KR20160032569A - Two-step phase separation-based 3D bioplotting for macro/nanoporous collagen scaffolds comprised of nanofibrous collagen filaments - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 다공성 콜라겐 지지체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체를 모사한 3차원 매크로 기공과 나노섬유형 필라멘트 구조로 이루어진 다공성 콜라겐 지지체에 관한 것이다.
The present invention relates to a porous collagen support, and more particularly, to a porous collagen support composed of a three-dimensional macropore and a nanofiber type filament structure simulating a living body.
콜라겐(collagen)은 인체의 경조직(뼈, 치아 등) 및 연조직(연골, 피부, 인대, 근육 등)을 이루는 유기물의 주된 성분으로, 원활한 조직재생에 필수적인 성분이다. 따라서, 이러한 콜라겐 고분자를 이용하여 인체의 손상된 조직 및 장기를 효과적으로 재생하고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있다(비특허문헌 1).Collagen is a major component of the organisms that make up the hard tissues (bone, teeth, etc.) and soft tissues (cartilage, skin, ligaments, muscles, etc.) of the human body and is essential for smooth tissue regeneration. Therefore, studies have been actively conducted to effectively regenerate damaged tissues and organs of the human body using such collagen polymers (Non-Patent Document 1).
특히, 조직재생용 콜라겐 지지체는 세포의 부착, 성장 및 분화에 적합하도록 수백 마이크론(100-1000 ㎛) 크기의 기공을 갖는 다공성 구조를 갖는 것이 바람직한 것으로 잘 알려져 있으며, 이에 따라 다공성 콜라겐 지지체를 제조할 수 있는 다양한 기술들이 개발되고 있다(비특허문헌 2). Particularly, it is well known that a collagen support for tissue regeneration has a porous structure having a pore size of several hundred microns (100-1000 mu m) so as to be suitable for attachment, growth and differentiation of cells, and thus, a porous collagen support Various technologies have been developed (Non-Patent Document 2).
이러한 다공성 콜라겐 지지체를 제조하는 방법으로, 콜라겐 용액을 동결건조(freeze drying)하여 스폰지 형태로 만드는 기술이 광범위하게 사용되고 있다. 이외에 콜라겐 용액에 기공유도물질(포로젠, porogen)을 첨가한 후 매우 낮은 온도에서 동결(freezing)하여 고화시킨 후, 첨가된 포로젠을 적절한 용매로 제거하여 다공성 구조를 얻는 방법 등이 사용되고 있다(비특허문헌 3 및 4).
As a method for producing such a porous collagen support, a technique of freezing and drying the collagen solution into a sponge form has been widely used. In addition, a method of adding a porogen to a collagen solution, freezing it at a very low temperature to solidify it, and then removing the added porogen with an appropriate solvent to obtain a porous structure Non-Patent Documents 3 and 4).
한편, 조직재생용 지지체의 다공성 구조(예, 기공율, 기공크기, 기공연결도 등)를 정밀하게 제어할 수 있는 3D 바이오플라팅(3D bioplotting) 기술이 개발되어, 다양한 생분해성 고분자를 이용한 지지체 제조에 매우 활발하게 이용되고 있다(비특허문헌 5). On the other hand, a 3D bioplotting technique capable of precisely controlling the porous structure (for example, porosity, pore size, pore connectivity, etc.) of the support for tissue regeneration has been developed and manufacturing of a support using various biodegradable polymers (Non-Patent Document 5).
3D 바이오플라팅 기술은 고분자를 고온에서 용융(melt) 시키거나 적절한 용매(solvent)를 이용하여 용액 형태로 제조한 후, 3D 프린터를 이용하여 미세노즐을 통해 고분자 용융체나 용액을 미세노즐을 통해 압출하면서 3차원적으로 적층하여 다공성 구조를 얻는 기술이다. 고분자 용융체의 경우 냉각을 통해 필라멘트를 고형화 시키고, 용액의 경우 적절한 비용매(non-solvent)내에서 압출하여 고분자를 석출(precipitation) 또는 상분리(phase separation)를 통해 고형화를 유도시킬 수 있다(비특허문헌 6 및 7).3D bioflattening technology is a process in which a polymer is melted at a high temperature or made into a solution form using an appropriate solvent and then extruded through a fine nozzle and a polymer melt or solution through a fine nozzle using a 3D printer And three-dimensionally laminated to obtain a porous structure. In the case of a polymer melt, the filament can be solidified by cooling, and in the case of a solution, the polymer can be extruded in a suitable non-solvent to induce solidification through precipitation or phase separation of the polymer (Non-patent Documents 6 and 7).
상기 3D 바이오플라팅 기술은 적절한 비용매의 선택에 따라 고분자 지지체를 이루는 필라멘트 내부에 수많은 미세기공을 만들 수 있어, 치밀한 필라멘트로 이루어진 다공성 지지체에 비해 더 우수한 조직 재생능을 가질 수 있을 것으로 기대되고 있다(비특허문헌 8 및 9).
The 3D bioflattening technique is expected to produce a number of micropores in the filaments constituting the polymer scaffold according to the selection of a suitable nonporous scaffold to have a better tissue regeneration ability than the porous scaffold made of dense filaments (Non-patent documents 8 and 9).
현재까지 3D 바이오플라팅 기술은 다양한 생분해성 고분자 기반 지지체 개발에 매우 활발하게 이용되었다. 하지만, 콜라겐 고분자의 경우 용융체(melt) 형태로 제조하기 위해 열을 가하는 경우 콜라겐이 물리화학적으로 변성되어 원래의 우수한 조직 재생능을 잃어버리는 문제점이 있었다. 또한 콜라겐 고분자 용액 (solution)의 경우 점도가 낮고, 높은 친수성 특성을 갖기 때문에, 통상적인 3D 바이오플라팅 기술에 직접적으로 적용하기에는 다소 어려운 점이 있었다. Until now, 3D bioplating technology has been actively used for the development of various biodegradable polymer-based supports. However, in the case of the collagen polymer, when heat is applied to produce a melt, the collagen is physically and chemically modified, and the original excellent tissue regenerating ability is lost. In addition, collagen polymer solutions are somewhat difficult to apply directly to conventional 3D bioflattening techniques because of their low viscosity and high hydrophilic properties.
최근, 콜라겐 용액을 미세노즐을 통해 압출과 동시에 매우 낮은 온도에서 급속으로 동결하여 필라멘트를 고형화시키는 방식으로 다공성 콜라겐 지지체를 제조할 수 있는 새로운 방식의 3D 바이오프린팅 기술이 개발되었다(비특허문헌 10).Recently, a new type of 3D bio-printing technology has been developed which can produce a porous collagen support by extruding a collagen solution through a fine nozzle and rapidly freezing the filament at a very low temperature to solidify the filament (Non-Patent Document 10) .
특히, 이 기술은 콜라겐 용액을 매우 낮은 온도에서 급속으로 동결하여 콜라겐 필라멘트를 고형화시키는 방식을 채택하고 있으며, 동결시 콜라겐 용액에 존재하는 다량의 물이 얼음 결정으로 성장하고, 이를 동결건조 과정을 통해 제거하므로, 다공성 콜라겐 필라멘트를 제조할 수 있었다. In particular, this technique employs a method of solidifying collagen filament by rapidly freezing the collagen solution at a very low temperature, and a large amount of water present in the collagen solution during freezing grows into ice crystals, So that the porous collagen filament could be produced.
