KR20160015076A

KR20160015076A - c-Met 저해제의 효능 예측을 위한 바이오마커 Hsp90

Info

Publication number: KR20160015076A
Application number: KR1020140097560A
Authority: KR
Inventors: 이지민; 김보규; 오승자; 김경아; 이샛별; 황재웅
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2014-07-30
Filing date: 2014-07-30
Publication date: 2016-02-12
Also published as: US9956244B2; US20160030559A1

Abstract

c-Met 저해제의 효능 예측을 위한 바이오마커 Hsp90, Hsp90의 검출 물질을 포함하는 c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별을 위한 조성물, Hsp90의 검출 물질을 포함하는 c-Met 저해제의 효능 검정을 위한 조성물, Hsp90 저해제를 포함하는 c-Met 저해제에 대한 저항성 저감용 조성물, 및 c-Met 저해제 및 Hsp90 저해제를 포함하는 병용 투여용 조성물이 제공된다.

Description

c-Met 저해제의 효능 예측을 위한 바이오마커 Hsp90{Biomarker Hsp90 for predicting effect of a c-Met inhibitor}

바이오마커(Biomarker)란 외부적인 영향으로 인해 생명체 내부에서 유발된 변화를 알아낼 수 있는 지표를 의미하며, 암, 뇌졸중, 치매 등 각종 질병을 진단하거나 특정 치료제의 효능을 예측하거나 모니터링하기 위한 용도로 연구가 활발해 지고 있다. 약물 개발과 관련한 바이오마커로는 약물의 생체 내 작용여부를 확인하기 위한 효능 검정 마커 (Pharmacodynamic marker; PD 마커), 생체 내 투여이전에 약물의 반응성을 미리 예측하여 투여할 수 있는 효능 예측 마커(Predictive marker) 등이 있다. 이러한 marker의 활용은 약물의 임상전략을 수립하는데 도움이 되는데, 가령 약물의 작용을 통해 효능이 예상되는 효능 예측 마커의 경우에는 환자 선별 과정에 활용하여 보다 효과적인 약물 치료가 가능하게 하며, 효능 검증 마커의 경우에는 약물이 개별 환자에서 잘 작용하고 있는지 여부 및/또는 저항성 획득 여부 등을 모니터링하여 보다 효과적인 치료 전략을 수립할 수 있도록 한다. 또한, 효능 예측 마커가 없는 경우라도, 효능 검정 마커가 존재한다면 약물 치료에 있어서 개별 환자의 약물에 대한 반응을 좀 더 초기에 모니터링 가능하기 때문에, 약물의 효능이 나타나는 군과 그렇지 않은 군의 조기 선별을 가능하게 하여, 결론적으로 보다 효과적이고 성공적인 약물 치료가 가능하게 한다. 또한, 효과 검증 마커는 투여농도에 따른 약물 반응성 정도를 모니터링 하여 약물의 적정 투여량 산정의 지표로도 이용 가능하다.

한편, 암은 현재까지 주요 사망원인중의 하나이다. 의료기술의 발달로 암의 치료 기술에 눈에 뛰는 변화가 오고 있지만, 5년 생존률 수치는 지난 20년 동안 10%정도 향상에 그쳤을 뿐이다. 이는 암의 급속한 성장, 전이 등의 특성으로 적정시기의 진단과 치료가 어렵기 때문이라고 할 수 있다. 적절한 바이오마커를 암 치료에 도입함으로써, 암의 특성을 파악하여 적절한 치료제를 적기에 사용할 수 있는 기회를 증대시켜 암 치료의 성공률을 크게 높일 수 있다. 가령, 동일한 폐암 환자라도 폐암 분류별, 유전자별, 분비하는 단백질별 특성이 상이하고 이에 따른 적합한 치료제도 상이하다. 따라서 특정 치료제를 사용하는 화학요법에 있어서, 상기 치료제에 상응하는 바이오마커가 존재한다면, 시행착오를 줄이고 성공 확률을 보다 높일 수 있다. 이러한 취지로 항암 치료제의 효능 예측 또는 검정을 위한 바이오마커 탐색이 매우 중요하며, 적합한 바이오마커가 성공적으로 도출된다면, 항암제의 효용과 가치 및 이를 사용하는 치료의 성공률을 크게 상승시킬 수 있을 것이다.

한편, c-Met은 간세포 성장 인자 (hepatocyte growth factor, HGF)의 수용체이며, HGF는 c-Met 수용체 티로신 키나제의 세포외 부위에 결합하여 다양한 정상세포와 종 양세포에서 분열, 운동, 형태발생, 혈관형성을 유발하는 사이토카인의 일종이다. c-Met은 세포 표면에 존재하는 대표적인 수용체 티로신 키나제(receptor tyrosine kinase)로, 그 자체가 암유발 유전자이며, 때로는 리간드인 HGF와 상관 없이도 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침습, 신생혈관 생성 등과 같은 종양과 관련된 여러 가지 기작에 관여하기 때문에 최근 항암 치료의 타겟으로 주목받는 단백질이며, c-Met의 작용을 저해하는 항체 등의 표적 치료제의 개발이 진행되고 있다.

이와 같이 개발된 c-Met 표적 치료제를 이용한 치료의 효능을 보다 증진시키고 성공 가능성을 높이기 위하여, 상기 치료제의 효능을 예측 또는 검정하여 상기 치료제의 적용이 적합한 환자의 선별하고 치료제 투여후의 반응성을 모니터링하여 보다 효과적인 치료 전략을 수립하는데 적용 가능한 바이오마커의 개발이 요구된다.

일 예는 Hsp90 단백질 및 이들을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별을 위한 바이오마커를 제공한다.

다른 예는 Hsp90 및 이들을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, c-Met 저해제의 효능 검정을 위한 바이오마커를 제공한다.

다른 예는 Hsp90 및 이들을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 포함하는 c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별을 위한 조성물 및 키트를 제공한다.

다른 예는 Hsp90 및 이들을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질, 및/또는 변이된 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 포함하는 c-Met 저해제의 효능 검정을 위한 조성물 및 키트를 제공한다.

다른 예는 생물 시료 내의 Hsp90 및 이들을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 존재 여부 및/또는 수준을 측정하는 단계를 포함하는, c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별 방법, 또는 c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

다른 예는 생물 시료 내의 Hsp90 및 이들을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 존재 여부 및/또는 수준을 측정하는 단계를 포함하는 c-Met 저해제의 효능 검정 방법 또는 c-Met 저해제의 효능 검정을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

다른 예는 Hsp90 저해제를 포함하는 c-Met 저해제에 대한 저항성 저감용 조성물을 제공한다. 다른 예는 Hsp90 저해제를 포함하는 c-Met 저해제에 대한 저항성을 갖는 암의 치료용 조성물을 제공한다.

다른 예는 Hsp90 저해제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 c-Met 저해제에 대한 저항성 저감 방법을 제공한다. 다른 예는 Hsp90 저해제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 c-Met 저해제에 대한 저항성을 갖는 암의 치료 방법을 제공한다.

다른 예는 상기 선별된 c-Met 저해제 및 Hsp90 저해제를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물을 제공한다.

Hsp90 및 이들을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 c-Met 저해제의 효능을 미리 예측하거나 및/또는 투여된 c-Met 저해제로 인한 저항성 유발 여부를 모니터링하기 위한 용도가 제공된다.

본 명세서에서, 상기 c-Met 저해제는 c-Met을 표적으로 하는 c-Met 관련 질병의 예컨대 암의 예방, 개선, 경감, 및/또는 치료 효과를 갖는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 상기 c-Met 저해제의 효능은 c-Met 저해제의 c-Met 관련 질병, 예컨대 암의 예방, 개선, 경감, 및/또는 치료 효과를 의미하는 것으로, 암의 경우, 암세포 또는 암조직의 감소, 암세포 또는 암조직의 사멸, 암전이와 관련된 암세포의 이동 및/또는 침투의 억제 등의 효과를 의미한다.

Hsp90 (heat shock protein 90)은 샤페론 단백질(chaperone protein)의 일종으로, 종양 성장에 필요한 단백질을 안정화시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있지만, 현재까지 c-Met 단백질과의 관계는 보고된 바 없다.

본 발명의 일 예에서는 Hsp90의 발현 수준 및/또는 변이 여부 및/또는 기능이상 여부에 따라서 c-Met 저해제에 대한 반응성이 달라지고, c-Met 저해제 처리 후의 c-Met 저해제에 대한 저항성 획득 여부에 따라서 Hsp90의 발현 수준 차이 및/또는 변이 여부 및/또는 기능 이상 여부가 달라짐을 밝혔다. 보다 구체적으로, 생물 시료의 Hsp90 또는 이를 암호화하는 유전자의 수준이 낮은 경우, 상기 생물 시료 또는 상기 생물 시료가 유래하는 환자에 c-Met 저해제, 예컨대 항 c-Met 항체를 적용시 그 효능이 잘 발휘됨을 확인할 수 있다. 또한, c-Met 저해제, 예컨대 항 c-Met 항체에 대하여 저항성이 내재적으로 존재하거나(innate resistance), 상기 저해제의 반복된 처리에 의하여 유도된 경우(acquired resistance), Hsp90 또는 이를 암호화하는 유전자의 수준이 높거나, 상기 저해제 처리에 의하여 증가하는 것을 확인할 수 있다. 다른 예에서, Hsp90 또는 이를 암호화하는 유전자에 변이 (예컨대, A577N, A577D, C598A, 등)가 존재하거나 및/또는 Hsp90의 기능 이상 (예컨대 Hsp90 ATPase 기능 이상)이 발생하는 경우, 이러한 변이 및/또는 기능 이상이 존재하지 않는 경우와 비교하여, c-Met 저해제, 예컨대 항 c-Met 항체가 효능을 잘 발휘하거나, c-Met 저해제, 예컨대 항 c-Met 항체에 대한 저항성이 없거나 낮음을 확인하였다.

즉, Hsp90의 발현 수준 및/또는 변이 여부 및/또는 기능 이상 여부를 측정함으로써 c-Met 저해제의 효능을 예측하여 c-Met 저해제를 적용하기에 적합한 대상을 선별하거나, c-Met 저해제 처리 여부 또는 처리 전후에 따른 Hsp90의 발현 수준 및/또는 변이 여부 및/또는 기능 이상 여부의 변화를 측정함으로써 c-Met 저해제에 대한 저항성 획득 여부 및/또는 상기 저해제의 효능을 모니터링하여 c-Met 저해제의 계속적인 적용 여부를 결정하는데 유용하게 사용될 수 있다. 이를 기초로, Hsp90의 c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 효능 검정용 바이오마커로서의 유용성을 최초로 제안한다.

본 발명에서는, c-Met 저해제가 Hsp90와 c-Met 단백질의 결합 분리하여 항암 효능 등의 c-Met 관련 질병 치료 효능을 발휘함을 확인하였으며, Hsp90의 수준이 높은 경우, c-Met 저해제가 기능하지 못함을 밝힘으로써, Hsp90의 c-Met 저해제의 효능 예측 마커로서의 유용성을 확인하였다. 또한, c-Met 저해제에 장기 노출되어 이에 대한 저항성이 유도되는 경우, Hsp90의 수준이 증가 (양적 증가), 및/또는 아미노산 서열의 변이, 및/또는 기능 이상이 발생함을 확인하였다. 이로 인하여, c-Met 저해제 적용 전에 Hsp90의 양 및/또는 아미노산 서열 변이 여부, 및/또는 기능 이상 여부를 미리 측정하여 c-Met 저해제에 대하여 선천적 저항성(innate resistance)이 있는 경우를 선별해낼 수 있으며, c-Met 저해제 적용 후에는 Hsp90의 양을 측정하여 c-Met 저해제 적용 전후의 양적 증가 여부를 확인하거나, Hsp90의 아미노산 서열 변이 여부 및/또는 Hsp90 기능 이상 여부를 확인하여 c-Met 저해제 처리에 따른 저항성 획득 (유도) 여부를 모니터링 할 수 있다. 또한, c-Met 저해제에 대하여 저항성을 가지는 원인이 Hsp90의 양적 증가일 경우, Hsp90의 양을 감소시키거나 기능을 억제하는 약물과 c-Met 저해제를 병용 투여함으로써, c-Met 저해제에 대한 저항성 (선천적 저항성 및/또는 획득 저항성)을 극복할 수 있음을 확인하였다.

상기 Hsp90(heat shock protein 90)은 단백질 (client proteins)의 적절한 접힘, 열충격 (heat stress)에 대한 안정성 등에 기여하는 샤페론 단백질의 일종으로, 종양 성장에 필요한 단백질을 안정화시켜 암의 발생 또는 성장과 관련 있는 것으로 알려져 있다. Hsp90은 가장 흔한 열-관련 단백질(heat-related proteins)의 하나이다. "90"은 상기 단백질의 분자량이 약 90kDa 정도임을 의미한다. 상기 Hsp90은 진핵생물, 예컨대, 효모, 또는 마우스, 래트 등의 설치류, 인간, 원숭이 등의 영장류 등을 포함하는 포유류에서 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, 효모 Hsp90 (예컨대, NCBI Accession No. NP_013911.1, NP_015084.1 등), 인간 Hsp90 (예컨대, NCBI Accession No. NP_001017963.2, NP_005339.3 등), 마우스 Hsp90 (예컨대, NCBI Accession No. NP_034610.1, NP_032328.2 등), 래트 Hsp90 (예컨대, NCBI Accession No. NP_786937.1, AAT99569.1 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. Hsp90를 암호화하는 유전자(mRNA)는, 예컨대, 효모 Hsp90 (예컨대, NCBI Accession No. NM_001182692.1, NM_001184054.1 등), 인간 Hsp90 (예컨대, NCBI Accession No. NM_001017963.2, NM_005348.3 등), 마우스 Hsp90 (예컨대, NCBI Accession No. NM_010480.5, NM_008302.3 등), 래트 Hsp90 (예컨대, NCBI Accession No. NM_175761.2, AY695393.1 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다

일 구체예는 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별을 위한 바이오마커를 제공한다.

다른 예는 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 c-Met 저해제의 효능 검정을 위한 바이오마커를 제공한다.

다른 예는 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 포함하는 c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별을 위한 조성물 및 키트를 제공한다.

다른 예는 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 포함하는 c-Met 저해제의 효능 검정을 위한 조성물 및 키트를 제공한다.

다른 예는 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준 및/또는 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 변이 여부 및/또는 Hsp90의 기능 이상 여부를 측정하는 단계를 포함하는 c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별 방법, 또는 c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 다른 예는 생물 시료 내의 Hsp90 및 이들을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준 및/또는 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 변이 여부 및/또는 Hsp90의 기능 이상 여부를 측정하는 단계를 포함하는 c-Met 저해제의 효능 검정 방법 또는 c-Met 저해제의 효능 검정을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 c-Met 저해제의 효능 예측은 c-Met 저해제에 대한 저항성이 내재적(선천적)으로 존재하는지 여부 등과 같이 c-Met 저해제가 효능을 발휘하는데 영향을 미치는 요건을 확인하여, c-Met 저해제가 효능을 발휘할 수 있을지 여부를 예측하는 것을 의미할 수 있다. c-Met 저해제의 효능 검정은 c-Met 저해제가 효능을 잘 발휘하고 있는지 여부 및/또는 c-Met 저해제 투여에 의하여 저항성이 유도되었는지 여부를 모니터링하는 것을 의미한다.

