KR20160033987A - 질량분석을 이용한 생체시료 내의 단백질 정량분석법 및 그 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질의약품의 생체시료내 정량분석법 및 그 조성물에 관한 것으로서, 효소처리에 의한 단백질 특이적인 단편 펩티드, 글라이칸 포함 단편 펩티드, 정량을 목적으로 하는 Stable-isotope가 포함된 단백질의약품 합성 펩티드, 이와 유사한 정량목적 표지화 그리고 이 단편 및 단백질 전체를 직접 질량분석을 이용하여 정량하고자 하는 질량분석 방법 및 그 조성물에 관한 것이다.

Description

질량분석을 이용한 생체시료 내의 단백질 정량분석법 및 그 조성물{A quantitative method for protein in biological sample using mass spectrometry and a composition therefor}
본 발명은 단백질의약품의 생체시료내 정량분석법 및 그 조성물에 관한 것으로서, 효소처리에 의한 단백질 특이적인 단편 펩티드, 글라이칸 포함 단편 펩티드, 정량을 목적으로 하는 Stable-isotope가 포함된 단백질의약품 합성 펩티드, 이와 유사한 정량목적 표지화 그리고 이 단편 및 단백질 전체를 직접 질량분석을 이용하여 정량하고자 하는 질량분석 방법 및 그 조성물에 관한 것이다.
최근 신약 개발과 바이오시밀러의 개발 증가로 혈장과 같은 생체 시료내 존재하는 단백질의약품에 대한 정량분석 요구가 점차 증가하고 있다. 특히, 단백질의약품은 chemical과는 다른 고분자로서 생산공정상의 어려움이 있을 뿐만 아니라 단백질의약품의 특성분석 및 정량분석에 많은 기술적인 한계를 가지고 있다. 최근 질량분석법의 개발로 펩티드맵핑, Glycan 동정 및 상대정량, 이황화결합자리 결정과 같은 단백질의약품의 특성분석법이 개발되고 있으며 바이오시밀러 개발을 위해서는 필수적인 분석들이라고 할 수 있다. 단백질의약품의 생체내 대사나 시간에 따른 혈액내 잔존량등에 대한 관심이 높은데 이를 위해 사용하는 방법은 ELISA법이 주된 방법이다. 항체를 기반으로 하는 ELISA는 단백질의약품에 대한 적절한 항체가 개발되어 있으면 활용이 용이하나 그렇지 못한 경우는 항체개발을 위한 소요시간과 분석법 개발자체에 대한 시간 등의 이유로 다른 방법 등이 요구되는 실정이다. 또한, glycan을 포함하는 단백질의약품과 단일클론 항체단백질 의약품의 경우는 상대적으로 ELISA를 이용한 정량방법에 제한적이다. 특히, 혈액 내에서 다른 효소나 기타 요소 등에 의해 변형되는 단백질의약품에 대한 모니터링의 방법으로는 적합하지 않다. 하지만, 최근 Multiplex이 가능한 질량분석법의 활용으로 혈액과 같은 생체시료내의 원래 형태의 단백질의약품은 물론 기타 변형된 단백질의약품의 정량분석이 가능한 잠재력이 있다. 또한, 혈액내의 다양한 항체에 대하여 선택적으로 다수의 단백질의약품을 동시에 정량분석을 수행할 수 있다는 것도 장점이다.
