KR20160008862A - 생열귀 에틸아세테이트 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 자극 완화, 피부 장벽 강화 및 염증 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생열귀(Rose davurica Pall.) 에틸아세테이트 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 자극 완화, 피부 장벽 강화 및 염증 억제용 조성물에 관한 것으로, 항산화효과, 항염효과, 단백분해효소 활성 저해 효과 및 각질 세포 분화 촉진 효과를 나타냄으로써, 피부 자극 완화, 피부 장벽 강화 및 염증을 억제하여 내·외부적인 자극으로부터 피부를 보호하는데 우수한 효과를 발휘한다.

Description

생열귀 에틸아세테이트 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 자극 완화, 피부 장벽 강화 및 염증 억제용 조성물 {Composition for skin irritant alleviation, skin barrier enhancement and anti-inflammatory with the ethyl acetate extract of Rose davurica}

본 발명은 생열귀(Rose davurica Pall.) 에틸아세테이트 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 자극 완화, 피부 장벽 강화 및 염증 억제용 조성물에 관한 것이다.

신체에 있어서 최외각 방어막인 피부는 다양한 환경으로부터 신체를 방어하는 기능을 수행하기 때문에 항상 직·간접적인 자극을 받고 있다. 일 예로, 피부가 자외선에 노출될 경우 돌연변이를 유발하여 직접적으로 병증을 일으킬 수 있으며, 간접적으로는 활성산소종을 생산하여 다양한 병증을 유발할 수 있다. 자외선에 일차적으로 노출되는 피부층인 표피는 대부분 각질 세포로 구성되어 있는데, 자외선에 노출될 경우, 각질세포로부터 세포 외 기질단백질을 분해하는 효소 중 한 가지인 MMP-9의 발현이 증가한다고 보고되어 있다.

기질금속단백질분해효소(matrix metalloprotease, MMP)는 아연과 칼슘 의존성 엔도펩티다아제(endopeptidase)에 속하는데, 거의 모든 세포 외 기질의 구성성분을 분해할 수 있다. 그 중 92kDa 젤라티네이즈(92kDa gelatinase) 혹은 타입 Ⅳ 콜라게네이즈(type Ⅳ collagenase)라고 불리우는 MMP-9은 기저막 주요 구성성분인 타입 Ⅳ 콜라겐(type Ⅳ collagen)을 분해하는 효소로, 염증세포를 비롯해 비만세포, 대식세포, 호중구, 섬유아세포 및 상피세포 등에서 생산된다.

상기 MMP-9은 역조절 단백질인 TIMP-1과 복합체를 이루어 작용이 조절되며, 이를 통해 세포 외 기질의 항상성이 유지된다. 치유 과정이 시작될 경우 세포 외 기질의 합성과 축척 및 조직의 재형성이 일어나는데, 이 과정에서 MMP-9이 관여한다. 정상적인 환경에서는 일정량의 MMP-9과 TIMP-1이 발현하여 MMP-9이 적정수준으로 작용하지만, 자외선을 비롯한 다양한 자극으로 인해 MMP-9이 과도하게 발현될 경우 TIMP-1이 역 조절 단백질로서 기능을 다하지 못하여 세포 외 기질의 과도한 분해로 이어져 기저막이 얇아짐과 더불어 염증 세포들의 이동과 침윤을 촉진시켜 궁극적으로 염증을 악화시키는 작용을 한다. 이전의 연구들을 살펴보면 알러지성 염증을 비롯한 다양한 염증 병소에서 다른 부위보다 많은 양의 MMP-9가 발현되었다고 보고되어 있다.

염증을 발생시키는 내면적인 요인인 MMP-9의 발현 혹은 활성을 억제하여 알러지성 염증, 접촉성 염증, 지루성 염증 등을 포함한 만성적인 염증을 치료하고자 다양한 제품들이 출시되고 있지만, 대부분의 제품들이 염증 발생 후, 외부적으로 도포를 하여 염증의 발생을 약화시키거나 염증이 악화되는 것을 예방하는 것일 뿐, 근본적으로 염증의 발생을 억제하는 화장료 및 외용제의 개발은 미미한 실정이다.

한편, 각질세포는 표피 최하층에서 지속적으로 증식(proliferation)하는 기저세포(basal cell)가 단계적으로 형태 및 기능상의 변화를 거치며, 피부 표면까지 상승한 특징적인 세포이다. 여러 가지 복합적인 신호에 의해 세포분화가 시작되면 케라티노사이트(keratinocytes)가 바깥쪽으로 이동하여 특이적인 표피 종말분화(epidermal terminal differentiation) 과정을 시작하며, 최종적으로는 각질세포막(cornified envelope)을 형성하여 외부 환경에 대한 신체 보호 기능을 하게 된다.

각질층은 피부 내 수분의 흡수 및 보존을 통해 외부 환경의 도전으로부터 인체를 보호하고, 피부의 습윤태를 유지한다. 피부건조증은 건선(psoriasis), 비늘증(ichthyosis), 아토피피부염, 건성습진 등과 같은 피부장벽 기능에 장애가 있는 경우에 발생하며, 각질층의 화학적 또는 물리적 특성에 따라 피부장벽 기능에는 큰 차이를 보인다. 피부 각질층에서 수분의 유지는 (1) 세포간 지질(intercellular lamellar lipids), (2) 각질세포(corneocyte), (3) 자연보습인자(natural moisturizing)의 세가지 요소에 의해 이루어지며, 이중 하나라도 이상이 발생할 경우 피부는 건조 상태에 이른다.