하지만, 상기 기술은 고분자 용액을 필라멘트 형태로 동결하기 위해 매우 낮은 온도(예, -40℃)가 필요하여 부가적인 장치가 필요로 한다. 또한, 적층을 반복할수록 동결부분(예, -40℃)으로부터 멀어짐으로서 콜라겐 필라멘트를 효과적으로 고형화시킬 수 없어, 두꺼운 3차원 다공성 지지체를 제조하기에는 한계가 있다.However, this technique requires additional equipment because very low temperatures (e.g., -40 ° C) are required to freeze the polymer solution in filament form. Further, as the lamination is repeated, the collagen filament can not be effectively solidified by moving away from the freezing portion (for example, -40 ° C), and thus there is a limit to producing a thick three-dimensional porous support.
또한, 생체조직을 구성하는 주요 성분인 세포외 기지물질(extra cellular matrix)의 나노구조를 모방한 나노다공성 필라멘트로 구성된 다공성 콜라겐 지지체의 개발 사례는 아직 보고되지 않았으며, 빠르고 완벽한 조직재생을 유도할 수 있는 매크로 수준의 기공(100-1000 ㎛ 크기)과 나노수준(< 1 ㎛)의 기공을 동시에 갖는 다공성 콜라겐 지지체를 제조할 수 있는 새로운 기술 개발은 아직 보고되지 않았다.
In addition, there have been no reports on the development of porous collagen scaffolds composed of nano-porous filaments that mimic the nanostructures of extracellular matrix, the major constituent of biological tissue, Novel technology has yet to be developed to produce porous collagen scaffolds having both macro-level pores (100-1000 mu m size) and nano-level (<1 mu m) pores at the same time.
본 발명은 제어된 매크로 기공구조를 갖는 다공성 콜라겐 지지체를 제조할 수 있는 3D 바이오플라팅 기술과 나노섬유형 콜라겐 필라멘트를 제조할 수 있는 2단계 상분리 공정(two-step phase separation) 기술을 결합하여, ‘2단계 상분리 기반 3D 바이오플라팅 기술’을 제공하는데 목적이 있다.
The present invention combines a 3D bioflattening technique capable of producing a porous collagen support having a controlled macro-pore structure and a two-step phase separation technique capable of producing a nanofiber type collagen filament, '2D phase-based 3D bioplating technology'.
본 발명에서는 콜라겐 고분자 및 산을 포함하는 콜라겐 용액을 제조하는 단계;In the present invention, there is provided a method for producing collagen, comprising: preparing a collagen solution containing collagen polymer and acid;
상기 콜라겐 용액을 응고 매체 내부로 압출하여 콜라겐 필라멘트를 겔화하고, 상기 콜라겐 필라멘트를 적층하는 단계; 및Extruding the collagen solution into a coagulation medium to gellify the collagen filaments, and laminating the collagen filaments; And
적층된 콜라겐 필라멘트를 비용매 매체에 담지하는 단계를 포함하는 다공성 콜라겐 지지체의 제조 방법을 제공한다. And carrying the laminated collagen filament on a non-solvent medium.
또한, 본 발명에서는 전술한 제조 방법에 의해 제조되고, 평균 직경이 300 내지 1000 ㎛인 하나 이상의 콜라겐 필라멘트가 일방향으로 정렬된 구조를 가지는 다공성 콜라겐 지지체를 제공한다.
In addition, the present invention provides a porous collagen support having a structure prepared by the above-described production method and having a structure in which one or more collagen filaments having an average diameter of 300 to 1000 탆 are aligned in one direction.
본 발명에서는 3D 바이오프린터를 부가적인 장치, 예를 들어, 동결 시스템 없이 상온에서 3차원적으로 연결된 매크로 기공과 나노기공을 동시에 갖는 매크로/나노 다공성 콜라겐 지지체를 제조 할 수 있다.In the present invention, it is possible to produce a macro / nano porous collagen support having macropores and nano pores connected three dimensionally at room temperature without any additional device, for example, a freezing system.
본 발명은 컴퓨터 제어기반 3D 바이오플라팅 기술을 용용한 것으로, 다공성 콜라겐 지지체의 매크로 기공구조(기공율, 기공 크기, 기공연결도 등)를 임으로 제어할 수 있으며, 다양한 조직재생 부위에 적합한 맞춤형 기계적 물성(강도) 및 조직 재생능을 갖는 다공성 지지체를 제조할 수 있다.The present invention relates to a 3D bioflattening technique based on computer control, which can control the macropore structure (porosity, pore size, pore connectivity, etc.) of porous collagen scaffolds, and provides customized mechanical properties suitable for various tissue regeneration sites (Strength) and tissue regeneration ability of the porous support.
또한, 본 발명에서는 생체의 세포외기지물질의 나노구조를 모방한 나노섬유형 콜라겐 필라멘트를 제조 할 수 있어, 다공성 콜라겐 지지체의 조직재생능을 향상 시킬 수 있다. Also, in the present invention, it is possible to produce a nanofiber-type collagen filament that mimics the nanostructure of an extracellular matrix material of a living body, thereby improving the tissue regeneration ability of the porous collagen scaffold.
또한, 본 발명에 따른 다공성 콜라겐 지지체는 3차원적으로 연결된 매크로 기공과 나노기공을 동시에 갖는 독특한 구조를 가지므로, 상기 다공성 콜라겐 지지체를 조직 재생용 지지체로 활용시 매우 우수한 골조직 재생능을 보일 수 있다.
In addition, since the porous collagen support according to the present invention has a unique structure having three-dimensionally connected macropores and nanopores simultaneously, the porous collagen support can exhibit excellent bone tissue regeneration ability when used as a support for tissue regeneration .
도 1은 본 발명에 따른 다공성 콜라겐 지지체의 제조 방법을 나타내는 개략도이다.
도 2는 1차 상분리 유도 후의 다공성 콜라겐 지지체의 형상을 보여주는 광학현미경 이미지이다.
도 3은 실시예에 의해 제조된 다공성 콜라겐 지지체의 형상 및 콜라겐 필라멘트의 표면구조를 보여주는 주사전자현미경(SEM, Scanning Electron Microscopy)이미지이다.
도 4는 실시예에 의해 제조된 다공성 콜라겐 지지체의 형상 (횡단면)및 나노섬유형 콜라겐 필라멘트 구조를 보여주는 주사전자현미경 이미지이다.
도 5는 실시예에 의해 제조된 다공성 콜라겐 지지체의 기계적 물성 (인장강도 및 압축강도)를 보여주는 그래프이다.
도 6은 실시예에 의해 제조된 다공성 콜라겐 지지체의 생체적합성을 보여주는 공초점주사현미경(CLSM; Confocal Laser Scanning Microscopy) 이미지이다. 1 is a schematic view showing a method for producing a porous collagen support according to the present invention.
Fig. 2 is an optical microscope image showing the shape of the porous collagen support after the primary phase separation.
