KR20160021970A - Novel Biomarker for analysing prognosis of esophageal cancer - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 식도암 예후 분석용 신규 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다.
The present invention relates to a novel biomarker for the analysis of the prognosis of esophageal cancer and its use.
식도는 인두와 위의 사이를 연결하는 관강상의 장기로서, 대부분은 흉강, 일부는 경부와 복강에 존재한다. 흉강의 상부에서는 기관과 척추의 사이에 있고, 하부에서는 심장, 대동맥과 폐에 둘러싸여 있다. 식도는 입으로부터 먹은 음식물을 위에 보내는 기능을 한다.The esophagus is a tubular organs that connect the pharynx and the stomach, mostly in the thoracic cavity, and partly in the neck and abdominal cavity. In the upper part of the thorax, it lies between the trachea and the vertebrae, and in the lower part it is surrounded by the heart, the aorta and the lungs. The esophagus functions to send food from the mouth above.
이러한 식도에 발생하는 식도암은 악성종양으로서, 식도 선암(esophageal adenocarcinoma)과 편평세포 식도암(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)이 대표적이다. 이중에서 편평세포 식도암은 가장 공격적인 악성종양 중 하나로서, 5년 생존율이 10%에 불과한 암이다(Fred T. Bosman FC, Ralph H Hruban, Neil D Theise (2009), International Agency of Reserach on Cancer). 이러한 편평세포 식도암에 대해서는 암 관련 섬유아세포(cancer-associated fibroblast; CAF)에 대한 연구가 거의 이루어지지 않은 실정이다.Esophageal adenocarcinoma and esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) are typical malignant tumors of the esophagus. As one of squamous cell esophageal cancer is the most aggressive malignancies in the double, the cancer survival rate is only 10% five years (Fred T. Bosman FC, Ralph H Hruban, Neil D Theise (2009), International Agency of Reserach on Cancer). There has been little research on cancer-associated fibroblast (CAF) for such squamous cell carcinoma.
현재 식도암 환자에 대한 가장 중요한 치료 수단은 수술이다. 그러나, 수술이 끝난 후의 항암 치료와 방사선 치료, 그리고 CT나 MRI 같은 추후 추적 검사를 정기적으로 해야 하는데, 이런 추가 시술과 검사는 매우 비싸고 환자들에게도 매우 고통스러우며, 모든 식도암 환자들이 이런 추가 치료와 검사를 계속 받을 필요는 없다.Currently, surgery is the most important treatment for esophageal cancer patients. However, after surgery, chemotherapy, radiotherapy, and follow-up such as CT or MRI should be performed regularly. These additional procedures and tests are very expensive and very painful for patients, You do not need to keep receiving.
따라서, 이런 추가 검사와 치료를 받아야 될 필요가 있는 환자들을 선별하기 위한 예후 예측 검사가 필수적이나, 현재 적절한 검사법이 없는 실정이다. 기존의 예후 예측용 키트는 주로 암세포 자체에 초점을 맞추었으나, 일반적인 통념과는 달리 암세포의 행동양상은 암세포 자체보다는 암세포를 에워싼 주변 세포와 주변 환경(암 미세 환경) 등에 의해 큰 영향을 받아 예후 예측의 정확도가 떨어지는 문제가 있다.
Therefore, prognostic predictors are essential for screening patients who need to undergo these additional tests and treatments, but currently there is no appropriate test. Although the conventional prognostic kits mainly focus on the cancer cells themselves, unlike the conventional wisdom, the behavior patterns of the cancer cells are greatly affected by the surrounding cells surrounding the cancer cells rather than the cancer cells themselves, and the surrounding environment (cancer microenvironment) There is a problem that the accuracy of prediction is inferior.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.
본 발명자들은 식도암의 예후를 신속 및 정확하게 분석할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 식도암 주변의 암 관련 섬유아세포에서 발현된 SMA(smooth muscle actin), FSP1(fibroblast-specific protein-1) 또는 PDGFRα(derived growth factor receptorα)의 발현수준과 식도암의 예후 사이에 유의적인 상관관계가 있어, 상기 마커를 통하여 식도암의 예후 판정이 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have tried to find a novel biomarker capable of quickly and accurately analyzing the prognosis of esophageal cancer. As a result, there was a significant correlation between the expression level of smooth muscle actin (SMA), fibroblast-specific protein-1 (FSP1) or PDGFRα (derived growth factor receptor) expressed in cancer- , Confirming that the prognosis of esophageal cancer can be determined through the marker, thereby completing the present invention.
따라서, 본 발명의 목적은 식도암 환자의 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a kit for analyzing the prognosis of a patient suffering from esophageal cancer.
본 발명의 다른 목적은 식도암 환자의 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.
It is another object of the present invention to provide a method for providing information necessary for the prognosis of patients with esophageal cancer.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 식도암의 병변 내 또는 주변의 암 관련 섬유아세포(cancer-associated fibroblast)에서 발현된 SMA(smooth muscle actin), FSP1(fibroblast-specific protein-1) 또는 PDGFRα(derived growth factor receptorα)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 식도암 환자의 예후 분석용 키트를 제공한다.
