KR20160060190A - Method Producing Daptomycin Using Decanoyl Glyceride - Google Patents
Method Producing Daptomycin Using Decanoyl Glyceride Download PDFInfo
- Publication number
- KR20160060190A KR20160060190A KR1020140161384A KR20140161384A KR20160060190A KR 20160060190 A KR20160060190 A KR 20160060190A KR 1020140161384 A KR1020140161384 A KR 1020140161384A KR 20140161384 A KR20140161384 A KR 20140161384A KR 20160060190 A KR20160060190 A KR 20160060190A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- decanoyl
- present
- decanoic acid
- streptomyces
- aptomycin
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
본 발명은 데카노일 글리세라이드를 이용한 답토마이신의 생산방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing anatomicin using decanoyl glyceride.
답토마이신은 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin- resistant Staphylococcus aureus, MRSA)나 반코마이신 내성 엔테로코카이(vancomycin-resistant Enterococci, VRE)를 포함하는 그람 양성 병원균에 효과적인 항생제이다(Clinical Infections Diseases, 38:P.1673-1681, 2004). 또한 답토마이신은 2003년 미국 식품의약국(Food and drug administration, FDA)으로부터 큐비신(Cubicin, Cubist Pharmaceuticals)이라는 제품명으로 그람 양성 병원균에 의해 발생되는 피부 감염 또는 피부 조직 감염의 치료제로 승인을 받았으며, 2006년에는 스타필로코커스 아우레우스와 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스에 의해 발생되는 균혈증 또는 심내막염 치료제로 승인을 받았고 수요량도 증가 추세이다(Pharmacology, 81:P.79-91, 2008, African Journal of Biotechnology, 11:P.6241-6258, 2012).Aptomycin is an effective antibiotic for Gram-positive pathogens including methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and vancomycin-resistant Enterococci (VRE) ( Clinical Infections Diseases , 38 : P.1673-1681, 2004). In addition, aptomycin was approved by the Food and Drug Administration (FDA) in 2003 for the treatment of skin infections or skin tissue infections caused by gram-positive pathogens under the name Cubicin (Cubist Pharmaceuticals) In 2006, it was approved as a treatment for bacteremia or endocarditis caused by Staphylococcus aureus and methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and demand is also increasing ( Pharmacology , 81: P.79-91, 2008, African Journal of Biotechnology , 11: P.6241-6258, 2012).
스트렙토마이세스 로제오스포러스(Streptomyces roseosporus)는 2차 대사 산물로 13개의 아미노산과 하나의 지방산으로 구성되는 원형의 리포펩타이드 형태인 다양한 A21978C 유도체들을 생산한다(The Journal of Antibiotics, 40:P.761-777, 1987). 이 A21978C 유도체들 중 지방산이 결합하는 위치에 데카노익산이 결합된 구조가 답토마이신이며 이는 우수한 생물학적 활성을 가진다(The Journal of Antibiotics, 40:P.761-777, 1987). Streptomyces roseosporus produces a variety of A21978C derivatives which are in the form of circular lipopeptides consisting of 13 amino acids and one fatty acid as secondary metabolites ( The Journal of Antibiotics , 40: P.761- 777, 1987). The structure of the A21978C derivatives in which the decanoic acid is bonded at the position where the fatty acid binds is aptomycin, which has excellent biological activity ( The Journal of Antibiotics , 40: P.761-777, 1987).
답토마이신의 산업적 제조 공정은 효소에 의한 반합성법과 데카노익산 첨가를 통한 발효법으로 나뉜다. 효소에 의한 반합성법은 스트렙토마이세스 로제오스포러스로부터 A21978C를 생산하는 첫 번째 단계; 엑티노플라네스 우타헨시스(Actinoplanes utahensis)의 효소를 이용하여 탈아실화(deacylation) 반응을 시키는 두 번째 단계; 및 n-데카노일(n-decanoyl)기를 합성법으로 부착하는 세 번째 단계로 이루어진다(미국등록특허 제382,012호, Journal of Antibiotics, 41:P.1093-1105, 1988). 하지만 반합성법에 의한 답토마이신 제조는 공정이 매우 복잡하며 제조 단가가 높아 경제성이 낮다.The industrial manufacturing process of the aptomycin is divided into the semi-synthesis by enzyme and the fermentation by decanoic acid addition. An enzyme-based semi-synthetic method is the first step in producing A21978C from Streptomyces rogusporus; A second step of performing a deacylation reaction using an enzyme of Actinoplanes utahensis ; And n-decanoyl group by a synthetic method (U.S. Patent No. 382,012, Journal of Antibiotics , 41: P.1093-1105, 1988). However, the production of aptomycin by the semi-synthetic method is very complicated and the manufacturing cost is high and the economical efficiency is low.
발효법에 의한 답토마이신의 제조는 스트렙토마이세스 로제오스포러스의 배양 시 전구체인 데카노익산 첨가를 통해 이루어진다(미국등록특허 제 4,885,243호). 따라서 발효법에 의한 답토마이신 제조 공정은 반합성법에 비해 단순하며 이에 따라 제조 기간이 단축되는 장점이 있다.The production of aptomycin by fermentation is accomplished through the addition of decanoate, which is a precursor in the culture of Streptomyces rosewaspora (U.S. Patent No. 4,885,243). Therefore, the process for preparing the aptomycin by the fermentation method is simpler than the semi-synthetic method, and thus the manufacturing time is shortened.
하지만 발효법으로 답토마이신을 생산할 경우 데카노익산이 스트렙토마이세스 로제오스포러스에 대해 강한 독성을 갖기 때문에 첨가 속도를 최소화하여야 하는 문제점이 있다(Journal of Biotechnology, 7:P.283-292, 1988). 이처럼 답토마이신 제조 시 전구체로 이용되는 데카노익산의 첨가 속도를 제한한다면 답토마이신 생산성 증가에는 한계가 있다. 한편 생산성을 증가시키기 위하여 데카노익산의 첨가농도를 증량할 경우 고농도 데카노익산에 의하여 균이 용해(lysis)되기 때문에 답토마이신의 정제 공정 및 수율에 영향을 주는 다수의 불순물이 생성되는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 데카노익산보다 독성이 낮은 데카날(decanal)이나 쿠페아 오일(cuphea oil)을 첨가하는 방법이 제안되었다(미국등록특허 제8,313,922 B2호). 하지만 데카날은 데카노익산보다 고가로 산업적 이용에 한계가 있으며 쿠페아 오일은 천연 오일로 데카노익산 이외의 다른 지방산을 포함하고 있어 배양액 중 답토마이신 이외의 유연물질이 다량 생성되어 정제 과정의 비용이 상승하는 문제점이 있다.However, there is a problem that decanoic acid is strongly toxic to Streptomyces rogueusporus when it is produced by a fermentation method, so that the addition rate must be minimized ( Journal of Biotechnology , 7: P.283-292, 1988). Thus, there is a limit to the productivity of aptomycin when the rate of addition of decanoic acid, which is used as a precursor in the production of aptomycin, is limited. On the other hand, when increasing the concentration of decanoic acid to increase the productivity, the bacteria are lysed by the high concentration of decanoic acid, so that a large number of impurities affecting the purification process and yield of the adomycin are generated . To overcome this problem, a method of adding decanal or cuphea oil, which is less toxic than decanoic acid, has been proposed (U.S. Patent No. 8,313,922 B2). However, decanal is more expensive than decanoic acid and has limited industrial use. Coupea oil is a natural oil that contains other fatty acids than decanoic acid. Therefore, a large amount of non-aptomycin in the culture medium is produced, There is a problem of rising.
답토마이신 발효 후 생성되는 주요 불순물은 답토마이신 구조에 포함된 아미노산 중 일부가 결여된 유도체, 데카노익산 구조에 메칠기(methyl group) 한 개가 결여되거나 추가된 유도체, 산화성 유사체(oxidative analogue), 베타-이성질체(β-isomer), 안하이드로 답토마이신(anhydro-daptomycin), 락톤 가수분해물(lactone hydrolysis product) 등 최소한 13개 이상의 다양한 유도체들이 알려져 있다(유럽등록특허 제 1,252,179 B1호). 배양액 중에 존재하는 다양한 유도체들을 제거하고 고순도 답토마이신을 제조하기 위해 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피, 개질완충액 용액 증강(modified buffer enhanced) 음이온 교환 크로마토그래피 등 다단계의 정제공정을 적용하고 있다(유럽등록특허 제1,252,179 B1). 하지만 상기 특허방법을 적용하더라도 데카노익산 또는 쿠페아 오일을 전구체로 사용하여 생산된 답토마이신의 배양액 중에 존재하는 다수의 유도체들로 인하여 수율이 저하되고 고가의 수지가 필요하여 제조원가가 크게 상승하는 문제점이 있다.The major impurities produced after the fermentation of the aptomycin include derivatives lacking some of the amino acids contained in the anatomic structure, derivatives lacking or adding one methyl group to the decanoic acid structure, oxidative analogues, At least 13 different derivatives are known (European Patent No. 1,252,179 B1), including isomers (an isomer, anhydro-daptomycin, and lactone hydrolysis product). In order to remove various derivatives present in the culture medium and to prepare high purity aptomycin, a multistage purification process such as anion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography and anion exchange chromatography, and modified buffer enhanced anion exchange chromatography (European Patent No. 1,252,179 B1). However, even if the above-mentioned patent method is applied, the yield is lowered due to a large number of derivatives present in the culture solution of adomycin produced using decanoic acid or coupea oil as a precursor, have.
따라서 산업적으로 답토마이신을 제조하기 위해서는 효소에 의한 반합성법보다 발효법이 바람직하며, 이 경우에도 답토마이신의 생산성이 향상되고 유연물질이 감소되는 발효 공정 개발이 절실히 필요하다.
Therefore, in order to industrially produce aptomycin, a fermentation method is preferable to a semi-synthetic method using an enzyme, and in this case too, it is necessary to develop a fermentation process in which the productivity of aptomycin is improved and the amount of a substance is reduced.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.