다양한 피부 질병으로 인한 피부 건조증을 완화 시키기 위해 로션과 크림 그리고 오일 제형의 상품들이 개발되고 있지만, 이러한 제품들은 시간이 경과하거나 다른 자극에 의해 막이 손상되었을 경우, 그 효과를 지속시키기에는 한계가 있다. 따라서, 피부 장벽을 구성하는 주요 요인인 각질층과 지질 그리고 보습인자의 발현에 영향을 주어 외부적인 도포가 아닌 내부적인 작용 기작에 영향을 주어 피부 장벽을 강화 할 수 있는 천연 유래의 기능성 물질에 대한 탐색이 필요한 실정이다.

한편, 생열귀 (Rose davurica Pall.)는 장미과(Rosacea)에 속하는 다년생 식물로서 우리나라, 일본, 만주 및 시베리아 등에 분포하는 낙엽활엽관목이다. 우리나라에서는 강원도 이북 해발 200~1,200 m에 자생하며, 추위에 강하고 습기가 있는 비옥한 토양에서 잘 자란다. 높이는 1~1.5 m이며 줄기는 곧게 서고, 적갈색이며 가시가 있다. 잎은 우상복엽으로 나며, 타원형 또는 장 타원형으로 양끝이 뾰족하며, 길이 1~3 m 로서 가장자리에 잔 톱니가 있고 뒷면에 선점이 있다. 민간에서는 식용으로 쓰이며 뿌리와 열매는 건위이기와 양혈조경에 쓰이며 소화불량, 기대복사, 위통, 월경부조 등의 치료에 사용하는 유용한 약용식물자원이다. 생열귀 열매는 레몬보다 아스코르브산(ascorbic acid) 함량이 10~30배 가량 높고, 당근보다 베타-카로틴(β-carotene)이 8~10배 가량 높다는 연구결과가 보고된 바 있다.

또한, 생열귀나무 열매와 과피에서는 베툴린산(betulinic acid), 알피토린산(alphitolic acid), 올레아놀릭산(oleanolic acid), 마스리닉산(maslinic acid), 우르솔릭산(ursolic acid), 포모릭산(pomolic acid), 토르멘틱산(tormentic acid) 등의 트리테르펜(triterpene)과 퀘세틴(quercetin), 하이페린(hyperin), 틸리로사이드(tiliroside) 등의 플라보노이드(flavonoid)를 포함하는 것으로 보고되어 있다.

종래에 생열귀 또는 그 추출물을 이용한 다양한 연구가 수행되었으나, 아직까지 생열귀를 사용한 근본적인 염증 억제 효능에 대한 연구는 밝혀진 바가 없다.

대한민국 등록특허 제10-0460133호(발명의 명칭: 생열귀나무 추출물로부터 항산화활성이 우수한 카테킨의 생산방법)에는, 생열귀나무로부터 알코올로 추출하거나 혹은 이로부터 에틸아세테이트 등의 유기용매로 분획한 생열귀나무 추출물 및 이로부터 항산화 활성이 높은 플라반계 화합물인 카테킨(Catechin)을 단리하는 방법에 대해 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-2004-0038243호(발명의 명칭: 생열귀나무 추출물을 함유하는 항산화 또는 항노화용 피부화장료 조성물)에는, 생열귀나무(Rosa davurica Pall.) 추출물을 함유하는 항산화 또는 항노화용 피부 화장료 조성물에 대해 기재되어 있다.

본 발명은 염증성 사이토카인(cytokine)인 TNF-α의 생성 억제 및 MMP-9 발현 억제를 통해, 피부자극 완화 및 염증 발현을 억제하고, 각질 세포 분화를 유도하여 피부 장벽 강화효과를 갖는 생열귀 추출물을 함유하는 조성물을 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제1형태로 생열귀(Rose davurica Pall.) 에틸아세테이트 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 자극 완화용 화장료 조성물을 제공한다.

한편, 본 발명은 제2형태로 생열귀(Rose davurica Pall.) 에틸아세테이트 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 장벽 강화용 화장료 조성물을 제공한다.

한편, 본 발명의 제1형태 및 제2형태인 화장료 조성물에 있어서, 상기 생열귀 에틸아세테이트 추출물은 바람직하게 생열귀에 메탄올을 가하여 메탄올 추출물을 수득하는 단계 (a); 상기 단계 (a)에서 수득한 메탄올 추출물에 물 및 n-헥산을 가하고 분획하는 단계 (b); 상기 단계 (b)의 분획 후, 물 층을 분리하고, 여기에 다이클로로메테인을 가하여 분획하는 단계 (c); 및 상기 단계 (c)의 분획 후, 물 층을 분리하고, 여기에 에틸아세테이트를 가하여 분획하는 단계(d); 로부터 회수되는 에틸아세테이트 분획추출물인 것이 좋다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 일 예로 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 일 예로 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있다. 다만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우, 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 용액 또는 유탁액인 경우, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 일 예로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 현탁액인 경우, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우, 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형 또는 비누일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나, 떼어내거나, 물로 씻어낼 수도 있다. 일 예로, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누일 수 있고, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩일 수 있으며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔일 수 있다. 다만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수도 있다.

한편, 본 발명은 제3형태로 생열귀(Rose davurica Pall.) 에틸아세테이트 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 억제용 외용제 조성물을 제공한다.

한편, 본 발명의 제3형태인 외용제 조성물에 있어서, 상기 생열귀 에틸아세테이트 추출물은 바람직하게 생열귀에 메탄올을 가하여 메탄올 추출물을 수득하는 단계 (a); 상기 단계 (a)에서 수득한 메탄올 추출물에 물 및 n-헥산을 가하고 분획하는 단계 (b); 상기 단계 (b)의 분획 후, 물 층을 분리하고, 여기에 다이클로로메테인을 가하여 분획하는 단계 (c); 및 상기 단계 (c)의 분획 후, 물 층을 분리하고, 여기에 에틸아세테이트를 가하여 분획하는 단계(d); 로부터 회수되는 에틸아세테이트 분획추출물인 것이 좋다.