일 구체예에서, 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준 및/또는 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 변이 여부 및/또는 Hsp90의 기능 이상 여부를 측정하는 단계를 포함하는 c-Met 저해제의 효능 예측 방법, c-Met 저해제의 효능 예측을 위한 정보를 제공하는 방법, c-Met 저해제의 적용 대상의 선별 방법 또는 c-Met 저해제의 적용 대상의 선별을 위한 정보를 제공하는 방법이 제공된다.

앞서 설명한 바와 같이, 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 높은 경우는 상기 생물 시료가 c-Met 저해제에 대하여 저항성을 갖는 것을 의미하는 것일 수 있다. 그러므로, 상기 c-Met 저해제의 효능 예측 또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별 방법에 있어서, 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 낮은 경우, 상기 생물 시료 또는 상기 생물 시료가 유래하는 환자에서 상기 c-Met 저해제가 효능을 발휘할 것으로 판단(예측)하거나, 상기 생물 시료 또는 상기 생물 시료가 유래하는 환자를 c-Met 저해제의 적용 대상으로 판단할 수 있다. 따라서, 상기 c-Met 저해제의 효능 예측 또는 효능 예측을 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 측정하는 단계 이후에 상기 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 낮은 경우, 상기 생물 시료 또는 상기 생물 시료가 유래하는 환자에서 상기 c-Met 저해제가 효능을 발휘할 것으로 판단(예측)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 c-Met 저해제의 적용 대상의 선별 방법 또는 c-Met 저해제의 적용 대상의 선별을 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 측정하는 단계 이후에 상기 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 낮은 경우, 상기 생물 시료 또는 상기 생물 시료가 유래하는 환자를 상기 c-Met 저해제를 적용하기에 적절한 대상으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

"Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 낮다"함은, 예컨대, Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자가 존재하지 않거나, 적용하고자 하는 c-Met 저해제가 효능을 발휘하지 못하는 환자로부터 분리된 생물 시료(비교 기준 시료; 예컨대, 세포주 H1373 (ATCC, CRL-5866) 폐암 세포주, HCC1806 (ATCC, CRL-2335) 유방암 세포주, Caki-1 (ATCC, HTB-46) 신장암 세포주, SKBR3 (ATCC, HTB-30) 유방암 세포주, BT474 (ATCC, HTB-20) 유방암 세포주, HT-29 (ATCC, HTB-38) 대장암 세포주, LoVo (ATCC, CCL-229) 대장암 세포주, HCT116 (ATCC, CCL-247) 대장암 세포주, SW620 (ATCC, CCL-227) 대장암 세포주, Ls174T (ATCC, CL-188) 대장암 세포주, 또는 c-Met 저해제의 반복적 또는 지속적 투여에 의하여 이에 대한 저항성이 발생한 세포주, 등)와 비교하여 Hsp90 단백질 양 및/또는 이를 암호화하는 유전자 (DNA, cDNA 또는 mRNA)의 양이 적은 경우를 의미하는 것일 수 있다. 또는, Hsp90 단백질에 대한 통상의 항체(예컨대, Cell signaling, #4874)를 사용하는 통상의 면역조직화학검사(IHC)로 측정하여 0 또는 +1의 값이 얻어지는 경우를 Negative로 판단하고 그 이상의 값이 얻어지는 경우를 Positive로 판단할 수 있는데, Negative인 경우 생물 시료 내에 Hsp90이 존재하지 않거나 또는 수준이 낮은 경우로 볼 수 있다. 따라서, Hsp90 단백질에 대한 통상의 항체(예컨대, Cell signaling, #4874)를 사용하는 통상의 면역조직화학검사(IHC)로 측정하여 0 또는 +1의 값이 얻어지는 경우 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 낮다고 판단할 수 있다.

다른 예에서, 생물 시료 내에 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 변이 및/또는 Hsp90의 기능 이상이 존재하는 것으로 확인되는 경우, 이들 변이 및/또는 기능 이상이 존재하지 않는 경우와 비교하여, c-Met 저해제가 효능을 잘 발휘하거나 c-Met 저해제에 대하여 저항성이 없거나 낮은 것으로 판단할 수 있다. 상기 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 변이는 Hsp90의 아미노산 서열 중 하나 이상이 다른 아미노산으로 치환되거나 결실되거나, 이와 같이 치환 또는 결실된 Hsp90을 암호화하도록 하는 Hsp90 유전자의 변이일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 변이는 인간 Hsp90 (예컨대, NCBI Accession No. NP_005339.3)의 598번째 아미노산인 Cys 또는 인간 이외의 다른 species 유래의 Hsp90에서 통상적인 서열 배열(sequence alignment) 상 상기 인간 Hsp90의 598번째 아미노산(Cys)에 대응하는 아미노산 (예컨대, 효모 Hsp90 (NCBI Accession No. NP_015084.1)의 577번째 아미노산인 Ala)의 다른 아미노산으로의 치환 또는 결실을 의미하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 Hsp90 (NCBI Accession No. NP_005339.3)의 598번째 아미노산인 Cys의 Ala로의 치환 (C598A), 또는 효모 Hsp90 (NCBI Accession No. NP_015084.1)의 577번째 아미노산인 Ala의 Asn으로의 치환 (A577N) 또는 상기 577번째 아미노산인 Ala의 Asp로의 치환 (A577D), 또는 상기 변이에 해당하는 다른 species 유래의 Hsp90의 변이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 또는 이와 같은 아미노산 변이를 갖는 Hsp90을 암호화하도록 하는 Hsp90 유전자의 변이일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 Hsp90 또는 이를 암호화하는 유전자의 변이 여부는 통상적인 단백질의 아미노산 서열 또는 유전자의 염기서열 확인 방법에 의하여 확인될 수 있다. 예컨대, 상기 Hsp90 또는 이를 암호화하는 유전자의 변이 여부는 상기 변이 Hsp90 또는 이를 암호화하는 유전자와 상호작용하는 물질, 예컨대, 상기 변이 Hsp90와 결합 가능한 화학물질, 항체, 앱타머, 및 상기 변이 Hsp90를 암호화하는 유전자와 혼성화 가능한 프라이머, 프로브, 및 앱타머 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 변이 Hsp90 또는 이를 암호화하는 유전자의 변이 여부는 상기 상호작용하는 물질을 이용하는 통상적인 단백질 또는 유전자 분석 방법, 예컨대, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색, 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting), 폴리머레이즈 연쇄 반응법 (PCR), FISH(fluorescent in situ hybridization), 마이크로어레이법, 등을 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 프라이머는 상기 변이 Hsp90을 암호화하는 유전자 (전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)의 염기서열 중 연속하는 5 내지 1000bp 예컨대 10 내지 500bp, 20 내지 200bp, 또는 50 내지 200bp의 유전자 단편을 검출할 수 있는 것으로, 상기 유전자 단편의 3'-말단 및 5'-말단 각각의 연속하는 5 내지 100bp, 예컨대, 5 내지 50bp, 5 내지 30bp, 또는 10 내지 25bp 부위와 혼성화 가능한 (예컨대, 상보적인) 염기서열을 포함하는 프라이머쌍일 수 있다. 상기 프로브 또는 앱타머는 총 길이가 5 내지 100 bp, 5 내지 50bp, 5 내지 30bp, 또는 5 내지 25bp인 것일 수 있으며, 상기 변이 Hsp90을 암호화하는 유전자 (전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)의 염기서열 중 연속하는 5 내지 100 bp, 5 내지 50bp, 5 내지 30bp, 또는 5 내지 25bp의 유전자 단편과 결합 가능 또는 혼성화 가능한 (예컨대, 상보적) 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 '결합 가능'하다 함은 상기 유전자 부위와 공유 결합 등의 화학적 및/또는 물리적 결합에 의하여 결합할 수 있음을 의미할 수 있고, 상기 '혼성화 가능'하다 함은 상기 유전자 부위의 염기서열과 80% 이상, 예컨대 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 가짐으로써 상보적 결합이 가능함을 의미할 수 있다. 상기 변이는 Hsp90의 기능 이상, 예컨대, ATPase 기능 이상을 유발하는 변이일 수 있다. 또한, 상기 Hsp90의 기능 이상, 예컨대, ATPase 기능 이상은 상기 Hsp90 또는 이를 암호화하는 유전자의 변이에 기인하는 것일 수 있다.

다른 구체예에서, 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준 및/또는 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 변이 여부 및/또는 Hsp90의 기능 이상 여부를 측정하는 단계를 포함하는 c-Met 저해제의 효능 검정 방법 또는 c-Met 저해제의 효능 검정을 위한 정보를 제공하는 방법이 제공된다. 앞서 설명한 바와 같이, 상기 효능 검정 방법은 c-Met 저해제의 투여에 따른 저항성 획득(유도) 여부를 모니터링하는 것을 포함한다.

일 구체예에서, 상기 c-Met 저해제의 효능 검정 방법 또는 c-Met 저해제의 효능 검정을 위한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 상기 c-Met 저해제를 처리하기 전에 환자로부터 얻어진 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준과 상기 c-Met 저해제를 처리한 후에 환자로부터 얻어진 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 각각 측정하고 비교하여, 상기 c-Met 저해제를 처리한 후에 환자로부터 얻어진 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 상기 c-Met 저해제를 처리하기 전 (또는 상기 c-Met 저해제를 처리하지 않은 무처리군)보다 감소하거나 처리전 수준을 유지하는 경우, 상기 생물 시료 또는 상기 생물 시료가 유래하는 환자에서 상기 c-Met 저해제가 효능을 발휘하는 것으로 판단할 수 있다. 또한, 상기 c-Met 저해제를 처리한 후에 환자로부터 얻어진 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 상기 c-Met 저해제를 처리하기 전(또는 상기 c-Met 저해제를 처리하지 않은 무처리군)보다 증가한 경우, 상기 생물 시료 또는 상기 생물 시료가 유래하는 환자에게서 상기 c-Met 저해제에 대한 저항성이 유발된 것으로 판단할 수 있다.

따라서, 상기 c-Met 저해제의 효능 검정 방법 또는 c-Met 저해제의 효능 검정을 위한 정보를 제공하는 방법은, 상기 측정하는 단계 이후에, 상기 c-Met 저해제 처리전 (또는 무처리군) 및 처리군의 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 비교하는 단계 및/또는 상기 c-Met 저해제 처리군의 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 상기 c-Met 저해제 처리 전 (또는 무처리군)보다 감소한 경우, 상기 생물 시료가 유래하는 환자에서 상기 c-Met 저해제가 효능을 발휘하는 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 c-Met 저해제는 항 c-Met 항체일 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 c-Met 저해제의 효능 검정 방법 또는 c-Met 저해제의 효능 검정을 위한 정보를 제공하는 방법은, 상기 측정하는 단계 이후에, 상기 c-Met 저해제 처리 전 (또는 무처리군) 및 처리군의 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 비교하는 단계 및/또는 상기 c-Met 저해제 처리군의 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 상기 c-Met 저해제 처리 전 (또는 무처리군)보다 증가한 경우, 상기 생물 시료가 유래하는 환자에서 상기 c-Met 저해제에 대한 저항성이 유도된 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 c-Met 저해제는 항 c-Met 항체일 수 있다.

상기 상기 c-Met 저해제의 효능 검정 방법 또는 c-Met 저해제의 효능 검정을 위한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 상기 c-Met 저해제 무처리군과 처리군은 각각 동일한 생물 시료에 전체에 대하여 c-Met 저해제를 처리하기 전과 처리한 후의 상태를 의미하거나, 동일한 생물 시료를 분량하여 c-Met 저해제를 처리하지 않은 군(예컨대 vehicle만 처리; 무처리군)과 c-Met 저해제를 처리한 군을 의미할 수 있다. 본 명세서에서, 별도의 언급이 없는 한, c-Met 저해제 무처리군과 c-Met 저해제 처리 전의 생물 시료, c-Met 저해제 처리군과 c-Met 저해제 처리 후의 생물 시료는 각각 서로 동일한 의미로 사용되는 것일 수 있다.상기 효능 검정 방법은 상기 c-Met 저해제의 계속적인 사용 여부 판단 및/또는 상기 c-Met 저해제의 적절한 투여 조건 (예컨대, 투여량, 투여 간격, 투여 회수 등) 결정에 활용될 수 있다. 예컨대, 상기 c-Met 저해제 처리군 또는 처리 후의 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 상기 c-Met 저해제 무처리군 또는 처리 전보다 감소한 경우, 예컨대, 상기 c-Met 저해제 처리군 또는 처리 후의 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 상기 c-Met 저해제 무처리군 또는 처리 전의 약 0 내지 약 80중량%, 약 0 내지 약 70중량%, 약 0 내지 약 60중량%, 약 0 내지 약 50중량%, 약 0 내지 약 40중량%, 약 0 내지 약 30중량%, 약 0 내지 약 20중량%, 또는 약 0 내지 약 10중량%인 경우, 상기 c-Met 저해제를 계속 사용할 수 있는 것으로 판단할 수 있다. 또한, 상기 c-Met 저해제 처리군 또는 처리 후의 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 상기 c-Met 저해제 무처리군 또는 처리 전보다 감소한 경우, 예컨대, 상기 c-Met 저해제 처리군 또는 처리 후의 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 상기 c-Met 저해제 무처리군 또는 처리 전의 약 0 내지 약 80중량%, 약 0 내지 약 70중량%, 약 0 내지 약 60중량%, 약 0 내지 약 50중량%, 약 0 내지 약 40중량%, 약 0 내지 약 30중량%, 약 0 내지 약 20중량%, 또는 약 0 내지 약 10중량%인 경우의 c-Met 저해제의 투여 조건을 상기 c-Met 저해제의 적절한 투여 조건으로 판단할 수 있다. 상기 투여 조건은 투여 용량, 투여 간격, 투여 회수 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 상기 c-Met 저해제의 효능 예측 방법, c-Met 저해제의 적용 대상의 선별 방법, 및/또는 c-Met 저해제의 효능 검정 방법에 있어서, 상기 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 측정하는 단계는, 임의로 i) 생물 시료를 준비하는 단계; ii) 상기 생물 시료에 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 처리(첨가)하여 반응시키는 단계; 및 iii) 상기 얻어진 반응물을 분석하여 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 정량하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 단계 i)의 생물 시료를 준비하는 단계는 환자로부터 생물 시료를 얻는(분리하는) 단계 또는 환자로부터 분리된 생물 시료를 입수하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 단계 ii)에서 상기 상호작용하는 물질은 Hsp90에 특이적으로 결합하는 화합물 (small molecule), 항체, 앱타머, 또는 Hsp90를 암호화하는 유전자의 일부 또는 전부에 결합하는 폴리뉴클레오타이드 (예컨대, 프라이머, 프로브, 앱타머 등), 화합물 등일 수 있으며, 이들은 형광 물질, 발색 물질 등의 표지 물질로 표지되거나 표지되지 않은 것일 수 있다. 상기 단계 iii)에서, 상기 반응물은 단계 ii)에서 얻어진 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 및 이와 상호작용하는 물질이 상호작용(결합)하여 생성된 복합체(complex)일 수 있으며, 상기 정량하는 단계는 상기 생성된 복합체를 정량하거나, 상기 복합체에 표지된 표지 물질을 측정하거나, 상기 복합체를 시료로부터 분리한 후, 이로부터 Hsp90 또는 이를 암호화하는 유전자를 다시 분리하여 분리된 Hsp90 또는 이를 암호화하는 유전자를 정량하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 Hsp90의 정량은 ELISA, 면역조직화학검사법, 등의 통상적인 단백질 정량 방법에 의하여 수행될 수 있으며, Hsp90 유전자의 정량은 qPCR 또는 mRNA 마이크로 어레이 등의 통상적인 유전자 (DNA 또는 RNA) 정량 방법에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 Hsp90 및 이들을 암호화하는 유전자의 수준은 상기 단백질 또는 유전자와 상호작용하는 물질을 이용하는 통상적인 모든 단백질 분석 방법에 의하여 측정될 수 있다. 상기 Hsp90 또는 이들을 암호화하는 유전자와 상호작용하는 물질은 Hsp90 단백질 및/또는 Hsp90 유전자에 특이적으로 결합하는 화학 물질(chemical, small molecule), 단백질, 펩타이드, 핵산 분자(폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 Hsp90 또는 이들을 암호화하는 유전자와 상호작용하는 물질은 Hsp90 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 항체, 압타머, 및 Hsp90을 암호화하는 유전자의 전부 또는 일부에 결합하는 핵산 분자(예컨대, 프라이머, 프로브, 앱타머 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