본 발명자들은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 미생물을 이용하여 답토마이신 발효 시 전구체로 첨가되는 데카노익산(decanoic acid)의 독성으로 인하여 균이 용해(lysis)되고 고농도 첨가에 의한 생산성 증가에 한계가 있는 문제점 및 데카노익산을 첨가하면서 발효할 때 생성되는 다량의 답토마이신 유도체를 감소시키고자 연구 노력하였다. 그 결과, 답토마이신의 n-데카노일 측쇄(n-decanoyl side chain)의 재료로 데카노일 글리세라이드(decanoyl glyceride)를 첨가하여 전구체로 사용할 경우, 데카노익산을 직접 첨가할 때 나타나는 균체생육 저해 문제점이 없고 답토마이신 생산성이 현저히 증가되며, 배양액으로부터 답토마이신의 분리 및 회수 공정에서 수율을 현저히 저하시키는 원인물질인 답토마이신의 유도체가 감소되는 것을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다. The present inventors have found that bacterial lysis is caused by the toxicity of decanoic acid, which is added as a precursor in the fermentation of aptomycin, using microorganisms of the genus Streptomyces sp. And decanoic acid was added to the fermentation process. As a result, when decanoyl glyceride was added to the n-decanoyl side chain of aptomycin as a precursor, addition of decanoic acid directly inhibited cell growth inhibition Which is a causative substance that significantly decreases the yield in the step of isolating and recovering the platomycin from the culture broth, is reduced. Thus, the present invention has been completed.
따라서, 본 발명의 목적은 전구체로서 데카노일 글리세라이드를 이용하는 답토마이신 생산 방법을 제공하는데 있다. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for producing an antimycin using decanoyl glyceride as a precursor.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법에 의해 생산된 답토마이신을 제공하는데 있다. It is another object of the present invention to provide an antimycin produced by the method of the present invention.
본 발명의 또 다른 목적은 답토마이신 제조용 조성물을 제공하는데 있다.
It is still another object of the present invention to provide a composition for the preparation of aptomycin.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention and claims.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 답토마이신의 생산방법을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a method for producing aptomycin comprising the steps of:
(a) 데카노일 글리세라이드(decanoyl glyceride)를 첨가한 배양액에 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균주를 배양시키는 단계; 및 (a) culturing a strain of Streptomyces sp. in a culture medium to which decanoyl glyceride is added; And
(b) 상기 균주 또는 균주 배양액으로부터 답토마이신을 수득하는 단계.
(b) obtaining a stepomycin from the strain or strain culture.
본 발명자들은 스트렙토마이세스 속 미생물을 이용하여 답토마이신 발효 시 전구체로 첨가되는 데카노익산의 독성으로 인하여 균이 용해되고 고농도 첨가에 의한 생산성 증가에 한계가 있는 문제점 및 데카노익산을 첨가하면서 발효할 때 생성되는 다량의 답토마이신 유도체를 감소시키고자 연구 노력하였다. 그 결과, 답토마이신의 n-데카노일 측쇄의 재료로 데카노일 글리세라이드를 첨가하여 전구체로 사용할 경우, 데카노익산을 직접 첨가할 때 나타나는 균체생육 저해 문제점이 없고 답토마이신 생산성이 현저히 증가되며, 배양액으로부터 답토마이신의 분리 및 회수 공정에서 수율을 현저히 저하시키는 원인물질인 답토마이신의 유도체가 감소되는 것을 규명하였다. DISCLOSURE OF THE INVENTION Problems to be Solved by the Invention Problems to be Solved by the Invention Problems to be Solved by the Invention Problems to be Solved by the Invention Problems to be Solved by the Invention Problems to be Solved by the Invention Problems to be Solved by the Invention Problems to be Solved by the Invention [ And to reduce the amount of. As a result, when decanoyl glyceride is added as a material for the n-decanoyl side chain of aptomycin and used as a precursor, there is no problem of inhibiting the growth of the cells, which is observed when decanoic acid is directly added, and the productivity of aptamycin is remarkably increased. Which is a causative substance that significantly reduces the yield in the step of isolating and recovering the sumomatomycin from the human body.
본 발명의 가장 중요한 특징은 답토마이신 발효 시 전구체로 데카노일 글리세라이드를 이용한다는 것이다. The most important feature of the present invention is that decanoyl glyceride is used as a precursor in the fermentation of aptomycin.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 답토마이신 발효 시 전구체로 이용되는 데카노일 글리세라이드는 데카노일 모노글리세라이드, 데카노일 다이글리세라이드 또는 데카노일 트리글리세라이드이다. According to one embodiment of the present invention, decanoyl glyceride used as a precursor in the fermentation of aptomycin in the present invention is decanoyl monoglyceride, decanoyl diglyceride or decanoyl triglyceride.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명에서 답토마이신 발효 시 전구체로 이용되는 데카노일 글리세라이드는 데카노일 트리글리세라이드이다. According to certain embodiments of the present invention, decanoyl glyceride, which is used as a precursor in the fermentation of aptomycin in the present invention, is decanoyl triglyceride.
본 발명에서 사용되는 데카노일 트리글리세라이드는 대부분이 데카노익산으로 이루어져 있으며, 이러한 특징을 통해 데카노익산 이외에 여러 지방산을 포함하는 다른 전구체들에 비해 답토마이신 발효 시 유연물질 생성 가능성이 매우 적다. The decanoyl triglyceride used in the present invention is mostly composed of decanoic acid. With this feature, it is very less likely to form a suppository in fermentation of anatomicin than other precursors including various fatty acids in addition to decanoic acid.
본 발명에서 답토마이신 생산에 이용되는 균주는 스트렙토마이세스 속 균주이다. In the present invention, the strain used for the production of aptomycin is Streptomyces sp.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 스트렙토마이세스 속 균주는 스트렙토마이세스 코엘리콜롤(S. coelicolor), 스트렙토마이세스 리비단(S. lividans), 스트렙토마이세스 알비칸(S. albicans), 스트렙토마이세스 그리세우스(S. griseus), 스트렙토마이세스 필리카토스포러스(S. plicatosporus), 스트렙토마이세스 서브루틸러스(S. subrutilus), 스트렙토마이세스 스타우로스포린(S. staurosporine), 스트렙토마이세스 스카비에(S. scabiei) 또는 스트렙토마이세스 이포모애(S. ipomoeae), 스트렙토마이세스 로제오스포러스(S. roseosporus)이다. According to one embodiment of the present invention, the Streptomyces sp. Strain used in the present invention is a strain selected from the group consisting of Streptomyces coelicolor , Streptomyces lividans , Streptomyces albicans ( S S. albicans , S. griseus , S. plicatosporus , S. subrutilus , S. pneumoniae , S. aureus and S. aureus . staurosporine , S. scabiei or S. ipomoeae , and S. roseosporus .
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 스트렙토마이세스 속 균주는 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주(KCTC 12558BP)로서 서열목록 제1서열의 16S rRNA 서열을 갖는다. According to a specific embodiment of the present invention, the Streptomyces sp. Strain used in the present invention has the 16S rRNA sequence of Sequence Listing 1 sequence as Streptomyces sp. CKDBD 1100 strain (KCTC 12558BP).
본 발명에 따르면, 답토마이신 생산을 위해 사용되는 배지 성분 및 첨가량은 당업계에 공지된 다양한 방법을 참고하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.According to the present invention, the medium components and the amount of the medium to be used for the production of aptomycin can be determined by those skilled in the art with reference to various methods known in the art.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 스트렙토마이세스 속 균주를 이용하여 답토마이신을 배양하기 위한 배양 pH는 바람직하게는 pH 5-8이며, 보다 바람직하게는 pH 5.5-7.5이며, 보다 더 바람직하게는 pH 6.0-7.0이다. 답토마이신 발효를 위한 배양 온도 조건은 25-35℃이며 바람직하게는 28-32℃이다. 답토마이신 발효를 위한 용존 산소 조건은 20-80%이며 바람직하게는 30-70%이며 보다 바람직하게는 40-60%이다. 답토마이신 발효를 위한 교반 조건은 100-500 rpm이며 바람직하게는 100-400 rpm이며 더 바람직하게는 100-300 rpm이다. 답토마이신 생산을 위한 배양 조건은 해당 기술 분야에 알려진 여러 가지 방법 혹은 균주, 배지 조성, 배양 규모 및 기타 고려사항에 따라 당업자의 실험에 의해 결정될 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the culturing pH for culturing the aptomycin using the Streptomyces sp. Strain of the present invention is preferably pH 5-8, more preferably pH 5.5-7.5, And preferably pH 6.0-7.0. The incubation temperature conditions for anatomycin fermentation are 25-35 ° C, preferably 28-32 ° C. Dissolved oxygen conditions for anatomycin fermentation are 20-80%, preferably 30-70%, and more preferably 40-60%. Agitation conditions for anatomycin fermentation are 100-500 rpm, preferably 100-400 rpm, and more preferably 100-300 rpm. Culture conditions for the production of aptomycin can be determined by those skilled in the art according to various methods known in the art or depending on the strain, medium composition, culture size and other considerations.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 답토마이신 생산을 위해 첨가되는 데카노일 글리세라이드는 배양액 1 L 당 1 ml 내지 100 ml의 농도로 첨가되며, 보다 바람직하게는 배양액 1 L 당 20 ml 내지 80 ml, 보다 더 바람직하게는 배양액 1 L 당 40 ml 내지 70 ml이다. According to one embodiment of the present invention, the decanoyl glyceride added for the production of aptomycin is added at a concentration of 1 ml to 100 ml per 1 L of the culture, more preferably 20 ml to 80 ml per 1 L of the culture, Even more preferably from 40 ml to 70 ml per liter of culture.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 답토마이신 생산을 위해 첨가되는 데카노일 글리세라이드의 첨가 속도는 0.1 ml/L시간 내지 3.0 ml/L시간이고, 보다 바람직하게는 0.1 ml/L시간 내지 2.0 ml/L시간이며, 보다 더 바람직하게는 0.5 ml/L시간 내지 1.5 ml/L시간이다. According to one embodiment of the present invention, the addition rate of decanoyl glyceride added for the production of aptomycin is 0.1 ml / L hour to 3.0 ml / L hour, more preferably 0.1 ml / L hour to 2.0 ml / L hour, and even more preferably from 0.5 ml / L hour to 1.5 ml / L hour.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 균주 배양액 1 L 당 0.1-10 g의 답토마이신을 생산할 수 있다. According to one embodiment of the present invention, 0.1 to 10 g of aptomycin can be produced per liter of the culture broth by the method of the present invention.