[선행 특허 문헌]
공개특허 특2003-0031911
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 고안된 것으로서 본 발명의 목적은 효과적인 시료 전처리 및 새로운 단백질의약품 정량분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 단백질의약품으로부터 유래된 단편 즉, 효소절단 펩티드 정량용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a) 혈장 시료로부터 단백질을 분리하는 단계; b)상기 단백질을 단백질 분해 효소를 처리하여 펩티드로 만드는 단계;c) 필요한 경우에 상기 펩티드와 동일 서열이며, 안정 동위원소(stable isotope)를 포함하는 스탠다드 펩티드를 첨가하는 단계;및 d) 상기 단백질 또는 펩티드 시료를 액체크로마토그래피법을 이용하여 분리하되, 질량 분석법을 이용하는 단계를 포함하는 생체 시료내 단백질 정량분석 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 질량 분석법은 목표 단백질 및 펩티드의 특정 m/z 구간에 대하여 LC-MS/MS 수행 동안 지속적으로 텐덤스펙트럼을 얻고 특정 절편 이온(fragment ion)의 강도(intensity)를 고려하여 정량하고, 이때 얻어지는 풀 레인지(full range) 질량 스펙트럼 내의 타겟 단백질 및 펩티드 유래 특이적 절편의 최적 조합을 찾아내어 정량에 활용하고, 민감도의 증가를 위해 타겟 이온의 분리 폭(isolation width를 넓히거나 직접 시간(accumulation time)을 조절하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 타깃 분자가 없는 배경(background) 혈장 시료로부터 얻어지는 타겟 단백질 및 펩티드 텐덤스펙트럼들에 비교하여 타겟 단백질 및 펩티드 포함 혈장시료에서만 관측되는 절편 이온들을 대상으로 정량하는 것을 특징으로 하고, 이들 대상은 타겟 단백질 및 펩티드의 특정 b-이온 또는 y-이온이거나 이들의 조합이거나 다른 인터널 절편(internal fragment)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 시스테인(Cysteine)-특이적 혹은 라이신-특이적 반응성 화학물질을 이용하여 단백질을 표지한 후 얻어지는 특이적 절편을 정량에 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 질량 분석방법에 농도를 알고 있는 펩티드를 첨가하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 생체 시료내에서 분리된 타겟 단백질의 펩티드와 동일 서열이며, 안정 동위원소(stable isotope)를 포함하고, 해당 펩티드는 분석하려는 타겟 단백질 특이적이거나 혹은 다른 단백질과 공통의 펩티드이며, 질량이 서로 다른 안정 동위원소를 포함하는 것을 특징으로 하는 질량분석법을 이용한 생체시료 내의 단백질 정량분석용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 펩티드는 타겟 단백질이 아바스틴(Avastin)인 경우에는 아바스틴의 210번 잔기부터 250번 잔기 부위에서 유래한 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 혈액과 같은 생체시료에서 효과적으로 단백질의약품을 분리정제하고 질량분석을 이용하여 단백질의약품을 손쉽게 정량분석을 수행할 수 있는 방법을 포함한다.
한 구체예에서, 질량 분석기는 본 발명의 기질과 함께 사용되다. 본 발명에 따른 기질의 한 지형에 위치한 시료는 질량분석기의 입력 시스템에 도입한다. 이후, 시료는 이온화 소스로 이온화시킨다. 전형적인 이온화 소스에는 레이저, 고속원자 충격 또는 플라즈마가 포함된다. 생성된 이온은 이온 광학적 어셈블리로 수집하고, 이후 질량 분광기로 지나가는 이온을 분석한다. 질량 분광기를 빠져 나온 이온은 검출기로 검출한다. 그 다음, 검출기는 검출된 이온의 정보를 질량-대-전하 비율로 해독한다. 검출물의 검출에는 일반적으로 신호 강도의 검출이 포함되는데, 이는 기질에 결합된 검출물의 함량을 반영한다. 질량 분석기와 관련된 추가적인 정보는 Principles of Instrument Analysis, 3 rd ed., Skoog, Saunders College Publishing, Philadelphia, 1985 및 Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4 thed. Vol. 15(John Wiley & Sons, New York 1995), pp. 1071-1094를 참조한다.
텐덤 질량 분석법(예, MS/MS. MS/MS/MS, ESI-MS/MS 등)은 단백질과 펩티드와 같은 생물분자에 대한 서열 정보를 얻는데 활용할 수 있다. 텐덤 질량 분석법은 어미 이온을 발생시키는 질량 분석법을 의미하는데, 여기서 상기 어미 이온은 딸 이온으로 단편화되고, 이는 이후 질량 분석된다. 일반적으로, 메스필터(Mass Filter)를 이용하여, 단편화되는 특정 질량-대-전하 비율을 갖는 어미 이온을 선별한다.