예컨대, 상기 Hsp90 단백질의 수준은 상기 Hsp90 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 항체, 압타머 등을 이용하는 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색, 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting), 마이크로어레이법, 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 상기 Hsp90를 암호화하는 유전자 (DNA, cDNA 또는 mRNA)의 수준은 통상의 유전자 분석 방법을 이용하여 측정할 수 있으며, 예컨대 상기 유전자와 혼성화 가능한 프라이머, 프로브, 또는 앱타머를 사용하는 통상적인 유전자 분석 방법, 예컨대, 폴리머레이즈 연쇄 반응법 (PCR), FISH(fluorescent in situ hybridization), 마이크로어레이법, 등을 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 프라이머는 Hsp90을 암호화하는 유전자 (전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)의 염기서열 중 연속하는 5 내지 1000bp 예컨대 10 내지 500bp, 20 내지 200bp, 또는 50 내지 200bp의 유전자 단편을 검출할 수 있는 것으로, 상기 유전자 단편의 3'-말단 및 5'-말단 각각의 연속하는 5 내지 100bp, 예컨대, 5 내지 50bp, 5 내지 30bp, 또는 10 내지 25bp 부위와 혼성화 가능한 (예컨대, 상보적인) 염기서열을 포함하는 프라이머쌍일 수 있다. 상기 프로브 또는 앱타머는 총 길이가 5 내지 100 bp, 5 내지 50bp, 5 내지 30bp, 또는 5 내지 25bp인 것일 수 있으며, Hsp90을 암호화하는 유전자 (전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)의 염기서열 중 연속하는 5 내지 100 bp, 5 내지 50bp, 5 내지 30bp, 또는 5 내지 25bp의 유전자 단편과 결합 가능 또는 혼성화 가능한 (예컨대, 상보적) 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 '결합 가능'하다 함은 상기 유전자 부위와 공유 결합 등의 화학적 및/또는 물리적 결합에 의하여 결합할 수 있음을 의미할 수 있고, 상기 '혼성화 가능'하다 함은 상기 유전자 부위의 염기서열과 80% 이상, 예컨대 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 가짐으로써 상보적 결합이 가능함을 의미할 수 있다.

한편, 항 c-Met 항체와 같은 c-Met 저해제를 사용하는 치료의 특성상, 적용되는 암세포의 c-Met 발현량이 일정 수준 이상인 것이 상기 c-Met 저해제가 효능을 발휘할 수 있는 전제될 수 있다. 그러므로, c-Met 또는 이를 암호화하는 유전자는 단독 또는 상기한 Hsp90 또는 이를 암호화하는 유전자와 조합하여, c-Met 저해제의 효능 예측, 효능 검정, 또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별에 있어서 마커로 사용될 수 있다.

따라서, 상기 c-Met 저해제의 효능 예측 및/또는 효능 검정용 조성물 및 키트, 또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별용 조성물 및 키트는 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질 이외에, c-Met 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 "상호작용하는 물질"은 c-Met 및/또는 c-Met 유전자에 특이적으로 결합하는 화학 물질(chemical, small molecule), 단백질, 펩타이드, 핵산 분자 (폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 "상호작용하는 물질"은 c-Met에 특이적으로 결합하는 화합물, 항체, 앱타머, 또는 c-Met를 암호화하는 유전자의 일부 또는 전부에 결합하는 핵산 분자 (예컨대, 프라이머, 프로브, 앱타머 등), 화합물 등일 수 있으며, 이들은 형광 물질, 발색 물질 등의 표지 물질로 표지되거나 표지되지 않은 것일 수 있다.

또한, 상기 c-Met 저해제의 효능 예측 방법 (또는 효능 예측을 위한 정보를 제공하는 방법), 효능 검정 방법 (또는 효능 검정을 위한 정보를 제공하는 방법), 또는 적용 대상 선별 방법 (또는 적용 대상 선별을 위한 정보를 제공하는 방법)은, 환자로부터 얻어진 생물 시료의 c-Met 단백질 수준 또는 이를 암호화하는 유전자 (예컨대, 전장 DNA, cDNA, mRNA 등)의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 시료의 c-Met 단백질 수준 또는 이를 암호화하는 유전자 (예컨대, 전장 DNA, cDNA, mRNA 등)의 수준을 측정하는 단계는 단계는 앞서 설명한 Hsp90 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 수준을 측정하는 단계와의 순서에 있어서 제한이 없으며, 상기 두 측정 단계는 동시에 또는 순서에 관계없이 순차적으로 수행될 수 있다. 그 구체적인 측정 단계는 앞서 기재한 바와 같다. 예컨대, 통상적인 웨스턴 블라팅 방법을 사용하여, 상기 생물시료 (예컨대, 암세포 또는 암조직)으로부터 얻어진 전체 세포내 단백질 일정량 (예컨대, 10ug(microgram))을 로딩하고, 멤브레인에 일정시간 (예컨대, 30초 정도) 노출시 band가 검출되는 경우, c-Met 저해제를 사용하는 치료가 효능을 나타낼 수 있는 전제 요건이 충족되었다고 판단할 수 있다. 또 다른 구체예에서, Affymetrix array을 사용하여 제조자 설명서에 따라서 mRNA 수준을 측정한 결과, 생물 시료 내 c-Met의 mRNA 수준이 약 13.5 이상, 약 13.6 이상 또는 약 13.78 이상인 경우, c-Met 저해제를 사용하는 치료가 효능을 나타낼 수 있는 전제 요건이 충족되었다고 판단할 수 있다. 이와 같은 c-Met의 고발현 특성을 갖는 암세포는 주로 폐암, 유방암, 뇌암, 위암, 간암, 신장암 등의 암세포일 수 있으나, 다른 종류의 암세포라도 하여도 환자 개개인의 특성에 따라서 c-Met 발현량이 높은 경우도 c-Met 저해제를 이용하는 치료 대상에 포함될 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 c-Met 저해제의 효능 예측 또는 검정 방법 (또는 효능 예측 또는 검정에 정보를 제공하는 방법) 또는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별 방법 (또는 대상 선별에 정보를 제공하는 방법)에서 사용된 생물 시료는 c-Met 발현량이 높은, 예컨대, Affymetrix array를 이용한 측정 결과 c-Met 수준이 약 13.5 이상, 약 13.6 이상 또는 약 13.78 이상인 조직, 세포, 또는 체액 (혈액, 혈청, 소변, 타액 등)일 수 있다.

본 명세서에서, 상기 c-Met 저해제의 적용 대상은 c-Met 저해제를 사용하는 치료법을 적용하기에 적합한 환자를 의미하는 것으로, 모든 포유류, 예컨대 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류일 수 있고, 예컨대 암환자일 수 있다. 상기 생물 시료는 환자(예컨대, 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등을 포함하는 포유류), 또는 상기 환자로부터 분리되거나 인공적으로 배양된 세포, 조직, 체액 (예컨대, 혈액, 혈청, 소변, 타액 등) 등일 수 있으며, 예컨대 혈액 또는 혈청일 수 있다.

다른 예는 상기 선별된 c-Met 저해제의 적용 대상에게 c-Met 저해제를 투여하는 단계를 포함하는 c-Met 억제 방법을 제공한다.

다른 예는 상기 선별된 c-Met 저해제의 적용 대상에게 c-Met 저해제를 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.

상기 c-Met 억제 방법 또는 암의 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여 단계 이전에 상기 항 c-Met 항체 적용 대상을 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 그 구체적 방법 및 단계를 앞서 설명한 바와 같다. 상기 c-Met 저해제는 항 c-Met 항체일 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 c-Met 억제 방법 또는 암의 예방 및/또는 치료 방법은,

c-Met 저해제의 적용 대상을 확인하는 단계; 및

상기 c-Met 저해제의 적용 대상에게 c-Met 저해제의 약학적 유효량을 투여하는 단계

를 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 c-Met 억제 방법 또는 암의 예방 및/또는 치료 방법은,

생물 시료 내의 Hsp90 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 수준 및/또는 Hsp90 또는 이를 암호화하는 유전자의 변이 여부 및/또는 기능 이상을 측정하여 c-Met 저해제의 적용 대상을 선별하는 단계;

상기 선별된 c-Met 저해제의 적용 대상에게 c-Met 저해제의 약학적 유효량을 투여하는 단계

를 포함할 수 있다.

이 때, 상기 c-Met 저해제의 투여 조건 예컨대, 투여량, 투여 간격, 및/또는 투여 회수는 상기 c-Met 저해제의 효능 검정 방법에서 판단된 c-Met 저해제의 적절한 투여 조건일 수 있다.

한편, Hsp90를 저해하는 경우, c-Met 저해제에 대하여 저항성을 갖는 암에 대한 항암 효능이 회복되는 것을 확인하였다. 또한, c-Met과 Hsp90를 함께 저해하는 경우, c-Met만 저해하는 경우와 비교하여, 암 치료 효능, 예컨대, c-Met 저해제에 대하여 저항성을 갖는 암에 대한 치료 효능이 현저하게 증진됨을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 다른 예는 Hsp90 저해제를 유효성분으로 포함하는 c-Met 저해제에 대한 저항성 저감용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 Hsp90 저해제를 유효성분으로 포함하는 c-Met 저해제에 대한 저항성을 갖는 암의 치료용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 Hsp90 저해제를 투여하는 단계를 포함하는 c-Met 저해제에 대한 저항성 저감 방법을 제공한다. 다른 예는 Hsp90 저해제를 투여하는 단계를 포함하는 c-Met 저해제에 대한 저항성을 갖는 암의 치료 방법을 제공한다.

다른 예는 c-Met 저해제 및 Hsp90 저해제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 병용 투여용 약학 조성물은 c-Met 저해제의 약학적 유효량 및 Hsp90 저해제의 약학적 유효량이 혼합된 혼합제를 포함하는 두 약물의 동시 투여를 위한 형태일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 병용 투여용 약학 조성물은 c-Met 저해제의 약학적 유효량 및 Hsp90 저해제의 약학적 유효량이 각각 제제화되어 동시적 또는 순차적으로 투여되기 위한 형태일 수 있다. 이 경우, 상기 병용 투여용 약학 조성물은 유효 성분으로 c-Met 저해제의 약학적 유효량을 포함하는 제1 약학 조성물 및 유효성분으로 Hsp90 저해제의 약학적 유효량을 포함하는 제2 약학 조성물을 포함하는 동시적 또는 순차적 투여를 위한 병용 투여용 약학 조성물일 수 있다. 순차적 투여의 경우 그 순서는 서로 바뀌어도 무방하다.

다른 예는 c-Met 저해제의 약학적 유효량을 포함하는 제1 약학 조성물, Hsp90 저해제의 약학적 유효량을 포함하는 제2 약학 조성물, 및 포장 용기를 포함하는, 암의 예방 및/또는 치료용 키트를 제공한다.

또 다른 예는 c-Met 저해제 및 Hsp90 저해제를 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 병용 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 투여하는 단계 이전에 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

한 구체예에서, 상기 병용 투여는 c-Met 저해제와 Hsp90 저해제를 혼합한 혼합제를 투여함으로써 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 병용 투여는 c-Met 저해제를 투여하는 제1 단계 및 Hsp90 저해제를 투여하는 제2 단계를 동시에 또는 순차적으로 수행하는 것일 수 있다. 순차적으로 투여하는 경우 그 순서는 서로 바뀌어도 무방하다.