본 발명에 따르면, 본 발명의 생산방법을 이용하면 전구체로 데카노익산(decanoic acid)을 이용하여 답토마이신을 생산하는 방법에 비해 유연물질을 감소시킬 수 있다. According to the present invention, by using the production method of the present invention, it is possible to reduce the amount of the flexible substance compared with the method of producing the adenomatous acid using decanoic acid as a precursor.
본 발명에서 용어 “유연물질”은 답토마이신 생산 시 생성될 수 있는 불순물(출발물질, 중간물질, 부생성물, 분해생성물 등)을 의미한다. The term " flexible material " in the present invention means impurities (starting materials, intermediates, by-products, decomposition products and the like) which can be produced in the production of aptomycin.
스트렙토마이세스 속 균주 또는 균주 배양액으로부터 답토마이신을 수득하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 정제 방법을 이용하여 실시할 수 있다. Streptomyces spp. Or step culturing can be carried out using various purification methods known in the art.
본 발명에 따르면, 스트렙토마이세스 속 균주 배양물을 원심분리하여 배지 상등액과 균주를 분리한 다음, 배지 상등액에 적합한 추출용매를 첨가하여 답토마이신을 추출할 수 있다. According to the present invention, the culture of Streptomyces sp. Strain is centrifuged to separate the culture supernatant and the strain, and a suitable extraction solvent may be added to the culture supernatant to extract aptomycin.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 스트렙토마이세스 속 균주 배양물에 메탄올을 첨가한 후 정밀여과하여 감압 농축하여 답토마이신을 수득한다. According to one embodiment of the present invention, methanol is added to a culture of Streptomyces sp. Strain, followed by microfiltration and concentration under reduced pressure to obtain a suitable microorganism.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 스트렙토마이세스 속 균주 배양물에 메탄올을 첨가한 후 정밀여과하여 감압 농축한 다음 크로마토그래피를 실시하여 답토마이신을 수득한다. According to another embodiment of the present invention, methanol is added to the strain of Streptomyces sp. Strain, followed by microfiltration, followed by concentration under reduced pressure, followed by chromatography to obtain a tryomycin.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 상술한 본 발명의 방법을 이용하면 데카노익산 및 쿠페아 오일을 이용하여 답토마이신을 생산하는 방법에 비해 높은 정제 수율 및 순도로 답토마이신을 생산할 수 있다.
As demonstrated in the following examples, the above-described method of the present invention can produce aptomycin at a higher purification yield and purity than the method of producing adenosine and decanoic acid using coupea oil.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 답토마이신을 제공한다. In accordance with another aspect of the present invention, the present invention provides an antimycin produced by the method of the present invention.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주를 데카노일 글리세라이드를 포함하는 답토마이신 제조용 조성물을 제공한다.
According to another aspect of the present invention, there is provided a composition for the preparation of aptomycin comprising decanoyl glyceride, wherein the Streptomyces sp. CKDBD strain 1100 of the present invention is used.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(ⅰ) 본 발명은 스트렙토마이세스 속 균주의 배양액에 n-데카노일 측쇄의 재료로 데카노일 글리세라이드를 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는 답토마이신 생산방법을 제공한다. (I) The present invention provides a method for producing aptomycin, which comprises culturing a culture of Streptomyces sp. Strain by adding decanoyl glyceride as a material for the n-decanoyl side chain and culturing.
(ⅱ) 본 발명의 답토마이신 생산방법은 n-데카노일 측쇄의 재료로 데카노일 글리세라이드를 첨가하기 때문에 데카노익산을 직접 첨가할 경우 나타나는 균체생육 저해 문제점이 없다.(Ii) The method of the present invention for the production of aptomycin does not have the problem of inhibiting the growth of the cells, which is obtained when decanoyl glyceride is added as a material for the n-decanoyl side chain.
(ⅲ) 본 발명의 답토마이신 생산방법은 n-데카노일 측쇄의 재료로 데카노일 글리세라이드를 고농도로 첨가하는 것이 가능하며, 이로 인해 현저히 증가된 답토마이신 생산성을 나타낸다.(Iii) The method of producing an aptomycin of the present invention can add decanoyl glyceride as a material of the n-decanoyl side chain at a high concentration, thereby showing a remarkably increased aptamycin productivity.
(ⅳ) 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 답토마이신 및 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주(KCTC 12558BP) 및 데카노일 글리세라이드를 포함하는 답토마이신 제조용 조성물을 제공한다. (Iv) The present invention provides a composition for the preparation of aptomycin, which comprises adatomycin and Streptomyces sp. CKDBD 1100 strain (KCTC 12558BP) and decanoyl glyceride produced by the method of the present invention.
(ⅴ) 본 발명의 방법은 답토마이신 발효에서 전구체로 데카노일 글리세라이드를 사용함으로써 데카노익산 또는 데카노익산 이외에 다수의 불순물을 함유한 천연오일을 사용하는 경우보다 답토마이신 생산성을 현저히 증가시키며, 유연물질을 현저히 감소시킴으로써 정제 공정을 훨씬 단순화시켰으며, 수율 향상과 함께 고순도의 답토마이신을 생산을 가능하게 한다.
(V) Using the decanoyl glyceride as a precursor in anodomycin fermentation, the method of the present invention significantly increases the productivity of aptamycin, compared with the use of natural oils containing many impurities other than decanoic acid or decanoic acid, Significant reduction of the suppositories greatly simplifies the purification process and enables the production of high purity aptomycin with improved yield.
도 1은 답토마이신의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 데카노익산과 데카노일 트리글리세라이드의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주(KCTC 12558BP)를 발효조에서 데카노익산과 데카노일 트리글리세라이드를 각각 첨가하면서 발효한 배양액의 샘플을 현미경으로 관찰한 결과이다. 이는 데카노일 트리글리세라이드 첨가 시 균주에 대한 성장저해가 적음을 나타낸 것이다.
도 4는 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주(KCTC 12558BP)를 발효조에서 데카노익산과 데카노일 트리글리세라이드를 각각 첨가하면서 발효한 배양액의 추출물을 고성능액체크로마토그래피로 분석한 결과이다. 이는 데카노일 트리글리세라이드 첨가 시 생산성 증가 및 유연물질 감소를 나타낸 것이다.Fig. 1 shows the structure of aptomycin.
Figure 2 shows the structure of decanoic acid and decanoyl triglyceride.
Fig. 3 is a result of microscopic observation of a sample of a fermented broth obtained by adding Streptomyces sp. CKDBD 1100 (KCTC 12558BP) in a fermentation tank with decanoic acid and decanoyl triglyceride, respectively. This shows that the addition of decanoyl triglyceride inhibits growth of the strain.
FIG. 4 shows the result of analysis of the extract of the culture broth fermented by adding the decanoic acid and decanoyl triglyceride in the fermenter to the Streptomyces sp. CKDBD 1100 strain (KCTC 12558BP) by high performance liquid chromatography. This shows an increase in productivity and a decrease in the amount of the substance when decanoyl triglyceride is added.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
실시예Example
실시예 1: 데카노익산 첨가농도에 따른 답토마이신 생산성과 균의 성장 Example 1: Productivity and microbial growth of aptomycin according to the concentration of decanoic acid
글리세롤 용액 상태로 -70℃의 초저온 냉동고에 보관된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) CKDBD 1100 균주(KCTC 12558BP)를 준비한 다음 표 1의 종균배지(DS 배지)가 5 mL 첨가된 시험관에 접종 후 28-32℃, 220 rpm으로 20-30시간 동안 진동 배양하였다. 상기 DS 배지의 배양액을 표 2의 생산배지(DM 배지)가 20 mL 첨가되고 데카노익산이 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 mL/L 농도가 되도록 첨가된 100 mL 삼각플라스크에 각각 1 mL씩 접종하여 5일간, 28-32℃에서 220 rpm으로 진동 배양하였다. Streptomyces sp . CKDBD 1100 strain (KCTC 12558BP) stored in an ultra-low temperature freezer at -70 ° C in glycerol solution was prepared and then inoculated into a test tube containing 5 mL of the seed medium (DS medium) shown in Table 1 And vibrated at 28-32 DEG C and 220 rpm for 20-30 hours. 20 mL of the production medium (DM medium) shown in Table 2 was added to the culture medium of the DS medium, and 100 mL Erlenmeyer flask containing decanoic acid so as to have the concentration of 0, 5, 10, 15, 20, 25 and 30 mL / 1 mL each was inoculated and vibrated at 28-32 ° C for 5 days at 220 rpm.
데카노익산이 농도별로 첨가된 각각의 플라스크에서 답토마이신 생산성은 고성능액체크로마토그래피 분석을 통해 확인하였다. 고성능액체크로마토그래피 분석을 위한 시료는 배양액을 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 획득한 상층액을 0.45 ㎛ 사이즈의 실린지 필터(syringe filter)로 여과 후 사용하였다. 고성능액체크로마토그래피 분석을 위한 이동상은 3차 증류수, 트리에틸아민(tryethylamine), 인산 및 아세토나이트릴(acetonitrile)을 포함한다. 유속은 1 mL/분이며 옥타데실실란이 결합된 실리카겔 컬럼(octadecylsilane linkage silica gel column)을 이용하여 분석하였다. 고성능액체크로마토그래피는 Waters 2695 모델을 이용하였으며 검출기는 Waters 2998 광다이오드 배열 검출기(photodiode array detector)를 사용하였다. For each of the flasks added decanoic acid by concentration, anatomicin productivity was ascertained by high performance liquid chromatography analysis. Samples for high performance liquid chromatography were obtained by centrifuging the culture solution at 13,000 rpm for 10 minutes, and then the supernatant was filtered using a syringe filter having a size of 0.45 μm. The mobile phase for high performance liquid chromatography analysis includes tertiary distilled water, tryethylamine, phosphoric acid and acetonitrile. The flow rate was 1 mL / min and analyzed using an octadecylsilane linkage silica gel column coupled with octadecylsilane. High performance liquid chromatography was performed on a Waters 2695 model and a detector was a Waters 2998 photodiode array detector.
