KR20160083758A - Detection of mutations in ATP7B gene using PCR-LDR - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a detection method of a mutation in an ATP7B (ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide) gene using a polymerase chain reaction (PCR) and ligase detection reaction (LDR); to a method for providing information required for the diagnosis of Wilson′s disease by using the detection method; and to a composition for the diagnosis of Wilson′s disease, which includes a PCR primer set for the amplification of a mutation in an ATP7B gene and an LDR probe set for detection of the mutation. The method for providing information required for diagnosis of Wilson′s disease comprises the following steps: performing a PCR process to amplify a fragment including the mutated portion of an ATP7B gene by using DNA separated from a clinical specimen as a template; and performing an LDR process of a PCR product to detect a mutation in an ATP7B gene.

Description

ＰＣＲ―ＬＤＲ을 이용한 ＡＴＰ７Ｂ 유전자의 돌연변이 검출{Detection of mutations in ATP7B gene using PCR-LDR}Mutation detection of ATP7B gene using PCR-LDR (Detection of mutations in ATP7B gene using PCR-LDR)

본 발명은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reactioin, PCR)과 리가아제 검출 반응(Ligase Detection Reaction, LDR)을 이용한 ATP7B(ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide) 유전자의 돌연변이 검출 방법, 이를 이용하여 윌슨병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법, 및 윌슨병 진단용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a method for detecting a mutation of ATP7B (ATPase, Cu ++ transporting and beta polypeptide) gene using polymerase chain reaction (PCR) and ligase detection reaction (LDR) And a composition for diagnosing Wilson's disease.

윌슨(Wilson)병은 구리 대사 이상으로 인하여 간, 뇌, 각막, 신장 및 적혈구에 구리가 침착되는 보통염색체 열성 유전질환으로, 13번 염색체에 위치하는 ATP7B(ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide) 유전자 돌연변이에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다. 이 유전자의 돌연변이로 인하여 간 및 뇌에 구리가 축적되어 간 증상 혹은 신경학적 증상이 나타난다. Wilson's disease is a common chromosomal recessive disorder in which copper deposits in the liver, brain, cornea, kidney, and red blood cells due to copper metabolism abnormality. ATP7B (ATPase, Cu ++ transporting, beta polypeptide) gene mutation located on chromosome 13 And the like. Mutations in this gene cause copper accumulation in the liver and brain resulting in liver or neurological symptoms.

구리의 흡수에 관여하는 효소인 ATP7B를 코딩하는 유전자에 돌연변이가 발생하면 구리운반 P-형 ATPase 단백질에 이상이 생겨 간세포 내에서 미세담도로 구리가 배출되지 못하고, 구리가 셀룰로플라스민과 결합하지 못하므로 혈액 내로 배출되지 못하여, 간세포, 적혈구, 뇌 등의 장기에 구리가 침착되어 중독증상이 나타나고, 구리이온에 의한 자유라디칼(free readical)의 발생으로 장기에 산화적 손상을 유발한다.When a mutation occurs in the gene encoding ATP7B, an enzyme involved in the absorption of copper, an abnormality occurs in the copper-carrying P-type ATPase protein, so that copper is not released into the microbial cells in the hepatocyte, and copper binds to the celluloplasmic In addition, copper is deposited in organs such as hepatocytes, red blood cells, and brain due to inability to be released into the blood, resulting in toxic symptoms, and free radicals caused by copper ions cause oxidative damage to organs.

윌슨병은 보통염색체 열성으로 유전된다. 부모 양쪽 모두가 보인자인 경우에 25%의 확률로 환자인 자녀가 생길 수 있다. 윌슨병은 희귀병이나 국내에서 지난 10년간 발생한 유전질환 중 가장 많이 발생한 질환이며 다른 나라와 비교해 발생률이 높은 편에 속한다. 따라서 윌슨병 환자에 대한 조기 진단과 치료의 중요성이 강조되고 있다. 특히, 신생아 대사 검사와 같이, 저비용으로 편리하고 효율적으로 시행할 수 있는 검사법의 개발이 요구된다. Wilson's disease is usually inherited as chromosomal recessive. If both parents are observers, a patient with a 25% probability can be born. Wilson's disease is the most common genetic disease in the last 10 years in Korea, and it has a higher incidence rate than other countries. Therefore, the importance of early diagnosis and treatment of Wilson's disease is emphasized. In particular, it is required to develop a test method that can be conveniently and efficiently carried out at low cost, such as the neonatal metabolism test.

윌슨병은 임상적, 생화학적 및 분자유전학적 소견으로 진단할 수 있다. 임상적, 생화학적 진단은 특징적인 각막환(K-F 고리), 특징적인 신경학적 이상소견, 혈중 내 낮은 셀룰로플라스민 수치, 24시간 동안 소변 중 구리 배설량 증가, 간내 증가된 구리의 양을 고려하고, 이들 중 2가지 이상이 양성이면 윌슨병의 확진 가능성이 매우 높다. 최근 혈중 셀룰로플라스민의 농도를 측정하여 윌슨병을 진단하는 기술이 개발되고 있으나, 셀룰로플라스민의 농도 측정은 생화학적 소견이 아직 충분히 나타나지 않은 초기 윌슨병 환자들은 정확한 진단이 어렵고 보인자를 판별할 수 없다는 문제가 있다.Wilson's disease can be diagnosed by clinical, biochemical, and molecular genetic findings. Clinical and biochemical diagnoses include characteristic corneal rings (KF rings), characteristic neurologic abnormalities, low levels of celluloplasmin in the blood, elevated copper excretion in the urine for 24 hours, and increased copper in the liver If two or more of these are positive, the possibility of Wilson's disease is very high. Recently, there has been developed a technique to diagnose Wilson's disease by measuring the concentration of celluloplasmin in the blood. However, the measurement of celluloplasmin level is difficult because the initial Wilson's disease patients whose biochemical findings have not yet been sufficiently diagnosed can not be accurately diagnosed, There is no problem.

현재, 윌슨병의 확진을 위해서 ATP7B 유전자의 돌연변이를 확인하는 분자유전학적 진단 방법이 이용되고 있다. 약 80%의 윌슨병 환자에서 유전자 이상을 규명할 수 있으며 임상적, 생화학적 진단법에 의한 윌슨병 확진시 도움을 줄 수 있다. 또한 증상이 없는 환자인지 이형접합 보인자인지 여부를 확진하는 데는 분자유전학적 진단 방법이 표준 방법이다. 특히 분자유전학적 진단 방법을 이용하면 생화학적 또는 임상적 양상이 비전형적이거나 생화학적 소견이 아직 충분히 나타나지 않은 윌슨병 초기 환자 및 현재 무증상이나 보인자인 환자 등 임상적으로 감별이 어려운 환자를 확진할 수 있다. 또한 관련 돌연변이가 밝혀지면 해당 가계 내에서도 예측적 검사가 가능하다.Currently, a molecular genetic diagnostic method is used to confirm the mutation of the ATP7B gene in order to confirm Wilson's disease. Approximately 80% of patients with Wilson 's disease can be diagnosed with genetic abnormalities and can be helpful in the diagnosis of Wilson' s disease by clinical and biochemical diagnosis. Molecular genetic diagnosis is the standard method for confirming whether the patient is a symptomless patient or a heterozygous carrier. In particular, molecular genetic diagnostic methods can be used to identify patients with Wilson's disease who are not atypical or biochemical in their biochemical or clinical features and who are currently asymptomatic have. In addition, if related mutations are identified, predictive testing is also possible within the household.

ATP7B 유전자에 대한 돌연변이는 전세계적으로 다양한 종류들이 보고되었고 인종이나 민족 간에 차이가 있는 것으로 나타났다. 중부/동부/북서부 유럽 국가에서는 H1069Q 돌연변이 빈도가 가장 높게 발견되며(17-72%), 지중해 연안 국가에서는 이탈리아, 그리스, 터키에서는 H1069Q 돌연변이(9.4-35%), 스페인에서는 M645R 돌연변이(27%), 카나리 제도에서는 L708P 돌연변이(64%)의 빈도가 가장 높다. 한국에서는 R778L 돌연변이가 37.5%로 가장 높은 빈도를 차지하고 있고, 중국의 경우도 비슷한 양상을 보인다(49.2%) (The Korean Journal of Hepatology 2009, 15, 295-298). 특히 한국인에서는 R778L(c.2333G>T), A874V(c.2621C>T), N1270S(c.3809A>G)의 3가지가 전체 돌연변이 대립유전자의 50% 이상을 차지하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이 외에도 c.2513delA, T1029I (c.3086C>T), G1035V (c.3104G>T), L1083F (c.3247C>T), G1186S (c.3556G>T)의 돌연변이가 1 내지 8% 빈도로 확인되었다 (The Korean Journal of Hepatology 2009, 15, 295-298; Human Mutation 2007, 28, 1108-1113; Liver International, 2011, 31, 831-839). 따라서, 이들 돌연변이의 분석에 의해 60% 이상의 윌슨병 진단이 가능하다.Mutations in the ATP7B gene have been reported across the world in a variety of species, with differences in race or ethnicity. H1069Q mutation frequency was highest (17-72%) in Central / Eastern / Northwest European countries, H1069Q mutation (9.4-35%) in Italy, Greece and Turkey and M645R mutation (27% , And the Canary Islands has the highest incidence of L708P mutation (64%). In Korea, R778L mutation has the highest frequency (37.5%), and China has a similar pattern (49.2%) (Korean Journal of Hepatology 2009, 15, 295-298). In Korea, three types of R778L (c.2333G> T), A874V (c.2621C> T) and N1270S (c.3809A> G) are known to account for more than 50% of all mutant alleles. Mutations of c.2513delA, T1029I (c.3086C> T), G1035V (c.3104G> T), L1083F (c.3247C> T), and G1186S (c.3556G> T) (Human Mutation 2007, 28, 1108-1113; Liver International, 2011, 31, 831-839). Thus, by analyzing these mutations, more than 60% of Wilson's disease can be diagnosed.

윌슨병의 분자유전학적 진단 방법으로 제한효소 절편 질량다형성법을 이용한 검출방법과 실시간 중합효소연쇄반응의 용융 곡선 분석을 이용한 진단법, 직접염기서열분석법이 이용되고 있다. Molecular genetic diagnosis of Wilson 's disease is based on the detection method using the restriction fragment length polymorphism method, the detection method using the melting curve analysis of real - time PCR, and the direct base sequence analysis method.

제한효소 절편 질량다형성법은 정확도가 우수하고, 정량분석이 가능하지만 고가의 MALDI-TOF MS가 필요하며, 여러 개의 표적 돌연변이 존재 여부를 검출하기 위해 여러 개의 제한효소들이 사용됨에 따라 제한효소에 의한 절단, 절단된 단편의 정제 등이 요구되어 검사법이 복잡해진다는 단점이 있다. Restriction enzyme fragmentation mass polymorphism is superior in accuracy and can be quantitatively analyzed, but expensive MALDI-TOF MS is required. Since several restriction enzymes are used to detect the presence of multiple target mutations, restriction enzyme digestion , The cleavage of the cleaved fragment is required, and the test method is complicated.

Taqman이나 분자 비콘(molecular beacon) 등 유전형에 특이적인 형광 표지된 프로브를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응법은 정확도가 우수하지만 다중 돌연변이 검출이 어려운 단점이 있다. 다중 분석을 위하여 실시간 중합효소 연쇄반응 후 증폭된 산물들의 용융 곡선 분석을 이용한 진단법이 제시되었으나 용융 곡선의 분석이 복잡하고 비특이적 증폭 등에 의하여 정확도 및 특이도가 떨어질 수 있으므로 실제 진단 검사에서 적용하기에는 한계가 있다.Real - time polymerase chain reaction using fluorescence - labeled probes specific for genotypes, such as Taqman and molecular beacons, has the disadvantage of being highly accurate but difficult to detect multiple mutations. Although the diagnostic method using the melting curve analysis of the products amplified after the real-time PCR has been proposed for multiple analysis, the accuracy and specificity of the melting curve can be reduced due to complicated and nonspecific amplification. have.

직접염기서열분석법은 정확도가 우수하지만, 시간 및 비용이 비교적 많이 들고 근본적으로 다중 돌연변이 검출이 불가능하다.Direct sequence sequencing has excellent accuracy, but is relatively time and costly and is fundamentally impossible to detect multiple mutations.

이에 본 발명자들은 기존의 분자유전학적 분석법에 비해 저렴한 비용으로 윌슨병을 유발하는 주요한 다중 돌연변이를 정확하고 신속하게 검출하여 효율적으로 윌슨병의 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있는 방법에 대한 연구를 수행하여, 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors conducted a study on a method for accurately and rapidly detecting a major multiple mutation inducing Wilson disease at a lower cost than the existing molecular genetic analysis method, and thereby providing information necessary for the diagnosis of Wilson's disease efficiently , Thereby completing the present invention.

본 발명은 ATP7B 유전자의 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR) 및 리가아제 검출반응(LDR)에 의해 윌슨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. The present invention aims to provide a method for providing information necessary for diagnosis of Wilson's disease by polymerase chain reaction (PCR) and ligase detection reaction (LDR) using primers and probes for mutation detection of ATP7B gene.