상기 피부 외용제 조성물은 일 예로 경고제(PLASTERS), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 첩부제, 서방화제제 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.

한편, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 일 예로, 약리학적으로 허용되는 기제; 젖당, 글루코오스, 수크로오스, 만니톨, 감자녹말, 옥수수녹말, 탄산칼슘, 인산칼슘 및 셀룰로오스를 포함하는 운반제 및 부형제; 전분, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 당밀, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스를 포함하는 결합제; 한천, 전분, 젤라틴 가루, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 결정 셀룰로오스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨 및 알긴산 나트륨을 포함하는 분쇄제; 스테아린산 마그네슘, 활석 및 수첨 식물유를 포함하는 윤활제; 및 착색제 등을 포함할 수 있다. 상기 외에도 안정화제, 용해보조제, 경피흡수 촉진제 등의 보조제가 더 첨가될 수 있다.

한편, 본 발명의 피부 외용제 조성물에 대한 표준 투여량은 환자의 개별적 특성에 의해 그 양이 변화될 수 있으며, 실질적으로 숙련된 임상 의사는 환자를 위해 본 발명의 피부 외용제 조성물에 대한 이상적인 투여량 및 투여 계획을 정할 수 있다. 또한, 적절한 투여량을 결정하는데 참조 문헌을 참조할 수 있고, 시험관 내 또는 동물 모델에서 일반적으로 결정될 수도 있다.

한편, 본 발명에서 "유효성분으로 함유한다"는 의미는 본 발명의 화장료 조성물이 피부 자극 완화 및c 피부 장벽 강화 효과를 나타내고, 피부 외용제 조성물이 염증 억제효과를 나타낼 수 있는 정도로 생열귀 에틸아세테이트 추출물이 첨가되는 것을 의미하고, 약물 전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션(formulation) 되는 것을 포함할 수 있다.

본 발명은 항산화효과, 항염효과, 단백분해효소 활성 저해 효과 및 각질 세포 분화 촉진 효과를 나타냄으로써, 피부 자극 완화, 피부 장벽 강화 및 염증을 억제하여 내·외부적인 자극으로부터 피부를 보호하는데 우수한 효과를 발휘한다.

도 1은 생열귀 에틸아세테이트(E.A.) 추출물 획득 과정을 나타낸 모식도 이다.
도 2는 HaCaT cell line에 본 발명에 따른 생열귀 에틸아세테이트(E.A.) 추출물을 처리한 후, 생성되는 ROS의 양을 측정하여 항산화력을 나타낸 그래프이다.
도 3 은 HaCaT cell line에 본 발명에 따른 생열귀 에틸아세테이트(E.A.) 추출물을 처리한 후, ELISA 방법으로 생성되는 TNF-α의 양을 비교 측정하여 TNF-α 생성 억제능을 나타낸 그래프이다.
도 4 는 HaCaT cell line에 본 발명에 따른 생열귀 에틸아세테이트(E.A.) 추출물을 처리한 후, RT-PCR 방법으로 생성되는 염증성 사이토카인인 IL-1α, IL-8, IL-10의 발현량을 아가로스 젤 전기영동으로 확인한 사진이다. 이때, 그래프는 베타액팀(β-actin)에 대한 각 사이토카인들의 상대적인 발현량을 나타낸다.
도 5는 HaCaT cell line에 본 발명에 따른 생열귀 에틸아세테이트(E.A.) 추출물을 처리한, 후 ELISA 방법으로 생성되는 MMP-9의 양을 측정하여 MMP-9 생성능을 나타낸 그래프이다.
도 6은 HaCaT cell line에 본 발명에 따른 생열귀 에틸아세테이트(E.A.) 추출물을 처리한 후, 지아모그래피(zymography) 방법으로 MMP-9의 단백분해활성 정도를 측정해 나타낸 사진이다.
도 7은 HaCaT cell line에 본 발명에 따른 생열귀 에틸아세테이트(E.A.) 추출물을 처리한 후, RT-PCR 방법으로 생성되는 각질 세포 분화 인자인 인보루크린(involucrin)과 필라그린(filaggrin)의 발현량을 아가로스 젤 전기영동으로 확인 한 사진이다. 이때, 그래프는 베타액틴(β-actin)에 대한 각 사이토카인들의 상대적인 발현량을 나타낸다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[실시예 1: 생열귀 에틸아세테이트 추출물의 제조]

생열귀 분말(대광약업사) 200 g을 100% 메탄올 4 L의 상온에서 오버헤드스틸러를 이용하여 3시간 동안 추출한 다음, 어드반택 NO.3(Toyo Roshi Kai Ltd.) 여과지로 1차 여과를 수행한 후, NO.5 여과지로 2차 여과를 수행하였다.

여과 후, 상기 메탄올 추출물을 5% 농도로 증류수에 녹인 후 극성 정도가 다른 유기 용매인 노르말 헥산(n-hexane), 다이클로로메테인(dichloromethane, D.C.), 에틸아세테이트(ethyl acetate, E.A.), 노르말 부탄올(n-BuOH) 및 물의 순서로 분획한 다음 감압회전농축기를 이용하여 에틸아세테이트 분획추출물로부터 2.4 g을 얻었다 (도 1 참조).

[실험예 1: 항산화 효과 평가(ROS 측정)]

본 실험예는 상기 실시예 1에서 제조된 생열귀 분획추출물의 항산화 효과를 평가하기 위해 활성 산소종(Reactive Oxygen Species, ROS) 생성억제율을 측정하고자 하였다.