FIG. 3 is a scanning electron microscopy (SEM) image showing the shape of the porous collagen support and the surface structure of the collagen filament manufactured according to the embodiment.
Fig. 4 is a scanning electron microscope image showing the shape (cross-sectional view) of the porous collagen support produced by the embodiment and the nanofiber type collagen filament structure.
5 is a graph showing the mechanical properties (tensile strength and compressive strength) of the porous collagen support prepared by the examples.
6 is a Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) image showing the biocompatibility of the porous collagen support prepared according to the example.
본 발명은 콜라겐 고분자 및 산을 포함하는 콜라겐 용액을 제조하는 단계;The present invention provides a method for producing collagen, comprising: preparing a collagen solution containing collagen polymer and acid;
상기 콜라겐 용액을 응고 매체 내부로 압출하여 콜라겐 필라멘트를 겔화하고, 상기 콜라겐 필라멘트를 적층하는 단계; 및Extruding the collagen solution into a coagulation medium to gellify the collagen filaments, and laminating the collagen filaments; And
적층된 콜라겐 필라멘트를 비용매 매체에 담지하는 단계를 포함하는 다공성 콜라겐 지지체의 제조 방법에 관한 것이다.
And carrying the laminated collagen filament on a non-solvent medium.
이하, 본 발명에 따른 다공성 콜라겐 지지체의 제조 방법에 대해 구체적으로 설명한다. Hereinafter, a method of preparing a porous collagen support according to the present invention will be described in detail.
본 발명에서는 먼저, 콜라겐 고분자 및 산을 포함하는 콜라겐 용액을 제조한다. 본 발명에서는 상기 단계를 ‘콜라겐 용액 제조’라 명칭할 수 있다. In the present invention, first, a collagen solution containing a collagen polymer and an acid is prepared. In the present invention, this step may be referred to as " preparation of collagen solution ".
상기 콜라겐 용액은 콜라겐 고분자 및 산을 혼합하여 제조할 수 있다.The collagen solution may be prepared by mixing a collagen polymer and an acid.
콜라겐은 피부의 섬유 모세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 세포외간질에 존재하고, 생체 단백질 총중량의 30%를 차지하는 중요한 단백질로 견고한 3중 나선구조를 가지고 있다. 주된 기능으로는 피부의 기계적, 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포접착의 지탱 및 세포분할과 분화(유기체의 성장 혹은 상처 치유 시)의 유도 등이 알려져 있다. Collagen is a major substrate protein produced in the fibroblasts of the skin and exists in extracellular epilepsy. It is an important protein that occupies 30% of the total weight of the bioprotein, and has a rigid triple helix structure. Its main functions are mechanical and rigidity of skin, resistance of connective tissues and binding force of tissues, support of cell adhesion, and induction of cell division and differentiation (when organism grows or heals the wound).
본 발명에서 사용되는 콜라겐은 콜라겐 Ⅰ, Ⅲ, 및 Ⅳ형일 수 있으며, 구체적으로 콜라겐 Ⅰ형 일 수 있다. 상기 콜라겐은 가축의 가죽과 뼈, 소의 무릎관절 등에서 추출함으로써 생산하거나 인간의 사체 또는 태반조직으로부터 추출하여 생산할 수 있다. 또한, 세포배양 방법을 이용하여 생산할 수 있다. The collagen used in the present invention may be collagen I, III, or IV, and may be specifically collagen I. The collagen can be produced by extraction from livestock skins, bones, and knee joints of cattle, or extracted from human carcass or placenta tissues. It can also be produced using a cell culture method.
산은 콜라겐 고분자를 용해시킬 수 있다면, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 이러한 산으로, 아세트산(acetic acid), 탄산, 염산 또는 히알루론산를 사용할 수 있다. The acid is not particularly limited as long as it can dissolve the collagen polymer. As such an acid, acetic acid, carbonic acid, hydrochloric acid or hyaluronic acid may be used.
상기 콜라겐 용액의 pH는 3 내지 6일 수 있다. 상기 범위에서 후술할 1차 상분리 유도에 의해 콜라겐 용액 중의 콜라겐 고분자가 나노섬유형 콜라겐 필라멘트로 겔화할 수 있다. The pH of the collagen solution may be 3 to 6. In the above range, the collagen polymer in the collagen solution can be gelated with the nanofiber type collagen filament by the first phase separation induction described later.
또한, 콜라겐 용액에서 콜라겐 고분자는 1 내지 10 wt/vol%로 존재할 수 있다. 일 구체예에서 상기 콜라겐 고분자는 산 100 ml 대비 1 내지 10 g으로 포함될 수 있다. In addition, the collagen polymer in the collagen solution may be present at 1 to 10 wt / vol%. In one embodiment, the collagen polymer may be included in an amount of 1 to 10 g based on 100 ml of the acid.
본 발명에서는 콜라겐 고분자 및 용매의 혼합을 위해 자석 교반기 등의 교반기를 이용하여 교반하는 과정을 추가로 수행할 수 있다.
In the present invention, a stirring process may be further performed using a stirrer such as a magnetic stirrer for mixing the collagen polymer and the solvent.
본 발명에서는 콜라겐 용액을 제조한 후, 상기 콜라겐 용액을 응고 매체 내부로 압출하여 콜라겐 필라멘트를 겔화하고, 상기 콜라겐 필라멘트를 적층하는 단계를 수행한다. 상기 단계에서는 콜라겐 용액을 3D 바이오프린터 장비를 이용하여 응고 욕조 내에서 압출하여 콜라겐 필라멘트를 겔(gell)화하여 형상을 유지하고, 3차원적으로 적층할 수 있다. 이는 콜라겐 용액과 응고 매체의 수소 이온 농도에 의한 상분리 현상의 유도에 의해 이루어진다. 따라서, 본 발명에서는 상기 단계를 ‘1차 상분리 유도’라 명칭할 수 있다. In the present invention, after the collagen solution is prepared, the collagen solution is extruded into the coagulation medium to gel the collagen filaments, and the collagen filaments are laminated. In the above step, the collagen solution is extruded in a coagulation bath using a 3D bio printer device to gel the collagen filaments to maintain their shape and to stack them three-dimensionally. This is achieved by induction of phase separation by the hydrogen ion concentration of the collagen solution and the coagulation medium. Therefore, in the present invention, this step may be referred to as 'first order phase separation.'
구체적으로, 콜라겐 용액을 응고 매체가 담지된 응고 욕조(coagulation bath) 내에서 압출하여 1차 상분리를 유도하는데, 상기 응고 매체의 종류는 콜라겐 용액을 겔화 시킬 수 있는 액체라면 특별히 제한되지 않는다. Specifically, the collagen solution is extruded in a coagulation bath carrying a coagulation medium to induce primary phase separation. The type of the coagulation medium is not particularly limited as long as it is a liquid capable of gelling the collagen solution.
