 광역동 치료를 위한 암세포를 대상으로 한 근적외선 기반 광역동 치료효과 확인 실험을 통하여, 해당 틴소나노입자 유도체를 이용한 광감응제 전달을 통하여 표적지향적인 선택적 전달에 따라 약제학적 유효물질 전달뿐 아닌 광감응 치료와의 상호 보완 복합 치료법에 적합한 나노입자임을 세포 수준에서 확연히 검증할 수 있었다. As shown in FIG. 11, experiments were carried out to confirm the effect of photo-sensitization through near-infrared irradiation and the effect of photodynamic therapy, which can complement the delivery and treatment of pharmacologically active molecules. Firstly, ZnPc was used as a control group in order to confirm whether the candidate groups including the carbon nanoparticles in solution generated free radicals by irradiation with near infrared light in 1x PBS buffer solution. When near-infrared irradiation was performed, active oxygen generation was caused by energy transfer from ZnPc to the surrounding oxygen. The generation of active oxygen was confirmed by using a singlet oxygen sensor green (SOSG) reagent. We used the fact that SOSG increased fluorescence at 525 nm through the product formed by reaction with reactive oxygen species. As shown in FIG. 11E, when a 660 nm near-infrared laser was irradiated to the solution containing these candidate groups at an intensity of 30 mW / cm 2 , it was observed that a significant amount of reactive oxygen was generated by ZnPc, ZnPc loaded on the nanoparticles was found to accelerate the generation of active oxygen by adding cellular components. These results indicate that when ZnPc is properly loaded on carbon nanoparticles, the active oxygen evolution of ZnPc is inhibited by the intermolecular energy transfer and only when ZnPc is released from the carbon nanoparticles due to the interaction with the cell components, And that the carbon nanoparticles synthesized by the present inventors can be effectively applied as a photo-sensitization vehicle in a biological environment. Based on these results, 120,000 HeLa cell lines were seeded onto 12-well culture plates with the target ligand conjugated to the objective of selective disease treatment, and CD-PEG, CD-PEG-FA, CD-PEG-FA / ZnPc was treated with serum-free cell culture medium for 12 hours, then washed with 1 × PBS and replaced with fresh medium containing serum. A 660-nm near-infrared laser was applied to each well at 30 mW / cm 2 for 10 minutes. After incubation for 4 hours, the cells were incubated in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C and treated with 200 μL of Live / Dead dye (the corresponding Live / Dead dye solution was incubated with 2 μM calcein AM 2 < / RTI > uM EthiD-1 in sterile PBS). After incubation for 30 min in an incubator, it was observed by fluorescence microscope. The fluorescence filter used was 520 nm (green) and 630 nm (red). As shown in FIGS. 11A to 11D, in the region where the near infrared ray was irradiated, cancerous cell death was induced according to the generation of active oxygen by the wide dynamic effect, and the region of red stained cells was observed as a result of Live / Fluorescence microscopy images of the survival of cancer cells stained green by Live / Dead staining were also confirmed in the area without near infrared irradiation. Based on the result of active oxygen generation in the solution level at the in vitro level and the experiment for confirming the effect of the near-infrared-based photodynamic therapy on the cancer cells for the actual photodynamic therapy, the target is detected through the photosensitizer delivery using the corresponding tin nano- Based on selective delivery, it was verified that the nanoparticles were suitable for the complex therapeutic method complementary to the photodynamic therapy as well as the pharmaceutical active substance delivery at the cellular level.

본 발명자는 상기 세포 수준에서의 결과를 토대로 동물 수준에서의 약제학적 유효물질 전달 및 치료 연구에 적합한 수준의 전달체 역할이 가능함을 검증하고자, 마우스(쥐)를 실험대상으로 하였으며, Balb/c nude 마우스(male)에 HeLa 세포를 심어 xenograft 종양을 성장시켜 표적지향성에 따른 광감응치료 효과를 관찰하였다. 멸균된 1x PBS에 6,000,000개의 HeLa를 분산시켜 마우스에 피하투여하고 70 mm3까지 종양이 성장하였을 때 CD-PEG, CD-PEG-FA, CD-PEG-FA/ZnPc을 마우스의 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 도 12a부터 도 12c에서 보여지듯이 CD-PEG-FA/ZnPc를 투여한 마우스에서 종양부분에 ZnPc의 강한 형광신호를 관찰할 수 있었고, 추가적으로 마우스를 희생시켜 해부하여 내부 장기들을 통하여 조사해본 결과, 형광신호가 오직 종양에서만 특이적으로 강하게 유지되는 것을 확인하였다. 상기 결과는 동물 수준에서 탄소나노입자의 표적지향성을 입증하는 것이며, 진단 기법으로의 응용에 있어서 형광이미징을 통한 표적지향형 탄소나노입자 유도체의 추적확인이 충분히 가능하다는 것을 시사한다.The present inventors used mice (rats) as an experimental subject to verify that it is possible to play a role as a carrier suitable for pharmaceutical effective substance delivery and therapeutic studies at the animal level based on the results at the cellular level. Balb / c nude mice (HeLa cells) were grown on xenograft tumors to observe the effect of the photosensitizing treatment according to the target orientation. CD-PEG-FA and CD-PEG-FA / ZnPc were administered via the tail vein of the mice when the tumors grew to 70 mm 3 , and 6,000,000 HeLa were dispersed in sterile 1x PBS. Respectively. As shown in FIGS. 12A to 12C, strong fluorescence signals of ZnPc were observed in the tumor portion of the mouse treated with CD-PEG-FA / ZnPc. Furthermore, when mice were sacrificed and examined through internal organs, Confirming that the signal was only specifically and strongly maintained in the tumor. These results demonstrate the target orientation of the carbon nanoparticles at the animal level, suggesting that tracking of the target-oriented carbon nanoparticle derivatives through fluorescence imaging is sufficiently feasible in applications as diagnostic techniques.