일 구체예에서, 상기 Hsp90 저해제는 Hsp90 단백질 및/또는 Hsp90를 암호화하는 유전자의 발현 및/또는 기능을 억제하는 모든 물질일 수 있으며, 예컨대, Hsp90 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머, 화학 물질 (소분자 화합물 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염), Hsp90를 암호화하는 유전자의 전부 또는 일부 (예컨대, 5 내지 100 bp, 5 내지 50bp, 5 내지 30bp, 또는 5 내지 25bp)에 특이적으로 결합 하는 (또는 상보적 염기서열을 갖는) 핵산 분자 (예컨대, 압타머, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA (small interfering RNA), shRNA (small hairpin RNA), miRNA (microRNA), 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 Hsp90 저해제는 SNX-2112 (PF-04928473; 아래 화학식 참조), 겔다나마이신(Geldanamycin), 17-AAG (17-(Allylamino)-17-desmethoxygeldanamycin) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[SNX-2112]

상기 c-Met 저해제는 c-Met 단백질 및/또는 c-Met을 암호화하는 유전자의 발현 및/또는 기능을 억제하는 모든 물질일 수 있으며, 예컨대, c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머, 화학 물질 (소분자 화합물 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염), c-Met을 암호화하는 유전자의 전부 또는 일부 (예컨대, 5 내지 100 bp, 5 내지 50bp, 5 내지 30bp, 또는 5 내지 25bp)에 특이적으로 결합 하는 (또는 상보적 염기서열을 갖는) 핵산 분자 (예컨대, 압타머, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA (small interfering RNA), shRNA (small hairpin RNA), miRNA (microRNA), 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 c-Met 저해제는 하기하는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 크리조티닙(crizotinib; 3-[(1R)-1-(2,6-dichloro-3-fluorophenyl)ethoxy]-5-(1-piperidin-4-ylpyrazol-4-yl)pyridin-2-amine; PF-02341066), 카보잔티닙(cabozantinib; XL-184), 포레티닙(foretinib; E7050), PHA-665752, SU11274, SGX-523, PF-04217903, EMD 1214063, Golvatinib, INCB28060, MK-2461, 티반티닙(tivantinib; ARQ 197), NVP-BVU972, AMG458, BMS 794833, BMS 777607, MGCD-265, AMG-208, BMS-754807, JNJ-38877605, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

다른 예는 앞서 설명한 바와 같은 Hsp90 변이체 (변이 Hsp90) 또는 이를 암호화하는 유전자를 제공한다. 상기 Hsp90 변이체 또는 이를 암호화하는 유전자는 c-Met 저해제, 예컨대 항 c-Met 항체의 적용 가능한 환자 선별, 효능 예측, 및/또는 효능 검정을 위한 마커로서 사용될 수 있다. 상기 Hsp90 변이체는 Hsp90의 기능 이상, 예컨대 ATPase 기능 이상을 유발하는, 하나 이상의 아미노산의 결실 및/또는 다른 아미노산으로의 치환을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 Hsp90 변이체는 효모 Hsp90 (NCBI Accession No. NP_013911.1)에 있어서 577번째 아미노산인 Ala 또는 다른 종 유래의 Hsp90의 상기 위치에 해당하는 아미노산 및/또는 598번째 아미노산인 Cys 또는 다른 종 유래의 Hsp90의 상기 위치에 해당하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환 또는 결실을 포함하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로,효모 Hsp90 (NCBI Accession No. NP_013911.1)의 577번째 아미노산인 Ala의 Asn으로의 치환 (A577N), 577번째 아미노산인 Ala의 Asp로의 치환 (A577D), 598번째 아미노산인 Cys의 Als로의 치환 (C598A), 및 상기 변이에 해당하는 다른 종 유래의 Hsp90의 변이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 변이를 포함하는 것일 수 있다.

다른 예는 상기 Hsp90 변이체 또는 이를 암호화하는 유전자와 상호작용하는 물질을 포함하는 c-Met 저해제, 예컨대 항 c-Met 항체의 적용 가능한 환자 선별, 효능 예측, 및/또는 효능 검정을 위한 조성물을 제공한다. 상기 상호작용하는 물질은 앞서 설명한 바와 같다.

일 구체예에서, 상기 항 c-Met 항체는 c-Met을 항원으로 인식하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 예컨대, 상기 항 c-Met 항체는 c-Met에 특이적으로 결합하여 세포내 이동(internalization) 및 분해(degradation)를 유도하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 항 c-Met 항체는 c-Met의 특정 부위, 예컨대 SEMA 도메인 내의 특정 부위를 에피토프로 인식하는 것일 수 있다.

본 명세서에서, 별도의 언급이 없는 한, 항 c-Met 항체는 완전한 형태의 항 c-Met 항체뿐 아니라 상기 항체의 항원 결합 부위도 포함하기 위하여 사용된다.

상기 "c-Met 단백질"은 간세포 성장 인자와 결합하는 수용체 티로신 카이네이즈를 의미한다. 상기 c-Met 단백질은 모든 종에서 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 c-Met (예컨대, NP_000236), 원숭이 c-Met (예컨대, Macaca mulatta, NP_001162100) 등과 같은 영장류 유래의 것, 또는 마우스 c-Met (예컨대, NP_032617.2), 래트 c-Met (예컨대, NP_113705.1) 등과 같은 설치류 유래의 것 등일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면, GenBank Aceession Number NM_000245에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 GenBank Aceession Number NM_000236에 제공된 폴리펩티드 서열에 의해 암호화된 단백질, 또는 그의 세포외 도메인을 포함한다. 수용체 티로신 키나제 c-Met은 예를 들면, 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생혈관 생성 과정 등의 여러 가지 기작에 관여한다.

HGF(Hepatocyte growth factor)의 수용체인 c-Met은 세포외 부위, 막투과 부위, 세포내 부위의 세 부분으로 구분되며, 세포외 부위의 경우, 이황화 결합에 의해 α-소단위체와 β-소단위체가 연결된 형태로 HGF 결합 도메인인 SEMA 도메인, PSI 도메인(plexin-semaphorins-integrin homology domain) 및 IPT 도메인(immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain)으로 이루어진다. c-Met 단백질의 SEMA 도메인은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, c-Met의 세포외 부위에 존재하는 도메인으로서, HGF가 결합하는 부위에 해당한다. SEMA 도메인 중에서 특정 부위, 예컨대, 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 영역은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 중 2번과 3번 프로펠러 도메인 사이의 루프(loop) 부위에 해당하며, 본 발명에서 제안되는 항 c-Met 항체의 에피토프로 작용할 수 있다.

용어, "에피토프(epitope)"는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 부위, 예컨대, c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71 내에 위치하는 연속하는 5개 내지 19개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에피토프는 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하여 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.

상기 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 2번과 3번 프로펠러 구조의 도메인 사이의 루프 부위 중 가장 바깥으로 위치한 부위에 해당하며, 상기 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 일 구체예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 특이적으로 결합하는 부위이다.

따라서, 항 c-Met 항체는 서열번호 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,

서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 부위;

서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;

상기 중쇄 상보성 결정영역 및 경쇄 상보성 결정영역의 조합; 또는

상기 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

상기 서열번호 4 내지 서열번호 9는 각각 하기 일반식 Ⅰ 내지 일반식 Ⅵ으로 표시되는 아미노산 서열이다:

일반식 Ⅰ

Xaa₁-Xaa₂-Tyr-Tyr-Met-Ser (서열번호 4),

일반식 Ⅱ

Arg-Asn-Xaa₃-Xaa₄-Asn-Gly-Xaa₅-Thr (서열번호 5),

일반식 Ⅲ

Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa₆-Tyr (서열번호 6),

일반식 Ⅳ

Lys-Ser-Ser-Xaa₇-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa₈-Gly-Asn-Xaa₉-Xaa₁₀-Asn-Tyr-Leu-Ala (서열번호 7)

일반식 Ⅴ

Trp-Xaa₁₁-Ser-Xaa₁₂-Arg-Val-Xaa₁₃ (서열번호 8)

일반식 Ⅵ

Xaa₁₄-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa₁₅-Pro-Xaa₁₆-Thr (서열번호 9)

상기 일반식 Ⅰ에서, Xaa₁은 존재하지 않거나 Pro 또는 Ser이고, Xaa₂는 Glu 또는 Asp이며,

상기 일반식 Ⅱ에서, Xaa₃은 Asn 또는 Lys이며, Xaa₄는 Ala 또는 Val이고, Xaa₅는 Asn 또는 Thr이며,

상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa₆은 Ser 또는 Thr이고,

상기 일반식 Ⅳ에서, Xaa₇은 His, Arg, Gln 또는 Lys이고, Xaa₈은 Ser 또는 Trp이고, Xaa₉은 His 또는 Gln이며, Xaa₁₀는 Lys 또는 Asn이고,

상기 일반식 Ⅴ에서, Xaa₁₁은 Ala 또는 Gly이며, Xaa₁₂은 Thr 또는 Lys이고, Xaa₁₃는 Ser 또는 Pro이며,

상기 일반식 Ⅵ에서, Xaa₁₄은 Gly, Ala 또는 Gln이고, Xaa₁₅는 Arg, His, Ser, Ala, Gly 또는 Lys이며, Xaa₁₆는 Leu, Tyr, Phe 또는 Met이다.

일 구체예에서, 상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-L3은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 부위; 및 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편에서, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위는 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변영역을 인간 항체의 불변영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 부위에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 부위 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.

인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 유래 항체일 수 있다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 생체에서 분리된 것 또는 비자연적으로 발생한 것 (즉, 자연적으로 존재하지 않는 것)일 수 있다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 재조합적 또는 합성적으로 제조된 것일 수 있다.

완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변영역은 중쇄 불변영역과 경쇄 불변영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 부위 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 부위 도메인 V_H 및 3개의 불변영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 부위 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 부위 도메인 V_L 및 불변영역 도메인 C_L을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 부위(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 일 구체예에서, 상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 부위와 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.

Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다.

F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.

이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 부위와 단쇄의 가변 부위가 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다.

상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

상기 항 c-Met 항체의 앞서 정의된 CDR 부위 또는 경쇄 가변 부위와 중쇄 가변 부위를 제외한 부위, 예컨대, 경쇄 불변영역과 중쇄 불변영역은 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM 등)으로부터 유래하는 것일 수 있다.

용어 "힌지 영역(hinge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.

동물 유래 항체가 키메릭화(chimerization) 과정을 거치게 되면, 동물 유래의 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지로 치환되지만, 동물 유래 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지에 비하여 그 길이가 짧고, 두 개의 중쇄 사이의 이황화결합(disulfide bond)이 3개에서 2개로 감소하여 힌지의 경직성(rigidity)이 서로 상이한 효과를 보이게 된다. 따라서, 힌지 영역의 변형(modification)은 인간화 항체의 항원 결합 효율성을 증가시킬 수 있다. 상기 힌지 영역의 아미노산 서열을 변형시키기 위한 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

이에, 본 발명의 일 구체예에서, 항원 결합 효율성을 증진시키기 위하여, 상기 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환되어 아미노산 서열이 변형된 힌지 영역을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103 또는 서열번호 104의 아미노산 서열을 갖는 힌지 영역, 또는 서열번호 105의 아미노산 서열을 갖는 힌지 영역(비변형 인간 힌지 영역)을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 힌지 영역은 서열번호 100 또는 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 항 c-Met 항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포에서 생산되는, c-Met 단백질의 세포외 부위(extracellular region)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있다 (대한민국 공개특허 제2011-0047698호 참조; 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함됨). 상기의 항 c-Met 항체는 대한민국 공개특허 제2011-0047698호에 정의된 항체를 모두 포함할 수 있다.

상기 항 c-Met 항체의 앞서 정의된 CDR 부위 또는 경쇄 가변 부위와 중쇄 가변 부위를 제외한 경쇄 불변영역과 중쇄 불변영역은 모든 서브타입의 면역글로불린의 경쇄 불변영역과 중쇄 불변영역일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,

서열번호 62의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 66의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 및 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및

서열번호 68의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 70의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 및 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄

를 포함하는 것일 수 있다.

예컨대, 상기 항-c-Met 항체는,

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 또는

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 및

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체

로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

한편, 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄이며, 서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에서 36번 (kabat numbering에 따름, 서열번호 68 내의 62번째 아미노산 위치) 히스티딘 (histidine)이 티로신 (tyrosine)으로 치환된 형태의 폴리펩티드이다. 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 생산량이 증가될 수 있다. 또한 상기 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 상기 서열번호 68의 아미노산 서열 중 1번째부터 20번째까지의 시그널 펩타이드를 제외한 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에서 kabat numbering에 의한 27e 위치(kabat numbering에 따름, 서열번호 108 내 32번째 위치; CDR-L1 내부)의 세린(Ser)이 트립토판(Trp)으로 치환된 것으로, 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 활성(예컨대, c-Met에 대한 결합친화도, c-Met 분해 활성 및 Akt 인산화 억제 활성 등)이 보다 증진될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 c-Met 항체는 서열번호 106의 경쇄 상보성결정영역, 서열번호 107의 경쇄 가변 부위, 또는 서열번호 108의 경쇄를 포함하는 항 c-Met 항체일 수 있다.

다른 예에서, 상기 c-Met 저해제는 c-Met과 함께 다른 단백질, 예컨대 종양 관련 단백질 (e.g., 각종 성장인자 (EGF, HER2, HER3, VEGF, FGF, 등), 상기 성장인자의 수용체 (EGFR, VEGFR, FGFR, 등), 등)을 함께 저해하는 이중 저해제, 예컨대 이중 특이 항체일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 c-Met 저해제는 c-Met과 EGFR을 모두 저해하는 것일 수 있으며, 예컨대, 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체일 수 있다. 상기 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것일 수 있다.

상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 앞서 설명한 바와 같다.

구체적으로, 상기 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,

서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;

서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;

상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는

상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

	중쇄 CDR		경쇄 CDR
CDR-H1	NYDMS(서열번호109)	CDR-L1	TGSSSNIGNNDVS(서열번호112)
CDR-H2	GISHSSGSKYYADSVKG(서열번호110)	CDR-L2	DDNKRPS(서열번호113)
CDR-H3	KDATPRPLKPFDY(서열번호111)	CDR-L3	GSWDASLNA(서열번호114)

예컨대, 상기 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 115 또는 서열번호 117의 중쇄 가변 영역, 서열번호 116 또는 서열번호 118의 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 115 또는 서열번호 117의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 116 또는 서열번호 117의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 EGFR scFv일 수 있다.

<서열번호 115: 항 EGFR 항체의 중쇄 가변 영역>

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSGISHSSGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDATPRPLKPFDYWGQGTLVTVSS　　

(상기 서열에서 굵은 글씨로 표시한 부분이 CDR 부위이며, 순서대로 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3이다)

<서열번호 116: 항 EGFR 항체의 경쇄 가변 영역>

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNDVSWYQQLPGTAPKLLIYDDNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDASLNAYVFGGGTKLTVLG

(상기 서열에서 굵은 글씨로 표시한 부분이 CDR 부위이며, 순서대로 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3이다)

<서열번호 117: 항 EGFR 항체의 중쇄 가변 영역>

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKCLEWVSGISHSSGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDATPRPLKPFDYWGQGTLVTVSS　　

<서열번호 118: 항 EGFR 항체의 경쇄 가변 영역>

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNDVSWYQQLPGTAPKLLIYDDNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDASLNAYVFGCGTKLTVLG

상기 서열번호 115의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 116의 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드 또는 항 EGFR scFv에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은 링커, 예컨대, 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및/또는 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및/또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 이중 특이 항체의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드 링커는 Gly, Asn, Ser, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 총 1 내지 100개, 2 내지 50개, 또는 5 내지 25개를 포함하여 이루어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)n (n은 (G4S)의 반복수)로서, 1 내지 10의 정수, 예컨대 2 내지 5의 정수)로 표현되는 것일 수 있다.

상기 c-Met 저해제 및/또는 Hsp90 저해제는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 적용 (투여)될 수 있으며, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는, 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 c-Met 저해제는 상기 성분들 이외에 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 c-Met 저해제 및/또는 Hsp90 저해제는 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 또는 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 c-Met 저해제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 명세서에 있어서 "약학적 유효량"은 약물이 약학적으로 의미있는 효과를 나타낼 수 있는 양을 의미한다. 1회 투여를 위한 c-Met 저해제의 약학적 유효량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라서 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 1회 투여를 위한 상기 c-Met 저해제의 약학적 유효량은 0.001 내지 100mg/kg, 또는 0.02 내지 10mg/kg 범위일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1회 투여를 위한 약학적 유효량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명에서 c-Met 저해제 및/또는 Hsp90 저해제는 암 및/또는 암전이의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 상기 암은 c-Met의 과발현 및/또는 비정상적인 활성화와 관련된 것일 수 있으며, 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 예컨대, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 위암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 암은 원발성 암뿐 아니라 전이성 암도 포함한다. 또한 상기 암은 기존의 c-Met 저해제, 예컨대 항 c-Met 항체에 대하여 저항성을 갖는 암 (예컨대, 위암, 폐암, 신장암 등의 고형암)일 수 있다.

