KR20160084958A

KR20160084958A - 혈액 응고인자 ⅷ 유전자를 타겟으로 하는 엔도뉴클레아제 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20160084958A
Application number: KR1020150001391A
Authority: KR
Inventors: 김동욱; 김진수; 박철용; 김덕형
Original assignee: 연세대학교 산학협력단; 기초과학연구원
Priority date: 2015-01-06
Filing date: 2015-01-06
Publication date: 2016-07-15
Also published as: KR101658135B1

Abstract

본 발명은 정상 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 역위 유발 방법, 역위가 발생한 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 역위 교정 방법 및 이를 이용하여 제작된 역위가 교정된 A형 혈우병 환자-유래 유도만능 줄기세포에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 중증 A형 혈우병의 원인 중 다수를 차지하는 F8 유전자의 인트론 1 및 인트론 22의 역위를 효율적으로 재현함으로써, A형 혈우병의 발병기작 연구 및 치료제 스크리닝을 위한 리서치 툴(research tool)로서 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 제작된 역위-교정 유도만능 줄기세포는 정상 유전자 또는 단백질 전달을 통한 제한적인 방법에 의하지 않고 돌연변이가 발생한 유전자형을 야생형과 같은 상태로 복구시킴으로서, A형 혈우병에 대한 효율적이고 근원적인 치료가 가능하게 한다.

Description

혈액 응고인자 Ⅷ 유전자를 타겟으로 하는 엔도뉴클레아제 및 이의 용도{Endonuclease for Targeting blood coagulation factor Ⅷ and Use Thereof}

본 발명은 혈액 응고인자 Ⅷ 유전자를 타겟으로 하는 엔도뉴클레아제를 이용한 A형 혈우병 치료용 조성물에 관한 것이다.

A형 혈우병(Hemophilia A)은 전 세계적으로 남성 5000명 당 1명의 유병률을 가지는 흔한 유전적 출현질환(Bleeding Disorder) 중의 하나이다. 이 질환은 혈액 응고인자 Ⅷ(F8)에서의 다양한 유전자 변이에 의해 유발된다. 유전자형에 따라, 임상적 증상은 경증(5-30% 활성), 보통(1-5% 활성) 및 중증(<1% 활성)으로 나뉜다(Graw et al., 2005). 중증 A형 혈우병의 약 절반이 점 돌연변이 보다는 F8 1번 인트론 상동체(int1h, 중증 A형 혈우병의 약 5%) 및 22번 인트론 상동체(int22h, 중증 A형 혈우병의 약 40%)를 포함하는 염색체 역위에 의해 발생한다. 이들 두 가지 역위는 비대립성 상동 재조합(nonallelic homologous recombination, NAHR)을 통해 상동체에서 유도되는 DSB(DNA double-strand break)의 잘못된 복구로부터 유래된다. 일전에 본 발명자들은 140kp 떨어져 있고 각각 0.1% 및 1.9%의 빈도를 가지는 두 개의 동일한 int1h 서열(이하 int1h-1 및 int1h-2) 사이의 염색체 분절을 역위시키기 위하여, 불멸화된 야생형 인간 세포주에서 주문 제작한 ZFN(zinc finger nuclease)를, 야생형 유도만능세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)에서 TALEN(transcriptional activator-like effect nuclease)을 이용한 바 있다(Park et al., 2014). 상기 방법은 잘못된 DSB 복구를 모방하여 인위적으로 역위 유전자형을 유도한다. 세 개의 int22h 서열(int22h-1, -2 및 -3)을 포함하는 다른 600-kbp 역위는 140-kbp 역위보다 8배 더 빈번하였으나, 역위 부위의 크기가 크고, X 염색체 상에 2개가 아닌 3개의 상동체가 존재하여 복구가 더 어려웠다. 뿐만 아니라, int22h(10 kbp)는 int1h(1 kbp)보다 훨씬 크기 때문에, 통상적인 PCR을 이용하여 int22h 역위 또는 복구의 유전자형을 분석하는 것은 매우 어려운데, 이는 전체 10-kbp int22h가 증폭되어야 하기 때문이다. 사실, 유전자 가위(programmable nuclease)를 이용하여 환자-유래 iPSC는 물론, 인간 세포에서 int22h를 포함하는 600-kbp 염색체 분절이 복구될 수 있다고 알려진 바는 없다.

본 발명자들은, Ⅱ형의 다발의 규칙적인 간격을 가진 짧은 회귀성 반복 Cas(CRISPR)/CRISPR-associated)로서, RGEN(RNA-guided engineered nuclease)(Cho et al., 2013; Cho et al., 2014)으로 알려진 시스템을 사용하여 A형 혈우병 환자 유래의 iPSC에서 이들 두 역위를 정상적인 배열로 복구시키고자 하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 혈액 응고인자 Ⅷ(F8)에서의 다양한 유전자 변이에 의해 유발되는 A형 혈우병에 대한 효율적이고 근원적인 치료방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, F8 유전자의 역위가 역위 발생 부위를 타겟팅하는 가이드 RNA 및 이에 의해 타겟팅된 부위를 절단하는 RNA-유도 엔도뉴클레아제를 이용하여 성공적으로 복구(correction)될 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 역위 교정용 조성물 및 이를 이용한 역위 교정 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 역위가 교정된 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell)의 제조방법, 이를 이용하여 제조된 유도만능 줄기세포 및 이를 유효성분으로 포함하는 A형 혈우병 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 역위 교정용 조성물을 제공한다:

(a) RNA-유도 엔도뉴클레아제 또는 RNA-유도 엔도뉴클레아제 인코딩 뉴클레오타이드; 및

(b) 다음의 클레오타이드 서열 또는 이들의 상보적인 서열을 특이적으로 인식하는 유도 RNA(guiding RNA) 또는 상기 유도 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드:

(ⅰ)서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열;

(ⅱ)서열목록 제 2 서열의 뉴클레오타이드 서열; 및

(ⅲ) F8 유전자의 22번 인트론 상의 상기 (ⅰ) 및 상기 (ⅱ) 사이의 562,975bp 길이의 뉴클레오타이드 내에 존재하는 15-25 bp 뉴클레오타이드 서열

로 구성된 군으로부터 선택되는 한 쌍의 뉴클레오타이드 서열로서, 상기 (ⅲ)은 상기 (ⅰ) 및 상기 (ⅱ) 사이의 562,975bp 길이의 뉴클레오타이드 내에서 상기 (ⅰ) 또는 상기 (ⅱ)과 각각 80% 이상의 서열 유사성(sequence homology)을 가지는 뉴클레오타이드 서열이 존재하지 않으며, 동시에 다운스트림에 5’-N(G/A)G-3’뉴클레오타이드가 연결된 것을 특징으로 하는 조성물.

본 발명자들은 혈액 응고인자 Ⅷ(F8)에서의 다양한 유전자 변이에 의해 유발되는 A형 혈우병에 대한 효율적이고 근원적인 치료방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, F8 유전자의 역위가 역위 발생 부위를 타겟팅하는 가이드 RNA 및 이에 의해 타겟팅된 부위를 절단하는 RNA-유도 엔도뉴클레아제를 이용하여 성공적으로 복구(correction)될 수 있음을 발견하였다.

본 발명에 따르면, 본 발명은 F8 유전자의 22번 인트론 상동체(int22h)의 역위 발생 부위를 특이적으로 인식하는 유도 RNA(guiding RNA)를 이용하여 타겟 부위가 가이딩 되며, 상기 부위를 RNA-유도 엔도뉴클레아제가 정확하게 절단함으로써 역위로 인해 뒤집힌 유전자 부위가 절단된다. 절단된 유전자 부위는 일정 빈도로 재역위를 일으킴으로서 결과적으로 역위의 교정(correction)이 달성되게 된다.