According to one aspect of the present invention, the present invention provides a method of treating smooth muscle actin (SMA), fibroblast-specific protein-1 (FSP1), or PDGFR? (?) Expressed in cancer-associated fibroblasts in or around a lesion of an esophagus cancer. derived growth factor receptor < RTI ID = 0.0 > a) < / RTI > or an aptamer.
본 발명자들은 식도암의 예후를 신속 및 정확하게 분석할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 식도암 주변의 암 관련 섬유아세포에서 발현된 SMA, FSP1 또는 PDGFRα의 발현수준과 식도암의 예후 사이에 유의적인 상관관계가 있어, 상기 마커를 통하여 식도암의 예후 판정이 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have tried to find a novel biomarker capable of quickly and accurately analyzing the prognosis of esophageal cancer. As a result, there was a significant correlation between the expression level of SMA, FSP1, or PDGFRa expressed in cancer-associated fibroblasts around the esophageal cancer and the prognosis of the esophagus cancer, confirming that the prognosis of the esophageal cancer can be determined through the marker .
본 명세서에서 사용된 표현, "식도암 환자의 예후 분석용 키트"는 식도암 환자의 예후 분석용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 "식도암 환자의 예후 분석용 키트"는 "식도암 환자의 예후 분석용 조성물"과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.As used herein, the expression "kit for prognosis of patients with esophageal cancer" means a kit containing a composition for prognosis of patients with esophageal cancer. Therefore, the above expression "kit for prognosis of esophageal cancer patients" can be used interchangeably or in combination with "composition for analyzing prognosis of esophageal cancer patients ".
본 발명자들은 본 발명의 마커를 사용하면, 개체로부터 채취한 시료(암 관련 섬유아세포 또는 이를 포함하는 조직 등의 생물학적 시료 등)로부터 식도암의 예후를 신속하고 정확하게 분석(예측)할 수 있음을 확인하였다.Using the marker of the present invention, the present inventors confirmed that the prognosis of esophageal cancer can be quickly and accurately analyzed (predicted) from a sample collected from an individual (a cancer-related fibroblast or a biological sample such as tissue containing the same) .
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 식도암은 편평세포 식도암이다.According to one embodiment of the present invention, the esophageal cancer is squamous cell esophageal cancer.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 예후 분석은 식도암을 수술로 절제한 환자의 재발 위험성 또는 생존 예측이다.According to one embodiment of the present invention, the prognosis analysis is a risk of recurrence or prediction of survival in a patient who has undergone surgery for esophageal cancer.
본 발명의 키트는 식도암 환자의 예후 분석용 마커의 발현수준을 측정할 수 있는 물질을 포함한다. 상기 용어, "식도암 환자의 예후 분석용 마커"는 식도암의 예후를 분석할 수 있는, 긍정적 예후를 갖는 환자에 비하여 부정적 예후를 갖는 환자에서 증가 양상을 보이는 생체 분자를 의미한다.The kit of the present invention includes a substance capable of measuring the expression level of a marker for analyzing the prognosis of a patient with esophageal cancer. The term "marker for analyzing the prognosis of patients with esophageal cancer" refers to a biomolecule capable of analyzing the prognosis of esophageal cancer, showing an increased pattern in a patient having a negative prognosis as compared to a patient having a positive prognosis.
본 발명의 목적상, 상기 마커는 암 관련 섬유아세포에서 발현된 SMA(smooth muscle actin), FSP1(fibroblast-specific protein-1) 또는 PDGFRα(derived growth factor receptorα)이다.For the purposes of the present invention, the markers are smooth muscle actin (SMA), fibroblast-specific protein-1 (FSP1) or PDGFRα (derived growth factor receptorα) expressed in cancer-associated fibroblasts.
상기 마커의 서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 개시되어 있으며, 예를 들어 SMA의 유전자 서열은 NCBI 참조 서열: NG_011541.1, 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열: NP_001135417.1 또는 NP_001604.1이고, FSP1의 유전자 서열은 NCBI 참조 서열: NG_027993.1, 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열: NP_002952.1 또는 NP_062427.1이며, PDGFRα의 유전자 서열은 NCBI 참조 서열: NG_009250.1, 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열: NP_006197.1이다.For example, the gene sequence of SMA is NCBI reference sequence: NG_011541.1, the amino acid sequence is NCBI reference sequence: NP_001135417.1 or NP_001604.1, and the sequence of the marker is disclosed in NCBI (National Center for Biotechnology Information) The gene sequence of FSP1 is NCBI reference sequence: NG_027993.1, the amino acid sequence is NCBI reference sequence: NP_002952.1 or NP_062427.1, the gene sequence of PDGFRα is NCBI reference sequence: NG_009250.1, the amino acid sequence is NCBI reference sequence: NP_006197 .
본 명세서에서 사용된 용어, "암 관련 섬유아세포(cancer-associated fibroblast; CAF)"는 암 병변의 내부 및/또는 주변에 존재하여 암 주변 환경을 구성하는 섬유아세포를 의미하며, 상기 CAF는 다양한 암의 종양 기질 내의 두드러진 세포 유형이다. 상기 CAF는 형태적 특징(방추 또는 방추 유사 모양) 또는 당업계에 알려진 CAF 마커의 검출을 통하여 구별해낼 수 있다.As used herein, the term " cancer-associated fibroblast (CAF) "refers to a fibroblast that is present in and / or around a cancerous lesion and constitutes the environment surrounding the cancer, Lt; RTI ID = 0.0 > of the < / RTI > The CAF can be distinguished by morphological features (such as spindle or spindle-like shape) or detection of CAF markers known in the art.