사람 유래의 각질 형성 세포(HaCaT cell)를 배양접시 바닥에 접종한 후, 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신(100 ㎍/ml), 10% FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 동물세포배양배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)를 넣고 37℃, 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기내에서 배양하였다. 배양 후, HaCaT cell을 96 웰 플레이트(well plate)에 1×10⁵ cells/ml의 농도로 희석하여 100 ㎕씩 접종한 후, 24시간 배양하였다.

그 후, 배지를 모두 제거하고, 멸균완충용액(DPBS)을 이용해 세포를 세척한 후, 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 시료를 적당한 농도로 희석하여 각 시료를 웰(well) 당 100 ㎕씩 3회 반복처리하고, 24시간 추가 배양하였다. 24시간 후, 배지를 제거하고, DPBS 용액 200 ㎕를 넣은 후 워싱하였으며, 이 과정을 2회 반복하여 수행하였다. 워싱 후, 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹아 있는 DCFH-DA를 20 μM(in PBS)로 희석하여 웰(well)에 100 ㎕ 넣은 후 37℃, 5% CO₂ 배양기(incubator)에서 20분간 배양하고, DCFH-DA를 제거한 후, DPBS를 넣어 3회 세척하였다. 그 후, 100 μM H₂O₂ 를(in PBS) 각 웰(well)에 100 ㎕를 넣고, 배양기(incubator)에서 배양한 후, 형광현미경을 이용하여 이미지 촬영 및 ELISA reader를 이용하여 형광을 측정하였고(485/535nm), 양성 대조군으로 퀘세틴(quercetin)을 사용하였다. 이때, 활성 산소종(ROS)의 생성 억제율은 하기 수학식 1을 이용하여 계산하였고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

[수학식 1]

ROS 생성억제율(%)=100-{(A-C)/(A-B)}

A: (-) H₂O₂

B: (+) H₂O₂

C: sample

시료	ROS 생성억제율(%)
	처리농도(uM)		처리농도(㎍/㎖)
	20	50	50	100
(-) H2O2	100
(+) H2O2	0
실시예 1	-	-	139	149.4
Quercetin	15.5	77.7	-	-

실험결과, 실시예 1의 생열귀 에틸아세테이트 분획추출물은 농도 의존적으로 ROS 생성을 억제시키며, 양성 대조군보다 탁월한 활성산소 생성억제능을 보여주었다. 따라서, 본 발명의 생열귀 에틸아세테이트 분획추출물의 뛰어난 항산화 효과를 확인할 수 있었다(표 1).

[실험예 2: 항염증 효능 평가]

다양한 자극원으로 인해 피부에 염증유발 사이토카인(cytokine)들이 발생하는데 그 중 대표적인 자극원이 UVB 이다. 따라서, 본 실험예에서는 사람 각질 형성세포인 HaCaT cell에 자극원 UVB를 처리하여 염증성 사이토카인(cytokine)인 TNF-α, IL-1α, IL-8 및 IL-10의 발현이 실시예 1에서 제조된 생열귀 에틸아세테이트 분획추출물 처리에 의해 얼마나 저해되는지 여부를 하기와 같이 확인하고자 하였다.

1) 염증성 사이토카인(cytokine) TNF-a 발현 평가

사람 유래의 각질 형성 세포 HaCaT cell 을 배양접시의 바닥에 접종한 후, 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신 (100 μg/ml), 10% FBS(Fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지를 넣고 37℃, 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다.

배양 후, HaCaT cell을 12 웰 플레이트(well plate)에 1X10⁵ cells/ml의 농도로 희석하여 1000 ㎕씩 접종하고, 24 시간 배양하였다. 그 후, 배지를 모두 제거하고, 세포의 건조를 예방하기 위해 완충 버퍼인 DPBS를 가하여 12.5 mJ/cm²의 UVB를 조사하였다. 조사 후, 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 시료를 적당한 농도로 희석하여 각 시료를 웰(well) 당 1000 ㎕씩 3회 반복 처리하고, 24시간 추가 배양한 세포배양액을 사용하여 ELISA 방법(Human TNF-alpha Quantikine ELISA Kit, R&D systems, DTA00C)으로 배양액으로 분비된 TNF-α를 측정하였다.

TNF-α 항체가 균일하게 도포되어 있는 96 웰 플레이트의 각 웰에 200 ㎕의 스탠다드(standard) 또는 세포 배양액을 넣은 후, 상온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 2시간 후, 상등액을 모두 제거하고, 워싱 버퍼(washing buffer)로 4회 세척하고 각 웰(well)에 200 ㎕ 콘쥬게이트(conjugate)를 넣은 후, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후, 상등액을 모두 제거하고 워싱 버퍼(washing buffer)로 4회 세척하여 각 웰(well)에 200 ㎕ 기질(substrate) 용액을 가한 후, 암 조건 상온에서 20분간 반응시켰다. 20분 후, 50 ㎕의 반응 정지액을 가하여 반응을 정지시키고, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

배양액으로 방출된 TNF-α의 양은 ELISA kit에 포함되어 있는 표준용액을 희석하여 작성된 표준 농도 곡선에 샘플의 흡광도를 대입하여 계산하였다. 또한 UVB를 조사하지 않은 세포의 배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였고, 양성 대조군으로 덱사메타손(dexamethasone)을 사용하였다. 이때, TNF-α의 생성 억제율은 하기 수학식 2를 이용하여 계산하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

[수학식 2]

TNF-α 생성억제율 = 100-{(A-C)/(A-B)}

A : (-) UVB

B : (+) UVB

C : Sample

시료	TNF-α 생성억제율(%)
	처리농도(uM)	처리농도(㎍/㎖)
	1	50	100
(-) UVB	100
(+) UVB	0
실시예 1		99.9	101.7
Dexamethasone	97.0

실험결과, 생열귀 에틸아세테이트 분획추출물(실시예 1)을 처리한 모든 군에서, 염증성 사이토카인인 TNF-α의 발현이 양성 대조군인 덱사메타손(dexamethasone)과 유사하거나 보다 우수하게 억제되는 것으로 확인하였다(표 2).