구체적으로, 응고 매체는 콜라겐 고분자의 비용매 또는 비용매와 용매의 혼합물일 수 있다. 상기 콜라겐 고분자의 비용매는 아세톤 등의 케톤 계열 유기 용매일 수 있으며, 용매는 물 또는 아세트산일 수 있다. 상기 응고 미체로 비용매와 용매의 혼합물을 사용할 경우, 비용매 및 용매의 비율은 1:99 내지 10:90 또는 3:97 내지 7:93일 수 있다. Specifically, the solidifying medium may be a non-solvent of a collagen polymer or a mixture of a non-solvent and a solvent. The non-solvent of the collagen polymer may be ketone-based organic solvent such as acetone, and the solvent may be water or acetic acid. When a mixture of the non-solvent and the solvent is used in the solidification, the ratio of the non-solvent and the solvent may be from 1:99 to 10:90 or from 3:97 to 7:93.
상기 응고 매체의 pH는 8 내지 11일 수 있다. 상기 범위에서 콜라겐 용액 및 응고 매체 사이의 상분리 유도 현상이 용이하게 일어나며, 콜라겐 용액 중의 콜라겐 고분자가 나노섬유형 콜라겐 필라멘트로 겔화할 수 있다. 상기 응고 매체의 pH는 암모니아수 또는 염산(1N-HCl)을 사용하여 8 내지 11로 조정할 수 있다. The pH of the solidifying medium may be 8 to 11. In the above range, phase separation induction phenomenon easily occurs between the collagen solution and the coagulation medium, and the collagen polymer in the collagen solution can be gelated with the nanofiber type collagen filament. The pH of the solidification medium can be adjusted to 8 to 11 using ammonia water or hydrochloric acid (1N-HCl).
본 발명에서 콜라겐 용액의 압출 및 적층은 3D 바이오프린터를 사용하여 수행하는데, 3D 바이오프린터를 사용함으로써 사용자가 원하는 구조로 프로그램하여 적층할 수 있으며, 복잡한 구조의 지지체를 용이하게 제조할 수 있다. 성형체의 적층 시 바이오프린터의 속도는 압출 속도에 따라 제어될 수 있다. 상기 3D 바이오프린터는 파이버를 압출하는 압출 시스템(압출기)와 연결 설치되어, 압출 시스템에서 압출된 성형체를 프로그램된 디자인에 따라 적층할 수 있다. 구체적으로 압출된 성형체를 원하는 방향에 따라 적층할 수 있으며 수회 적층할 수 있다.In the present invention, the extrusion and lamination of the collagen solution are performed using a 3D bio printer. By using a 3D bio printer, a user can program and stack the desired structure, and a support having a complicated structure can be easily manufactured. The speed of the bio-printers can be controlled according to the extrusion speed when the molded body is laminated. The 3D bio-printer may be connected to an extrusion system (extruder) for extruding fibers, and the extruded extrusion system may be laminated according to a programmed design. Specifically, the extruded molded body can be laminated along a desired direction and laminated a plurality of times.
일 구체예에서, 3D 바이오프린터를 이용하여 콜라겐 용액을 응고 욕조 내에 미세노즐을 통해 압출할 수 있다. 상기 pH 3 내지 6의 콜라겐 용액은 pH 8 내지 11인 응고 매체와 pH 농도 차에 의해 상 분리되어 응고 매체 내에서 콜라겐 필라멘트로 겔화되고, 상기 콜라겐 필라멘트를 용이하게 적층할 수 있다. In one embodiment, the 3D bio-printer can be used to extrude the collagen solution through the fine nozzles in a coagulation bath. The collagen solution having a pH of 3 to 6 is phase-separated by a pH concentration difference with a coagulating medium having a pH of 8 to 11, gelled into a collagen filament in a coagulating medium, and the collagen filament can be easily laminated.
상기 적층은 3차원으로 적층될 수 있으며, 일 구체예에서는 콜라겐 필라멘트가 일 방향성을 가지도록 적층할 수 있다. 상기 일 방향성이란 필라멘트가 다층으로 형성된 필라멘트 적층체에서 필라멘트들이 일정 간격으로 적층된 하나의 층을 기준으로 한 쪽 방향으로 향함을 의미한다. 즉, 필라멘트가 다층으로 형성될 경우, 하나의 층은 필라멘트들이 한 방향으로 일정 간격을 가지도록 형성되며, 상기 하나의 층과 접하는 다른 층은 필라멘트들이 하나의 층과 수직하는 방향으로 일정 간격을 가지도록 형성될 수 있다. 이때, 필라멘트 사이의 간격은 10 내지 1000 ㎛일 수 있다. The laminate may be laminated in three dimensions, and in one embodiment, the collagen filaments may be laminated so as to have unidirectionality. The unidirectional means that the filaments are oriented in one direction with respect to one layer of filaments stacked at regular intervals in the filament stacked body in which filaments are formed in multiple layers. That is, when the filaments are formed in multiple layers, one layer is formed such that the filaments are spaced apart in one direction, and the other layer in contact with the one layer is formed such that the filaments are spaced apart in a direction perpendicular to one layer . At this time, the spacing between the filaments may be 10 to 1000 mu m.
일 구체예에서, 콜라겐 용액의 압출 시 10 내지 20 kPa의 압축공기를 주입하여 압출할 수 있으며, 노즐의 입경은 1,000 ㎛, 800 ㎛ 이하, 600 ㎛ 이하 또는 400 ㎛ 이하일 수 있다. 또한, 3D 프린팅 속도, 즉 압출 속도는 1 내지 10 mm/s 또는 1 내지 5 mm/s 범위 내로 제어할 수 있으며, 높이 방향으로는 50 내지 150 mm/s 또는 80 내지 120mm/s 의 속도로 적층할 수 있다. In one embodiment, when the collagen solution is extruded, compressed air of 10 to 20 kPa may be injected and extruded. The diameter of the nozzle may be 1,000 占 퐉, 800 占 퐉, 600 占 퐉, or 400 占 퐉 or less. In addition, the 3D printing speed, i.e., the extrusion speed, can be controlled within the range of 1 to 10 mm / s or 1 to 5 mm / s, and in the height direction at the speed of 50 to 150 mm / s or 80 to 120 mm / can do.
상기 단계에 의해 콜라겐 필라멘트의 적층체를 제조할 수 있다.
By this step, a laminate of collagen filaments can be produced.
본 발명에서는 ‘1차 상분리 유도 단계’ 후에, 적층된 콜라겐 필라멘트를 비용매 매체에 담지하는 단계를 수행한다. 상기 단계에서는 겔화된 콜라겐 필라멘트 내의 콜라겐 고분자간의 화학적 가교를 유도하여 콜라겐 필라멘트를 구조적으로 안정화할 수 있다. 즉, 상기 단계에서는 콜라겐 필라멘트 간의 접착을 증진시킬 수 있다. 또한, 잔류하고 있는 물을 용매추출법을 이용하여 제거하여 나노섬유형 구조를 갖는 콜라겐 필라멘트를 형성함 수 있다. 본 발명에서는 상기 단계를 ‘2차 상분리 유도 단계’라 명칭할 수 있다. In the present invention, the step of carrying the laminated collagen filament onto the non-solvent medium is performed after the 'first phase separation induction step'. In this step, the collagen filament can be structurally stabilized by inducing chemical crosslinking between the collagen polymers in the gelled collagen filament. That is, in the above step, the adhesion between the collagen filaments can be enhanced. The remaining water may be removed using a solvent extraction method to form a collagen filament having a nanofiber-type structure. In the present invention, this step may be referred to as a 'second phase separation induction step'.