본 명세서에서, 용어“뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명에서 용어“특이적으로 인식”은 본 발명의 타겟 서열과의 상보성에 기초하여 이를 선택적으로 인식하는 것을 의미하며, 이에 “특이적으로 결합(annealing)”과 동일한 의미로 사용된다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 본 발명의 유도 RNA가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 본 발명의것을 의미하며, 실질적으로 본 발(substantially complementary) 및 완전히 본 발(perfectly complementary)명의것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 구체적으로는 완전히 본 발명의것을 의미한다. 본 명세서에서, 용어, “실질적으로 본 발명의 유”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 서열목록 제1서열은 F8 유전자의 int22h-1의 다운스트림에 존재하는 20bp의 연속된 뉴클레오타이드 서열 중 80% 이상의 서열 유사성을 가지는 다른 뉴클레오타이드 서열이 존재하지 않으면서 다운스트림에 5’-N(G/A)G-3’뉴클레오타이드가 직접적으로 연결된 서열 중 가장 먼저 나타나는 서열이며, 서열목록 제2서열은 F8 유전자의 int22h-3의 업스트림에 존재하는 20bp의 연속된 뉴클레오타이드 서열 중 80% 이상의 서열 유사성을 가지는 다른 뉴클레오타이드 서열이 존재하지 않으면서 업스트림에 5’-N(G/A)G-3’뉴클레오타이드가 직접적으로 연결된 서열 중 업스트림 쪽에서 가장 먼저 나타나는 서열이다. 따라서, 이들 두 서열 또는 이들 두 서열 사이에 존재하면서 상술한 (ⅲ)의 조건을 만족하는 뉴클레오타이드 서열을 타겟으로 이용할 경우, F8 유전자의 22번 인트론에서 발생하는 역위, 보다 구체적으로는 int22h-1과 int22h-3 사이에서 발생하는 역위를 교정할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 RNA-유도 엔도뉴클레아제는 Cas9(CRISPR associated protein 9)이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 유도 RNA(guiding RNA)는 상기 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열 및 상기 서열목록 제 2 서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 상보적인 서열을 특이적으로 인식하는 유도 RNA(guiding RNA)이다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 RNA-유도 엔도뉴클레아제 및 유도 RNA는 각각 단백질 및 전사된 RNA의 형태로 이용될 수도 있고, 이들을 각각 코딩하는 DNA가 탑재된 벡터로 형질전환함으로써 목적 세포에 전달될 수도 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 역위 교정용 조성물을 제공한다:

(b) 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열 내에 포함되는 15-25 bp 길이의 뉴클레오타이드 서열로서 상기 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열 내에80% 이상의 서열 유사성(sequence homology)을 가지는 뉴클레오타이드 서열이 존재하지 않으며, 동시에 다운스트림에 5’-N(G/A)G-3’뉴클레오타이드가 연결된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 서열을 특이적으로 인식하는 유도 RNA(guiding RNA) 또는 상기 유도 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드.

본 발명에 따르면, 본 발명은 전술한 발명의 양태에 따라 F8 유전자의 22번 인트론에서 발생하는 역위의 교정이 가능하지만, 서열목록 제 4 서열의 F8 유전자의 1번 인트론 내 서열을 타겟으로 하는 유도 RNA를 사용함으로써 F8 유전자의 1번 인트론에서 발생하는 역위의 교정 또한 가능하다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 유도 RNA는 서열목록 제 3 서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 서열을 특이적으로 인식한다. 서열목록 제 3 서열은 1번 인트론 상동체 1(int1h-1) 및 int1h-2에 모두 존재하는 연속된 뉴클레오타이드 서열로서, 이를 타겟으로 하는 유도 RNA를 이용하여 int1h-1 및 int1h-2 사이에서 발생하는 역위의 교정이 가능하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 역위가 교정된 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell)의 제조방법을 제공한다:

(a) A형 혈우병 환자로부터 분리된 체세포를 역분화시켜 유도만능 줄기세포를 수득하는 단계;

(b) 상기 유도만능 줄기세포를 상술한 본 발명의 조성물과 접촉시키거나 상기 조성물이 삽입된 유전자 전달체로 형질전환시키는 단계.

A형 혈우병 환자로부터 분리된 체세포를 역분화시켜 수득한 유도만능 줄기세포는 환자 고유의 역위된 유전자를 간직하고 있으며, 이는 상술한 본 발명의 방법을 통해 인 비트로에서 교정될 수 있다. 즉, 역위가 발생한 부분을 조사한 뒤 상기 역위발생 부위를 특이적으로 인식하는 유도 RNA를 이용한다면, 일정 빈도로 역위가 교정되어 야생형과 동일한 유전자형을 가지는 환자 맞춤형 유도만능 줄기세포를 수득할 수 있는 것이다.

본 명세서에서 용어“유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell)”는 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포를 지칭하며, 역분화 유도만능 줄기세포로도 지칭된다. 유도만능 줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지며, 구체적으로 세포 외형, 유전자, 단백질 발현 패턴이 유사하고, 인 비트로 및 인 비보에서 전분화능을 가지며, 테라토마(teratoma)를 형성하고, 유전자의 생식선 전이(germline transmission)가 가능하다. 본 발명의 유도만능 줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 포유류 유래의 역분화 유도만능 줄기세포를 포함하나, 구체적으로는 인간 유래의 유도만능 줄기세포이며, 가장 구체적으로는 A형 혈우병 환자로부터 유래한 유도 만능 줄기세포이다.

본 명세서에서 용어“역분화”는 존재하는 분화 세포들을 미분화 상태로 되돌려 새로운 분화 조직 형성이 가능하도록 하는 후성학적인 역행과정을 의미하는 것으로 리프로그래밍 과정이라고도 말하며 세포 유전체의 후성학적인 변형(epigenetic changes)의 가역성에 기초한 것이다. 본 발명에서의 목적에 따라, 상기“역분화”란 0% 이상 내지 100% 미만의 분화능을 가지는 분화된 세포들을 미분화 상태로 되돌리는 과정이라면 모두 이에 포함되고 예를 들어 0%의 분화능을 가지는 분화된 세포를 1%의 분화능을 가지는 분화된 세포로 미분화시키는 과정도 이에 포함될 수 있다.

본 발명의 역분화는 이미 분화된 세포의 분화능을 회복시킬 수 있는 당업계에 알려진 다양한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 예를 들어 상기 A형 혈우병 환자로부터 분리된 체세포에 OCT4, NANOG, SOX2, LIN28, KLF4 및 c-MYC로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 형질전환함으로써 이루어질 수 있다.

유도만능 줄기세포를 얻기 위해 인간 체세포를 배양하는 데에 이용되는 배지는 통상적인 어떠한 배지도 포함한다. 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지(Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640(Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 “유전자 전달체”는 원하는 타겟 유전자를 대상 세포에 도입하여 발현시키기 위한 매개체를 의미한다. 이상적인 유전자 전달체는 인체 또는 세포에 무해하고 대량생산이 용이하며 효율적으로 유전자를 전달할 수 있어야 한다.

본 명세서에서, 용어“유전자 전달”은 유전자가 세포 내로 운반되는 것을 의미하며, 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달체는 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.

본 발명의 유전자 전달체을 제조하기 위해, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명에 있어서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 결합된 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 릴랙신 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대 CMV(포유동물 사이토 메갈로 바이러스) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, U6 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 프로모터는 CMV 프로모터 및/또는 U6 프로모터이다.

본 발명의 유전자 전달체는 다양한 형태로 제작할 수 있는 데, 이는 (ⅰ) 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자, (ⅱ) 플라스미드, (ⅲ) 바이러스 벡터, 그리고, (ⅳ) 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태로 제작할 수 있다.

본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 동물 형질전환에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Act . Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀(Metho s in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다. 가장 구체적으로는, 본 발명의 유전자 전달체는 플라스미드이다.

본 발명에서, 유전자 전달체가 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 상기 접촉시키는 단계는 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.

본 발명에서 유전자 전달체가 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)) 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자를 세포내로 도입시킬 수 있으며, 가장 구체적으로는 전기 천공법을 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 의하여 제조된 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell)를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 유도만능 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 A형 혈우병 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 유도만능 줄기세포는 혈우병 환자의 유전자 역위가 교정된 세포로써, 이후 적절한 체세포로 분화되어 환자에게 이식된 후 교정된 유전자를 발현함으로써 난치병인 A형 혈우병에 대한 유용한 세포치료용 조성물이 될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 직접 체내 이식된 채 인 비보에서 목적세포로 분화를 유도할 수도 있고, 혹은 인 비트로에서 목적세포로 분화를 완료한 뒤 체내에 이식할 수도 있다.

구체적으로는, 본 발명에서 치료하고자 하는 A형 혈우병은 중증 A형 혈우병이다. 본 명세서에서 용어“중증 A형 혈우병(severe hemophilia A)”은 혈액 응고인자 Ⅷ(F8)의 활성이 정상인의 1% 미만인 경우를 의미한다.

본 명세서에서 용어“치료”는 (a)질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b)질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c)질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물은 A 형 혈우병에 걸린 개체에서 교정되어 야생형과 동일한 유전자를 발현함으로써 유전자 역위로 유발되었던 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 A형 혈우병의 치료 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.

본 명세서에서 용어“투여”또는“투여하다”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다. 따라서, 용어“투여하다”는 본 발명의 유효성분인 유도만능 줄기세포 또는 이를 재분화시킨 성체세포를 주입 또는 이식(transplantation)하는 것을 포함하므로, 용어“투여하다”는“주입하다”또는“이식하다”와 같은 의미로 사용된다.