본 발명의 목적상 상기 CAF는 식도암의 내부 및/또는 주변에 위치하여 식도암의 미세 환경(주변 환경)을 구성하는 섬유아세포를 의미한다.For the purpose of the present invention, the CAF refers to fibroblasts located in and / or around the esophagus cancer and constituting the microenvironment (surrounding environment) of the esophagus cancer.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 면역분석 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상기 마커의 측정은 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시될 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the kit of the present invention can be carried out by an immunoassay method, that is, an antigen-antibody reaction method. In this case, the measurement of the marker may be performed using an antibody or an aptamer that specifically binds to the marker.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.As used herein, the term "antibody" refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site. For purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to the marker of the present invention, and includes both polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies.
상기한 바와 같이 새로운 식도암 예후 분석 마커가 규명되었으므로, SMA, FSP1 또는 PDGFRα(이들을 "마커 단백질 항원"이라 함)를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.Since the new esophageal cancer prognostic analysis markers have been identified as described above, the generation of antibodies using SMA, FSP1 or PDGFRa (these are referred to as "marker protein antigens") can be easily performed using techniques well known in the art .
상기 다클론 항체는 상기한 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.The polyclonal antibody can be produced by a method well known in the art for obtaining serum containing the antibody by injecting the marker protein antigen into the animal and collecting it from the animal. Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal species host, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, small dogs, and the like.
상기 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein, European Jounral of Immunology 6:511-519, 1976 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al. Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al. J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.The monoclonal antibody may be prepared by a hybridoma method (see Kohler and Milstein, European Jounal of Immunology 6: 511-519, 1976) or a phage antibody library (Clackson et al. Nature, 352: 624 -628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597, 1991).
상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.The antibody prepared by the above method can be isolated and purified by gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like. In addition, the antibodies of the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms with two full-length light chains and two full-length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen binding function, and includes Fab, F (ab ') 2, F (ab') 2 and Fv.
본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 식도암의 예후를 분석하는데 이용될 수 있다.When the method of the present invention is carried out using an antibody or an aptamer, the present invention can be carried out according to a conventional immunoassay to analyze the prognosis of esophageal cancer.
이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 방법에 따라 실시할 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 면역조직화학 염색법, 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 캡처-엘라이자, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 분석방법이 제한되는 것은 아니다.Such immunoassay can be carried out according to various quantitative or qualitative immunoassay methods developed in the past. The immunoassay format may be selected from the group consisting of immunohistochemical staining, Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), capture-ELISA, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Immunoprecipitation Assay, Complement Fixation Assay, Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS), and Protein Chip, among others, are available for immunoassay, Ouchterlony immunoassay, rocket immunoelectrophoresis, , But the analysis method of the present invention is not limited by the above examples.
상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.Methods of immunoassay or immunostaining are described in Enzyme Immunoassay, ET Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) , in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, JM ed., Humana Press, NJ, 1984; And Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, which is incorporated herein by reference.
본 발명의 키트는 상기와 같은 면역분석을 실시하는데 필요한 물질을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨쥬게이트 됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 더 포함할 수 있다.The kit of the present invention may further include a substance necessary for carrying out the above immunoassay. For example, a kit of the invention can be conjugated to a reagent capable of detecting an antibody, such as a labeled secondary antibody, chromophores, an enzyme (e. G., Conjugated to an antibody) And the like.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 상기한 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
According to one embodiment of the present invention, the kit of the present invention can be manufactured from a number of separate packages or compartments containing the above components.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 식도암 환자로부터 분리된 암 관련 섬유아세포에서 발현된 SMA, FSP1 및 PDGFRα로 구성된 군으로부터 선택된 마커의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 식도암 환자의 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a prognostic assay for esophageal cancer patients comprising the step of measuring the expression levels of markers selected from the group consisting of SMA, FSP1 and PDGFRa expressed in cancer-associated fibroblasts isolated from esophageal cancer patients To provide the necessary information to the user.
상기 방법과 상술한 키트는 동일한 마커에 관한 발명이기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략하기로 한다.Because the method and the kit described above are inventions for the same marker, the description common to both is omitted in order to avoid the excessive complexity of the present specification.