비용매 매체는 콜라겐 고분자의 비용매와 가교제의 혼합물일 수 있다. The non-solvent medium may be a mixture of a non-solvent and a crosslinking agent of the collagen polymer.
가교제는 콜라겐 필라멘트 간의 화학적 가교를 유도하고 콜라겐 필라멘트를 구조적으로 안정화하여, 최종 제조되는 다공성 콜라겐 지지체의 물성을 향상시킬 수 있다. 이러한, 가교제로는 EDC(N-ethyl-N′-(3-(dimethylamino)propyl)carbodiimide), NHS(N-hydroxysuccinimide), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether:EGDGE), 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether:BDDE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether) 및 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 가교제로 EDC(N-ethyl-N′-(3-(dimethylamino)propyl)carbodiimide) 및 NHS(N-hydroxysuccinimide)을 혼합 사용할 수 있는데, 이 때 EDC 및 NHS의 부피비는 7:1 내지 2:1 또는 5:1 내지 3:1일 수 있다. The crosslinking agent induces chemical crosslinking between the collagen filaments and structurally stabilizes the collagen filaments, thereby improving the physical properties of the porous collagen support finally prepared. Examples of the crosslinking agent include EDC (N-ethyl-N '- (3- (dimethylamino) propyl) carbodiimide, N-hydroxysuccinimide, ethylene glycol diglycidyl ether (EGDGE) Butene glycol diglycidyl ether (BDDE), 1,6-hexanediol diglycidyl ether, propylene glycol diglycidyl ether, polypropylene glycol Polypropylene glycol diglycidyl ether, and diglycerol polyglycidyl ether. The term " polyglycidyl ether " In one embodiment, EDC (N-ethyl-N '- (3- (dimethylamino) propyl) carbodiimide) and NHS (N-hydroxysuccinimide) may be used as a crosslinking agent, wherein the volume ratio of EDC and NHS is 7: To 2: 1 or from 5: 1 to 3: 1.
콜라겐 고분자의 비용매는 용매추출법을 통해 콜라겐 필라멘트에 잔류하는 물을 제거하여 나노섬유형 구조를 갖는 콜라겐 필라멘트를 형성하도록 할 수 있다. 이러한 비용매로는 에탄올 및 에틸 알코올로 이루어진 그룹으로터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.The non-solvent of the collagen polymer can be removed by removing the water remaining in the collagen filament through a solvent extraction method to form a collagen filament having a nanofiber-type structure. As such non-solvent, one or more selected from the group consisting of ethanol and ethyl alcohol can be used.
상기 콜라겐 필라멘트 적층체의 비용매 매체에서의 담지는 10 내지 30 시간, 또는 15 내지 25 시간 동안 수행할 수 있다. The support of the collagen filament laminate in the non-solvent medium can be carried out for 10 to 30 hours, or for 15 to 25 hours.
상기 단계를 통해 콜라겐 필라멘트의 상분리가 유도되며, 콜라겐 나노섬유가 가교(cross-linking)되어 다공성 콜라겐 지지체가 제조될 수 있다. In this step, phase separation of the collagen filaments is induced, and the collagen nanofibers are cross-linked to produce a porous collagen support.
또한, 본 발명에서는 1차 상분리 유도 단계 후에, 다공성 콜라겐 지지체를 동결건조하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. Further, in the present invention, after the first phase separation induction step, a step of lyophilizing the porous collagen supporter may be further performed.
상기 단계를 통해 다공성 콜라겐 지지체 내부에 잔존하는 물을 제거할 수 있다. 상기 동결건조는 통상적인 동결 건조기를 이용하여 예를 들어, -40℃ 이하의 온도에서 20 내지 30시간 동안 수행할 수 있다.
Through this step, water remaining in the porous collagen support can be removed. The freeze-drying can be carried out using a conventional freeze dryer, for example, at a temperature of -40 DEG C or lower for 20 to 30 hours.
본 발명에 따른 제조 방법에 의해 콜라겐 필라멘트가 일방으로 정렬된 다공성 콜라겐 지지체가 형성된다.According to the production method of the present invention, a porous collagen support having collagen filaments aligned in one direction is formed.
상기 일방향성은 필라멘트가 다층으로 형성된 다공성 지지체에서 필라멘트가 일정 간격으로 적층된 하나의 층을 기준으로 한 쪽 방향으로 향함을 의미한다.
The unidirectional means that the filament is oriented in one direction with respect to one layer in which the filaments are stacked at a predetermined interval in the porous support in which filaments are formed in multiple layers.
본 발명은, 또한 상기 방법으로 제조된 다공성 콜라겐 지지체에 관한 것이다.The present invention also relates to a porous collagen support prepared by the above method.
특히, 상기 다공성 콜라겐 지지체는 평균 직경(지름)이 300 내지 1000 ㎛, 400 내지 900 ㎛ 또는 500 내지 800 ㎛인 필라멘트가 하나의 층마다 일방향으로 형성되어 있다. Particularly, the porous collagen supporter has filaments having an average diameter (diameter) of 300 to 1000 mu m, 400 to 900 mu m, or 500 to 800 mu m in one direction for each layer.
상기 다공성 콜라겐 지지체는 필라멘트들 사이에 평균 직경(지름)이 10 내지 1000 ㎛ 또는 100 내지 900 ㎛ 또는 200 내지 800 ㎛인 매크로 기공이 형성된다. 또한, 다공성 콜라겐 지지체에서 콜라겐 지지체는 나노섬유형 구성을 가지며, 상기 콜라겐 필라멘트 내부에는 10 내지 500 nm, 20 내지 100 nm 또는 30 내지 50 nm의 나노 기공을 갖는다.The porous collagen support is formed with macropores having an average diameter (diameter) of 10 to 1000 mu m or 100 to 900 mu m or 200 to 800 mu m between the filaments. In the porous collagen support, the collagen support has a nanofiber-type structure, and the collagen filament has nanopores in the range of 10 to 500 nm, 20 to 100 nm, or 30 to 50 nm.
즉, 다공성 콜라겐 지지체는 나노기공 및 매크로 기공의 이중 기공 구조를 지닌다. That is, the porous collagen support has a double pore structure of nanopores and macropores.
상기 다공성 콜라겐 지지체에서 기공율은 90%이상이며, 기공이 정렬된 방향에서의 높은 강도를 가지며, 우수한 세포 접착성을 가진다.
The porous collagen support has a porosity of 90% or more, a high strength in a direction in which pores are aligned, and has excellent cell adhesiveness.
본 발명은, 또한 상기 다공성 콜라겐 지지체를 포함하는 제품에 관한 것이다.The present invention also relates to a product comprising said porous collagen support.
본 발명에 따른 다공성 콜라겐 지지체는 나노 기공/매크로 기공의 이중 기공구조 및 우수한 물성을 가지므로, 인체의 뼈나 치아 등의 경조직 재생뿐만 아니라, 연골, 피부, 인대, 근육 등의 다양한 연조직 재생에도 사용될 수 있다.
The porous collagen support according to the present invention has a double pore structure of nano pores / macropores and excellent physical properties. Therefore, it can be used not only for hard tissue regeneration of bones and teeth of human body but also for regeneration of various soft tissues such as cartilage, skin, ligament and muscle have.