조성물의“치료적 유효량”은 조성물을 투여하고자 하는 대상체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 추출물의 함량을 의미하며, 이에 “예방적 유효량”을 포함하는 의미이다. 본 명세서에서 용어“대상체”는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 식염수, PBS(phosphate buffered saline) 또는 배지 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 구체적으로는 혈관 내(intravascular) 투여를 할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 1일 당 10²-10¹⁰세포이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 역위 유도용 조성물을 제공한다:

(ⅰ)서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열;

(ⅱ)서열목록 제 2 서열의 뉴클레오타이드 서열; 및

본 발명에서 이용되는 각 구성에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 방법을 역위가 발생한 환자 세포를 출발물질로 사용할 경우 발생한 역위의 재역위, 즉 교정을 유도할 수 있으나, 반대로 정상인의 세포를 출발물질로 이용할 경우 역위를 유도할 수 있다. 따라서, 정상 유전자형을 가지는 세포를 출발 세포로 이용함으로써 본 발명은 인위적 혈우병 세포를 효율적으로 수득하는 유용한 리서치 툴(research tool)이 될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 역위 유도용 조성물을 정상인의 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 역위 유도 방법을 제공한다.

본 발명에서 이용되는 각 조성물 및 단계에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 정상 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 역위 유발 방법, 역위가 발생한 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 역위 교정 방법 및 이를 이용하여 제작된 역위가 교정된 A형 혈우병 환자-유래 유도만능 줄기세포를 제공한다.

(b) 본 발명의 방법은 중증 A형 혈우병의 원인 중 다수를 차지하는 F8 유전자의 인트론 1 및 인트론 22의 역위를 효율적으로 재현함으로써, A형 혈우병의 발병기작 연구 및 치료제 스크리닝을 위한 리서치 툴(research tool)로서 유용하게 이용될 수 있다.

(c) 본 발명의 방법으로 제작된 역위-교정 유도만능 줄기세포는 정상 유전자 또는 단백질 전달을 통한 제한적인 방법에 의하지 않고 돌연변이가 발생한 유전자형을 야생형과 같은 상태로 복구시킴으로서, A형 혈우병에 대한 효율적이고 근원적인 치료가 가능하게 한다.

도 1은 A형 혈우병 환자-유래 iPSC에서 부분-역위된 F8 유전자의 교정 결과를 보여주는 그림이다. 도 1a는 인간 피부 섬유아세포(WT) 및 A형 혈우병 환자-유래 소변세포(Pa1, Pa2 및 Pa3)에서 지놈 DNA를 분리하고 적절한 프라이머(Bagnall et al., 2006)로 PCR 분석을 수행함으로써 인트론 1 (왼쪽) 또는 22(오른쪽) 역위를 검출한 결과이다. 도 1b는 인트론 22의 역위 및 복구를 보여주는 모식도이다. 세 개의 상동 부위를 int22h-1, int22h-2 및 int22h-3로 각각 나타내었다. 파란색 화살표 머리는 PCR 프라이머를 나타낸다. int22h-1 또는 int22h-3 근처의 뉴클레아제 타겟 부위는 검은색(RGEN 02) 또는 붉은색(RGEN 03) 번개모양으로 각각 표시하였다. 도 1c는 HeLa 세포에서 뉴클레아제 타겟 부위의 돌연변이를 T7E1 분석으로 확인한 결과이다. 도 1d는 HeLa 세포에서 563-kbp 염색체 분절의 역위에 해당하는 PCR 산물을 보여준다. 도 1e는 iPSC 클론에서 역위 교정을 확인하는 PCR 분석결과이다. 도 1f는 역위-교정된 iPSC 클론에서의 변곡점 연결부 DNA 서열을 보여준다. 각 RGEN 타겟 서열을 밑줄로 표시하였으며, PAM 서열은 녹색으로 표시하였고, 점선은 삭제된 염기를 나타낸다. 소문자는 삽입된 서열을 나타내고, 파란색 화살표는 절단 부위를 보여준다.
도 2는 역위-교정된 iPSC 클론의 특성을 분석한 결과를 보여주는 그림이다. 도 2a는 부모 및 교정된 세포주에서 내생적인 OCT4, SOX2, LIN28 및 NANOG mRNA를 검출하기 위한 정량적 실시간 PCR(qPCR) 결과를 보여준다. 각 유전자으 발현 수준은 GAPDH를 통해 표준화하였다. 도 2b는 역위-교정된 세포주의 인 비트로 분화를 보여준다. 각 마커 단백질의 발현은 외배엽(Nestin), 중배엽[α-SMA(α-smooth muscle actin)] 및 내배엽[AFP(α-fetoprotein)]으로 분화하였음을 나타낸다. 스케일바, 50 mm. 도 2c는 인간 ESC 특이적 마커인 OCT4 및 SSEA4 발현을 면역세포화학을 통해 검출한 결과이다. 스케일바, 100 mm. 각 iPSC 세포주의 핵형도 함께 표시하였다. 도 1d는 인트론 1 및 22 역위-교정된 iPSC 세포주에서 분화한 세포에서의 F8 유전자 발현을 보여주는 그림이다. 야생형 iPSCs(WT), 환자 iPSCs (Pa1, Pa2 및 Pa3) 및 역위-교정된 Pa1-(Co-1 및 Co-2) 또는 Pa2-iPSCs (Co-1, Co-2 및 Co-3)에서 유래한 세포에서의 F8 및 중배엽 마커(Brachyury)의 발현을 RT-PCR(상단) 및 qPCR(하단)로 측정하였다. GAPDH 발현이 로딩 대조군으로 사용되었다. 도 2e는 역위-교정된 iPSC 세포주에서 엑손 1 및 2 또는 엑손 22 및 23 사이의 올바른 스플라이싱을 보여주는 크로마토그램이다.
도 3은 A형 혈우병 환자-유래 iPSC에서 인트론 1 역위의 교정을 보여주는 그림이다. 도 3a는 중증 A형 혈우병 환자에서 발견되는 인트론 1 역위가 교정되는 과정의 모식도를 나타낸다. 파란색 화살표 머리는 PCR 프라이머를 나타낸다. 도 3b는 HeLa 세포에서 F8 유전자의 인트론 1 내 RGEN 01 타겟 부위의 돌연변이 빈도를 T7E1 분석을 통해 측정한 결과를 보여준다. 도 3b는 HeLa 세포의 역위 유전자형에 상응하는 PCR 산물을 보여주는 그림이다. 도 3d는 두 개의 인트론 1 상동체(int1 homolog 1 및 2로 명명) 및 변곡점 연결부의 DNA 서열을 나타낸 그림이다. 지놈 DNA를 RGEN-인코딩 플라스미드로 형질전환한 HeLa 세포에서 분리하고 역위 특이적인 PCR 밴드를 분리한 뒤 두 변곡점 연결부의 서열을 분석하였다. RGEN 타겟서열은 밑줄로 표시하였으며, PAM 서열은 녹색으로 표시하였고, 점선은 삭제된 염기를 나타낸다. 소문자는 삽입된 염기를 나타낸다. 도 3e는 4개의 교정된 클론(Co-1~Co-4)의 지놈 DNA PCR 분석결과를 보여준다. 지놈 DNA를 인트론 1 역위 환자(Pa1-U)의 소변-유래 세포 및 역위 또는 정상 유전자형의 양성 대조군인 야생형 iPSC(WT)에서 각각 분리하였다. 도 3f는 두 개의 상동체(int1 homolog 1 및 2로 명명) 및 변곡점 연결부의 DNA 서열을 보여준다. 지놈 DNA를 RGEN-인코딩 플라스미드로 형질전환한 iPSC에서 분리하였다. 복구 특이적 PCR 밴드를 분리하고, 두 개의 변곡점 연결부의 서열을 분석하였다. RGEN 타겟 서열을 밑줄로 표시하였고, PAM 서열은 녹색으로 나타냈으며, 점선은 삭제된 염기를 의미한다.
도 4는 HeLa 세포 또는 환자 iPSC에서의 타겟팅된 역위 및 복구를 보여주는 그림이다. 도 4a는 HeLa 세포에서 역위에 대한 두 변곡점 연결부의 DNA 서열을 나타낸다. 각 RGEN 타겟 서열을 밑줄로 표시하였고, PAM 서열은 녹색으로 나타냈으며, 점선은 삭제된 염기를 의미한다. 소문자는 삽입된 염기를 나타내며, 파란색 화살표는 절단 부위를 나타낸다. 도 4b 및 4c는 각각 인트론 1(4b) 및 인트론 22(4c) 부위에서의 변곡점 연결부의 DNA 서열을 나타낸다. RGEN RNP는 전기천공을 통해 인트론 1(Pa1-iPSCs) 또는 인트론 22(Pa3-iPSCs) 역위 세포로 직접적으로 전달되었다. 전체 DNA를 iPSC에서 분리 후 시퀀싱하였다. 각 RGEN 타겟 서열을 밑줄로 표시하였고, PAM 서열은 녹색으로 나타냈으며, 점선은 삭제된 염기를 의미한다. 소문자는 삽입된 염기를 나타내며, 두 개의 파란색 화살표는 절단 부위를 나타낸다. 서열이 한번 이상 검출된 경우, 검출된 횟수를 괄호 내 번호로 표시하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

본 발명에 따른 A형 혈우병 환자의 소변-유래 iPSC의 분석은 연세대학교 연구윤리 심의위원회의 승인(IRB # 4-2012-0028) 하에 이루어졌다. 모든 자원자들은 인간 iPSC 생성을 위한 소변시료 기증에 앞서 서면 동의서에 서명하였다.