데카노익산 첨가 농도에 따른 답토마이신 생산성 및 균의 성장은 표 3과 같았다. 데카노익산을 첨가하지 않을 경우 답토마이신 생산성이 5.6 mg/L이었지만 첨가농도가 증가함에 따라 답토마이신 생산성이 증가하여 15 mL/L 첨가할 경우 22.5 mg/L의 답토마이신 생산성을 나타내었고 이후 급격히 감소하여 30 mL/L의 데카노익산이 첨가된 경우에는 답토마이신을 전혀 생산하지 않았다.The productivity and the growth of the microorganisms according to the concentration of decanoic acid were as shown in Table 3. When decanoic acid was not added, anatomicin productivity was 5.6 mg / L. However, when the concentration was increased, the productivity of aptomycin was increased. When 15 mL / L was added, the productivity was increased to 22.5 mg / , And when 30 mL / L of decanoic acid was added, no anyomycin was produced.
각각의 배양액으로부터 균체농도를 비교하기 위하여 배양액 10 mL를 침전관에 채우고 3,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 균체량(PMV, packed mycelial volume)을 분석한 결과 데카노익산 첨가농도가 증가할수록 균의 성장이 현저히 감소하였다. 그리고 데카노익산 첨가농도에 비례하여 배양액의 점도(viscosity)가 현저히 감소한 결과로부터 균의 성장이 데카노익산에 의해 크게 저해되는 것을 보여주었다.
In order to compare cell concentration from each culture, 10 mL of the culture was filled in a precipitation tube and centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes. The concentration of decanoic acid (PMV, packed mycelial volume) Respectively. The results showed that the viscosity of the culture solution decreased significantly in proportion to the concentration of decanoic acid, indicating that the growth of the bacteria was greatly inhibited by decanoic acid.
실시예 2: 오일 종류별 답토마이신 생산성과 균의 성장 Example 2: Productivity and growth of aptomycin by oil type
실시예 1에서 답토마이신의 전구체인 데카노익산을 생산배지에 첨가하는 농도가 증가할수록 균의 성장에 대한 저해가 심하여 답토마이신 생산성 증가에 한계가 있음을 확인할 수 있다. 답토마이신 구조 중 n-데카노일 측쇄의 재료로 사용될 전구체로, 상기 데카노익산 이외에 데카날(decanal)과 데카노일 트리글리세라이드(decanoyl triglyceride)를 생산배지에 각각 첨가하여 답토마이신 생산성과 균의 성장에 대한 영향을 조사하였다. It can be confirmed that as the concentration of decanoic acid, which is a precursor of aptomycin, in the production medium is increased in Example 1, the inhibition against the growth of the microorganism is severe and there is a limit to the increase in the yield of aptamycin. Decanal and decanoyl triglyceride are added to the production medium in addition to the above decanoic acid, and the productivity and the growth of the microorganism are added to the production medium, respectively, as a precursor to be used as the material of the n-decanoyl side chain in the aptomycin structure. .
실시예 1과 마찬가지로 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) CKDBD 1100 균주(KCTC 12558BP)를 표 1의 종균배지(DS 배지)가 5 mL 첨가된 시험관에 접종 후 28-32℃, 220 rpm으로 20-30시간 동안 진동 배양하였다. 상기 DS 배지의 배양액을 생산배지(DM 배지)가 20 mL 첨가되고 데카날, 콩기름, 팜 씨앗 오일, 코코넛 오일, 쿠페아 오일, 데카노일 트리글리세라이드가 각각 15 mL/L 농도가 되도록 첨가된 100 mL 삼각플라스크에 각각 1 mL씩 접종하여 5일간, 28-32℃에서 220 rpm으로 진동 배양하였다. As in Example 1, Streptomyces sp . CKDBD 1100 strain (KCTC 12558BP) was inoculated into a test tube to which 5 mL of the seed medium (DS medium) shown in Table 1 was added, followed by incubation at 20- And vibrated for 30 hours. 20 mL of the production medium (DM medium) was added to the culture medium of the DS medium, and 100 mL triangles supplemented with decanal, soybean oil, palm seed oil, coconut oil, coupea oil and decanoyl triglyceride so as to have a concentration of 15 mL / The flask was inoculated with 1 mL each and vibrated at 28-32 ° C for 5 days at 220 rpm.
첨가된 전구체 종류에 따른 답토마이신 생산성과 균체량 및 점도를 표 4에 나타내었다. 데카노익산이 첨가된 경우 답토마이신 생산성이 22.5 mg/L이었지만 데카날과 데카노일 트리글리세라이드가 첨가된 경우에는 각각 64.3 mg/L로 증가하였다. 그리고 오일 종류별로는 데카노일 트리글리세라이드 첨가 시 답토마이신 생산성이 380 mg/L로 가장 높았고 다음으로 쿠페아 오일, 코코넛 오일, 팜 씨앗 오일, 콩기름 순으로 답토마이신 생산성을 보여주었다. 한편, 배지 중에 전구체를 첨가하지 않거나 콩기름, 팜 씨앗 오일, 코코넛 오일, 쿠페아 오일, 데카노일 트리글리세라이드오일을 첨가한 경우, 균체량은 23-26%, 점도는 136-183 cP로 양호한 성장을 보여주었으나 데카노익산 및 데카날을 첨가한 경우에는 균체량과 점도가 현저히 낮아 균의 성장이 크게 저하되었음을 알 수 있다.
Table 4 shows the productivity of the antimycin, the amount of cells and the viscosity according to the type of precursor added. When decanoic acid was added, anatomicin productivity was 22.5 mg / L, but decanal and decanoyl triglyceride were increased to 64.3 mg / L, respectively. The yield of adipocyte productivity was highest at 380 mg / L when decanoyltriglyceride was added, followed by coumoe oil, coconut oil, palm seed oil and soybean oil. On the other hand, when the precursor was not added to the medium or soybean oil, palm seed oil, coconut oil, coupea oil, decanoyl triglyceride oil were added, the amount of the cells showed good growth of 23-26% and viscosity of 136-183 cP However, when decanoic acid and decanal were added, the amount of cells and the viscosity were remarkably low, indicating that the growth of the microorganism was greatly reduced.
트리글리세라이드Synthetic decanoyl
Triglyceride
실시예 3: 답토마이신 발효 시 사용한 오일들의 지방산 함량 분석Example 3: Fatty acid content analysis of oils used in the fermentation of aptomycin
실시예 2에서 답토마이신 발효를 위하여 배지에 사용한 오일들 각각에 포함된 지방산 함량을 분석하였다.The fatty acid content of each of the oils used in the medium was analyzed for the aptomycin fermentation in Example 2.
분석원리는 유지를 메탄올성 수산화나트륨용액으로 처리하여 알칼리염을 만든 후 트리플루오로보란메탄올 용액을 가하고 가열하여 에스테르화 하여 생성된 지방산에스테르를 이소옥탄에 녹여 분석한 다음 총 지방산의 합을 구하고 각각의 지방산 함량을 분석하는 것이다.The analytical principle is that the oil is treated with a sodium hydroxide solution to make an alkali salt, then a trifluoroborane methanol solution is added, and the esterified fatty acid ester is heated to dissolve in isooctane, and the sum of the total fatty acids is determined And to analyze the fatty acid content.
구체적으로 지방산 함량을 분석할 샘플 약 25 mg을 유리 튜브에 정밀히 취하고 내부표준용액(triundecanoin(C11:0) 0.01 g을 이소옥탄용액에 녹여 10 mL가 되게 한 용액) 1 mL를 첨가한다. 이어 0.5 N 메탄올성 수산화나트륨용액 1.5 mL를 가하고 질소를 불어넣은 후 즉시 뚜껑을 덮고 혼합한다. 이어 100℃ 히팅 블록에서 약 5분간 가온한다. 이를 냉각한 후 14% 트리플루오로보란메탄올 용액 2 mL를 가하고 다시 질소를 불어넣은 후 즉시 뚜껑을 덮고 혼합하고 100℃에서 30분간 가온한다. 이어 30-40℃로 냉각하여 이소옥탄용액 1 mL를 가하여 질소를 불어넣은 후 뚜껑을 덮고 이 온도에서 30초간 격렬히 진탕한다. 다음 즉시 포화 염화나트륨용액 5 mL를 가하고 질소를 불어넣은 후 뚜껑을 덮고 진탕한다. 상온으로 냉각한 후 수층으로부터 분리된 이소옥탄층을 무수황산나트륨으로 탈수하여 시험용액으로 한다.Specifically, take approximately 25 mg of the sample to be analyzed for fatty acid content into a glass tube and add 1 mL of an internal standard solution (0.01 g of triundecanoin (C11: 0) dissolved in iso-octane solution to make 10 mL). Add 1.5 mL of 0.5 N methanolic sodium hydroxide solution, blow the nitrogen and immediately cover and mix. It is then heated in a 100 ° C heating block for about 5 minutes. After cooling, add 2 mL of 14% trifluoroborane methanol solution, blow the nitrogen again, cover immediately and mix and warm at 100 ° C for 30 minutes. After cooling to 30-40 ° C, add 1 mL of isooctane solution, blow nitrogen into the flask, cover and cover with vigorous shaking for 30 seconds at this temperature. Then immediately add 5 mL of saturated sodium chloride solution, blow the nitrogen, cover and shake. After cooling to room temperature, the iso-octane layer separated from the aqueous layer is dehydrated with anhydrous sodium sulfate to prepare a test solution.