본 발명은 또한, ATP7B 유전자의 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브를 포함하는 윌슨병 진단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. The present invention also aims to provide a composition for diagnosing Wilson's disease comprising a primer and a probe for detecting mutation of the ATP7B gene.

본 발명의 일 양태는 윌슨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법으로서, One aspect of the present invention is a method for providing information necessary for diagnosis of Wilson's disease,

검체로부터 분리된 DNA를 주형으로, ATP7B(ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide) 유전자의 돌연변이를 포함하는 단편을 증폭시키는 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계, 및 (PCR) which amplifies a fragment containing a mutation of the ATP7B (ATPase, Cu ++ transporting, beta polypeptide) gene, using the DNA isolated from the sample as a template, and

수득된 PCR 산물을 대상으로 리가아제 검출 반응(LDR)을 수행하여, ATP7B 유전자의 돌연변이를 검출하는 단계를 포함하고, Detecting a mutation of the ATP7B gene by performing a ligase detection reaction (LDR) on the obtained PCR product,

상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 구성된 군으로부터 선택되고,Wherein the mutation of the ATP7B gene is selected from the group consisting of c.2333G> T, c.2621C> T, c.3809A> G, c.2513delA, and c.3086C> T,

상기 LDR은 해당 돌연변이 부위에 대한 야생형 검출용 왼쪽 프로브, 돌연변이형 검출용 왼쪽 프로브, 및 공통된 오른쪽 프로브로 이루어진 프로브 세트를 이용하여 수행되는 것인 방법을 제공한다. Wherein the LDR is performed using a probe set consisting of a left probe for wild type detection, a left probe for mutation detection, and a common right probe for the mutation site.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 구성될 수 있다. In one embodiment of the invention, the mutation of the ATP7B gene can consist of c.2333G> T, c.2621C> T, c.3809A> G, c.2513delA, and c.3086C> T.

본 발명에서 사용되는 ATP7B 유전자 돌연변이는 하기와 같이 정의된다:The ATP7B gene mutation used in the present invention is defined as follows:

ATP7B 유전자의 돌연변이는 서열번호 1을 기준으로 표시된다. 서열번호 1은 ATP7B 유전자(GenBank Accession No. NM_000053)의 코딩 서열(CDS)을 나타내며, 번역 개시 코돈인 ATG의 A를 뉴클레오티드 +1로 표시한다. The mutation of the ATP7B gene is represented by SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1 represents the coding sequence (CDS) of the ATP7B gene (GenBank Accession No. NM_000053), and A of the translation initiation codon ATG is represented by nucleotide +1.

치환(substitution) 돌연변이는 기호'>'를 표시하여 기재하며, '>'앞의 문자는 정상인 ATP7B 유전자의 뉴클레오티드이며, '>' 뒤의 문자는 돌연변이 ATP7B 유전자의 뉴클레오티드를 의미한다. 결실(deletion) 돌연변이는 "del"로 표시하며, "del" 다음의 문자는 결실된 뉴클레오티드를 나타낸다. Substitution mutations are indicated by the symbol '>', the letter preceding the '>' is the nucleotide of the normal ATP7B gene, and the letter after the '>' is the nucleotide of the mutant ATP7B gene. Deletion mutations are denoted by "del ", and letters following" del "denote deleted nucleotides.

돌연변이 "c.2333G>T"은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 2333번째 염기의 G에서 T로의 치환을 의미한다. The mutation "c.2333G > T" means the G to T substitution of the 2333rd base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

돌연변이 "c.2621C>T"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 2621번째 염기의 C에서 T로의 치환을 의미한다. The mutation "c.2621C > T" means the C to T substitution of the 2621 < th > base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO:

돌연변이 "c.3809A>G"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 3809번째 염기의 A에서 G로의 치환을 의미한다.The mutation "c.3809A > G" means substitution of A to G of the 3809 base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

돌연변이 "c.2513delA"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 2513번째 염기 A의 결실을 의미한다.The mutation "c.2513delA" means the deletion of nucleotide sequence 2513 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

돌연변이 "c.3086C>T"는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 3086번째 염기의 C에서 T로의 치환을 의미한다.The mutation "c.3086C> T" means the substitution of C to T of the 3086th base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

한국인 윌슨병 환자에 대한 연구 결과들에 의하면, c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>T가 전체 돌연변이 대립유전자의 50%를 차지하며 그 외에 c.2513delA, c.3086C>T, c.3104G>T, c.3247C>T, c.3556G>T의 돌연변이도 각각 1 내지 8% 빈도를 차지하는 것으로 확인되었다 (The Korean Journal of Hepatology 2009, 15, 295-298; Human Mutation 2007, 28, 1108-1113; Liver International, 2011, 31, 831-839). 따라서, 이들 돌연변이의 분석에 의해 60% 이상의 윌슨병 보인자 진단이 가능하다. C.2333G> T, c.2621C> T, c.3809A> T account for 50% of all mutant alleles, and c.2513delA, c.3086C> Mutations of T, c.3104G> T, c.3247C> T, and c.3556G> T were also found to occupy 1 to 8% of the frequency (see Korean Journal of Hepatology 2009, 15, 295-298; , 28, 1108-1113, Liver International, 2011, 31, 831-839). Thus, by analyzing these mutations, more than 60% of Wilson's disease can be diagnosed.

본 명세서에서 용어 "중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)"은 증폭시키고자 하는 표적 부위 특이적 프라이머 쌍 및 DNA 중합효소를 이용한, 연쇄 반응에 의해 표적 부위를 증폭시키는 반응을 의미한다. 중합효소 연쇄반응의 반응액의 조성 및 반응 조건은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자가 필요에 따라 용이하게 결정할 수 있다. As used herein, the term " polymerase chain reaction (PCR) "refers to a reaction in which a target site is amplified by a chain reaction using a target site-specific primer pair and a DNA polymerase to be amplified. The composition and reaction conditions of the reaction solution of the polymerase chain reaction can be easily determined by a person skilled in the art to which the present invention belongs.

본 명세서에서 용어 "리가아제 검출반응(ligase detection reaction, LDR)"은 서로 인접한 왼쪽 프로브와 오른쪽 프로브가 표적 유전자 서열과 완전히 상보적으로 결합한 경우에만 리가아제에 의해 라이게이션되는 것에 기반하여 표적 서열의 변이를 검출하는 반응을 의미한다. 왼쪽 프로브와 오른쪽 프로브가 서로 인접한 부분에서 완전히 상보적인 경우에만 리가아제에 의해 하나로 연결된 산물이 생성되고, 두 개의 프로브가 서로 인접한 부분에서 상보적이지 않을 경우에는 하나로 연결된 산물이 생성되지 않는다. 따라서, LDR은 반응의 특이성이 매우 높아서 돌연변이를 정확하게 검출할 수 있다. LDR에서는 각 사이클마다 리가아제에 의한 염기서열 특이적 라이게이션 반응이 일어나서 매우 정확하게 유전형을 확인할 수 있다. 특히, 열에 강한 리가아제를 사용하여 고온, 예를 들면, 45 내지 70℃에서 LDR을 수행할 경우, 프로브의 염기 서열 특이성이 더 높아지고, 프로브간 상호작용을 줄일 수 있으므로 다중 분석에 유리하다. As used herein, the term " ligase detection reaction (LDR) "refers to the reaction of a target sequence with a target sequence based on ligation by a ligase only when the adjacent left and right probes are fully complementary to the target gene sequence It means a reaction to detect mutation. If the left and right probes are completely complementary to each other, a ligated product is produced by one ligand, and if two probes are not complementary to each other, a linked product is not produced. Therefore, the LDR has a very high specificity of the reaction, so that the mutation can be accurately detected. In LDR, a nucleotide sequence-specific ligation reaction occurs by each ligase in each cycle, so that the genotype can be confirmed accurately. Particularly, when heat-resistant ligase is used to perform LDR at a high temperature, for example, 45 to 70 ° C, the sequence specificity of the probe becomes higher and the inter-probe interaction can be reduced, which is advantageous for multiplex analysis.

본 명세서에서 용어 "프로브(probe)"는 표적 서열에 상보적인 서열, 즉 표적 부위 특이적 서열을 포함하는, 단일가닥 핵산 분자를 의미한다. 프로브는 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위 내에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 리포터 형광물질 또는 소광물질(quencher)이 프로브의 말단에 부착될 수 있다. As used herein, the term "probe" refers to a single-stranded nucleic acid molecule that contains a sequence complementary to the target sequence, i.e., a target site-specific sequence. Probes can be modified to the extent that the hybridization specificity is not impaired. For example, a reporter fluorescent substance or a quencher may be attached to the end of the probe.

본 명세서에서 용어 "LDR 프로브"는 리가아제 검출 반응에서 이용되는 서로 인접한 표적 서열에 결합하는 왼쪽 프로브와 오른쪽 프로브를 의미한다. 왼쪽 프로브와 오른쪽 프로브가 모두 표적 서열에 완전한 상보성으로 결합한 경우에만 라이게이션이 일어나 하나의 LDR 산물을 생성하고, 그에 의해 표적 서열의 변이를 확인할 수 있게 한다. 특정 염기 서열의 돌연변이를 확인하기 위해 이용되는 LDR 프로브는 야생형 검출용 왼쪽 프로브, 돌연변이 검출용 왼쪽 프로브 및 공통된 오른쪽 프로브가 한 세트로 구성될 수 있다. 왼쪽 프로브의 5' 말단에 형광물질을 포함하나, 그에 한정되지 않는 표지 물질이 결합될 수 있고, 오른쪽 프로브의 5' 말단은 라이게이션을 위한 인산기로 수식될 수 있다. As used herein, the term "LDR probe" refers to a left probe and a right probe that bind to adjacent target sequences used in a ligase detection reaction. Only when the left probe and the right probe both bind to the target sequence with complete complementarity, ligation occurs to produce one LDR product, thereby allowing the identification of the variation of the target sequence. The LDR probe used to identify mutations in a particular base sequence can be configured as a set of wild-type detection left probes, mutation detection left probes, and common right probes. A label material including, but not limited to, a fluorescent material may be attached to the 5 'end of the left probe, and the 5' end of the right probe may be modified with a phosphate group for ligation.

본 명세서에서, "야생형 검출용 (LDR) 왼쪽 프로브"는 표적 부위의 야생형 서열과 완전히 상보적인 염기서열을 가져서 높은 특이성으로 표적 부위의 야생형 서열에 특이적으로 결합하는 프로브를 의미한다. As used herein, the term " left probe for wild type detection (LDR) "means a probe that has a base sequence completely complementary to the wild-type sequence of the target site and specifically binds to the wild-type sequence of the target site with high specificity.

본 명세서에서, "돌연변이형 검출용 (LDR) 왼쪽 프로브"는 표적 부위의 돌연변이형 서열과 완전히 상보적인 염기서열을 가져서 높은 특이성으로 표적 부위의 돌연변이형 서열에 특이적으로 결합하는 프로브를 의미한다. As used herein, the term "LDR left probe for mutation detection" means a probe having a base sequence completely complementary to a mutant sequence of a target site and specifically binding to a mutant sequence of a target site with high specificity.

LDR 반응 후, 해당 검체에서 ATP7B 돌연변이 부위의 유전형은 야생형 검출용 프로브와 돌연변이 검출용 프로브의 신호 검출에 의해 판단될 수 있다. 프로브가 형광 물질로 표지되고, 야생형 검출용 프로브의 형광 신호만 검출되는 경우, 해당 검체는 그 돌연변이 부위에 돌연변이를 갖지 않는 야생형, 즉, 정상이라는 것을 의미하고, 돌연변이 검출용 프로브의 형광 신호만 검출되는 경우, 이는 그 돌연변이의 동형접합형의 존재, 즉, 윌슨병 환자라는 것을 의미하며, 야생형 검출용 프로브와 돌연변이 검출용 프로브의 형광 신호가 모두 검출되는 경우, 이는 야생형과 돌연변이 모두가 존재하는 이형접합형을 갖는 보인자라는 것을 의미한다. After the LDR reaction, the genotype of the ATP7B mutation site in the specimen can be judged by signal detection of the wild type detecting probe and the mutation detecting probe. When the probe is labeled with a fluorescent substance and only the fluorescence signal of the wild type detection probe is detected, it means that the specimen is wild type, that is, normal, which does not mutate at the mutation site, and only fluorescence signal of the probe for mutation detection This means that it is a homozygous homozygote of the mutation, that is, a Wilson's disease patient. When both the wild type detecting probe and the fluorescent signal of the mutation detecting probe are detected, it is a variant in which both the wild type and the mutation are present Means a donor with a junction type.

본 명세서에서 용어 "프라이머(primer)"는 중합효소연쇄반응에서 증폭되는 표적 핵산 부위의 5' 말단 서열 또는 3' 말단 서열에 각각 상보적이고, 적합한 온도에서 중합효소 연쇄 반응액 중 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 반응 온도와 프라이머의 용도 등의 인자에 따라 정해지나, 일반적으로 15 내지 30개의 뉴클레오티드로 이루어진다. As used herein, the term "primer" refers to a nucleic acid sequence complementary to the 5 ' end or the 3 ' end sequence of a target nucleic acid region amplified in a polymerase chain reaction, Quot; means a single-stranded oligonucleotide that can act as a starting point for a polymerase reaction. The suitable length of the primer is determined depending on factors such as the reaction temperature and the use of the primer, but is generally 15 to 30 nucleotides.