세포배양 및 형질전환

HeLa 세포(ATCC, CCL-2)를 10% FBS(fetal bovine serum), 0.1 mM 비필수 아미노산 및 1% 항생제가 보충된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에서 배양하였다. DSB를 유발하기 위하여, 1 X 10⁵HeLa 세포를Lipofectamine 2000 형질감염 시약(Invitrogen)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 Cas9-인코딩 플라스미드 및 sgRNA-인코딩 플라스미드(각각 0.5 mg)로 공-형질전환하였다. WiCell Inc에서 구입한 인간 ESC(hESC) 세포주(H9), 인간 피부 섬유아세포-유래 야생형 iPSCs(WT-iPSC Epi3 line) (Park et al., 2014) 및 소변-유래 iPSC는 hESC 배지[20% 넉아웃 혈청 대체물(Gibco), 1% 비필수 아미노산 (Invitrogen) 및 0.1 mM 2-머캅토에탄올(Sigma)을 보충한 DMEM/F12 (Gibco)]에서 4 ng/mL bFGF(basic fibroblast growth factor, PeproTech)와 함께 유지시켰다. 소변-유래 iPSC에서 복구를 유발시키기 위하여, 전기천공 시스템(Neon; Invitrogen)을 이용하여 1 X 10⁶세포에 5μg Cas9-인코딩 플라스미드 및 5 μg sgRNA-인코딩 플라스미드(인트론 22 역위에 대해 각 5μg의 sgRNA 플라스미드)를 전기천공하였다.

Cas9 단백질을 소변-유래 iPSC로 직접 전달하기 위하여, 종래에 보고된 방법을 조금 변형하여 형질전환을 수행하였다(Kim et al., 2014). Cas9 단백질(15μg)을 20μg의 전사된 sgRNA(인트론 22 역위에 대한 각 sgRNA 플라스미드 20μg)와 혼합하고 상온에서 10분 간 인큐베이션하여 RNP (RGEN ribonucleoprotein)가 형성되도록 하였다. RNP는 미세천공 시스템을 통해 2 X 10⁵iPSC에 형질전환되었다.

중증 A형 혈우병 환자로부터 소변-유래 세포의 분리 및 확장

중증 A형 혈우병으로 진단된 11명의 환자로부터 소변 시료를 수집하였으며, 상기 진단은 한국 혈우재단으로부터 임상적으로 확인된 것이다. 소변-유래 세포는 종래에 보고된 방법으로 분리하였다(Zhou et al., 2012). 요약하면, 세포를 약 100 ml의 중간뇨(midstream urine)로부터 10분간 400 g에서의 원심분리를 통해 수집하였다. 세포를 PBS로 두 번 세척한 뒤, 10%(vol/vol) FBS, REGM(renal epithelial cell growth medium, Single Quot kit(Lonza)에서 수득) 및 1% 항생제가 보충된 DMEM/Ham’s F12(1:1) 배지(Hyclone)에서 배양하였다. 이러한 조건에서 4일간 배양 후, 세포를 확장시키기 위해 REGM(Lonza)에서 배양하였다. 이들 세포를 젤라틴-코팅된 배양접시에 80-90% 컨플루언시로 나누었다. F8 유전자형을 확인하기 위하여, 소변-유래 환자세포에서 분리한 지놈 DNA 시표를 F8 좌위의 인트론 1 및 22 역위 부근의 적절한 부위를 인식하는 프라이머 세트를 이용하여 PCR 분석을 하였다(Bagnall et al., 2006; Park et al., 2014).

RGEN 조성물

종래 보고된 방법으로 Cas9-인코딩 플라스미드를 구축하였다(Cho et al., 2013). HA 에피토프 및 NLS(nuclear localization signal)에 융합된 Cas9 단백질을 CMV 프로모터 하에서 발현시켰다. sgRNA 발현에는 U6 프로모터를 사용하였다(Cho et al., 2014). 정제된 재조합 Cas9 단백질은 ToolGen, Inc에서 구입하였다. 가이드 RNA는 MEGA short script T7 킷(Ambion)을 이용하여 종래에 보고된 방법으로 인 비트로에서 전사하였다(Kim et al., 2014). 전사된 RNA는 페놀:클로로포름 추출을 통해 정제하고, 분광계로 정량화하였다.

T7E1 분석 및 타겟팅된 역위의 빈도 측정

종래에 보고된 방법에 따라 T7E1 분석을 수행하였다(Kim et al., 2009). 요약하면, RGEN 타겟 부위를 포함하는 PCR 앰플리콘를 가열하여 변성(denature)시키고 어닐링하여 이형접합(heteroduplex) DNA 절편을 형성시켰다. 이후 상기 절편에 T7 엔도뉴클레아제(New England Biolabs)를 37℃에서 20분 간 처리하여 미스매치 부위가 절단될 수 있도록 한 뒤, 생성물을 아가로스 젤 전기영동으로 분석하였다. F8 좌위에서의 타겟팅된 교정의 빈도를 종래에 보고된 방법으로 디지털 PCR 분석을 통해 측정하였다(Kim et al., 2010). 리포펙타민 2000 형질전환 시약 (Invitrogen)을 이용하여 RGEN 및 sgRNA 플라스미드로 공-형질전환된 세포에서 분리한 지놈 DNA를 순차적으로 희석하고, 희석된 시료에 대해 PCR 분석을 수행하였다. 각 희석 포인트에서의 양성밴드 절편을 결정하고 결과를 Extreme Limiting Dilution Analysis 프로그램을 이용하여 분석하였다(HuandSmyth,2009).

HeLa 세포에서 F8 좌위의 RGEN-매개 역위의 확인

본 발명에서 설계된 RGEN의 유전체 교정활성을 확인하기 위하여, 각 RGEN을 sgRNA 발현 플라스미드와 함께 HeLa 세포에 공-형질전환하였다. RGEN 활성은 T7E1 분석을 통해 측정하였다.

환자-유래 iPSC의 F8 좌위에서의 타겟팅된 RGEN-매개 교정

iPSC를 STO 세포 지지층에서 배양하고 Ⅳ형 콜라게나아제로 처리하여 채집하였다. PBS로 세척한 뒤, 세포를 종래에 보고된 방법으로 단일세포로 분리하였다(Desbordes et al., 2008). 이들 단일세포들을 RGEN 및 sgRNA 플라스미드와 혼합하고 850볼트 전압으로 30분간 펄스를 가하였다. 이후 세포를 지지세포 위에 씨딩하고 10일간 배양하였다. F8 좌위에서 발생한 유전자 역위를 검출하기 위하여, 개개의 콜로니에서 추출한 세포를 파쇄하고 PCR 분석을 하였으며, 사용된 프라이머는 다음과 같다:1-F1: 5’-AAATCACCCAAGGAAGCACA-3’, 1-R1: 5’-TGGCATTAACGTATTACTTGGAGA-3’; 1-F2: 5’-TGCTGAGCTAGCAGGTTTAATG-3’, 1-R2: 5’- TGCTGAGCTAGCAGGTTTAATG-3’; 22-F1: 5’-TGGGGCTGTGTAAATTTGCT-3’, 22-R2: 5’-CAAACGTAGCATTACCTGATTGT-3’; 22-F2: 5’-ACAACCAGAGCAGAAATCAATGA-3’, 22-R2: 5’-TTTCACCACATCCACGCCAA-3’.

클론 세포군의 확립 및 특성분석

교정된 세포의 클론을 분리하기 위하여, 원하는 유전자 변형(역위 유전자형의 교정)이 이루어진 것으로 PCR을 통해 확인된 각 콜로니를 단일세포로 분리하고 새로운 세포 지지층에 씨딩하였다. 4회 계대배양 후, 몇몇 클론(인트론 1 교정된 4개 클론 및 인트론 22 교정된 3개 클론)을 선정하여 시퀀싱을 하고 추가 실험을 진행하였다. 변곡점의 서열 분석을 위하여, 증폭된 PCR 산물을 전기영동하여 아가로스젤로부터 용출하였다.