2) 염증성 사이토카인 IL-1α, IL-8, IL-10 유전자 발현 평가

사람 유래의 각질 형성 세포 HaCaT cell을 배양접시의 바닥에 접종한 후, 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신 (100 μg/ml), 10% FBS(Fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지를 넣고, 37℃, 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다.

배양 후, HaCaT cell을 6 웰 플레이트(well plate)에 1X10⁵ cells/ml의 농도로 희석하여 2000 ㎕씩 접종한 후 24 시간 배양하였다. 그 후, 배지를 모두 제거하고, 세포의 건조를 예방하기 위해 완충 버퍼인 DPBS를 가한 후 12.5 mJ/cm²의 UVB를 조사하였고, 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 시료를 적당한 농도로 희석하여 각 시료를 웰(well) 당 2000 ㎕씩 처리하였다. 처리 후, 24시간 추가 배양한 세포로부터 발현된 IL-1α, IL-8, IL-10 유전자 양을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 이때, RT-PCR은 하기와 같이 수행하였다.

상기 배양한 HaCaT cell을 DPBS 완충 용액으로 두 번 세척한 다음 각 웰에 1 ml의 QIAzol을 넣고 10분 동안 상온에서 반응시킨 후 세포를 회수한 후, 200 ㎕ 클로로포름(chloroform)을 넣고 인버팅(inverting)을 수행하였다. 4℃, 12,000 g에서 20분 간 원심분리를 수행하여 400 ㎕ 의 상층액을 회수한 후, 각각의 튜브에 500 ㎕ 의 아이소프로판올(isopropanol)을 가한 후 인버팅(inverting)을 수행하고, 실온에서 10 분간 반응시켰다.

그 후, 4℃, 12,000 g에서 20분간 원심분리를 수행하여 RNA를 침전시킨 후, 상등액을 버렸다. 75% 에탄올을 사용하여 RNA 펠렛(pellet)을 세척(4℃, 12,000 g에서 5분간 원심분리) 한 후, 공기건조(air dry)시켜 DEPC H₂O를 넣어 RNA를 추출하였다. 총 RNA를 전기영동으로 확인 후, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 RNA를 정량 한 다음 첫번째 가닥(first strand) cDNA를 합성하였다. 그 후, cDNA 합성은 cDNA 합성 키트(Thermo, #K 1643)를 사용하여 다음과 같이 수행하였다. 총 RNA(0.5㎍) 에 4 ㎕ 5X 반응 버퍼(reaction buffer)와 2 ㎕ 'Maxima Enzyme Mix'를 가한 후, 총 부피가 20 ㎕가 되도록 뉴클레아제 프리 워터(nuclease free water)를 가해 준 후, 25℃에서 10분, 50℃에서 15분, 85℃에서 5분의 순서대로 반응 조건을 설정하여 cDNA를 합성하였다.

그 후, cDNA 증폭은 'Go Taq Master Mix kit, Promega'를 사용하여 다음과 같이 수행하였다. 1 ㎕ cDNA 합성과 12.5 ㎕ master mix, 1.25 ㎕ 포워드 프라이머(forward primer, 10 pmol), 1.25 ㎕ 리버스 프라이머(reverse primer, 10 pmol), 9 ㎕ 뉴클레아제 프리 워터(uclease free water)를 혼합하여 cDNA를 증폭하였다. 타켓 유전자의 증폭을 위해 사용된 프라이머 배열은 다음과 같다.

IL-1α 유전자

Forward primer : 5'-CTC ACG GCT GCT GCA TTA CA-3'

Reverse primer : 5'-GTG CCG TGA GTT TCC CAG AA-3'

IL-6 유전자

Forward primer : 5'-ATG ACT TCC AAG CTG GCC GTG GCT-3'

Reverse primer : 5'-TCT CAG CCC TCT TCA AAA ACT TCT C-3'

IL-10 유전자

Forward primer : 5'-ATC AAG GCG CAT GTG AAC TC-3'

Reverse primer : 5'-GTT GGC TCC CCA AAG AAC AT-3'

온도가 Tm 값 이하로 떨어지면 프라이머 이량체 형성이나 비특이적 시작이 일어나게 되므로 이와 같은 난점을 극복하기 위해여 사이클링(cycling) 조건은 먼저 94℃ 에서 2 분 동안 반응 시킨 후, 삼단계 프로그램(변성: 95℃, 1분, 어닐링: 55℃, 1분, 72℃, 1.5분)을 25 cycle 반응 시킨 후, 72℃에서 10분동안 반응시킨 PCR 산물을 4℃에 보관하였다.

PCR 반응이 끝난 산물 5 ㎕를 0.5 ㎕/ml 에티듐 브로마이드(ethidium bromide, EtBr)가 들어있는 1.5% 아가로스 겔에 전기영동 시켜 UV 트랜실루미네이터(transilluminator)로 증폭된 DNA 밴드를 확인 하였으며, 발현 정도는 베타액틴(β-actin)에 대한 상대적인 양으로 나타내었다.

실험결과, 도 4에 나타난 바와 같이 UVB를 처리한 HaCaT cell에서는 IL-1 α, IL-8 및 IL-10 총 3가지 염증성 사이토카인의 발현량이 UVB를 처리하지 않은 네거티브 컨트롤(negative control)에 비하여 상당히 증가하는 것을 볼 수 있었고, 그 중 IL-10의 경우 UVB조사 시 약 6배 발생량이 증가함을 확인하였다.