본 발명의 일 구체예에서, 검체는 윌슨병의 진단 대상으로부터 분리된 혈액, 혈장, 혈청, 혈흔지, 체액, 뇨, 세포, 모발, 조직, 융모막, 양수, 태반, 또는 제대혈 등의 시료일 수 있고, 그로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 이용되는 방법에 의해 DNA를 분리할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the specimen can be a sample of blood, plasma, serum, blood, blood, urine, cells, hair, tissue, chorionic membrane, amniotic fluid, placenta, umbilical cord blood or the like separated from the subject of diagnosis of Wilson's disease And DNA can be isolated therefrom by a method commonly used in the technical field to which the present invention belongs.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 중합효소연쇄반응은 단일 또는 다중 중합효소 연쇄반응으로 수행될 수 있다. In one embodiment of the invention, the polymerase chain reaction can be performed in a single or multiple polymerase chain reaction.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 PCR은 서열번호 2 내지 11로 구성된 군으로부터 선택된 프라이머 쌍을 이용하여 수행될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the PCR may be performed using a pair of primers selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 2 to 11.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 왼쪽 프로브의 5' 말단은 형광 물질로 표지되고, 상기 오른쪽 프로브의 5' 말단은 라이게이션 반응을 위한 인산기로 수식될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the 5 'end of the left probe is labeled with a fluorescent substance and the 5' end of the right probe can be modified with a phosphate group for a ligation reaction.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 야생형 검출용 프로브와 돌연변이 검출용 프로브는 상이한 형광물질에 의해 표지될 수 있다. 이에 의해, 야생형 검출용 프로브의 형광물질에 의한 신호와 돌연변이 검출용 프로브의 형광물질에 의한 신호가 구별되므로, 야생형 검출용 프로브의 신호가 양성이면 야생형, 돌연변이 검출용 프로브의 신호가 양성이면 돌연변이, 양자 모두의 신호가 양성이면 야생형과 돌연변이의 이형접합형인 것으로 판단할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the wild type detecting probe and the mutation detecting probe may be labeled with different fluorescent materials. As a result, a signal due to the fluorescent substance of the wild type detection probe and a signal due to the fluorescent substance of the probe for mutation detection are distinguished. Therefore, if the signal of the wild type detection probe is positive and the signal of the probe for the mutation detection is positive, If both signals are positive, it can be judged to be a heterozygous type of wild type and mutation.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 형광물질은 6-FAM(6-Carboxyfluorescein), TET(2',7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 6-JOE(6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3(Cyanine 3), Cy5, 및 VIC로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In one embodiment of the invention, the fluorescent material is selected from the group consisting of 6-Carboxyfluorescein, TET (2 ', 7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 6-JOE 4 ', 5'-dichloro-2', 7'-dimethoxyfluorescein), HEX (2 ', 4', 5 ', 7'- tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3 (Cyanine 3) Cy5, and VIC. However, the present invention is not limited thereto.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 LDR에서In one embodiment of the present invention, the LDR

상기 c.2333G>T은 서열번호 12 내지 14의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되고,The c.2333G > T is detected by a probe set consisting of a probe comprising a target site specific sequence of SEQ ID NOS: 12 to 14,

상기 c.2621C>T는 서열번호 15 내지 17의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되며,Wherein c.2621C > T is detected by a probe set consisting of a probe comprising a target site-specific sequence of SEQ ID NOS: 15 to 17,

상기 c.3809A>G는 서열번호 18 내지 20의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되고,The above c.3809A> G is detected by a probe set consisting of a probe comprising a target site specific sequence of SEQ ID NOS: 18 to 20,

상기 c.2513delA는 서열번호 21 내지 23의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되며, 및 Wherein said c.2513delA is detected by a probe set consisting of a probe comprising a target site specific sequence of SEQ ID NOS: 21 to 23, and

상기 c.3086C>T는 서열번호 24 내지 26의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출될 수 있다. The c.3086C > T can be detected by a probe set comprising a probe comprising the target site specific sequence of SEQ ID NOS: 24 to 26.

본 발명의 일 구체예에서, LDR 프로브는 표적 돌연변이에 따라 LDR 산물의 크기가 구별될 수 있도록 최종 LDR 산물의 크기를 조절하기 위해 충전 서열(stuffer sequence)를 더 포함할 수 있다. 충전 서열의 크기 및 조성은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자가 필요에 따라 선택할 수 있다. In one embodiment of the invention, the LDR probe may further comprise a stuffer sequence to control the size of the final LDR product so that the size of the LDR product can be distinguished according to the target mutation. The size and composition of the charge sequence can be selected by a person skilled in the art to which the present invention belongs.

본 발명의 일 구체예에서, 왼쪽 LDR 프로브에 서열번호 27의 충전 서열을 포함시키고, 오른쪽 프로브에 서열번호 28의 충전 서열을 포함시킬 수 있다. In one embodiment of the invention, the left LDR probe can include the sequence of SEQ ID NO: 27 and the right probe can include the sequence of SEQ ID NO: 28.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 LDR에서, In one embodiment of the present invention, in the LDR,

상기 c.2333G>T은 서열번호 29 내지 31의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되고,Wherein c.2333G > T is detected by a probe set consisting of the probes of SEQ ID NOS: 29 to 31,

상기 c.2621C>T는 서열번호 32 내지 34의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되고,Wherein c.2621C > T is detected by a probe set consisting of the probes of SEQ ID NOS: 32 to 34,

상기 c.3809A>G는 서열번호 35 내지 37의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되고,C.3809A > G is detected by a probe set consisting of the probes of SEQ ID NOS: 35 to 37,

상기 c.2513delA는 서열번호 38 내지 40의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되며,The c.2513delA is detected by a probe set consisting of the probes of SEQ ID NOS: 38 to 40,

상기 c.3086C>T는 서열번호 31 내지 43의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출될 수 있다. The c.3086C > T can be detected by a probe set consisting of the probes of SEQ ID NOS: 31 to 43.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 리가아제 검출 반응(LDR)은 모세관 전기영동에 의해 LDR 산물을 분리하는 단계를 포함할 수 있다. In one embodiment of the invention, the ligase detection reaction (LDR) may comprise separating the LDR product by capillary electrophoresis.

모세관 전기영동 분석은 염기서열의 길이에서 1개의 뉴클레오티드 차이까지 구별할 수 있기 때문에, LDR 산물의 길이를 조절하여 여러 개의 돌연변이를 동시에 분석할 수 있다. 또한, LDR 산물의 길이를 다르게 하는 것 외에, 분석 대상 돌연변이별로 상이한 형광물질로 표지된 프로브를 사용하는 것에 의해 LDR 산물을 검출할 수 있다. Because capillary electrophoresis analysis can distinguish one nucleotide difference from the length of a nucleotide sequence, multiple mutations can be analyzed simultaneously by controlling the length of the LDR product. In addition to the different lengths of the LDR products, LDR products can be detected by using probes labeled with different fluorescent substances for mutations to be analyzed.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 리가아제 검출 반응은 대장균 리가아제, Taq 리가아제, T4 리가아제, 9°N 리가아제, 앰플리가아제(ampligase), 및 pfu DNA 리가아제로 구성된 군으로부터 선택된 리가아제를 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. In one embodiment of the present invention, the ligase detection reaction is carried out using a ligase selected from the group consisting of E. coli ligase, Taq ligase, T4 ligase, 9 [deg.] N ligase, Amplifyase, and pfu DNA ligase But the present invention is not limited thereto.

본 발명의 일 구체예에서, 윌슨병의 진단을 위해 필요한 정보를 제공하기 위해, 검체에 대해 ATP7B 유전자 돌연변이, c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T 중 하나 이상, 또는 5종 모두의 유전형을 분석할 수 있다. In one embodiment of the invention, in order to provide the necessary information for the diagnosis of Wilson's disease, the ATP7B gene mutation, c.2333G> T, c.2621C> T, c.3809A> G, c.2513delA, And c.3086C > T, or both.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, 및 c.3809A>G로 이루어질 수 있다. In one embodiment of the invention, the mutation of the ATP7B gene can consist of c.2333G> T, c.2621C> T, and c.3809A> G.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 이루어질 수 있다.In one embodiment of the invention, the mutation of the ATP7B gene can consist of c.2333G> T, c.2621C> T, c.3809A> G, c.2513delA, and c.3086C> T.

본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 2 내지 11의 PCR 프라이머 및 서열번호 12 내지 26의 서열을 포함하는 LDR 프로브를 포함하는, ATP7B 유전자의 돌연변이 검출용 조성물로서, Another aspect of the present invention is a composition for detecting a mutation of the ATP7B gene, which comprises a PCR primer of SEQ ID NO: 2 to 11 and an LDR probe comprising the sequence of SEQ ID NO: 12 to 26,

상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 구성된 군으로부터 선택되고, Wherein the mutation of the ATP7B gene is selected from the group consisting of c.2333G> T, c.2621C> T, c.3809A> G, c.2513delA, and c.3086C> T,

상기 c.2333G>T은 서열번호 2 및 3의 프라이머로 이루어진 PCR 프라이머 쌍 및 서열번호 12 내지 14의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고, The c.2333G > T is detected by a pair of PCR primers consisting of the primers of SEQ ID NOS: 2 and 3 and a set of LDR probes consisting of probes comprising the target site specific sequences of SEQ ID NOs: 12 to 14,

상기 c.2621C>T는 서열번호 4 및 5의 프라이머로 이루어진 PCR 프라이머 쌍 및 서열번호 15 내지 17의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되며,The c.2621C > T is detected by a pair of PCR primers consisting of the primers of SEQ ID NOS: 4 and 5 and a set of LDR probes consisting of the probe containing the target site specific sequence of SEQ ID NOS: 15 to 17,

상기 c.3809A>G는 서열번호 6 및 7의 프라이머로 이루어진 PCR 프라이머 쌍 및 서열번호 18 내지 20의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고,Wherein c.3809A> G is detected by a pair of PCR primers consisting of the primers of SEQ ID NOs: 6 and 7 and a set of LDR probes consisting of probes comprising the target site specific sequences of SEQ ID NOs: 18 to 20,

상기 c.2513delA는 서열번호 8 및 9의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 21 내지 23의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되며, 및 The c.2513 delA is detected by a set of LDR probes consisting of a primer pair consisting of the primers of SEQ ID NOs: 8 and 9 and a probe comprising the target site specific sequence of SEQ ID NOs: 21 to 23, and

상기 c.3086C>T는 서열번호 10 및 11의 프라이머로 이루어진 PCR 프라이머 쌍 및 서열번호 24 내지 26의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고,Wherein c.3086C > T is detected by a pair of PCR primers consisting of the primers of SEQ ID NOs: 10 and 11 and a set of LDR probes consisting of the probe comprising the target site specific sequence of SEQ ID NOs: 24 to 26,

상기 프로브 세트는 해당 돌연변이 부위에 대한 야생형 검출용 왼쪽 프로브, 돌연변이형 검출용 왼쪽 프로브, 및 공통된 오른쪽 프로브로 이루어지는 것인 조성물을 제공한다.Wherein the probe set comprises a left probe for wild type detection, a left probe for mutation detection, and a common right probe for the mutation site.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 구성될 수 있다. In one embodiment of the invention, the mutation of the ATP7B gene can consist of c.2333G> T, c.2621C> T, c.3809A> G, c.2513delA, and c.3086C> T.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 LDR 프로브 중 야생형 검출용 왼쪽 LDR 프로브와 돌연변이형 검출용 왼쪽 LDR 프로브는 5' 말단에서 상이한 형광 물질로 표지되고, 오른쪽 LDR 프로브는 5' 말단에서 라이게이션을 위한 인산기로 수식될 수 있다. 야생형 검출용 프로브의 형광물질에 의한 신호와 돌연변이 검출용 프로브의 형광 물질에 의한 신호가 구별되므로, 야생형 검출용 프로브의 신호가 양성이면 야생형, 돌연변이 검출용 프로브의 신호가 양성이면 돌연변이, 양자 모두의 신호가 양성이면 야생형과 돌연변이의 이형접합형인 것으로 판단할 수 있다. In one embodiment of the invention, the left LDR probe for wild type detection and the left LDR probe for mutation detection in the LDR probe are labeled with a different fluorescent substance at the 5 'end, and the right LDR probe is labeled for the ligation at the 5' It can be modified with phosphoric acid. Since the signal by the fluorescent substance of the wild type detection probe and the signal by the fluorescent substance of the probe for mutation detection are distinguished, if the signal of the wild type detection probe is positive, the wild type, if the signal of the mutation detection probe is positive, If the signal is positive, it can be judged to be a heterozygous type of wild type and mutation.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 형광 물질은 6-FAM, TET, 6-JOE, HEX, Cy3, Cy5, 및 VIC로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the fluorescent material may be selected from the group consisting of 6-FAM, TET, 6-JOE, HEX, Cy3, Cy5, and VIC.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 윌슨병의 진단을 위해 사용될 수 있다. In one embodiment of the invention, the composition can be used for the diagnosis of Wilson's disease.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 중합효소 연쇄반응의 수행을 위해 필요한 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), DNA 중합효소, 및 완충 용액을 더 포함할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the composition may further comprise a dNTP mixture (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), a DNA polymerase, and a buffer solution necessary for carrying out a polymerase chain reaction.