하기 실시예에서 확인한 바와 같이, 암 관련 섬유아세포에서의 SMA, FSP1 및 PDGFRα의 발현수준은 부정적 예후를 나타낸 환자에서 더 높았기 때문에, 상기 발현수준을 측정하여 식도암 환자의 예후 분석에 필요한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 측정한 마커의 발현수준을 예후를 알고 있는 환자의 측정값과 비교하거나, 혹은 후술할 방법과 같이 마커의 발현수준을 일정 기준에 따라 정량적으로 수치화한 후, 이 점수를 토대로 환자의 예후를 예측할 수 있다.Since the expression levels of SMA, FSP1 and PDGFRa in cancer-associated fibroblasts were higher in the patients who showed negative prognosis as described in the following examples, the expression levels were measured to provide information necessary for the analysis of the prognosis of esophageal cancer patients can do. For example, the level of expression of the measured marker may be compared with the value of the patient who knows the prognosis, or quantitatively the expression level of the marker may be quantitatively determined as described below, The prognosis can be predicted.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 항원-항체 반응 방식으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 상기 식도암 예후 분석용 마커에 대한 항체를 이용한 면역조직화학 염색을 통하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 암 관련 섬유아세포를 포함하는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 ㎛ 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체를 세척하고, 검출라벨로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한 후, 이의 결과를 토대로 식도암 환자의 예후를 판정한다.According to one embodiment of the present invention, the method of the present invention can be carried out by an antigen-antibody reaction method. For example, the present invention can be carried out by immunohistochemical staining using an antibody against the marker for the prognosis of esophageal cancer. For example, tissues containing cancer-associated fibroblasts are harvested and fixed, and paraffin-embedded blocks are prepared by methods well known in the art. They are made into sections of several micrometers in thickness and affixed to a glass slide, and reacted with the above-described antibodies by a known method. Thereafter, the unreacted antibody is washed, labeled with a detection label, read on the microscope for labeling the antibody, and the prognosis of the esophageal cancer patient is determined based on the result.
본 발명의 다른 변형예에 따르면, 항체 대신에 상기 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 상기 앱타머는 바람직하게는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al. Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.
According to another variant of the invention, an aptamer that specifically binds to the marker protein can be used in place of the antibody. The aptamer is preferably a peptide molecule, and the general contents of aptamers are described in Bock LC et al. Nature 355 (6360): 5646 (1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78 (8): 42630 (2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA . 95 (24): 142727 (1998).
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 식도암 환자의 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for providing information necessary for the prognosis analysis of an esophageal cancer patient, comprising the steps of:
(a) 식도암 환자로부터 분리된 암 관련 섬유아세포가 포함된 조직시료에 대하여 SMA, FSP1 및 PDGFRα로 구성된 군으로부터 선택된 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 사용하여 면역조직화학 염색을 실시하는 단계;(a) immunohistochemical staining is performed using an antibody or aptamer that specifically binds to a marker selected from the group consisting of SMA, FSP1, and PDGFRa for tissue samples containing cancer-associated fibroblasts isolated from esophageal cancer patients step;
(b) 단계 (a)의 결과물에 대하여 염색의 강도, 염색의 범위 또는 이들의 조합을 토대로 상기 조직시료가 상기 마커에 대하여 양성 또는 음성인지 여부를 결정하는 단계; 및(b) determining whether the tissue sample is positive or negative for the marker based on the intensity of the staining, the range of staining, or a combination thereof against the result of step (a); And
(c) 단계 (b)의 결정 결과를 토대로, 상기 조직시료가 상기 마커에 대하여 양성이면, 상기 환자가 부정적 예후를 나타낼 것으로 판정하는 단계.(c) determining, based on the determination result of step (b), that the patient will exhibit a negative prognosis if the tissue sample is positive for the marker.
이하, 본 방법에 대하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the method will be described in detail.
단계 (a)에서는 식도암 환자로부터 채취한 암 관련 섬유아세포가 포함된 조직시료를 대상으로 당업계에 알려진 면역조직화학 염색방법을 사용하여 SMA, FSP1 및 PDGFRα로 구성된 군으로부터 선택된 마커를 염색한다. 이러한 면역조직화학 염색법은 당업자에게 잘 알려져 있는 기술이다.In step (a), tissue samples containing cancer-associated fibroblasts collected from esophageal cancer patients are stained with markers selected from the group consisting of SMA, FSP1 and PDGFRa using immunohistochemical staining methods known in the art. Such immunohistochemical staining is a technique well known to those skilled in the art.
단계 (b)에서는 이러한 면역조직화학 염색 결과를 토대로 염색의 강도 및/또는 염색의 범위를 고려하여 분석대상 조직시료가 상기 마커에 대하여 양성 또는 음성인지 여부를 결정한다. 이러한 양성/음성의 판단은 분석자(예컨대, 임상병리학자)가 직접 실시할 수도 있으며, 이러한 판단이 가능하도록 프로그램 된 컴퓨터 시스템을 사용하여 자동적으로 실시할 수도 있다.In step (b), the intensity of the staining and / or the range of staining are considered based on the result of immunohistochemical staining to determine whether the tissue sample to be analyzed is positive or negative for the marker. Such positive / negative judgment may be performed directly by an analyst (for example, a clinicopathologist), or may be automatically performed using a computer system programmed to enable such judgment.