본 발명은 제어된 매크로 기공구조를 갖는 다공성 콜라겐 지지체를 제조할 수 있는 3D 바이오플라팅 기술과 나노섬유형 콜라겐 필라멘트를 제조할 수 있는 2단계 상분리 공정(two-step phase separation) 기술을 결합한 2단계 상분리 기반 3D 바이오플라팅 기술에 관한 것으로, The present invention relates to a method for producing a porous collagen support having a controlled macro-pore structure, comprising the steps of: (a) preparing a porous collagen support having a controlled macro-pore structure, (b) combining a 3D bioflattening technique capable of producing a porous collagen support with a controlled- The present invention relates to a phase separation based 3D bioplating technique,
상기 ‘2단계 상분리 기반 3D 바이오플라팅 기술’은, 콜라겐 용액을 응고 용매 내에서 압출하여 1차 상분리를 유도하여, 콜라겐 필라멘트를 겔(gell)화하여 3차원적으로 연결된 겔화된 콜라겐 필라멘트로 구성된 다공성 지지체를 제조한 후, 이를 비용매 매체에 담지하여 겔화된 콜라겔 필라멘트 내의 콜라겐 고분자의 2차 상분리를 유도하여 나노섬유형 콜라겐 필라멘트로 변환시킬 수 있다. The 'two-step phase separation based 3D bioplating technique' is a technique of extracting a collagen solution in a coagulation solvent to induce a first phase separation to form a gelatinized collagen filament in which a collagen filament is gelated to be three- The porous support may be prepared and supported on a non-solvent medium to induce secondary phase separation of the collagen polymer in the gelated collagen filaments, thereby converting the collagen filament into a nanofiber type collagen filament.
본 발명에 의해 제조된 다공성 콜라겐 지지체는, 3차원적으로 연결된 매크로 기공(10 내지 1000 ㎛)을 가짐과 동시에, 나노섬유형 콜라겐 필라멘트 구조로 이루어진 독특한 구조를 가질 수 있다.The porous collagen support prepared according to the present invention may have macropores (10 to 1000 탆) connected three-dimensionally and have a unique structure composed of a nanofiber type collagen filament structure.
또한, 컴퓨터 제어 기반 기술로서, 다양한 조직재생에 적합한 맞춤형 기공구조(기공율, 기공 크기 등)를 갖는 나노섬유형 콜라겐 필라멘트로 이루어진 매크로 다공성 콜라겐 지지체를 제조할 수 있다.
Further, as a computer-control-based technique, a macroporous collagen support made of a nanofiber-type collagen filament having a customized pore structure (porosity, pore size, etc.) suitable for various tissue regeneration can be produced.
이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the scope of the present invention is not limited by the following examples.
실시예Example 1: 매크로/마이크로 이중기공구조형 다공성 콜라겐 지지체 제조 1: Macro / micro duplex tool molding Porous collagen support manufacture
하기 (1) 내지 (4)의 방법으로 다공성 콜라겐 지지체를 제조하였다. 상기 다공성 콜라겐 지지체의 제조 방법은 도 1에 개략적으로 도시하였다.A porous collagen support was prepared by the following methods (1) to (4). The method for producing the porous collagen support is schematically shown in Fig.
(1) 콜라겐 용액제조(1) Production of collagen solution
아세트산(acetic acid, 0.05 M, pH 3.4) 20 ml에 콜라겐(Type-Ⅰ) 0.5 g을 넣고 자석 교반기를 이용하여 24 시간 동안 교반하여 콜라겐 용액(2.5 wt/vol%)을 제조하였다.
0.5 g of collagen (Type-I) was added to 20 ml of acetic acid (0.05 M, pH 3.4) and stirred for 24 hours using a magnetic stirrer to prepare a collagen solution (2.5 wt / vol%).
(2) 1차 상분리 유도(2) induction of primary phase separation
증류수 380 ml 및 아세톤 20 ml를 혼합하여 상기 증류수 및 아세톤의 부피비가 95:5인 혼합용액을 제조하고, 암모니아수 2 ml를 천천히 첨가한 후(혼합용액 100 ml 당 암모니아수 0.5 ml), 염산 4 ml을 첨가하여 용액의 pH 값이 10이 되도록 조정하였다. 380 ml of distilled water and 20 ml of acetone were mixed to prepare a mixed solution having a volume ratio of 95: 5 of distilled water and acetone. 2 ml of ammonia water was slowly added (0.5 ml of ammonia water per 100 ml of the mixed solution) and 4 ml of hydrochloric acid To adjust the pH value of the solution to 10.
3D 바이오프린터를 이용하여 콜라겐 용액을 응고 욕조내에서 미세노즐을 통해 압출하여 콜라겐 필라멘트를 겔화시키고, 이를 3차원적으로 적층하여 겔화된 콜라겐 필라멘트 적층체를 제조하였다. 구체적으로, 콜라겐 용액을 20 ml 용량의 주사기에 부은 후, 10-20 kPa의 압축공기를 주입하여 주사기의 20게이지(~600 ㎛) 노즐로부터 콜라겐 용액이 토출되어 적층 욕조 내에서 산성용액인 콜라겐 용액 내의 아세트산과 응고 매체 내의 암모니아수의 pH 농도 차에 의해 상 분리되어 수조 내에서 콜라겐 필라멘트가 형성되도록 하였으며, 3D 프린팅은 3 mm/s의 속도로 조절하였고, 높이 방향으로는 100 mm/s의 속도로 적층하였다. The collagen solution was extruded through a fine nozzle in a coagulating bath using a 3D bio printer to gel the collagen filaments, and the resulting collagen filament laminate was laminated three - dimensionally. Specifically, the collagen solution was poured into a 20 ml syringe, 10-20 kPa of compressed air was injected, and the collagen solution was discharged from a 20 gauge (~ 600 μm) nozzle of the syringe, and a collagen solution The 3D printing was controlled at a speed of 3 mm / s and the height direction was 100 mm / s. The amount of ammonia in the coagulating medium was determined by the pH difference between acetic acid and ammonia water in the coagulation medium. Respectively.
이때, 압출은 겔화되는 필라멘트가 일방향을 향하도록 지그재그로 형성되도록 하였으며, 파이버들간의 간격 역시 1mm를 주었다. 그 다음 층은 90도 회전하여, 위에서 바라보았을 때 모눈눈금을 나타내게 하였다. 가로방향으로 20 mm, 세로방향으로 20 mm 되도록 적층하였으며, 적층 횟수는 2, 5, 7 및 9회로 하였다.
At this time, extrusion was performed so that filaments to be gelled were formed in a zigzag shape so as to face one direction, and the interval between the fibers was also 1 mm. The next layer was rotated 90 degrees to show the grid scale when viewed from above. 20 mm in the transverse direction and 20 mm in the longitudinal direction, and the number of laminations was 2, 5, 7, and 9, respectively.