지방산 분석을 위한 기체크로마토그래피 조건으로 칼럼은 SP-2560(100 m x 0.25 mm x 0.2 ㎛)을 사용하였으며 주입부 온도는 225℃로 하고 칼럼온도 100℃에서 4분간 유지한 후 3℃/분의 비율로 240℃까지 온도를 상승시킨 다음 15분 이상 유지하였다. 또한 검출기 온도는 285℃로 하고 유량은 헬륨 가스를 0.75 mL/분으로 하였으며 분할비율(split ratio)은 20 : 1로 하여 분석하였다.SP-2560 (100 mx 0.25 mm x 0.2 m) was used as the column for the analysis of fatty acids. The column was maintained at a column temperature of 100 ° C for 4 minutes at a feeding temperature of 225 ° C, and a ratio of 3 ° C / The temperature was raised to 240 캜 and maintained for 15 minutes or longer. The detector temperature was 285 ° C, the helium gas flow rate was 0.75 mL / min, and the split ratio was 20: 1.
기체크로마토그래피-불꽃이온화검출기(GC-FID)상에서의 분석은 각 지방산의 메틸 에스테르이므로 해당 지방산으로 전환해야하기 때문에 각 지방산별 전환계수를 사용하여 환산하였다. 이와 같은 방법으로 각각의 오일 종류에 따른 지방산 함량 분석 결과를 표 5에 나타내었다.
Since the analysis on the gas chromatography-flame ionization detector (GC-FID) is a methyl ester of each fatty acid, it is converted using the conversion coefficient for each fatty acid since it has to be converted to the corresponding fatty acid. Table 5 shows the results of fatty acid content analysis for each type of oil in this manner.
트리글리세라이드Decanoil
Triglyceride
답토마이신 발효배지에 첨가한 오일 종류별로 지방산 함량을 조사한 결과 콩기름에서는 답토마이신의 전구체인 데카노익산이 검출되지 않았고 팜 오일, 코코넛 오일, 쿠페아 오일, 데카노일 트리글리세라이드에서는 데카노익산(C10:0)이 각각 3.7%, 6.9%, 85.3%, 99.9%인 것으로 확인되었다. 특히 데카노일 트리글리세라이드에서는 카프릴산(C8:0)이 0.1%로 데카노익산 이외의 지방산이 거의 없었지만 콩기름, 팜 오일, 코코넛 오일, 쿠페아 오일의 경우 데카노익산 이외의 지방산이 6-8가지 이상 존재하는 것을 알 수 있다. 따라서, 데카노익산 이외의 지방산이 많이 함유된 상기 오일들을 답토마이신 발효 시 전구체로 사용할 경우 다량의 유연물질들이 생성되고 생산성이 감소할 가능성이 매우 높다고 볼 수 있다.
The fatty acid content of the oil added to the fermentation broth of the athomycin fermentation medium was not detected in the soybean oil, but decanoic acid (C10: 0) was not detected in the palm oil, coconut oil, coupea oil and decanoyltriglyceride ) Were 3.7%, 6.9%, 85.3% and 99.9%, respectively. Especially, in decanoyl triglyceride, caprylic acid (C8: 0) was 0.1% and there was almost no fatty acid other than decanoic acid. However, in case of soybean oil, palm oil, coconut oil and coupea oil, 6-8 fatty acids other than decanoic acid Or more. Therefore, when the above-mentioned oils containing a large amount of fatty acids other than decanoic acid are used as precursors in the fermentation of the platomycin, a large amount of flexible substances are produced and the productivity is likely to decrease.
실시예 4: 데카노일 트리글리세라이드 첨가농도에 따른 답토마이신 생산성과 균의 성장Example 4 Effect of Decanoyl Triglyceride Addition on Aptomycin Productivity and Bacterial Growth
실시예 3으로부터 생산배지에 첨가되는 답토마이신의 전구체들 중 균의 성장이 우수하고 가장 높은 답토마이신 생산성을 보여주었던 데카노일 트리글리세라이드의 첨가농도에 따른 영향을 조사할 필요가 있었다. 실시예 1과 같이 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주(KCTC 12558BP)를 준비한 다음 표 1의 종균배지(DS 배지)가 5 mL 첨가된 시험관에 접종 후 28-32℃, 220 rpm으로 20-30시간 동안 진동 배양하였다. 상기 DS 배지의 배양액을 생산배지(DM 배지)가 20 mL 첨가되고 데카노일 트리글리세라이드가 각각 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 mL/L 농도가 되도록 첨가된 100 mL 삼각플라스크에 각각 1 mL씩 접종하여 5일간, 28-32℃에서 220 rpm으로 진동 배양하였다. It was necessary to investigate the influence of the concentration of decanoyltriglyceride added, which showed excellent growth of bacteria among the precursors of anatomycin added to the production medium from Example 3 and showed the highest productivity of aptamycin. Streptomyces sp. CKDBD 1100 strain (KCTC 12558BP) was prepared as in Example 1, and then inoculated into a test tube containing 5 mL of the seed medium (DS medium) shown in Table 1, and then inoculated at 28-32 DEG C and 220 rpm for 20-30 hours And vibrated. 20 mL of the culture medium of the DS medium was added to a 100 mL Erlenmeyer flask to which 20 mL of the production medium (DM medium) was added and decanoyl triglyceride was added so as to have concentrations of 0, 10, 20, 30, 40, 50 and 60 mL / 1 mL inoculated and vibrated at 28-32 ° C for 5 days at 220 rpm.
데카노일 트리글리세라이드 첨가 농도에 따른 답토마이신 생산성 및 균의 성장은 표 5와 같았다. 전구체를 첨가하지 않을 경우 답토마이신 생산성이 5.6 mg/L이지만 데카노일 트리글리세라이드 첨가농도가 증가함에 따라 답토마이신 생산성이 현저히 증가하여 50 mL/L 첨가할 경우 560 mg/L로 최대의 생산성을 나타내었다.The productivity and the growth of the microorganism according to the concentration of decanoyl triglyceride were as shown in Table 5. When the precursor was not added, the productivity of anatomicin was 5.6 mg / L, but the productivity of the adduct was significantly increased as the concentration of decanoyltriglyceride was increased. When the concentration was 50 mL / L, the productivity was 560 mg / L .
각각의 배양액으로부터 균체농도를 비교한 결과 데카노일 트리글리세라이드를 10 mL/L 첨가한 경우 균체량과 점도가 상승하였으며 그 이상의 농도에서는 균체량과 점도가 점차 감소하였지만 하락폭이 데카노익산 첨가에 비하여 훨씬 적었다. 따라서 실시예 1로부터 실시예 4에 걸친 실험 결과 스트렙토마이세스 속 균주를 이용한 답토마이신 발효생산에 있어서 전구체로 합성 데카노일 트리글리세라이드를 사용할 경우 균에 대한 성장저해가 적고 생산성이 현저히 높아지기 때문에 데카노익산, 데카날 또는 다른 천연오일들에 비해 훨씬 경제적임을 알 수 있다.
When the concentration of decanoyltriglyceride was added at 10 mL / L, cell mass and viscosity were increased. However, at the concentration above, cell weight and viscosity gradually decreased, but the decrease was much smaller than decanoic acid addition. Therefore, as a result of experiments conducted from Example 1 to Example 4, it was found that when decanoyltriglyceride synthesized as a precursor in the production of an athomycin fermentation using Streptomyces sp. Strain is used, the growth inhibition against bacteria is small and productivity is remarkably increased, , Decanal or other natural oils.
트리글리세라이드(mL/L)Decanoil
Triglyceride (mL / L)
실시예 5: 발효조에서 데카노익산 용액의 첨가 속도에 따른 영향Example 5: Influence of addition rate of decanoic acid solution in a fermenter
실시예 1에서와 같이 데카노익산에 의한 균의 생육 저해 때문에 발효조에서 데카노익산 용액의 첨가 속도는 균에 대한 생육저해를 최소화할 수 있는 범위 내에서 답토마이신 생산성을 최대화할 수 있도록 엄격하게 조절되어야 한다. 발효조 배양을 위하여 상기의 과제의 해결 수단에 기술된 종자배양, 전배양 및 본배양의 배지 조성을 적용하였다. 종자배양은 500 mL의 삼각 플라스크에서 50 mL의 부피로 배양을 진행하였으며 배양 온도는 28-32℃, 교반 속도는 120 rpm으로 유지하여 20-30시간 동안 배양하였다. 전배양은 5 L의 발효조에서 2 L의 부피로 배양을 진행하였고 초기 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 28-32℃, 용존 산소량은 40-60%로 유지하여 20-30시간 동안 배양하였다. 본배양은 5 L의 발효조에서 2 L의 부피로 배양을 진행하였으며 초기 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 28-32℃, 용존 산소량은 40-60%, pH는 6-7로 유지하였다. 데카노익산 용액은 배양 후 20-30시간부터 0.1-1.0 mL/L시간의 속도로 첨가였으며 배양은 10-13일간 진행하였다. 데카노익산 용액의 첨가 속도에 따른 답토마이신 생산성과 균의 성장은 아래의 표 7과 같았다. 답토마이신의 전구체가 되는 데카노익산 용액의 첨가 속도가 빠를수록 답토마이신 생산성은 증가되지만 최대 생산성을 나타내는 첨가 속도인 0.5 mL/L.시간 이상에서는 생산성이 감소되었다. 또한 데카노익산 첨가속도가 증가할수록 균체량과 점도가 감소하여 데카노익산에 의해 균의 성장이 크게 저해된다는 것을 확인할 수 있다.