다음으로 탄노나노입자 유도체의 광역동치료효과를 검증하고자, 멸균된 1x PBS에 6,000,000개의 HeLa를 분산시켜 마우스에 피하투여하고 70 mm3까지 종양이 성장하였을 때, CD-PEG, CD-PEG-FA, CD-PEG-FA/ZnPc을 마우스의 꼬리 정맥을 통해 투여한 후 각각의 종양에 660 nm의 근적외선 레이저를 0.3 W/cm2의 세기로 20분 동안 조사하였다. 도 13a와 도 13b에서 보여지듯이 CD-PEG-FA/ZnPc를 투여한 마우스에서 종양성장 억제효과를 볼 수 있었지만, 레이저를 조사해주지 않거나 CD-PEG/ZnPc, CD-PEG-FA 를 처리해준 마우스에서는 종양성장 억제효과가 나타나지 않았다. 상기 동물실험결과는 세포수준에서 결과에 상응하는 놀라운 결과로써 동물수준에서도 탄소나노입자의 표적지향성이 입증되며, 진단 기법으로의 응용에 있어서 형광이미징을 통한 표적지향형 탄소나노입자 유도체의 추적확인이 충분히 가능하다는 것을 시사할 뿐만 아니라, 틴소나노입자 유도체를 이용한 광감응제 전달을 통하여 표적지향적인 선택적 전달에 따라 약제학적 유효물질 전달 및/또는 광감응 치료와의 상호보완 복합치료법에 적합한 나노입자임을 나타낸다.
Next, in order to examine the effect of the tandem nanoparticle derivatives on the photodynamic therapy, 6,000,000 HeLa were dispersed in sterilized 1 × PBS and subcutaneously injected into mice. When tumors were grown up to 70 mm 3 , CD-PEG, CD-PEG-FA , CD-PEG-FA / ZnPc were administered via the tail vein of each mouse, and each tumor was irradiated with a 660 nm near-infrared laser at an intensity of 0.3 W / cm 2 for 20 minutes. As shown in FIGS. 13A and 13B, in the mice treated with CD-PEG-FA / ZnPc, tumor growth was inhibited. However, in mice treated without laser irradiation or treated with CD-PEG / ZnPc and CD-PEG-FA Tumor growth inhibitory effect was not observed. The results of these animal experiments demonstrate the target orientation of the carbon nanoparticles at the animal level as an astonishing result corresponding to the results at the cellular level and it is sufficient to trace the target-oriented carbon nanoparticle derivatives through fluorescence imaging It is also suggested that this nanoparticle is suitable for the combined therapy with the pharmaceutical active substance delivery and / or photodynamic therapy according to the targeted selective delivery through the photosensitizer delivery using the Tinso nanoparticle derivatives .