본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 2 내지 11의 서열로 이루어진, ATP7B 유전자의 돌연변이 증폭용 프라이머 세트로서, Another embodiment of the present invention is a primer set for mutation amplification of the ATP7B gene comprising the sequence of SEQ ID NOS: 2 to 11,

상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 구성된 군으로부터 선택되고, Wherein the mutation of the ATP7B gene is selected from the group consisting of c.2333G> T, c.2621C> T, c.3809A> G, c.2513delA, and c.3086C> T,

서열번호 2과 3으로 이루어진 프라이머 쌍은 c.2333G>T의 증폭을 위해 이용되고, The primer pair consisting of SEQ ID NOS: 2 and 3 is used for amplification of c.2333G > T,

서열번호 4와 5 이루어진 프라이머 쌍은 c.2621C>T의 증폭을 위해 이용되며, The primer pair consisting of SEQ ID NOS: 4 and 5 is used for amplification of c.2621C > T,

서열번호 6과 7로 이루어진 프라이머 쌍은 c.3809A>G의 증폭을 위해 이용되고, The primer pair consisting of SEQ ID NOS: 6 and 7 is used for the amplification of c. 3809A > G,

서열번호 8과 9로 이루어진 프라이머 쌍은 c.2513delA의 증폭을 위해 이용되며, The primer pair consisting of SEQ ID NOS: 8 and 9 is used for amplification of c.2513 delA,

서열번호 10과 11로 이루어진 프라이머 쌍은 c.3086C>T의 증폭을 위해 이용되는 것인 프라이머 세트를 제공한다. A pair of primers consisting of SEQ ID NOS: 10 and 11 provides a set of primers that are used for amplification of c.3086C> T.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 ATP7B 돌연변이 검출을 위한 반응 전에 검체의 ATP7B 돌연변이 부위의 증폭을 위해 이용될 수 있다. In one embodiment of the invention, the primer set can be used for amplification of the ATP7B mutation site of the sample prior to the reaction for ATP7B mutation detection.

본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 12 내지 26의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진, ATP7B 유전자의 돌연변이 검출용 LDR 프로브 세트로서, Another embodiment of the present invention is a set of LDR probes for detecting mutation of the ATP7B gene, which comprises a probe comprising a target site-specific sequence of SEQ ID NOS: 12 to 26,

상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 구성된 군으로부터 선택되고,Wherein the mutation of the ATP7B gene is selected from the group consisting of c.2333G> T, c.2621C> T, c.3809A> G, c.2513delA, and c.3086C> T,

각 LDR 프로브 세트는 해당 돌연변이 부위에 대한 야생형 검출용 왼쪽 프로브, 돌연변이형 검출용 왼쪽 프로브, 및 공통된 오른쪽 프로브로 이루어지고,Each LDR probe set consists of a left probe for wild type detection for the mutation site, a left probe for mutation detection, and a common right probe,

c.2333G>T는 서열번호 12 내지 14의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고, c.2333G > T is detected by a set of LDR probes consisting of probes comprising target site specific sequences of SEQ ID NOS: 12 to 14,

c.2621C>T는 서열번호 15 내지 17의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되며, c.2621C > T is detected by a set of LDR probes consisting of probes comprising the target site-specific sequences of SEQ ID NOS: 15 to 17,

c.3809A>G는 서열번호 18 내지 20의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고, c.3809A > G is detected by a set of LDR probes consisting of probes comprising target site specific sequences of SEQ ID NOS: 18 to 20,

c.2513delA는 서열번호 21 내지 23의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고, 및 c.2513 delA was detected by a set of LDR probes consisting of probes comprising the target site specific sequences of SEQ ID NOS: 21 to 23, and

c.3086C>T는 서열번호 24 내지 26의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되는 것인 LDR 프로브 세트를 제공한다. c. 3086C > T is detected by a set of LDR probes consisting of probes comprising the target site specific sequences of SEQ ID NOS: 24 to 26.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 LDR 프로브 세트는 ATP7B 유전자의 돌연변이를 검출하기 위한 리가아제 검출 반응에서 이용될 수 있다. In one embodiment of the invention, the LDR probe set may be used in a ligation assay to detect mutations of the ATP7B gene.

본 발명의 일 구체예에서, 각 돌연변이 부위에 대한 LDR 프로브 세트는 해당 돌연변이 부위에 대한 야생형 검출용 왼쪽 프로브, 돌연변이형 검출용 왼쪽 프로브, 및 공통된 오른쪽 프로브로 이루어지고, 상기 왼쪽 프로브의 5' 말단은 형광 물질로 표지되고, 상기 오른쪽 프로브의 5' 말단은 라이게이션 반응을 위한 인산기로 수식될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the LDR probe set for each mutation site comprises a left probe for wild type detection, a left probe for mutation detection, and a common right probe for the mutation site, Is labeled with a fluorescent substance, and the 5 ' end of the right probe can be modified with a phosphate group for ligation reaction.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 야생형 검출용 왼쪽 프로브와 상기 돌연변이형 검출용 왼쪽 프로브는 상이한 형광 물질로 표지될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the wild type detecting left probe and the mutant detecting left probe may be labeled with different fluorescent materials.

본 발명의 일 구체예에서, LDR 프로브는 표적 돌연변이에 따라 LDR 산물의 크기가 구별될 수 있도록 LDR 산물의 크기를 조절하기 위해 충전 서열을 더 포함할 수 있다. 충전 서열은 왼쪽 프로브의 5' 영역, 또는 오른쪽 프로브의 3' 영역, 또는 왼쪽 프로브의 5' 영역 및 오른쪽 프로브의 3' 영역에 추가될 수 있다.In one embodiment of the invention, the LDR probe may further comprise a charge sequence to control the size of the LDR product such that the size of the LDR product can be distinguished according to the target mutation. The charge sequence may be added to the 5 'region of the left probe, the 3' region of the right probe, or the 5 'region of the left probe and the 3' region of the right probe.

이하에서 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

본 발명의 일 구체예에 따른 ATP7B 돌연변이에 특이적인 프라이머 및 프로브를 이용한 중합효소 연쇄반응 및 리가아제 검출 반응에 의해 한국인 호발 ATP7B 돌연변이의 존재 여부를 신속하고 정확하게 판별하고, 이에 의해 이에 의해 윌슨병의 조기 진단, 보인자 판별, 및 효율적 질환 관리에 크게 기여할 수 있다.The presence or absence of the ATP7B mutation in Korean can be rapidly and accurately determined by a polymerase chain reaction and a ligase detection reaction using a primer and a probe specific for the ATP7B mutation according to an embodiment of the present invention, Early diagnosis, identification of donors, and efficient disease management.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 방법에 의해 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, 2513delA, 및 c.3086C>T의 이형접합형 및 야생형에 대해 수득된 LDR 분석 결과를 보여준다. Figure 1 is a graph showing the results obtained for the heterozygous and wild type strains of c.2333G> T, c.2621C> T, c.3809A> G, 2513delA, and c.3086C> T by the method according to one embodiment of the present invention LDR analysis results.

실시예 1. ATP7B 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 제작Example 1. Preparation of ATP7B gene mutation detection primer and probe

서열번호 1의 ATP7B 유전자(GenBank Accession No., NM_000053)의 돌연변이는 구리 대사 이상 질환인 윌슨병을 유발하는 것으로 알려져 있다. 본 실시예에서는 한국인에서 높은 빈도로 발생하는 것으로 확인된 ATP7B 유전자의 돌연변이, c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA 및 c.3086C>T를 검출하기 위해 이용할 수 있는 PCR 프라이머 및 LDR 프로브를 제작하였다. Mutations in the ATP7B gene of SEQ ID NO: 1 (GenBank Accession No. NM_000053) are known to cause Wilson's disease, a copper metabolic disorder. In this example, to detect mutations in the ATP7B gene, c.2333G> T, c.2621C> T, c.3809A> G, c.2513delA and c.3086C> T, Available PCR primers and LDR probes were prepared.

ATP7B 유전자의 염기 서열을 바탕으로 각 표적 돌연변이를 포함하는 부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 설계하였다. 하기의 표 1은 각 표적 돌연변이를 포함하는 부위를 증폭하기 위해 중합효소 연쇄반응에서 사용하는 프라이머를 나타낸다.Based on the nucleotide sequence of the ATP7B gene, a pair of primers was designed to amplify the region containing each target mutation. Table 1 below shows the primers used in the polymerase chain reaction to amplify sites containing each target mutation.

표적Target 프라이머 서열 (5' 말단→3' 말단 방향)The primer sequence (from the 5 'end to the 3' end) c.2333G>Tc.2333G> T F: TCT GGT CAT CCT GGT GGT TG (서열번호 2) F: TCT GGT CAT CCT GGT GGT TG (SEQ ID NO: 2) R: AA CAT GGT GTT CAG AGG AAG TGA (서열번호 3) R: AA CAT GGT GTT CAG AGG AAG TGA (SEQ ID NO: 3) c.2621C>Tc.2621C> T F: AGC TGG CCT AGA ACC TGA CC (서열번호 4) F: AGC TGG CCT AGA ACC TGA CC (SEQ ID NO: 4) R: CAT CTG AGC CTC TTC CAC CA (서열번호 5)R: CAT CTG AGC CTC TTC CAC CA (SEQ ID NO: 5) c.3809A>Gc.3809A> G F: GGT CCA GGA GCT CCA GAA TAA (서열번호 6)F: GGT CCA GGA GCT CCA GAA TAA (SEQ ID NO: 6) R: ACA GTG AGG AAG GGG TCT GC (서열번호 7)R: ACA GTG AGG AAG GGG TCT GC (SEQ ID NO: 7) c.2513delAc.2513delA F: AGC TGG CCT AGA ACC TGA CC (서열번호 8)F: AGC TGG CCT AGA ACC TGA CC (SEQ ID NO: 8) R: CAT CTG AGC CTC TTC CAC CA (서열번호 9)R: CAT CTG AGC CTC TTC CAC CA (SEQ ID NO: 9) c.3086C>Tc.3086C> T F: TCT TTG CAG TGG GAG TTG TTG (서열번호 10)F: TCT TTG CAG TGG GAG TTG TTG (SEQ ID NO: 10) R: AAT AAA AGA GCA TTG GCG GG (서열번호 11)R: AAT AAA AGA GCA TTG GCG GG (SEQ ID NO: 11)

또한, c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA 및 c.3086C>T 에 대하여 서열 특이적인 라이게이션 반응을 위한 프로브를 제작하였다. 프로브는 해당 부위별로 왼쪽 프로브 2개 (야생형 및 돌연변이형 각 1개)와 오른쪽 프로브 1개 (공통)의 세트로 구성된다. 야생형 왼쪽 프로브는 3' 말단이 야생형 서열과 완벽하게 일치하며 돌연변이형 왼쪽 프로브는 3' 말단이 돌연변이형 서열과 완벽하게 일치하여 야생형과 돌연변이형의 염기서열에 따라 특이성을 가질 수 있도록 디자인하였다. 왼쪽 프로브의 5' 말단에는 형광 물질을 표지하였고, 변이가 없는 야생형 유전자 단편과 결합하는 프로브, 즉 야생형 검출용 프로브와 변이가 있는 유전자 단편과 결합하는 프로브, 즉 돌여변이 검출형 프로브는 각각 서로 다른 형광물질로 표지하였다. 오른쪽 프로브의 5' 말단은 라이게이션 반응을 위하여 인산기로 수식하였다.
In addition, probes for sequence specific ligation reactions were prepared for c.2333G> T, c.2621C> T, c.3809A> G, c.2513delA and c.3086C> T. The probe consists of a set of two left probes (one for each of the wild type and the mutant type) and one right probe (common for each). The wild-type left probe is designed to match the wild-type sequence at the 3 'end, and the 3' end of the mutant-type left probe is perfectly matched to the mutant-type sequence, so that it can have specificity depending on the wild type and mutant type. A fluorescent substance was labeled at the 5 'end of the left probe, and a probe binding to a wild-type gene fragment without mutation, that is, a probe binding to a wild-type detection probe and a gene fragment having a mutation, And labeled with a fluorescent substance. The 5 'end of the right probe was modified with phosphate groups for the ligation reaction.

하기의 표 2는 각 표적 돌연변이 부위의 야생형 및 돌연변이형을 검출하는 프로브를 나타낸다.Table 2 below shows probes for detecting wild type and mutant type of each target mutation site.