반면 UVB를 처리한 HaCaT cell에 생열귀 에틸아세테이트 분획추출물을 처리 한 경우 3가지 염증성 사이토카인의 발현이 효과적으로 감소함을 확인하였다. IL-1α의 경우 농도 의존적으로 발생량이 감소하였고, IL-8의 경우 양성대조군인 덱사메타손(dexamethasone) 보다 우수한 효과를 나타내었다. 그리고 IL-10의 경우, 오히려 생열귀 에틸아세테이트 분획추출물이 IL-10 유전자의 발현을 억제하여 오히려 자극원으로 UVB를 처리하기 전보다 낮은 양의 IL-10이 발현됨을 확인하였다. 따라서, 염증을 완화시키는데 생열귀 에틸아세테이트 분획추출물이 탁월한 효능을 갖고 있는 것으로 확인할 수 있었다.

[ 실험예 3 : MMP-9 발현 억제능 평가]

피부가 자외선에 노출될 경우 표피에 존재하는 각질 형성 세포로부터 MMP-9이 발생하게 되며, 이렇게 발생한 MMP-9은 세포 외 기질을 분해 및 재조합하여 염증을 유발 및 유지하는데 주요한 역할을 담당하고 있다. 따라서, 본 실험예에서는 MMP-9의 UV자극에 의한 발현 변화 및 본 발명의 생열귀 에틸아세테이트 분획추출물 처리에 의한 발현 변화를 ELISA 확인법과 젤라틴 자이모그래피(gelatin zymography)를 통해 하기와 같이 확인하고자 하였다.

1) MMP-9 ELISA

상기 실시예 1에서 제조된 생열귀 에틸아세테이트 분획추출물의 MMP-9 발현 억제 효과를 확인하기 위해, 사람 유래의 각질 형성 세포 HaCaT cell 을 배양접시의 바닥에 접종한 후, 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신 (100 μg/ml), 10% FBS(Fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지를 넣고 37℃, 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기내에서 배양하였다.

배양 후, HaCaT cell을 24 웰 플레이트(well plate)에 1X10⁵ cells/ml의 농도로 희석하여 500 ㎕씩 접종한 후, 24 시간 배양하고, 배지를 모두 제거하였다. 그 후, 세포의 건조를 예방하기 위해 완충 버퍼인 DPBS를 가하고, 320 mJ/cm²의 UVA를 조사한다. 조사 후, 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 시료를 적당한 농도로 희석하여 각 시료를 웰(well) 당 500 ㎕씩 처리한 후, 12시간 추가 배양한 세포배양액을 사용하여 ELISA 방법(Human MMP-9 Platinum ELISA Kit, eBioscience)으로 배양액으로 분비된 MMP-9을 측정하였다.

MMP-9 항체가 균일하게 도포되어 있는 96 웰 플레이트(well plate)의 각 웰(well)에 1X 에세이 버퍼(assay buffer)가 포함된 표준용액과 샘플용액을 각각 100 ㎕씩 가한 후, MMP-9 과 결합할 바이오틴 콘쥬게이트(biotine conjugate)를 50 ㎕ 더 가한 후, 상온에서 2시간 반응 시켰다. 2시간 후, 상등액을 모두 제거하고 워싱 버퍼(washing buffer)로 4회 세척하고 각 웰(well)에 100 ㎕ 스트렙타비딘-HRP(streptavidin-HRP, 바이오틴 콘쥬게이트와 결합)를 넣은 후, 상온에서 1시간 동안 반응 시켰다. 1시간 후, 상등액을 모두 제거하고 워싱 버퍼(washing buffer)로 4회 세척하고 각 웰(well)에 100 ㎕ TMB 기질(substrate) 용액을 가한 후, 상온에서 20분간 암조건에서 반응시켰다. 10분 후, 100 ㎕의 반응 정지액을 가하여 반응을 정지 시킨 후, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

배양액으로 방출 된 MMP-9의 양은 ELISA kit에 포함되어 있는 표준용액을 희석하여 작성된 표준 농도 곡선에 샘플의 흡광도를 대입하여 계산하였다. 또한, UVA를 조사하지 않은 세포의 배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였고, 양성 대조군은 레티노산(retinoic acid)을 사용하였다. 이때, MMP-9의 생성 억제율은 하기 수학식 3을 이용하여 계산하였고, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

[수학식 3]

MMP-9 생성억제율 = 100 × ( A / B )

A : sample

B : (-) UVA

시료	MMP-9 생성율(%)
	처리농도(uM)	처리농도(㎍/㎖)
	2	50	100
(-) UVA	100
(+) UVA	209.6
실시예 1		161.2	143.9
Retinoic acid	121.7

실험결과, 생열귀 에틸아세테이트 분획추출물(실시예 1)은 농도 의존적으로 MMP-9의 생성을 억제 시키며 100 ㎕/ml을 처리한 경우 양성 대조군인 레티노산(retinoic acid)과 유사한 정도로 MMP-9의 발현을 억제 시킴을 보여주었다(표 3).

2) MMP-9 자이모그래피(zymography)

상기 실시예 1에서 제조된 생열귀 에틸아세테이트 분획추출물의 MMP-9 활성 억제 효과를 확인하기 위해 사람 유래의 각질 형성 세포 HaCaT cell을 배양접시의 바닥에 접종한 후, 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신 (100 μg/ml), 10% FBS(Fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지를 넣고 37℃, 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다. 배양 후, HaCaT cell을 24 웰 플레이트(well plate)에 1X10⁵ cells/ml의 농도로 희석하여 500 ㎕씩 접종한 후 24시간 배양하였다.