The rate of addition of decanoic acid solution in the fermentation tank is strictly controlled so as to maximize the productivity of aptomycin within a range that minimizes growth inhibition against bacteria due to inhibition of bacterial growth by decanoic acid as in Example 1 . For the cultivation of the fermenter, the medium composition of the seed culture, pre-culture and main culture described in the solution means of the above-mentioned problem was applied. The seed culture was carried out in a volume of 50 mL in a 500 mL Erlenmeyer flask. Culturing was carried out at a temperature of 28-32 ° C and a stirring speed of 120 rpm for 20-30 hours. The pre-culture was carried out in a volume of 2 L in a 5 L fermentor. The initial agitation speed was 200 rpm, the incubation temperature was 28-32 ° C, and the dissolved oxygen was maintained at 40-60% for 20-30 hours. The cultivation was carried out at a volume of 2 L in a 5 L fermentor. The initial agitation speed was 200 rpm, the incubation temperature was 28-32 ° C, the dissolved oxygen was 40-60%, and the pH was maintained at 6-7. The decanoic acid solution was added at a rate of 0.1-1.0 mL / L from 20-30 hours after the incubation, and the cultivation was continued for 10-13 days. The productivity and the growth of the microorganism according to the addition rate of the decanoic acid solution were as shown in Table 7 below. The faster the addition rate of decanoic acid solution, which is a precursor of aptomycin, the higher the productivity of athomycin but the productivity decreased at the addition rate of 0.5 mL / L. In addition, it can be confirmed that as the decanoic acid addition rate is increased, the amount of the cells and the viscosity are decreased, and the growth of the bacteria is greatly inhibited by decanoic acid.
실시예 6: 발효조에서 쿠페아 오일 용액의 첨가 속도에 따른 영향Example 6 Effect of Addition Rate of Coupeau Oil Solution on Fermentation Tank
실시예 2에서 플라스크 배양 시 전구체로 첨가한 데카노익산에 비해 생산성이 높았던 쿠페아 오일을 발효조에 첨가하면서 배양하였을 때의 영향을 조사하기 위하여 상기의 과제의 해결 수단에 기술된 종자배양, 전배양 및 본배양의 배지 조성을 적용하여 발효조 배양을 실시하였다. 본배양에서 쿠페아 오일 용액 첨가속도는 0.1-2.0 mL/L.시간으로 하였고 배양온도, 통기교반, 용존산소 유지농도, pH 유지 등 다른 배양조건은 실시예 5와 동일하게 진행하였다.In order to investigate the effect of adding coupea oil, which was higher in productivity than decanoic acid added as a precursor in the flask culture in Example 2, to the fermentation tank when cultured, the seed culture, pre-culture and pre-culture described in the above- Cultivation of the fermenter was performed using the medium composition of the present culture. In this culture, the addition rate of coupea oil solution was 0.1-2.0 mL / L. The other culture conditions such as culture temperature, aeration stirring, dissolved oxygen concentration, and pH maintenance were the same as in Example 5.
쿠페아 오일 용액의 첨가 속도에 따른 답토마이신 생산성과 균의 성장은 아래의 표 8과 같았다. 데카노익산 첨가 속도에 따라 균의 성장이 심하게 저해되었던 실시예 5와 달리 쿠페아 오일 용액의 첨가속도가 1.0 mL/L.시간일 때까지 균의 성장이 증가하였고 그 이상의 첨가속도에서 균체량과 점도가 유사하거나 소폭 감소하였다. 이와 같이 쿠페아 오일을 첨가할 경우 균의 성장 저해가 훨씬 완화되어 발효조 배양 시 첨가속도를 엄격하게 조절하지 않아도 되는 것을 알 수 있다. 하지만 실시예 5에서는 데카노익산 용액의 경우 첨가 속도가 0.5 mL/L.시간일 때 최대 생산성인 2,620 mg/L를 나타내었던 반면, 본 실시예 6에서는 쿠페아 오일 첨가속도가 1.0 mL/L.시간일 때 1,050 mg/L의 최대 생산성을 나타내어 생산성 측면을 고려할 때 경제성이 떨어짐을 알 수 있다.
The productivity of the aptomycin and the growth of the bacterium according to the addition rate of the coupea oil solution were as shown in Table 8 below. Unlike Example 5, in which the growth of bacteria was severely inhibited by the decanoate addition rate, the growth of the bacteria was increased until the addition rate of the coupea oil solution was 1.0 mL / L. At the addition rate, Similar or slightly decreased. As described above, the addition of coupea oil significantly inhibits the growth of bacteria and thus does not require strict control of the rate of addition during fermentation. However, in Example 5, the decanoic acid solution showed a maximum productivity of 2,620 mg / L at an addition rate of 0.5 mL / L. On the other hand, in Example 6, the rate of addition of coupea oil was 1.0 mL / , It shows the maximum productivity of 1,050 mg / L, which is not economical considering productivity.
실시예 7: 발효조에서 데카노일 트리글리세라이드 용액의 첨가 속도에 따른 영향Example 7 Effect of Decanoyl Triglyceride Solution Addition Rate on Fermentation Tank
발효조 배양에서 데카노일 트리글리세라이드 영향을 조사하기 위하여 상기의 과제의 해결 수단에 기술된 종자배양, 전배양 및 본배양의 배지 조성을 적용하여 발효조 배양을 실시하였다. 본배양에서 데카노일 트리글리세라이드 첨가속도는 0.1-2.0 mL/L.시간으로 하였고 배양온도, 통기교반, 용존산소 유지농도, pH 유지 등 다른 배양조건은 실시예 5와 동일하게 진행하였다.In order to investigate the effect of decanoyl triglyceride in the fermenter culture, the fermenter was cultured by applying the medium composition of seed culture, pre-culture and main culture described in the above-mentioned solution means. The decanoyltriglyceride addition rate was 0.1-2.0 mL / L. In this culture, other culture conditions such as culture temperature, aeration agitation, dissolved oxygen concentration, and pH maintenance were carried out in the same manner as in Example 5.
데카노일 트리글리세라이드 용액의 첨가 속도에 따른 답토마이신 생산성과 균의 성장은 아래의 표 9와 같았다. 실시예 5에서 데카노익산 용액의 첨가 속도가 0.5 mL/L.시간일 때 최대 생산성 2,620 mg/L를 나타내었던 반면 데카노일 트리글리세라이드의 경우에는 첨가 속도가 0.5 mL/L.시간일 때 3,080 mg/L의 생산성을 보여주었고 첨가속도가 1.5 mL/L.시간일 때 최대 생산성인 4,770 mg/L를 나타내었다. 또한 데카노일 트리글리세라이드 용액의 첨가속도가 0.5 mL/L.시간일 때까지 균의 성장이 증가하였고 그 이상의 첨가속도에서 균체량과 점도가 감소하였지만 데카노익산을 첨가한 경우와 비교하여 균의 성장 저해가 훨씬 완화되는 결과를 나타내었다. 한편, 실시예 6에서 쿠페아 오일을 첨가하였을 때 답토마이신의 최대 생산성이 1,050 mg/L였던 것과 비교하여 최대생산성이 4,770 mg/L로 약 4.5배 높은 것을 알 수 있다. 따라서, 답토마이신 발효 시 첨가되는 전구체로 데카노익산이나 천연오일인 쿠페아 오일보다 고순도의 데카노일 트리글리세라이드를 사용하는 것이 훨씬 효과적이라는 것을 알 수 있다.
The productivity and the growth of the microorganism according to the addition rate of the decanoyl triglyceride solution were as shown in Table 9 below. The maximum productivity was 2,620 mg / L when the decanoic acid solution was added at a rate of 0.5 mL / L in Example 5, while the decanolyltriglyceride yield was 3,080 mg at the rate of 0.5 mL / L. / L and showed maximum productivity of 4,770 mg / L at the addition rate of 1.5 mL / L. In addition, the growth of bacteria increased until the addition rate of decanoyl triglyceride solution was 0.5 mL / L. At the addition rate, the amount of cells and viscosity decreased, but the inhibition of growth of bacteria The results are shown in Fig. On the other hand, in Example 6, when the coupea oil was added, the maximum productivity was 4,770 mg / L, which was about 4.5 times higher than the maximum productivity of the adenosine monoclonal antibody of 1,050 mg / L. Thus, it can be seen that it is much more effective to use decanoyl triglyceride of high purity than decanoic acid or a natural oil, Coupea oil, as a precursor to be added during the fermentation of aptomycin.
실시예 8: 전구체 종류에 따른 균의 형태(morphology) 비교Example 8: Comparison of morphology according to precursor types
발효조에서 데카노익산, 쿠페아 오일, 데카노일 트리글리세라이드 각각의 용액을 0.5 mL/L.시간 속도로 첨가한 경우(실시예 5, 실시예 6, 실시예 7), 각각에 대하여 5일차 본배양액 샘플을 취하여 현미경으로 관찰하였다(도 3).When the solutions of decanoic acid, coupea oil, and decanoyltriglyceride were added to the fermentation tank at a rate of 0.5 mL / L (Example 5, Example 6, Example 7) Were taken and observed under a microscope (Fig. 3).