이러한 양성/음성의 판단의 기준은 예를 들어, 하기 표 1에 나타난 기준과 같이, 염색의 강도를 일정 기준(예컨대, 상, 중, 하)으로 구분하고, 염색의 범위 역시 일정 수치범위별로 세분한 다음, 상기 염색의 강도와 염색의 범위 기준의 각 조합에 적절한 수치를 배정한 다음, 분석대상 시료의 면역염색 결과를 상기 기준에 대입하여 수치화된 결과를 얻는다. 이후, 얻은 수치화 결과를 미리 결정된 양성/음성 판정 기준(예컨대, 2점 이상이면 양성으로 판정)과 비교하여 분석대상 시료가 마커에 대하여 양성인지, 아니면 음성인지 여부를 결정한다.The criterion for judging positive / negative is that, for example, the intensity of the dyeing is divided into a certain standard (for example, upper, middle, lower) as shown in the following Table 1, and the range of dyeing is also subdivided Then, appropriate values are assigned to each combination of the intensity of the staining and the range of the staining range, and the result of immuno staining of the sample to be analyzed is substituted into the standard to obtain a numerical result. Thereafter, the obtained quantification result is compared with a predetermined positive / negative judgment criterion (for example, judged as positive if two or more), and it is determined whether the analysis subject sample is positive or negative for the marker.
이후, 판정결과를 토대로 단계 (c)에서는 분석대상 식도암 환자의 예후를 판정하게 되는데, 분석대상 조직시료가 하나 이상의 마커에 대하여 양성이면, 부정적 예후를 나타낼 것으로 판정한다. 이러한 판정 결과를 토대로, 부정적 예후가 예상되는 환자에게는 항암 치료와 방사선 치료 등의 보조치료를 실시할 수 있다.
Thereafter, in step (c), the prognosis of the subject to be analyzed is determined based on the determination result. If the tissue sample to be analyzed is positive for one or more markers, it is determined that the prognosis is negative. Based on these results, patients with negative prognosis may be treated with adjuvant therapy such as chemotherapy and radiotherapy.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(ⅰ) 본 발명은 식도암 예후 분석에 대한 신규한 바이오마커를 제공한다.(I) The present invention provides a novel biomarker for the analysis of esophageal cancer prognosis.
(ⅱ) 본 발명은 암 관련 섬유아세포에서 발현된 SMA, FSP1 및 PDGFRα의 발현이 긍정적 예후를 갖는 환자에 비하여 부정적 예후를 갖는 환자에서 증가 양상을 보인다는 연구결과에 기초한다. 따라서, 본 발명의 마커를 이용하면 신속 및 정확하게 식도암의 예후 분석이 가능하다.
(Ii) The present invention is based on the finding that the expression of SMA, FSP1 and PDGFRa expressed in cancer-associated fibroblasts increases in patients with a negative prognosis as compared to patients with a positive prognosis. Therefore, the use of the marker of the present invention makes it possible to quickly and accurately analyze the prognosis of esophageal cancer.
도 1은 암 관련 섬유아세포를 SMA, FSP-1, FAP, PDGFRα 및 PDGFRβ에 대하여 면역조직화학 염색한 결과를 보여준다.
도 2a 내지 2c는 암 관련 섬유아세포에서 발현된 각 마커의 발현수준에 대하여 로그 순위 검정에 의한 카플란-마이어법을 사용하여 도출한 전체 생존곡선과 무병생존 곡선을 보여준다.Figure 1 shows immunohistochemical staining of cancer-associated fibroblasts against SMA, FSP-1, FAP, PDGFR [alpha] and PDGFR [beta].
Figures 2a to 2c show the overall survival curves and disease free survival curves derived using Kaplan-Meier method by log rank test for expression levels of each marker expressed in cancer-associated fibroblasts.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
실시예Example
실험재료 및 실험방법Materials and Experiments
조직시료Tissue sample
삼성서울병원(서울, 한국)에서 1995년부터 2008년까지 원발성 ESCC(Esophageal Squamous Cell Carcinoma) 치료를 위하여 수술절제(curative surgical resection)를 받은 환자로부터 총 116개의 포르말린으로 고정되고 파라핀 포매된 종양 샘플을 얻었다. 본 후향적 연구(retrospective study)는 삼성서울병원의 IRB(institutional review board)의 승인을 받았으며, 1996년 헬싱키 선언에 따라 수행되었다. 모든 환자는 수술 전에 화학요법 또는 방사선 치료를 받지 않았다. 수술 후 보조치료는 환자의 86.2%에서 실시되었다(100/116): 31명의 환자는 화학요법과 방사선 치료를 받았고, 51명의 환자는 오직 화학요법만 받았으며, 18명의 환자는 오직 방사선 치료만 받았다. 나이, 성별, 종양 크기, 조직학적 등급, 침윤도(invasion depth, pT), 결절 상태(nodal status, pN) 및 원위부 전이(distant metastasis, pM)에 대하여 임상병리학 보고서를 검토하였다. 평균 경과관찰 기간(median follow-up period)은 30개월이었다(0 내지 108개월). pTNM 분류는 AJCC(American Joint Committee on Cancer staging) 7th 판에 따라 실시하였다.
A total of 116 formalin-fixed, paraffin-embedded tumor samples were obtained from patients undergoing curative surgical resection for primary ESCC (Esophageal Squamous Cell Carcinoma) treatment from 1995 to 2008 at Samsung Medical Center (Seoul, Korea) . This retrospective study was approved by the institutional review board (IRB) of the Samsung Seoul Hospital and was conducted in accordance with the Helsinki Declaration in 1996. All patients were not given chemotherapy or radiotherapy prior to surgery. Postoperative adjuvant therapy was performed in 86.2% of patients (100/116): 31 patients received chemotherapy and radiotherapy, 51 patients received only chemotherapy, and 18 patients received only radiation therapy. Clinical pathology reports were reviewed for age, sex, tumor size, histologic grade, invasion depth (pT), nodal status (pN) and distant metastasis (pM). The median follow-up period was 30 months (0-108 months). pTNM classification was carried out according to the AJCC (American Joint Committee on Cancer staging) 7 th edition.