표적 돌연변이Target mutation 프로브　Probe 프로브 서열 (5' 말단→3' 말단 방향)The probe sequence (from the 5 'end to the 3' end) c.2333G>Tc.2333G> T 야생형 왼쪽Wild type left TACCTTTGCCAAGTGTTCCAGCCACC (서열번호 12)TACCTTTGCCAAGTGTTCCAGCCACC (SEQ ID NO: 12) 돌연변이형 왼쪽Mutant left TACCTTTGCCAAGTGTTCCAGCCACA (서열번호 13)TACCTTTGCCAAGTGTTCCAGCCACA (SEQ ID NO: 13) 오른쪽Right side GGCCCAGGGCAATGAACACAAAGA (서열번호 14)GGCCCAGGGCAATGAACACAAAGA (SEQ ID NO: 14) c.2621C>Tc.2621C> T 야생형 왼쪽 Wild type left CTAAGAAACCCGGAAGCACTGTAATTGC (서열번호 15)CTAAGAAACCCGGAAGCACTGTAATTGC (SEQ ID NO: 15) 돌연변이형 왼쪽Mutant left CTAAGAAACCCGGAAGCACTGTAATTGT (서열번호 16)CTAAGAAACCCGGAAGCACTGTAATTGT (SEQ ID NO: 16) 오른쪽Right side GGGGTCTATAAATGCACATGGCTCTGTG (서열번호 17)GGGGTCTATAAATGCACATGGCTCTGTG (SEQ ID NO: 17) c.3809A>Gc.3809A> G 야생형 왼쪽Wild type left GGGCCAAGGCCGGGGAGTCAT (서열번호 18)GGGCCAAGGCCGGGGAGTCAT (SEQ ID NO: 18) 돌연변이형 왼쪽Mutant left GGGCCAAGGCCGGGGAGTCAC (서열번호 19)GGGCCAAGGCCGGGGAGTCAC (SEQ ID NO: 19) 오른쪽Right side TGACCCCATCCCCCACCATGG (서열번호 20)TGACCCCATCCCCCACCATGG (SEQ ID NO: 20) c.2513delAc.2513delA 야생형 왼쪽Wild type left GTCAAGGTGGTCCCTGGGGGAAA (서열번호 21)GTCAAGGTGGTCCCTGGGGGAAA (SEQ ID NO: 21) 돌연변이형 왼쪽Mutant left GTCAAGGTGGTCCCTGGGGGAA- (서열번호 22)GTCAAGGTGGTCCCTGGGGGAA- (SEQ ID NO: 22) 오른쪽Right side GTTTCCAGTGGATGGGAAAGTCCTGGA (서열번호 23)GTTTCCAGTGGATGGGAAAGTCCTGGA (SEQ ID NO: 23) c.3086C>Tc.3086C> T 야생형 왼쪽Wild type left ACGCCATGGGTAATGGTGCCAG (서열번호 24)ACGCCATGGGTAATGGTGCCAG (SEQ ID NO: 24) 돌연변이형 왼쪽Mutant left ACGCCATGGGTAATGGTGCCAA (서열번호 25)ACGCCATGGGTAATGGTGCCAA (SEQ ID NO: 25) 오른쪽Right side TCTTGTCAAACATCACAGTCTTTATCTGCCAAAAAC (서열번호 26)TCTTGTCAAACATCACAGTCTTTATCTGCCAAAAAC (SEQ ID NO: 26)

결과분석 시 모세관 전기영동 상에서 표적 돌연변이 별 라이게이션 산물을 구별하기 위하여 표적 돌연변이를 포함하는 부위에 특이적인 서열에 크기 조절을 위한 충전 서열(stuffer sequence)을 프로브에 추가하여 최종 LDR 산물의 크기를 다르게 할 수 있다. 하기 표 3은 충전 서열의 예시이며, 필요에 따라 길이를 조절하여 사용할 수 있다.In order to distinguish the ligation products of the target mutants on the capillary electrophoresis in the result analysis, the size of the final LDR product was varied by adding a stuffer sequence for size control to the sequence specific to the site containing the target mutation can do. Table 3 below is an example of the charge sequence, and the length can be adjusted as needed.

서열 (5' 말단→3' 말단 방향)Sequence (from the 5 'end to the 3' end) 왼쪽 프로브용For left probe GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTACTACTATTAGTA (서열번호 27)GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTACTACTATTAGTA (SEQ ID NO: 27) 오른쪽 프로브용For right probe TAAATCTACTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC (서열번호 28)TAAATCTACTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC (SEQ ID NO: 28)

결과분석 시 모세관 전기영동 상에서 표적 돌연변이별 라이게이션 산물을 구별하기 위하여 길이 조절을 위한 충전 서열을 추가하는 방법 외에도 돌연변이별 서로 다른 형광물질을 수식하여 구분할 수 있다.In order to distinguish ligation products from target mutants on capillary electrophoresis in the result analysis, it is possible to distinguish the different fluorescent substances by mutation in addition to adding the charge sequence for length control.

하기 표 4는 각 돌연변이에 대하여 표적 부위 특이적인 서열 및 충전 서열을 포함하는 LDR 프로브 서열을 보여준다. 야생형 왼쪽 프로브와 돌연변이형 왼쪽 프로브는 각각 HEX 및 FAM으로 표지되었다. Table 4 below shows the LDR probe sequences containing the target site specific sequence and the charge sequence for each mutation. The wild type left probe and the mutant type left probe were labeled with HEX and FAM, respectively.

표적
돌연변이Target
Mutation 프로브　Probe 프로브 서열 (5' 말단→3' 말단 방향)The probe sequence (from the 5 'end to the 3' end) c.2333G>Tc.2333G> T 야생형 왼쪽Wild type left HEX-GGGTTCCCTAAGGGTTGGATACCTTTGCCAAGTGTTCCAGCCACC (서열번호 29)HEX-GGGTTCCCTAAGGGTTGGATACCTTTGCCAAGTGTTCCAGCCACC (SEQ ID NO: 29) 돌연변이형 왼쪽Mutant left FAM-GGGTTCCCTAAGGGTTGGATACCTTTGCCAAGTGTTCCAGCCACA (서열번호 30)FAM-GGGTTCCCTAAGGGTTGGATACCTTTGCCAAGTGTTCCAGCCACA (SEQ ID NO: 30) 오른쪽Right side P-GGCCCAGGGCAATGAACACAAAGATCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC (서열번호 31)P-GGCCCAGGGCAATGAACACAAAGATCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC (SEQ ID NO: 31) c.2621C>Tc.2621C> T 야생형 왼쪽 Wild type left HEX-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTCTAAGAAACCCGGAAGCACTGTAATTGC (서열번호 32)HEX-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTCTAAGAAACCCGGAAGCACTGTAATTGC (SEQ ID NO: 32) 돌연변이형 왼쪽Mutant left FAM-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTCTAAGAAACCCGGAAGCACTGTAATTGT (서열번호 33)FAM-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTCTAAGAAACCCGGAAGCACTGTAATTGT (SEQ ID NO: 33) 오른쪽Right side P-GGGGTCTATAAATGCACATGGCTCTGTGAATCTACTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC (서열번호 34)P-GGGGTCTATAAATGCACATGGCTCTGTGAATCTACTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC (SEQ ID NO: 34) c.3809A>Gc.3809A> G 야생형 왼쪽Wild type left HEX-GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGGGCCAAGGCCGGGGAGTCAT (서열번호 35)HEX-GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGGGCCAAGGCCGGGGAGTCAT (SEQ ID NO: 35) 돌연변이형 왼쪽Mutant left FAM-GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGGGCCAAGGCCGGGGAGTCAC (서열번호 36)FAM-GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGGGCCAAGGCCGGGGAGTCAC (SEQ ID NO: 36) 오른쪽Right side P-TGACCCCATCCCCCACCATGGTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC (서열번호 37)P-TGACCCCATCCCCCACCATGGTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC (SEQ ID NO: 37) c.2513delAc.2513delA 야생형 왼쪽Wild type left HEX-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTACTACTATTAGTAGTCAAGGTGGTCCCTGGGGGAAA (서열번호 38)HEX-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTACTACTATTAGTAGTCAAGGTGGTCCCTGGGGGAAA (SEQ ID NO: 38) 돌연변이형 왼쪽Mutant left FAM-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTACTACTATTAGTAGTCAAGGTGGTCCCTGGGGGAA- (서열번호 39)FAM-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTACTACTATTAGTAGTCAAGGTGGTCCCTGGGGGAA- (SEQ ID NO: 39) 오른쪽Right side P-GTTTCCAGTGGATGGGAAAGTCCTGGATAAATCTACTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC (서열번호 40)P-GTTTCCAGTGGATGGGAAAGTCCTGGATAAATCTACTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC (SEQ ID NO: 40) c.3086C>Tc.3086C> T 야생형 왼쪽Wild type left HEX-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTACTACACGCCATGGGTAATGGTGCCAG (서열번호 41)HEX-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTACTACACGCCATGGGTAATGGTGCCAG (SEQ ID NO: 41) 돌연변이형 왼쪽Mutant left FAM-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTACTACACGCCATGGGTAATGGTGCCAA (서열번호 42)FAM-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCTACTACACGCCATGGGTAATGGTGCCAA (SEQ ID NO: 42) 오른쪽Right side P-TCTTGTCAAACATCACAGTCTTTATCTGCCAAAAACAAATCTACTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC (서열번호 43)P-TCTTGTCAAACATCACAGTCTTTATCTGCCAAAAACAAATCTACTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC (SEQ ID NO: 43)

실시예 2. 중합효소 연쇄반응 및 리가아제 검출 반응에 의한 ATP7B 유전자형 판별Example 2. Identification of ATP7B genotypes by polymerase chain reaction and ligase detection reaction

본 실시예에서는 실시예 1에서 수득된 PCR용 프라이머 및 LDR용 프로브를 이용하여, 검체의 ATP7B 유전자형을 분석하였다.
In this Example, the ATP7B genotype of the specimen was analyzed using the PCR primer and the LDR probe obtained in Example 1.

2-1. 중합효소 연쇄반응2-1. Polymerase chain reaction

검체의 혈액 등의 샘플로부터 지노믹 DNA를 분리하였다. DNA 분리 및 정제는 G-dex Kit(인트론)를 이용하였다. 중합효소 연쇄반응에는 실시예 1에서 제작된 표적 돌연변이 부위를 포함하는 단편의 증폭용 프라이머(서열번호 2 내지 11)를 사용하였다. 중합효소 연쇄반응 반응물은 각 15 ㎕ 반응을 기준으로 지노믹 DNA 주형 1㎕, 각 프라이머 0.133 uM을 포함하였다. 다중 중합효소 연쇄반응은 95℃에서 5분간 반응시키고, 94℃에서 1, 57℃에서의 1분, 72℃에서의 1분 30초로 이루어진 사이클을 35회 수행하고, 72℃에서 5분간 반응시켰다. 중합효소연쇄반응 후에는 Exo-SAP(GE Healthcare)을 처리하여 남아있는 dNTP와 잔류 프라이머를 제거하였다.
Genomic DNA was isolated from a sample such as blood of a specimen. G-dex Kit (intron) was used for DNA isolation and purification. For the polymerase chain reaction, primers (SEQ ID NOS: 2 to 11) for amplification of fragments containing the target mutation site prepared in Example 1 were used. The polymerase chain reaction reaction contained 1 μl of genomic DNA template and 0.133 μM of each primer on the basis of each 15 μl reaction. The multiple polymerase chain reaction was carried out at 95 ° C. for 5 minutes, and the cycle consisting of 94 ° C. for 1 minute at 57 ° C., 1 minute 30 seconds at 72 ° C. was performed 35 times and reaction was carried out at 72 ° C. for 5 minutes. After the polymerase chain reaction, Exo-SAP (GE Healthcare) was treated to remove residual dNTPs and residual primers.

2-2. LDR(Ligation Detection Reaction)에 의한 ATP7B 유전자 돌연변이의 검출2-2. Detection of mutation of ATP7B gene by LDR (Ligation Detection Reaction)

리가아제 검출 반응을 위한 반응액은 실시예 2-1에서 수득된 Exo-SAP 처리가 끝난 중합효소 연쇄반응물 1 ㎕와 각 표적 돌연변이와 야생형을 탐침할 수 있는 형광 표지된 프로브(서열번호 29 내지 43) 각각 250 fmole을 첨가한 반응물에 5 Unit의 Taq 리가아제 및 1X 반응버퍼를 포함했다. 반응은 94℃에서 1분, 65℃에서 2분 30초로 이루어진 사이클을 25회 수행하였다. 수행된 결과는 모세관 전기영동을 통해 확인하였다.
The reaction solution for the ligase detection reaction was prepared by mixing 1 占 of the Exo-SAP-treated polymerase chain reaction obtained in Example 2-1 with fluorescently labeled probes capable of probing each target mutant and wild type (SEQ ID NOs: 29 to 43 ) Were added 5 units of Taq ligase and 1X reaction buffer to the reaction mixture added with 250 fmole each. The reaction was carried out 25 times at 94 DEG C for 1 minute and at 65 DEG C for 2 minutes and 30 seconds. The results were confirmed by capillary electrophoresis.