실시예Example 8: 인간 세포 수준에서의  8: At the human cell level CDCD -- PEIPEI 를 이용한 핵산전달의 유효성 검증Validation of nucleic acid delivery using

다음으로, 본 발명자는 CD-PEI가 유효물질인 핵산 및/또는 리보핵산을 올바로 적재한 상태로 세포 내로 도입되어 세포질로 유효물질을 효과적으로 방출함으로써 특정 단백질의 발현을 감소시키는지를 검증하고자 하였다. 먼저 GFP 발현을 억제시키는 siRNA(siGFP)를 후보군으로 하여 siGFP/CD-PEI를 형성하였고 이를 eGFP-HeLa 세포주에 처리하였다. 30,000개의 eGFP-HeLa 세포주를 12-well culture plate에 분주하고 50 nM 농도의 siGFP/CD-PEI를 혈청이 없는 세포배지와 함께 12시간 동안 처리해 준 후 1x PBS로 잔여 물질을 씻어주는 과정을 거치고 혈청이 포함된 새로운 배지로 교체하고 24시간 동안 추가로 세포를 배양하였다. 이 후 520 nm에서 형광필터를 가지는 형광현미경으로 각각의 세포를 관찰하였으며 이는 GFP발현 세포의 형광(521 nm, 녹색)을 나타낸다. 도 14a에서 보여지듯이, 상용되고 있는 리포펙타민(Lipo)이나 PEI를 이용한 siGFP의 전달보다 CD-PEI를 이용한 siGFP의 전달의 경우에서 GFP가 발현된 세포의 수가 적은 것을 관찰할 수 있었다. 형광현미경의 결과를 뒷받침하기 위해서 동일한 실험군을 유세포분석기를 통해 GFP 발현된 세포수를 정량하고 형광의 상대적인 세기도 분석하였다. 도 14b와 도 14c에서 보여지듯이, CD-PEI를 이용한 GFP-특이적 siRNA(siGFP)의 전달에서 약 70%의 GFP 발현억제 효율을 얻을 수 있었으며 Lipo, PEI 대비 높은 생체적합성과 함께 월등한 억제효과를 나타내었다. 상용되는 Lipo는 높은 유전자 전달효율에도 불구하고 조성물 자체가 가지는 높은 독성으로 인해 전달체로 사용상의 제한이 있으며, 본 연구진이 개발한 CD-PEI의 경우 높은 생체적합성을 나타내므로 Lipo를 충분히 대체할 수 있는 물질임을 시사한다. Next, the present inventors tried to verify whether CD-PEI reduces the expression of a specific protein by efficiently releasing an effective substance into the cell, which is introduced into a cell with the nucleic acid and / or ribonucleic acid being an effective substance loaded correctly. First, siGFP / CD-PEI was formed by using siRNA (siGFP) that inhibited GFP expression and then treated with eGFP-HeLa cell line. 30,000 eGFP-HeLa cell lines were plated on a 12-well culture plate and treated with 50 nM siGFP / CD-PEI for 12 hours with serum-free cell culture medium. After washing the remaining material with 1x PBS, , And cells were further cultured for 24 hours. Each cell was then observed with a fluorescence microscope having a fluorescence filter at 520 nm, indicating fluorescence (521 nm, green) of GFP-expressing cells. As shown in FIG. 14A, it was observed that the number of GFP-expressing cells was smaller in the case of siGFP transfer using CD-PEI than in the case of siPFP using lipofectamine (Lipo) or PEI, which is commonly used. To support the results of fluorescence microscopy, the number of GFP-expressing cells was quantitated by flow cytometry in the same experimental group and the relative intensity of fluorescence was also analyzed. As shown in FIGS. 14B and 14C, GFP-specific siRNA (siGFP) delivery using CD-PEI showed about 70% inhibition of GFP expression and superior biocompatibility with Lipo and PEI, Respectively. Despite the high gene transfer efficiency, the commercially available Lipo has a limitation in its use as a carrier due to the high toxicity of the composition itself, and CD-PEI developed by the present inventor shows high biocompatibility, It is a substance.

또한 도 15에서 보여지듯이, 탄소나노입자를 유전자 전달체로 활용하여 VEGF 발현을 억제하는 siRNA(siVEGF)의 전달을 통해 VEGF가 과다발현된 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231에 대한 VEGF 발현억제 유무를 분석해 보았다. 30,000개의 MDA-MB-231 세포주를 12-well culture plate에 분주하고 50 nM 농도의 siVEGF/CD-PEI를 혈청이 없는 세포배지와 함께 12시간 동안 처리해 준 후 1x PBS로 잔여 물질을 씻어주는 과정을 거치고 혈청이 포함된 새로운 배지로 교체하고 24시간 동안 추가로 배양하였다. 이후 total RNA isolation, cDNA 합성, PCR을 통해 VEGF의 mRNA을 얻어낸 후, 젤전기영동을 통해 그 발현량을 비교하였다. 상기 도 14의 결과와 유사하게, VEGF를 특이적으로 표적하는 siRNA(siVEGF)를 전달할 경우에서도 CD-PEI의 핵산 및/또는 리보핵산 전달 우수성을 확인할 수 있었다. In addition, as shown in FIG. 15, the inhibition of VEGF expression on human breast cancer cell line MDA-MB-231, which overexpresses VEGF through the transfer of siRNA (siVEGF) inhibiting VEGF expression using carbon nanoparticles as a gene carrier, saw. 30,000 MDA-MB-231 cell lines were plated on 12-well culture plates and treated with 50 nM siVEGF / CD-PEI for 12 hours with serum-free cell culture medium and washed with 1x PBS. And replaced with fresh medium containing serum and further cultured for 24 hours. Then, VEGF mRNA was obtained by total RNA isolation, cDNA synthesis, and PCR, and the expression levels of VEGF mRNA were compared by gel electrophoresis. Similar to the results shown in FIG. 14, even when siRNA (siVEGF) specifically targeting VEGF was delivered, the excellence of nucleic acid and / or ribonucleic acid delivery of CD-PEI was confirmed.