조직 마이크로어레이(Tissue microarray, TMA)Tissue microarray (TMA)
조직학적 진단과 면역염색의 대표 영역을 선택하기 위하여 H&E(Hematoxylin and eosin) 염색된 조직을 조사하였다. 하나 또는 두 개의 원통형 코어(직경 2 mm)를 H&E 슬라이드에 상응하는 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 조직 블록에서 제거하여 조직 마이크로어레이를 구축하였다. 종양 요소(20-50%) 및 기질(stromal) 요소(50-80%) 모두를 포함하는 코어를 선별하였다. 선별 편향을 최소화하기 위하여, CAF와 기질 세포들이 꽉 들어차 있는 최소 하나 이상의 CAF의 핫 스팟(hot spot)을 포함하는 조직 코어를 선택하였다. 조직 어레이 완료 후에 마이크로어레이 블록을 4 mm 두께로 절편화하였다.
H & E (Hematoxylin and eosin) stained tissues were examined to select representative areas of histological diagnosis and immunohistochemistry. A tissue microarray was constructed by removing one or two cylindrical cores (2 mm in diameter) from the formalin-fixed, paraffin-embedded tissue block corresponding to the H & E slides. Cores were selected that contained both tumor elements (20-50%) and stromal elements (50-80%). To minimize the selection bias, tissue cores were selected that contained hot spots of at least one or more CAFs filled with CAF and stromal cells. After completion of the tissue array, the microarray blocks were sectioned to a thickness of 4 mm.
면역조직화학 염색Immunohistochemical staining
마이크로 슬라이드 위의 절편을 자일렌으로 탈파라핀하고, 희석된 알코올(alcohol series)을 사용하여 수화시킨 다음, 메탄올에 용해된 0.3% H2O2에 담가 내생의 페록시다아제 활성을 억제시켰다. 98℃에서 절편에 TE 버퍼(10 mM Tris 및 1 mM EDTA, pH 9.3)를 30분간 처리하였다. 비-특이적 염색을 줄이기 위하여, 각 절편에 0.1% 트윈 20이 함유된 PBS에 용해된 4% 소혈청 알부민을 30분간 처리하였다. 이후, 절편을 항-SMA(1:100, Millipore, Billerica, MA, USA), 항-FAP(1:100, Abcam), 항-FSP1(1:100, Millipore), 항-PDGFRα(1:100, Cell Signaling Technology), 항-PDGFRβ(1:100, Abcam), 항-CD34(1:100, Dako, Glostrup, Denmark) 및 항-CD68(1:1000, Dako)과 함께 상온에서 60분간 인큐베이션 한 다음, 버퍼로 세 번 연속 세척하였다. 상기 항체는 3 mg/㎖ 염소 글로불린이 함유된 PBST에 용해시킨 후 사용하였다. 이후, 절편들을 항-마우스/토끼 항체(Envision plus, Dako)와 함께 상온에서 30분간 인큐베이션 하였다. 3,3′-diaminobenzidine(Dako)을 발색제로 사용하였다. 절편들을 Meyer's 헤마톡시린으로 대비염색 하였다. 1차 항체를 사용하지 않은 것을 면역염색의 음성 대조군으로 사용하였다.
The sections on the micro-slides were deparaffinized with xylene, hydrated using a diluted alcohol series, and then immersed in 0.3% H 2 O 2 dissolved in methanol to inhibit the peroxidase activity of the endogenous. The sections were treated with TE buffer (10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.3) for 30 minutes at 98 ° C. To reduce non-specific staining, each section was treated with 4% bovine serum albumin dissolved in PBS containing 0.1
면역조직화학 분석 및 평가Immunohistochemical analysis and evaluation
두 명의 병리학자가 임상병리학적 결과(예후)에 대한 사전지식 없이 면역조직화학 결과를 평가하고, 점수가 일치하지 않을 시에는 일치할 때까지 논의를 진행하였다. 다음과 같이, 두 명의 임상병리학자가 임상병리학적 결과에 대한 사전지식 없이 염색 강도와 양성 기질 세포의 비율에 따라 SMA, FAP, FSP1, PDGFRα 및 PDGFRㅯ에 대한 면역조직화학적 점수를 평가하였다: 1점, 기질 세포의 <50%의 약한 염색 또는 <20% 중간 염색; 2점, ≥50%의 약한 염색, 20-50%의 중간 염색 또는 <20%의 강한 염색; 3점, ≥50%의 중간 염색 또는 ≥20%의 강한 염색(표 1 및 도 1). 2점 혹은 3점을 받은 경우를 각 단백질 발현에 대한 양성으로 판단하였다.Two pathologists evaluated the immunohistochemical results without prior knowledge of the clinical pathology (prognosis), and continued to discuss the results if the scores were not consistent. Two clinicopathologists evaluated the immunohistochemical scores for SMA, FAP, FSP1, PDGFRα and PDGFR ㅯ according to the intensity of staining and the proportion of benign stromal cells without prior knowledge of clinicopathologic results: , <50% weak staining or <20% intermediate staining of stromal cells; 2 points, weak staining of ≥50%, intermediate staining of 20-50% or strong staining of <20% 3 points, intermediate staining ≥50% or strong staining ≥20% (Table 1 and Fig. 1). Two or three points were judged positive for each protein expression.