RNA 분리, RT-PCR 및 qPCR

TRIzol 시약(Invitrogen)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 총 RNA를 정제하였다. DiaStar^TMcDNA 합성 킷(SolGent, Korea)을 이용하여 총 RNA(1μg)로부터 cDNA를 합성하였다. Factor Ⅷ, Brachyury 및 GAPDH의 발현을 확인하기 위하여, 합성된 cDNA를 주형으로 Ex-Taq (Takara)을 이용하여 PCR을 수행하였다. qPCR을 위하여, SYBRPremix Ex-Taq(Takara)을 제조사의 설명서에 따라 사용하였다. 인트론 1 또는 인트론 22 교정 세포주로부터 F8 mRNA를 각각 증폭하기 위하여, 엑손 1(또는 인트론 22 교정 세포주에서 엑손 21)에 위치한 정방향 프라이머를 엑손 3(또는 인트론 22 교정 세포주에서 엑손 23)에 위치한 역방향 프라이머와 함께 사용하였다. RT-PCR 또는 qPCR에는 다음의 프라이머 세트를 이용하였다: GAPDH-F: 5’- CCCCTCAAGGGCATCCTGGGCTA-3’, GAPDH-R: 5’-GAGGTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’; OCT4-F: 5’-CCTCACTTCACTGCACTGTA-3’, OCT4-R: 5’-CAGGTTTTCTTTCCCTAGCT-3’ ;LIN28-F: 5’-AGCCATATGGTAGCCTCATGTCCGC-3’, LIN28-R: 5’-TCAATTCTGTGCCTCCGGGAGCAGGGTAGG-3’; SOX2-F: 5’-TTCACATGTCCCAGCACTACCAGA-3’, SOX2-R: 5’- TCACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGC-3’; NANOG-F: 5’-TGAACCTCAGCTACAAACAG-3’, NANOG-R: 5’- TGGTGGTAGGAAGAGTAAAG-3’; F8-엑손1-F: 5’-CTGCTTTAGTGCCACCAGAAGA-3’, F8-엑손3-R: 5’-GACTGACAGGATGGGAAGCC-3’; F8-엑손21-F: 5’- CCGGATCAATCAATGCCTGGAG-3’, F8-엑손23-R: 5’-ATGAGTTGGGTGCAAACGGATG-3’; Brachyury-F: 5’- ATCACAAAGAGATGATGGAGGAA-3’, Brachyury-R: 5’-GGTGAGTTGTCAGAATAGGTTGG-3’).

소변-유래 iPSC의 생성 및 인 비트로 분화

3계대 이하로 배양 후, 소변-유래 세포로부터 iPSC를 생성하였다. 에피좀 리프로그램 벡터 또는 센다이 바이러스(Invitrogen)를 이용하여 종래에 보고된 방법에 따라 소변-유래 세포로부터 iPSC를 제작하였다(Okita et al., 2011). 인간 ES 세포와 유사한 형태를 보이는 7개의 iPSC 콜로니를 기계장치로 집어올려 특성분석을 위해 더 배양하였다. iPSC는 인 비트로에서 공지의 방법을 이용하여 세 개의 배엽으로 분화시켰다(Sugii et al., 2010). Ⅳ형 콜라게나아제(Invitrogen)를 통해 부분적으로 iPSC를 분리시킴으로써 배아체(Embryoid body, EB) 형성을 유도하였다. EB를 페트리디쉬(SPL Lifesciences, Korea)에 옮기고 bFGF가 없고 5% FBS가 보충된 hESC 배지에서 10일간 분화하였다. EB가 세가지 배엽을 대표하는 세포로 자발적으로 분화되는지 여부는 적절한 항체를 이용한 면역염색을 통해 조사하였다. iPSC를 중배엽 계열로 분화시키기 위하여, 종래에 보고된 방법을 조금 변형하여 사용하였다(Yoo et al., 2013). 요약하면, EB를 페트리디쉬에 옮기고 bFGF가 없고 20 ng/mL BMP4(bone morphogenic protein-4, R&D Systems) 및 10 ng/mL 액티빈 A(PeproTech)가 보충된 hESC 배지에서 배양하였다. 3일 째에, EB를 마트리젤-코팅된 디쉬에 플레이팅하고 상술한 배지에서 3일간 추가로 배양하였다. 분화 6일 째에, 중배엽 계열로 분화한 세포를 채집하여 F8 유전자 발현을 조사하였다.

iPSC의 특성 분석

백혈구 알칼린 포스파타아제 염색 킷(Sigma)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 알칼린 포스파타아제 활성을 측정하였다. iPSC 세포주가 소변-유래 세포에서 생성되었음을 확인하기 위하여 STR(hort tandem repeat)을 분석하였다. AmpFISTR PCR 반응시스템(Applied Biosystems)을 이용하여 iPSC 세포주 및 부모 세포에서 분리한 지놈 DNA 시료로부터 STR 좌위를 증폭하였다. PCR-기반 STR 분석은 Human Pass Inc(Korea)에서 수행하였다. 핵형 분석을 위하여, 각 iPSC 세포주 유래 염색체에 대한 G-밴딩 분석을 GenDix Inc(Korea)에서 수행하였다. ES 세포 마커에 대한 면역염색은 종래에 보고된 방법대로 수행하였다(Park et al., 2014). 핵의 시각화를 위해 DAPI(4’, 6-디아미노-2-페닐인돌, Vector Laboratories)를 사용하였으며, 이미지는 Olympus IX71 현미경 또는 FSX 시스템을 이용하여 캡쳐 후 분석하였다.

타겟팅된 심층 시퀀싱

뉴클레아제 타겟 부위를 포함하는 지놈 DNA 분절은 Phusion 중합효소(New England Biolabs)를 이용하여 증폭하였다. 동일한 양의 PCR 앰플리콘에 대해 IlluminaMiSeq을 이용하여 페어드-엔드 리드(paired-end read) 시퀀싱을 수행하였다. 전체 리드end.005% 이하을 희섭열 리드는 제외 시퀀. RGEN 절단부위 부근(PAMen3bp 업스트림)에 l은 RGEN에 의해 유발된 돌연변이로 간주하였다.

전체 유전자 시퀀싱

DNeasy Tissue 킷(Qiagen)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 지놈 DNA를 정제하였다. Covaris 시스템을 이용하여 지놈 DNA(1μg)를 절편화하고 End Repair Mix를 통해 무딘 말단(blunt end)을 형성시켰다. 절편화된 DNA를 아답터로 결합시켜 라이브러리를 제작하였다. IlluminaHiSeq X Ten Sequencer를 이용하여 Macrogen(Korea)에서 라이브러리를 시퀀싱하였다.

전체 유전자 시퀀싱 분석 및 변이정보 추출

IlluminaHiSeq X Ten Sequencer에서 수득한 FASTQ 파일을 Illumina, Inc(USA)의 Isaac 워크플로우를 통해 Macrogen에서 분석하였다. 요약하면, 페어드 엔드에 의해 리딩된 FASTQ 파일을 기준 유전자(hg19)에 따라 Isaac Genome Alignment software(Isaac Aligner)를 이용하여 얼라인하였다. 이후, SNP(single nucleotide polymorphism) 및 indels을 Isaac Variant Caller로 동정하였다. 수많은 변이 중에서, 본 발명자들은 RGEN이 치환을 거의 유도하지 않기 때문에 indel에 초점을 맞추었다. 바이오인포매틱스 필터를 적용하여 공공 데이터베이스에 등재된 indel 및 다른 유전자에서 추출된 indel을 제외시켰다. 다음으로, RGEN 타겟 부위를 indel 위치에 상응하는 야생형 좌위와 비교하였다. 31-106개의 indel 부위가 5’-N(G/A)G-3’PAM 서열을 포함하였으며, 각각의 온-타겟 서열과 최소 12 뉴클레오타이드 매치를 보였다. 마지막으로, 반복서열을 가지는 부위를 제외시킨 후 10개 indel 부위에 대해 타겟팅된 심층 시퀀싱을 수행하였다.

잠재적인 오프-타겟 부위의 검사

각 유전자 서열에서 수많은 잠재적인 오프-타겟 부위에 뉴클레아제-유도 indel이 존재하는지를 조사하기 위하여, Cas-OFFinder를 사용하여 온-타겟 부위와 8개까지의 뉴클레오타이드가 차이나거나, 5 염기의 DNA 또는 RNA 벌지(bulge)와 2개까지의 뉴클레오타이드가 차이나는 모든 잠재적인 오프-타겟 부위를 동정하였다(Bae et al., 2014). 각 잠재적인 오프-타겟 부위에서 전체 CIGAR 스트링의 20%로 이루어진 보존적 CIGAR 스트링을 만들기 위해 내부 컴퓨터 프로그램을 사용하였다. 다음으로 수많은 잠재적인 오프-타겟 부위의 보전적 CIGAR 스트링과 기준 서열의 CIGAR 스트링을 비교하였다. 그 결과, 83- 348개의 잠재적인 오프-타겟 부위를 수득하였다. 마지막으로, 독립 클론에서만 관찰되고 타겟 부위 주변에서 반복 서열을 가지지 않는 4개의 indel 부위에 대해 타겟팅된 심층 시퀀싱을 수행하였다.