도 1은 모세관 전기영동결과를 나타낸다. 모세관 전기영동결과 모두 야생형 프로브에 결합된 형광색의 피크(peak)를 나타내는 샘플은 표적 돌연변이를 포함하는 유전자 부위에서 야생형이고, 5개의 피크 중 야생형에 결합된 형광색의 피크와 돌연변이형 프로브에 결합된 형광색의 피크가 함께 검출되는 샘플은 야생형과 돌연변이형 유전자를 모두 갖는 이형접합 돌연변이(hetero)로 진단할 수 있다.
Figure 1 shows the results of capillary electrophoresis. All of the capillary electrophoresis results showed that the sample exhibiting the peak of fluorescent color bound to the wild-type probe was wild-type at the gene site containing the target mutation, and the peak of the fluorescent color bound to the wild type among the five peaks and the fluorescent color coupled to the mutant probe Can be diagnosed as a heterozygous mutant (hetero) having both wild type and mutant type genes.

실시예 3. 임상검체 유전자형 진단Example 3. Diagnosis of Clinical Specimen Genotype

실시예 1에서 제작된 한국인 윌슨병의 원인이 되는 주요한 ATP7B 돌연변이, c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA 및 c.3086C>T를 검출하는 프라이머 및 프로브를 사용하여 실제 임상검체를 대상으로 유전자 검사를 실시하였다.
Primers and probes were used to detect the major ATP7B mutations causing Korean Wilson's disease in Example 1, c.2333G> T, c.2621C> T, c.3809A> G, c.2513delA and c.3086C> Were used to conduct genetic tests on actual clinical specimens.

랩지노믹스 진단검사의학과에서 수집된 600개의 샘플로부터 추출한 지노믹 DNA를 주형으로 각 유전형에 대한 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 및 LDR을 수행하여 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA 및 c.3086C>T 돌연변이 5종에 대한 유전형을 분석하였다. 실험결과 600명 중 c.2333G>T 2명, c.2621C>T 3명, c.3809A>G 1명, c.2513delA 1명, c.3086C>T 1명의 이형접합 변이가 검출되었다. 야생형과 이형접합 돌연변이 검체들에 대한 염기서열분석 결과 100% 결과가 일치함을 확인하였다.
C.2333G> T, c.2621C> T, c. By carrying out PCR and LDR using genomic DNA extracted from 600 samples collected from Lap Genomics Diagnostic Laboratory and using primer and probe set for each genotype. 3809A> G, c.2513delA, and c.3086C> T mutations were analyzed. Among the 600 patients, heterozygous mutations of c.2333G> T 2, c.2621C> T 3, c.3809A> G 1, c.2513delA 1, and c.3086C> T 1 were detected. Sequence analysis of wild type and heterozygous mutant samples confirmed 100% results.

이와 같은 결과는 본 발명의 일 구체예에 따른 ATP7B 돌연변이 검출 방법이 한국인에서 윌슨병을 유발하는 주요한 ATP7B 돌연변이를 효과적으로 검출하여, 윌슨병의 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다는 것을 보여준다.These results show that the ATP7B mutation detection method according to one embodiment of the present invention effectively detects the major ATP7B mutation causing Wilson's disease in Korean and can provide information necessary for diagnosis of Wilson's disease.