통계 분석Statistical analysis
Pearson's chi-square 테스트 또는 Fisher's exact 테스트를 사용하여 상관관계를 조사하였다. 전체 생존율(OS)과 무병생존율(DFS)을 Kaplan-Meier 법을 사용하여 측정하고, 로그순위 검정(log-rank test)으로 비교하였다. 생존율은 수술일부터 측정하였다. 콕스 비례 위험 모델(Cox proportional hazards model)을 다변량 분석을 위하여 이용하였다. 일변량 분석에서 통계적으로 유의성이 있는 임상병리학적 요인을 공변수(covariable)로 다변량 분석에 포함시켰다. 위험 비율(Hazard ratio) 및 95% 신뢰구간(confidence intervals, CI)을 각 요인에 대하여 평가하였다. 모든 테스트는 두 번 실시하였으며, P≤0.05를 유의성 있는 것으로 고려하였다. 이러한 통계 분석은 SPSS 통계 분석 소프트웨어(SPSS Inc, Chicago, IL, USA)를 사용하여 실시하였다.
Correlations were examined using Pearson's chi-square test or Fisher's exact test. Overall survival (OS) and disease free survival (DFS) were measured using the Kaplan-Meier method and compared using a log-rank test. Survival rate was measured from the day of surgery. The Cox proportional hazards model was used for multivariate analysis. Statistically significant clinicopathologic factors in the univariate analysis were included in the multivariate analysis as covariable. Hazard ratios and 95% confidence intervals (CI) were evaluated for each factor. All tests were performed twice and P? 0.05 was considered significant. Statistical analysis was performed using SPSS statistical software (SPSS Inc, Chicago, IL, USA).
실험결과Experiment result
기질 섬유아세포에서의 CAF 마커의 발현은 ESCC에서 빈번하며, SMA 및 FSP1은 부정적 임상결과와 강한 연관성이 있다.Expression of CAF markers in matrix fibroblasts is frequent in ESCC, and SMA and FSP1 are strongly associated with negative clinical outcomes.
본 발명자들은 FSP1, FAP, PDGFRα 및 PDGFRㅯ에 대한 항체를 검증한 다음 IHC를 실시하였다. SMA, FSP1, FAP, PDGFRα 및 PDGFRㅯ는 각각 ESCC 환자의 기질 섬유아세포의 82.8%, 72.4%, 61.2%, 88.8% 및 54.3%에서 발현되었다(도 1). 암 기질 섬유아세포에서 SMA의 발현은 4 cm 이상의 종양 사이즈(p<0.001), advanced T stage(p<0.001) 및 N stage(p<0.001)에서 더 빈번히 관찰되었으나, 잘 분화된 종양에서는 덜 빈번히 관찰되었다(p<0.001). 또한, 이것은 EMT 표현형과도 연관성이 있었다(p=0.005). FSP1의 발현은 나이 많은 환자(≥65세)에서 더 빈번히 확인되었다(p=0.037). PDGFRβ의 발현은 분화가 저조한 종양과 관련성이 있었다(p=0.010). 그러나, FAP 및 PDGFRα와 임상병리학적 파라미터 사이의 유의성 있는 관련성은 없었다.The present inventors verified antibodies against FSP1, FAP, PDGFR [alpha] and PDGFR [gamma] and then performed IHC. SMA, FSP1, FAP, PDGFRα and PDGFR ㅯ were expressed in 82.8%, 72.4%, 61.2%, 88.8% and 54.3% of the fibroblasts of ESCC patients, respectively (Fig. SMA expression was more frequently observed in cancerous fibroblasts than in tumor size (p <0.001), advanced T stage (p <0.001) and N stage (p <0.001), but not in well differentiated tumors (P <0.001). This was also associated with the EMT phenotype (p = 0.005). Expression of FSP1 was more frequently identified in older patients (≥65 years) (p = 0.037). Expression of PDGFRβ was associated with poorly differentiated tumors (p = 0.010). However, there was no significant association between FAP and PDGFRα and clinicopathologic parameters.