상기 암의 예방 및/또는 치료 효과는 암세포의 성장을 억제하는 효과뿐 아니라, 이동(migration), 침습(invasion), 전이(metastasis) 등을 억제하여 이로 인한 암의 악화를 억제하는 효과를 포함한다.

Hsp90를 c-Met 억제제 (타겟 치료제)의 효능 예측/검정 마커로서의 용도와, Hsp90/c-Met의 결합의 분리 기작을 이용하는 c-Met 억제제의 경우, 다른 특정 Met 치료제에 저항성이 생긴 경우에도 이를 극복할 수 있다. 보다 구체적으로,

1) Hsp90의 양을 미리 측정 c-Met 타겟 치료제의 항암 효능 여부를 예측 가능하고;

2) c-Met 타겟 치료제에 반응성을 보이다 저항성을 가지게 된 경우를 Hsp90의 양적 증가로 확인할 수 있으며;

3) Hsp90의 양이 증가하여 c-Met 타겟 치료제에 저항성을 가지게 된 경우, c-Met 타겟 치료제와 Hsp90 억제제 (예컨대, siRNA)와의 병용 투여로 이를 극복 할 수 있고,

4) 특정 Met 타겟 치료제에 저항성을 가지게 되고 Hsp90의 활성 또는 수준에 이상이 없는 경우, Hsp90와 c-Met의 결합의 분리를 유도할 수 있는 다른 Met 타겟 치료제를 사용하여 저항성을 극복 가능하다.

도 1은 항 c-Met 항체 반응군인 H1993 폐암세포주(상단)와 비반응군인 H1373 폐암세포주(하단)에서의 항 c-Met 항체(L3-1Y/IgG2) 또는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체(ME22S) 처리에 따른 세포 증식 정도를 보여주는 그래프이다.
도 2는 항 c-Met 항체 반응군인 H1993 폐암세포주와 비반응군인 H1373 폐암세포주에서의 항 c-Met 항체(L3-1Y/IgG2) 또는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체(ME22S) 처리에 따른 c-Met과 Hsp90 결합의 분리 여부를 보여주는 western blotting 결과이다.
도 3은 항 c-Met 항체(L3-1Y/IgG2)에 대한 저항성 획득에 따른 Hsp90 수준 변화를 보여주는 western blotting 결과이다.
도 4는 항 c-Met 항체(L3-1Y/IgG2) 반응군과 비반응 군에서의 Hsp90 및 c-Met 수준을 비교하여 보여주는 western blotting 결과이다.
도 5는 H1993 세포주와 H1993 Re9 세포주 (항 c-Met 항체에 대한 저항성 획득 세포주)에서 항 c-Met 항체(L3-1Y/IgG2) 또는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체(ME22S)와 Hsp90 siRNA의 병용투여에 의한 세포 증식 정도를 보여주는 그래프이다.
도 6은 H1993 세포주와 H1993 Re21 세포주 (항 c-Met 항체에 대한 저항성 획득 세포주)에서 항 c-Met 항체(L3-1Y/IgG2) 또는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체(ME22S)와 Hsp90 억제제의 병용투여에 의한 세포 증식 정도를 보여주는 그래프이다.
도 7은 환자 유래의 폐암 (비소세포성폐암) 세포를 이식한 xenograft 마우스 모델에서의 L3-1Y/IgG2에 대한 반응성 여부에 따른 Hsp90 수준을 비교하여 보여주는 western blotting 결과이다.
도 8은 항 c-Met 항체에 대한 저항성이 유도된 EBC1 세포에서 항 c-Met 항체(L3-1Y/IgG2)를 다양한 농도로 투여시의 세포 증식 정도를 보여주는 그래프이다.
도 9는 항 c-Met 항체에 대한 저항성이 유도된 H1993 세포에서 항 c-Met 항체(L3-1Y/IgG2)를 다양한 농도로 투여시의 세포 증식 정도를 보여주는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

참고예 1: 항 c- Met 항체의 제작

1.1. c- Met 에 대한 마우스 항체 ' AbF46' 의 생산

1.1.1. 마우스의 면역화

하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 마우스를 얻기 위하여, 5마리의 마우스에 한 마리당 100 ㎍의 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질(R&D Systems)과 동량의 완전 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant)를 혼합하여 4-6 주된 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하였다. 2주 후에 상기와 동일한 방법으로 상기 항원으로 사용된 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 앞서 주사한 양의 절반인 50 ㎍을 동량의 불완전 프로인드 어주번트(incomplete Freund's adjuvant)과 혼합하여 마우스의 복강 내에 주사하였다. 일주일 후 마지막 부스팅(boosting)이 수행되고 3일 후에 상기 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 1/1000로 PBS에 희석하여 ELISA로 c-Met을 인지하는 항체의 역가가 증가됨을 확인하였다. 상기의 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 하기의 세포융합과정을 수행하였다.

1.1.2. 세포 융합 및 하이브리도마의 제조

세포융합 실험 3일 전에 50 ㎍의 PBS에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질 혼합물을 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하고, 면역화 된 마우스를 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하였다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양 배지(DMEM, GIBCO, Invitrogen)와 혼합하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 상기 현탁액을 원심분리하여 세포층을 회수하였다. 상기 얻어진 비장세포 1x10⁸개와 골수종세포(Sp2/0) 1x10⁸개를 혼합한 다음, 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 상기 원심분리된 침전물을 천천히 분산시키고, 배양 배지(DMEM)에 들어있는 45%(w/v) 폴리에틸렌글리콜(PEG)(1 ㎖)을 처리하고, 37 ℃에서 1분 동안 유지시킨 후, 배양 배지(DMEM) 1 ㎖을 첨가하였다. 이후 배양배지(DMEM) 10 ㎖을 1분 동안 첨가하고, 37℃의 물에서 5분 동안 방치한 후 50 ㎖로 맞추어 다시 원심분리하였다. 세포 침전물을 분리 배지(HAT 배지)에 1~2x10⁵/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96-웰(well) 플레이트에 0.1 ㎖씩 분주한 후 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하여 하이브리도마 세포군을 제작하였다.

1.1.3. c- Met 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별

상기 참고예 1.1.2에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 c-Met 단백질에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질과 인간의 Fc 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 분석 방법을 통하여 스크리닝하였다.

마이크로타이터 플레이트에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 한 웰당 각각 50 ㎕ (2 ug/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. c-Met이 아닌 Fc에 결합되는 항체를 선별하여 제외시키기 위하여 인간의 Fc 단백질을 위와 동일한 방법으로 플레이트 표면에 부착시켰다.

상기 참고예 1.1.2에서 얻어진 하이브리도마 세포의 배양액을 상기 준비된 각각 웰에 50 ㎕씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(TBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응 정도는 ELISA Reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.

위와 같은 반응 정도 확인에 의하여, 인간의 Fc에는 결합되지 않고, 인간의 c-Met 단백질에만 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 반복하여 선별하였다. 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 1개의 클론을 최종적으로 얻었다. 최종 선별된 단일클론 항체 생산 하이브리도마를 2009년 10월 6일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 대한민국 서울 종로구 연건동에 소재하는 한국 세포주연구재단에 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00220를 부여받았다 (한국 공개특허 제2011-0047698 참조).

1.1.4. 단일클론 항체의 생산 및 정제

상기 참고예 1.1.3에서 얻은 하이브리도마 세포를 무혈청 배지에서 배양하고 배양액으로부터 단일클론 항체를 생산 정제하였다.

먼저 10%(v/v) FBS가 포함된 배양 배지(DMEM) 배지 50 ㎖에서 배양된 상기 하이브리도마 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 20 ㎖ PBS로 2회 이상 세척하여 FBS가 제거된 상태에서, 상기 세포 침전물을 배양 배지(DMEM) 배지 50 ㎖에 재현탁시킨 후, 3일 동안 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.

이후, 원심분리하여, 항체를 생산하는 세포를 제거하고 항체들이 분비된 배양액을 분리하여, 4℃에 보관하거나 바로 모아서 항체의 분리 정제에 사용하였다. 친화성 칼럼(Protein G agarose column; Pharmacia, USA)을 장착한 AKTA 정제 기기(GE Healthcare)를 이용하여 상기 준비된 배양액 50 ㎖ 내지 300 ㎖로부터 항체를 순수 정제한 후, 단백질 응집용 필터(Amicon)를 사용하여 PBS로 상층액을 치환하여 정제된 항체를 보관하고, 이후의 실시예에 사용하였다.

1.2. c- Met 에 대한 키메릭 항체 chAbF46 의 제작

일반적으로 마우스 항체는 치료 목적으로 인간에게 주입되었을 때 면역거부반응(immunogenicity)을 보일 가능성이 높으므로, 이를 해결하기 위하여, 상기 참고예 1.1.4에서 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터, 항원 결합에 관련된 변이 영역(variable region)을 제외한 불변영역(constant region)을 인간 IgG1 항체의 서열로 치환하는 키메릭 항체 chAbF46을 제작하였다.

중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-TGA-XhoI'(서열번호 38)로, 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI-signal sequence-VL- BsiWI-CL-TGA-XhoI'(서열번호 39)로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 38)을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 39)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 키메릭 항체의 발현을 위한 중쇄를 포함하는 벡터 및 경쇄를 포함하는 벡터를 각각 구축하였다.

상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 Freestyle^TM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x10⁵cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x10⁶cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. Freestyle^TM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 Freestyle^TM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO₂ _,130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.

이후, 10%(v/v) FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 5시간 동안 배양한 다음, FBS가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 48시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액을 각각 100 ml 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출시켰다. 얻어진 용출물을 PBS 버퍼로 교환하여 최종적으로 키메릭 항체 AbF46(이하, chAbF46로 명명함)을 정제하였다.

1.3. 키메릭 항체 chAbF46 으로부터 인간화 항체 huAbF46 의 제작

1.3.1. 중쇄의 인간화( Heavy chain humanization )

H1-heavy 및 H3-heavy 2종의 디자인을 위하여, 우선 Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 상기 참고예 1.2에서 정제된 마우스 항체 AbF46의 VH 유전자와 가장 상동성이 높은 인간의 생식선(germline) 유전자를 분석하였다. 그 결과, VH3-71이 아미노산 레벨에서 83%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR 부분이 VH3-71의 골격(framework)에 도입되도록 디자인하였다. 이때, 30번(S→T), 48번(V→L), 73번(D→N), 78번(T→L) 아미노산은 원래 마우스 AbF46 항체의 아미노산 서열로 back-mutation 하였다. 이후, H1은 추가로 83번(R→K)과 84번(A→T) 아미노산에 돌연변이를 주어 최종적으로 H1-heavy(서열번호 40)와 H3-heavy(서열번호 41)를 구축하였다.

H4-heavy의 디자인을 위하여 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, AbF46 항체의 마우스 골격 서열과 서열이 매우 유사함과 동시에, 기존의 가장 안정하다고 알려진 VH3 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 도입하였다. 이를 통하여 H4-heavy (서열번호 42)를 구축하였다.

1.3.2. 경쇄의 인간화( Light chain humanization )

H1-light(서열번호 43) 및 H2-light(서열번호 44) 2종의 디자인을 위하여, Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여, 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석하였다. 그 결과, VK4-1이 아미노산 레벨에서 75%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H1-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하였으며, H2-light는 49번 아미노산(Y→I) 1개만을 back-mutation 하여 구축하였다.

H3-light(서열번호 45)의 디자인을 위하여, Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석한 결과 중, 상기 VK4-1 이외에 VK2-40을 선정하였다. 마우스 항체 AbF46 VL과 VK2-40은 아미노산 레벨에서 61%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H3-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하여 구축하였다.

H4-light(서열번호 46)의 디자인을 위하여, 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, 기존의 가장 안정하다고 알려진 Vk1 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 도입하였다. 이때, H4-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 추가로 back-mutation 하여 구축하였다.

이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(H1-heavy; 서열번호 47, H3-heavy; 서열번호 48, H4-heavy; 서열번호 49)을 pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit 에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(H1-light; 서열번호 50, H2-light; 서열번호 51, H3-light; 서열번호 52, H4-light; 서열번호 53)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여, 클로닝함으로써, 인간화 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 인간화 항체 AbF46(이하, huAbF46로 명명함)을 정제하였다. 한편, 이후 실시예에서 사용한 인간화 항체 huAbF46의 중쇄, 경쇄 조합은 H4-heavy (서열번호 42) 및 H4-light(서열번호 46)이다.

1.4. huAbF46 항체의 scFv 라이브러리 제작

huAbF46 항체의 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위를 이용하여 huAbF46 항체의 scFv를 제작하기 위한 유전자를 디자인하였다. 각각의 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위를 'VH-링커-VL'의 형태가 되도록 하고, 상기 링커는 'GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS'(서열번호 54)의 아미노산 서열을 가지도록 디자인하였다. 이렇게 디자인된 huAbF46 항체의 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 55)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였으며, 이를 발현시키기 위한 벡터를 서열번호 56에 나타내었다.

이후, 상기 벡터로부터 발현된 결과물을 분석하여, c-Met에 특이적인 결합력을 보임을 확인하였다.

1.5. 친화도 성숙( affinity maturation )을 위한 라이브러리 유전자의 제작

1.5.1. 표적 CDR 의 선정 및 프라이머 제작

huAbF46 항체의 친화도 성숙(affinity maturation)을 위하여 6개의 상보성 결정 부위(complementary determining region, CDR)를 상기 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터 'Kabat numbering'에 의하여 정의하였으며, 각각의 CDR은 하기 표 2와 같다.

CDR	아미노산 서열
CDR-H1	DYYMS(서열번호 1)
CDR-H2	FIRNKANGYTTEYSASVKG(서열번호 2)
CDR-H3	DNWFAY(서열번호 3)
CDR-L1	KSSQSLLASGNQNNYLA(서열번호 10)
CDR-L2	WASTRVS(서열번호 11)
CDR-L3	QQSYSAPLT(서열번호 12)

항체 CDR의 무작위 서열 도입을 위하여 다음과 같이 프라이머를 제작하였다. 기존의 무작위 서열 도입 방식은 돌연변이를 주고자 하는 부위에 동일한 비율의 염기 (25% A, 25% G, 25% C, 25% T)가 도입되도록 N 코돈을 이용하였으나, 본 실시예에서는 huAbF46 항체의 CDR에 무작위 염기를 도입하기 위하여, 각 CDR의 아미노산을 코딩하는 3개의 야생형(wild-type) 뉴클레오타이드 중 첫번째와 두번째 뉴클레오타이드의 85%는 그대로 보존하고, 나머지 3개의 염기를 각각 5%씩 도입하는 방식을 취하였다. 또한, 세 번째 뉴클레오타이드는 동일하게(33% G, 33% C, 33% T)가 도입되도록 프라이머를 디자인하였다.