본 발명에서 도 2는 1차 상분리 유도 후 다공성 콜라겐 지지체의 형상을 보여주는 광학현미경 이미지이다. 상기 도 2에서 콜라겐 필라멘트의 층 수는 왼쪽에서부터 각각 2, 5, 7 및 9개이다. 2 is an optical microscope image showing the shape of the porous collagen supporter after the primary phase separation. In FIG. 2, the number of collagen filaments is 2, 5, 7 and 9 from the left.
상기 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에서는 상온에서 다양한 층의 수로 이루어진 콜라겐 필라멘트를 제조할 있으며, 상온에서 이루어지는 공정의 특성상 적층 수를 임의로 조절할 수 있으며, 종래 3D 바이오플라팅 기술과는 달리 두꺼운 샘플의 제조도 용이하다.
As shown in FIG. 2, in the present invention, collagen filaments having various numbers of layers at room temperature are prepared. The number of layers can be arbitrarily controlled due to the nature of processes at room temperature. Unlike conventional 3D bioplating techniques, Is also easy to manufacture.
(3) 2차 상분리 유도(3) Secondary Phase Separation Induction
EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)와 NHS(N-hydroxysuccininmide)를 0.05 M 농도가 되도록 각각 95% 에탄올에 0.05 M이 되도록 용해시켜 EDC 용액 및 NHS 용액을 제조한 뒤, EDC 용액과 NHS 용액이 부피비로 4:1이 되도록 하여 비용매 매체를 제조하였다. EDC solution and NHS solution were prepared by dissolving EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) and NHS (N-hydroxysuccininmide) Solution and NHS solution in a volume ratio of 4: 1.
상기에서 제조된 용액에 콜라겐 필라멘트 적층체를 비용매 매체 내에 24시간 담지하였다.
The collagen filament laminate was carried in the non-solvent medium for 24 hours in the solution prepared above.
(4) 동결건조 (4) Freeze-dried
(3)의 다공성 콜라겐 지지체를 동결건조기를 이용하여 -40℃ 이항의 온도에서 24시간 동안 동결건조하였다.
The porous collagen supporter of (3) was lyophilized for 24 hours at a temperature of -40 deg. C using a freeze dryer.
본 발명에서 도 3은 실시예에 의해 제조된 다공성 콜라겐 지지체의 형상 및 콜라겐 필라멘트 표면구조를 보여주는 주사전자현미경(SEM, Scanning Electron Microscopy)이미지로, (A)는 다공성 콜라겐 지지체의 형상을, (B)는 콜라겐 필라멘트의 표면구조를 나타낸다. 3 is a scanning electron microscope (SEM) image showing the shape of the porous collagen support and the collagen filament surface structure prepared according to the embodiment, wherein (A) shows the shape of the porous collagen support, (B) ) Represents the surface structure of the collagen filament.
상기 도 3에 나타난 바와 같이, 다공성 콜라겐 지지체는 콜라겐 필라멘트가 하나의 층마다 일방향으로 형성되며, 위에서 바라보았을 때 모눈눈금 형상을 가지는 것을 확인할 수 있다. 또한, 콜라겐 필라멘트는 나노 섬유형 형상을 지니며, 나노 크기의 미세 기공이 형성되어 있는 것을 확인할 수 있다.
As shown in FIG. 3, it can be seen that the porous collagen support has a grid scale shape when viewed from above, in which the collagen filaments are formed in one direction for each layer. In addition, the collagen filament has a nanofiber-like shape, and nano-sized micropores are formed.
또한, 도 4는 실시예에 의해 제조된 다공성 콜라겐 지지체의 횡단면 형상 및 나노섬유형 콜라겐 필라멘트의 구조를 보여주는 주사전자현미경 이미지로, (A)는 다공성 콜라겐 지지체의 형상(횡단면)을, (B)는 콜라겐 필라멘트(저배율)를, (C) 콜라겐 필라멘트(고배율)를 나타낸다. FIG. 4 is a scanning electron microscope image showing the cross-sectional shape of the porous collagen support produced by the embodiment and the structure of the nanofiber-type collagen filament, wherein (A) shows the shape of the porous collagen support (cross- Shows a collagen filament (low magnification), and (C) a collagen filament (high magnification).
상기 도 4에 나타난 바와 같이, 다공성 콜라겐 지지체의 황단면을 관찰한 결과, 높이 방향으로도 콜라겐 필라멘트가 원 형상을 잘 유지하고 있는 것을 확인할 수 있으며, 또한, 콜라겐 필라멘트는 나노 섬유형 형상을 지니며, 나노 크기의 미세 기공이 형성되어 있는 것을 확인할 수 있다.
As shown in FIG. 4, the cross section of the porous collagen supporter was observed. As a result, it was confirmed that the collagen filament retained the circular shape well even in the height direction, and the collagen filament had a nanofiber shape , It can be confirmed that nano-sized micropores are formed.
실험예Experimental Example 1. 기공구조 분석 1. Pore structure analysis
실시예 1에서 제작된 다공성 콜라겐 지지체에 대하여 정렬된 기공구조를 확인하기 위하여 전계 방사 주사전자현미경(FE-SEM; JSM-6701F; JEOL Techniques, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. (FE-SEM; JSM-6701F; JEOL Techniques, Tokyo, Japan) in order to confirm the aligned pore structure for the porous collagen support prepared in Example 1. [
다공성 콜라겐 지지체의 전체 기공율(porosity)은 그 단면적과 무게로 계산되었다. The total porosity of the porous collagen support was calculated by its cross-sectional area and weight.
나노섬유 크기 및 기공의 크기는 샘플의 전계 방사 주사전자현미경의 사진을 통해 계산되었다.
The size of the nanofiber and the size of the pores were calculated by photographing the field emission scanning electron microscope of the sample.
상기 측정된 결과를 하기 표 1에 나타냈다.
The measured results are shown in Table 1 below.
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 제조된 다공성 콜라겐 지지체는 약 95% 이상의 기공율을 가지며, 직경이 약 500 ㎛인 콜라겐 필라멘트 내부에 약 40 nm 수준의 나노기공을 가지는 것을 확인할 수 있다.
As shown in Table 1, the prepared porous collagen support has a porosity of about 95% or more and has nano pores of about 40 nm in a collagen filament having a diameter of about 500 μm.
실험예Experimental Example 2. 기계적 물성 평가 2. Evaluation of mechanical properties
실시예 1에서 제작된 다공성 콜라겐 지지체에서 정렬된 기공구조를 가지는 채널의 구조상 짜임새를 평가하기 위하여 인장강도 및 압축강도를 측정하였다. The tensile strength and compressive strength of the porous collagen support prepared in Example 1 were measured in order to evaluate the structure of the channel having the aligned pore structure.
인장강도는 만능시험기 OTU-05D, Oriental TM Corp., Korea)를 이용하여 크로스헤드 스피드를 5 mm/min하여 측정를 이용하여 측정하였다. The tensile strength was measured using a universal testing machine OTU-05D, Oriental TM Corp., Korea) at a crosshead speed of 5 mm / min.
또한, 압축강도는 만능재료시험기의 크로스헤드 스피드를 1 mm/min하여 측정하였다.
In addition, the compressive strength was measured at a crosshead speed of 1 mm / min in a universal testing machine.