도 16에서 보여지는 바와 같이, siRNA 이외에 다른 종류의 핵산인 plasmid DNA(pDNA)를 전달하여 그 실효성을 검증하고자 하였다. pDNA 전달의 경우, 상기의 siRNA 전달(세포질 내 도입)의 경우와 달리 DNA가 세포 핵내로 도입이 되어야만 도입된 DNA가 분자생물학적으로 증폭 가능하기 때문에 DNA를 세포핵까지 전달할 수 있는 전달체의 개발이 매우 중요하다. 이에 본 발명자는 합성된 탄소나노입자 유도체가 상기 목적에 부합됨을 검증하고자 세포수준에서 실험을 진행하였으며, 통상의 GFP 발현을 유도하는 plasmid DNA(pGFP)를 전달하고자 하였다. 30,000개의 HeLa 세포주를 12-well culture plate에 분주하고 pGFP/CD-PEI를 혈청이 없는 세포배지와 함께 12시간 동안 처리한 후 1x PBS로 잔여 물질을 씻어주었고 혈청이 포함된 새로운 배지로 교체하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 520 nm에서 형광필터를 가지는 형광현미경으로 각각의 세포를 관찰하였으며 이는 GFP발현 세포의 형광(521 nm, 녹색)을 나타낸다. 도 16에서 보여지듯이, 상용되고 있는 Lipo을 이용한 pGFP의 전달보다 CD-PEI를 이용한 pGFP의 전달의 경우에서, GFP를 발현하는 세포 수가 많은 것을 관찰할 수 있었다(도 16a). 형광현미경의 결과를 뒷받침하기 위해서 동일한 실험군을 유세포분석기를 통해 GFP 발현된 세포수를 정량하였으며 형광의 상대적인 세기도 분석하였다(도 16b). 상기 유세포분석 결과를 정량화한 결과에서 CD-PEI를 이용한 pDNA의 전달의 경우에 약 50% 이상의 GFP 발현 효율을 얻을 수 있었으며, Lipo 대비 높은 생체적합성과 함께 월등한 GFP 발현효과를 나타내었다(도 16c). 상용되는 Lipo는 그 높은 효율에도 불구하고 자체의 높은 독성을 인해 제한이 있으며 본 연구진이 개발한 CD-PEI의 경우 높은 생체적합성을 나타내므로 Lipo를 충분히 대체할 수 있는 물질임을 시사한다.As shown in Fig. 16, plasmid DNA (pDNA), which is a kind of nucleic acid other than siRNA, was transferred to verify its effectiveness. In the case of pDNA delivery, unlike the case of siRNA delivery (intracellular introduction), the introduction of DNA into the cell nucleus requires molecular biologically amplification of the introduced DNA, so development of a carrier capable of delivering DNA to the nucleus is very important Do. Accordingly, the present inventors conducted experiments at the cell level to verify that the synthesized carbon nanoparticle derivatives meet the above-mentioned purpose and tried to deliver plasmid DNA (pGFP) which induces normal GFP expression. 30,000 HeLa cell lines were plated on a 12-well culture plate and pGFP / CD-PEI was treated with serum-free cell culture medium for 12 hours. The remaining material was washed with 1x PBS and replaced with a fresh medium containing serum Lt; / RTI > Each cell was then observed with a fluorescence microscope having a fluorescence filter at 520 nm, indicating fluorescence (521 nm, green) of GFP-expressing cells. As shown in FIG. 16, it was observed that the number of GFP-expressing cells was larger in the case of pGFP transfer using CD-PEI than in the case of using pGFP using a commercially available Lipo (FIG. 16A). To support the results of fluorescence microscopy, the number of GFP-expressing cells was determined by flow cytometry in the same experimental group, and the relative intensity of fluorescence was also analyzed (Fig. 16B). As a result of quantifying the flow cytometry results, about 50% or more GFP expression efficiency was obtained in the case of transferring pDNA using CD-PEI, and superior biocompatibility with Lipo showed superior GFP expression effect (FIG. 16C ). The commercial Lipo is limited due to its high toxicity despite its high efficiency, and it suggests that CD-PEI developed by this researcher shows high biocompatibility and is a sufficient substitute for Lipo.

본 연구진은 상기 결과로부터 탄소나노입자 유도체를 이용하여 목적에 맞는 유효성분을 성공적으로 전달함을 종합적으로 확인함으로써, 세포, 동물수준에서의 약제학적 생리활성물질의 전달을 통한 치료 및/또는 진단 연구에 적합한 수준의 전달체 역할이 가능할 것으로 판단하였다.
Based on the above results, the present inventors confirmed that a carbon nanoparticle derivative can be used to successfully deliver an effective ingredient to a target, thereby enabling a therapeutic and / or diagnostic research on the delivery of a pharmacologically active substance at the cellular and animal level It is possible to play a role as a carrier of the appropriate level.