그 후, 배지를 모두 제거하고, 세포의 건조를 예방하기 위해 완충 버퍼인 DPBS를 가하여 320 mJ/cm²의 UVA를 조사하였다. 조사 후, 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 시료를 적당한 농도로 희석하여 각 시료를 웰(well) 당 500 ㎕씩 처리한 후, 12시간 추가 배양한 세포의 배지를 회수하여 발현된 MMP-9의 활성을 확인하였다. 이때, 겔 자이모그래피(gel zymography)는 하기와 같이 수행하였다.

각각의 세포 배양액을 회수한 다음, 0.1 M Tris-HCl(pH 6.8), 10% 글리세롤(glycerol), 2% 도데실 황산 나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS) 및 0.02%(w/v) 브로모페놀블루(bromophenol blue)가 함유된 같은 완충액에 재희석 하고, 이 용액을 0.1%(w/v) 젤라틴이 함유된 10% 폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gel)에 가열하지 않고, 전기영동시켰다.

전기영동 후에 젤을 실온에서 2.5% 트리톤(Triton) X-100(2 x 30분)에 담가 적시고 증류수로 세척하였다. 그 후, 젤을 인큐베이션 버퍼(50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 10 mM CaCl2, 0.01% NaN3)를 담은 탱크에 담구어 37℃에서 48시간 동안 반응시켰다. 효소 활성에 의한 젤라틴 분해 정도는 쿠마시브릴리언트 블루(coomassie brillinat blue) R-250 (Bio-Rad, 미국)을 사용한 염색에서 확인하였다.

실험결과, 도 6에 나타난 바와 같이 젤라틴 자이모그래피(gelatin zymography)에서 얻은 밴드의 강도가 네거티브 컨트롤(negative control) 대비 UV를 조사한 대조군에서 뚜렷하게 생겼으며, 생열귀 에틸아세테이트 분획추출물을 처리함에 따라 농도 의존적으로 MMP-9 밴드의 강도가 감소함을 확인하였다. 생열귀 에틸아세테이트 분획추출물을 처리한 군의 경우 양성대조군인 레티노산(retinoic acid)보다 월등하게 MMP-9의 활성을 억제함을 확인하였다.

상기에서 살펴본, MMP-9 ELISA 및 MMP-9 zymography 연구를 통해 본 발명의 생열귀 에틸아세테이트 분획추출물이 MMP-9의 발현과 활성을 억제함에 있어 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.

[실험예 4: 각질 세포 분화 유도 평가]

각질형성 세포에 의해 피부 최외각층에 각질세포막(cornified envelope, CE)이 생성되고, 그로 인해 외부 환경에 대한 신체 보호 기능을 하게 된다. 이러한 각질세포막은 각질 세포가 분화하면서 생성되는데 분화 초기를 거쳐 그 후의 단계인 과립층(granular layer)에서 세포막 선구체(cell envelope precursor)인 인보루크린(involucrin), 필라그린(filaggrin) 등이 발현 되어 트랜스글루타미나아제-1(transglutaminase-1)에 의해 크로스 링크(cross liking)를 하게 되고, 이로 인해 각질세포막이 생성된다. 따라서, 본 실험예에서는 실시예 1의 생열귀 에틸아세테이트 분획추출물이 각질 형성 세포로부터 인보루크린(involucrin)과 필라그린(filaggrin)의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 RT-PCR을 통해 확인하고자 하였다.

사람 유래의 각질 형성 세포 HaCaT cell 을 배양접시의 바닥에 접종한 후, 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신 (100 μg/ml), 10% FBS(Fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지를 넣고 37℃, 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다. HaCaT cell을 6 웰 플레이트(well plate)에 2X10⁵ cells/ml의 농도로 희석하여 2000 ㎕씩 접종한 후 24 시간 배양하였다. 배양 후, 배지를 모두 제거하고, 0.03 mM CaCl₂가 포함된 배지에 시료를 적당한 농도로 희석하여 각 시료를 웰(well)당 2000 ㎕씩 처리한 후, 48시간 추가 배양한 세포로부터 발현된 인보루크린(involucrin), 필라그린(filaggrin) 유전자 양을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 그 후, 최종 RNA 추출과 cDNA 합성은 상기 실험예2 의 방법과 동일하게 수행하였다.

cDNA 합성 후, 1 ㎕ cDNA 합성과 12.5 ㎕ 마스터 믹스(master mix), 1.25 ㎕ 포워드 프라이머(forward primer, 10 pmol), 1.25 ㎕ 리버스 프라이머(reverse primer, 10 pmol), 9 ㎕ 뉴클레아제 프리 워터(nuclease free water)를 혼합하여 cDNA를 증폭하였다. 타켓 유전자의 증폭을 위해 사용된 프라이머 배열은 다음과 같다.

인보루크린(involucrin) 유전자

Forward primer : 5'-GGG TGG TTA TTT ATG TTT GGG TGG-3'

Reverse primer : 5'-GCC AGG TCC AAG ACA TTC AAC-3'

필라그린(Filaggrin) 유전자

Forward primer : 5'-ACG GGG CCC AGC ACT AGA GG-3'

Reverse primer : 5'-TGC CCA CGG GAG GCA TCA GA-3'

온도가 Tm 값 이하로 떨어지면 프라이머 이량체 형성이나 비특이적 시작이 일어나게 되므로, 이와 같은 난점을 극복하기 위해여 사이클링(cycling) 조건은 삼단계 프로그램(denaturation :95℃, 0.5분, annearling : 58℃, 0.5분, 72℃, 1분)을 33 사이클(cycle) 반응 후, 72℃에서 5분 동안 반응시킨 PCR 산물을 4℃에 보관하였다.

PCR 반응이 끝난 산물 5 ㎕를 0.5 ㎕/ml 에티듐 브로마이드(ethidium bromide, EtBr)가 들어있는 1.5% 아가로스 겔에 전기영동 시켜 UV 트랜실루미네이터(transilluminator)로 증폭된 DNA 밴드를 확인 하였으며, 발현 정도는 베타액틴(β-actin)에 대한 상대적인 양으로 나타냈다.