특정 구체예에서, 단편화(fragmentation)는 충돌-유도된 해리(CID)이다. CID는 제 1 질량 분석기와 제 2 질량 분석기사이에 위치하는 충돌 쳄버에서 실시할 수 있다. 충돌 쳄버는 완충 가스, 특히 헬륨과 같은 불활성 가스로 채워진다. 대안으로, 어미 이온은 표면 유도된 해리, 광해리(예, 레이저로), 전자 유도된 해리(예, 전자빔으로)로 단편화시킬 수 있다.
비행 시간 분광기를 이용하는 질량 분석기에서, 포스트-소스 붕괴(PSD)와 인-소스 붕괴(ISD)를 활용하여 단편화를 유발한다(Li et al.(2000) supra). PSD에는 타임드-이온-셀렉터(timed-ion-selector)를 이용하여 펩티드 이온 조성물로부터 전구물질 이온을 " 여과" 하는 단계가 포함된다. 선택된 질량 이온은 레플렉트론(reflectron)에서 분리되는 단편 이온으로 자발적으로 붕괴된다. ISD는 PSD와 상이한 조건을 이용하는데, 여기에는 이온 공급원에서 급속한 준안정(metastable) 붕괴가 포함된다.
적절한 구체예에서, 텐덤 질량 분석법은 사중극자 시간비행 질량 분석기 QqTOF MS(Krutchinsky et al., WO 99/38 185)에 추가로 연결되는 레이저 탈착/이온화 질량 분석기를 포함하는 모든 텐덤 질량분석법을 포함한다. MALDI-QqTOF MS(Krutchinsky et al., WO 99/38185; Shevchenko et al. (2000) Anal. Chem. 72:2132-2141), ESI-QqTOF MS(Figeys et al. (1998) Rapid Comm'ns. Mass Spec. 12: 1435-144), 칩 모세관 전기이동(칩-CE)-QqTOF MS(Li et al.(2000) Anal.Chem. 72: 599-609)는 전술하였다.
본 발명의 질량 분석법으로 수득된 질량 스펙트럼 데이터는 함수와 같은 분석 알고리즘을 적용하여 산물의 함량 및 고유성에 관한 정보를 얻는데 활용될 수 있다. 폴리펩티드의 탈착 및 검출로 만들어진 데이터는 임의의 적절한 수단(예, 시각, 컴퓨터 등)으로 분석할 수 있다. 한 구체예에서, 데이터는 프로그램가능한 디지털 컴퓨터를 이용하여 분석한다. 컴퓨터 프로그램은 코드를 저장하는 판독가능 매체를 포함한다. 특정 코드는 기질에서 각 특징의 위치, 각 특징에서 흡수제의 고유성, 흡수제를 세척하는데 사용되는 용리 조건을 포함하는 메모리로 충실하게 전달될 수 있다. 이후, 프로그램은 이런 정보를 활용하여, 특징적인 선택성(예, 사용한 흡수제와 용리액의 유형)을 정의하는 기질상의 일단의 특징을 확인할 수 있다. 컴퓨터는 또한 기질에서 어드레스가능한 특정 위치로부터 접수된 다양한 분자 질량에서 신호의 강도에 대한 데이터를 입력으로 받아들이는 코드를 보유한다. 이런 데이터는 피크 값의 신호 강도 및 검출된 각 산물에서 측정된 분자 질량을 비롯하여 산물의 총수를 시사한다.
데이터 분석에는 검출된 피크 값(예, 특정 질량-대-전하 값 또는 값의 범위)의 신호 강도(예, 피크의 높이)를 측정하고 " 극단치" (사전측정된 통계적 분포를 벗어나는 데이터)를 제거하는 단계가 포함될 수 있다. 관찰된 피크는 정규화시킬 수 있는데, 여기서 일부 기준군에 상대적인 각 피크의 높이가 계산된다. 가령, 기준군은 스케일에서 0으로 설정되는 장치와 화학약품(예, 에너지 흡수 분자)에 의해 발생하는 기준 소음일 수 있다. 이후, 각 폴리펩티드 또는 다른 물질에서 검출된 신호 강도는 소요의 스케일(예, 100)로 상대적 강도 형태로 제시할 수 있다. 대안으로, 시료에 표준을 도입하고, 이런 표준으로부터 피크는 검출된 산물에서 관찰되는 신호의 상대적 강도를 측정하는 기준군으로 활용할 수 있다. Biomarker Wizard 프로그램(Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, CA)과 같은 소프트웨어 프로그램은 질량 스펙트럼의 분석을 보조하는데 사용할 수 있다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 혈액내의 다양한 항체에 대하여 선택적으로 다수의 단백질의약품을 동시에 정량분석을 수행할 수 있다는 것도 장점이다. 본 발명은 혈액과 같은 생체시료에서 효과적으로 단백질의약품을 분리정제하고 질량분석을 이용하여 단백질의약품을 손쉽게 정량분석을 수행할 수 있다.