결론적으로, 본 연구는 다음과 같은 의미를 갖는다. 본 발명은 생체적합한 탄소나노입자 유도체의 합성은 기존의 방법을 보다 간단하게 개선하여 간편할 뿐만 아니라 높은 수율로 최종 산물을 얻을 수 있는 합성 방법론을 제시하였다. 무엇보다 흥미롭고 가치있는 점은, 탄소나노입자 유도체의 표면에 표적 리간드를 도입함으로써 목적에 따라 선택적인 적용이 가능하며, 입자 내부에 유효성분을 적재함으로서 추가적인 효과를 얻을 수 있다는 것이다. 또한 분자량을 달리한 PEI의 사용으로 높은 생체적합성 및 고효율의 생리활성물질 전달체를 매우 간단한 방법으로 합성이 가능하다는 것이다. 이는 기존의 생접합 기술에서 요구되던 화학물질을 이용한 표면 개질/처리 후 단계적인 접합으로 요구되던 경제적, 노동적인 장애를 줄여, 단 한번의 단계에서 간단하게 합성을 가능케함으로써 기존의 단점을 획기적으로 극복하였다고 할 수 있다. 이러한 방식의 접근법은 본 연구진에 의해 보고되는 약제학적 유효분자 전달 및 광감응성 복합 치료의 응용 이외에도 수 많은 분야에 적용이 가능하다. 실제적인 약제학적 유효성분의 전달을 통한 화학적 치료 가능성을 내포하는 ZnPc을 적재하여 근적외선 레이저 조사에 기반한 광감응복합치료 가능성의 검증을 위해 수행한 인간 자궁경부암 세포주 HeLa의 암세포 사멸 관련 연구결과를 바탕으로, 약제학적 조성물에 대한 우수한 전달 효율과 함께 조사시키는 근적외선 레이저의 세기 및 조사시간의 세밀한 조절을 바탕으로 순수한 광응성 광역동치료 및 화학적-광복합치료에서의 국소부위 한정치료 기법 역시 제시하고 있다. 아울러 CD-PEI의 높은 유전자전달 효율성을 바탕으로 탄소나노입자의 형광에 의한 생체 내에서의 바이오이미징 진단법과 특정 질병을 표적치료할 수 있는 복합적 접근법을 제시하고 있다.
In conclusion, this study has the following meaning. The synthesis of biocompatible carbon nanoparticle derivatives of the present invention has been simplified to simplify the conventional method, and a synthetic methodology for obtaining final products with a high yield has been proposed. What is most interesting and valuable is that by introducing a target ligand to the surface of the carbon nanoparticle derivative, it can be selectively applied depending on the purpose, and an additional effect can be obtained by loading the active ingredient into the particle. In addition, the use of PEI with different molecular weights makes it possible to synthesize highly biocompatible and highly efficient biologically active substance transporters in a very simple manner. This reduces the economic and labor barriers required by stepwise joining after surface modification / treatment using chemicals, which is required in existing bio-bonding technology, and enables simple synthesis in a single step, dramatically overcoming the existing disadvantages . This approach can be applied to many fields as well as the application of the pharmaceutical effective molecule transfer and the photoreactive combination therapy reported by the present inventors. Based on the results of studies on cancer cell death of human cervical cancer cell line HeLa, which was carried out to verify the possibility of photoreactive combination therapy based on near-infrared laser irradiation by loading ZnPc, which implies the possibility of chemical treatment through practical medicinal active ingredient delivery Based on fine control of intensity and irradiation time of near infrared ray laser irradiated with excellent delivery efficiency to pharmaceutical composition, it also suggests a technique of localized region limited treatment in pure photoreactive photodynamic therapy and chemo-optic combination treatment. In addition, based on the high gene transfer efficiency of CD-PEI, the method of bioimaging in vivo by fluorescence of carbon nanoparticles and a complex approach to target specific diseases are presented.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현 예 및 실시 예를 상세히 설명한다.
그러나 본원은 여러가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현 예 및 실시 예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서 어떤 부재가 다른 부재 “상에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐만 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방비하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, “A 및/또는 B”의 기재는, “A 또는 B, 또는 A 및 B”를 의미한다.Hereinafter, embodiments and examples of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings, which will be readily apparent to those skilled in the art to which the present invention pertains.
The present invention may, however, be embodied in many different forms and should not be construed as limited to the embodiments and examples described herein. In order to clearly illustrate the present invention, parts not related to the description are omitted, and similar parts are denoted by like reference characters throughout the specification.
When a member is referred to as being " on " another member throughout the specification, this includes not only when a member is in contact with another member, but also when another member exists between the two members.