상기 측정된 결과를 도 5에 나타내었다. 상기 도 5에서 왼쪽 그래프는 다공성 콜라겐 지지체의 인장강도를 오른쪽 그래프는 압축강도를 나타낸다. The measured results are shown in Fig. 5, the left graph shows the tensile strength of the porous collagen support, and the right graph shows the compressive strength.
실시예 1에서 제조된 다공성 콜라겐 지지체의 최대 인장강도는 약 353 kPa 및 0.0 내지 0.1 구간(mm/mm)에서의 압축강도는 약 30 kPa 수준으로, 조직 재생에 적합한 것을 확인할 수 있다.
The maximum tensile strength of the porous collagen support prepared in Example 1 is about 30 kPa at about 353 kPa and 0.0 to 0.1 section (mm / mm), and it is confirmed that it is suitable for tissue regeneration.
실험예Experimental Example 3. 생체적합성 평가 3. Biocompatibility assessment
실시예 1에서 제작된 다공성 콜라겐 지지체의 생체적합성을 in vitro cell test를 이용하여 평가하였다. The biocompatibility of the porous collagen scaffold prepared in Example 1 was evaluated using an in vitro cell test.
구체적으로 분화 조골 세포인 MC3T3-E1 세포를 2X105 cells/ml의 밀도로 부착한 후 3시간 및 24시간 경과 후 공초점주사현미경(CLSM; fluoview fv1000; Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 세포의 부착 및 분화 양상을 평가하였다.
Specifically, MC3T3-E1 cells, which are differentiated osteoblasts, were attached at a density of 2 × 10 5 cells / ml, and after 3 hours and 24 hours, cells were cultured using a confocal scanning microscope (CLSM: fluoview fv1000; Nikon, Tokyo, Japan) Adhesion and differentiation patterns were evaluated.
상기 측정된 결과를 도 6에 나타내었다. 상기 도 6은 MC3T3-E1 세포 부착후 3 시간 및 24 시간 이후의 나타낸다. 상기 도 6에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 MC3T3-E1 세포는 다공성 콜라겐 지지체 잘 부착하여 우수한 생체적성을 보이는 것을 확인할 수 있다.
The measured results are shown in Fig. FIG. 6 shows 3 hours and 24 hours after the attachment of MC3T3-E1 cells. As shown in FIG. 6, it can be confirmed that the MC3T3-E1 cells prepared in Example 1 exhibited excellent biocompatibility due to adhesion of the porous collagen support.
Claims (15)
상기 콜라겐 용액을 응고 매체 내부로 압출하여 콜라겐 필라멘트를 겔화하고, 상기 콜라겐 필라멘트를 적층하는 단계; 및
적층된 콜라겐 필라멘트를 비용매 매체에 담지하는 단계를 포함하는 다공성 콜라겐 지지체의 제조 방법.
Preparing a collagen solution containing a collagen polymer and an acid;
Extruding the collagen solution into a coagulation medium to gellify the collagen filaments, and laminating the collagen filaments; And
A method for producing a porous collagen support comprising the steps of: (1) supporting a laminated collagen filament on a non-solvent medium;
콜라겐 용액의 pH는 3 내지 6이고, 응고 매체의 pH는 8 내지 11인 다공성 콜라겐 지지체의 제조 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the pH of the collagen solution is from 3 to 6 and the pH of the coagulation medium is from 8 to 11.
산은 아세트산, 탄산, 염산 또는 히알루론산인 다공성 콜라겐 지지체의 제조 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the acid is acetic acid, carbonic acid, hydrochloric acid or hyaluronic acid.
응고 매체는 콜라겐 고분자의 비용매 또는 비용매와 용매의 혼합물인 다공성 콜라겐 지지체의 제조 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the solidification medium is a mixture of a non-solvent or non-solvent of a collagen polymer and a solvent.
압출 및 적층은 3D 바이오프린터를 통해 수행하며, 3차원으로 적층되는 다공성 콜라겐 지지체의 제조 방법.
The method according to claim 1,
Extrusion and laminating are carried out through a 3D bio-printer and are laminated three-dimensionally.
콜라겐 필라멘트의 적층은 상기 콜라겐 필라멘트들이 일방향을 향하도록 적층하는 다공성 콜라겐 지지체의 제조 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the collagen filaments are laminated so that the collagen filaments are oriented in one direction.
일방향을 향하도록 적층된 필라멘트들은 10 내지 1000 ㎛의 간격을 가지는 다공성 콜라겐 지지체의 제조 방법.
The method according to claim 6,
Wherein the filaments laminated so as to face in one direction have an interval of 10 to 1000 占 퐉.
비용매 매체는 가교제 및 비용매의 혼합물인 다공성 콜라겐 지지체의 제조 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the non-solvent medium is a mixture of a crosslinking agent and a non-solvent.
가교제는 EDC(N-ethyl-N′-(3-(dimethylamino)propyl)carbodiimide), NHS(N-hydroxysuccinimide), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether:EGDGE), 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether:BDDE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether) 및 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 다공성 콜라겐 지지체의 제조 방법.
9. The method of claim 8,
The crosslinking agent may be EDC (N-ethyl-N '- (3- (dimethylamino) propyl) carbodiimide, N-hydroxysuccinimide, ethylene glycol diglycidyl ether (EGDGE), butanediol diglycidyl 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE), 1,6-hexanediol diglycidyl ether, propylene glycol diglycidyl ether, polypropylene glycol diglycidyl ether, Wherein the porous collagen support comprises at least one selected from the group consisting of polypropylene glycol diglycidyl ether and diglycerol polyglycidyl ether.
비용매는 에탄올 및 에틸 알코올로 이루어진 그룹으로터 선택된 하나 이상을 포함하는 다공성 콜라겐 지지체의 제조 방법.
9. The method of claim 8,
Wherein the non-solvent comprises at least one selected from the group consisting of ethanol and ethyl alcohol.
동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 다공성 콜라겐 지지체의 제조 방법.
The method according to claim 1,
≪ / RTI > further comprising the step of lyophilizing the porous collagen support.
다공성 콜라겐 지지체 중의 콜라겐 필라멘트는 나노섬유형 구조를 가지는 다공성 콜라겐 지지체의 제조 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the collagen filament in the porous collagen support has a nanofiber type structure.
평균 직경이 300 내지 1000 ㎛인 하나 이상의 콜라겐 필라멘트가 일방향으로 정렬된 구조를 가지는 다공성 콜라겐 지지체.
A process for the preparation of a compound according to any one of claims 1 to 12,
A porous collagen support having a structure in which at least one collagen filament having an average diameter of 300 to 1000 占 퐉 is aligned in one direction.
다공성 콜라겐 지지체는 콜라겐 필라멘트 내부에 형성된 10 내지 500 nm의 나노 기공 및 필라멘트들 사이에 형성된 평균 직경 200 내지 1000㎛의 매크로 기공을 가지는 다공성 콜라겐 지지체.
14. The method of claim 13,
The porous collagen support has nanopores of 10 to 500 nm formed inside the collagen filaments and macropores of an average diameter of 200 to 1000 탆 formed between the filaments.
다공성 콜라겐 지지체는 90% 이상의 기공율을 가지는 다공성 콜라겐 지지체. 14. The method of claim 13,
The porous collagen support has a porosity of 90% or more.
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