도 1은 Avastin과 Herceptin의 서열 비교 그림이고,
도 2는 Extracted Ion chromatogram 법을 이용한 Avastin의 N말단 및 C말단 펩티드 정량용 크로마토그램 (트립신 처리)이다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
혈액 시료로부터 항체의약품을 분리하고 질량분석을 이용한 정량하는 방법은 실시예는 다음과 같다.
A.혈액시료의 항체분리정제 용액의 조성은 하기 표1과 같다.
정제 용액 조성
Ammonium Biocarbonate buffer (이하 Ambic) 100mM (pH8.0)
Acetic acid 50mM (pH3.0)
B.시료 준비
1.혈장 시료 50uL를 정제용액과 1:1 (v/v)로 섞은 후 18,000 X g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 시료에 남아있는 세포와 잔해물(debris)들을 제거한다.
2.원심분리된 잔해물들이 섞이지 않도록 주의하면서 Protein G fragment로 이루어진 컬럼을 이용하여 항체단백질을 포집하고 정제용액으로 3회 wash한 후, D.W을 가하여 1회 wash하자마자 50mM acetic acid (pH3)를 이용하여 항체의약품을 용출하는 방식으로 부분 정제한다.
3.용액을 speed-vac을 이용하여 모두 dry한후 5mM TCEP/5mM Iodoacetamide/50mM Ambic buffer(pH8.0)를 50uL가하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨다.
4.Cold acetone 300uL를 가하여 4℃에서 10분동안 반응시켜 침전시키고 상등액은 버린다. 이후 8M Urea solution을 15uL가하여 denature한후 500uL의 Ambic buffer와 protease (예, trypsin)를 첨가하여 3시간 동안 반응 후 필요한 경우 heavy 합성 펩티드의 적절한 양을 첨가하여 섞은 후 SEP-PAK(C18)을 이용하여 함께 desalting하고 dry하여 보관한다. 질량분석 직전에 0.1% formic acid 50uL로 resuspension하여 분석 시료를 준비한다.항체단백질을 직접 질량분석을 수행하는 경우 시료준비 2번을 수행한 후에 용액을 speed-vac을 이용하여 모두 dry한후 질량분석 직전에 1% formic acid 50uL로 resuspension한다.
C.액체크로마토그래피
1. 앞서 준비된 단백질/펩티드 시료를 Waters UPLC 및 Triple-Tof 5600 mass spectrometry를 이용하여 분석한다.
2. 액체크로마토그래피 실시의 예는 표 2와 같다.
Figure pat00001
D.항체의약품 특이적 펩티드 선정 및 펩티드 합성
1.본 발명은 예로서 Avastin의 항 VEGF 항체단백질의 경우 trypsin으로 펩티드 단편을 생성할 수 있는데 이때 Herceptin과 같은 다른 항체의약품과 선택적으로 혹은 공통적으로 항체량을 대변하는 항체 단편 (펩티드조각)을 선정을 포함하고 있다. 선택적인 서열을 포함하는 펩티드를 정량목표로 삼거나 (예, Variable region의 특이적인 tryptic fragment로 Avastin 혹은 Herceptin과 같은 다른 항체의약품들과 구별할 수 있는 서열 포함 펩티드) 공통적으로 확인할 수 있는 효소부산물 펩티드를 선정할 수 있다. 또한, 이들과 동일한 서열이며 stable isotope를 포함한 heavy standard peptide를 합성하고 이를 절대 정량분석에 활용하는 것도 가능하다.