Throughout this specification, when an element is referred to as " including " an element, it is understood that the element may include other elements as well, without departing from the other elements unless specifically stated otherwise. The terms " about "," substantially ", etc. used to the extent that they are used throughout the specification are intended to be taken to mean the approximation of the manufacturing and material tolerances inherent in the stated sense, Accurate or absolute numbers are used to help prevent unauthorized exploitation by unauthorized intruders of the referenced disclosure. The word " step (or step) " or " step " used to the extent that it is used throughout the specification does not mean " step for.
Throughout this specification, the term " combination thereof " included in the expression of the machine form means one or more combinations or combinations selected from the group consisting of the constituents described in the expression of the machine form, And the like.
Throughout this specification, the description of "A and / or B" means "A or B, or A and B".

Claims (28)

평균 직경이 2 nm 이상 내지 20 nm 이하인 탄소나노입자, 및 상기 탄소나노입자의 표면을 PEI 또는 PEG로 개질하여 표면에 결합된 물질, 태그(tag), 및/또는 리간드를 포함하는 생리활성물질 전달용 조성물.
Carbon nanoparticles having an average diameter of 2 nm or more to 20 nm or less and a physiologically active substance containing a substance, a tag, and / or a ligand bound to the surface by modifying the surface of the carbon nanoparticle with PEI or PEG / RTI >
제 1항에 있어서,
상기 생리활성 물질은 탄소나노입자의 표면에 결합된 miRNA, siRNA, DNA, peptide, protein, DNase, RNase, proteinase, kinase, polymerase, recombinase, inhibitor, agonist, antagonist, small molecule, 또는 천연물으로부터 선택된 것을 포함하는 것인, 생리활성물질 전달용 조성물.
The method according to claim 1,
The physiologically active substance may be selected from miRNA, siRNA, DNA, peptide, protein, DNase, RNase, proteinase, kinase, polymerase, recombinase, inhibitor, agonist, antagonist, small molecule or natural substance bound to the surface of carbon nanoparticles Wherein the physiologically active substance is a physiologically active substance.
제 1항에 있어서,
상기 생리활성물질의 태그(tag)에 특이적으로 결합하는 물질 또는 리간드는 니켈, 니켈-NTA, 글루타티온, 덱스트린, 비오틴, 또는 스트렙타비딘을 포함하는 것인, 생리활성물질 전달용 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the substance or ligand that specifically binds to a tag of the physiologically active substance includes nickel, nickel-NTA, glutathione, dextrin, biotin, or streptavidin.
제 1항에 있어서,
상기 탄소나노입자의 표면에 결합된 상기 물질 또는 리간드에 상기 태그(tag)가 결합됨으로써 상기 탄소나노입자 표면에 흡착 또는 적재된 상기 생리활성물질을 포함하는, 생리활성물질 전달용 조성물.
The method according to claim 1,
And a physiologically active substance adsorbed or loaded on the surface of the carbon nanoparticles by binding the tag to the substance or ligand bound to the surface of the carbon nanoparticle.
제 1항에 있어서,
상기 탄소나노입자의 표면에 결합된 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드, 또는 엡타머를 추가 포함하는, 생리활성물질 전달용 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the composition further comprises an antibody, a ligand, a cell permeable peptide, or an eptamer bound to the surface of the carbon nanoparticles.
제 1항에 있어서,
상기 생리활성물질은 프로테아좀과 같은 단백질 복합체, 카스파제(caspase), 리보뉴클레아제(RNase), 키나아제(kinase), 포스파타아제(phosphatase)와 같은 효소 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인, 생리활성물질 전달용 조성물.
The method according to claim 1,
The physiologically active substance is selected from the group consisting of an enzyme such as a protein complex such as proteasome, an enzyme such as caspase, ribonuclease (RNase), kinase, phosphatase, and an antibody Wherein the physiologically active substance is a physiologically active substance.
제 1항에 있어서,
상기 탄소나노입자의 표면에 결합된 상기 물질 또는 리간드에 상기 태그(tag)가 결합됨으로써 상기 탄소나노입자 내에 흡착 또는 적재된 상기 생리활성물질을 추가 포함하는, 생리활성물질 전달용 조성물
The method according to claim 1,
And a physiologically active substance adsorbed or loaded in the carbon nanoparticles by binding the tag to the substance or ligand bound to the surface of the carbon nanoparticle.
제 1항에 있어서,
상기 생리활성물질은 정전기적 상호작용에 의해 상기 탄소나노입자의 표면에 흡착 또는 적재(loading)되는 것인, 생리활성물질 전달용 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the physiologically active substance is adsorbed or loaded on the surface of the carbon nanoparticles by electrostatic interaction.
제 1항에 있어서,
상기 생리활성물질은 pi-pi 상호작용에 의해 상기 탄소나노입자 내에 흡착 또는 적재(loading)되는 것인, 생리활성물질 전달용 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the physiologically active substance is adsorbed or loaded in the carbon nano-particles by pi-pi interaction.