<110> Lab Genomics <120> Detection of ATP7B mutations using PCR-LDR <160> 43 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4398 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgcctgagc aggagagaca gatcacagcc agagaagggg ccagtcggaa aatcttatct 60 aagctttctt tgcctacccg tgcctgggaa ccagcaatga agaagagttt tgcttttgac 120 aatgttggct atgaaggtgg tctggatggc ctgggccctt cttctcaggt ggccaccagc 180 acagtcagga tcttgggcat gacttgccag tcatgtgtga agtccattga ggacaggatt 240 tccaatttga aaggcatcat cagcatgaag gtttccctgg aacaaggcag tgccactgtg 300 aaatatgtgc catcggttgt gtgcctgcaa caggtttgcc atcaaattgg ggacatgggc 360 ttcgaggcca gcattgcaga aggaaaggca gcctcctggc cctcaaggtc cttgcctgcc 420 caggaggctg tggtcaagct ccgggtggag ggcatgacct gccagtcctg tgtcagctcc 480 attgaaggca aggtccggaa actgcaagga gtagtgagag tcaaagtctc actcagcaac 540 caagaggccg tcatcactta tcagccttat ctcattcagc ccgaagacct cagggaccat 600 gtaaatgaca tgggatttga agctgccatc aagagcaaag tggctccctt aagcctggga 660 ccaattgata ttgagcggtt acaaagcact aacccaaaga gacctttatc ttctgctaac 720 cagaatttta ataattctga gaccttgggg caccaaggaa gccatgtggt caccctccaa 780 ctgagaatag atggaatgca ttgtaagtct tgcgtcttga atattgaaga aaatattggc 840 cagctcctag gggttcaaag tattcaagtg tccttggaga acaaaactgc ccaagtaaag 900 tatgaccctt cttgtaccag cccagtggct ctgcagaggg ctatcgaggc acttccacct 960 gggaatttta aagtttctct tcctgatgga gccgaaggga gtgggacaga tcacaggtct 1020 tccagttctc attcccctgg ctccccaccg agaaaccagg tccagggcac atgcagtacc 1080 actctgattg ccattgccgg catgacctgt gcatcctgtg tccattccat tgaaggcatg 1140 atctcccaac tggaaggggt gcagcaaata tcggtgtctt tggccgaagg gactgcaaca 1200 gttctttata atccctctgt aattagccca gaagaactca gagctgctat agaagacatg 1260 ggatttgagg cttcagtcgt ttctgaaagc tgttctacta accctcttgg aaaccacagt 1320 gctgggaatt ccatggtgca aactacagat ggtacaccta catctgtgca ggaagtggct 1380 ccccacactg ggaggctccc tgcaaaccat gccccggaca tcttggcaaa gtccccacaa 1440 tcaaccagag cagtggcacc gcagaagtgc ttcttacaga tcaaaggcat gacctgtgca 1500 tcctgtgtgt ctaacataga aaggaatctg cagaaagaag ctggtgttct ctccgtgttg 1560 gttgccttga tggcaggaaa ggcagagatc aagtatgacc cagaggtcat ccagcccctc 1620 gagatagctc agttcatcca ggacctgggt tttgaggcag cagtcatgga ggactacgca 1680 ggctccgatg gcaacattga gctgacaatc acagggatga cctgcgcgtc ctgtgtccac 1740 aacatagagt ccaaactcac gaggacaaat ggcatcactt atgcctccgt tgcccttgcc 1800 accagcaaag cccttgttaa gtttgacccg gaaattatcg gtccacggga tattatcaaa 1860 attattgagg aaattggctt tcatgcttcc ctggcccaga gaaaccccaa cgctcatcac 1920 ttggaccaca agatggaaat aaagcagtgg aagaagtctt tcctgtgcag cctggtgttt 1980 ggcatccctg tcatggcctt aatgatctat atgctgatac ccagcaacga gccccaccag 2040 tccatggtcc tggaccacaa catcattcca ggactgtcca ttctaaatct catcttcttt 2100 atcttgtgta cctttgtcca gctcctcggt gggtggtact tctacgttca ggcctacaaa 2160 tctctgagac acaggtcagc caacatggac gtgctcatcg tcctggccac aagcattgct 2220 tatgtttatt ctctggtcat cctggtggtt gctgtggctg agaaggcgga gaggagccct 2280 gtgacattct tcgacacgcc ccccatgctc tttgtgttca ttgccctggg ccggtggctg 2340 gaacacttgg caaagagcaa aacctcagaa gccctggcta aactcatgtc tctccaagcc 2400 acagaagcca ccgttgtgac ccttggtgag gacaatttaa tcatcaggga ggagcaagtc 2460 cccatggagc tggtgcagcg gggcgatatc gtcaaggtgg tccctggggg aaagtttcca 2520 gtggatggga aagtcctgga aggcaatacc atggctgatg agtccctcat cacaggagaa 2580 gccatgccag tcactaagaa acccggaagc actgtaattg cggggtctat aaatgcacat 2640 ggctctgtgc tcattaaagc tacccacgtg ggcaatgaca ccactttggc tcagattgtg 2700 aaactggtgg aagaggctca gatgtcaaag gcacccattc agcagctggc tgaccggttt 2760 agtggatatt ttgtcccatt tatcatcatc atgtcaactt tgacgttggt ggtatggatt 2820 gtaatcggtt ttatcgattt tggtgttgtt cagagatact ttcctaaccc caacaagcac 2880 atctcccaga cagaggtgat catccggttt gctttccaga cgtccatcac ggtgctgtgc 2940 attgcctgcc cctgctccct ggggctggcc acgcccacgg ctgtcatggt gggcaccggg 3000 gtggccgcgc agaacggcat cctcatcaag ggaggcaagc ccctggagat ggcgcacaag 3060 ataaagactg tgatgtttga caagactggc accattaccc atggcgtccc cagggtcatg 3120 cgggtgctcc tgctggggga tgtggccaca ctgcccctca ggaaggttct ggctgtggtg 3180 gggactgcgg aggccagcag tgaacacccc ttgggcgtgg cagtcaccaa atactgtaaa 3240 gaggaacttg gaacagagac cttgggatac tgcacggact tccaggcagt gccaggctgt 3300 ggaattgggt gcaaagtcag caacgtggaa ggcatcctgg cccacagtga gcgccctttg 3360 agtgcaccgg ccagtcacct gaatgaggct ggcagccttc ccgcagaaaa agatgcagtc 3420 ccccagacct tctctgtgct gattggaaac cgtgagtggc tgaggcgcaa cggtttaacc 3480 atttctagcg atgtcagtga cgctatgaca gaccacgaga tgaaaggaca gacagccatc 3540 ctggtggcta ttgacggtgt gctctgtggg atgatcgcaa tcgcagacgc tgtcaagcag 3600 gaggctgccc tggctgtgca cacgctgcag agcatgggtg tggacgtggt tctgatcacg 3660 ggggacaacc ggaagacagc cagagctatt gccacccagg ttggcatcaa caaagtcttt 3720 gcagaggtgc tgccttcgca caaggtggcc aaggtccagg agctccagaa taaagggaag 3780 aaagtcgcca tggtggggga tggggtcaat gactccccgg ccttggccca ggcagacatg 3840 ggtgtggcca ttggcaccgg cacggatgtg gccatcgagg cagccgacgt cgtccttatc 3900 agaaatgatt tgctggatgt ggtggctagc attcaccttt ccaagaggac tgtccgaagg 3960 atacgcatca acctggtcct ggcactgatt tataacctgg ttgggatacc cattgcagca 4020 ggtgtcttca tgcccatcgg cattgtgctg cagccctgga tgggctcagc ggccatggca 4080 gcctcctctg tgtctgtggt gctctcatcc ctgcagctca agtgctataa gaagcctgac 4140 ctggagaggt atgaggcaca ggcgcatggc cacatgaagc ccctgacggc atcccaggtc 4200 agtgtgcaca taggcatgga tgacaggtgg cgggactccc ccagggccac accatgggac 4260 caggtcagct atgtcagcca ggtgtcgctg tcctccctga cgtccgacaa gccatctcgg 4320 cacagcgctg cagcagacga tgatggggac aagtggtctc tgctcctgaa tggcagggat 4380 gaggagcagt acatctga 4398 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c.2333G>T <400> 2 tctggtcatc ctggtggttg 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.2333G>T <400> 3 aacatggtgt tcagaggaag tga 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c.2621C>T <400> 4 agctggccta gaacctgacc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.2621C>T <400> 5 catctgagcc tcttccacca 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c.3809A>G <400> 6 ggtccaggag ctccagaata a 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.3809A>G <400> 7 acagtgagga aggggtctgc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c.2513delA <400> 8 agctggccta gaacctgacc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.2513delA <400> 9 catctgagcc tcttccacca 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forwrad primer for c.3806C>T <400> 10 tctttgcagt gggagttgtt g 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.3806C>T <400> 11 aataaaagag cattggcggg 20 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.2333G>T <400> 12 tacctttgcc aagtgttcca gccacc 26 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.2333G>T <400> 13 tacctttgcc aagtgttcca gccaca 26 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.2333G>T <400> 14 ggcccagggc aatgaacaca aaga 24 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.2621C>T <400> 15 ctaagaaacc cggaagcact gtaattgc 28 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.2621C>T <400> 16 ctaagaaacc cggaagcact gtaattgt 28 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.2621C>T <400> 17 ggggtctata aatgcacatg gctctgtg 28 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.3809A>G <400> 18 gggccaaggc cggggagtca t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.3809A>G <400> 19 gggccaaggc cggggagtca c 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.3809A>G <400> 20 tgaccccatc ccccaccatg g 21 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.2513delA <400> 21 gtcaaggtgg tccctggggg aaa 23 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.2513delA <400> 22 gtcaaggtgg tccctggggg aa 22 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.2513delA <400> 23 gtttccagtg gatgggaaag tcctgga 27 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.3086C>T <400> 24 acgccatggg taatggtgcc ag 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.3086C>T <400> 25 acgccatggg taatggtgcc aa 22 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.3086C>T <400> 26 tcttgtcaaa catcacagtc tttatctgcc aaaaac 36 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stuffer sequence for left probe <400> 27 gggttcccta agggttggac gctactacta ttagta 36 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stuffer sequence for right probe <400> 28 taaatctact ctagattgga tcttgctggc ac 32 <210> 29 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.2333G>T <400> 29 gggttcccta agggttggat acctttgcca agtgttccag ccacc 45 <210> 30 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.2333G>T <400> 30 gggttcccta agggttggat acctttgcca agtgttccag ccaca 45 <210> 31 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.2333G>T <400> 31 ggcccagggc aatgaacaca aagatctaga ttggatcttg ctggcac 47 <210> 32 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.2621C>T <400> 32 gggttcccta agggttggac gctctaagaa acccggaagc actgtaattg c 51 <210> 33 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.2621C>T <400> 33 gggttcccta agggttggac gctctaagaa acccggaagc actgtaattg t 51 <210> 34 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.2621C>T <400> 34 ggggtctata aatgcacatg gctctgtgaa tctactctag attggatctt gctggcac 58 <210> 35 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.3809A>G <400> 35 gggttcccta agggttggag ggccaaggcc ggggagtcat 40 <210> 36 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.3809A>G <400> 36 gggttcccta agggttggag ggccaaggcc ggggagtcac 40 <210> 37 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.3809A>G <400> 37 tgaccccatc ccccaccatg gtctagattg gatcttgctg gcac 44 <210> 38 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.2513delA <400> 38 gggttcccta agggttggac gctactacta ttagtagtca aggtggtccc tgggggaaa 59 <210> 39 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.2513delA <400> 39 gggttcccta agggttggac gctactacta ttagtagtca aggtggtccc tgggggaa 58 <210> 40 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.2513delA <400> 40 gtttccagtg gatgggaaag tcctggataa atctactcta gattggatct tgctggcac 59 <210> 41 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.3086C>T <400> 41 gggttcccta agggttggac gctactacac gccatgggta atggtgccag 50 <210> 42 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.3086C>T <400> 42 gggttcccta agggttggac gctactacac gccatgggta atggtgccaa 50 <210> 43 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.3086C>T <400> 43 tcttgtcaaa catcacagtc tttatctgcc aaaaacaaat ctactctaga ttggatcttg 60 ctggcac 67 <110> Lab Genomics <120> Detection of ATP7B mutations using PCR-LDR <160> 43 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 4398 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgcctgagc aggagagaca gatcacagcc agagaagggg ccagtcggaa aatcttatct 60 aagctttctt tgcctacccg tgcctgggaa ccagcaatga agaagagttt tgcttttgac 120 aatgttggct atgaaggtgg tctggatggc ctgggccctt cttctcaggt ggccaccagc 180 acagtcagga tcttgggcat gacttgccag tcatgtgtga agtccattga ggacaggatt 240 tccaatttga aaggcatcat cagcatgaag gtttccctgg aacaaggcag tgccactgtg 300 aaatatgtgc catcggttgt gtgcctgcaa caggtttgcc atcaaattgg ggacatgggc 360 ttcgaggcca gcattgcaga aggaaaggca gcctcctggc cctcaaggtc cttgcctgcc 420 caggaggctg tggtcaagct ccgggtggag ggcatgacct gccagtcctg tgtcagctcc 480 attgaaggca aggtccggaa actgcaagga gtagtgagag tcaaagtctc actcagcaac 540 caagaggccg tcatcactta tcagccttat ctcattcagc ccgaagacct cagggaccat 600 gtaaatgaca tgggatttga agctgccatc aagagcaaag tggctccctt aagcctggga 660 ccaattgata ttgagcggtt acaaagcact aacccaaaga gacctttatc ttctgctaac 720 cagaatttta ataattctga gaccttgggg caccaaggaa gccatgtggt caccctccaa 780 ctgagaatag atggaatgca ttgtaagtct tgcgtcttga atattgaaga aaatattggc 840 cagctcctag gggttcaaag tattcaagtg tccttggaga acaaaactgc ccaagtaaag 900 tatgaccctt cttgtaccag cccagtggct ctgcagaggg ctatcgaggc acttccacct 960 gggaatttta aagtttctct tcctgatgga gccgaaggga gtgggacaga tcacaggtct 1020 tccagttctc attcccctgg ctccccaccg agaaaccagg tccagggcac atgcagtacc 1080 actctgattg ccattgccgg catgacctgt gcatcctgtg tccattccat tgaaggcatg 1140 atctcccaac tggaaggggt gcagcaaata tcggtgtctt tggccgaagg gactgcaaca 1200 gttctttata atccctctgt aattagccca gaagaactca gagctgctat agaagacatg 1260 ggatttgagg cttcagtcgt ttctgaaagc tgttctacta accctcttgg aaaccacagt 1320 gctgggaatt ccatggtgca aactacagat ggtacaccta catctgtgca ggaagtggct 1380 ccccacactg ggaggctccc tgcaaaccat gccccggaca tcttggcaaa gtccccacaa 1440 tcaaccagag cagtggcacc gcagaagtgc ttcttacaga tcaaaggcat gacctgtgca 1500 tcctgtgtgt ctaacataga aaggaatctg cagaaagaag ctggtgttct ctccgtgttg 1560 gttgccttga tggcaggaaa ggcagagatc aagtatgacc cagaggtcat ccagcccctc 1620 gagatagctc agttcatcca ggacctgggt tttgaggcag cagtcatgga ggactacgca 1680 ggctccgatg gcaacattga gctgacaatc acagggatga cctgcgcgtc ctgtgtccac 1740 aacatagagt ccaaactcac gaggacaaat ggcatcactt atgcctccgt tgcccttgcc 1800 accagcaaag cccttgttaa gtttgacccg gaaattatcg gtccacggga tattatcaaa 1860 attattgagg aaattggctt tcatgcttcc ctggcccaga gaaaccccaa cgctcatcac 1920 ttggaccaca agatggaaat aaagcagtgg aagaagtctt tcctgtgcag cctggtgttt 1980 ggcatccctg tcatggcctt aatgatctat atgctgatac ccagcaacga gccccaccag 2040 tccatggtcc tggaccacaa catcattcca ggactgtcca ttctaaatct catcttcttt 2100 atcttgtgta cctttgtcca gctcctcggt gggtggtact tctacgttca ggcctacaaa 2160 tctctgagac acaggtcagc caacatggac gtgctcatcg tcctggccac aagcattgct 2220 tatgtttatt ctctggtcat cctggtggtt gctgtggctg agaaggcgga gaggagccct 2280 gtgacattct tcgacacgcc ccccatgctc tttgtgttca ttgccctggg ccggtggctg 2340 gaacacttgg caaagagcaa aacctcagaa gccctggcta aactcatgtc tctccaagcc 2400 acagaagcca ccgttgtgac ccttggtgag gacaatttaa tcatcaggga ggagcaagtc 2460 cccatggagc tggtgcagcg gggcgatatc gtcaaggtgg tccctggggg aaagtttcca 2520 gtggatggga aagtcctgga aggcaatacc atggctgatg agtccctcat cacaggagaa 2580 gccatgccag tcactaagaa acccggaagc actgtaattg cggggtctat aaatgcacat 2640 ggctctgtgc tcattaaagc tacccacgtg ggcaatgaca ccactttggc tcagattgtg 2700 aaagggtgg aagaggctca gatgtcaaag gcacccattc agcagctggc tgaccggttt 2760 agtggatatt ttgtcccatt tatcatcatc atgtcaactt tgacgttggt ggtatggatt 2820 gtaatcggtt ttatcgattt tggtgttgtt cagagatact ttcctaaccc caacaagcac 2880 atctcccaga cagaggtgat catccggttt gctttccaga cgtccatcac ggtgctgtgc 2940 attgcctgcc cctgctccct ggggctggcc acgcccacgg ctgtcatggt gggcaccggg 3000 gtggccgcgc agaacggcat cctcatcaag ggaggcaagc ccctggagat ggcgcacaag 3060 ataaagactg tgatgtttga caagactggc accattaccc atggcgtccc cagggtcatg 3120 cgggtgctcc tgctggggga tgtggccaca ctgcccctca ggaaggttct ggctgtggtg 3180 gggactgcgg aggccagcag tgaacacccc ttgggcgtgg cagtcaccaa atactgtaaa 3240 gaggaacttg gaacagagac cttgggatac tgcacggact tccaggcagt gccaggctgt 3300 ggaattgggt gcaaagtcag caacgtggaa ggcatcctgg cccacagtga gcgccctttg 3360 agtgcaccgg ccagtcacct gaatgaggct ggcagccttc ccgcagaaaa agatgcagtc 3420 ccccagacct tctctgtgct gattggaaac cgtgagtggc tgaggcgcaa cggtttaacc 3480 atttctagcg atgtcagtga cgctatgaca gaccacgaga tgaaaggaca gacagccatc 3540 ctggtggcta ttgacggtgt gctctgtggg atgatcgcaa tcgcagacgc tgtcaagcag 3600 gaggctgccc tggctgtgca cacgctgcag agcatgggtg tggacgtggt tctgatcacg 3660 ggggacaacc ggaagacagc cagagctatt gccacccagg ttggcatcaa caaagtcttt 3720 gcagaggtgc tgccttcgca caaggtggcc aaggtccagg agctccagaa taaagggaag 3780 aaagtcgcca tggtggggga tggggtcaat gactccccgg ccttggccca ggcagacatg 3840 ggtgtggcca ttggcaccgg cacggatgtg gccatcgagg cagccgacgt cgtccttatc 3900 agaaatgatt tgctggatgt ggtggctagc attcaccttt ccaagaggac tgtccgaagg 3960 atacgcatca acctggtcct ggcactgatt tataacctgg ttgggatacc cattgcagca 4020 ggtgtcttca tgcccatcgg cattgtgctg cagccctgga tgggctcagc ggccatggca 4080 gcctcctctg tgtctgtggt gctctcatcc ctgcagctca agtgctataa gaagcctgac 4140 ctggagaggt atgaggcaca ggcgcatggc cacatgaagc ccctgacggc atcccaggtc 4200 agtgtgcaca taggcatgga tgacaggtgg cgggactccc ccagggccac accatgggac 4260 caggtcagct atgtcagcca ggtgtcgctg tcctccctga cgtccgacaa gccatctcgg 4320 cacagcgctg cagcagacga tgatggggac aagtggtctc tgctcctgaa tggcagggat 4380 gaggagcagt acatctga 4398 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c.2333G> T <400> 2 tctggtcatc ctggtggttg 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.2333G> T <400> 3 aacatggtgt tcagaggaag tga 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c.2621C> T <400> 4 agctggccta gaacctgacc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.2621C> T <400> 5 catctgagcc tcttccacca 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c.3809A> G <400> 6 ggtccaggag ctccagaata a 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.3809A> G <400> 7 acagtgagga aggggtctgc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c.2513delA <400> 8 agctggccta gaacctgacc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.2513delA <400> 9 catctgagcc tcttccacca 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forwrad primer for c.3806C> T <400> 10 tctttgcagt gggagttgtt g 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c.3806C> T <400> 11 aataaaagag cattggcggg 20 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.2333G> T <400> 12 tacctttgcc aagtgttcca gccacc 26 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.2333G> T <400> 13 tacctttgcc aagtgttcca gccaca 26 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.2333G> T <400> 14 ggcccagggc aatgaacaca aaga 24 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.2621C> T <400> 15 ctaagaaacc cggaagcact gtaattgc 28 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.2621C> T <400> 16 ctaagaaacc cggaagcact gtaattgt 28 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.2621C> T <400> 17 ggggtctata aatgcacatg gctctgtg 28 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.3809A> G <400> 18 gggccaaggc cggggagtca t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.3809A> G <400> 19 gggccaaggc cggggagtca c 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.3809A> G <400> 20 tgaccccatc ccccaccatg g 21 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.2513delA <400> 21 gtcaaggtgg tccctggggg aaa 23 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.2513delA <400> 22 gtcaaggtgg tccctggggg aa 22 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.2513delA <400> 23 gtttccagtg gatgggaaag tcctgga 27 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.3086C> T <400> 24 acgccatggg taatggtgcc ag 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.3086C> T <400> 25 acgccatggg taatggtgcc aa 22 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.3086C> T <400> 26 tcttgtcaaa catcacagtc tttatctgcc aaaaac 36 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stuffer sequence for left probe <400> 27 gggttcccta agggttggac gctactacta ttagta 36 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stuffer sequence for right probe <400> 28 taaatctact ctagattgga tcttgctggc ac 32 <210> 29 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.2333G> T <400> 29 gggttcccta agggttggat acctttgcca agtgttccag ccacc 45 <210> 30 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.2333G> T <400> 30 gggttcccta agggttggat acctttgcca agtgttccag ccaca 45 <210> 31 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.2333G> T <400> 31 ggcccagggc aatgaacaca aagatctaga ttggatcttg ctggcac 47 <210> 32 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.2621C> T <400> 32 gggttcccta agggttggac gctctaagaa acccggaagc actgtaattg c 51 <210> 33 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.2621C> T <400> 33 gggttcccta agggttggac gctctaagaa acccggaagc actgtaattg t 51 <210> 34 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.2621C> T <400> 34 ggggtctata aatgcacatg gctctgtgaa tctactctag attggatctt gctggcac 58 <210> 35 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.3809A> G <400> 35 gggttcccta agggttggag ggccaaggcc ggggagtcat 40 <210> 36 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.3809A> G <400> 36 gggttcccta agggttggag ggccaaggcc ggggagtcac 40 <210> 37 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.3809A> G <400> 37 tgaccccatc ccccaccatg gtctagattg gatcttgctg gcac 44 <210> 38 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.2513delA <400> 38 gggttcccta agggttggac gctactacta ttagtagtca aggtggtccc tgggggaaa 59 <210> 39 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.2513delA <400> 39 gggttcccta agggttggac gctactacta ttagtagtca aggtggtccc tgggggaa 58 <210> 40 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.2513delA <400> 40 gtttccagtg gatgggaaag tcctggataa atctactcta gattggatct tgctggcac 59 <210> 41 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type left probe for c.3086C> T <400> 41 gggttcccta agggttggac gctactacac gccatgggta atggtgccag 50 <210> 42 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type left probe for c.3086C> T <400> 42 gggttcccta agggttggac gctactacac gccatgggta atggtgccaa 50 <210> 43 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right probe for c.3086C> T <400> 43 tcttgtcaaa catcacagtc tttatctgcc aaaaacaaat ctactctaga ttggatcttg 60 ctggcac 67