Avastin의 경우 210번정도부터 250번정도까지 Herceptin과 구분되는 영역으로 이 부분 펩티드가 우선적인 Avastin 혹은 Herceptin 특이적 서열을 포함하고 있다(도 1). 이 영역 주변 혹은 서열의 차이를 보이는 구간에 해당하는 효소단편을 활용하여 정량분석을 실시할 수 있다.
E.새로운 질량분석법
1.앞서 준비된 단백질/펩티드 용액 시료를 상기 액체크로마토그래피법을 이용하여 분리하되 다음의 새로운 질량분석법을 이용하여 항체의약품을 정량분석을 수행하는 방법을 제공한다.
2.목표 단백질 및 펩티드의 특정 m/z 구간 (예: 0.7~20Da)에 대하여 LC-MS/MS수행동안 지속적으로 텐덤스펙트럼을 얻고 특정 fragment ion의 intensity만을 고려하여 정량하는 방법을 제공한다. 이때 얻어지는 full range mass spectrum내의 타겟 단백질/펩티드 유래 특이적 fragment의 최적 조합을 찾아내어 정량에 활용할 수 있으며, 민감도의 증가를 위해 타겟 ion의 isolation width를 넓힐 수 있고, accumulation time을 조절할 수도 있는 방법을 제공한다.
3.타겟 molecule이 없는 background 혈장시료로부터 얻어지는 타겟 단백질/펩티드 텐덤스펙트럼들에 대하여 타겟 단백질/펩티드 포함 혈장시료에서만 관측되는 fragment ion들을 대상으로 정량하는 방법을 제공한다. 이들은 타겟 단백질/펩티드의 특정 b-ion 혹은/그리고 y-ion의 조합일 수 있다 (혹은 다른 internal fragment일수도 있다).
4.Cysteine-specific 혹은 lysine-specific 반응성 chemical (예, iTRAQ)을 이용하여 항체단백질을 labeling한 후 얻어지는 특이적 fragment를 정량에 사용하는 방법을 제공한다 (예, iTRAQ의 reporter ion, 특정 chemical의 immonium ion).
5.Extracted Ion chromatogram (XIC)법을 이용한 펩티드의 동정 및 시료 확인: 질량분석을 통해 얻어진 데이터를 ProteinPilot 프로그램을 이용해 avastin database를 사용해서 Detected Protein Threshold [Unused ProtScore (Conf)] >: 0.05 (10%)로 설정하여 서치된 결과와 비교하여 N-term 및 C-term의 펩티드를 확인한다(도 2): XIC로 peak를 얻어낼 때 RT width 와 mass width는 1로 설정하여 진행하고 gaussian smoothed를 2 point로 정하여 그래프를 얻는다. 동정된 펩티드의 모분자값으로 동정해내는 방법인 XIC를 통해 Avastin mAb의 존재를 확인하고 기본적인 정량 결과를 확인하는 방법으로 기초 평가방법을 제공한다 (peak intensity 및 retention time을 확인).