1.5.2. huAbF46 항체의 라이브러리 제작 및 c- Met 에 대한 결합력 확인

CDR의 무작위 서열 도입을 통한 항체 라이브러리 유전자의 구축은 상기 참고예 1.5.1과 같은 방법으로 제작된 프라이머를 이용하여 수행하였다. 주형으로 huAbF46 항체의 scFv를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 이용하여, 2개의 PCR 절편을 제작하고, 이를 중복 확장 중합효소연쇄반응(overlap extension PCR) 방법을 통하여, 원하는 CDR만 각각 돌연변이된 huAbF46 항체의 scFv 라이브러리 유전자를 확보하여 제작된 6개의 CDR을 각각 표적으로 하는 라이브러리들을 구축하였다.

이렇게 제작된 라이브러리는 야생형과 각 라이브러리의 c-Met에 대한 결합력을 확인하였으며,　각각의 라이브러리는 야생형에 비하여 c-Met에 대한 결합력이 대부분 낮아지는 경향을 보였으나, 일부 c-Met에 대한 결합력이 유지되는 돌연변이들을 확인하였다.

1.6. 제작된 라이브러리로부터 친화도가 개선된 항체의 선별

상기 구축된 라이브러리로부터 c-Met에 대한 라이브러리의 결합력을 향상시킨 후, 각각의 개별 클론으로부터 scFv의 유전자 서열을 분석하였다. 확보된 유전자 서열은 각각 하기 표 3과 같으며, 이를 IgG 형태로 변환하였다. 하기 클론 중에서, L3-1, L3-2, L3-3, L3-5으로부터 생산된 4종의 항체를 선별하여 후속 실험을 수행하였다.

클론 이름	도출된 라이브러리	CDR 서열
H11-4	CDR-H1	PEYYMS(서열번호 22)
YC151	CDR-H1	PDYYMS(서열번호 23)
YC193	CDR-H1	SDYYMS(서열번호 24)
YC244	CDR-H2	RNNANGNT(서열번호 25)
YC321	CDR-H2	RNKVNGYT(서열번호 26)
YC354	CDR-H3	DNWLSY(서열번호 27)
YC374	CDR-H3	DNWLTY(서열번호 28)
L1-1	CDR-L1	KSSHSLLASGNQNNYLA(서열번호 29)
L1-3	CDR-L1	KSSRSLLSSGNHKNYLA(서열번호 30)
L1-4	CDR-L1	KSSKSLLASGNQNNYLA(서열번호 31)
L1-12	CDR-L1	KSSRSLLASGNQNNYLA(서열번호 32)
L1-22	CDR-L1	KSSHSLLASGNQNNYLA(서열번호 33)
L2-9	CDR-L2	WASKRVS(서열번호 34)
L2-12	CDR-L2	WGSTRVS(서열번호 35)
L2-16	CDR-L2	WGSTRVP(서열번호 36)
L3-1	CDR-L3	QQSYSRPYT(서열번호 13)
L3-2	CDR-L3	GQSYSRPLT(서열번호 14)
L3-3	CDR-L3	AQSYSHPFS(서열번호 15)
L3-5	CDR-L3	QQSYSRPFT(서열번호 16)
L3-32	CDR-L3	QQSYSKPFT(서열번호 37)

1.7. 선별된 항체의 IgG 로의 변환

선별된 4종의 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-XhoI'(서열번호 38)로 구성되며, 중쇄의 경우 친화도 성숙 후에 항체의 아미노산이 변경되지 않았으므로, huAbF46 항체의 중쇄를 그대로 사용하였다. 다만, 힌지 영역(hinge region)은 인간 IgG1의 힌지가 아닌 U6-HC7 힌지(서열번호 57) 로 치환하였다. 경쇄는 'EcoRI-signal sequence-VL-BsiWI-CL-XhoI'로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였으며, 친화도 성숙 후에 선별된 상기 4종 항체의 경쇄 가변 부위를 포함하여 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 58 내지 서열번호 61)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 38)을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(L3-1 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 58, L3-2 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 59, L3-3 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 60, L3-5 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 61)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 친화력 성숙된 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 친화력 성숙된 4종의 항체(이하, huAbF46-H4-A1(L3-1 유래), huAbF46-H4-A2 (L3-2 유래), huAbF46-H4-A3 (L3-3 유래), 및 huAbF46-H4-A5(L3-5 유래)로 명명함)를 정제하였다.

1.8. 불변영역 및/또는 힌지영역이 치환된 huAbF46 - H4 -A1의 제조

상기 참고예 1.7에서 선별된 4종의 항체 중에서, c-Met과의 결합친화도가 가장 높고, Akt 인산화 및 c-Met 분화 정도가 가장 낮은 것으로 측정된 huAbF46-H4-A1을 대상으로, 힌지영역 또는 불변영역 및 힌지영역이 치환된 항체를 제작하였다.

huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변 부위, U6-HC7 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변 부위 및 인간의 카파(kappa) 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(U6-HC7)으로; huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변 부위, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변 부위 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(IgG2 hinge)로; huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변 부위, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변 부위 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)로 각각 명명하였다. 또한, 한편, 상기 3종의 항체는 생산량 증대를 위하여 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄의 36번 히스티딘 (histidine)을 모두 티로신 (tyrosine)으로 치환하였다.

상기 3종 항체를 제작하기 위해, huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변 부위, U6-HC7힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 62)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 63), huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변 부위, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 64)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 65), huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변 부위, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 66)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 67), 36번 히스티틴이 티로신으로 치환된 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변 부위 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 68)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 69)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편을 삽입하여, 상기 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 3종의 항체(huAbF46-H4-A1(U6-HC7), huAbF46-H4-A1(IgG2 hinge), huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc))를 정제하였다. 이 중에서 본 발명에 따른 항 c-Met 항체를 대표하여 huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)을 선택하여 하기의 실시예에 사용하였으며, 편의상 상기 항체를 L3-1Y/IgG2로 명명하였다.

참고예 2: 항 c- Met /항 EGFR 이중 특이 항체의 제작

2.1. 항 EGFR scFv 의 제작

EGFR에 결합하는 항 EGFR scFv는 서열번호 115 중쇄 가변 영역과 서열번호 116의 경쇄 가변 영역 사이에 (GGGGS)₃ 펩타이드 링커를 넣어서 제작하였다. 구체적으로, 자동화 유전자 합성(㈜바이오니아에 의뢰)으로 인간화 항 EGFR 항체 중쇄 가변 영역 (서열번호 115) 코딩 DNA 서열(서열번호 119)과 경쇄 가변 영역(서열번호 116) 코딩 DNA 서열(서열번호 120)에 (GGGGS)₃ linker peptide 코딩 DNA 서열을 첨가하여 항 EGFR 항체의 scFv 코딩 DNA를 합성하였다. 이와 같이 제작된 항 EGFR scFv 항체를 항 EGFR 항체 E-2로 명명하였다.

상기 제작된 항 EGFR 항체의 scFv의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 경쇄 가변 영역이 아미노산 서열, 및 이들의 코딩 염기서열을 아래의 표 4에 정리하였다 (굵은 글씨로 표시한 부분이 CDR 부위이며, 순서대로 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 또는 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3이다):

	항 EGFR 항체 E-2의 중쇄가변영역	항 EGFR 항체 E-2의 경쇄가변영역
아미노산서열	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSGISHSSGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDATPRPLKPFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 115)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNDVSWYQQLPGTAPKLLIYDDNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDASLNAYVFGGGTKLTVLG (서열번호 116)
암호화 염기서열	GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAATTATGATATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGGATCTCTCATAGTAGTGGTAGTAAATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAGATGCTACTCCGCGTCCGCTGAAGCCTTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA (서열번호 119)	CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTACTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAATAATGATGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGATGATAATAAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAATCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTTCTTGGGATGCTAGCCTGAATGCTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTAGGC (서열번호 120)

한편, 중쇄 가변 영역(서열번호 115)의 44번 아미노산 G를 C로, 경쇄 가변 영역 (서열번호 116)의 100번 G를 C로 치환하여 사용한 것을 제외하고, 상기와 동일한 방법으로 변형된 항 EGFR scFv (중쇄 가변 영역: 서열번호 117; 경쇄 가변 영역: 서열번호 118)를 제작하였다. 상기 항체 내 아미노산 위치는 kabat numbering에 따랐다. 이와 같은 변형(치환)에 의하여 scFv의 안정성이 증진될 수 있다.

<서열번호 117: 변형된 항 EGFR 항체 E-2의 중쇄 가변 영역 >

<서열번호 118: 변형된 항 EGFR 항체 E-2의 경쇄 가변 영역 >

이와 같이 얻어진 변형된 항 EGFR scFv (서열번호 117 및 서열번호 118 포함)를 하기의 이중 특이 항체 제작에 사용하였다.

2.2. 항 c- Met /항 EGFR 이중 특이 항체의 제작

상기 참고예 1에서 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y-IgG2의 Fc의 c-말단에 상기 실시예 1에서 제작된 변형된 항 EGFR scFv(서열번호 117 및 서열번호 118 포함)를 융합하였다. 그 융합과정은 아래와 같다.

Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 참고예 1에서 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y-IgG2의 중쇄에 해당하는 염기서열(서열번호 66)을 갖는 DNA 절편을 삽입하고, pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 항 c-Met 항체 L3-1Y-IgG2의 경쇄에 해당하는 염기서열(서열번호 68)을 갖는 DNA 절편을 삽입하였다. 이후, pcDNA^TM3.3 에 삽입된 L3-1Y-IgG2의 Fc의 c-말단에 상기 실시예 1에서 제작된 항 EGFR scFv 코딩 DNA를 (G4S)2로 이루어진 10개의 아미노산 길이를 가진 linker pepetide의 코딩 DNA 서열을 사용하여 융합함으로써 이중항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 구축된 벡터를 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭하였으며, 임시발현은 Freestyle^TM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x10⁵cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x10⁶cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. Freestyle^TM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=3:2 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 Freestyle^TM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO₂ _,130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체를 정제하였다.

상기 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y-IgG2의 c-말단에 변형된 항 EGFR scFv가 융합된 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체를 ME22S로 명명하였다.

실시예 1: 항 c- Met 항체에 의한 Hsp90 - Met 간 결합의 분리 기작 확인

H1993 폐암세포주(ATCC, CRL-5909)는 상기 참고예에서 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2 또는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 ME22S 처리 시 항암효능을 보이는 세포주인 반면, H1373 폐암세포주 (ATCC, CRL-5866)는 L3-1Y/IgG2 또는 ME22S에 반응하지 않는 세포주이다.

이를 확인하기 위하여, H1993 폐암세포주(ATCC, CRL-5909), 및 H1373 폐암세포주(ATCC, CRL-5866)를 RPMI1640 배지 (#11875-093, Gibco)에 10%(v/v) FBS와 1%(v/v) Penicilin-Streptomycin을 첨가하여 5% CO₂ 및 37℃ 조건에서 배양하였다. 세포 증식 분석(Cell proliferation assay)을 위하여, 각 세포주를 5x10³ cell/well의 농도로 96 웰 플레이트에 분주하고, 24시간 후 항체(L3-1Y/IgG2 또는 ME22S)를 0nM, 0.018nM, 0.64nM, 3.2nM, 또는 16nM의 양으로 각각 처리하였다. 비교를 위하여, L3-1Y/IgG2 또는 ME22S를 대신하여 시판중인 EGFR 저해제인 Erbitux (#ET509081213, Merck)를 사용하여 동일한 시험을 수행하였다. 항체 처리 후 72시간에 CellTiter Glo assay(Promega, G7573)를 통해 세포수 변화를 측정하였다. 이 방법은 살아있는 세포의 대사를 반영하는 ATP 양을 측정하는 방식이다. CellTiter Glo assay 내에는 세포 내의 ATP와 반응하면 luminoscence를 방출하는 기질이 첨가되어 있다. 이 luminoscence를 측정함으로써 살아있는 세포의 수를 정량할 수 있다.

상기 얻어진 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서와 같이 H1993 세포주에서는 L3-1Y/IgG2 또는 ME22S이 암 세포 성장 억제 효능을 나타내지만, H1373 세포주에서는 암세포 성장 억제 효능이 나타나지 않음을 확인할 수 있다.

L3-1Y/IgG2 또는 ME22S이 효능을 보이는 H1993 폐암세포주에 L3-1Y/IgG2 또는 ME22S를 처리할 경우, Met과 Hsp90과의 결합이 분리됨을 확인하기 위하여, Met 단백질을 사용하여 Immunoprecipitation 후 bead에 붙은 단백질 중 Hsp90이 있는지 western blot으로 확인하였다. 구체적으로, H1993 세포에서의 항 c-Met 항체의 Hsp90와 Met 간 결합 분리 유도 여부를 확인하기 위하여, 공면역침전(co-immunoprecipitation)에 의하여 Hsp90-Met 결합 단백질을 분리 정제하여 면역블라팅으로 정량하였다. 상기 세포에 항체를 10nM의 농도로 30분 동안 처리한 후, 세포를 분리해내어 용해 버퍼 Complete lysis-M (Roche, 04719956001)를 사용하여 단백질 추출물을 얻었다. 이 추출물 500ug을 c-Met 항체 컨쥬게이트된 A/G 아가로오스 비드(Pierce)와 함께 풀-다운 (pull-down)시키고, 항-Hsp90 항체(cell signaling)를 사용하여 면역블라팅하여 Met과 Hsp90의 결합을 확인하였다.. 비교를 위하여, L3-1Y/IgG2 또는 ME22S이 효능을 보이지 않는 H1373 세포주에 대해서도 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 확인되는 바와 같이, H1993 폐암세포주에서는 L3-1Y/IgG2 또는 ME22S 처리시에 Met과 Hsp90과의 결합이 분리됨을 확인할 수 있으나, H1373 폐암세포주에서는 L3-1Y/IgG2 또는 ME22S 처리에 의한 Hsp90-Met 결합 분리 기작을 확인할 수 없었다.