제 1항에 있어서,
상기 생리활성물질은 공유결합에 의해 다양한 작용기를 표면에 추가한 탄소나노입자에 흡착 또는 적재(loading)되는 것인, 생리활성물질 전달용 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the physiologically active substance is adsorbed or loaded onto carbon nanoparticles to which various functional groups are added to the surface by covalent bonding.
제 1항에 있어서,
광감응을 통해 열발산 및/또는 활성산소를 발생하는 광감응제를 pi-pi 상호작용에 의해 상기 탄소나노입자 내에 흡착 또는 적재(loading)되는 것인, 생리활성물질 전달용 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the photosensitizer capable of generating heat radiation and / or active oxygen through photosensitivity is adsorbed or loaded in the carbon nanoparticles by pi-pi interaction.
제 1항에 있어서,
상기 PEI는 그 형태가 branched 및/또는 linear 형태로서 평균 분자량이 1 kDa 이상 100 kDa 이하인 범위로 이를 조절하는 방법 및 이를 포함하는 생리활성물질 전달용 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the PEI has a branched and / or linear form and has an average molecular weight of 1 kDa or more and 100 kDa or less; and a composition for delivering a physiologically active substance comprising the same.
제 1항에 있어서,
상기 PEG의 분자량을 조절함으로써 탄소나노입자의 평균 직경을 2 nm 이상 내지 20 nm 이하인 범위로 조절하는 방법 및 이를 포함하는 생리활성물질 전달용 조성물.
The method according to claim 1,
And controlling the molecular weight of the PEG to adjust the average diameter of the carbon nanoparticles to a range of 2 nm or more to 20 nm or less, and a composition for transferring the physiologically active substance containing the same.
제 1항에 있어서,
상기 탄소나노입자, PEG가 코팅된 탄소나노입자 및 PEI가 코팅된 탄소나노입자를 마이크로웨이브 조사, 가열, 가압 등의 방식을 통해 합성하는 방법 및 이를 포함하는 생리활성물질 전달용 조성물.
The method according to claim 1,
A method for synthesizing carbon nanoparticles, PEG-coated carbon nanoparticles, and PEI-coated carbon nanoparticles through microwave irradiation, heating, or pressurization; and a composition for transferring physiologically active substances comprising the same.
제 11항에 있어서,
상기 PEI가 코팅된 탄소나노입자를 PEI와 시트르산, 글루코즈 등과의 반응으로 공유결합을 형성하여 합성하는 방법 및 이를 포함하는 생리활성물질 전달용 조성물.
12. The method of claim 11,
A method for synthesizing carbon nanoparticles coated with PEI by forming a covalent bond by reaction with PEI, citric acid, glucose, etc., and a composition for transferring physiologically active substance comprising the same.
제 1항에 있어서,
상기 탄소나노입자, PEG가 코팅된 탄소나노입자 및 PEI가 코팅된 탄소나노입자를 합성하기 위하여, 반응물의 농도, 반응물의 비율, 반응시간 등을 조절함으로서 크기를 달리하여 다양한 파장의 형광 발광을 나타내게 하는 합성 방법 및 이를 포함하는 생리활성물질 전달용 조성물.
The method according to claim 1,
In order to synthesize the carbon nanoparticles, the PEG-coated carbon nanoparticles and the PEI-coated carbon nanoparticles, the concentration of the reactants, the ratio of the reactants, and the reaction time were controlled to produce fluorescent light of various wavelengths And a composition for delivering a physiologically active substance containing the same.
제 1항에 있어서,
상기 탄소나노입자, PEG가 코팅된 탄소나노입자 및 PEI가 코팅된 탄소나노입자의 형광 발광을 나타내는 조성물 및 이를 포함하는 미용, 치료, 진단을 목적으로 하는 조성물.
The method according to claim 1,
A composition exhibiting fluorescence emission of the carbon nanoparticles, PEG-coated carbon nanoparticles and PEI-coated carbon nanoparticles, and a composition for cosmetic, therapeutic and diagnostic purposes containing the same.
제 1항에 있어서,
상기 탄소나노입자, PEG가 코팅된 탄소나노입자 및 PEI가 코팅된 탄소나노입자의 표면에 형광 염료를 공유결합으로 접합시키는 방법 및 이를 포함하는 생리활성물질 전달용 조성물.
The method according to claim 1,
A method of covalently bonding a fluorescent dye to the surfaces of the carbon nanoparticles, the PEG-coated carbon nanoparticles and the PEI-coated carbon nanoparticles, and a composition for transferring the physiologically active substance comprising the same.
평균 직경이 2 nm 이상 내지 20 nm 이하인 탄소나노입자; 상기 탄소나노입자의 표면을 PEI 또는 PEG로 개질하여 표면에 결합된 물질, 태그(tag), 또는 리간드; 및 상기 탄소나노입자 내에 흡착 또는 적재된 생리활성물질을 포함하는 생리활성물질 전달용 조성물을 목적 세포 및/또는 조직 내로 도입하는 것을 포함하는, 생리활성물질 전달 방법.