Pept. # Location Mass [M] Sequence ΔMass Modification m/z z RT
T1 1~18 1877.8789 DIQMTQSPSSLSASVGDR -0.0007 None 939.9467 2 33.69
T1-T2 1~42 4660.2173 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGK 0.0120 C#@23 1166.0616 4 62.77
T1-T3 1~45 4956.4023 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPK -0.0010 C#@23 1240.1078 4 60.94
T2 19 - 42 2800.3491 VTITCSASQDISNYLNWYQQKPGK -0.0010 C#@5 934.4570 3 54.98
T2-T3 19 - 45 3096.5339 VTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPK -0.0011 C#@5 775.1407 4 52.56
T4 46 - 61 1761.9414 VLIYFTSSLHSGVPSR 0.0005 None 588.3210 3 43.40
T5 62 - 103 4659.1064 FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTK 0.0038 C#@27 1165.7839 4 75.97
T7-T8 108 - 126 2101.1208 RTVAAPSVFIFPPSDEQLK -0.0015 None 701.3809 3 50.76
T8 109 - 126 1945.0197 TVAAPSVFIFPPSDEQLK -0.0004 None 973.5171 2 55.40
T9 127 - 142 1796.8879 SGTASVVCLLNNFYPR 0.0026 C#@8 899.4512 2 61.63
T11-T13 146 - 183 4160.0034 VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK -0.0003 None 1041.0081 4 48.26
T12 150 - 169 2134.9614 VDNALQSGNSQESVTEQDSK -0.0101 None 712.6611 3 17.54
T12-T13 150 - 183 3618.7021 VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK 0.0031 None 1207.2413 3 42.32
T13 170 - 183 1501.7512 DSTYSLSSTLTLSK -0.0010 None 751.8829 2 39.24
T15-T16 189 - 207 2140.0735 HKVYACEVTHQGLSSPVTK 0.0005 C#@6 536.0256 4 21.70
T16 191 - 207 1874.9197 VYACEVTHQGLSSPVTK 0.0013 C#@4 625.9805 3 26.79
T17-T18 208 - 214 868.3497 SFNRGEC -0.0001 C#@7 435.1822 2 2.69
표 3은 Avastin의 light chain에서 동정된 peptide의 예 (tryptic mapping)
Pept. # Location Mass [M] Sequence ΔMass Modification m/z z RT
T1 1~19 1880.9956 EVQLVESGGGLVQPGGSLR 0.0026 None 941.5051 2 40.76
T2 20 - 38 2196.9722 LSCAASGYTFTNYGMNWVR 0.0030 C#@3 1099.4933 2 51.48
T4 44 - 65 2517.1853 GLEWVGWINTYTGEPTYAADFK -0.0025 None 840.0690 3 66.38
T4-T5 44 - 66 2673.2864 GLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR 0.0045 None 892.1027 3 62.10
T6-T7 67 - 76 1200.6139 RFTFSLDTSK -0.0023 None 601.3142 2 31.99
T7 68 - 76 1044.5128 FTFSLDTSK 0.0004 None 523.2637 2 36.21
T8 77 - 87 1282.6339 STAYLQMNSLR -0.0014 None 642.3243 2 31.64
T9 88 - 98 1289.5598 AEDTAVYYCAK 0.0005 C#@9 645.7872 2 16.94
T10 99 - 127 3322.5359 YPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTK 0.0050 None 1108.5193 3 58.94
T11 128 - 139 1185.6394 GPSVFPLAPSSK 0.0002 None 593.8270 2 34.88
T11-T12 128 - 153 2488.2996 GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK -0.0001 C#23 830.4405 3 51.30
T12 140 - 153 1320.6708 STSGGTAALGCLVK -0.0010 C#@11 661.3427 2 30.37
T13 154 - 216 6712.3071 DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK 0.0123 C#@53 1119.7251 6 78.09
T14-T16 217 - 224 941.5546 VDKKVEPK -0.0014 None 471.7846 2 0.79
T17-T18 225 - 254 3333.6348 SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK -0.0007 C#@2; C#@8; C#@11 834.4160 4 55.70
T18 229 - 254 2843.4502 THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK 0.0005 C#@4; C#@7 948.8240 3 57.93