실험결과

우선, 본 발명자들은 서로 인척관계가 없는 11명의 중증 A형 혈우병 환자들의 유전자형을 분석하고 int1 역위를 가진 한명의 환자와 int22 역위를 가진 2명의 환자를 동정하였다. 이에, int1 역위를 가진 한명의 환자(“Pa1”로 명명) 및 int22 역위를 가진 두 명의 환자(“Pa2”및“Pa3”으로 명명)를 선정하여 실험을 진행하였다(도 1a). 에피좀 벡터 또는 센다이 바이러스를 통해 4개의 Yamanaka 인자를 소변 내 상피세포에 도입함으로써 각각의 iPSC를 확립하여, 출혈 질환을 가지는 이들 환자의 섬유아세포를 수득하여 침습형 생검을 거치는 것을 피하고자 하였다. 동시에, Cas9 단백질 및 sgRNA(small guide RNA)로 구성된 RGEN이 야생형 HeLa 세포 및 환자 iPSC에서 이들 역위를 유도하거나 복구하는 활성을 가지는지를 조사하였다. RGEN 01은 int1h 내의 부위를 타겟팅하도록 설계되었다(도 3a). RGEN 01은 활성이 매우 높았으며, int1h 내의 타겟 부위에서 34%의 빈도로 소규모 삽입 및 삭제(insertions and deletions, indels)를 유도하였다(도 3b). 나아가, RGEN 01은 역위-특이적 PCR에서 보는 바와 같이 HeLa 세포의 140-kbp 염색체 분절 역위를 유도한다(도 3c). 디지털 PCR 분석 결과 상기 역위의 빈도는 2.2%-3.1%로 측정되었다(Kim et al., 2010; Lee et al., 2010).

본 발명자들은 역위-특이적 PCR 앰플리콘의 DNA 서열을 분석한 결과, 두개의 역위 변곡점 연결부(breakpoint junction)에서 indel이 유도되었음을 확인하였다(도 3d). 이러한 높은 빈도에 근거하여, 본 발명자들은 Cas9 단백질 및 sgRNA를 인코딩하는 플라스미드를 Pa1 유래 iPSC(Pa1- iPSCs)에 공-형질전환하고 PCR을 이용하여 iPSC 콜로니를 분석하였다. 120개 콜로니 중 8개 콜로니(반드시 하나의 세포에서 유래하지 않음)(6.7%)가 아가로스 젤 상에서 양성 PCR 밴드를 생성하였다.

4개의 콜로니를 추가적으로 배양하여 단일세포 유래 클론을 수득하였다. 이들 클론은 int1h-1 및 int1h-2 부위에 해당하는 PCR 앰플리콘을 생성하였는데, 이를 통해 Pa1 세포의 140-kbp 염색체 분절에서의 역위가 복구되었음을 알 수 있다(도 3e).

반면, 이러한 PCR 앰플리콘은 Pa1 iPSCs 또는 비뇨기 세포로부터 생성되지 않았다. 본 발명자들은 PCR 앰플리콘을 시퀀싱함으로써 세 개의 클론의 타겟 부위에서 indel이 유도되지 않음을 관찰하였다. 다른 클론에서는, 타겟 부위에서 3-bp 삭제가 검출되었다(도 3f).

이어 본 발명자들은 다른 int22h 역위에도 초점을 맞추었다. 목적하는 600-kbp 분절 역위의 복구 이외에 두 개 또는 세 개의 int22 상동체를 포함하는 원치 않은 삭제 또는 역위의 가능성을 배제하기 위하여 상동체의 바깥 부분을 타겟팅하는 두가지 RGEN을 사용하였다(도 1b). 이러한 전략은 또한 적절한 프라이머를 사용하여 복구 여부를 잘 검출할 수 있게 한다. 본 발명자들은 int22h-1 및 int22h-3 근처의 부위를 타겟팅하기 위해 두 개의 RGEN(RGEN 02 및 RGEN 03)을 설계하고, T7E1(T7 endonuclease I) 분석을 통해 HeLa 세포에서의 뉴클레아제 활성을 시험하였다. 이들 RGEN은 활성이 매우 높았으며, 44% 또는 32% 빈도로 타겟 부위의 indel을 유도하였다(도 1c). 다음으로, 두 타겟 부위 사이의 563-kbp 염색체 분절의 역위를 PCR로 검출하였다. RGEN 02 또는 RGEN 03 만을 HeLa 세포에 형질전환할 경우 역위-특이적 PCR 앰플리콘이 생성되지 않았다. 반면, 이들 RGEN 플라스미드를 공-형질전환하자 두 개의 역위-특이적 PCR 앰플리콘이 생성되었다(도 1d). 역위 빈도는 1.5%-2.2%이다(표 1).

HeLa 세포에서의 타겟팅된 역위 빈도

	지놈 DNA 양 (유전자 절반 당 카피수)					빈도 (%)		p 값 (Fit)
	1 ng (300)	333 pg (100)	100 pg (30)	33 pg (10)	10 pg (3)	추정값	상한 및 하한^*	p 값 (Fit)
int1h1	16/16	16/16	10/16	3/16	0/16	3.1	(2.0-4.7)	0.04
int1h2	16/16	15/16	7/16	3/16	0/16	2.2	(1.4-3.3)	0.24
int22 (junction1)	16/16	13/16	8/16	6/16	0/16	2.2	(1.4-3.3)	0.43
int22 (junction3)	16/16	13/16	6/16	0/16	-	1.5	(1.0-2.3)	0.13

^*상한 및 하한은 95% 신뢰구간을 나타낸다.

PCR 앰플리콘의 DNA 서열을 조사한 결과 indel이 대부분 두 개의 역위 변곡점 연결부를 수반함을 관찰함으로써 두 개의 RGEN으로 유발된 두 개의 DSB가 오류-빈발 NHEJ(non-homologous end joining)에 의해 복구되었음을 알 수 있었다(도 4a). HeLa 세포는 F8 엑손의 방향에 있어서 야생형이다. Pa2 및 Pa3 세포에서, F8 엑손 1-22는 역위되었다. 그러나, 여전히 이들 두 RGEN 타겟 부위는 보존되어 있어 대량의 염색체 분절을 복구할 수 있다.

다음으로, RGEN 02 및 03를 전기천공을 통해 Pa2 iPSC에 형질전환하고, 135개 콜로니를 분리한 뒤 이의 지놈 DNA에 대한 PCR 분석을 수행하였다. 5개의 콜로니(3.7%)가 역위-교정(즉, 복구)에 해당하는 PCR 앰플리콘을 생성하였다. Pa2 iPSCs 또는 야생형 iPSC에서는 이러한 PCR 산물이 수득되지 못했다(도 1e). 이들 콜로니들을 확장하여 3개의 독립된 단일세포-유래 클론을 분리하였다. 두 개의 RGEN 부위 사이의 563-kbp 염색체 분절이 복구되었는지를 확인하기 위하여 두 역위 변곡점 연결부에서의 DNA 서열을 조사하였다(도 1f). 그 결과, HeLa 세포에서처럼 오류-빈발 NHEJ의 특징인 indel이 이들 역위-교정된 iPSC의 두 변곡점 연결부에서 관찰되었다.

본 발명자들은 역위-교정된 iPSC가 다능성을 유지하는지를 조사하였다. 우선, 역위-교정된 Pa1(int1h 역위) 및 Pa2(int22h 역위) iPSC에서의 줄기세포 마커 발현을 조사한 결과 OCT4, SOX2, LIN28 및 NANOG가 활발하게 전사됨을 확인하였다(도 2a). 또한, 이들 역위-교정된 iPSC는 3가지 1차 배엽으로 성공적으로 분화하였으며(도 2b), 나아가 이들은 정상적인 핵형을 보였다(도 2c). 이를 종합하면, RGEN에 의한 전체적인 염색체 복구는 환자-유래 iPSC의 다능성에 부정적인 영향을 끼치지 않음을 알 수 있다.

중배엽에서 유래된 상피 세포는 F8 유전자 발현의 주된 근원이다(Shahani et al., 2010). 본 발명자들은 환자 iPSC 및 역위-교정된 환자 iPSC를 중배엽으로 분화시킨 뒤 RT-PCR을 통해 F8 mRNA의 수준을 측정하였다. 예상대로, Pa1-iPSC에서 분화된 세포에서 F8 엑손 1 및 2에 상응하는 PCR 밴드가 검출됨으로써 환자-유래 세포에서는 F8이 발현되지 않음을 알 수 있었다(도 2d). 반면, 이들 엑손에 해당하는 PCR 밴드는 야생형 iPSC 또는 두 개의 역위-교정된 Pa1-iPSCs(Co-1 및 Co-2)로부터 분화된 세포에서 검출되었다. 유사하게, F8 엑손 22 및 23에 상응하는 PCR 앰플리콘은 Pa2- 및 Pa3-iPSC에서 분화된 세포에서 검출되지 않았으나, 3개의 역위-교정된 iPSC에서 분화된 세포에서는 검출되었다(도 2d).