Carbon nanoparticles having an average diameter of 2 nm or more and 20 nm or less; A substance, a tag, or a ligand bound to the surface by modifying the surface of the carbon nanoparticle with PEI or PEG; And introducing a physiologically active substance-containing composition containing the physiologically active substance adsorbed or loaded in the carbon nanoparticles into a target cell and / or tissue.
제 19항에 있어서,
상기 생리활성 물질은 탄소나노입자의 표면에 결합된 miRNA, siRNA, DNA, peptide, protein, DNase, RNase, proteinase, kinase, polymerase, recombinase, inhibitor, agonist, antagonist, small molecule, 또는 천연물으로부터 선택된 것을 포함하는 것인, 생리활성물질의 전달 방법.
20. The method of claim 19,
The physiologically active substance may be selected from miRNA, siRNA, DNA, peptide, protein, DNase, RNase, proteinase, kinase, polymerase, recombinase, inhibitor, agonist, antagonist, small molecule or natural substance bound to the surface of carbon nanoparticles Wherein the physiologically active substance is administered to the patient.
제 19항에 있어서,
상기 탄소나노입자의 표면에 결합된 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드, 또는 엡타머를 추가 포함하는 것인, 생리활성물질 전달 방법.
20. The method of claim 19,
Wherein the carbon nanoparticle further comprises an antibody, ligand, a cell permeable peptide, or an epithelium bound to the surface of the carbon nanoparticle.
제 19항에 있어서,
상기 생리활성물질은 프로테아좀과 같은 단백질 복합체, 카스파제(caspase), 리보뉴클레아제(RNase), 키나아제(kinase), 포스파타아제(phosphatase)와 같은 효소 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인, 생리활성물질 전달 방법.
20. The method of claim 19,
The physiologically active substance is selected from the group consisting of an enzyme such as a protein complex such as proteasome, an enzyme such as caspase, ribonuclease (RNase), kinase, phosphatase, and an antibody Of the physiologically active substance.
제 19항에 있어서,
상기 생리활성물질 전달용 조성물을 목적 세포 및/또는 조직 내로 도입하는 것은, 상기 생리활성물질 전달용 조성물을 세포 배양액에 첨가하여 상기 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것인, 생리활성물질 전달 방법.
20. The method of claim 19,
Wherein the step of introducing the composition for delivering a physiologically active substance into a target cell and / or tissue comprises introducing the composition for delivering a physiologically active substance into a cell culture fluid and introducing the composition into the target cell.
제 19항에 있어서,
상기 생리활성물질 전달용 조성물을 목적 세포 및/또는 조직 내로 도입하는 것은, 상기 생리활성물질 전달용 조성물을 혈관 내 투여, 경구투여, 경피투여, 또는 주사에 의한 국부투여에 의하여 상기 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것인, 생리활성물질 전달 방법.
20. The method of claim 19,
Introduction of the composition for delivering a physiologically active substance into a target cell and / or tissue can be carried out by introducing the composition for delivering a physiologically active substance into the target cell by intravascular administration, oral administration, transdermal administration, or local administration by injection Wherein the physiologically active substance is a physiologically active substance.
제 19항에 있어서,
상기 생리활성물질 전달용 조성물을 고부가가치 식물의 세포, 캘러스(callus) 및/또는 조직 내로 도입하는 것을 포함하는 것인, 생리활성물질 전달 방법.
20. The method of claim 19,
And introducing the composition for delivering the physiologically active substance into a cell, callus and / or tissue of a high value-added plant.
제 19항에 있어서,
상기 생리활성물질 전달용 조성물을 생식세포, 체세포, 종양세포 및/또는 배아(embryo) 내로 도입하는 것을 포함하는 것인, 생리활성물질 전달 방법
20. The method of claim 19,
And introducing the composition for delivering the physiologically active substance into germ cells, somatic cells, tumor cells and / or an embryo.
제 19항에 있어서,
상기 탄소나노입자 및/또는 상기 탄소나노입자 내에 약리활성을 가지는 생리활성물질이 흡착 또는 적재된 조성물을 이용한 화학적 치료 방법.
20. The method of claim 19,
Wherein the carbon nanoparticles and / or the physiologically active substance having pharmacological activity in the carbon nanoparticles are adsorbed or loaded.
제 19항에 있어서,
상기 탄소나노입자 및/또는 상기 탄소나노입자 내에 약리활성을 가지는 생리활성물질이 흡착 또는 적재된 조성물에 근적외선 레이저를 조사하여 유도되는 발열을 이용한 광감응 치료 방법.



20. The method of claim 19,
Wherein the carbon nanoparticles and / or the carbon nanoparticles are adsorbed or loaded with a physiologically active substance having pharmacological activity, and irradiated with a near-infrared laser.



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