실시예 2: 항 c- Met 항체에 대한 저항성 획득시 Hsp90 양적 증가 확인

항 c-Met 항체의 반복 투여로 저항성이 유도된 경우의 Hsp90 단백질의 양적 변화를 측정하기 위해, L3-1Y/IgG2의 반복 투여로 L3-1Y/IgG2 항체에 대해 저항성이 유도된 EBC1 (JCRB 0820) 및 H1993 (ATCC, CRL-5909) 세포주를 제작하였다. 저항성이 유도되기 전에는 두 세포주 모두 L3-1Y/IgG2에 대하여 반응성을 나타낸다. 상기 저항성 획득 EBC1 세포주 및 H1993 세포주의 제작 과정은 다음과 같다: EBC1 (JCRB 0820) 및 H1993 (ATCC, CRL-5909) 세포에 각각 L3-1Y/IgG2 항체를 처리량을 늘리면서 3개월 이상 처리하였다. L3-1Y/IgG2 항체의 처리량은 초기 처리 농도 1 ug/ml부터 시작하여 저항성이 나타날 때까지 10 ug/ml까지 증가시켰다. L3-1Y/IgG2 항체 저항성 획득을 확인하기 위하여, 저항성 획득 클론에 L3-1Y/IgG2 항체를 다양한 양(도 8 및 도 9 참조)으로 처리하고, 항체 처리 72시간 후에 CellTiter Glo assay(Promega, G7573)를 통해 세포수 변화를 측정하였다

상기 얻어진 결과를 도 8 (EBC1 세포) 및 도 9(H1993 세포)에 나타내었다. 도 8 및 도 9에서 확인되는 바와 같이, EBC1#7, H1993-Re9, 및 H1993-Re21 클론에서 L3-1Y/IgG2 항체에 대한 저항성이 획득된 것을 확인할 수 있다이와 같이 얻어진 L3-1Y/IgG2에 대한 저항성이 획득된 세포주를 EBC1-Re7 (EBC1-L3-1Y/IgG2 resistant cell clone #7), H1993-Re9 (H1993-L3-1Y/IgG2 resistant cell clone #9) 및 H1993-Re21(H1993-L3-1Y/IgG2 resistant cell clone #21)로 각각 명명하였다.

상기 저항성이 획득된 세포주에서의 Hsp90의 양을 측정하였다. 구체적으로 EBC1, EBC1-#7, H1993, H1993-RE #9와 H1993-RE #21 를 각각 2 x 10⁵ 세포/ml의 양으로 60mm 플레이트에 분주하고, 24시간 후 단백질로 lysis하여 (Complete lysis-M (Roche, 04719956001) 이용) 세포 용해물을 얻은 후, 웨스턴 블라팅으로 Hsp90의 단백질 양 정도를 측정하였다.

상기 얻어진 단백질 양을 저항성이 획득되기 전의 세포와 비교하여 도 3에 나타내었다. 도 3에서 GAPDH (housekeeping gene)은 대조군으로 사용되었다. 도 3에 나타난 바와 같이, EBC1 및 H1993의 두 세포주 모두에서, 저항성 획득 전과 비교하여, 저항성 획득 후의 Hsp90 단백질 수준이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있다.

실시예 3: 항 c- Met 항체에 대한 반응군과 비반응군의 Hsp90 수준 비교

L3-1Y/IgG2의 단독 투여시 효능이 나타나는 세포주(L3-1Y/IgG2-responsive cells)에는 앞서 사용된 EBC1 및 H1993 폐암세포주 이외에 MKN45 (JCRB 0254) 위암 세포주, Hs746T (ATCC, HTB-135) 위암세포주 등이 있으며, L3-1Y/IgG2의 단독 투여시 효능이 나타나지 않는 세포주(L3-1Y/IgG2-non-responsive cells)에는 앞서 사용된 H1373 폐암 세포주 이외에도, HCC1806 (ATCC, CRL-2335) 유방암 세포주, Caki-1 (ATCC, HTB-46) 신장암 세포주, SKBR3 (ATCC, HTB-30), BT474 (ATCC, HTB-20) 유방암세포주, HT-29 (ATCC, HTB-38), LoVo (ATCC, CCL-229), HCT116 (ATCC, CCL-247), SW620 (ATCC, CCL-227), Ls174T (ATCC, CL-188) 대장암 세포주 등이 있다.

이들 세포주에서 protein lysates를 추출하여 동량을 취하여 western blot 실험을 수행하였다. 구체적으로, 위 세포들을 각각 2 x 10⁵ 세포/ml의 양으로 60mm 플레이트에 분주하고, 24시간 후 단백질로 lysis하여 (Complete lysis-M (Roche, 04719956001) 이용) 세포 용해물을 얻은 후, 웨스턴 블라팅으로 Hsp90의 단백질 양 정도를 측정하였다.. 상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, L3-1Y/IgG2 비반응군(L3-1Y/IgG2-non-responsive cells group)과 비교하여, L3-1Y/IgG2 반응군(L3-1Y/IgG2-responsive cells group)에서는 Hsp90 단백질 수준이 현저하게 낮은 반면 c-Met 수준은 현저하게 높은 것을 확인할 수 있다.

실시예 4: Hsp90 발현 저해시의 항 c- Met 항체 또는 항 c- Met /항 EGFR 이중 특이 항체의 효능 확인

항 c-Met 항체와 Hsp90 siRNA의 병용 투여의 효능을 H1373 세포주 및 H1993-L3-1Y/IgG2 resistant cell clone #9 세포를 이용하여 시험하였다.

5000개의 H1373 세포(ATCC, CRL-5866) 또는 5000개의 H1993-L3-1Y/IgG2 resistant cell clone #9 세포(실시예 2 참조) 각각 Hsp90 siRNA (siHsp90으로 표시; 20nM, Dharmacon의 SMART pool 사용, catalog number: L-005186-00-0005)를 reverse transfection하여 96-well plate에 분주하고 배양하였다 (배지: 10% FBS in RPMI 1640 (GIBCO), 배양 온도: 37℃). 상기 reverse transfection은 lipofectamine RNAi max (invitrogen)을 사용하여 수행하였으며, opti-MEM (Gibco)에 희석한 10~20uM의 siRNA와 opti-MEM (Gibco)에 희석한 lipofectamine RNAi max를 미리 15분간 상온에서 인큐베이션하여, 상기 각각의 세포 5000개/well과 섞어서 reverse transfection 시켰다. 24시간 후, L3-1Y/IgG2 를 처리하였으며, 항체 처리 후 72시간 이후에 CellTiter Glo assay를 통해 세포수 변화를 측정하였다(실시예 1 참조). Hsp90 siRNA의 control로 negative control siRNA (siNEG로 표시; Dharmacon의 SMARTpool 사용, catalog number: D-001206-14-20)를 처리하였으며 L3-1Y/IgG2 는 10ug/ml로부터 1/5로 dilution하여 처리하였다.

상기 얻어진 결과를 도 5a에 나타내었다. 도 5a에 나타난 바와 같이, H1373 및 H1993-Re9 세포에서 L3-1Y/IgG2 와 Hsp90 siRNA와 병용 투여시, 암세포 성장 억제 효능이 저항성 획득 세포주로까지 확대됨을 확인할 수 있다.

한편, H1993(ATCC, CRL-5909), H1373(ATCC, CRL-5866), 및 Caki-1(ATCC, HTB-46) 세포를 각각 2 x 10⁵ 세포/ml의 양으로 60mm 플레이트에 분주하고, 24시간 후 단백질로 lysis하여 (Complete lysis-M (Roche, 04719956001) 이용) 얻은 후, 웨스턴 블라팅으로 Hsp90의 단백질 양 정도를 측정하여 그 결과를 도 5b에 나타내었다. 도 5b에서 보여지는 바와 같이, c-Met 저해제가 효능을 보이는 H1993 세포와 비교하여, c-Met 저해제가 효능을 보이지 못하는 H1373 및 Caki-1 세포에서의 Hsp90의 발현량이 현저히 많은 것을 알 수 있다.

실시예 5: Hsp90 저해제와 항 c- Met 항체 또는 항 c- Met /항 EGFR 이중 특이 항체와의 병용 투여시의 효능 확인

H1993-L3-1Y/IgG2 resistant cell clone #21 세포를 이용하여, 항 c-Met 항체 또는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체와 Hsp90 억제제의 병용 투여 효능을 확인하였다. 5000개의 H1993-L3-1Y/IgG2 resistant cell clone #21 세포를 96-well plate에 분주하고, 24시간 후 L3-1Y/IgG2 또는 ME22S와 Hsp90 억제제 SNX-2112 (Selleck chemical, S2639)를 처리하였으며, 항체 처리 후 72시간 이후에 CellTiter Glo assay를 통해 세포수 변화를 측정하였다 (실시예 1 참조). L3-1Y/IgG2 또는 ME22S는 50nM로부터 1/5로 dilution하여 처리하였으며, SNX-2112는 처리 농도를 10nM로 고정하여 처리하였다.

상기 얻어진 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, H1993-Re21 세포에 L3-1Y/IgG2 또는 ME22S와 Hsp90 억제제 병용 투여시, L3-1Y/IgG2 또는 ME22S의 암세포 성장 억제 효능이 저항성 획득 세포주로까지 확대됨을 확인할 수 있다.

실시예 6. Xenograft mouse model 을 이용한 Hsp90 수준 측정

L3-1Y/IgG2에 대한 반응성 여부에 따른 환자 유래 폐암 세포를 마우스에 이식한 xenograft model에서의 Hsp90 수준을 측정하였다. 각 환자 유래 폐암 세포를 마우스에 이식하여 환자 유래 암세포(폐암세포)가 이식된 xenograft 마우스 모델을 제작하였다(Oncotest GmbH, Freibrug Germany에 의뢰). 환자유래 폐암세포(비소세포성폐암 (NSCLC))인 LXFA 526, LXFA 923, LXFA 1647, 및 LXFA 2201 세포를 각각 NMRI nude 마우스 (4-6주령, female; Harlan)에 s.c로 주입하여 xenograft 마우스 모델을 제작하였다. 이 중에서 LXFA 526 및 LXFA 923은 L3-1Y/IgG2에 대하여 반응성을 보이는 세포이고, LXFA 923 및 LXFA 2201은 L3-1Y/IgG2에 대하여 반응성을 보이지 않는 세포이다. 상기 xenograft 마우스 모델의 제작 방법은 Oncotest SOP "Subcutaneous implantation" 방법을 따랐다. 마우스는 그룹당 5 마리씩을 사용하였다.

구체적으로, 조직샘플을 Lysis buffer와 함께 넣고 갈아서 단백질을 추출하였으며(Complete lysis-M (Roche, 04719956001) 이용), 웨스턴 블라팅으로 Hsp90 및 c-Met의 단백질 양 정도를 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, L3-1Y/IgG2에 대한 비반응군인 LXFA 2201의 경우, Met의 수준이 L3-1Y/IgG2에 대한 반응군인 LXFA 526보다 높음에도 불구하고 L3-1Y/IgG2에 대하여 반응을 나타내지 않은 이유가 높은 Hsp90의 수준 때문임을 확인할 수 있다.