Claims (14)

윌슨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법으로서,
검체로부터 분리된 DNA를 주형으로, ATP7B(ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide) 유전자의 돌연변이를 포함하는 단편을 증폭시키는 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계, 및
수득된 PCR 산물을 대상으로 리가아제 검출 반응(LDR)을 수행하여, ATP7B 유전자의 돌연변이를 검출하는 단계를 포함하고,
상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 구성된 군으로부터 선택되고,
상기 LDR은 해당 돌연변이 부위에 대한 야생형 검출용 왼쪽 프로브, 돌연변이형 검출용 왼쪽 프로브, 및 공통된 오른쪽 프로브로 이루어진 프로브 세트를 이용하여 수행되는 것인 방법.As a method for providing information necessary for diagnosis of Wilson's disease,
(PCR) which amplifies a fragment containing a mutation of the ATP7B (ATPase, Cu ++ transporting, beta polypeptide) gene, using the DNA isolated from the sample as a template, and
Detecting a mutation of the ATP7B gene by performing a ligase detection reaction (LDR) on the obtained PCR product,
Wherein the mutation of the ATP7B gene is selected from the group consisting of c.2333G> T, c.2621C> T, c.3809A> G, c.2513delA, and c.3086C> T,
Wherein the LDR is performed using a probe set consisting of a left probe for wild type detection, a left probe for mutation detection, and a common right probe for the mutation site. 청구항 1에 있어서, 상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 구성된 것인 방법. The method according to claim 1, wherein the mutation of the ATP7B gene consists of c.2333G> T, c.2621C> T, c.3809A> G, c.2513delA, and c.3086C> T. 청구항 1에 있어서, 상기 왼쪽 프로브의 5' 말단은 형광 물질로 표지되고, 상기 오른쪽 프로브의 5' 말단은 라이게이션 반응을 위한 인산기로 수식되는 것인 방법. The method of claim 1, wherein the 5 'end of the left probe is labeled with a fluorescent material and the 5' end of the right probe is modified with a phosphate group for ligation reaction. 청구항 3에 있어서, 상기 야생형 검출용 왼쪽 프로브와 상기 돌연변이형 검출용 왼쪽 프로브는 상이한 형광 물질로 표지되는 것인 방법. 4. The method of claim 3, wherein the wild-type detection left probe and the mutant detection left probe are labeled with different fluorescent materials. 청구항 1에 있어서, 상기 LDR에서
상기 c.2333G>T은 서열번호 12 내지 14의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되고,
상기 c.2621C>T는 서열번호 15 내지 17의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되며,
상기 c.3809A>G는 서열번호 18 내지 20의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되고,
상기 c.2513delA는 서열번호 21 내지 23의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되며, 및
상기 c.3086C>T는 서열번호 24 내지 26의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되는 것인 방법. The method of claim 1,
The c.2333G > T is detected by a probe set consisting of a probe comprising a target site specific sequence of SEQ ID NOS: 12 to 14,
Wherein c.2621C > T is detected by a probe set consisting of a probe comprising a target site-specific sequence of SEQ ID NOS: 15 to 17,
The above c.3809A> G is detected by a probe set consisting of a probe comprising a target site specific sequence of SEQ ID NOS: 18 to 20,
Wherein said c.2513delA is detected by a probe set consisting of a probe comprising a target site specific sequence of SEQ ID NOS: 21 to 23, and
Wherein the c.3086C > T is detected by a probe set consisting of a probe comprising a target site specific sequence of SEQ ID NOS: 24 to 26. 청구항 1에 있어서, 상기 LDR에서
상기 c.2333G>T은 서열번호 29 내지 31의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되고,
상기 c.2621C>T는 서열번호 32 내지 34의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되며,
상기 c.3809A>G는 서열번호 35 내지 37의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되고,
상기 c.2513delA는 서열번호 38 내지 40의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되며, 및
상기 c.3086C>T는 서열번호 41 내지 43의 프로브로 이루어진 프로브 세트에 의해 검출되는 것인 방법.The method of claim 1,
Wherein c.2333G > T is detected by a probe set consisting of the probes of SEQ ID NOS: 29 to 31,
Wherein c.2621C > T is detected by a probe set consisting of the probes of SEQ ID NOS: 32 to 34,
C.3809A > G is detected by a probe set consisting of the probes of SEQ ID NOS: 35 to 37,
Wherein the c.2513delA is detected by a probe set consisting of the probes of SEQ ID NOS: 38 to 40, and
Wherein the c.3086C > T is detected by a probe set consisting of the probes of SEQ ID NOS: 41 to 43. 청구항 3에 있어서, 상기 형광 물질은 6-FAM(6-Carboxyfluorescein), TET(2',7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 6-JOE(6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3(Cyanine 3), Cy5, 및 VIC로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법. 4. The method of claim 3, wherein the fluorescent material is selected from the group consisting of 6-Carboxyfluorescein, 2 ', 7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein, 6-carboxy- 5'-dichloro-2 ', 7'-dimethoxyfluorescein, HEX (2', 4 ', 5', 7'- tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3 (Cyanine 3) VIC. &Lt; / RTI &gt; 청구항 1에 있어서, 상기 PCR은 서열번호 2 내지 11로 구성된 군으로부터 선택된 프라이머 쌍을 이용하여 수행되는 것인 방법.The method according to claim 1, wherein the PCR is performed using a pair of primers selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 2 to 11. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리가아제 검출 반응(LDR)은 모세관 전기영동에 의해 LDR 산물을 분리하는 단계를 포함하는 것인 방법. The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the ligase detection reaction (LDR) comprises separating the LDR product by capillary electrophoresis. 서열번호 2 내지 11의 PCR 프라이머 및 서열번호 12 내지 26의 서열을 포함하는 LDR 프로브를 포함하는, ATP7B 유전자의 돌연변이 검출용 조성물로서,
상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 구성된 군으로부터 선택되고,
상기 c.2333G>T은 서열번호 2 및 3의 프라이머로 이루어진 PCR 프라이머 쌍 및 서열번호 12 내지 14의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고,
상기 c.2621C>T는 서열번호 4 및 5의 프라이머로 이루어진 PCR 프라이머 쌍 및 서열번호 15 내지 17의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되며,
상기 c.3809A>G는 서열번호 6 및 7의 프라이머로 이루어진 PCR 프라이머 쌍 및 서열번호 18 내지 20의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고,
상기 c.2513delA는 서열번호 8 및 9의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 21 내지 23의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되며, 및
상기 c.3086C>T는 서열번호 10 및 11의 프라이머로 이루어진 PCR 프라이머 쌍 및 서열번호 24 내지 26의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고,
상기 프로브 세트는 해당 돌연변이 부위에 대한 야생형 검출용 왼쪽 프로브, 돌연변이형 검출용 왼쪽 프로브, 및 공통된 오른쪽 프로브로 이루어지는 것인 조성물. A composition for detecting a mutation of the ATP7B gene, comprising a PCR primer of SEQ ID NOs: 2 to 11 and an LDR probe comprising the sequence of SEQ ID NOs: 12 to 26,
Wherein the mutation of the ATP7B gene is selected from the group consisting of c.2333G> T, c.2621C> T, c.3809A> G, c.2513delA, and c.3086C> T,
The c.2333G > T is detected by a pair of PCR primers consisting of the primers of SEQ ID NOS: 2 and 3 and a set of LDR probes consisting of probes comprising the target site specific sequences of SEQ ID NOs: 12 to 14,
The c.2621C > T is detected by a pair of PCR primers consisting of the primers of SEQ ID NOS: 4 and 5 and a set of LDR probes consisting of the probe containing the target site specific sequence of SEQ ID NOS: 15 to 17,
Wherein c.3809A> G is detected by a pair of PCR primers consisting of the primers of SEQ ID NOs: 6 and 7 and a set of LDR probes consisting of probes comprising the target site specific sequences of SEQ ID NOs: 18 to 20,
The c.2513 delA is detected by a set of LDR probes consisting of a primer pair consisting of the primers of SEQ ID NOs: 8 and 9 and a probe comprising the target site specific sequence of SEQ ID NOs: 21 to 23, and
Wherein c.3086C > T is detected by a pair of PCR primers consisting of the primers of SEQ ID NOs: 10 and 11 and a set of LDR probes consisting of the probe comprising the target site specific sequence of SEQ ID NOs: 24 to 26,
Wherein the probe set comprises a left probe for wild type detection, a left probe for mutation detection, and a common right probe for the mutation site. 청구항 10에 있어서, 상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 구성되는 것인 조성물. 11. The composition of claim 10, wherein the mutation of the ATP7B gene consists of c.2333G> T, c.2621C> T, c.3809A> G, c.2513delA, and c.3086C> T. 청구항 10에 있어서, 상기 LDR 프로브 중 야생형 검출용 왼쪽 LDR 프로브와 돌연변이형 검출용 왼쪽 LDR 프로브는 5' 말단에서 상이한 형광 물질로 표지되고, 오른쪽 LDR 프로브는 5' 말단에서 라이게이션을 위한 인산기로 수식되는 것인 조성물. 11. The method of claim 10, wherein the left LDR probe for wild type detection and the left LDR probe for mutation detection are labeled with different fluorescent materials at the 5 'end and the right LDR probe is labeled with a phosphate group for ligation at the 5' &Lt; / RTI &gt; 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 윌슨병의 진단용인 것인 조성물. The composition according to any one of claims 10 to 12 for the diagnosis of Wilson's disease. 서열번호 12 내지 26의 표적 부위 특이적 서열을을 포함하는 프로브로 이루어진, ATP7B 유전자의 돌연변이 검출용 LDR 프로브 세트로서,
상기 ATP7B 유전자의 돌연변이는 c.2333G>T, c.2621C>T, c.3809A>G, c.2513delA, 및 c.3086C>T로 구성된 군으로부터 선택되고,
각 LDR 프로브 세트는 해당 돌연변이 부위에 대한 야생형 검출용 왼쪽 프로브, 돌연변이형 검출용 왼쪽 프로브, 및 공통된 오른쪽 프로브로 이루어지고,
c.2333G>T는 서열번호 12 내지 14의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고,
c.2621C>T는 서열번호 15 내지 17의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되며,
c.3809A>G는 서열번호 18 내지 20의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고,
c.2513delA는 서열번호 21 내지 23의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되고, 및
c.3086C>T는 서열번호 24 내지 26의 표적 부위 특이적 서열을 포함하는 프로브로 이루어진 LDR 프로브 세트에 의해 검출되는 것인 LDR 프로브 세트. A set of LDR probes for mutation detection of the ATP7B gene, comprising a probe comprising the target site specific sequence of SEQ ID NOS: 12 to 26,
Wherein the mutation of the ATP7B gene is selected from the group consisting of c.2333G> T, c.2621C> T, c.3809A> G, c.2513delA, and c.3086C> T,
Each LDR probe set consists of a left probe for wild type detection for the mutation site, a left probe for mutation detection, and a common right probe,
c.2333G > T is detected by a set of LDR probes consisting of probes comprising target site specific sequences of SEQ ID NOS: 12 to 14,
c.2621C > T is detected by a set of LDR probes consisting of probes comprising the target site-specific sequences of SEQ ID NOS: 15 to 17,
c.3809A > G is detected by a set of LDR probes consisting of probes comprising target site specific sequences of SEQ ID NOS: 18 to 20,
c.2513 delA was detected by a set of LDR probes consisting of probes comprising the target site specific sequences of SEQ ID NOS: 21 to 23, and
c.3086C > T is detected by a set of LDR probes consisting of probes comprising target site specific sequences of SEQ ID NOS: 24-26.
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