T19 255 - 261 834.4269 DTLMISR 0.0016 None 418.2207 2 19.43
T20 262 - 280 2138.0203 TPEVTCVVVDVSHEDPEVK -0.0005 C#@6 713.6807 3 41.37
T21 281 - 294 1676.7947 FNWYVDGVEVHNAK 0.0002 None 559.9388 3 38.91
T22-T23 295 - 307 1671.7853 TKPREEQYNSTYR -0.0009 Deamidated(N)@9 558.2690 3 8.62
T23 299 - 307 1189.4888 EEQYNSTYR -0.0019 Deamidated(N)@5 595.7516 2 9.25
T24 308 - 323 1806.9993 VVSVLTVLHQDWLNGK 0.0024 None 603.3403 3 60.27
T24-T25 308 - 326 2227.2002 VVSVLTVLHQDWLNGKEYK 0.0008 None 743.4073 3 57.25
T28 333 - 340 837.4960 ALPAPIEK 0.0003 None 419.7553 2 20.40
T31-T33 347 - 366 2342.1689 GQPREPQVYTLPPSREEMTK -0.0018 None 586.5495 4 28.56
T32 351 - 361 1285.6666 EPQVYTLPPSR -0.0020 None 643.8406 2 26.80
T32-T33 351 - 366 1903.9349 EPQVYTLPPSREEMTK -0.0009 None 635.6523 3 30.30
T34 367 - 376 1160.6223 NQVSLTCLVK -0.0018 C#@7 581.3184 2 34.47
T35 377 - 398 2543.1240 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK -0.0067 None 848.7153 3 50.35
T36 399 - 415 1872.9146 TTPPVLDSDGSFFLYSK -0.0007 None 937.4645 2 52.70
T37-T38 416 - 422 817.4658 LTVDKSR -0.0009 None 409.7402 2 2.80
T39 423 - 445 2800.2598 WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK -0.0011 C#@9 934.4272 3 40.24
T40 446 - 453 787.4440 SLSLSPGK 0.0012 None 394.7292 2 16.48
*C#: Carbamidomethyl(C)
표 4는 Avastin의 heavy chain에서 동정된 peptide의 예 (tryptic mapping)

Claims (7)

  1. a) 혈장 시료로부터 단백질을 분리하는 단계;
    b)상기 단백질을 단백질 분해 효소를 처리하여 펩티드로 만드는 단계;
    c) 필요한 경우에 상기 펩티드와 동일 서열이며, 안정 동위원소(stable isotope)를 포함하는 스탠다드 펩티드를 첨가하는 단계;및
    d) 상기 단백질 또는 펩티드 시료를 액체크로마토그래피법을 이용하여 분리하되, 질량 분석법을 이용하는 단계를 포함하는 생체 시료내 단백질 정량분석 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 질량 분석법은 목표 단백질 및 펩티드의 특정 m/z 구간에 대하여 LC-MS/MS 수행 동안 지속적으로 텐덤스펙트럼을 얻고 특정 절편 이온(fragment ion)의 강도(intensity)를 고려하여 정량하고, 이때 얻어지는 풀 레인지(full range) 질량 스펙트럼 내의 타겟 단백질 및 펩티드 유래 특이적 절편의 최적 조합을 찾아내어 정량에 활용하고, 민감도의 증가를 위해 타겟 이온의 분리 폭(isolation width를 넓히거나 직접 시간(accumulation time)을 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 타깃 분자가 없는 배경(background) 혈장 시료로부터 얻어지는 타겟 단백질 및 펩티드 텐덤스펙트럼들에 비교하여 타겟 단백질 및 펩티드 포함 혈장시료에서만 관측되는 절편 이온들을 대상으로 정량하는 것을 특징으로 하고, 이들 대상은 타겟 단백질 및 펩티드의 특정 b-이온 또는 y-이온이거나 이들의 조합이거나 다른 인터널 절편(internal fragment)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 시스테인(Cysteine)-특이적 혹은 라이신-특이적 반응성 화학물질을 이용하여 단백질을 표지한 후 얻어지는 특이적 절편을 정량에 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 질량 분석방법에 농도를 알고 있는 펩티드를 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 생체 시료내에서 분리된 타겟 단백질의 펩티드와 동일 서열이며, 안정 동위원소(stable isotope)를 포함하고, 해당 펩티드는 분석하려는 타겟 단백질 특이적이거나 혹은 다른 단백질과 공통의 펩티드이며, 질량이 서로 다른 안정 동위원소를 포함하는 것을 특징으로 하는 질량분석법을 이용한 생체시료 내의 단백질 정량분석용 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 펩티드는 타겟 단백질이 아바스틴(Avastin)인 경우에는 아바스틴의 210번 잔기부터 250번 잔기 부위에서 유래한 것을 특징으로 하는 질량분석법을 이용한 생체시료 내의 단백질 정량분석용 조성물.

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CN114019065A (zh) * 2021-10-20 2022-02-08 澳门科技大学 一种共价药物及其代谢产物的药代动力学分析方法

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