데카노익산을 첨가한 배양액에서는 균사의 길이가 짧고 마디가 많으며 균사체가 뭉쳐있는 형태(pellet growth form)가 많이 관찰되었으며, 쿠페아 오일 또는 데카노일 트리글리세라이드 용액을 첨가한 배양액에서는 균사의 길이가 길고 마디가 적으며 균사체가 퍼져있는 형태(mycelial growth form)가 대부분을 차지하였다. 데카노익산은 첨가 시 균에 대한 독성이 높아 균사체가 뭉쳐있는 형태로 성장하게 되고 펠렛(pellet) 내부로 영양분 및 산소의 출입이 제한되기 때문에 세포내 대사활성을 떨어뜨릴 수 있다. 그 결과 균의 성장속도가 더욱 느려지거나 세포의 용해(lysis) 현상이 일어나기 때문에 데카노익산을 고농도로 첨가할 경우 답토마이신 생산성이 낮아진다고 할 수 있다. 반면에 데카노일 트리글리세라이드는 첨가 시 그 자체로는 균에 대한 독성이 없고 균이 성장함에 따라 글리세롤과 데카노익산으로 천천히 분해되면서 균의 성장과 답토마이신 합성에 이용될 수 있기 때문에 균사체가 퍼져있는 형태(mycelial growth form)를 유지한다고 볼 수 있다. 그 결과 데카노익산에 비해 데카노일 트리글리세라이드를 고농도로 첨가할 경우에도 균의 성장이 유지되고 생산성이 증가한다고 볼 수 있다. 한편, 쿠페아 오일은 데카노일 트리글리세라이드와 마찬가지로 균의 성장에 대한 저해는 거의 없지만 유리지방산을 포함하여 모노글리세라이드, 다이글리세라이드, 트리글리세라이드 내에 데카노익산 뿐만 아니라 다양한 지방산 및 그 밖의 불순물을 함유하므로 답토마이신 생산성이 높지 않은 것으로 볼 수 있다.In the culture medium containing decanoic acid, the length of mycelium was short, the number of nodes was large and the mycelium was in a pellet growth form. In the culture solution containing the coupea oil or decanoyltriglyceride solution, (Mycelial growth form) was the most common. When decanoic acid is added, it is highly toxic to fungi and grows in the form of aggregated mycelia, and the intracellular metabolic activity may be lowered because the nutrients and oxygen are restricted to the inside of the pellet. As a result, the growth rate of the microorganisms is slowed down or the lysis of the cells occurs. Therefore, when a high concentration of decanoic acid is added, the productivity of aptomycin is lowered. On the other hand, decanoyl triglyceride itself does not have toxicity to the bacteria itself, and when it is added, it grows slowly and decomposes into glycerol and decanoic acid as the bacteria grow. Since decanoyl triglyceride can be used for the growth of bacteria and the synthesis of aptomycin, (Mycelial growth form). As a result, when decanoyl triglyceride is added at a higher concentration than decanoic acid, the growth of the microorganism is maintained and the productivity is increased. On the other hand, coupea oil contains almost no inhibition against the growth of bacteria as decanoyl triglyceride, but contains various fatty acids and other impurities as well as decanoic acid in monoglycerides, diglycerides and triglycerides including free fatty acids It can be considered that the productivity of aptomycin is not high.
실시예 9: 전구체 종류에 따른 유연물질 생성 비교Example 9: Comparison of the generation of a substance according to precursor types
발효조에서 데카노익산, 쿠페아 오일, 데카노일 트리글리세라이드 각각의 용액을 0.5 mL/L.시간 속도로 첨가한 경우(실시예 5, 실시예 6, 실시예 7), 각각에 대하여 10일차 본배양액 샘플을 취하여 실시예 1에 기재된 고성능액체크로마토그래피 분석을 수행하였다(도 4).When the solution of each of decanoic acid, coupea oil and decanoyl triglyceride was added to the fermentation tank at a rate of 0.5 mL / L (Example 5, Example 6, Example 7) Was performed to perform the high performance liquid chromatography analysis described in Example 1 (FIG. 4).
분석 결과 표 10과 같이 데카노익산 용액을 첨가한 경우 생산성이 2,620 mg/L이고 크로마토그램상에 나타난 답토마이신 피크(peak)의 함량은 72.3%인 반면 쿠페아 오일 용액을 첨가한 경우에는 생산성이 560 mg/L로 저조하였고 크로마토그램상에 나타난 답토마이신 피크의 함량도 68.7%로 감소하였다. 하지만 데카노일 트리글리세라이드 용액을 첨가한 경우에는 생산성이 3,380 mg/L이고 크로마토그램상에 나타난 답토마이신 피크의 함량이 86.5%에 달하였다. 따라서 답토마이신 발효에서 전구체로 데카노일 트리글리세라이드를 사용할 경우 데카노익산 또는 데카노익산 이외에 다수의 불순물을 함유한 천연오일을 첨가하는 경우보다 생산성이 현저히 증가할 뿐만 아니라 유연물질이 현저히 감소되었기 때문에 답토마이신 정제 공정이 훨씬 단순화되고 수율 향상 및 고순도 답토마이신 제조가 가능하게 된다.
As shown in Table 10, when the decanoic acid solution was added, the productivity was 2,620 mg / L, and the amount of aptomycin peak on the chromatogram was 72.3%, whereas when the coupea oil solution was added, the productivity was 560 mg / L, and the amount of aptomycin peak on the chromatogram decreased to 68.7%. However, when decanoyl triglyceride solution was added, the productivity was 3,380 mg / L, and the amount of aptomycin peak on the chromatogram reached 86.5%. Therefore, when decanoyl triglyceride is used as a precursor in the anodomycin fermentation, the productivity is remarkably increased as compared with the case of adding natural oil containing many impurities in addition to decanoic acid or decanoic acid, It is possible to simplify the mycin purification process, to improve the yield and to manufacture high purity acetomycin.
트리글리세라이드Decanoil
Triglyceride
실시예 10: 배양액으로부터 답토마이신 정제Example 10: Quantification of the antimycin
전구체로 데카노익산, 쿠페아오일, 데카노일 트리글리세라이드를 사용한 각각의 배양액에 메탄올을 첨가한 후 정밀여과(micro filtration)를 통한 추출을 실시하였다. 추출된 용액을 감압 농축한 다음 각각의 농축액에 대하여 역상크로마토그래피(reverse chromatography)를 실시하여 역상크로마토그래피 횟수에 따른 정제수율과 HPLC 순도를 비교분석하였다. 표 11의 결과와 같이 데카노익산을 첨가한 배양액의 경우 역상크로마토그래피를 3회 실시하였을 때 순도 94.2%, 정제수율 31.2%이었으나, 쿠페아 오일을 첨가한 배양액의 경우 역상크로마토그래피를 4회 실시하여 순도 93.4%, 정제 수율 20.4%를 나타내어 데카노익산을 첨가한 배양액보다 순도와 정제 수율 면에서 감소하였다. 반면에, 데카노일 트리글리세라이드를 첨가한 배양액의 경우는 역상크로마토그래피를 2회 실시하였음에도 불구하고 순도 95.1%, 정제수율 46.5%로 다른 전구체를 첨가한 배양액보다 순도와 정제수율이 우수한 결과를 나타냈다.Methanol was added to each of the cultures using decanoic acid, coupea oil, and decanoyl triglyceride as precursors, followed by extraction through microfiltration. The extracted solution was concentrated under reduced pressure and then subjected to reversed phase chromatography on each of the concentrates to compare the purification yield and HPLC purity according to the number of reversed phase chromatography. As shown in Table 11, in the case of the culture solution containing decanoic acid, the purity was 94.2% and the purification yield was 31.2% when the reversed phase chromatography was performed three times. However, in the case of the culture solution containing the coupea oil, the reversed phase chromatography was performed four times Purity 93.4% and purification yield 20.4%, which were lower in terms of purity and purification yield than the culture with decanoic acid. On the other hand, in the case of decanoyltriglyceride added culture, purity and yield were 46.5% and 95.1%, respectively, although the reverse phase chromatography was performed twice.
따라서 데카노익산이 첨가된 배양액은 균의 용해(lysis) 현상으로 균체 잔해(cell debris) 및 유도체가 증가하고, 쿠페아 오일이 첨가된 배양액에서는 오일에 포함된 기타 지방산 및 불순물로 인하여 답토마이신 유도체가 다량 생성되어 정제 수율과 제품의 순도가 감소하지만 데카노일 트리글리세라이드를 배양액에 첨가할 경우 발효 생산성이 증가할 뿐만 아니라 정제 수율과 제품의 순도가 크게 증가되는 효과가 나타난 것으로 볼 수 있다.
Therefore, the culture solution containing decanoic acid increases the cell debris and derivatives due to the lysis of the bacteria, and in the culture solution containing the coupea oil, the adipocyte derivatives due to other fatty acids and impurities contained in the oil However, when decanoyltriglyceride is added to the culture solution, not only the fermentation productivity is increased but also the purification yield and the purity of the product are greatly increased.
(mg/L) Aptomycin
(mg / L)
그라피 횟수Reverse phase chromatography
Number of images
트리글리세라이드Decanoil
Triglyceride
상기의 본 발명에 대한 상세한 기술은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 단지 바람직한 구현의 예일 뿐이며 이에 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다. 따라서, 본 발명은 하기의 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다.
The foregoing detailed description of the present invention is merely an example of preferred embodiments of the present invention by those skilled in the art, and the scope of the present invention is not limited thereto. Accordingly, the present invention is defined by the following claims and their equivalents.
하기 본 균주의 기탁은 대한민국 농촌진흥청의 지원 하에서 과제번호 PJ009541에 의해 이루어진 것이다.
The deposit of the strain described below was made under task number PJ009541 under the support of the Rural Development Administration of the Republic of Korea.