역위-교정된 iPSC로부터 분화된 세포에서 엑손 1 및 2 또는 엑손 22 및 23이 올바르게 스플라이싱되었음을 생어 시퀀싱을 통해 확인하였다(도 2e). 이러한 결과는 인트론 1 및 22 역위를 가지는 환자 iPSC에서 F8 유전자가 교정되었음을 보여준다.

RGEN 온-타겟 및 오프-타겟 부위에서 플라스미드 절편의 원치 않는 삽입을 막기 위해, 인트론 1 또는 22 역위를 가지는 두 개의 환자 iPSC(Pa1 및 Pa3)에 E.coli에서 발현된 후 정제된 재조합 Cas9 단백질 및 인 비트로에서 전사된 sgRNA(RGEN ribonucleoprotein, RNP)을 형질도입하였다.

PCR 및 생어 시퀀싱을 이용하여 F8 유전자의 유전적 기능을 회복하는 140-kbp 또는 563-kbp 염색체 분절의 복구를 확인하였다(도 4b 및 4c). 플라스미드와 달리 RNP는 형질도입 직후 염색체의 타겟 DNA를 즉시 절단하고 세포 내에서 빠르게 분해되기 때문에(Kim et al., 2014), RGEN RNP의 형질도입을 통해 온-타겟 사이트의 유전체 교정활성을 희생시키지 않고도 오프-타겟 효과를 감소시킬 수 있다.

RGEN은 온-타겟 부위와 서열이 동일한 오프-타겟 돌연변이를 유도할 수 있다(Cho et al., 2014; Cradick et al., 2013; Fu et al., 2013; Hsu et al., 2013; Pattanayak et al., 2013). 본 발명자들은 타겟팅된 심층 시퀀싱(deep sequencing) 및 전체 지놈 시퀀싱(whole genome sequencing, WGS)을 이용하여 본 발명에서 이용된 RGEN이 환자 iPSC에서 역위의 교정 이외에 다른 이차적 피해를 남기는지 여부를 조사하였다. 우선, 웹 기반 프로그램인 Cas-OFFinder(www.rgenome.net, Bae et al. 2014)를 이용하여 인간 유전자에서 3개의 RGEN 온-타겟 부위와 3개에 이르는 뉴클레오타이드가 상이한 잠재적인 오프-타겟 부위를 탐색하였다. RGEN 01, RGEN 02 및 RGEN 03에서 총 12, 6 및 14개 부위가 각각 발견되었다. 역위-교정된 iPSC에서 indel이 이들 부위에서 유발되지 않았음을 확인하기 위하여 타겟팅된 심층 시퀀싱을 이용하였다(표 2).

잠재적인 오프-타겟 부위의 분석

3개 미스매치까지 허용하는 오프-타겟 부위의 타겟팅된 심층 시퀀싱
RGEN	RGEN 01		RGEN 02		RGEN 03
오프-타겟 부위	12		6		14
심층시퀀싱에 의한 확인	0		0		0
오프-타겟 부위의 WGS 분석 및 변이정보 추출
클론	Pa1	Pa1_Co-1		Pa2		Pa2_Co-1
모든 변이	4,006,558	3,964,083		3,945,677		3,933,902
Raw indel calls	505,673	496,678		488,735		477,957
데이터베이스에 없는 Indel	56,586	52,832		51,105		48,614
KO 클론-특이적 indels	13,707	10,914		11,578		9,848
상동체 부위의 후보 indel	N/A	(RGEN 01) 52		N/A		(RGEN 02) 106	(RGEN 03) 31
반복 서열의 제외	N/A	7		N/A		0	3
심층시퀀싱에 의한 확인	N/A	0		N/A		0	0
8개 미스매치까지 허용하는 오프-타겟 부위의 WGS 분석
RGEN	RGEN 01		RGEN 02		RGEN 03
오프-타겟 부위	511,710		652,127		937,778
잠재적 후보	83		348		163
반복 서열의 제외	1		2		1
심층시퀀싱에 의한 확인	0		0		0

다음으로, 환자(Pa1 및 Pa2) iPSC에서 분리한 지놈 DNA 및 각각의 역위-교정된 iPSC에 대해 WGS를 수행하였다. 우선, hg19 표준 유전자를 기준으로 indel을 동정하기 위하여 변이정보 추출 프로그램인 Isaac을 사용하였다. 바이오인포매틱스 필터를 적용하여 공공 데이터베이스에 등재된 indel, int1h 또는 int22h 역위 및 다른 역위-교정된 유전자를 가지는 환자 유전자에서 추출된 indel, 그리고 시퀀싱 오류에 기인한 homo-polymer 또는 반복서열에서 나타나는 indel을 제외시켰다. 그 결과, 각각의 역위-교정된 유전자 서열에서 고유의 9,848-13,707개 indel이 수득되었다. 다음으로, RGEN 타겟부위를 indel 위치에 상응하는 야생형 좌위와 비교하였다. 31-106개 indel 부위만이 5’-N(G/A)G-3’PAM 서열을 가졌으며, 각각의 온-타겟 서열과 최소 12개 뉴클레오타이드 매치를 보였다(표 2). 이후 두 개의 역위-교정된 유전자에서 이들 indel에 상응하는 DNA 서열을 조사하였다. 어떠한 indel도 타겟팅된 심층 시퀀싱으로 확인되지 않았다. 다음으로, 온-타겟 부위와 8개까지의 뉴클레오타이드가 차이나거나, 5 염기의 DNA 또는 RNA 벌지(bulge)와 2개까지의 뉴클레오타이드가 차이나는 모든 잠재적인 오프-타겟 부위를 Cas-OFFinder를 통해 컴퓨터로 동정하였다. 이후 수천개의 잠재적인 오프-타겟 부위 중 도출된 10개의 부근에 배열된 시퀀스 리드를 표준 서열과 비교한 결과(표 2), 오프-타겟 indel은 동정되지 않았다. 이러한 결과는 본 발명에서 이용된 세 개의 RGEN이 역위-교정된 환자 iPSC에서 오프-타겟 돌연변이를 유발하지 않음을 보여준다. 요약하면, 본 발명자들은 중증 A형 혈우병의 절반에 이르는 원인을 제공하는 두 개의 대규모 염색체 역위를 복구하기 위하여 환자-유래 iPSC에서 RGEN을 사용하였으며, 이를 통해 역위-교정된 iPSC에서 분화된 세포가 F8 유전자를 발현함을 관찰하였다. 타겟팅된 심층 시퀀싱 및 WGS 분석을 통해 역위-교정된 iPSC에서 오프-타겟 돌연변이가 유발되지 않음을 확인하였다. 이는 RGEN 또는 다른 유전자 가위를 이용하여 환자 iPSC에서 염색체 역위 등의 대규모 유전자 재배열이 교정될 수 있음을 보여주는 첫 번째 사례이다. 염색체 역위는 헌터 증후군(Bondeson et al., 1995) 및 암(Nikiforova et al., 2000)과 같은 다른 유전적 질환과도 관련이 있다. RGEN을 이용한 iPSC에서의 타겟팅된 유전자 재배열은 유전자의 구조적 변형을 가능하도록 하여 이들의 기능을 연구하는 수단 및 A형 혈우병을 비롯한 광범위한 염색체 재배열로 유발되는 다양한 유전질환의 유전자 및 세포치료 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation Yonsei University <120> Endonuclease for Targeting blood coagulation factor 8 and Use Thereof <130> PN140652 <160> 29 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 1 cccgtataac tcttaaacac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 2 tggtaagagt accggtggga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 3 ggtccccggg gttgtgcccc 20 <210> 4 <211> 1041 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 4 cagttgtcag tatgtgaaca atgttggaaa catgttattt tgtctgattt cctttgggag 60 aattcattgc cagctataaa tctgtggaaa cgctgccaca caatcttagc acacaagatt 120 ggcagaaaat cgcttagaaa cactgaaaac atgtgacaaa gtgctttccg tgaaaagggt 180 ggatgcgaag cagtaaggac ccccttcatg aagcacgcgg tcaccctcca gccaccagaa 240 ccagaggaac gctgtggtaa ctgagggaaa acgcatctag gcacacgtca cggtggcacc 300 ttccagcagg tccccggggt tgtgcccctg gagctctgac aaagagtgtg gcccggaaat 360 gtgatgtttg gactgcaagt tttggtgaga aataacaatg catcaggttg cagacaaagc 420 agaccctgct ctgtgcgttt atgggagccg cgcccaacag gaaccacagg gaatgatcga 480 aaggagaggg acggacacaa acagacacac cagagagagg ttctcaggag gaggctctgt 540 ggcctccaga ccacgtcaaa gccaaggcag aaaggatgaa ctgaggaaag gaggaaaatt 600 tccccttaag gaaggtaaaa tccagaaggg atccctaaaa tggtgagcag tttaaaccta 660 gcagttttgc attaattcac ataaagtata atgaaaactg ttggacacac aaggagagac 720 tggccaatct atagtcacag aggaagacct tcacacccct tcacaggatc tcgcagcaga 780 ttggctgaaa agtctccttg aaactgcaga cctctctcaa ggagacccac tgagttgggc 840 aaaggtgggg ccgacttaat tcttgcctcc ctgctctccc acgtagccct gcatttcact 900 ccattccagg gtttctggga cacccgagaa agcacgtagt ccagggagca cgtctgccaa 960 ctgaaggcct tgacaaatga ctttctgtac tggctgaggg ccagggccca gcgtactgat 1020 aaggaagctc ttccagaaaa a 1041 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-F1 <400> 5 aaatcaccca aggaagcaca 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-R1 <400> 6 tggcattaac gtattacttg gaga 24 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-F2 <400> 7 tgctgagcta gcaggtttaa tg 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-R2 <400> 8 tgctgagcta gcaggtttaa tg 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 22-F1 <400> 9 tggggctgtg taaatttgct 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 22-R2 <400> 10 caaacgtagc attacctgat tgt 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 22-F2 <400> 11 acaaccagag cagaaatcaa tga 23 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 22-R2 <400> 12 tttcaccaca tccacgccaa 20 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-F <400> 13 cccctcaagg gcatcctggg cta 23 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-R <400> 14 gaggtccacc accctgttgc tgta 24 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCT4-F <400> 15 cctcacttca ctgcactgta 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCT4-R <400> 16 caggttttct ttccctagct 20 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LIN28-F <400> 17 agccatatgg tagcctcatg tccgc 25 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LIN28-R <400> 18 tcaattctgt gcctccggga gcagggtagg 30 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2-F <400> 19 ttcacatgtc ccagcactac caga 24 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2-R <400> 20 tcacatgtgt gagaggggca gtgtgc 26 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG-F <400> 21 tgaacctcag ctacaaacag 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG-R <400> 22 tggtggtagg aagagtaaag 20 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F8-exon1-F <400> 23 ctgctttagt gccaccagaa ga 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F8-exon3-R <400> 24 ctgctttagt gccaccagaa ga 22 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F8-exon3-R <400> 25 gactgacagg atgggaagcc 20 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F8-exon21-F <400> 26 ccggatcaat caatgcctgg ag 22 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F8-exon23-R <400> 27 atgagttggg tgcaaacgga tg 22 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Brachyury-F <400> 28 atcacaaaga gatgatggag gaa 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Brachyury-R <400> 29 ggtgagttgt cagaataggt tgg 23