실험결과, 도 7에 나타난 바와 같이 각질 형성 세포의 분화 지표인 인보루크린(involucrin)과 필라그린(filaggrin)의 발현이 분화를 억제하는 조건인 저농도(0.03 mM) 칼슘 배지 처리군에 비하여 분화를 활발히 일으키는 조건인 고농도(1.2 mM) 칼슘 배지 처리군에서 월등히 많은 양이 발현되었음을 확인하였다.

생열귀 에틸아세테이트 분획추출물 처리군에서, 두 인자의 발현 양상을 확인 한 결과, 인보루크린(involucrin)과 필라그린(filaggrin) 두 가지 인자 모두 고농도 칼슘 처리 군과 유사한 정도로 발현이 유도되었고, 필라그린(filaggrin)의 경우 양성대조군 보다 월등히 많은 양이 발현되어 각질 형성 세포의 분화를 촉진함을 확인하였다. 이는 물리적 피부 장벽을 강화하는데 생열귀 에틸아세테이트 분획추출물의 효능이 탁월함을 나타낸다.

[실험예 5 : 인체 첩포 검사]

인체 첩포실험은 일차자극물질(primary irritants)을 검색하기 위한 방법으로 널리 사용되고 있으나(Matsumura et al , 1995), 피부과적으로는 알레르기성 접촉피부염의 진단을 위한 진단용 첩포시험(Diagnostic patch test)을 의미한다.

때문에, 본 실험예에서는 생열귀 에틸아세테이트 분획추출물(실시예 1)이 피부 사용에 적합한지를 판정하고자 하였다.

건강한 성인 여자 4명의 팔 안쪽 부위에 키트(Finn chamber)를 이용하여 생열귀 에틸아세테이트 분획추출물을 10% DMSO에 각각의 농도로 희석 시킨 후, 40㎕를 넣은 뒤, 이를 테이프(scanpore tape)로 피부에 고정하였다. 24시간 후에 이를 피부에서 떼어 내고 1시간 후, 홍반과 부종의 정도를 판정하였다. 판정기준은 하기의 국제 접촉피부염 연구위원회(International Contact Dermatitis Research Group;ICDRG)의 기준에 따랐으며(Wooding et al , 1967; Rietschell, 1982; Fischer ＆ Maibach, 1984; Aberer et al , 1993), 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

<판정기준>

0= 발적없음

1= 발적(erythema)

2= 발적 및 구진(papules)

3= 발적, 구진 및 소수포(vesicles)

4= 심한 부종 및 소수포

	피부 자극 정도
피험자	증류수	10% DMSO	생열귀 에틸아세테이트 분획추출물(%)
			0.5	1	5	10
1	0	0	0	0	0	0
2	0	0	0	0	0	0
3	0	0	0	0	0	0
4	0	0	0	0	0	0

실험결과, 총 네 명의 여성 피험자에게 아무런 증상이 나타나지 않음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 생열귀 에틸아세테이트 분획추출물은 피부 외용제 사용에 적합함이 확인되었다.

Claims (6)

1. 생열귀(Rose davurica Pall.) 에틸아세테이트 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 자극 완화용 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 생열귀 에틸아세테이트 추출물은,
   생열귀에 메탄올을 가하여 메탄올 추출물을 수득하는 단계 (a);
   상기 단계 (a)에서 수득한 메탄올 추출물에 물 및 n-헥산을 가하고 분획하는 단계 (b);
   상기 단계 (b)의 분획 후, 물 층을 분리하고, 여기에 다이클로로메테인을 가하여 분획하는 단계 (c); 및
   상기 단계 (c)의 분획 후, 물 층을 분리하고, 여기에 에틸아세테이트를 가하여 분획하는 단계(d); 로부터 회수되는 에틸아세테이트 분획추출물인 것을 특징으로 하는 피부 자극 완화용 화장료 조성물.
   
3. 생열귀(Rose davurica Pall.) 에틸아세테이트 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 장벽 강화용 화장료 조성물.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 생열귀 에틸아세테이트 추출물은,
   생열귀에 메탄올을 가하여 메탄올 추출물을 수득하는 단계 (a);
   상기 단계 (a)에서 수득한 메탄올 추출물에 물 및 n-헥산을 가하고 분획하는 단계 (b);
   상기 단계 (b)의 분획 후, 물 층을 분리하고, 여기에 다이클로로메테인을 가하여 분획하는 단계 (c); 및
   상기 단계 (c)의 분획 후, 물 층을 분리하고, 여기에 에틸아세테이트를 가하여 분획하는 단계(d); 로부터 회수되는 에틸아세테이트 분획추출물인 것을 특징으로 하는 피부 장벽 강화용 화장료 조성물.
   
5. 생열귀(Rose davurica Pall.) 에틸아세테이트 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 염증 억제용 외용제 조성물.
   
6. 제3항에 있어서,
   상기 생열귀 에틸아세테이트 추출물은,
   생열귀에 메탄올을 가하여 메탄올 추출물을 수득하는 단계 (a);
   상기 단계 (a)에서 수득한 메탄올 추출물에 물 및 n-헥산을 가하고 분획하는 단계 (b);
   상기 단계 (b)의 분획 후, 물 층을 분리하고, 여기에 다이클로로메테인을 가하여 분획하는 단계 (c); 및
   상기 단계 (c)의 분획 후, 물 층을 분리하고, 여기에 에틸아세테이트를 가하여 분획하는 단계(d); 로부터 회수되는 에틸아세테이트 분획추출물인 것을 특징으로 하는 염증 억제용 외용제 조성물.
   

Images