<110> Chong Kun Dang Bio. Co., Ltd. <120> Method Producing Daptomycin Using Decanoyl Glyceride <130> PN140555 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1400 <212> RNA <213> CKDBD 1100 16S rRNA <400> 1 gctccctccc acaaggggtt gggccaccgg cttcgggtgt taccgacttt cgtgacgtga 60 cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcag caatgctgat ctgcgattac 120 tagcaactcc gacttcatgg ggtcgagttg cagaccccaa tccgaactga gaccggcttt 180 ttgagattcg ctccgcctcg cggcatcgca gctcattgta ccggccattg tagcacgtgt 240 gcagcccaag acataagggg catgatgact tgacgtcgtc cccaccttcc tccgagttga 300 ccccggcagt ctcctgtgag tccccatcac ccccgaaggg catgctggca acacagaaca 360 agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacagcca 420 tgcaccacct gtataccgac cacaaggggg gcaccatctc tgatgctttc cggtatatgt 480 caagccttgg taaggttctt cgcgttgcgt cgaattaagc cacatgctcc gctgcttgtg 540 cgggcccccg tcaattcctt tgagttttag ccttgcggcc gtactcccca ggcggggaac 600 ttaatgcgtt agctgcggca ccgacgacgt ggaatgtcgc caacacctag ttcccaacgt 660 ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt cgctcctcag 720 cgtcagtaat ggcccagaga tccgccttcg ccaccggtgt tcctcctgat atctgcgcat 780 ttcaccgcta caccaggaat tccgatctcc cctaccacac tctagctagc ccgtatcgaa 840 tgcagacccg gggttaagcc ccgggctttc acatccgacg tgacaagccg cctacgagct 900 ctttacgccc aataattccg gacaacgctt gcgccctacg tattaccgcg gctgctggca 960 cgtagttagc cggcgcttct tctgcaggta ccgtcacttt cgcttcttcc ctgctgaaag 1020 aggtttacaa cccgaaggcc gtcatccctc acgcggcgtc gctgcatcag gctttcgccc 1080 attgtgcaat attccccact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag 1140 tgtggccggt cgccctctca ggccggctac ccgtcgtcgc cttggtaggc cattacccca 1200 ccaacaagct gataggccgc gggctcatcc ttcaccgccg gagctttcaa ccccgtccca 1260 tgcgggacag agtgttatcc ggtattagac cccgtttcca gggcttgtcc cagagtgaag 1320 ggcagattgc ccacgtgtta ctcacccgtt cgccactaat ccaccaccga agtgatttca 1380 tcntcgactg catgntaagc 1400 <110> Chong Kun Dang Bio. Co., Ltd. <120> Method Producing Daptomycin Using Decanoyl Glyceride <130> PN140555 <160> 1 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 1400 <212> RNA ≪ 213 > CKDBD 1100 16S rRNA <400> 1 gctccctccc acaaggggtt gggccaccgg cttcgggtgt taccgacttt cgtgacgtga 60 cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcag caatgctgat ctgcgattac 120 tagcaactcc gacttcatgg ggtcgagttg cagaccccaa tccgaactga gaccggcttt 180 ttgagattcg ctccgcctcg cggcatcgca gctcattgta ccggccattg tagcacgtgt 240 gcagcccaag acataagggg catgatgact tgacgtcgtc cccaccttcc tccgagttga 300 ccccggcagt ctcctgtgag tccccatcac ccccgaaggg catgctggca acacagaaca 360 agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacagcca 420 tgcaccacct gtataccgac cacaaggggg gcaccatctc tgatgctttc cggtatatgt 480 caagccttgg taaggttctt cgcgttgcgt cgaattaagc cacatgctcc gctgcttgtg 540 cgggcccccg tcaattcctt tgagttttag ccttgcggcc gtactcccca ggcggggaac 600 ttaatgcgtt agctgcggca ccgacgacgt ggaatgtcgc caacacctag ttcccaacgt 660 ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt cgctcctcag 720 cgtcagtaat ggcccagaga tccgccttcg ccaccggtgt tcctcctgat atctgcgcat 780 ttcaccgcta caccaggaat tccgatctcc cctaccacac tctagctagc ccgtatcgaa 840 tgcagacccg gggttaagcc ccgggctttc acatccgacg tgacaagccg cctacgagct 900 ctttacgccc aataattccg gacaacgctt gcgccctacg tattaccgcg gctgctggca 960 cgtagttagc cggcgcttct tctgcaggta ccgtcacttt cgcttcttcc ctgctgaaag 1020 aggtttacaa cccgaaggcc gtcatccctc acgcggcgtc gctgcatcag gctttcgccc 1080 attgtgcaat attccccact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag 1140 tgtggccggt cgccctctca ggccggctac ccgtcgtcgc cttggtaggc cattacccca 1200 ccaacaagct gataggccgc gggctcatcc ttcaccgccg gagctttcaa ccccgtccca 1260 tgcgggacag agtgttatcc ggtattagac cccgtttcca gggcttgtcc cagagtgaag 1320 ggcagattgc ccacgtgtta ctcacccgtt cgccactaat ccaccaccga agtgatttca 1380 tcntcgactg catgntaagc 1400
Claims (11)
(a) 데카노일 글리세라이드(decanoyl glyceride)를 첨가한 배양액에 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균주를 배양시키는 단계; 및
(b) 상기 균주 또는 균주 배양액으로부터 답토마이신을 수득하는 단계.
A method of producing a < RTI ID = 0.0 > aptomycin < / RTI &
(a) culturing a strain of Streptomyces sp. in a culture medium to which decanoyl glyceride is added; And
(b) obtaining a stepomycin from the strain or strain culture.
The method according to claim 1, wherein the decanoyl glyceride is decanoyl monoglyceride, decanoyl diglyceride or decanoyl triglyceride.
3. The method of claim 2, wherein the decanoyl glyceride is decanoyl triglyceride.
2. The method according to claim 1, wherein the Streptomyces sp. Strain is selected from the group consisting of Streptomyces coelicolor , S. lividans , Streptomyces albicans , Streptomyces In the case of S. griseus , S. plicatosporus , S. subrutilus , S. staurosporine , < RTI ID = 0.0 > Streptomyces < Characterized in that it is S. scabiei or S. ipomoeae .
The method according to claim 1, wherein the Streptomyces sp. Strain is Streptomyces sp. CKDBD 1100 strain (KCTC 12558BP).
The method of claim 1, wherein the decanoyl glyceride is added at a concentration of 1 ml / L to 100 ml / L.
The method of claim 1, wherein the decanoyl glyceride is added at a rate of 0.1 ml / L to 3.0 mL / L.
[Claim 3] The method according to claim 1, wherein the productivity of the method is 0.1 g / L to 10 g / L.
[Claim 3] The method according to claim 1, wherein the production method comprises reducing the amount of the suppositories, compared with a method of producing the adenosine monoclonal antibody by adding decanoic acid to the culture medium of Streptomyces sp.
9. A method according to any one of claims 1 to 9,
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140161384A KR101716879B1 (en) | 2014-11-19 | 2014-11-19 | Method Producing Daptomycin Using Decanoyl Glyceride |
| PCT/KR2015/011231 WO2016080665A1 (en) | 2014-11-19 | 2015-10-22 | Method for producing daptomycin using decanoyl glyceride |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140161384A KR101716879B1 (en) | 2014-11-19 | 2014-11-19 | Method Producing Daptomycin Using Decanoyl Glyceride |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20160060190A true KR20160060190A (en) | 2016-05-30 |
| KR101716879B1 KR101716879B1 (en) | 2017-03-17 |
Family
ID=56014150
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020140161384A KR101716879B1 (en) | 2014-11-19 | 2014-11-19 | Method Producing Daptomycin Using Decanoyl Glyceride |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101716879B1 (en) |
| WO (1) | WO2016080665A1 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110343638B (en) * | 2019-07-01 | 2020-08-11 | 浙江大学 | Streptomyces strain capable of producing daptomycin and application thereof |
| CN110642872B (en) * | 2019-11-18 | 2020-12-22 | 湖北宏中药业股份有限公司 | Method for extracting staurosporine |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6696412B1 (en) * | 2000-01-20 | 2004-02-24 | Cubist Pharmaceuticals, Inc. | High purity lipopeptides, Lipopeptide micelles and processes for preparing same |
| CA2408399A1 (en) * | 2000-05-09 | 2001-11-15 | Nitromed, Inc. | Infrared thermography and methods of use |
| DE602008005731D1 (en) * | 2008-08-01 | 2011-05-05 | Olon Spa | Improved manufacturing process for daptomycin |
| KR20120058790A (en) * | 2010-11-30 | 2012-06-08 | 주식회사 빅바이오 | Streptomyces roseosporus mutant having enhanced productivity of daptomycin and production method of daptomycin using the same |
-
2014
- 2014-11-19 KR KR1020140161384A patent/KR101716879B1/en active IP Right Grant
-
2015
- 2015-10-22 WO PCT/KR2015/011231 patent/WO2016080665A1/en active Application Filing
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Vivian Miao et al., Microbiology, Vol.151, pp.1507-1523 (2005)* * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101716879B1 (en) | 2017-03-17 |
| WO2016080665A1 (en) | 2016-05-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5729919B2 (en) | Thiacomycin production | |
| KR940005656B1 (en) | Method for selectively increasing the ratio of single major components of teicoplanin a2 gomples | |
| WO2010058427A2 (en) | Process for production and purification of polymyxin b sulfate | |
| EP1904505B1 (en) | Biologically active compounds obtainable from sorangium cellulosum | |
| KR101716879B1 (en) | Method Producing Daptomycin Using Decanoyl Glyceride | |
| US20070142424A1 (en) | Process for producing tacrolimus (FK-506) using vegetable oil as sole source of carbon | |
| CN108660093B (en) | Marine streptomycete and tunicamycin compound and preparation method thereof | |
| KR101579766B1 (en) | Method for preparing cyclic lipopeptide compound | |
| CN109053601A (en) | A kind of noval chemical compound LW-1 of the separation and Extraction from Aspergillus terreus secondary metabolite | |
| CN109293662A (en) | A kind of new secondary metabolite LW-4 of Aspergillus terreus SKL-001 | |
| CN105176904A (en) | Genetic engineering strain Streptomyces tsukubaensis L21 and application thereof | |
| CN105671102A (en) | Method of preparing ascomycin through fermentation | |
| CN113396214B (en) | Method for producing nigericin from streptomyces sp.mcc 0151 | |
| CN110872338B (en) | Indole diterpenoid compound and preparation method and application thereof | |
| CN108727169A (en) | A kind of preparation method of the biphenyl ether compound in marine fungi source and the application as antiseptic | |
| CN110105435B (en) | Fermentation medium and fermentation method for producing A40926 | |
| Salas et al. | Production of the dinoflagellate Amphidoma languida in a large scale photobioreactor and structure elucidation of its main metabolite AZA-39 | |
| CN102168020B (en) | Marine-source fungus and application thereof | |
| US20160083764A1 (en) | An improved process for the preparation of fidaxomicin | |
| RU2495937C1 (en) | Method of preparation of tacrolimus by microbiological synthesis method | |
| CN112795487B (en) | Fermentation medium and fermentation method for producing fusidic acid | |
| KR101601089B1 (en) | Novel Strain Bacteria Producing Daptomycin and Preparing Method for Daptomycin Using the Same | |
| CN111285828B (en) | Compound proximicin and preparation method and application thereof | |
| JPH0246294A (en) | Production of angnocyclinone from streptomyces microorganism and production thereof | |
| CN111454338A (en) | Mutant of semomycin precursor peptide, application thereof and prepared semomycin analogue |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20200116 Year of fee payment: 4 |