Claims

다음을 포함하는 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 역위 교정용 조성물:
(a) RNA-유도 엔도뉴클레아제 또는 RNA-유도 엔도뉴클레아제 인코딩 뉴클레오타이드; 및
(b) 다음의 클레오타이드 서열 또는 이들의 상보적인 서열을 특이적으로 인식하는 유도 RNA(guiding RNA) 또는 상기 유도 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드:
(ⅰ)서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열;
(ⅱ)서열목록 제 2 서열의 뉴클레오타이드 서열; 및
(ⅲ) F8 유전자의 22번 인트론 상의 상기 (ⅰ) 및 상기 (ⅱ) 사이의 562,975bp 길이의 뉴클레오타이드 내에 존재하는 15-25 bp 뉴클레오타이드 서열
로 구성된 군으로부터 선택되는 한 쌍의 뉴클레오타이드 서열로서, 상기 (ⅲ)은 상기 (ⅰ) 및 상기 (ⅱ) 사이의 562,975bp 길이의 뉴클레오타이드 내에서 상기 (ⅰ) 또는 상기 (ⅱ)과 각각 80% 이상의 서열 유사성(sequence homology)을 가지는 뉴클레오타이드 서열이 존재하지 않으며, 동시에 다운스트림에 5’-N(G/A)G-3’뉴클레오타이드가 연결된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 RNA-유도 엔도뉴클레아제는 Cas9(CRISPR associated protein 9)인 것을 특징으로 하는 조성물
제 1 항에 있어서, 상기 유도 RNA(guiding RNA)는 상기 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열 및 상기 서열목록 제 2 서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 상보적인 서열을 특이적으로 인식하는 유도 RNA(guiding RNA)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 22번 인트론에서 발생하는 역위를 교정하는 것을 특징으로 하는 조성물.
다음을 포함하는 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 역위 교정용 조성물:
(a) RNA-유도 엔도뉴클레아제 또는 RNA-유도 엔도뉴클레아제 인코딩 뉴클레오타이드; 및
(b) 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열 내에 포함되는 15-25 bp 길이의 뉴클레오타이드 서열로서 상기 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열 내에80% 이상의 서열 유사성(sequence homology)을 가지는 뉴클레오타이드 서열이 존재하지 않으며, 동시에 다운스트림에 5’-N(G/A)G-3’뉴클레오타이드가 연결된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 서열을 특이적으로 인식하는 유도 RNA(guiding RNA) 또는 상기 유도 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드.
제 5 항에 있어서, 상기 유도 RNA는 서열목록 제 3 서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 서열을 특이적으로 인식하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 RNA-유도 엔도뉴클레아제는 Cas9(CRISPR associated protein 9)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 1번 인트론에서 발생하는 역위를 교정하는 조성물.
다음 단계를 포함하는 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 역위가 교정된 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell)의 제조방법:
(a) A형 혈우병 환자로부터 분리된 체세포를 역분화시켜 유도만능 줄기세포를 수득하는 단계;
(b) 상기 유도만능 줄기세포를 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시키거나 상기 조성물이 삽입된 유전자 전달체로 형질전환시키는 단계.
제 9 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 A형 혈우병 환자로부터 분리된 체세포에 OCT4, NANOG, SOX2, LIN28, KLF4 및 c-MYC로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 형질전환함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항의 방법에 의하여 제조된 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell).
제 11 항의 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell)를 유효성분으로 포함하는 A형 혈우병 치료용 조성물.
다음을 포함하는 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 역위 유도용 조성물:
(a) RNA-유도 엔도뉴클레아제 또는 RNA-유도 엔도뉴클레아제 인코딩 뉴클레오타이드; 및
(b) 다음의 클레오타이드 서열 또는 이들의 상보적인 서열을 특이적으로 인식하는 유도 RNA(guiding RNA) 또는 상기 유도 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드:
(ⅰ)서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열;
(ⅱ)서열목록 제 2 서열의 뉴클레오타이드 서열; 및
(ⅲ) F8 유전자의 22번 인트론 상의 상기 (ⅰ) 및 상기 (ⅱ) 사이의 562,975bp 길이의 뉴클레오타이드 내에 존재하는 15-25 bp 뉴클레오타이드 서열
로 구성된 군으로부터 선택되는 한 쌍의 뉴클레오타이드 서열로서, 상기 (ⅲ)은 상기 (ⅰ) 및 상기 (ⅱ) 사이의 562,975bp 길이의 뉴클레오타이드 내에서 상기 (ⅰ) 또는 상기 (ⅱ)과 각각 80% 이상의 서열 유사성(sequence homology)을 가지는 뉴클레오타이드 서열이 존재하지 않으며, 동시에 다운스트림에 5’-N(G/A)G-3’뉴클레오타이드가 연결된 것을 특징으로 하는 조성물.
다음을 포함하는 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 역위 유도용 조성물:
(a) RNA-유도 엔도뉴클레아제 또는 RNA-유도 엔도뉴클레아제 인코딩 뉴클레오타이드; 및
(b) 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열 내에 포함되는 15-25 bp 길이의 뉴클레오타이드 서열로서 상기 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열 내에80% 이상의 서열 유사성(sequence homology)을 가지는 뉴클레오타이드 서열이 존재하지 않으며, 동시에 다운스트림에 5’-N(G/A)G-3’뉴클레오타이드가 연결된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 서열을 특이적으로 인식하는 유도 RNA(guiding RNA) 또는 상기 유도 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드.
제 14 항에 있어서, 상기 유도 RNA는 서열목록 제 3 서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 서열을 특이적으로 인식하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 13 항 내지 또는 제 15 항 중 어느 한 항의 조성물을 정상인의 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 혈액 응고인자 Ⅷ(F8) 유전자의 역위 유도 방법.