한국세포주연구재단

KCLRFBP00220

20091006

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Biomarker Hsp90 for predicting effect of a c-Met inhibitor <130> DPP20140896KR <160> 120 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of AbF46 <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of AbF46 <400> 2 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of AbF46 <400> 3 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X is Pro or Ser or absent <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> X is Glu or Asp <400> 4 Xaa Xaa Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> X is Asn or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> X is Ala 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<222> (1008)..(1349) <223> huAbF46 VL <220> <221> misc_difference <222> (1350)..(1355) <223> EcoRI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (1356)..(1397) <223> V5 epitope <220> <221> misc_difference <222> (1398)..(1442) <223> (G4S)3 linker <220> <221> misc_difference <222> (1443)..(1649) <223> Aga2 <220> <221> misc_difference <222> (1650)..(1652) <223> TGA(stop codon) <220> <221> misc_difference <222> (1653)..(1660) <223> PmeI restriction site <400> 56 acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt 60 cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120 acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac 180 ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga 240 ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300 taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360 ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac 420 ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac cccggatcgg 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ttgacttttg 1320 gtcaaggtac aaaggtcgaa atcaagagag aattcggtaa gcctatccct aaccctctcc 1380 tcggtctcga ttctacgggt ggtggtggat ctggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 1440 ctcaggaact gacaactata tgcgagcaaa tcccctcacc aactttagaa tcgacgccgt 1500 actctttgtc aacgactact attttggcca acgggaaggc aatgcaagga gtttttgaat 1560 attacaaatc agtaacgttt gtcagtaatt gcggttctca cccctcaaca actagcaaag 1620 gcagccccat aaacacacag tatgtttttt gagtttaaac ccgctgatct gataacaaca 1680 gtgtagatgt aacaaaatcg actttgttcc cactgtactt ttagctcgta caaaatacaa 1740 tatacttttc atttctccgt aaacaacatg ttttcccatg taatatcctt ttctattttt 1800 cgttccgtta ccaactttac acatacttta tatagctatt cacttctata cactaaaaaa 1860 ctaagacaat tttaattttg ctgcctgcca tatttcaatt tgttataaat tcctataatt 1920 tatcctatta gtagctaaaa aaagatgaat gtgaatcgaa tcctaagaga attgggcaag 1980 tgcacaaaca atacttaaat aaatactact cagtaataac ctatttctta gcatttttga 2040 cgaaatttgc tattttgtta gagtctttta caccatttgt ctccacacct ccgcttacat 2100 caacaccaat aacgccattt aatctaagcg catcaccaac attttctggc gtcagtccac 2160 cagctaacat aaaatgtaag ctctcggggc tctcttgcct tccaacccag tcagaaatcg 2220 agttccaatc caaaagttca cctgtcccac ctgcttctga atcaaacaag ggaataaacg 2280 aatgaggttt ctgtgaagct gcactgagta gtatgttgca gtcttttgga aatacgagtc 2340 ttttaataac tggcaaaccg aggaactctt ggtattcttg ccacgactca tctccgtgca 2400 gttggacgat atcaatgccg taatcattga ccagagccaa aacatcctcc ttaggttgat 2460 tacgaaacac gccaaccaag tatttcggag tgcctgaact atttttatat gcttttacaa 2520 gacttgaaat tttccttgca ataaccgggt caattgttct ctttctattg ggcacacata 2580 taatacccag caagtcagca tcggaatcta gagcacattc tgcggcctct gtgctctgca 2640 agccgcaaac tttcaccaat ggaccagaac tacctgtgaa attaataaca gacatactcc 2700 aagctgcctt tgtgtgctta atcacgtata ctcacgtgct caatagtcac caatgccctc 2760 cctcttggcc ctctcctttt cttttttcga ccgaatttct tgaagacgaa agggcctcgt 2820 gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg acggatcgct 2880 tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg gaatttactc 2940 tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt ggattttaga aagtaaataa agaaggtaga 3000 agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta aaaaatttca acaaaaagcg 3060 tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta aatagatata cattcgatta 3120 acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg gtcttctaca cagacaagat 3180 gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa gataaaaggt agtatttgtt 3240 ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa aactattttt tctttaattt 3300 ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta aaaaatttaa attataatta 3360 tttttatagc acgtgatgaa aaggacccag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 3420 cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 3480 cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 3540 tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 3600 tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 3660 atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 3720 gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc 3780 aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 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agcagagcgc 4680 agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 4740 tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 4800 ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 4860 cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 4920 tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 4980 acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 5040 ggaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 5100 ttttgtgatg ctcgtcaggg gggccgagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 5160 tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 5220 attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 5280 cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 5340 ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 5400 aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg 5460 ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 5520 acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctcgg aattaaccct cactaaaggg 5580 aacaaaagct ggctagt 5597 <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> U6-HC7 hinge <400> 57 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 58 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-1 clone <400> 58 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtcagcagtc ctacagccgc ccgtacacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 59 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 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tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtgcacagtc ctacagccat ccgttctctt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 61 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-5 clone <400> 61 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtcagcagtc ctacagccgc ccgtttacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 62 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, U6-HC7 hinge and constant region of human IgG1 <400> 62 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Leu Gly 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ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720 agctgcgatt gccactgtcc tccatgtcca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 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caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg actcgag 1407 <210> 66 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG2 <400> 66 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 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<222> (751)..(753) <223> stop codon <220> <221> misc_difference <222> (754)..(759) <223> XhoI restriction site <400> 77 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gacattttga tgacccagtc tccatcctcc 120 ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccagc agaaaccagg acgatctcct 240 aaaatgctga taatttgggc atccactagg gtatctggag tccctgatcg cttcataggc 300 agtggatctg ggacggattt cactctgacc atcaacagtg tgcaggctga agatctggct 360 gtttattact gtcagcagtc ctacagcgct ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 420 gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 480 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 540 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 600 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 660 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 720 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tgactcgag 759 <210> 78 <211> 4170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding c-Met protein <400> 78 atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60 aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120 tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180 cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240 gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300 tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360 gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420 tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480 atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540 ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600 ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660 gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720 ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780 ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840 ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900 acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960 tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020 attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080 gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140 aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200 acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260 accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320 tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380 cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440 ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 1560 agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620 tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680 tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 1740 ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 1800 actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 1860 acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 1920 tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtggatcc tgtaataaca 1980 agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 2040 tacctaaaca gtgggaattc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 2100 agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 2160 gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 2220 gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 2280 acaggtgttg ggaaaaacct gaattcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 2340 gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 2400 tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 2460 ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 2520 tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 2580 aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 2640 agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 2700 ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 2760 ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacaggat tgattgctgg tgttgtctca 2820 atatcaacag cactgttatt actacttggg tttttcctgt ggctgaaaaa gagaaagcaa 2880 attaaagatc tgggcagtga attagttcgc tacgatgcaa gagtacacac tcctcatttg 2940 gataggcttg taagtgcccg aagtgtaagc ccaactacag aaatggtttc aaatgaatct 3000 gtagactacc gagctacttt tccagaagat cagtttccta attcatctca gaacggttca 3060 tgccgacaag tgcagtatcc tctgacagac atgtccccca tcctaactag tggggactct 3120 gatatatcca gtccattact gcaaaatact gtccacattg acctcagtgc tctaaatcca 3180 gagctggtcc aggcagtgca gcatgtagtg attgggccca gtagcctgat tgtgcatttc 3240 aatgaagtca taggaagagg gcattttggt tgtgtatatc atgggacttt gttggacaat 3300 gatggcaaga aaattcactg tgctgtgaaa tccttgaaca gaatcactga cataggagaa 3360 gtttcccaat ttctgaccga gggaatcatc atgaaagatt ttagtcatcc caatgtcctc 3420 tcgctcctgg gaatctgcct gcgaagtgaa gggtctccgc tggtggtcct accatacatg 3480 aaacatggag atcttcgaaa tttcattcga aatgagactc ataatccaac tgtaaaagat 3540 cttattggct ttggtcttca agtagccaaa ggcatgaaat atcttgcaag caaaaagttt 3600 gtccacagag acttggctgc aagaaactgt atgctggatg aaaaattcac agtcaaggtt 3660 gctgattttg gtcttgccag agacatgtat gataaagaat actatagtgt acacaacaaa 3720 acaggtgcaa agctgccagt gaagtggatg gctttggaaa gtctgcaaac tcaaaagttt 3780 accaccaagt cagatgtgtg gtcctttggc gtgctcctct gggagctgat gacaagagga 3840 gccccacctt atcctgacgt aaacaccttt gatataactg tttacttgtt gcaagggaga 3900 agactcctac aacccgaata ctgcccagac cccttatatg aagtaatgct aaaatgctgg 3960 caccctaaag ccgaaatgcg cccatccttt tctgaactgg tgtcccggat atcagcgatc 4020 ttctctactt tcattgggga gcactatgtc catgtgaacg ctacttatgt gaacgtaaaa 4080 tgtgtcgctc cgtatccttc tctgttgtca tcagaagata acgctgatga tgaggtggac 4140 acacgaccag cctccttctg ggagacatca 4170 <210> 79 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEMA domain of c-Met <400> 79 Leu His Glu His His Ile Phe Leu Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val 1 5 10 15 Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro 20 25 30 Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys 35 40 45 Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu 50 55 60 Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val 65 70 75 80 Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His Val Phe Pro His Asn His Thr Ala 85 90 95 Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu 100 105 110 Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val 115 120 125 Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr 130 135 140 Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp His Pro Leu His Ser Ile Ser Val 145 150 155 160 Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln 165 170 175 Ser Tyr Ile 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agaataatca ggttctgttc cataaactct ggattgcatt cctacatgga aatgcctctg 720 gagtgtattc tcacagaaaa gagaaaaaag agatccacaa agaaggaagt gtttaatata 780 cttcaggctg cgtatgtcag caagcctggg gcccagcttg ctagacaaat aggagccagc 840 ctgaatgatg acattctttt cggggtgttc gcacaaagca agccagattc tgccgaacca 900 atggatcgat ctgccatgtg tgcattccct atcaaatatg tcaacgactt cttcaacaag 960 atcgtcaaca aaaacaatgt gagatgtctc cagcattttt acggacccaa tcatgagcac 1020 tgctttaata ggacacttct gagaaattca tcaggctgtg aagcgcgccg tgatgaatat 1080 cgaacagagt ttaccacagc tttgcagcgc gttgacttat tcatgggtca attcagcgaa 1140 gtcctcttaa catctatatc caccttcatt aaaggagacc tcaccatagc taatcttggg 1200 acatcagagg gtcgcttcat gcaggttgtg gtttctcgat caggaccatc aacccctcat 1260 gtgaattttc tcctggactc ccatccagtg tctccagaag tgattgtgga gcatacatta 1320 aaccaaaatg gc 1332 <210> 83 <211> 1299 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding PSI-IPT domain of c-Met <400> 83 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 60 agacatttcc 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acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 960 ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 1020 tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 1080 aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 1140 agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 1200 ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 1260 ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacagga 1299 <210> 84 <211> 939 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding TyrKc domain of c-Met <400> 84 gtgcatttca atgaagtcat aggaagaggg cattttggtt gtgtatatca tgggactttg 60 ttggacaatg atggcaagaa aattcactgt gctgtgaaat ccttgaacag aatcactgac 120 ataggagaag tttcccaatt tctgaccgag ggaatcatca tgaaagattt tagtcatccc 180 aatgtcctct cgctcctggg aatctgcctg cgaagtgaag ggtctccgct ggtggtccta 240 ccatacatga aacatggaga tcttcgaaat ttcattcgaa atgagactca taatccaact 300 gtaaaagatc ttattggctt tggtcttcaa gtagccaaag gcatgaaata tcttgcaagc 360 aaaaagtttg tccacagaga cttggctgca agaaactgta tgctggatga aaaattcaca 420 gtcaaggttg ctgattttgg tcttgccaga gacatgtatg ataaagaata ctatagtgta 480 cacaacaaaa caggtgcaaa gctgccagtg aagtggatgg ctttggaaag tctgcaaact 540 caaaagttta ccaccaagtc agatgtgtgg tcctttggcg tgctcctctg ggagctgatg 600 acaagaggag ccccacctta tcctgacgta aacacctttg atataactgt ttacttgttg 660 caagggagaa gactcctaca acccgaatac tgcccagacc ccttatatga agtaatgcta 720 aaatgctggc accctaaagc cgaaatgcgc ccatcctttt ctgaactggt gtcccggata 780 tcagcgatct tctctacttt cattggggag cactatgtcc atgtgaacgc tacttatgtg 840 aacgtaaaat gtgtcgctcc gtatccttct ctgttgtcat cagaagataa cgctgatgat 900 gaggtggaca cacgaccagc ctccttctgg gagacatca 939 <210> 85 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of anti-c-Met antibody <400> 85 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 1 5 10 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 of anti-c-Met antibody <400> 86 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 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taaatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagatgct 300 actccgcgtc cgctgaagcc tttcgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgagc 360 tca 363 <210> 120 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coding nucleotide sequence of light chain variable region of anti-EGFR antibody <400> 120 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtactg gctcttcatc taatattggc aataatgatg tctcctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gatgataata agcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa atctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt tcttgggatg ctagcctgaa tgcttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta ggc 333

Claims

Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 포함하는 c-Met 저해제의 효능 예측용 조성물.
Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 포함하는 c-Met 저해제의 효능 검정용 조성물.
Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 포함하는 c-Met 저해제의 적용 대상 선별용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상호작용하는 물질은 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 결합하는 화학물질, 단백질, 펩타이드, 및 핵산 분자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, c-Met 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용 하는 물질을 추가로 포함하는, 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 c-Met 저해제는 c-Met의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 서열번호 73(EEPSQ)를 포함하는 연속하는 5개 이상의 아미노산을 인식 또는 결합하는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 조성물.
제6항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 부위;
서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
상기 중쇄 상보성 결정영역 및 경쇄 상보성 결정영역의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위의 조합
을 포함하는 것인, 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 c-Met 저해제는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체이고,
상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 c-Met 저해제는 c-Met의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 서열번호 73(EEPSQ)를 포함하는 연속하는 5개 이상의 아미노산을 인식 또는 결합하는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편인,
상기 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역; 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것인,
조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 c-Met 저해제는 크리조티닙(crizotinib; 3-[(1R)-1-(2,6-dichloro-3-fluorophenyl)ethoxy]-5-(1-piperidin-4-ylpyrazol-4-yl)pyridin-2-amine; PF-02341066), 카보잔티닙(cabozantinib; XL-184), 포레티닙(foretinib; E7050), PHA-665752, SU11274, SGX-523, PF-04217903, EMD 1214063, Golvatinib, INCB28060, MK-2461, 티반티닙(tivantinib; ARQ 197), NVP-BVU972, AMG458, BMS 794833, BMS 777607, MGCD-265, AMG-208, BMS-754807, JNJ-38877605, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 조성물.
환자로부터 얻은 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준, Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 변이 여부, 또는 Hsp90의 기능 이상 여부를 측정하는 단계를 포함하는, c-Met 저해제의 효능 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
환자로부터 얻은 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, c-Met 저해제의 효능 검정을 위한 정보를 제공하는 방법.
환자로부터 얻은 생물 시료 내의 Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준, Hsp90 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 변이 여부, Hsp90의 기능 이상 여부, 또는 이들 모두를 측정하는 단계를 포함하는, c-Met 저해제의 적용 대상 선별을 위한 정보를 제공하는 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, c-Met 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 c-Met 저해제는 c-Met의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 서열번호 73(EEPSQ)를 포함하는 연속하는 5개 이상의 아미노산을 인식 또는 결합하는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 방법.
제14항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 부위;
서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
상기 중쇄 상보성 결정영역 및 경쇄 상보성 결정영역의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위의 조합
을 포함하는 것인, 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 c-Met 저해제는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체이고,
상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 c-Met 저해제는 c-Met의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 서열번호 73(EEPSQ)를 포함하는 연속하는 5개 이상의 아미노산을 인식 또는 결합하는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편인,
상기 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역; 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것인,
방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 c-Met 저해제는 크리조티닙(crizotinib; 3-[(1R)-1-(2,6-dichloro-3-fluorophenyl)ethoxy]-5-(1-piperidin-4-ylpyrazol-4-yl)pyridin-2-amine; PF-02341066), 카보잔티닙(cabozantinib; XL-184), 포레티닙(foretinib; E7050), PHA-665752, SU11274, SGX-523, PF-04217903, EMD 1214063, Golvatinib, INCB28060, MK-2461, 티반티닙(tivantinib; ARQ 197), NVP-BVU972, AMG458, BMS 794833, BMS 777607, MGCD-265, AMG-208, BMS-754807, JNJ-38877605, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 방법.
c-Met 저해제 및 Hsp90 저해제를 포함하는, 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물.
제18항에 있어서, 상기 c-Met 저해제는 c-Met의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 서열번호 73(EEPSQ)를 포함하는 연속하는 5개 이상의 아미노산을 인식 또는 결합하는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물.
제19항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 부위;
서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
상기 중쇄 상보성 결정영역 및 경쇄 상보성 결정영역의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위의 조합
을 포함하는 것인, 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물.
제18항에 있어서, 상기 c-Met 저해제는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체이고,
상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 c-Met 저해제는 c-Met의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 서열번호 73(EEPSQ)를 포함하는 연속하는 5개 이상의 아미노산을 인식 또는 결합하는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편인,
상기 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역; 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것인,
암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물.
제18항에 있어서, 상기 c-Met 저해제는 크리조티닙(crizotinib; 3-[(1R)-1-(2,6-dichloro-3-fluorophenyl)ethoxy]-5-(1-piperidin-4-ylpyrazol-4-yl)pyridin-2-amine; PF-02341066), 카보잔티닙(cabozantinib; XL-184), 포레티닙(foretinib; E7050), PHA-665752, SU11274, SGX-523, PF-04217903, EMD 1214063, Golvatinib, INCB28060, MK-2461, 티반티닙(tivantinib; ARQ 197), NVP-BVU972, AMG458, BMS 794833, BMS 777607, MGCD-265, AMG-208, BMS-754807, JNJ-38877605, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물.
제18항에 있어서, 상기 Hsp90 저해제는 Hsp90 또는 Hsp90을 암호화하는 유전자에 결합하는 화학물질, 단백질, 펩타이드 및 핵산 분자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물.
제23항에 있어서, 상기 Hsp90 저해제는 SNX-2112, 겔다나마이신(Geldanamycin), 및 17-AAG (17-(Allylamino)-17-desmethoxygeldanamycin)로 이루어진 군에서 선택된 것인, 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물.
제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 위암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 또는 골육종인, 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물.
제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 c-Met 저해제에 대하여 저항성을 갖는 암인, 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물.
Hsp90 저해제를 포함하는, c-Met 저해제에 대한 저항성을 갖는 암의 치료용 약학 조성물.
제27항에 있어서, 상기 Hsp90 저해제는 Hsp90 또는 Hsp90을 암호화하는 유전자에 결합하는 화학물질, 단백질, 펩타이드 및 핵산 분자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, c-Met 저해제에 대한 저항성을 갖는 암의 치료용 약학 조성물.
제28항에 있어서, 상기 Hsp90 저해제는 SNX-2112, 겔다나마이신(Geldanamycin), 및 17-AAG (17-(Allylamino)-17-desmethoxygeldanamycin)로 이루어진 군에서 선택된 것인, c-Met 저해제에 대한 저항성을 갖는 암의 치료용 약학 조성물.