5개의 CAF 마커의 발현 패턴에 따른 카플란 마이어(Kaplan Meier) 생존 곡선을 도 2에 나타내었다. SMA 및 FSP1의 발현은 짧은 전체 생존율(OS) 및 무병생존율(DFS)과 유의성 있는 상관성을 보여주었다. 특히, 기질 SMA-양성 그룹의 5년 OS 및 DFS(각 41% 및 34%)는 SMA-음성 그룹(각 88% 및 75%) 보다 유의성 있게 낮았다(OS: p=0.005; DFS: p=0.004). 기질 FSP1-양성 그룹의 5년 OS 및 DFS(각 39% 및 35%)는 FSP1-음성 그룹(각 79% 및 58%) 보다 유의성 있게 낮았다(OS: p=0.002; DFS: p=0.044). 또한, 기질 PDGFRα-양성 그룹의 5년 OS(43%)는 PDGFRα-음성 그룹(100%) 보다 유의성 있게 낮았다(p=0.003). FAP 발현을 보인 환자는 낮은 5년 전체 생존율을 보였으나(41% vs 63%), 통계적 유의성은 인정되지 않았다(p=0.070). 또한, PDGFRβ 발현과 OS 및 DFS 사이에는 유의성 있는 연관성이 인정되지 않았다. 다변량 분석에서, FSP1 발현은 OS(HR: 4.86 (95% CI: 1.90-12.40), p=0.001) 및 DFS(HR: 2.77 (95% CI: 1.37-5.51), p=0.004)에 대한 독립적 예후인자(prognostic factor)였다.
The Kaplan Meier survival curve according to the expression pattern of five CAF markers is shown in FIG. Expression of SMA and FSP1 showed a significant correlation with short overall survival (OS) and disease free survival (DFS). In particular, the 5-year OS and DFS (41% and 34%, respectively) of the substrate SMA-positive group were significantly lower than those of the SMA-negative group (88% and 75% for each) (OS: p = 0.005; DFS: p = 0.004 ). The 5-year OS and DFS (39% and 35%, respectively) of the substrate FSP1-positive group were significantly lower than those of the FSP1-negative group (79% and 58%, respectively) (OS: p = 0.002; DFS: p = 0.044). In addition, the five-year OS (43%) of the substrate PDGFRα-positive group was significantly lower than the PDGFRα-negative group (100%) (p = 0.003). Patients with FAP showed a low 5-year overall survival rate (41% vs. 63%), but no statistical significance was observed (p = 0.070). There was also no significant association between PDGFRβ expression and OS and DFS. In multivariate analysis, FSP1 expression was independent prognostic for OS (HR: 4.86 (95% CI: 1.90-12.40), p = 0.001) and DFS (HR: 2.77 (95% CI: 1.37-5.51) Prognostic factor.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (8)
Specific binding to SMA (smooth muscle actin), FSP1 (fibroblast-specific protein-1), or PDGFRa (derived growth factor receptor alpha) expressed in cancer-associated fibroblast in or around the lesion of esophagus cancer A kit for analyzing the prognosis of an esophageal cancer patient comprising an antibody or an aptamer.
The kit according to claim 1, wherein the esophageal cancer is squamous cell esophageal cancer.
The kit according to claim 1, wherein the prognosis analysis is a risk of recurrence or prediction of survival in a patient who has undergone surgery for esophageal cancer.
Expression of markers selected from the group consisting of smooth muscle actin (SMA), fibroblast-specific protein-1 (FSP1) and PDGFRα (derived growth factor receptorα) expressed in cancer-associated fibroblasts isolated from esophageal cancer patients Wherein the method comprises the step of measuring the level of the cancer of the esophagus.
(a) 식도암 환자로부터 분리된 암 관련 섬유아세포(cancer-associated fibroblast)가 포함된 조직시료에 대하여 SMA(smooth muscle actin), FSP1(fibroblast-specific protein-1) 및 PDGFRα(derived growth factor receptorα)로 구성된 군으로부터 선택된 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 면역조직화학 염색을 실시하는 단계;
(b) 단계 (a)의 결과물에 대하여 염색의 강도, 염색의 범위 또는 이들의 조합을 토대로 상기 조직시료가 상기 마커에 대하여 양성 또는 음성인지 여부를 결정하는 단계; 및
(c) 단계 (b)의 결정 결과를 토대로, 상기 조직시료가 상기 마커에 대하여 양성이면, 상기 환자가 부정적 예후를 나타낼 것으로 판정하는 단계.
A method for providing information necessary for analyzing a prognosis of an esophageal cancer patient comprising the steps of:
(a) smooth muscle actin (SMA), fibroblast-specific protein-1 (FSP1) and PDGFRα (derived growth factor receptorα) for tissue samples containing cancer-associated fibroblasts isolated from esophageal cancer patients Performing immunohistochemical staining using an antibody that specifically binds to a marker selected from the group consisting of;
(b) determining whether the tissue sample is positive or negative for the marker based on the intensity of the staining, the range of staining, or a combination thereof against the result of step (a); And
(c) determining, based on the determination result of step (b), that the patient will exhibit a negative prognosis if the tissue sample is positive for the marker.
6. The method according to claim 4 or 5, wherein the esophageal cancer is squamous cell esophageal cancer.
[Claim 5] The method according to claim 4 or 5, wherein the prognosis analysis is a risk of recurrence or prediction of survival of a patient who has undergone surgery for esophageal cancer.
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|---|---|---|---|---|
| CN109541209A (en) * | 2018-09-26 | 2019-03-29 | 汕头大学医学院 | Esophageal squamous cell carcinoma microenvironment cell sign object molecular model and its application |
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| KR20080007659A (en) | 2005-05-02 | 2008-01-22 | 도레이 가부시끼가이샤 | Composition and method for diagnosing esophageal cancer and metastasis of esophageal cancer |
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| E902 | Notification of reason for refusal | ||
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